Academic literature on the topic 'Les dommages à l'ADN'

L’ubiquitylation est une modification post-transcriptionelle qui est nécessaire pour la dégradation des protéines mais aussi pour la régulation et la localisation de nombreux facteurs. Un grand nombre de protéines impliquées dans la réplication de l’ADN et dans la réponse aux lésions de l’ADN sont ubiquitylées. L’ubiquitylation durant la réponse aux dommages de l’ADN dépend de l’enzyme d’activation de l’ubiquitine UBA1 qui est située au sommet de la cascade d’ubiquitination. Durant ma thèse, j’ai mis à jour le mécanisme de recrutement d’UBA1 au niveau de l’ADN endommagé ainsi qu’un rôle majeur de l’ubiquitylation dans la voie de signalisation ATR.A l’aide d’une approche in vitro qui mime la voie de signalisation ATR, j’ai montré qu’UBA1 est recrutée au niveau de molécules d’ADN linéaire et qu’elle est nécessaire à l’ubiquitylation des protéines recrutées sur ce substrat. J’ai également découvert que l’ubiquitylation et le recrutement d’UBA1 in vitro sont dépendants de la kinase DNA-PKcs et de la poly(ADP-ribose) polymérase PARP1, deux senseurs majeurs des lésions de l’ADN. Il apparait que PARP1 régule le recrutement d’UBA1 via la formation de chaines de poly(ADP)-ribose (PAR). De plus, j’ai montré qu’UBA1 est capable de se lier aux chaines PAR. J’ai identifié la région d’UBA1 capable d’interagir avec les chaines PAR : il apparait que cette région est désorganisée et riche en acide aminés hydrophobes. La comparaison de la protéine UBA1 de levure et la protéine UBA6 humaine qui ne lient pas PAR nous a permis d’identifier les acides aminées hydrophobes nécessaires pour la lésion à PAR.J’ai aussi démontré qu’UBA1 est nécessaire pour la réponse aux lésions de l’ADN. En effet, l’inhibition ou la déplétion d’UBA1 conduit à une perte de la phosphorylation de Chk1 dans notre système in vitro. De même, le traitement avec des molécules induisant des lésions de l’ADN telles que le CPT, le MMS et la bléocine conduit à une phosphorylation moindre de Chk1 lorsqu’UBA1 est inhibée. Afin de démontrer que la liaison d’UBA1 aux chaines PAR est cruciale pour la réponse aux dommages, j’ai mis en place un système in vivo permettant d’exprimer des mutants d’UBA1 incapable de lier les chaines PAR.Globalement mes résultats indiquent qu’UBA1 est recrutée au niveau de l’ADN endommagé à l’aide de PARP1 et DNA-PKcs. Plus précisément, il apparait que la liaison avec les chaines PAR et l’ubiquitylation de protéines spécifiques est nécessaire pour la mise en place de la voie de signalisation ATR. L’importance d’UBA1 dans le processus est soulignée par le fait que son inhibition ou son inactivation conduit à une phosphorylation moindre de Chk1. Il est raisonnable de penser que des inhibiteurs d’UBA1 puissent être utilisés pour cibler la voie ATR dans les cellules cancéreuses. Finalement, cette étude devrait permettre de mieux comprendre comment les interactions entre les processus d’ubiquitylation et de PARylation permettent de réguler la réponse aux dommages<br>Ubiquitylation is an important posttranslational modification that is necessary for protein degradation as well as for the regulation and the localization of many cellular factors. A number of proteins implicated in DNA replication and DNA damage response are ubiquitylated. Ubiquitylation during the DNA damage response is selectively dependent on the ubiquitin-activating enzyme UBA1, which functions at the apex of the ubiquitylation cascade. In this thesis, I describe the mechanism of UBA1 recruited at damaged sites and uncover the role of ubiquitylation in ATR signaling.Using a cell free system developed in the lab that recapitulates ATR kinase-signaling pathway, I present evidence that, UBA1 is recruited to linear DNA substrates and mediate ubiquitylation of DNA-bound proteins. I found that protein ubiquitylation and the recruitment of UBA1 to DNA in cell-free extracts was dependent on the kinase DNA-PKcs and on the poly ADP-ribose polymerase PARP1, two sensors of DNA lesions. PARP1 regulates UBA1 recruitment in large part through poly (ADP)-ribose (PAR) chain formation. UBA1 exhibited affinity for PARP1 