Dissertations / Theses on the topic 'Lavage bronchoalvéolaire'

Technique du lavage broncho-alvéolaire, du dosage immunologique de l'alpha 1-antiprotéase et dosage de sa fraction fonctionnelle et études particulières dans la sarcoïdose, les pneumopathies allergiques, les pneumopathies interstitielles, les pneumoconioses, les convectivités, les radiolésions pulmonaires, les pneumopathies infectieuses et l'insuffisance respiratoire aiguë de l'adulte.

La thèse étudie l'intérêt clinique et épidémiologique d'une méthode de lavage nasal dans l'exploration de l'inflammation des voies aériennes, chez l'adulte et l'enfant. Une application clinique menée chez 13 enfants asthmatiques montre qu'il existe, entre les liquides de lavages nasal et bronchoalvéolaire, une corrélation en terme de polynucléaires neutrophiles. L'étude épidémiologique révèle que, chez 45 enfants asthmatiques allergiques, une exposition aux particules fines PM2,5, mesurée de façon personnalisée sur 48h, est associée aux nombres de polynucléaires neutrophiles et éosinophiles et aux niveaux en albumine, urée et alpha1-antitrypsine dans le liquide de lavage nasal. Cette association n'est pas retrouvée chez les enfants sains non atopiques (n=46). Ces résultats plaident en faveur du rôle des PM2,5, dans la sur-expression du phénotype allergique
This research describes the development of a nasal lavage method and its usefulness as a tool for the assessment of airways inflammation in clinical and epidemiological studies, in children as well as in adults. A clinical study conducted in 13 asthmatic children shows that a significant correlation between nasal and bronchoalveolar neutrophils exists when measured in nasal and bronchoalveolar lavages, respectively. Nasal lavage method used in an epidemiological study also reveals that, in asthmatic allergic children (n=45) but not in healthy children (n=46), nasal neutrophil and eosinophill and eosinophil counts are highly correlated to fine particles levels (PM2,5) measured in a personal way. Similar correlations are found with PM2,5 concentrations and nasal albumin, urea and alpha1-antitrypsin levels. These results support the hypothesis of PM2,5 involvement in allergic phenotype over-expression

L'infection par le virus respiratoire syncytial est la principale cause de bronchiolites et de broncho-pneumonies chez le nourrisson et le jeune enfant dans les pays developpes. Dans les annees 1960, un vaccin inactive par le formol a ete teste sur plus de 600 enfants. Lors de l'epidemie de vrs qui suivit non seulement le vaccin se revela inefficace, mais il potentialisa l'infection. Il a ete ontre recemment que l'on pouvait reproduire partiellement cette potentialisation chez le rat des cotonniers et la souris balb/c, sous forme d'une exacerbation des lesions histologiques pulmonaires chez les animaux immunises puis soumis a une epreuve. Cependant, l'infection reste asymptomatique chez les animaux neufs comme chez les animaux immunises. Nous avons utilise ce modele, et recherchant une alternative a l'histologie pour evaluer l'exacerbation des lesions pulmonaires, nous avons montre que les resultats de l'analyse cytologique des liquides de lavages bronchoalveolaires correlent bien ceux de l'histologie. Nous avons observe que la potentialisation chez la souris n'etait pas le seul fait du vrs inactive par le formol mais pouvait etre induite par les constituants du vrs ou bien reproduire avec d'autres couples d'immunisation-epreuve tels que le virus parainfluenza 3 ou l'albumine serique bovine

La caractérisation morphologique et biochimique d'une population purifiée de pneumocytes II ftaux de rats a permis une étude de son comportement devant l'exposition à deux intervenants majeurs de la silicose: les poussières minérales et les liquides de lavages bronchoalvéolaires. La silice, par ses propriétés de surface, est toxique aux doses élevées et mitogène aux faibles doses. Les liquides alvéolaires humains et ovins exposes in vivo a la silice sont nettement mitogènes par rapport à ceux non exposes. L'activité proliférative est corrélée à la cellular ite alvéolaire concomitante et semble en partie due à des molécules de type pdgf- et fgf-acide like. La silice n'a pas d'activité directe sur le métabolisme phospholipidique du pneumocyte II, tandis que les liquides alvéolaires stimulent l'activité de synthèse de novo des phospholipides et en inhibent la sécrétion. Ces altérations sont exacerbées dans la silicose et impliqueraient au moins en partie l'apoprotéine a du surfactant, retrouvée en grande quantité dans les liquides alvéolaires de silicose ovine. L'activité de réduction de tension de surface des composants du surfactant ovin est néanmoins observée dans la silicose

Chez les bovins, le developpement croissant d'anticorps monoclonaux diriges contre des antigenes lymphocytaires permet d'apporter des elements nouveaux sur la composition et l'evolution de leur systeme immunitaire. La periode neonatale represente une periode charniere pour le systeme immunitaire. Il est donc apparu souhaitable d'analyser par cytometrie en flux les sous-populations lymphocytaires sanguines ainsi que du lavage bronchoalveolaire. Au prealable, la reactivite des anticorps monoclonaux sur tissu lymphoide bovin a ete validee de meme que l'impact des facteurs techniques qui conditionnent la qualite des resultats en cytometrie en flux pour les sous-populations cd4 et cd8. Des differents anticoagulants evalues,. . .

