Dissertations / Theses on the topic 'Linfoma B difuso de células grandes'

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
O tipo de linfoma mais comum é o Linfoma B Difuso de Células Grandes (LBDCG), correspondendo a cerca de 50% dos linfomas no cão. O Rácio Neutrófilos/Linfócitos (RNL) determinado antes da quimioterapia em LBDCG humano é considerado um bom indicador de prognóstico quanto ao Tempo de Sobrevivência (TS - tempo decorrido desde o diagnóstico até à morte). No LBDCG canino tal não está confirmado, faltando estudos que comprovem a eficácia deste rácio como indicador prognóstico em cães tratados com CHOP. Este estudo tem por objectivo relacionar o RNL com o TS e o Período de Progressão (PP - tempo decorrido desde a data de diagnóstico até à recidiva) em cães com LBDCG. Estudaram-se dados relativos de 30 cães assistidos de 2010 a 2016, num hospital veterinário. Os dados foram analisados no programa RStudio. A amostra é constituída por 30 cães, 14 machos (46.67%) e 16 fêmeas (53,33%). Sete eram de raça indeterminada (23,33%), 4 Rottweiller (13,33%), 4 Labrador Retriever (13,33%), 2 Cocker Spaniel (6,67%), e 13 cães de raças diversas. A média de idades é de 9,7 anos (intervalo de 4 a 17). Os valores de RNL encontram-se entre 0,488 e 23,544. Os valores de TS encontram-se entre 32 a 705 dias. Os valores de PP encontram-se entre 0 e 431 dias. A correlação entre RNL e PP é de -0.215 (valor de p= 0,254). A correlação entre RNL e TS é de -0,3823 (valor de p= 0,03708). Com o aumento do RNL, existe tendência para que o TS seja menor e pior o prognóstico. De acordo com a análise inicial dos dados, obteve-se um valor “cut-off” de RNL= 3,1, superior ao qual o TS diminui significativamente e por isso se considera ter pior prognóstico. Este valor é susceptível de sofrer alterações com o aumento da amostra em estudo e do tratamento de mais dados. Pensa--se que o RNL refletirá a actividade inflamatória e a reduzida resposta imune celular antitumoral dos linfócitos, comparando a resposta inflamatória tumoral com a imunidade do hospedeiro. Os resultados encontrados vão ao encontro do descrito em medicina humana, ou seja, existe correlação negativa entre RNL e TS. Aumentando o RNL, piora o prognóstico, particularmente em valores superiores ao “cut-off” de RNL= 3,1. Os estudos efectuados até à data em medicina veterinária não demostraram relevância estatística, possivelmente por não incidirem sobre um histotipo específico de linfoma. Este é o primeiro estudo que avalia a associação prognóstica entre RNL e TS em cães com LBDCG tratados com CHOP. Pela análise desta amostra, a confirmar com estudos mais aprofundados, conclui-se que há motivos para considerar que o RNL poderá ter valor prognóstico em cães com LBDCG tratados com CHOP.
ABSTRACT - The most common hystotipe of lymphoma is the Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL), representing about 50% of dog’s lymphoma. The Neutrophil/Lymphocyte ratio (NLR) determined prior to quimotherapy in human DLBCL is considered a good prognosis indicator for the Survival Time (ST-time that goes from the diagnosis to death). In dog’s DLBCL this has not yet been confirmed and studies are missing that validate this ratio as an indicator of prognosis. The main goal of this study is to demonstrate the interaction between the NLR, the TS and the Time to Progression (TTP- time frame from the diagnosis to relapse) of dogs with DLBCL. We studied data from 30 dogs seen from 2010 to 2016 in a veterinary hospital. The data was analyzed in the RStudio Program. The sample consisted of 30 dogs, 14 males (46,67%) and 16 females (53,33%). Seven were of indeterminate breed, 4 Rottweillers (13,33%, 4 Labrador Retriever (13,33%), 2 Cocker Spaniel (6,67%) and 13 dogs of other breeds. The average age was 9,7 years (interval 4 to 17). The NLR values obtained were between 0,488 and 23,544. The TS values ranged from 32 and 705 days. The TPP values ranged from 0 and 431 days. The correlation between the RNL and TPP was -0,215 (p-value=0,254). The correlation between NLR and TS was 0,3823 (p-value=0,03708). With the increase of NLR, there was a tendency for the ST to decrease, worsening the prognosis. A cut-off value of NLR=3,1 was obtained, above which the ST decreased significatively and the prognosis was considered to be worst. These values will probably suffer adjustments as the present study proceeds with a larger number of studied cases. It is thought that the NLR mirrors the pro-neoplasic activity of the neutrophils and the reduced anti-neoplasic immune responde of the lymphocytes, relating the inflammatory neoplasic response with the host imunity. The results found are similar to what has been described in human medicine, as there is a negative correlation between the NLR and the ST. As the NLR increases, the prognosis worsens, especially for values above the cut-off of 3,1. The existing studies in veterinary medicine were not statistically relevant, possibly because they did not focus on a specific lymphoma histotype. This is the first study that evaluates the prognosis relation between the NLR and the ST in dogs with DLBCL treated with CHOP. The analysis of the present data, to be confirmed by more in depth studies, suggest that there are good reasons to consider that the NLR prior to chemotherapy might have a prognostic value in dogs with DLBCL treated with CHOP.
N/A

Orientador: Maria Aparecida Custódio Domingues
Resumo: O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) integra o grupo das neoplasias malignas hematopoiéticas classificado como linfomas não-Hodgkin e representa o subtipo mais prevalente no Brasil e no mundo. Ao seu diagnóstico, segue-se um estadiamento clínico denominado Classificação de Ann-Arbor/Lugano, visando estimar o tratamento. Neste estadiamento, além de exames laboratoriais, parâmetros clínicos e imagens radiológicas, faz-se avaliação da medula óssea (MO) para pesquisa de infiltração neoplásica. O presente estudo comparou a análise unicamente morfológica da MO em relação à combinação da morfologia com imunoistoquímica (IHQ) na detecção de infiltração neoplásica medular em pacientes com LDGCB. Para isso, realizou-se levantamento retrospectivo de 113 pacientes diagnosticados com LDGCB submetidos a biópsia/aspirado de MO para estadiamento. Informações clínicas foram levantadas nos prontuários médicos e as lâminas histológicas de biópsias e coágulos de MO foram revisadas quanto a seus aspectos morfológicos. Procedeu-se estudo IHQ com os marcadores CD20 e CD3, sendo este o padrão ouro. A sensibilidade da análise morfológica isolada foi de 42,9%, considerada baixa se considerarmos que esta serviria como um exame de triagem. A quantidade de acúmulos linfoides (AcL) na MO e o aumento de trama reticulínica no acúmulo linfoide mostraram p-valor respectivamente de 0,02, para uma mediana de 2 acúmulos, e 0,01 para uma mediana de trama reticulínica de II, mostrando assim existir uma re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL) belongs to a group of hematopoietic malignancies called Non-Hodgkin's Lymphomas, being the most prevalent in Brazil. After the diagnosis is followed a staging, called Ann-Arbor/Lugano classification, aiming to estimate the treatment. This staging, in addition to laboratory exams, clinical parameters and radiological images, includes the histological evaluation of bone marrow (BM) for the investigation of neoplastic infiltration. The present study compared BM morphological analysis only and morphology combined with immunohistochemistry (IHC) to detect BM infiltration in patients with DLBCL. For this, a retrospective survey was performed on 113 patients diagnosed with LDGCB submitted to biopsy / aspiration for BM staging. Clinical information was reviewed from medical records and histological biopsy and clots were reviewed for morphological aspects. The IHQ study was performed with CD20 and CD3 markers. The sensitivity of the isolated morphological analysis was 42.9%, considered low if we remember that this evaluation would serve as a screening test. The amount of lymphoid agreggates in BM and the increase in reticulin stain into the lymphoid agreggates showed p-value respectively of 0.02 and a median of 2 agreggates and 0.01 for a grade II reticulin, thus showing a relation of these two morphological parameters with BM infiltration. After this, we can conclude that the isolated morphological analysis is not recommended, and should always b... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
O linfoma canino é um dos tumores malignos com maior prevalência no cão, sendo o linfoma difuso de células B grandes o subtipo mais comum. A topoisomerase IIα, proteína nuclear multifuncional, participa nos mecanismos de proliferação celular, constituindo um importante alvo terapêutico em tumores do sistema hematopoiético. Embora vários artigos publicados demonstrem que a expressão de topoisomerase IIα é um fator de prognóstico em humanos com linfoma não-Hodgkin, a sua relevância no linfoma canino é desconhecida. Foi objetivo deste estudo avaliar a expressão de topoisomerase IIα em linfomas B caninos e o seu valor prognóstico. Foram analisados 12 casos de linfoma difuso de células B grandes com recurso à técnica de imunohistoquímica, após otimização do protocolo. Procedeu-se à contagem celular, dividindo-se a intensidade de imunomarcação em três graus (intensa, moderada e nula). Correlacionaram-se os níveis de expressão de topoisomerase IIα com o marcador de proliferação Ki-67 e com o tempo de sobrevivência mas, devido ao reduzido número de casos estudados, não foram obtidos valores estatisticamente significativos. Este estudo permitiu otimizar o processo de imunomarcação e de quantificação da topoisomerase IIα em linfomas caninos. De futuro, devem ser realizados mais trabalhos que permitam aferir a validade da expressão desta enzima como fator prognóstico, neste tipo de tumores.
ABSTRACT - Topoisomerase IIα expression analysis in canine diffuse large B-cell lymphoma - Canine lymphomas are one of the most common neoplasms in dogs, with the diffuse large B-cell lymphoma being the most common subtype. Topoisomerase IIα is a multifunctional nuclear protein and it plays an essential role in cellular proliferation. It is also an important therapeutic target in haematopoietic tumors. Although several reports showed that expression levels of topoisomerase IIα could be a predictive factor in human non-Hodgkin lymphoma, its importance in canine lymphoma is still unknown. The aims of this study were to evaluate the expression of topoisomerase IIα in canine B-cell lymphomas and to validate its prognostic value. Twelve cases of canine diffuse large B-cell lymphoma were analysed, using the immunohistochemical technique, after optimization of the protocol. Cell counting was performed and the observed immunostaining was divided according to an intensity scale. Correlation levels between topoisomerase IIα expression, Ki-67 proliferation index and survival analysis were performed. Due to the small number of analysed cases, no statistically significant results were obtained. This study allowed the assessment of topoisomerase IIα immunostaining and quantification methods in canine lymphomas. Further studies must be performed in order to assess the predictive value of topoisomerase IIα expression levels in this type of tumors.