and for PAR chains. Furthermore, we have identified minimal region on UBA1 which is prominently hydrophobic and disordered region of UBA1 which are required for its PAR binding activity. Through comparison with yeast UBA1 and human UBA6 which failed to bind with PAR chains, we identified hydrophobic amino acid residues which are critical for PAR binding.I also show evidence that UBA1 is required for efficient DNA damage signaling. In a cell free system, chemical inhibition or siRNA depletion of UBA1 led to the loss of ChK1 phosphorylation, suggesting that UBA1 activity is required for efficient DNA damage response. Consistent with these observations, when cells were treated with DNA lesion inducing drugs like CPT, MMS and Bleocin, we observed less efficient Chk1 phosphorylation. I have developed UBA1 replacement system to demonstrate functional significance of mutation in PAR binding residues of UBA in DNA damage response.Collectively, these results indicate that UBA1 is recruited to DNA damaged sites in a DNA-PKcs and PARP1 dependent-manner, in a larger part through its interaction with PAR chains and that protein ubiquitylation on DNA damages is necessary for the assembly of a productive ATR signaling complex. The importance of role of UBA1 in DNA damage response is underscored by the finding that UBA1 inhibition leads to inefficient Chk1 phosphorylation which is required for efficient DNA damage response. Thus, UBA1 inhibitors could be used to target ATR signaling in cancer cells. This study should eventually lead us to provide more insights on how cell maintains genome integrity through crosstalk between posttranslational modifications including ubiquitylation and PARylation

Des connexions entre la réponse aux dommages à l'ADN et le métabolisme de l'ARN ont récemment été mises en évidence. Mon équipe a identifié une protéine de liaison à l'ARN, SAF-A/hnRNP U, comme un substrat de la DNA-PK, kinase clé de la réparation des cassures double-brin de l'ADN. J'ai étudié l'implication de SAF-A dans la réponse aux dommages de l'ADN. Après micro-irradiation laser, SAF-A-GFP est recrutée transitoirement sur le site de dommage avant d'en être exclue. Ces deux phases sont indépendantes. Le recrutement de SAF-A dépend de PARP, tandis que son exclusion dépend d'ATM, d'ATR et de la DNA-PK. Le domaine de liaison à l'ARN de SAF-A reproduit la dynamique de SAF-A. Ce domaine interagit majoritairement avec des protéines de liaison à l'ARN, dont FUS et TAF15, qui présentent une dynamique similaire. L'inhibition de la transcription abolit la phase d'exclusion de SAF-A, suggérant que l'exclusion concerne la fraction de SAF-A engagée dans la transcription. Des conditions anormales de transcription conduisent à la formation d'hybrides ARN:ADN (R-loop). Pour les détecter, nous avons construit une lignée cellulaire exprimant une RNAseHI fusionnée à la mCherry et inactive (RmC), mais qui peut se lier aux R-loops. Après micro-irradiation laser, la RmC est recrutée sur l'ADN endommagé. Lorsque l'exclusion de SAF-A est bloquée, le recrutement de la RmC est prolongé. La surexpression de la RNAseHI mutée compromet la survie cellulaire après irradiation aux rayons X. Ces résultats mettent en évidence l'exclusion des protéines de liaison à l'ARN comme la conséquence d'un mécanisme de résolution des R-loops se formant suite aux dommages de l'ADN dans les régions transcrites<br>An expanding aspect of the DNA Damage Response (DDR) is its connexion with RNA metabolism. My team has identified the RNA-binding protein SAF-A/hnRNP U as a substrate for DNA-PK, the key kinase in DNA double-strand breaks repair. I have investigated SAF-A involvement in the DDR. After laser microirradiation, SAF-A-GFP dynamics exhibited a two phases profile with a first transient recruitment in the damaged nuclear area followed by a prolonged exclusion. The two phases were uncoupled. SAF-A recruitment was PARP-dependent, while its exclusion relied on ATM, ATR and DNA-PK. SAF-A RNA-binding domain recapitulated SAF-A dynamics after DNA damage. Mass-spectrometry analysis using this domain as a bait identified mostly RNA-binding partners, at least