La silicose est un modèle de pneumopathie inflammatoire chronique fibrosante dont l'agent étiologique est connu (ie: poussières de silice), ce qui constitue la raison principale des nombreux travaux de recherche clinique et expérimentale qui lui sont consacrés, en plus des incidences préventives et thérapeutiques évidentes qui découlent de son origine occupationnelle. De nombreux avancements ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes biologiques physiopathogéniques de cette pneumoconiose au cours des 50 dernières années. Il reste cependant beaucoup de points d'interrogation, en particulier au sujet des processus intimes à l'échelle moléculaire qui mènent à la constitution d'une fibrose pulmonaire invalidante. Un autre sujet d'intérêt est le rôle joué par les pneumocytes II alvéolaires (Pn II) dans ce type de pathologie. On sait depuis longtemps que dans la silicose l'épithélium alvéolaire de type I s'altère et l'épithélium de type II s'hypertrophie, s'hyperplasie et parfois se métaplasie. De plus, une conséquence directe à ces remaniements est représentée par la nette augmentation des phospholipides et apoprotéines du surfactant (produits par les Pn II) dans le liquide épithélial alvéolaire. La seule explication avancée pour justifier ces remaniements de l'épithélium de type II est le rôle de cellule réparatrice du Pn II envers l'épithélium de type I lésé. Ce mécanisme apparait non spécifique de la silicose puisque décrit dans plusieurs autres modes d'agression inflammatoire du poumon profond (eg: pneumopathie à la bléomycine, au SO2, au NO2, à l’O2, au pneumocoque, au cyclophosphamide, à l'hydroxytoluéne butylé, fibrose pulmonaire idiopathique,...). Cependant récemment des observations de pneumopathies expérimentales inflammatoires et/ou fibrosantes relataient une inflation de l'épithélium de type II sans altération de l'intégrité des Pn I et même parfois sans recrutement de cellules inflammatoires pulmonaires. Nous nous sommes proposés d'étudier les mécanismes impliqués dans la stimulation du renouvellement cellulaire de l'épithélium de type II. Pour ce faire un modèle de culture in vitro de Pn II fœtaux de rat a été développé et caractérisé avant toute expérimentation. Les cellules ont ensuite été étudiées dans leur réaction à deux types d'exposition (ie: poussières minérales, liquide de lavages bronchoalvéolaires [LLBA] de moutons normaux et silicotiques chroniques) par l'analyse des modifications de leur activité de croissance (incorporation de thymidine tritiée, autoradiographie, comptage cellulaire) et de leur viabilité (relâchement d'adénine dans le milieu de culture). Les résultats obtenus sont les suivants: 1- La silice à faibles concentrations et les LLBA concentrés de moutons normaux comme silicotiques chroniques sont nettement mitogènes pour les Pn II in vitro. 2- L'activité mitogène à faibles concentrations de silice est manifestement reliée aux propriétés de surface du minéral puisque disparaissant avec l'usage d'une silice recouverte de lactate d'aluminium et n'existant pas avec une poussière inerte (titane). 3- Les LLBA de moutons silicotiques chroniques stimulent la synthèse d'ADN nucléaire et la multiplication des Pn II de façon plus importante et à une moindre concentration que ceux des moutons normaux. 4- L'utilisation de LLBA de mêmes animaux à différents temps d'exposition à la silice (modèle expérimental de silicose) démontre une corrélation intéressante entre le degré d'activité mitogène sur les Pn II des LLBA de silicose chronique et les autres paramètres cellulaires inflammatoires étudiés dans le liquide épithélial (ie: cellularité totale, nombre de macrophages alvéolaires). 5- La silice exerce une action cytotoxique dose dépendante à tous les niveaux sur les Pn II in vitro. Cependant cet effet est mineur par rapport au stimulus mitogène aux faibles doses, alors qu'il est majeur associé à une inhibition de croissance aux fortes doses. Cette étude suggère l'existence d'une activité directe de la silice cristalline sur l'épithélium alvéolaire de type II qui combine, aux doses physiologiques, une faible toxicité à une surprenante activité mitogène. Par ailleurs les LLBA de moutons normaux contiennent physiologiquement un stimulant de croissance pour les Pn II alors que ceux de moutons silicotiques chroniques apparaissent encore plus stimulants. Ces deux observations sur l'activité de LLBA évoquent la présence d'un ou plusieurs facteurs de croissance dans le processus mitogène observé sur les Pn II. Ces résultats constituent un avancement dans la connaissance des mécanismes de contrôle de la croissance épithéliale pulmonaire et peuvent expliquer au moins en partie l'hyperplasie et l'hypertrophie de l'épithélium de type II dans la silicose.