Orientadores: Carmino Antonio de Souza, Jeane Eliete Laguila Visentainer
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Made available in DSpace on 2018-08-24T20:55:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marangon_AmandaVansan_D.pdf: 2274304 bytes, checksum: 433df5157fab3588b51689f24c4b86cf (MD5) Previous issue date: 2014
Resumo: O Linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) representa o subtipo mais prevalente de linfoma maligno não-Hodgkin, sendo responsável por 30-40% de todos os casos de LNH. O LDGCB não tem etiologia e patogênese bem definidas, porém o seu desenvolvimento parece estar relacionado a respostas imunes ineficazes, devido a frequente associação desse linfoma com estados de imunossupressão. Os fatores genéticos envolvidos no desenvolvimento e evolução da doença não são bem entendidos. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a influência dos genes KIR, dos ligantes HLA e do polimorfismo em genes de citocinas na susceptibilidade ou resistência ao desenvolvimento de LDGCB, bem como na evolução clínica e resposta ao tratamento. Para tanto, foram selecionados 112 pacientes com diagnóstico de LDGCB e 292 doadores de sangue e medula óssea como grupo controle. As tipificações dos genes KIR e dos ligantes HLA foram realizadas com a técnica de PCR-SSOP e a tipificação de citocinas foi realizada com a técnica PCR-SSP. As análises estatísticas foram realizadas pelo pacote estatístico "R" versão 3.0.2 para o programa Windows e os valores de P<0,05 foram considerados significativos. A distribuição dos genes KIR nos grupos estudados mostrou uma menor frequência do gene KIR2DL2 nos pacientes quando comparados aos controles (45,5% vs 58,1%; P=0,036), essa associação mostrou-se significativa também na combinação de KIR2DL2 com C1 (33,0%vs 45,9%; P=0,026) sugerindo um papel de proteção desse gene ao desenvolvimento de LDGCB. Em relação à evolução clínica da doença, os ligantes HLA-Bw4 e HLA-Bw4 80I foram mais frequentes nos pacientes com estádios mais avançados da doença (64,7% vs 40,9%; P=0,020 e 44,1% vs 25,0%; P=0,046, respectivamente) sugerindo que a presença desses ligantes pode ser fator de prognóstico ruim ao LDGCB. Em relação à resposta terapêutica, o gene KIR2DL3 foi associado positivamente ao tratamento do LDGCB, pois esse gene foi mais frequente nos indivíduos com resposta completa que nos indivíduos não respondedores (88,3% vs 71,0%; P=0,044). A respeito dos genes reguladores de citocinas, o genótipo IFN-gama-874/A:A foi associado positivamente ao LDGCB, sendo encontrado mais frequente nos pacientes que nos controles (50,9% vs 27,9%; P=0,001). Contrariamente os genótipos: IFN-gama-874/T:A, IL10-819/C:C e IL10-592/C:C foram menos frequentes nos pacientes que nos controles (P=0,001; P=0,025; P=0,025). Ademais, o genótipo IL10-1082/G:G foi relacionado a maior sobrevida livre de progressão. Os resultados encontrados sugerem que os genes KIR, os ligantes HLA e os genes de citocinas parecem ter envolvimento na proteção, susceptibilidade, evolução clínica e resposta ao tratamento do LDGCB
Abstract: Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most prevalent subtype of malignant non-Hodgkin lymphoma and affects approximately 30-40 % of all cases. The DLBCL has no clearly defined etiology and pathogenesis, but its development seems to be related to ineffective immune responses due to frequent association of lymphoma with immunosuppression. Genetic factors involved in the development and progression of the disease are not well understood. The aim of this study was to evaluate the influence of KIR genes, HLA ligands and cytokine polymorphisms in the susceptibility or resistance to the development of DLBCL, as well as influence in the clinical course and response to treatment. To this end, we selected 112 patients with DLBCL and 292 bone marrow donors as control group. The typing of KIR genes and HLA ligands were performed by PCR-SSOP and typing of cytokine genes was performed by PCR-SSP technique. Statistical analyzes were performed by the statistical package " R " version 3.0.2 for Windows program. P values < 0.05 were considered significant. The distribution of KIR genes in both groups showed a lower frequency of the KIR2DL2 gene in patients compared to controls (45.5% vs 58.1% P=0.036), this association was significant also in combination KIR2DL2 with C1 (33.0% vs 45.9%, P=0.026) suggesting a protective role of this gene to the development of DLBCL. Regarding the clinical course of the disease, HLA-Bw4 and HLA-Bw4 80I ligands were more frequent in patients with more advanced stages of the disease (64.7% vs 40.9%, P=0.020 and 44.1% vs 25 0%, P=0.046, respectively) suggesting that the presence of these ligands may be poor prognostic factor to DLBCL. In regard to treatment response, the KIR2DL3 gene was positively associated with the treatment of DLBCL, because this gene was more frequent in individuals with complete response than in nonresponders individuals (88.3% vs 71.0%, P=0.044 ). Regarding the cytokine genes , IFN -gamma-874/A genotype:A/A was positively associated with DLBCL, it was more frequently in patients than in controls (50.9% vs 27.9%, P=0.001). On other hand genotypes: IFNG -874 /T:A, IL10-819/C:C and IL10 -592 /C:C were less frequent in patients than in controls (P=0.001, P=0.025, P=0.025 respectively). Moreover, the genotype IL-1082/G:G was related to increased progression-free survival. The results suggest that the KIR genes, HLA ligands and cytokine genes seem to be involved in the protection, susceptibility, clinical course and response to treatment of DLBCL
Doutorado
Clinica Medica
Doutora em Clínica Médica

A família paraoxonase (PON1, PON2 e PON3) tem sido objeto de grande interesse por prevenir o estresse oxidativo e o processo inflamatório, condições importantes na carcinogênese. O Linfoma Difuso de Grandes Células B (LDGCB) consiste no subtipo histológico mais comum dentre os linfomas, doenças que se originam a partir das células do tecido linfoide e exibem distintos comportamentos clínicos, fatores patológicos e características epidemiológicas. Há escassez de dados sobre a atuação das paraoxonases na susceptibilidade diferencial ao risco de linfomas. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi investigar a frequência alélica e genotípica dos polimorfismos 192QR e 55LM, no gene da PON1, e 148AG e 311SC, no gene da PON2 e o efeito desses polimorfismos sobre as atividades da enzima PON e perfil lipídico em 182 indivíduos (78 pacientes com LDGCB e 104 indivíduos saudáveis). O sangue foi coletado, em 4 momentos, para a determinação do perfil lipídico e das atividades arilesterase e paraoxonase da PON. O DNA foi extraído de leucócitos do sangue periférico pelo método de extração salina. A análise dos polimorfismos foi realizada por PCR/RFLP. Não houve diferença estatística na distribuição de genótipos e frequência de alelos dos polimorfismos nos genes da PON1 e PON2. A atividade sérica da arilesterase apresentou valores significativamente maiores apenas entre os indivíduos saudáveis (p=0,001). As variantes 55MM e 192QQ, do gene da PON1, influenciaram as atividades arilesterase (p=0,011) e paraoxonase (0,001). O polimorfismo PON2 311SS associou-se a atividade arilesterase (p=0,021). A concentração de autoanticorpos oxLDL foi alterada, pela presença do genótipo 55LM (p=0,037) nos indivíduos com LDGCB
The paraoxonase family (PON1, PON2 and PON3) have been the subject of great interest, since they are responsible for preventing oxidative stress and inflammation, conditions important in carcinogenesis. The Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL) is the most common histological subtype among lymphomas, diseases that originate from cells of the lymphoid tissue and exhibit clinically distinct behaviors and pathological and epidemiological factors. There are paucity of data on the activity of paraoxonase in the differential susceptibility to the risk of lymphoma. Thus, the objective of this study was to investigate the genotypic and allelic frequency of polymorphisms 192QR and 55LM, in the PON1 gene and 148AG and 311SC, in the PON2 gene and the effect of these polymorphisms on PON enzyme activities and lipid profile in 182 subjects (78 patients with DLBCL and 104 healthy subjects). Blood was collected in four moments for the determination of lipid profile and paraoxonase and arylesterase activities of PON. The DNA was extracted from peripheral blood leukocytes by salt extraction method. The analysis of polymorphisms was performed by PCR/RFLP. There was no statistical difference in the distribution of genotypes and allele frequencies of polymorphisms in the PON1 and PON2 genes. The serum arylesterase activity was significantly higher only among healthy subjects (p=0.001). 192QQ and 55MM variants of the PON1 gene, influenced arylesterase (p=0.011) and paraoxonase (0.001) activities. The PON2 polymorphism was associated with 311SS arylesterase activity (p = 0.021). The concentration of oxLDL autoantibodies was altered by the presence of 55LM genotype (p = 0.037) in patients with DLBCL