two of them (FUS and TAF15) exhibited similar dynamics. Upon transcription inhibition, SAF-A exclusion was abolished, supporting that it concerns the pool of SAF-A engaged in RNA metabolism. Given that abnormal transcription conditions have been shown to promote RNA:DNA hybrids formation (R-loop), we constructed a cell line expressing a catalytically inactive mCherry-tagged RNAseHI (RmC), which retains its ability to bind R-loop. RmC recruitment to the laser damage site was abolished upon transcription inhibition. When SAF-A exclusion was blocked, RmC exhibited a prolonged recruitment, supporting that SAF-A release is a readout of R-loops resolution post-DNA damage. Finally, overexpressing this mutated RNAseHI negatively impacted cell survival after X-ray irradiation. These results uncover an anti-R-loop mechanism at DNA damage sites in transcribed areas testified by the post-damage exclusion of RNA-binding proteins from these sites

Tip60 est une histone acétyltransférase qui agit sous forme d'un complexe multiprotéique dans la cellule : le complexe Tip60. Elle est impliquée dans de nombreux processus cellulaires comme la prolifération, l'apoptose et la réponse aux dommages à l'ADN. Concernant ce dernier aspect, nous avons tout d'abord montré l'implication de Tip60 dans la voie du suppresseur de tumeur p53 en réponse aux dommages à l'ADN. Puis, nous avons mis en évidence que Tip60 est requise pour l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire en réponse aux UV, tout en révélant un antagonisme fonctionnel entre Tip60 et p400, une autre sous-unité du complexe Tip60. Enfin, nous avons récemment découvert l'implication de Tip60 dans la recombinaison homologue, une voie de réparation des cassures double-brin. Nous montrons également une interaction entre Tip60 et le complexe MRN, impliqué dans la reconnaissance des lésions. Nos résultats suggèrent que le complexe Tip60/MRN puisse être le complexe responsable de l'activation de la kinase ATM en réponse aux cassures double-brin. L'ensemble de ces travaux ont largement contribué à montrer l'importance cruciale de Tip60 à de multiples niveaux de la réponse aux dommages à l'ADN : signalisation, réparation, arrêt du cycle cellulaire et apoptose<br>Tip60 is a histone acetyltransferase acting as as a multimolecular complex in the cell : the so-called Tip60 complex. It is involved in several cellular processes such as proliferation, apoptosis and DNA damage response. As far as the latter aspect is concerned, we showed that Tip60 is involved in the p53 tumour suppressor pathway in response to DNA damage. Then we showed that Tip60 is required for apoptosis and cell cycle arrest in response to UV irradiation, and revealed a functional antagonism between Tip60 and p400, another subunit of the Tip60 complex. We also recently discovered that Tip60 is involved in homology-driven double-strand break repair. We showed an interaction between Tip60 and the MRN complex which allows the recognition of double-strand breaks in DNA. Our results suggest that the Tip60/MRN complex could be the one responsible for the ATM kinase activation in response to double-strand breaks. Altogether, our results contributed to show the crucial role of Tip60 at multiple levels of the DNA damage response : damage signaling, DNA repair, cell cycle arrest and apoptosis

Les dimères interbrins sont des lésions de type complexe, où les deux brins d'ADN sont pontés de façon covalente. Par conséquent, ce type de lésion est très toxique pour la cellule, car il nuit à la séparation des brins d'ADN nécessaire à des processus cruciaux pour la cellule, comme la réplication et la transcription. De plus, des expériences récentes montrent que la réparation des dimères interbrins passe par la formation d'un bris double brin, une autre lésion avec un potentiel toxique élevé. Ce n'est que tout récemment qu'on a montré que la radiation ionisante menait à la formation de dimères interbrins dans l'ADN cellulaire. On en sait donc encore très peu sur les conditions dans lesquelles se produisent les dimères et comment ils sont réparés. Récemment, à la suite d'une exposition aux radiations