Dans une premiere partie sont abordees les principales caracteristiques de l'infection par le virus respiratoire syncytial bovin (brsv). Les aspects epidemiologiques, cliniques virologiques, immunitaires, pathogeniques et vaccinaux sont precises dans une perspective de pathologie bovine et de pathologie comparee. Dans une seconde partie sont presentes les justifications et les objectifs du travail experimental. Les enjeux en sante animale et en pathologie comparee de l'infection par le vrsb sont majeurs sur les plans medicaux et economiques. La connaissance des mecanismes immunitaires s'avere indispensable a la mise au point de vaccins. Le veau est un modele d'infection potentiellement fructueux. La troisieme partie est consacree aux aspects methodologiques des cinq essais experimentaux. Deux etudes concernent les facteurs techniques, lies au prelevement et au conditionnement des populations leucocytaires du sang et du liquide de lavage bronchoalveolaire (llba), susceptibles d'influer sur les resultats de l'immunophenotypage lymphocytaire. Deux etudes sont consacrees a la mise au point d'un modele experimental d'infection par le vrsb, expressif sur le plan clinique. La derniere etude evalue les sous-populations lymphocytaires du sang et du llba lors d'infection experimentale par le vrsb. Aucune modification n'est perceptible sur les lymphocytes sanguins. Dans le llba, les lymphocytes cd4+ et cd0+ augmentent significativement de 5 a 9 jours post inoculation, alors que le titre viral diminue a partir de 6 a 7 jours post inoculation. L'ensemble des resultats plaide pour l'utilisation du veau comme modele experimental dans l'etude des reactions immunitaires cellulaires vis-a-vis du vrs.

La BPCO est une maladie pulmonaire caractérisée par une inflammation et un remodelage tissulaires. HMGBl, une protéine nucléaire libérée durant l'inflammation et la réparation, interagit principalement avec son récepteur, RAGE, constitutivement exprimé dans le poumon. Nous avons montré des taux élevés d'HMGBl dans le lavage bronchoalvéolaire (LBA), la muqueuse et l'épithélium bronchiques, ainsi que dans les macrophages alvéolaires de patients avec BPCO, comparativement à des sujets fumeurs et non-fumeurs. HMGBl dans le LBA corrèle significativement avec le degré de l'obstruction bronchique et de l'emphysème et avec le taux de nombreux médiateurs pro-inflammatoires qui participent à la pathogenèse de la BPCO. Dans tous ces types cellulaires, HMGBl est présente à la fois dans le noyau et le cytoplasme, suggérant que sa sécrétion extracellulaire pourrait expliquer l'augmentation de ses taux dans le LBA. L'expression de RAGE est également majorée dans l'épithélium et le muscle lisse de patients avec BPCO et elle coïncide avec celle d'HMGBl, suggérant l'existence d'interactions autocrines et paracrines entre ces deux protéines. Nous avons également mis en évidence la présence de complexes HMGBl/IL-lp, dans le LBA et les macrophages alvéolaires des patients BPCO. Ces complexes sont fonctionnels car ils potentialisent la synthèse de TNF-a. Enfin, dans des expériences préliminaires, nous avons montré que HMGB1 ralentit la régénération épithéliale in vitro, contribuant ainsi au remodelage tissulaire. En conclusion, les données présentées dans cette thèse suggèrent que le blocage de la voie HMGBl/RAGE représente une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de la BPCO
COPD is characterized by airway inflammation and remodeling. HMGBl, a nuclear protein that is released during inflammation and repair, interacts with pro-inflammatory cytokines and with its receptor, RAGE, which is highly expressed in the lung. In the present study, we have shown higher levels of HMGB 1 in bronchoalveolar lavage (BAL) from smokers with COPD, as compared to smokers and never smokers, and similar differences wer observed in epithelial cells and alveolar macrophages. BAL HMGBl correlated positively with the levels of pro-inflammatory mediators in BAI including IL-1D, and with the degree of airflow obstruction and emphysema. HMGBl-IL-1D D complexes were found in BAL supernatant and alveolar macrophages from smokers and COPD patients, as well as in the human macrophage cell line, THP-1, where they enhanced the synthesis of TNF-C RAGE was overexpressed in the airway epithelium and smooth muscle of COPD patients and it co-localized with HMGBl. Finally, in preliminary experiments we demonstrated that HMGBl delays epithelium repair in an in vitro model of mechanical wound injury using human bronchial epithelial cells growth in a air-liquid interface conditions. We conclude that elevated HMGBl expression in COPD airways may sustain inflammation through i interaction with IL-1D and RAGE and may contribute to airway remodeling by interfering with the normal epithelial repair process. Therefore strategies aimed at inhibiting the expression of HMGBl and RAGE or at blocking their interaction in target cells would be of therapeutic value f( attenuating lung remodelling and the accompanying respiratory functional deterioration in COPD