MOTA, Sandra Mara Brasileiro. Linfoma não-Hodgkin difuso de grandes células B : características clínicas, tratamento e prognóstico com os esquemas quimioterápicos CHOP e CHOP-Bleo. 2006. 75 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Fortaleza, 2006.
Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-01-04T14:28:51Z No. of bitstreams: 1 2006_dis_smbmota.pdf: 287907 bytes, checksum: 7e0bc229874c243a42727335a9fd1299 (MD5)
Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-01-23T11:37:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_dis_smbmota.pdf: 287907 bytes, checksum: 7e0bc229874c243a42727335a9fd1299 (MD5)
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Diffuse Large B-Cell Lymphomas (DLBCL) corresponds to 50% of non-Hodgkin’s lymphomas (LNH). Their treatment of choice is the association chemotherapy, in special the CHOP therapy (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone) considered the standard treatment initial of the DLBCL. Variations of this therapy, with the CHOP-Bleo protocol (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone and bleomycin) have been used with the intention of obtaining complete response rates for the patients. In Brazil, little is known about the incidence, clinical behavior, response to therapy and survival of the patients with DLBCL. This study aimed to set out the epidemiological profile of patients with diffuse large B-Cell lymphomas, who received medical care at Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC), outline in Ceará state, with the first attendment from January 1989 to December 2003, who the used the CHOP and/or CHOP-Bleo therapy; Evaluating the security and efficiency of the protocols proposed by analysis of the kind of therapeutical response, clinical and laboratorial outcomes of these patients. The data collection was performed from medical recording of the 31 patients analyzed. These, 21 (67,74%) were the men and 10 (32,26%) women. The average age was 45,81 ± 16,3 anos. Agriculturists represented 25,82% (8/31) of all patients. The stage III the Ann Arbor classification were the most frequent (32,26%), but only 45% of the patients had B symptoms. The values of lactate dehydrogenises (LDH) enzyme were elevated in 49% of the patients at diagnosis, but in 16% of the patients these values at diagnosis were unknown. As much as the IPI, 71% were classified as an IPI low and intermediate risk, 13% as an IPI intermediate-high risk, none of the study patients showed as an IPI high risk and 16% there is not possible the classification to establish due to the data is unknown. As much as the chemotherapy protocols used, 58% (18/31) of the patients was received CHOP chemotherapy, 36% (11/31) CHOP-Bleo chemotherapy and 6% (2/31) received CHOP associated with CHOP-Bleo chemotherapy. Among the patients who used CHOP chemotherapy, 78% was achieving complete response (CR), 17% was achieving relapse of the disease and only 5% were the death. In the group who used CHOP-Bleo chemotherapy, 63% was achieving RC, 18% was achieving relapse of the disease and 19% died. The 2 patients who used CHOP and CHOP-Bleo chemotherapy were achieving relapse of the disease. The values of the LDH after chemotherapy showed decreased in patients with RC as much as the relapsed patients. We verified that the overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) were not influenced by the clinic stage and initial values of the LDH patients. The logistic regression did not show statistical differences when the complete response was analyzed comparing to outcomes the studied variables after QT, except for the proportion of reduction of LDH levels and response to the treatment. The results stress the security and efficiency of the protocols CHOP e CHOP-Bleo in our study population. The data obtained also the need epidemiological studies in different DLBCL populations for the security in the choice chemotherapy, well as standardized the classification and description of the DLBCL and prognoses factures by pathologists and oncologists.
O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) corresponde a 50 % dos casos de linfoma não-Hodgkin (LNH). Seu tratamento de escolha é a quimioterapia de associação, em especial o esquema CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona), considerado o tratamento inicial padrão dos LDGCB. Variações deste esquema, como o protocolo CHOP-Bleo (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona e bleomicina) tem sido utilizadas com a intenção de se obter maiores taxas de remissão completa pelos pacientes. No Brasil, pouco se conhece a respeito da incidência, do comportamento clínico, da resposta às terapêuticas utilizadas e da sobrevida de pacientes com LDGCB. Este estudo teve como objetivos traçar o perfil epidemiológico dos pacientes portadores de linfoma difuso de grandes células B, atendidos no Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC), com data de primeiro atendimento de janeiro de 1989 a dezembro de 2003, e que fizeram uso dos esquemas quimioterápicos CHOP e/ou CHOP-Bleo; avaliar a eficácia e segurança terapêutica dos esquemas propostos através da análise do tipo de resposta terapêutica, achados clínicos e laboratoriais destes pacientes. A coleta dos dados foi realizada a partir dos prontuários médicos dos 31 pacientes analisados. Destes, 21 (67,74%) eram do sexo masculino e 10 (32,26%) do feminino, com idade média de 45,81 ± 16,3 anos. A ocupação trabalhador agrícola representou 25,82% (8/31). O estádio III da classificação de Ann Arbor foi o mais freqüente (32,26%), mas apenas 45% dos pacientes apresentaram sintomas B. A lactato desidrogenase (LDH) sérica de 49% dos pacientes encontrava-se elevada à época do diagnóstico, sendo que outros 16% dos pacientes não apresentavam resultado desta enzima em seus prontuários. Quanto ao IPI, 71% foram classificados como de risco baixo e intermediário, 13% de alto risco intermediário, nenhum dos pacientes do estudo apresentou IPI compatível com de alto risco e em 16% dos pacientes não foi possível estabelecer a classificação devido à ausência de dados nos prontuários. Quanto à utilização dos protocolos quimioterápicos, 58% (18/31) dos pacientes fizeram uso do esquema CHOP, 36% (11/31) utilizaram CHOP-Bleo e 6% (2/31) utilizaram os dois esquemas quimioterápicos. Entre os pacientes que utilizaram o esquema CHOP, 78% atingiram a remissão completa (RC), 17% apresentaram recidiva da doença e apenas 5 % foram a óbito. No grupo que utilizou o esquema CHOP-Bleo, 63% atingiram a RC, 18% apresentaram recidiva da doença e 19% foram a óbito. Os 2 pacientes que utilizaram os dois esquemas como tratamento apresentaram recidiva da doença. Os valores de LDH dos pacientes após a quimioterapia apresentam-se reduzidos tanto em pacientes que atingiram a remissão completa como naqueles que tiveram recidiva. Verificamos que a sobrevida global (SG) e a sobrevida livre de doença (SLD) não foram influenciadas pelo estádio clínico e LDH inicial dos pacientes. A regressão logística não mostrou significância estatística quando analisou a remissão completa dos pacientes a partir dos resultados das variáveis em estudo pós QT, com exceção da proporção de redução da LDH e a resposta ao tratamento. Os resultados mostraram a eficácia e segurança dos esquemas terapêuticos CHOP e CHOP-Bleo em nossa população de estudo. Os resultados demonstram ainda que se faz necessário o estudo epidemiológico de diferentes populações com LDGCB para que haja segurança na escolha de esquemas quimioterápicos, bem como a uniformidade em descrever e classificar os linfomas e os seus fatores prognóstico por parte dos patologistas e oncologistas.

Orientador: Sabryna Gouveia Calazans
Banca: Thiago Demarchi Munhoz
Banca: Mirela Tinucci Costa
Resumo: O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é o tipo de linfoma mais comum em cães e humanos, caracterizado por seu comportamento agressivo e por promover tempos de sobrevida variáveis, mesmo quando se utiliza a mesma abordagem terapêutica. Atualmente, poucos fatores prognósticos tem sido associados especificamente com LDGCB canino. A imunoexpressão de C-MYC e Bcl2 é reconhecida em humanos como fator prognóstico, devido a relação desses oncogenes com proliferação celular e evasão da apoptose nessa doença. O objetivo desse estudo foi avaliar a imunomarcação dos anticorpos C-MYC, Bcl2, e marcadores de proliferação celular Ki67 e índice mitótico (IM) em cães com LDGCB tratados com protocolo CHOP 19 semanas e correlacioná-la com o tempo de sobrevida e estadiamento clínico visando defini-los como possíveis fatores prognósticos. Trinta amostras de linfonodos de cães diagnosticados com LDGCB foram avaliadas. Para determinar a marcação de C-MYC, Bcl2 e Ki67 foi realizada a técnica de imuno-histoquímica utilizando-se os anticorpos C-MYC, Bcl2 (Santa Cruz Biotechnology) e MIB-1 (Dako), respetivamente. O IM foi calculado como descrito para outras neoplasias. A interpretação dos resultados da imuno-histoquímica para C-MYC e Bcl2, foi calculada no porcentagem de área do número de células marcadas, enquanto a contagem de Ki67 foi realizada com auxílio de uma gratícula, contando-se células positivas por área de 1 cm². Foram estabelecidos pontos de corte, calculando-se a média para todos o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) is the most common type of lymphoma in dogs and humans, being characterized by its aggressive behavior with variable survival times, even when same therapeutic approach is used. Currently, few prognostic factors are described in the literature regarding canine DLBCL. Immunoexpression of C-MYC and Bcl2 is recognized in humans as a prognostic factor in DLBCL, product of the relationship between these oncogenes with cellular proliferation and apoptosis escape. The objective of this study is to evaluate the immunolabeling of C-MYC, Bcl2, and markers of cellular proliferation Ki67 and mitotic index (MI) in dogs with DLBCL treated with 19 weeks CHOP protocol and correlate them to survival times and clinical stage in order to identify new prognostic factors. Thirty lymphnode samples of dogs diagnosed with DLBCL were evaluated. For immunoexpression of C-MYC, Bcl2 and Ki67, we perform immunohistochemistry using the antibodies C-MYC, Bcl2 (Santa Cruz Biotechnology) and MIB-1 (Dako), respectively. MI was calculated as previously discussed in other tumors. The interpretation of the immunohistochemistry results for C-MYC and Bcl2 was based on the expression level of the area of positive cells, whereas a grid reticle was used for counting Ki67 positive cells in a total area of 1 cm². Cutoff values for all markers were established calculating the mean value and then the C-MYC Bcl2, Ki67 and MI values were classified and defined as "low" and "high". Cas... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é o tipo de linfoma mais comum em cães e humanos, caracterizado por seu comportamento agressivo e por promover tempos de sobrevida variáveis, mesmo quando se utiliza a mesma abordagem terapêutica. Atualmente, poucos fatores prognósticos tem sido associados especificamente com LDGCB canino. A imunoexpressão de C-MYC e Bcl2 é reconhecida em humanos como fator prognóstico, devido a relação desses oncogenes com proliferação celular e evasão da apoptose nessa doença. O objetivo desse estudo foi avaliar a imunomarcação dos anticorpos C-MYC, Bcl2, e marcadores de proliferação celular Ki67 e índice mitótico (IM) em cães com LDGCB tratados com protocolo CHOP 19 semanas e correlacioná-la com o tempo de sobrevida e estadiamento clínico visando defini-los como possíveis fatores prognósticos. Trinta amostras de linfonodos de cães diagnosticados com LDGCB foram avaliadas. Para determinar a marcação de C-MYC, Bcl2 e Ki67 foi realizada a técnica de imuno-histoquímica utilizando-se os anticorpos C-MYC, Bcl2 (Santa Cruz Biotechnology) e MIB-1 (Dako), respetivamente. O IM foi calculado como descrito para outras neoplasias. A interpretação dos resultados da imuno-histoquímica para C-MYC e Bcl2, foi calculada no porcentagem de área do número de células marcadas, enquanto a contagem de Ki67 foi realizada com auxílio de uma gratícula, contando-se células positivas por área de 1 cm². Foram estabelecidos pontos de corte, calculando-se a média para todos os marcadores, e posteriormente os valores do C-MYC, Bcl2, Ki67 e a IM foram classificados e definidos como “baixo” ou “alto”. Amostras classificadas como alto C-MYC e alto Bcl2, concomitantemente, foram definidas como alvo duplo MYC/Bcl2. A média de C-MYC foi de 21 (intervalo: 2,5-53,5), de Bcl2 foi de 32,5 (intervalo: 16,9 – 76,8), de Ki67 foi de 107 (intervalo: 1 – 446) e de IM foi de 21 (intervalo: 0-73). Quando comparados os tempos de sobrevida para cada marcador, observou-se que o Ki67 apresentou diferença significativa entre as médias dos grupos baixo (281 dias) e alto (91 dias) (p<0,05). Não houve relação do alvo duplo MYC/Bcl2 com tempos de sobrevida (p>0,05), assim como não houve associação entre a imunomarcação dos anticorpos com o estadiamento clínico. Porém, houve correlação positiva entre C-MYC e Bcl2 (p<0,05) e entre Ki67 e IM (p<0,0001). A expressão imuno-histoquímica dos anticorpos C-MYC e Bcl2, individualmente ou em alvo duplo, não parece constituir um fator prognóstico em cães com LDGCB. Porém, valores acima de 107 células positivas de Ki67 podem estar associados com tempos de sobrevida mais curtos em cães com LDGCB tratados com protocolo CHOP 19 semanas.
Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) is the most common type of lymphoma in dogs and humans, being characterized by its aggressive behavior with variable survival times, even when same therapeutic approach is used. Currently, few prognostic factors are described in the literature regarding canine DLBCL. Immunoexpression of C-MYC and Bcl2 is recognized in humans as a prognostic factor in DLBCL, product of the relationship between these oncogenes with cellular proliferation and apoptosis escape. The objective of this study is to evaluate the immunolabeling of C-MYC, Bcl2, and markers of cellular proliferation Ki67 and mitotic index (MI) in dogs with DLBCL treated with 19 weeks CHOP protocol and correlate them to survival times and clinical stage in order to identify new prognostic factors. Thirty lymphnode samples of dogs diagnosed with DLBCL were evaluated. For immunoexpression of C-MYC, Bcl2 and Ki67, we perform immunohistochemistry using the antibodies C-MYC, Bcl2 (Santa Cruz Biotechnology) and MIB-1 (Dako), respectively. MI was calculated as previously discussed in other tumors. The interpretation of the immunohistochemistry results for C-MYC and Bcl2 was based on the expression level of the area of positive cells, whereas a grid reticle was used for counting Ki67 positive cells in a total area of 1 cm². Cutoff values for all markers were established calculating the mean value and then the C-MYC Bcl2, Ki67 and MI values were classified and defined as “low” and “high”. Cases classified as high C-MYC and high Bcl2, were defined as double target MYC/Bcl2. Mean values were 21 (range: 2,5-53,5) for C-MYC, 32,5 (range: 16,9-76,8) for Bcl2, 107 (range: 1-446) for Ki67 and 21 (range: 0-73) for MI. Only Ki67 immunoexpression was found to be statistical different when survival times were compared between groups low and high (281 days vs 91 days). When double target MYC/Bcl2 was analyzed, no relationship was identified with survival times (p>0,05). Additionally, an association between the antibodies immunoexpression and clinical staging was not identified. However, a positive correlation between C-MYC and Bcl2 (p<0,05) and, Ki67 and MI (P<0,0001) was established. The immunohistochemistry expression of the antibodies C-MYC and Bcl2, individually or in double target, does not appear to constitute a prognostic factor in dogs with DLBCL, whereas a value of Ki67>107 positive cells can be used in dogs with DLBCL to foresee shorter survival times when treated with 19 weeks CHOP protocol.