ionisantes, notre groupe a mis en évidence la formation de dimères interbrins dans un ADN où une thymidine avait été remplacée par le 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). Ces dimères n'étaient formés que lorsque le BrdU se trouvait au centre d'une zone mésappariée. Puisque c'était la première fois que ce type de dommage était observé lors d'une exposition de l'ADN bromé à la radiation ionisante, ma thèse a porté sur l'exploration de la formation du dimère interbrin, particulièrement sur les conditions qui favorisaient sa formation.Les trois articles présentés dans cette thèse montrent que la forme de l'ADN (forme A vs forme B), la séquence, ainsi que le type de radiation employé ont une influence importante sur le type et la fréquence du dommage produit. Ces résultats montrent qu'on en sait encore très peu sur le mécanisme réel de radiosensibilisation de l'ADN bromé dans les cellules. Cependant, ils mettent aussi en évidence la réactivité distincte des régions rnésappariées de l'ADN, ainsi que leur fort potentiel pour la formation de dimères. Or, ces régions mésappariées ne représentent qu'une fraction des structures secondaires et tertiaires de l'ADN présentes dans la cellule.

Résumé : Lors de l’utilisation de la radiation pour le diagnostic et le traitement du cancer, l’ADN est une cible importante due à son rôle dans la division cellulaire. La radiation y dépose de l’énergie par production abondante (10[indice supérieur 5] e[indice supérieur −]/MeV) d’électrons de basse énergie (EBE) (<50 eV) menant à la production de radicaux et à la dissociation de molécules. Une meilleure compréhension de ces phénomènes physico-chimiques mènera au développement de nouvelles stratégies en radioprotection et en radiothérapie. Il est primordial d’identifier et de quantifier ces dommages initiaux. Suite à des résultats obtenus par des expériences récentes (Li et al., 2010) sur des couches minces d’ADN irradiées par des EBE dans le vide, nous suggérons que certains produits désorbent en quantité significative. Nous proposons une méthode pour mesurer cette perte de matière en utilisant une balance à quartz pour mesurer in situ les changements de masse totale. Ce mémoire présentera la conception et la construction de l’appareil ainsi que les résultats d’irradiation de la thymine et de la thymidine. À 25 ◦ C, le taux de perte de masse spontanée des échantillons joue un rôle important pour les petites molécules comme la thymine (126 uma). L’irradiation augmente d’abord ce taux qui diminue d’un facteur 5 à 15 après une exposition prolongée, signe de modifications notables de l’échantillon. Pour des molécules plus imposantes comme la thymidine (242 uma), il n’y a pas de désorption spontanée et le taux de désorption induite par des électrons de 50 eV est de 0,4 ± 0,1 uma/e[indice supérieur -]. Cette méthode, nécessaire à la calibration d’autres expériences réalisées par HPLC et spectrométrie de masse, permet de compléter la quantificationdes fragments, qui peuvent aussi être l’origine de lésions subséquentes.<br>Abstract : DNA is the principle target of radiotherapy (RT) due to its crucial role in cellular growth and function. Ionizing radiation (IR) delivers its energy into the cell and its nucleus via sequential ionization events that produce many low-energy electrons (LEE)(10[superscript 5]e[superscript −] per MeV) which drive subsequent molecular dissociations and the formation of radicals and other reactive species. Since a better understanding of these mechanisms is needed to develop new strategies for radioprotection and RT, it is essential to identify and to quantify the initial damage induced by IR. Recent chromatographic (HPLC) analysis of short oligonucleotide irradiated with LEE in vacuo (Li et al., 2010) revealed that only ∼30 % of the loss of intact molecules could be explained by the formation of identifiable radiation products. We hypothesize that electron stimulated desorption (ESD) may account for some of the unexplained loss of the missing molecules. Here we propose a new experimental method to quantify this loss using a quartz crystal microbalance to measure in situ the total