Mise en contexte: Le syndrome d'aspiration méconiale (SAM) sévère est une détresse respiratoire causée par l'inhalation de liquide amniotique teinté de méconium. Les nouveau-nés atteints d'un SAM sévère nécessitent souvent un support ventilatoire invasif qui mène à un haut taux de morbidité et de mortalité. La ventilation liquidienne totale (VLT) est considérée comme une avenue thérapeutique prometteuse de lavage bronchoalvéolaire (LBA) effectué avec un perfluorocarbone dans le cas d'un SAM sévère. L'équipe Inolivent a développé récemment un 4 e prototype de ventilateur liquidien total (Inolivent 4) conçu pour des applications pédiatriques qui fait l'objet d'études expérimentales. Objectif: Les objectifs de cette maîtrise étaient de valider le ventilateur liquidien, d'optimiser les paramètres ventilatoires de la VLT, de mettre au point un modèle néonatal ovin de SAM ainsi que de caractériser l'efficacité et la tolérance d'un VLT-LBA en comparaison avec un lavage bronchoalvéolaire contenant une dilution de surfactant exogène (S-LBA) dans ce même modèle. Notre hypothèse est que le VLT-LBA sera mieux toléré et plus efficace qu'un S-LBA dans le cas d'un SAM sévère. Matériel et méthode: La validation du prototype 4 a été effectuée avec cinq agneaux à poumons sains et plusieurs paramètres ont été testés de façon à optimiser la ventilation. Ensuite, sept agneaux ont servis à développer le modèle pathologique de SAM. Étude animale randomisée contrôlée approuvée par notre comité d'éthique institutionnel. Une fois anesthésiés et paralysés, 20 agneaux nouveau-nés ont subis une chirurgie visant le monitorage des gaz du sang (GDS) et les paramètres hémodynamiques par thermodilution (Pulsion medical system, Ger). Un SAM sévère fut alors induit à l'aide de l'instillation de 2 aliquotes de 1mL/kg d'une dilution à 25% de méconium humain dans le salin. Les agneaux ont ensuite été randomisés dans deux groupes : VLT-LBA (n=10) à une ventilation minute de 160 mL/kg/min avec le PFDEC (Perfluorodecalin; F2Chemicals, UK) et S-LBA (n=10) ventilé conventionnellement en administrant deux LBA de 15 mL/kg contenant 5mg/mL de surfactant (BLES biochemicals Inc., Canada). Les deux groupes furent ventilés pour un total de 4 heures suivant la randomisation. Résultats: Le VLT-LBA permet une PaO[indice inférieur 2] significativement supérieure au S-LBA tout au long de l'expérimentation. Les valeurs de PaCO[indice inférieur 2], de pH ainsi que les paramètres hémodynamiques sont comparables pour les deux groupes à l'exception d'une augmentation de la pression artérielle pulmonaire moyenne (PaPm) durant la VLT. Le VLT-LBA permet le lavage de 43.14% du méconium instillé alors qu'avec le S-LBA on en retire 28.10% (p < 0,022). L'analyse histologique des coupes de poumons n'a montré aucune différence entre les scores totaux. Conclusion: Le VLT-LBA est bien toléré et est plus efficace que le S-LBA dans ce model expérimental ovin de SAM sévère. Les niveaux surélevés de PaPm durant la VLT nécessite d'être investigués. Cette expérimentation ouvre la voie à une éventuelle étude clinique avec le VLT-LBA comme traitement d'un SAM sévère.

La maladie inflammatoire des voies respiratoires profondes (MIVRP) et l’hémorragie pulmonaire induite à l’exercice (HPIE) sont des causes fréquentes de contre-performance chez les chevaux. Le lavage bronchoalvéolaire (LBA) est un outil diagnostique sensible ; cependant, les multiples possibilités de réalisation ont un impact incertain sur l’interprétation, et les valeurs seuils de pourcentages cellulaires ne sont pas consensuelles. Les objectifs du projet étaient de 1. Déterminer l’influence de la méthodologie du LBA et des critères diagnostiques utilisés sur les profils cytologiques et le diagnostic posé, 2. Déterminer la prévalence, l’association avec les performances et l’incidence de l’HPIE et la MIVRP sur une population de Trotteurs Français à l’entraînement. Deux études prospectives (138 et 30 chevaux) et une étude longitudinale (15 chevaux) ont été réalisées. Le volume instillé pour le LBA influe significativement sur les proportions de neutrophiles. Les profils cytologiques (MIVRP et HPIE) ne sont pas équivalents entre les poumons et des seuils restreints pour la MIVRP augmentent le risque d’erreur diagnostique si un seul poumon est prélevé. Une valeur seuil pour le dianostique cytologique d’HPIE a également été validée. La prévalence de l’HPIE est de 37% et n’a pas d’impact sur les performances dans la population étudiée. La MIVRP concerne 57 à 94 % des chevaux selon les seuils cytologiques utilisés, avec un taux de neutrophiles >10% significativement augmenté au cours de la saison, contrairement à celle de la MIVRP, justifiant la pertinence du suivi longitudinal.