Para avaliar a influência dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) do CYP2B6, CYP3A5, GSTM1, GSTP1, GSTT1, PON1, NQO1 e MDR1 na resposta ao tratamento com R-CHOP e CHOP, 82 pacientes com Linfoma Difuso de Grandes Células B, sem evidências de infecção por HIV, foram selecionados nesse estudo. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração de DNA. Os SNPs foram analisados por PCR-RFLP. Em relação aos pacientes que apresentaram resposta completa (RC) ao tratamento (70%), 51% foram tratados com R-CHOP. Sobre o tratamento, 50% dos pacientes com RC apresentaram classificação de ECOG 0-1 (p=0,0193) e a maioria desses pacientes (41%) não apresentaram envolvimento extranodal (p=0,0377). Não houve associação entre os SNPs do CYP2B6, CYP3A5, GSTT1, NQO1 e MDR1 (C3435T) e as variáveis estudadas. Apenas CYP3A5 (sexo p=0,0519), GSTM1 (idade p=0,016; tratamento p=0,0372), GSTP1 (envolvimento extranodal p=0,0307), PON1 (sintomas B p=0,0201; Bulky p=0,0148) e MDR1 C1236T (sexo p=0,0316) mostraram associação. Em relação à sobrevida global, apenas tratamento (p=0,0129), IPI (p=0,000342), idade (p=0,0155), estadiamento (p=0,00281) e ECOG (p=0,00869) apresentaram resultados significantes. Quanto à sobrevida livre de doença (SLD), apenas idade (p=0,0292), estadiamento (p=0,0402) e ECOG (p=0,0142) apresentaram resultados significantes
To evaluated the influence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) of CYP2B6, CYP3A5, GSTM1, GSTP1, GSTT1, PON1, NQO1 and MDR1 in the treatment response with R-CHOP and CHOP, 82 patients with Diffuse Large B-cell Lymphoma, without evidence of HIV infection, were enrolled in this study. Peripheral blood samples were collected for DNA extraction. The SNPs were analyzed by PCR-RFLP. In relation the patients that showed complete response (CR) to the treatment (70%), 51% were treated with R-CHOP. About the treatment, 50% of the patients with CR showed ECOG classification of 0-1 and the most of these patients (41%) did not showed extranodal involvement (p=0,0377). There was no association between CYP2B6, CYP3A5, GSTT1, NQO1 and MDR1 (C3435T) SNPs and the variables studied. Only CYP3A5 (gender p=0,0519), GSTM1 (age p=0,016; treatment p=0,0372), GSTP1 (extranodal involvement p=0,0307), PON1 (B symptoms p=0,0201; Bulky p=0,0148) e MDR1 C1236T (gender p=0,0316) showed association. In relation to overall survival, only treatment (p=0,0129), IPI (p=0,000342), age (p=0,0155), stadiament (p=0,00281) and ECOG (p=0,00869) showed significant results. To disease-free survival, only age (p=0,0292), stadiament (p=0,0402) e ECOG (p=0,0142) showed significant results

bgbrady@hotmail.com
The primary intestinal follicular lymphoma is a rare disease described in the last classification of lymphomas from WHO. It is a localized disease with excellent prognosis. We describe in this article ,a 64 year-old Peruvian female with abdominal pain and delayed vomiting for the last two years, has undergone a partial intestinal resection due to bowel obstruction. There was a well-circumscribed annular tumor. A diagnosis of non-polypoid primary intestinal follicular lymphoma was made. We report the case and review the literature in this article.
El linfoma folicular primario intestinal es un desorden raro descrito en la última clasificación de linfomas de la WHO. Es una entidad localizada con excelente pronóstico. En el presente artículo, reportamos una mujer peruana de 64 años de edad diagnosticada con linfoma folicular primario intestinal. Ella tuvo dos años con dolor abdominal y vómitos tardíos. Ella desarrolló una obstrucción intestinal y tuvo una resección completa del tumor. Se describe el caso y se realiza una revisión de la literatura de esta entidad.

Pacientes com linfoma difuso de grande célula B (LDGCB) do mesmo grupo de risco pelos critérios do Índice de Prognóstico Internacional (IPI), tratados com quimioterapia convencional à base de antraciclina, podem ter resposta terapêutica não esperada para seu grupo de risco. Isso pode ser explicado pelo fato do prognóstico dos LDGCB, que têm origem no centro germinativo (CG), ser superior aos originados após o CG (NCG). No intuito de aprimorar a avaliação de prognóstico e a abordagem terapêutica em LDGCB de IPI ajustado para a idade (IPIa) de risco intermediário alto e alto, elaboramos projeto de pesquisa, para verificar o papel dos marcadores imuno-histoquímicos (IH) e do transplante de medula óssea autólogo (ATMO), em primeira remissão completa (RC), neste grupo de pacientes. Avaliamos o impacto da expressão dos marcadores CD10, Bcl-6, MUM-1, Bcl-2 e p63 na obtenção de RC, sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida global (SG), isoladamente e de acordo com a origem em CG e NCG. Avaliamos 82 pacientes abaixo dos 60 anos, dos quais 16 (19,5%) receberam ATMO em primeira RC, além de serem comparados com os pacientes tratados com quimioterapia convencional e mantidos em observação após RC. A IH foi avaliável em 73 casos, 24 (32,9%) tiveram origem no CG e 49 (67,1%) NCG, sem diferença de sobrevida entre os grupos. A proteína Bcl-2 foi positiva em 27 (37%) pacientes e foi o único fator preditivo independente para SG à análise multivariada, com tendência de significância para RC. As SG e SLD em cinco anos para os 16 pacientes que receberam ATMO foi de 75% e 85,2%, respectivamente, a taxa de recidiva de 6,5% e diferença estatisticamente significativa para SLD (p = 0,015) em comparação aos pacientes apenas observados. Concluímos que o ATMO foi seguro e capaz de melhorar a sobrevida em LDGCB de risco intermediário alto e alto, e que a expressão de Bcl-2 pode ser utilizada na programação terapêutica inicial desses pacientes.
Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) patients from the same risk group according to the International Prognostic Index (IPI) treated with conventional anthracycline-based chemotherapy may show an unexpected therapeutic response. This can be explained by the fact that the prognosis of DLBCL originating in germinal center (GC) cells is superior than that originating out of germinal center (NGC). In order to improve the prognostic evaluation and the therapeutic approach to DLBCL patients with high intermediate to high age-adjusted IPI (aIPI), a research project was designed for the analysis of immunohistochemical markers and the role of autologous stem cell transplantation (ASCT) in first complete remission (CR) for this group of patients. The impact of the expression of CD10, Bcl-6, MUM-1, Bcl-2 and p63 markers on complete remission (CR), disease-free survival (DFS) and overall survival (OS), either individually and according to cell origin was evaluated by means of immunohistochemistry. Eighty-two patients aged under 60 years old were assessed, of which 16 (19.5%) underwent ASCT in first CR and were compared to patients receiving conventional chemotherapy and being monitored after CR. Immunohistochemistry was assessable in 73 cases, 24 (32.9%) being classified as GC-type and 49 (67.1%) as NGC-type, with no survival difference between the two groups. Bcl-2 expression was found in 37% (27) of the patients and was the single independent predicting factor of OS prognosis according to multivariate analysis. A significant tendency of expression of this protein was also observed for achieving CR, which was essential for longer survival, as shown by multivariate analysis. OS and DFS within 5 years were of 75% and 85.2% respectively for the group of 16 patients treated with ASCT, which resulted in lower relapse rates (6.5%) with statistically significant difference for DFS (p=0.015) when compared to the group of patients who achieved CR and was kept under monitoring. In this study ASCT was found to be a safe procedure for improving survival rates of DLBCL patients with high intermediate to high aIPI risk. Also, the expression of Bcl-2 protein was found to be useful as one of the variables to be analysed in the therapeutic approach to these patients

Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a clinically and genetically heterogeneous disease, accounting for 30% of all non-Hodgkin lymphoma cases. Although the addition of rituximab to standard treatment (CHOP: cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisone) has increased survival of DLBCL patients, 30-40% of patients still relapse. Moreover, 1-10% of the relapsed patients show central nervous system (CNS) involvement which is almost always a fatal condition. Consequently, further studies are needed to understand the molecular mechanisms involved in the disease and to develop novel therapies to improve the patients’ outcome. In this regard, modeling the disease in mice has reached a great relevance and it is necessary to develop novel models that represent the clinical features of the disseminated disease. In addition, novel biomarkers are needed to predict DLBCL outcome. Accumulating data have emerged about the correlation of CXCR4 receptor with disease dissemination and aggressiveness in several neoplasms. This receptor has also been described to play a role in the migration and trafficking of B cells and some hematological malignancies. However, no data are available about its involvement in DLBCL dissemination or its relevance as a prognostic marker in this disease. The goals of the current thesis were: 1) To develop bioluminescent mouse models of disseminated DLBCL which reflect this human pathology. 2) To evaluate the in vivo antitumor effect of a new inhibitor of focal adhesion signaling, E7123, in a model of DLBCL with central nervous system (CNS) involvement. And, 3) To study the role of CXCR4 receptor in the migration and dissemination of DLBCL cells and evaluated the expression of the receptor in lymph node biopsies of DLBCL patients and its prognostic value. We have developed bioluminescent xenograft models of disseminated DLBCL that derive from DLBCL cell lines and that reflect this human pathology. These models can be used to study cell dissemination and the effect of novel antitumor drugs against DLBCL. In fact, the focal adhesion inhibitor E7123 was tested in a disseminated DLBCL model with CNS involvement; this drug delayed the growth of DLBCL metastasis to the CNS and increased mouse survival time. These findings suggest that E7123 was able to cross the blood brain barrier and thus could be effective for the treatment of DLBCL patients with CNS involvement. However, further preclinical development and clinical assays will be necessary to evaluate E7123 antitumor effect in relapsed DLBCL patients. In addition, we observed that the level of membrane CXCR4 expression in DLBCL cell lines correlated positively with in vitro migration towards SDF-1α chemokine and this migration was inhibited by the CXCR4 antagonist, AMD3100. Expression of the receptor was also associated with increased engraftment and dissemination, and decreased survival time in DLBCL NOD/SCID mouse models. Moreover, the subcutaneous preconditioning of DLBCL cells produced changes in the levels of membrane CXCR4 that correlated with aggressiveness of the models; higher levels of CXCR4 led to shortened mouse survival and enhanced lymphoma dissemination. Furthermore, administration of the AMD3100 antagonist to a xenograft DLBCL model decreased dissemination of the tumor cells. Thus, AMD3100 could potentially be used in the treatment of DLBCL. We also evaluated the prognostic value of CXCR4 and found that the receptor is an independent prognostic factor associated with a decreased progression-free survival of patients. These results show that CXCR4 mediates dissemination of DLBCL cells and define for the first time its value as an independent prognostic marker in patients. This novel prognostic marker requires further studies and validation in an independent cohort of DLBCL patients to be used as a potentially clinical tool.
El linfoma difuso de célula grande B (LDCGB) es el tipo de linfoma no-Hodgkin más común en la población y representa un 30% de los casos. La incorporación de rituximab al tratamiento estándar CHOP (ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) ha aumentado la supervivencia de los pacientes. Aún así, un elevado porcentaje de pacientes recaen y es necesario desarrollar nuevos fármacos. Para ello es importante obtener modelos animales que reproduzcan las características clínicas observadas en pacientes y que permitan estudiar su mecanismo patogénico y evaluar nuevos tratamientos. Por otro lado, también es necesario obtener nuevos biomarcadores capaces de predecir el pronóstico en pacientes de LDCGB. Las proteínas implicados en señalización y tráfico celular son de gran interés; entre ellas el receptor de quimioquinas CXCR4 que ha sido descrito en el tráfico de linfocitos B tumorales y en la diseminación de varias neoplasias. El principal objetivo de esta tesis es generar modelos animales bioluminiscentes de LDCGB para el estudio de la patología y para la evaluación de nuevas terapias. También evaluamos el efecto antitumoral del inhibidor de adhesiones focales E7123 en un modelo de LDCGB con afectación del sistema nervioso central. Por último, estudiamos la implicación de CXCR4 en diseminación y su valor pronóstico en biopsias ganglionares de pacientes con LDCGB. En esta tesis conseguimos desarrollar modelos murinos bioluminiscentes de LDCGB diseminado que derivan de líneas celulares de linfoma humano y que reflejan las características clínico-patológicas de la enfermedad. Además, observamos que E7123, presenta efecto antitumoral en un modelo de LDCGB con afectación del sistema nervioso central. También, describimos una correlación positiva entre los niveles de expresión del receptor CXCR4 y la migración in vitro de las células de LDCGB inducida por la quimioquina SDF-1α. Esta correlación entre niveles de expresión y agresividad se mantiene en los modelos xenógrafos de LDCGB generados; las células de linfoma con mayor expresión de CXCR4 presentan mayor tasa de injerto, diseminación y un menor tiempo de supervivencia en los ratones inyectados. Además, el pre-condicionamiento subcutáneo de las líneas celulares modifica la expresión de CXCR4 y estos cambios de expresión también correlacionan con la agresividad de las células. Por último, describimos el valor pronóstico de CXCR4 como predictor del riesgo de recaída en pacientes con LDCGB; la presencia de CXCR4 en membrana está asociada con un mayor riesgo de recidiva.

Orientador: Mirela Tinucci Costa
Banca: Felipe Augusto Ruiz Sueiro
Banca: Lucas Campos de Sá Rodrigues
Banca: Andrigo Barboza De Nardi
Banca: Letícia Abrahão Anai
Resumo: A via Janus Kinase (JAK) e do transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) desempenham papéis importantes na patogênese de neoplasias hematopoiéticas. A ativação da via JAK2/STAT3 promove o crescimento e sobrevivência celular em uma variedade de linfomas humanos. Há uma necessidade de compreender a participação da via JAK2/STAT3 em linfomas caninos difusos de grandes células B e do potencial terapêutico dos inibidores de JAK no tratamento dessa doença. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de JAK2-STAT3 em linfomas difusos de grandes células B e o impacto do uso de inibidores de JAK2 como AZD1480 e CYT387 no crescimento in vitro dessa linhagem tumoral. Foi realizada técnica de imuno-histoquímica com os anticorpos anti-STAT3 e anti-STAT3 fosforilado (p-STAT3) em linfonodos acometidos por linfoma difuso de grandes células B e comparado à linfonodos normais e reativos. Para avaliação do efeito terapêutico dos inibidores de JAK2 (AZD1480 e CYT387) foi realizado ensaio de viabilidade celular pelo método de azul de tripan utilizando linhagens celulares de linfoma difuso de grandes células B (CLBL-1) e análise de apoptose por citometria de fluxo utilizando o sistema Annexin V. Houve aumento significativo na expressão de STAT3 e p-STAT3 em linfomas difusos de grandes células B em comparação com linfonodos normais. Ambos os fármacos inibiram o crescimento celular em proporções dependentes da dose administrada e houve um aumento significativo nas taxas de apopto... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: The Janus Kinase (JAK) and signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway play important roles in the pathogenesis of hematologic malignancies. Activated JAK2-STAT3 signaling pathway promotes the growth and survival of a variety of lymphomas in human. There is a great demand for understanding JAK-STAT pathway in canine diffuse large B cell lymphoma (DLBCLs) and evaluating the therapeutic potential of JAK inhibitors. Our study aims to evaluate the expression of JAK2-STAT3 pathway in canine DLBCLs and to assess the impact of AZD1480 and CYT387, two novel JAK inhibitors, on canine DLBCL cell growth. Immunohistochemistry was performed in canine DLBCLs, normal and reactive lymph nodes with primary antibodies against STAT3 and phosphorylated STAT3 (p-STAT3). To evaluate the therapeutic effect of novel JAK inhibitors, canine DLBCL cell line CLBL-1 was treated with either AZD1480 or CYT387 and trypan blue viability assay was performed post treatment. There was a significant increase in expression of STAT3 and pSTAT3 in canine DLBCLs compared with the normal lymph node. Both AZD1480 and CYT387 inhibited canine DLBCL cells in a dose dependent manner. This is the first study to evaluate the JAK2/STAT3 pathway in canine DLBCLs. The knowledge of JAK2-STAT3 activity in canine DLBCLs enables us to understand and explore the therapeutic potential of JAK inhibitors. The dose dependent cell growth inhibition by novel JAK inhibitors in this study will lead into the future studies of the underlying mechanism
Doutor