mass change due to ESD. This thesis describes the design and the construction of the novel apparatus and presents results for LEE irradiated thymine (thy) and thymidine (dT). We find that at 25 ◦ C, the thermal-induced mass loss is important for small molecules such as thy (126 amu). Upon irradiation at 50 eV, the rate of mass loss initially increases, but then decreased by factors between 5 and 15 indicating structural changes occurring at the sample surface. For larger molecules such as dT (242 amu), there is no thermal evaporation at 25 ◦ C and the LEE induced rate of desorption at 50 eV is 0.4 ± 0.1 amu/e[superscript -]. This work is needed to calibrate HPLC and mass spectrometry experiments allowing us to quantify the fragment species produced by LEE that are expected to induce further and biologically significant damage.

Un pontage ADN-protéine se forme lorsqu'une protéine se lie de façon covalente à l'ADN, ce qui a pour conséquence de bloquer certains processus biologiques tels que la réplication, la transcription, la réparation ou la recombinaison. Ces travaux de thèse consistent en l'étude des pontages se produisant lors d'une oxydation à un électron de l'ADN. La guanine possède le potentiel d'ionisation le plus bas parmi les composants de l'ADN; elle est donc facilement oxydée pour former un radical cation, lui-même impliqué dans la formation de nombreuses lésions oxydatives. Des travaux antérieurs ont permis de mettre en évidence la formation d'un adduit entre la guanine et la lysine, résultant de l'oxydation à un électron d'un oligonucléotide TGT en présence d'un peptide trilysine. Le mécanisme de cette réaction est une addition nucléophile de l'acide aminé central par le groupement amine ε, en position C8 du radical cation de la guanine. L'objectif de cette thèse a été de caractériser l'adduit guanine-lysine, de le quantifier dans l'ADN isolé puis dans l'ADN cellulaire, et d'étudier son implication dans la formation des pontages ADN-protéines. Différentes espèces nucléophiles sont capables de s'additionner sur le radical cation de la guanine. Nous nous sommes intéressés au cas des polyamines endogènes, qui sont des cations organiques présents en particulier dans le noyau des cellules. Ces molécules interviennent dans la stabilisation et la condensation de l'ADN, mais elles participent également à de nombreux processus cellulaires. Le lien entre polyamines et cancer a été largement décrit. Cependant le mécanisme par lequel la perturbation de leur métabolisme est impliquée dans le processus cancérogenèse reste à ce jour peu connu.Dans un premier temps, ces lésions ont été synthétisées chimiquement, sous la forme de nucléosides modifiés, afin de les caractériser. Par la suite des méthodes de quantification de ces dommages par chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en tandem ont été développées. Ces méthodes analytiques nous ont permis de démontrer que les adduits guanine-lysine et guanine-polyamines pouvaient se former dans l'ADN isolé suite à une oxydation à un électron. Des pontages entre guanine et lysine ont été mis en évidence dans l'ADN extrait de cellules THP1 irradiées par impulsions laser à 266 nm. Nous avons ensuite développé différents modèles de pontages entre un peptide et un oligonucléotide, afin d'étudier la structure chimique du pontage, et de déterminer si celui-ci pouvait se produire entre la guanine et la lysine. Des adduits guanine-polyamines ont également été détectés dans de l'ADN extrait de spermatozoïdes. Ces résultats ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension du rôle physiologique des polyamines ainsi que de leur implication dans la fertilité masculine<br>A DNA-protein crosslink (DPC) occurs when a protein becomes covalently bound to DNA. This kind of lesions seems to affect several metabolic processes, including DNA replication, transcription, repair and recombination. This PhD work deals with crosslinks which are formed through a one-electron oxidation of DNA. Guanine exhibits the lowest ionization potential among DNA components, therefore it is readily oxidized leading to the formation of a radical cation, which is