L'analyse des nanoparticules dans les échantillons cliniques est une entreprise scientifique redoutable puisqu'il n'existe pas de procédures capables de faire face à la complexité des matrices biologiques. L'hypothèse centrale de ce travail est que la présence accrue de nanoparticules d'oxyde de métal et de métal dans le lavage pulmonaire et les fluides reproducteurs peut être associée à une maladie pulmonaire interstitielle idiopathique et à une baisse de la fertilité féminine et masculine, respectivement. Les procédures d'extraction développées dans le cadre de cette thèse ont permis de mesurer la distribution de la taille hydrodynamique des nanoparticules d'or par DLS et leur quantification par ICP-OES. En raison des rendements d'extraction obtenus et de la ségrégation réussie du bruit biologique, les nanoparticules d'or extraites pourraient être observées de manière représentative à l'échelle nanométrique. Plus précisément, l'ESB pourrait détecter les noyaux denses de particules d'or à faible grossissement, et MET et MEB pourraient être utilisés pour résoudre le diamètre et la morphologie des feret des particules, respectivement. Enfin, la corona biomoleculaire dure de la nanoparticule d'or extraite à partir de lavages pulmonaires pourrait être sondée avec AFM, AES et XPS pour acquérir des informations sur sa morphologie, composition élémentaire et chimie, respectivement. L'application de méthodologies développées sur les patients n'a pas renvoyé de données analytiques qui pourraient associer de manière positive et significative une teneur élevée en particules avec une probabilité accrue de maladies pulmonaire interstitielle idiopathiques ou avec oligospermie
The quantitative and qualitative analysis of nanoparticles in human biological samples is a daunting scientific endeavour as there are no technical procedures capable to cope with the complexity of biological matrices. The central hypothesis of this work is that the increased presence of metal and metal oxide nanoparticles in pulmonary lavage and reproductive fluids may be associated with idiopathic interstitial lung disease and declining female and male fertility, respectively. The developed extraction procedures in the context of this thesis allowed the measuring of the the hydrodynamic size distribution of gold nanoparticles by DLS and their quantitation my means of ICP-OES. Due to the achieved extraction yields and the successful segregation of biological noise, extracted gold nanoparticles could be representatively observed at the nanoscale. Specifically, BSE could detect the dense gold particle cores at low magnification, and TEM and FESEM could be used to resolve the particles’ Feret diameter and morphology, respectively. Finally, the hard biomolecular corona of extracted gold nanoparticle from pulmonary lavages could be probed with AFM, AES, and XPS to acquire information on its morphology, elemental composition, and chemistry, respectively. The application of developed methodologies on patients did not return analytical data that could positively and significantly associate an elevated particle content with increased odds of idiopathic diseases or with low sperm count

Le développement d’une nouvelle sonde dite « activity-based probe » pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d’un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu’avec cette nouvelle sonde qu’il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l’ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l’analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l’analyse de carotides humaines de patients souffrant d’athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l’avenir de tester d’autres fluides pathologiques d’origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies
A new activity-based probe able to covalently modify the active site of proteases belonging to the matrix metalloprotease family (MMPs) has been developed in this thesis project. The probe was shown to behave as potent inhibitor of several MMPs, with nanomolar Ki values. This probe was also able to modify specifically only the free active site of MMPs, with particular high yields of cross-linking varying from 50 % to 11 %, depending of the MMPs tested. Using radioactivity as means of detection, this probe was able to detect active form of MMPs with a threshold of 1 femtomole. Applied to the study of bronchoalvelolar fluids (BAL) from mice exposed to nanoparticles by a lung aspiration protocol, this probe revealed the presence of the catalytic domain of MMP-12 under its active form, but not in control animals. When used to detect active form of MMPs from extracts obtained from human arteries of patient suffering from atherosclerosis, the probe was not able to detect such MMP active forms. Despite this negative result, the detection of active form of MMP in pathological fluid like BAL has never been reported before this work. Having validated this novel MMP activity-based probe, it will be possible to use it now for detecting MMPs from other pathological fluids or tissues extracts in which MMPs can be good markers of the pathology

Dans ce travail de thèse, l'efficacité de la voie intrapulmonaire et les paramètres biopharmaceutiques influençant la diffusion pulmonaire après nébulisation d'antibiotiques ont été évalués. La présence et l'impact de certaines pompes d'efflux dans un modèle in vitro de cellules primaires épithéliales pulmonaires de rat ont été testés. Trois fluoroquinolones et la colistine ont été utilisées comme molécules de référence. La combinaison des molécules testées a permis d'obtenir une vue d'ensemble des caractéristiques de diffusion intrapulmonaire des antibiotiques. L'étude in vivo avec les fluoroquinolones a démontré que les concentrations pulmonaires de ces molécules sont plus importantes que dans le plasma, probablement dû à la présence des transporteurs comme la glycoprotéine-P. La présence de ces transporteurs a été confirmée dans le modèle de cellules pulmonaires de rats. L'étude in vivo avec la colistine a montré qu'une lente diffusion pourrait conférer un avantage à la nébulisation par rapport à l'administration intraveineuse. En conclusion, l'administration par nébulisation des molécules, qui traversent les tissus lentement (colistine), pourrait être avantageuse, alors que pour d'autres, qui traversent vite la barrière (fluoroquinolones), la voie nébulisée pourrait ne pas présenter des avantages par rapport à la voie intraveineuse. De plus, les résultats ont démontré qu'une faible perméabilité à travers le poumon (colistine) pourrait donner un avantage à la nébulisation des antibiotiques, tandis qu'une affinité pour des transporteurs (fluoroquinolones) semble présenter un intérêt aussi bien dans le cadre d'une nébulisation que d'une administration intraveineuse
The aim of this study was to investigate the efficiency of intrapulmonary administration and the biopharmaceutical parameters regulating the pulmonary diffusion following nebulization. We examined whether certain efflux pumps were present in an in vitro model of rat lung cells and whether these efflux pumps could be beneficial by increasing lung concentrations in vivo. Fluoroquinolones and colistin were the molecules used as reference. These different molecules allowed an overview of the intrapulmonary diffusion characteristics of antibiotics. The in vivo study with fluoroquinolones showed that their lung concentrations are higher than in plasma, probably due to glycoprotein-P. The presence of this efflux pump was confirmed in the model with rat lung cells. The in vivo study with colistin showed that a slow diffusion may confer an advantage for nebulization over intravenous administration. In conclusion, the nebulization molecules passing slowly (colistin) across the tissues may be advantageous, whereas for others, with a fast passage across the barrier (fluoroquinolones), the pulmonary route may not provide an advantage over the intravenous administration. Moreover, the results showed that a slow permeability across the lung (colistin) may confer an advantage for the antibiotic nebulization, while affinity by transporters (fluoroquinolones) is beneficial for both nebulization and intravenous administration