O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é o subtipo de linfoma mais comum em países em desenvolvimento. Entretanto, apesar de sua prevalência e importância, ainda existem poucas publicações com dados epidemiológicos para a população brasileira. Conhecer os fatores de prognóstico é imperativo para identificar os pacientes que responderão melhor ao tratamento, além de permitir sua individualização terapêutica. Alguns estudos demonstraram que pacientes com o mesmo Índice Internacional de Prognóstico (IPI) podem apresentar diferentes sobrevidas, justificando a necessidade de identificar novos marcadores biológicos de prognóstico. O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto prognóstico da expressão dos genes BCL2, MDR1 e OCT1, de suas respectivas proteínas e da translocação t(14;18), nos desfechos de resposta completa (RC), sobrevida global (SG), sobrevida livre de doença (SLD) e sobrevida livre de progressão (SLP) em pacientes com LDGCB. Foram avaliados de forma retrospectiva 98 pacientes com LDGCB de novo tratados com R-CHOP. A expressão gênica foi avaliada por PCR em Tempo Real com RNA extraído de amostras parafinadas. A expressão proteica foi avaliada pelo método de imuno-histoquímica. A mediana de idade foi de 54,5 anos e 49 pacientes (50%) eram do sexo masculino. Sessenta e quatro pacientes (85,3%) obtiveram RC, com uma mediana de acompanhamento de 2,66 anos. A expressão mediana de BCL2, MDR1 e OCT1 foi 6,27; 0 e 24,49, respectivamente. Não encontramos impacto prognóstico da expressão do gene BCL2 na RC (p=0,277), SG (p=0,068) e SLD (p=0,860). Porém, a expressão de BCL2 >= à mediana associou-se à menor SLP (p=0,040). Encontramos associação entre expressão do gene OCT1 >= à mediana e pior prognóstico para SG (p=0,010) e SLP (p=0,016). Porém, não observamos impacto prognóstico da expressão de OCT1 para RC (p=0,464) e SLD (p=0,717). Não houve associação entre expressão do gene MDR1 e das proteínas BCL-2, Pg-p e OCT-1 com o prognóstico dos pacientes em relação à RC, SG, SLD e SLP. O número de sítios extralinfonodais (p=0,004 e p=0,005), estádio clínico (p < 0,001 para ambas), IPI (p < 0,001 para ambas) e nível de DHL (p=0,010 e p=0,008) apresentaram impacto prognóstico na SG e SLP, respectivamente. Quando os pacientes foram estratificados pelo estádio, IPI e idade, o grupo com expressão de OCT1 >= à mediana e IPI intermediário-alto ou alto risco apresentou pior SG (p=0,048) e o grupo com idade >= 60 anos e expressão de OCT1 >= à mediana apresentou pior prognóstico para SG e SLP (p=0,025 para ambas). Em conclusão, a expressão de MDR1 não apresentou impacto no prognóstico de portadores de LDGCB, porém, a expressão do gene BCL2 >= à mediana foi associada a menor SLP. Além disso, a hiperexpressão de OCT1 apresentou valor preditivo de prognóstico para a SG e SLP em pacientes com LDGCB tratados com R-CHOP
The diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common lymphoma subtype in developing countries. However, despite its prevalence and importance, there are still few publications showing the epidemiological data of the Brazilian population. Knowing the prognostic factors is imperative to identify patients supposed to better respond to treatment, as well as to allow their therapeutic individualization. Some studies have shown that patients with the same International Prognostic Index (IPI) may present different survival rates, thus justifying the need to identify new prognosis biomarkers. The aim of this study was to assess the prognostic impact of the genes BCL2, MDR1 and OCT1 and their respective proteins and t (14; 18) translocation on the complete response (CR), overall survival (OS), disease-free survival (DFS) and progression-free survival (PFS) of patients with DLBCL. We retrospectively assessed 98 patients with de novo DLBCL treated with R-CHOP. The gene expression was assessed through real-time PCR using RNA extracted from paraffin samples. The protein expression was assessed through the immunohistochemistry method. The median age was 54.5 years; 49 patients (50%) were men. Sixty-four patients (85.3%) had CR and median follow-up 2.66 years. The median expression of BCL2, MDR1 and OCT1 was 6.27; 0 and 24.49, respectively. We did not find the prognostic impact of the BCL2 gene expression on CR (p = 0.277), OS (p = 0.068) and on DFS (p = 0.860). However, the expression of BCL2 >= the median was associated with the lower PFS (p = 0.040). We found association between OCT1 gene expression >= the median and worse prognosis for OS (p = 0.010) and PFS (p = 0.016). However, we did not find the prognostic impact of OCT1 expression on CR (p = 0.464) and DFS (p = 0.717). There was no association between the MDR1 gene expression and the BCL-2, Pg-p and OCT-1 proteins, and the patients\' prognosis regarding CR, OS, DFS and PFS. The number of extranodal sites (p = 0.004 and p = 0.005), the clinical status (p <0.001 for both), the IPI (p < 0.001 for both) and DHL levels (p = 0.010 and p = 0.008) presented PFS, respectively. When the patients were stratified by stage, IPI and age, the group with OCT1 expression at the median and intermediate-to-high or high-risk IPI had worse OS results (p = 0.048) and the patients in the age group >= 60 years and expression of OCT1 >= the median presented worse prognosis for OS and PFS (p = 0.025 for both). Therefore, the MDR1 expression had no impact on the prognosis of DLBCL carriers. However, the expression of the BCL2 gene >= the median was associated with lower PFS. In addition, the OCT1 hyperexpression presented a predictive prognosis value for OS and PFS in patients with DLBCL treated with R-CHOP

INTRODUÇÃO: O linfoma difuso de grandes células B, sem outras especificaçoes (LDGCB, SOE) é uma neoplasia agressiva caracterizada pela heterogeneidade morfológica, imunofenotípica e molecular, porém o atual tratamento padrão utilizando imunoquimioterapia (R-CHOP) não considera tal diversidade. Há percentual significativo de pacientes que são refratários à terapia de primeira linha e alguns que apresentam recidiva precoce ou tardia, os quais representam as vítimas desta doença. O estudo imuno-histoquímico (IHQ), que é um método simples e universalmente disponível, vem sendo utilizado para reconhecer a diversidade biológica do LDGCB, SOE, identificando biomarcadores e subgrupos distintos da doença, que poderiam predizer a resposta terapêutica ao tratamento padrão e apontar possíveis candidatos a novas estratégias terapêuticas. OBJETIVOS: Este estudo avalia o valor prognóstico de cinco algoritmos para classificação do LDGCB segundo a célula de origem (COO) e da expressão de três biomarcadores (BCL2, CD30 e MYC) tendo como endpoint a sobrevida global. MÉTODOS: Foi realizado estudo retrospectivo com setenta e nove pacientes com LDGCB,SOE de novo tratados com imunoquimioterapia padrão, estadiados e acompanhados protocolarmente. Os casos foram classificados como subgrupo célula B centrogerminativa símile (GCB) ou como subgrupo célula B não-centrogerminativa símile (NGCB), de acordo com três algoritmos IHQ (Hans, Choi, e Visco-Young) pareados com estudo do perfil de expressão gênica (PEG) e dois algoritmos IHQ não-PEG pareados (Muris e Nyman). Foi estimado o valor prognóstico destes algoritmos e também avaliado a concordância entre eles. O valor prognóstico da expressão do BCL2, CD30 e MYC utilizando IHQ também foi analisado. RESULTADOS: Os algoritmos IHQ PEG pareados revelaram maior concordância entre si, porém nenhum deles revelou força prognóstica. A expressão do CD30 mostrou tendência a melhor prognóstico, porém a expressão de BCL2 e MYC avaliados isoladamente não revelaram impacto prognóstico. Contudo, a coexpressão do BCL2 e MYC, denominado como fenótipo linfoma duplo-expressor (LDE), revelou-se importante marcador prognóstico desfavorável. Foram identificados três subgrupos de risco baseado no fenótipo LDE e o Índice Prognóstico Internacional (IPI). CONCLUSÃO: Em pacientes com LDGCB, SOE de novo tratados com esquema terapêutico padrão, a pesquisa da expressão do fenótipo LDE é mais relevante do ponto vista prognóstico que a classificação em subgrupo GCB ou NGCB. Além disso, a expressão do CD30 pode ser relevante tanto para identificar subgrupo com tendência a melhor prognóstico como para identificar possíveis candidatos a nova terapia alvo
BACKGROUND: Diffuse large B-cell lymphoma, not otherwise specified (DLBCL, NOS) is an aggressive neoplasm characterized by morphological, phenotypic and molecular heterogeneity, but the current standard therapy using immunochemotherapy (R-CHOP) does not consider such diversity. There is a significant percentage of patients who are refractory to first-line therapy and those with early or late recurrence, whose represent the victims of this disease. Immunohistochemistry (IHC), a simple and universally available method, has been used to recognize the biological diversity of DLBCL, NOS, to identify biomarkers and distinct subgroups of the disease, which would predict the therapeutic response to standard treatment and point possible candidates for novel therapeutic strategies. OBJECTIVES: The current study was conducted to evaluate the prognostic value from five algorithms for classification of DLBCL based on cell of origin (COO) and the expression of three biomarkers (BCL2, CD30 and MYC) with overall survival (OS) as an endpoint. METHODS: We retrospectively evaluated seventy nine patients with de novo DLBCL, NOS treated with R-CHOP-like immunochemotherapy. The cases were assigned as germinal center B-cell like (GCB) or non-GCB subgroup (NGCB) according to five different IHC algorithms, including three algorithms based on gene expressing profile study (GEP), proposed by Hans, Choi, and Visco-Young, and two non-GEP based algoritms proposed by Muris, and Nyman. We evaluated their prognostic relevance and the concordance between these algorithms. The prognostic power of BCL2, CD30 and MYC expression were also assessed by IHC. RESULTS: None of the profiles assessed by IHC algorithms was able to predict overall survival (OS). The positive expression of CD30 showed a trend toward a better outcome. Neither the positive expression of BCL2 nor the positive expression of MYC were associated with outcome. However, the double-expressor lymphoma phenotype (DEL), represented by the concurrent expression of MYC and BCL2, exhibited a negative prognostic impact. Three different risk subgroups were identified based on the DEL phenotype and the International Prognostic Index (IPI) score. CONCLUSIONS: These data suggest that the DEL, rather than the cell of origin classification based on IHC, is a better predictor of OS in patients with DLBCL treated with R-CHOP-like immunochemotherapy. Besides, the CD30 expression may be a useful prognostic marker and a possible therapeutic target