involved in the formation of numerous oxidative DNA lesions. In a previous study, a crosslink between guanine moiety and a lysine residue, generated subsequently to a one electron oxidation of a TGT oligonucleotide in the presence of a trilysine peptide, has been described. The mechanism of formation of this adduct relies on the nucleophylic addition of the ε amino group of lysine onto the C8 position of the guanine radical cation. The aim of the present work was to characterize the guanine-lysine adduct and to quantify this lesion in isolated DNA and then in cellular DNA, and to investigate their implication in DNA-protein crosslinks. Several nucleophylic species are able to react with the guanine radical cation. We focused on polyamines, which are organic cations localized in the nucleus of cells at millimolar concentration ranges. These molecules are involved in stabilization and condensation of DNA, and participate also in numerous cellular processes. The relation between polyamine and cancer has been widely described. The mechanism by which dysregulation in their metabolism is related to carcinogenesis is still unknown.In the first part of this project, we focused on the synthesis and the characterization of these lesions as modified nucleosides. Subsequently, we have developed and optimized methods of quantification of these damages, using HPLC coupled with tandem mass spectrometry. Thanks to these analytical methods, we have demonstrated that guanine-lysine and guanine-polyamines adducts could be formed in isolated DNA following a one electron oxidation. Crosslinks between guanine and lysine have been highlighted in DNA extracted from THP1 cells exposed to laser pulses at 266 nm. We have then developed several crosslinks models between a peptide and an oligonucleotide, in order to investigate the chemical structure of the crosslink and determine whether it could occur between guanine and lysine. Guanine-polyamines adducts have also been detected in DNA extracted from sperm cells. These results open new prospects in the understanding of the physiological role of polyamines as well as their involvement in male fertility

La cellule dispose de plusieurs mécanismes de réparation, nécessitant tous l'accès à l'ADN, afin de prévenir les perturbations occasionnées par l'instabilité génomique. La structure des chromosomes eucaryotes (chromatine) forme une barrière physique empêchant l'accessibilité à l'ADN et ainsi les processus biologiques nucléaires tels la transcription, réplication, recombinaison et réparation des dommages de l'ADN. Dans ce dernier processus clé, certaines activités reconfigurant la chromatine pourraient donc s’avérer essentiels en facilitant l’accès à la machinerie de réparation. Nous avons démontré le recrutement spécifique du complexe histone acétyltransférase NuA4 par immunoprécipitation de chromatine à une cassure double brin de l’ADN, le type de dommage le plus dangereux pour la cellule. Des cinétiques ont permis de déterminer à quel moment NuA4 apparaît au site de cassure en relation avec les modifications de la chromatine environnante et de vérifier l’apparition subséquente de complexes de remodelage ATP dépendant. En parallèle, de nouveaux sites de phosphorylation d’histones qui pourraient être impliqués dans la réparation de dommages sur l’ADN ont été investigués. En conclusion, nos travaux permettent de lier fonctionnellement des complexes de modification/reconfiguration de la chromatine avec le processus de réparation de dommages à l’ADN.<br>Inscrit au Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures

La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatives. Sa production est associée à différentes pathologies, dont le développement de cancers. Un lien de causalité a été établi entre dommages à l’ADN, mutagénèse et cancérogenèse. Or, différentes études ont classé CDT dans la famille des génotoxines bactériennes. L’action génotoxique de CDT repose sur l’activité de sa sous-unité catalytique CdtB, connue pour induire des cassures double-brin (CDBs) de l’ADN génomique eucaryote. Cependant, des travaux de l’équipe ont montré qu’à des doses 1000 fois plus faibles que celles utilisées dans la littérature, CDT induit des dommages primaires (probablement de type cassure simple-brin), qui dégénèrent en CDB lors de la phase S. Afin de mieux documenter ce modèle, nous avons étudié ici les systèmes de réparation impliqués dans la réponse aux dommages à l’ADN induits par CDT. Nous avons ainsi confirmé l’importance des voies de réparations des CDBs (Homologous Recombinaison et Non-Homologous End-Joining). Nous avons également montré que le Nucleotide Excision Repair, impliqué dans la réparation des adduits à l’ADN, n’est pas impliqué dans la prise en charge des dommages induits par CDT. En revanche, nous avons démontré, pour la première fois, l’implication de systèmes de réparation de dommages plus précoces, comme le Single-Strand Break Repair et la voie de l’Anémie de Fanconi. Pour finir, afin de mieux caractériser ces dommages et leur induction, nous avons initié des travaux visant à étudier, in vitro, l’activité catalytique de CdtB. Dans ce but, différents mutants catalytiques ont été générés, purifiés, et leur activité nucléase a été testée. Une activité nucléase similaire entre les CdtB sauvages et mutantes a été obtenue lors d’un test in vitro (digestion d’un plasmide super-enroulé). Cependant, un test cellulaire (expression nucléaire en cellules eucaryotes de la sous-unité CdtB sauvage ou mutante) indique bien la perte de l’activité nucléase de la sous-unité mutante. Nos résultats montrent donc l’importance de tester les différentes sous-unités dans différents contextes. En conclusion, notre travail conforte les données selon lesquelles CDT induit des CSB, et non des CDB directes de l’ADN. De plus, notre travail a permis d’éclaircir les processus cellulaires activés dans la cellule hôte, suite aux dommages à l’ADN induits par CDT<br>The Cytolethal Distending Toxin (CDT) is a virulence factor produced by many pathogenic gram-negative bacteria, its production being associated to various diseases, including tumorigenesis. A causal relationship has been established between DNA damage, mutagenesis and cancerogenesis. Different studies classified CDT among the bacterial genotoxins. The CDT-related pathogenicity relies on the catalytic subunit CdtB action, shown to induce double-strand breaks (DSB) on the host genomic DNA. Previously, our team showed that, at doses 1000 times lower than those used in the literature, CDT probably induces single-strand breaks that degenerate into DSB during S-phase. To document this model, we studied the repair systems involved in host-cell in response to CDT-induced DNA damage. Since various repair pathways allow cells to respond different type of DNA damage, we speculated that non-DSB repair mechanisms might contribute to the cellular resistance to CDT-mediated genotoxicity. First, we confirm that HR is involved in the management of CDT-induced lesions, but also Non Homologous End Joining, the second major DSB repair mechanism. Next we show that nucleotide excision repair, involved in adducts repair, is not important to take care of CDT-induced DNA damage, whereas base excision repair impairment sensitizes CDT-treated cells, suggesting that CDT induce single-strand breaks. Moreover, we demonstrate for the first time the involvement and the activation of the Fanconi Anemia repair pathway in response to CDT. Finally, to better characterize CDT-induced damage, we initiate experiments to study CdtB nuclease activity in vitro. For this, different CdtB mutants have been generated, purified and their nuclease activity tested. A similar nuclease activity has been obtained for the wt or mutant CdtB in an in vitro assay (digestion of a supercoiled plasmid). However, a cell assay (nuclear expression of CdtB in eukaryotic cells) confirms the loss of activity for the mutant subunit. Our results thus indicate the importance to test the CdtB subunit in different context. To conclude, our work reinforces a model where CDT induces single-strand damage and not direct DSB. This also underlines the importance of cell proliferation to generate DSB and sheds light on the activated host-cell systems, after CDT-induced DNA damage