Le développement d'une nouvelle sonde dite " activity-based probe " pour réaliser la détection de formes actives de protéases appartenant à la famille des protéases à zinc de la matrice (MMP) a été réalisé dans ce travail, en partant d'un inhibiteur phosphinique puissant des MMP dans lequel a été introduit un groupement photoactivable de type diazérine. Ce composé se révèle un inhibiteur puissant de plusieurs MMP avec des affinités nanomolaires. Ce composé incubé avec différentes MMP est par ailleurs capables de modifier de façon covalente un grand nombre de MMP au niveau de leur site actif, avec des rendements de modification variant de plus de 50% à 11%, selon la nature des MMP. En ayant choisi comme moyen de détection la radioactivité, nous démontrons qu'avec cette nouvelle sonde qu'il est possible de détecter des formes actives de MMP avec des sensibilités de l'ordre de la femtomole dans des systèmes modèles de protéomes complexes. Appliquée à l'analyse de lavages broncho alvéolaires de souris traitées par voie pulmonaire avec des nanoparticules pour induire une réponse inflammatoire, cette nouvelle sonde permet de mettre en évidence la présence de formes actives du domaine catalytique de la MMP-12, une métalloprotéase à zinc exprimée par les macrophages, mais pas dans les animaux contrôles. En revanche l'analyse de carotides humaines de patients souffrant d'athérosclérose ne nous pas conduit avec cette sonde à la détection de formes actives de MMP. Malgré ce résultat, il est à noter que la détection de forme active de MMP dans un fluide pathologique est une première dans ce domaine. Cette sonde étant validée pour sa capacité à détecter des formes actives de MMP, elle permettra dans l'avenir de tester d'autres fluides pathologiques d'origine humaine ou bien des extraits de tissu comme des tumeurs pour lesquels les MMP pourraient être des marqueurs de ces pathologies.

La pollution de l’atmosphère, qu’elle soit d’origine anthropique ou naturelle, est décrite comme un des facteurs de risque majeurs pour la santé de l’homme. Une grande partie de cette pollution est due à la présence dans l’air des particules fines (PM2. 5). L’objectif de notre projet de recherche a consisté à déterminer la toxicité pulmonaire d’aérosols atmosphériques particulaires (PM2. 5) collectés à Dunkerque en termes d’activation métabolique, de génotoxicité et d’altérations du cycle cellulaire dans deux modèles de cellules : des cellules embryonnaires d’épithélium pulmonaire humain (L132) et des Macrophages Alvéolaires (MA) humains isolés à partir de lavages bronchiolo-alvéolaires réalisés chez des patients sains. En outre, un modèle de co-culture de ces deux types cellulaires a été développé afin de mieux intégrer l’hétérogénéité cellulaire des alvéoles pulmonaires. Les particules atmosphériques se sont avérées capables d’induire l’expression des différentes enzymes de la phase I et II de métabolisation (CYP1A1, CYP2E1, CYP2F1, EHm, NQO1, GSTµ1 et GSTµ3) dans les MA en mono- et co-culture et dans les cellules L132, principalement en mono-culture. Nos résultats ont montré l’effet génotoxique des aérosols via la formation d’adduits encombrants à l’ADN dans les MA en mono- et co-culture ainsi que dans les cellules L132 en co-culture, contrairement aux cellules L132 en mono-culture. Par ailleurs, une perte d’hétérozygotie et/ou une instabilité de certains microsatellites situés sur le chromosome 3p ont été observées dans 30 à 40 % des L132 en mono-culture après 72 heures d’exposition aux PM2. 5 provoquant des altérations significatives du cycle cellulaire, et notamment de la voie de signalisation P53/RB. Ce travail a, par conséquent, contribué à l’amélioration des connaissances quant à l’impact pulmonaire des expositions environnementales à la pollution atmosphérique particulaire de proximité. Cependant, le chantier des mécanismes d’action des polluants atmosphériques sur le système respiratoire reste ouvert et devrait être complété
Whether it is from anthropogenic or natural origin, air pollution is described as one of the major risk factors affecting the human health. Fine Particulate Matter (PM2. 5) is the main responsable to this atmospheric pollution. The objective of our research project consisted to determine the toxicity of the PM2. 5 collected in Dunkerque in terms of metabolic activation, genotoxicity, and cell cycle alterations, in two cell models : a human embryonic lung epithelial cell line (L132) and human Alveolar Macrophages (AM) isolated from broncho-alveolar lavages within healthy outpatients. Therefore, we developed a co-culture model using these two cell types in order to better integrate the cell heterogeneity of the alveoli. The atmospheric particles proved to be able to induce the gene expression of various phase I and phase II metabolism enzymes (CYP1A1, CYP2E1, CYP2F1, EHm, NQO1, GSTµ1 et GSTµ3) in human MA in both mon and co-culture and in L132 cells, only in monoculture. Our results showed also the genotoxicity of the aerosol through the formation of the DNA bulky adducts in human MA in mono and co-culture as well as in L132 cells in co-culture. In contrast, no DNA bulky adduct was reported in L132 cells in monoculture. In addition, a Loss of Heterozygosity (LOH) and/or a MicroSatellite Instability (MSI) of some microsatellites located on the short-arm of the chromosome 3 were observed in 30 to 40% of L132 cells in monoculture 72 hours after their exposure to PM2. 5. As a consequence, significant alterations of the gene expression and/or protein concentration of some of the key protein controllers involved in the TP53-RB gene signaling pathway were reported in the two cell models, in mono-cultures or in co-cultures. This work consequently contributed to the improvment of the knowledge about the adverse lung effects of environmental exposure. However, the better understanding of the underlying mechanisms of action involved in the toxicity of the atmospheric pollutants on the respiratory system still remains opened and should be completed