Orientador: Júlio Lopes Sequeira
Banca: Renee Laufer Amorim
Banca: Sara Maria de Carvalho e Suzano
Resumo: Os linfomas não Hodgkin (LNHs) são as neoplasias hematopoiéticas mais comuns nos cães, sendo o Linfoma Difuso de Grandes Células B (DLBCL) o subtipo mais frequente. Os DLBCLs são neoplasias formadas por células linfoides B com padrão de crescimento difuso e podem apresentar pelo menos cinco variantes. O presente trabalho teve como objetivos traçar o perfil imunoistoquímico dos DLBCLs dos cães, classificá-los de acordo com os critérios estabelecidos pela WHO (2008), WHO veterinária (2002) e Classificação de Kiel e efetuar a avaliação dos anticorpos utilizados pelo método de microarranjo de tecido (TMA), comparando-o com o corte convencional. Foi avaliada a expressão imunoistoquímica de marcadores pan B (CD79a, CD20 e PAX-5); a determinação dos índices proliferativo (Ki-67) e apoptótico (caspase-3) e também da expressão de p53 mutante. Foram observados 24 linfomas centroblásticos monomórficos, 4 imunoblásticos B e 1 centroblástico polimórfico de acordo com a classificação de Kiel. Este perfil é de 25 Linfomas de Grandes Células B Difusos/ DLBCL, NOS variante centroblástica e 4 Imunoblásticos de Grandes Células /DLBCL, NOS variante imunoblástica, pela WHO de 2002 e 2008, respectivamente. Houve marcação em 100%, 75,8% e 58,6% dos casos para o CD79a, CD20 e PAX-5, respectivamente. A mediana de porcentagem de marcação para o Ki-67 e para a caspase-3 foi de 45,9% e 10%, respectivamente. Já a expressão da proteína p53 mutante foi verificada em 16 tumores (55,1%). A análise destes marcadores utilizando-se o TMA resultou em perfil imunofenotípico idêntico e medianas de caspase-3, Ki67 e p53 significativamente semelhantes quando comparadas com o corte convencional. Concluiu-se que em nossas amostras não houve diferença estatística entre os diferentes subtipos histológicos em relação aos índices proliferativo e apoptótico e expressão da p53. Ainda, o TMA é uma técnica adequada para avaliação do...
Abstract: Non Hodgkin lymphomas (LNHs) are the most common hematopoietic tumors of dogs, among which Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL) is the most frequent subtype. DLBCLs are tumors composed of lymphoid B cell with a diffuse growth pattern and may present at least five variants. The present work intended to delineate the immunohistochemical profile of canine DLBCL, classify them according to the criteria proposed by WHO (2008); veterinary WHO (2002) and Updated Kiel Classification and also perform the evaluation of the used antibodies on tissue microarray (TMA) method in comparison to conventional histological sections. The immunohistochemical expression of pan B markers (anti CD79a, anti CD20 and PAX-5) was assessed; as well as the determination of proliferation index (Ki-67) and apoptosis (caspase 3) and also the expression of the mutant p53. There were 24 monomorphic centroblastic lymphomas, 4 imunoblastic B and 1 polimorphic centroblastic according to Kiel. That profile is 25 Diffuse Large B Cell Lymphoma/ DLBCL, NOS centroblastic variant and 4 Large Cell Imunoblastic/ DLBCL, NOS imunoblastic variant according to WHO 2002 and 2008 respectively. Immunolabeling was seen in 100%, 75.8% and 58.6% of the cases for CD79a, CD20 and PAX-5 respectively. The immunolabeling median percentage of Ki67 was 45.9% and for caspase-3 it was 10%. The expression of mutant p53 was observed in 16 tumors (55.1%). The analysis of those markers using TMA resulted in identical imunophenotype and significantly similar medians of caspase-3, Ki67 e p53 when compared to conventional sections. In conclusion there was no statistical difference among the histological subtypes regarding proliferation and apoptotic indexes and p53 expression in our samples. Also, TMA is an adequate technique for evaluating imunophenotype, proliferation and apoptotic indexes as well as presence of mutant p53
Mestre

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:23Z : No. of bitstreams: 1 000849906.pdf: 1765122 bytes, checksum: 8c6d553d9c85a8d8f90b29da0d564f24 (MD5)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Os linfomas não Hodgkin (LNHs) são as neoplasias hematopoiéticas mais comuns nos cães, sendo o Linfoma Difuso de Grandes Células B (DLBCL) o subtipo mais frequente. Os DLBCLs são neoplasias formadas por células linfoides B com padrão de crescimento difuso e podem apresentar pelo menos cinco variantes. O presente trabalho teve como objetivos traçar o perfil imunoistoquímico dos DLBCLs dos cães, classificá-los de acordo com os critérios estabelecidos pela WHO (2008), WHO veterinária (2002) e Classificação de Kiel e efetuar a avaliação dos anticorpos utilizados pelo método de microarranjo de tecido (TMA), comparando-o com o corte convencional. Foi avaliada a expressão imunoistoquímica de marcadores pan B (CD79a, CD20 e PAX-5); a determinação dos índices proliferativo (Ki-67) e apoptótico (caspase-3) e também da expressão de p53 mutante. Foram observados 24 linfomas centroblásticos monomórficos, 4 imunoblásticos B e 1 centroblástico polimórfico de acordo com a classificação de Kiel. Este perfil é de 25 Linfomas de Grandes Células B Difusos/ DLBCL, NOS variante centroblástica e 4 Imunoblásticos de Grandes Células /DLBCL, NOS variante imunoblástica, pela WHO de 2002 e 2008, respectivamente. Houve marcação em 100%, 75,8% e 58,6% dos casos para o CD79a, CD20 e PAX-5, respectivamente. A mediana de porcentagem de marcação para o Ki-67 e para a caspase-3 foi de 45,9% e 10%, respectivamente. Já a expressão da proteína p53 mutante foi verificada em 16 tumores (55,1%). A análise destes marcadores utilizando-se o TMA resultou em perfil imunofenotípico idêntico e medianas de caspase-3, Ki67 e p53 significativamente semelhantes quando comparadas com o corte convencional. Concluiu-se que em nossas amostras não houve diferença estatística entre os diferentes subtipos histológicos em relação aos índices proliferativo e apoptótico e expressão da p53. Ainda, o TMA é uma técnica adequada para avaliação do...
Non Hodgkin lymphomas (LNHs) are the most common hematopoietic tumors of dogs, among which Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL) is the most frequent subtype. DLBCLs are tumors composed of lymphoid B cell with a diffuse growth pattern and may present at least five variants. The present work intended to delineate the immunohistochemical profile of canine DLBCL, classify them according to the criteria proposed by WHO (2008); veterinary WHO (2002) and Updated Kiel Classification and also perform the evaluation of the used antibodies on tissue microarray (TMA) method in comparison to conventional histological sections. The immunohistochemical expression of pan B markers (anti CD79a, anti CD20 and PAX-5) was assessed; as well as the determination of proliferation index (Ki-67) and apoptosis (caspase 3) and also the expression of the mutant p53. There were 24 monomorphic centroblastic lymphomas, 4 imunoblastic B and 1 polimorphic centroblastic according to Kiel. That profile is 25 Diffuse Large B Cell Lymphoma/ DLBCL, NOS centroblastic variant and 4 Large Cell Imunoblastic/ DLBCL, NOS imunoblastic variant according to WHO 2002 and 2008 respectively. Immunolabeling was seen in 100%, 75.8% and 58.6% of the cases for CD79a, CD20 and PAX-5 respectively. The immunolabeling median percentage of Ki67 was 45.9% and for caspase-3 it was 10%. The expression of mutant p53 was observed in 16 tumors (55.1%). The analysis of those markers using TMA resulted in identical imunophenotype and significantly similar medians of caspase-3, Ki67 e p53 when compared to conventional sections. In conclusion there was no statistical difference among the histological subtypes regarding proliferation and apoptotic indexes and p53 expression in our samples. Also, TMA is an adequate technique for evaluating imunophenotype, proliferation and apoptotic indexes as well as presence of mutant p53

Orientador: Oslei Paes de Almeida
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-08-23T09:15:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ToralRizo_VictorHugo_D.pdf: 3216317 bytes, checksum: f10b9daa311d7ae2e304dc1ea8925abf (MD5) Previous issue date: 2013
Resumo: O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é o linfoma da cavidade bucal mais comum. Alguns dos LDGCB podem apresentar células grandes morfologicamente similares às células Hodgkin e Reed/Sternberg (HRS) dos linfomas de Hodgkin clássico (LHC). O objetivo deste estudo foi comparar os LDGCB bucal que apresentem células HRS-like (LDGCB-HRS) com o linfoma de Hodgkin primário nodal, considerando os aspectos histológicos e imunoistoquímicos (IQs), angiogênese, índice de mastócitos e células dendríticas (CD), por meio de um amplo painel IQ. Quize casos foram estudados, nos quais sete eram LDGCB-HRS like e oito eram LHC nodal. Para a análise dos aspectos histológicos e IQs foram utilizados os seguintes anticorpos: CD3, CD15, CD20, CD30, CD43, LCA, CD45RO, CD79a, CD83, EMA, MUM-1, PAX-5, perforina, granzyme B, FASN, Ki-67, LMP-1; e EBER1/2. Já para a análise da angiogênese foram utilizados os anticorpos CD34, CD31, D2-40, CD105, vWF e VEGF; e para o índice de mastócitos utilizou-se o mast cell triptase. Finalmente, para avaliar a expressão IQ das CD os anticorpos CD1a, CD83, CD123, CD207, S-100 e FXIIIa foram utilizados. Todas as lâminas foram escaneadas e as células HRS-like, mastócitos e CD imunopositivas foram analisados, assim como os parâmetros morfométricos da angiogênese. Os resultados mostraram que a imunoexpressão foi postiva em 100% de casos de LHC e em 57% dos casos de LDGCB de boca, enquanto que LCA, CD20 e CD79a foram exclusivos para todos os LDGCB, e apenas CD15 foi exclusivo para os LHC. Angiogênese e o índice de mastócitos estavam aumentados em ambas as lesões, e entre elas, o LHC obteve maiores valores que o LDGCB da cavidade bucal em todos os anticorpos analisados. Por fim, o índice de CDs foram estatisticamente significante entre os grupos, exceto para CD83, que não mostrou nenhuma diferença estatística. A distribuição de CD foi reconhecida principalmente na área tumoral e ao redor das células neoplásicas em ambas as entidades. Foi possível concluir que os LDGCB com células HRS-like da cavidade bucal devem ser incluídos no diagnóstico diferencial de LHC da cavidade bucal. Quando da avaliação destes casos, a analise morfológica detalhada assim como o uso de um amplo painel de IQ são recomendados para realizar o diagnóstico correto. A angiogênese é essencial para o desenvolvimento de LDGCB da cavidade bucal, e quaisquer dos anticorpos CD34, CD31 e vWF podem ser utilizados para avaliar os parâmetros morfométricos. A presença significativa de CD nestes linfomas provavelmente desempenha um papel patologicamente relevante nos linfomas. Nossos resultados sugerem que o aumento no número de CD parece ser um fator contribuinte para a resposta imune estimulada pelo crescimento tumoral
Abstract: Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common oral lymphoma. Some DLBCLs can present large cells morphologically similar to Hodgkin and Reed-Sternberg (HRS) cells of classical Hodgkin lymphoma (cHL). The objective of this study was to compare oral DLBCL presenting HRS-like cells (DLBCL-HRS like) with primary nodal cHL, considering the following aspects: histological and immunohistochemical (IHC), angiogenesis, index of mast cells and dendritic cells (DCs); through a broad immunohistochemical panel. Fifteen cases were studied, of which, seven were DLBCL-HRS like and eight were nodal cHL. For histological and IHC aspects, immunoexpression of CD3, CD15, CD20, CD30, CD43, LCA, CD45RO, CD79a, CD83, EMA, MUM-1, PAX-5, perforin, granzyme B, FASN, Ki-67, LMP-1; and EBER1/2, were assessed. As for angiogenesis analysis, the antibodies used were CD34, CD31, D2-40, CD105, vWF and VEGF; and for the index of mast cell were used the mast cell tryptase. Finally, for IHC expression of DCs, the antibodies used were CD1a, CD83, CD123, CD207, S-100, and FXIIIa. All slides were scanned and positive immunoreactive cells HRS-like, mast cell and DCs were analyzed, as well as morphometric parameters of angiogenesis. The results showed that the immunoexpression of CD30 was 100% positive in cHL and 57% in oral DLBCL HRS-like, while LCA, CD20 and CD79a were exclusive for all oral DLBCL, and only CD15 was exclusive for cHL. Angiogenesis and mast cell index values were increased in both lesions and between them, cHL was greater than oral DLBCL with all antibodies studied. Finally, DC subsets were statistically significant between groups, except CD83, which did not show statistical significance. The distribution of DCs was mainly in the tumor area, around neoplastic cells in both entities. It was possible to conclude that DLBCL-HRS should be included in the differential diagnosis of oral cHL. When evaluating these cases, a detailed morphologic and a broad IHC analyses for the correct diagnosis are recommended. Angiogenesis is essential to the development of DLBCL of the oral cavity and any of the antibodies CD34, CD31 and vWF could be used to evaluate morphometric parameters. The presence of significantly higher numbers of DCs in these lymphomas could suggest that these cells are likely to play a pathological relevant role in lymphomas. Our findings suggest that increased number of DCs in lymphomas appears to be a factor contributing to the immune response against tumor growth
Doutorado
Patologia
Doutor em Estomatopatologia