Les processus d’interaction solide-liquide régulent les mécanismes qui régissent la disponibilité des oligo-éléments en phase liquide. Dans cet article, ces processus ont été étudiés grâce à l'utilisation des éléments de terres rares (REE), car ils sont d'excellents traceurs des processus géochimiques. Le but de la première partie de ce travail était d'étudier la réactivité des particules volcaniques lors de l'interaction avec l'eau de la mer synthétique. Les résultats montrent que en dehors de la dissolution, qui est le processus principal, un procédé d'adsorption de surface se produit également, probablement sur la surface des cristaux nouvellement formé. La présence supposée de ces minéraux est suggéré par la variation temporelle de l'Y/Ho, des observations SEM et analyse XRD. Enfin, l'ajout des ligand dissous ne pas augmenter le taux de dissolution des particules volcaniques, mais modifiant la distribution de REE en phase liquide. Dans la deuxième partie de ce travail, l'étude des terres rares a été appliquée à un système humain. Ces éléments ont été utilisés, en fait, d'enquêter sur les fluides du poumon (BAL) chez les personnes exposées aux retombées de cendres volcaniques. Le résultat suggère que la co-précipitation du YLn-phosphates se produisent dans les poumons, à la suite de l'inhalation de particules volcaniques. Ce processus est confirmé par des simulations thermodynamiques et cinétiques indiquant que la cristallisation de YLn-phosphates et d'autres phases authigènes apparaît comme la conséquence de la dissolution de la fraction solubles de cendres
The solid-liquid interaction processes regulate the mechanisms governing the availability of trace elements in liquid phase. In this paper, these processes have been studied through the use of the Rare Earth Elements (REE) since they are excellent tracers of geochemical processes. The purpose of the first part of this work was to study the reactivity of volcanic particulates during the interaction with synthetic seawater. The results show that apart from the dissolution, which is the main process, a surface adsorption process also occurs, probably on the surface of newly formed crystals. The supposed presence of these minerals is suggested by the temporal variation of the Y/Ho ratio, by SEM observations and XRD analysis. Finally the addition of ligand species to dissolved media does not increase dissolution rate of volcanic particles but modify the YLn distribution in liquid phase. In the second part of this work, the Rare Earth study was applied to a human system. These elements were used, in fact, to investigate the effects due to the interactions between the inhaled atmospheric particulate matter and the lung fluids (BAL), in people exposed to fallout of volcanic ash. The results suggest that YLn-phosphate co-precipitation occurs in lungs as a consequence of inhalation of volcanic particles and their interactions with lung fluids. This process is confirmed by thermodynamic and kinetic simulations indicating that crystallisation of YLn-phosphates and other authigenic phases occurs as a consequence of the soluble ash fraction dissolution. The combination of YLn fractionation in bronchial fluids can represent a potential tracer of exposure to atmospheric fallout

Récemment, les microbiotes pulmonaires bactériens d’un nombre très limité de patients atteints de mucoviscidose et de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) ont été étudiés en utilisant l'amplification du gène 16S rDNA bactérien suivie par la construction de librairies de clones et différentes approches de séquençage. Ces études ont montré que la population microbienne de patients atteints de maladies respiratoires était plus diversifiée que prévue. Dans l'étude actuelle, nous utilisons une approche comparable pour identifier exhaustivement les agents pathogènes (bactéries, virus, et champignons) composant le microbiote pulmonaire associé aux pneumopathies développées en unités de réanimation. L'étude a inclus des patients admis en réanimation et présentant des formes de pneumopathies acquises sous ventilation mécanique (n = 106), de pneumopathies communautaires (n = 32), de pneumopathies nosocomiales sans ventilation mécanique (n = 22) et de pneumopathies d’aspiration (n = 25). Une cohorte de 25 patients admis en réanimation et ne présentant pas de symptômes de pneumopathie a été étudiée comme contrôle. Cette première partie du travail amènera ainsi à réaliser un catalogue exhaustif des agents de pneumopathies nosocomiales ; à connaître la prévalence des agents identifiés et d’identifier les co-infections fréquemment observées, et surtout à vérifier si ces agents peuvent être identifiés ou pas dans les prélèvements respiratoires profonds de patients non symptomatiques. Pour réaliser cette partie du travail, des séries de prélèvements, incluant des prélèvements de lavage broncho-alvéolaire (LBA), des prélèvements de sang et d'urine ont été étudiés. Ces prélèvements ont été testés par des moyens d’identification moléculaire moderne basés sur l’amplification de gènes conservés (gènes16S rDNA des bactéries et gène 18S rDNA des champignons) suivie par clonage et séquençage à grande échelle. D’autres pathogènes atypiques sont ciblés par des tests de PCR avec utilisation d’amorces spécifiques. Nous avons également inclus la culture, la co-culture d’amibes, la détection sérologique d'anticorps dirigés contre des agents sélectionnés et des tests d'antigène urinaire, afin de comparer ces tests de routine aux approches moléculaires. Comme résultats, les tests moléculaires nous ont permis d’identifier un vaste répertoire de 160 espèces bactériennes dont 73 n'ont jamais été précédemment rapportées à l’étiologie des pneumopathies. En outre, nous avons trouvé 37 phylotypes bactériens potentiellement nouveaux. Nous avons également identifié 24 espèces de champignons dont 6 n'ont pas été précédemment rapportées à l’étiologie des pneumopathies, 7 virus et étonnamment 6 espèces de plantes. De plus, certains agents pathogènes considérés comme typiques aux pneumopathies nosocomiales tels que Pseudomonas aeruginosa et des Streptococci ont été détectés chez les contrôles comme chez les patients. Cet étonnant résultat souligne l'existence d'un noyau de microbiote pulmonaire.Dans un deuxième travail, faisant suite aux travaux effectués dans notre laboratoire et qui ont pu mettre en évidence que 19% des pneumopathies nosocomiales étaient déterminées par des microorganismes associés aux amibes (MAAs) de l’eau préalablement ignorés ou négligés, nous avons utilisé un test d'immunofluorescence multiplexe pour tester la prévalence des anticorps contre les MAAs dans le sang de patients admis en réanimation et atteints de pneumopathies et la comparer à la prévalence au moment de l'admission. Comme résultat, nous démontrons que certains MAAs peuvent être plus fréquemment détectés après des épisodes de pneumopathies nosocomiales que lors de l’admission. En outre, la réponse immunitaire aux MAAs semble augmenter lorsque le séjour en réanimation est prolongé. Enfin, nous avons mis au point une stratégie de metagénomique pour tester les prélévements pour lesquels aucune étiologie n’a été retrouvée. [...]
Recently, bacterial microbiota from a limited number of patients with cystic fibrosis and ventilator-associated pneumonia (VAP) was studied using 16S rDNA gene amplification followed by clone libraries construction and sequencing. These studies have showed that the microbial population of patients with respiratory infections was more diverse than expected. In the current study, we use a similar approach to identify exhaustively the pathogens (bacteria, viruses, and fungi) comprising the microbiota associated with episodes of pneumonia developed in the intensive care units (ICU). Our study included patients admitted to ICUswith with episodes of ventilator-associated pneumonia (n = 106), community-acquired pneumonia (n = 32), nosocomial pneumonia without mechanical ventilation (n = 22) and aspiration pneumonia (n = 25). A cohort of 25 patients admitted to ICUs without symptoms of pneumonia were studied as controls. This first part of the work enables to prepare an exhaustive repertoire of nosocomial pneumonia pathogenes; to know the prevalence of the pathogens identified and to identify co-infections frequently observed, and especially to ascertain whether these agents can be identified or not in the respiratory samples of patients without symptoms of pneumonia. To perform this part of work, series of samples, including bronchoalveolar lavage (BAL) samples, blood samples and urine samples were collected. These samples were tested by means of modern molecular tools based on the amplification of conserved genes (bacterial 16S rDNA and fungal 18S rDNA genes), followed by highthroutput cloning and sequencing. The atypical pathogens are targeted by PCR tests using specific primers and probes. We also included culture, amoeba co-culture, serological detection of antibodies against selected agents and urinary antigen testing, to compare these routine tests to molecular approaches. Based on molecular testing, we identified a wide repertoire of 160 bacterial species of which 73 were never previously reported in pneumonia samples. Moreover, we found 37 putative new bacterial phylotypes. We also identified 24 fungal species of which 6 have not been previously reported in pneumonia, 7 viruses and surprisingly 6 plant species. Some pathogens considered being typical for ICU pneumonia such as Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus species may be detected as commonly in controls as in pneumonia patients which strikingly highlight the existence of a core of pulmonary microbiota.In a second work, following previous works performed in our laboratory which were able to show that 19% of nosocomial pneumonia were determined by micro-organisms associated to amoebae (AAMs) previously ignored or neglected, we used a recent test based on multiplex serology to test for the prevalence of antibodies against the AAMs in the blood of patients admitted to ICU and developed episodes of pneumonia and compare it to the prevalence at the time of admission (controls). As a result, we demonstrate that some AAMs may be more frequently detected after episodes of nosocomial pneumonia than at the admission. In addition, the immune response to AAMS appears to increase when the ICU stay is prolonged.Finally, in order to explore samples for which no microbial aetiology was found, we have developed a subtractive hybridization metagenomic strategy and tested it on different clinical samples. The sensitivity of this strategy was also evaluated. We have demonstrated that our method, based on the detection of DNA and RNA of microorganisms in a single test, allows sensitive detection of different types of microorganisms