Introdução: O linfoma difuso de grandes células B é o mais freqüente grupo de linfoma não- Hodgkin, perfazendo quase 50% dos casos no serviço de hematologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e Instituto do Câncer do Estado de São Paulo. Possui heterogeneidade clínica e biológica traduzida em mais de vinte subtipos na Organização Mundial da Saúde. Sua terapêutica se baseia na associação do anticorpo monoclonal anti-CD20 e quimioterapia com antracíclico, esquema que resulta em 43,5% de sobrevida global em 10 anos. Determinantes de prognóstico clínico como o Índice Internacional de Prognóstico e o Índice Internacional de Prognóstico Revisado carecem de acurácia, pois até 20% dos pacientes de baixo risco falecerão da doença e 60% dos pacientes de alto risco estarão vivos em quatro anos. Essas discrepâncias podem, em parte, ser atribuídas a fatores genéticos. A assinatura gênica do linfoma difuso de grandes células B tipo centro germinativo apresenta sobrevida global superior ao tipo células B ativadas (76% versus 16%, p=0,01), contudo o perfil de expressão gênica por microarray ainda não está disponível na prática clínica. Entretanto, o escore preditivo de mortalidade para linfoma difuso de grandes células B baseado no valor prognóstico da expressão dos genes BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 e SCYA3 por PCR em tempo real quantitativa mostrou-se independente do Índice Internacional de Prognóstico na era pré-rituximabe. Mas não foi significante em pacientes de alto risco clínico tratados com R-CHOP. Os genes BCL2, CCND2 e SCYA3 integram a assinatura de células B ativadas, BCL6 e LMO2 a do centro germinativo e FN1 a linfonodal. Objetivo: Avaliar o impacto da expressão absoluta dos genes BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 e SCYA3 em população brasileira com linfoma difuso de grandes células B tratada com R-CHOP em relação à resposta global, sobrevida livre de doença, sobrevida livre de progressão e sobrevida global. Métodos: A expressão gênica foi analisada por PCR em tempo real quantitativa de RNA extraído de amostras parafinadas de 63 pacientes, porém foi avaliável em 42. Seus valores foram normatizados pelo gene endógeno ABL e transformados em escala logarítmica na base 2 para posterior correlação com variáveis clínicas e de desfecho. Resultados: Com mediana de seguimento de 29 meses, as sobrevidas global, livre de doença e livre de progressão foram, respectivamente, 82,8%, 97,14% e 87,53%, enquanto a resposta completa foi 82,5%. A expressão de LMO2>3logs e BCL6>3,5logs definiu um grupo de maior sobrevida global (91% versus 64,3%, p=0,040) e sobrevida livre de doença (95,5% versus 70,7%, p=0,03), independentemente do Índice Internacional de Prognóstico (p=0,010 e p=0,042) e com significativa hiperexpressão do SCYA3 (p=0,046). Não se observou associação entre escore preditivo de mortalidade baseado nos seis genes e prognóstico. Assim, foi criado novo escore genético prognóstico baseado no poder da expressão concomitante de LMO2 e CCND2, definindo-se grupos de baixo risco (<2,5) e alto risco (>=2,5) com distintas sobrevidas global (92,4% versus 57,1%, p=0,011) e livre de progressão (96,2% versus 66,7%, p=0,013), independentes do IPI. Conclusão: Em pacientes com linfoma difuso de grandes células B tratados com R-CHOP, a hiperexpressão de BCL6, LMO2 e SCYA3 correlacionou-se com melhor prognóstico. O novo escore genético prognóstico definido por LMO2 e CCND2 estratificou grupos de risco de prognósticos distintos independentes do Índice Internacional de Prognóstico
Introduction: Diffuse large B-cell lymphoma is the most common type of non-Hodgkin lymphoma; which accounts for almost 50% of the cases at the Hematology Department of Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo and Instituto do Câncer do Estado de São Paulo. Its clinical and biological heterogeneity results in more than twenty subtypes according to the World Health Organization classification. Its treatment is based on a combination of anti-CD20 monoclonal antibody and antracycline-based chemotherapy, with a 10-year overall survival of 43.5%. Clinical prognostic determinants such as the International Prognostic Index and the Revised International Prognostic Index lack accuracy, since up to 20% of low-risk patients will die from the disease and up to 60% of high-risk patients will be alive within four years. Such discrepancies can partially be attributed to genetic factors. Diffuse large B-cell lymphoma germinal center gene signature shows superior overall survival compared to activated B-cell signature (76% versus 16%, p=0.01), however microarray gene expression profile is not yet available in clinical practice. Nonetheless, the Mortality Predictor Score for diffuse large B-cell lymphoma based on the prognostic value of BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 and SCYA3 gene expression by quantitative real-time PCR has proved to be independent from the International Prognostic Index in the pre-rituximab era. But it was not significant in high clinical risk patients treated with R-CHOP. The genes BCL2, CCND2 and SCYA3 compose activated B-cell signature, whereas BCL6 and LMO2 compose the germinal center signature and FN1 the lymph-node signature. Objective: Evaluate the impact of BCL2, BCL6, CCND2, FN1, LMO2 and SCYA3 absolute gene expression in Brazilian population diagnosed with diffuse large B-cell lymphoma and treated with R-CHOP, with respect to overall response, disease free survival, progression free survival and overall survival. Methods: Gene expression was analyzed by quantitative real-time PCR of RNA extracted from paraffin-embedded samples of 63 patients, although evaluable in 42. Their values were normalized by endogenous gene ABL and log- transformed on a base 2 scale for subsequent correlation with clinical and outcome variables. Results: With a median follow-up of 29 months, overall survival, disease free survival and progression free survival accounted for 82.8%, 97.14% and 87.53% respectively, while complete response was 82.5%. The expression of LMO2>3logs and BCL6>3.5logs defined a group with higher overall survival (91% versus 64.3%, p=0.040) and progression free survival (95.5% versus 70.7%, p=0.03), independent of International Prognostic Index (p=0.010 and p=0.042) and with significant overexpression of SCYA3 (p=0.046). It was not identified any association between six gene Mortality Predictor Score and prognosis. As a result, we developed the New Genetic Prognostic Score based on the power of concomitant expression of LMO2 and CCND2, defining low-risk (<2.5) and high-risk (>=2.5) groups with distinct overall survival (92.4% versus 57.1%, p=0.011) and progression free survival (96.2% versus 66.7%, p=0.013), independent of International Prognostic Index. Conclusion: In patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with R-CHOP, hyperexpression of BCL6, LMO2 and SCYA3 was correlated with a better prognosis. The New Genetic Prognostic Score, defined by LMO2 and CCND2, stratified risk groups with different prognosis, independent of International Prognostic Index

O linfoma difuso de grandes células B (LDGCB) é o linfoma não-Hodgkin mais comum em nossa instituição (49,5%) e a classificação da Organização Mundial da Saúde reconhece vários subtipos de LDGCB com base na morfologia, imuno-histoquímica (IHQ) e perfil molecular. Metade dos pacientes permanecem incuráveis com terapia padrão baseada no anticorpo monoclonal anti-CD20 (rituximabe) e quimioterapia baseada em antraciclina. Portanto, é necessário identificar pacientes de alto risco e melhorar o seu prognóstico. Na era pré-rituximabe, a melhor maneira de identificar esse grupo de alto risco baseava-se no Índice de Prognóstico Internacional (IPI). Mais recentemente, grande interesse em subtipos moleculares e a caracterização da assinatura gênica das células malignas têm sido publicados. Pacientes com perfil de expressão gênica do centro germinativo (CG) parecem ter melhor prognóstico do que aqueles com assinatura de células B ativadas. Algoritmos IHC correspondentes foram propostos e o de Hans é o mais usado. No entanto, estes indicadores prognósticos têm sido questionados na era rituximabe. Além da classificação molecular, imagem funcional das células tumorais com 18F-fluodesoxiglucose (18F-FDG), a tomografia por emissão de pósitrons (PET/CT) tem sido recomendada ao diagnóstico e final do tratamento para aumentar a acurácia do estadiamento e avaliação de resposta. Embora alguns estudos tenham demonstrado que PET ínterim pode prognosticar a eficácia do tratamento, não há consenso e a utilização da PETi permanece controversa. O objetivo deste estudo foi investigar o impacto de fatores prognósticos clínicos, da PETi após dois ciclos de quimioterapia, e a célula de origem (CO) usando o algoritmo de Hans, como ferramentas prognósticas em pacientes tratados com R-CHOP 21. Foram analisados prospectivamente 147 pacientes. Dados clínicos estavam disponíveis em 146 casos. PETi foi realizada em 111 pacientes e 114 pacientes foram classificados em CG e NCG pelo algoritmo IHC de Hans. Com mediana de seguimento de 42,8 meses, a sobrevida global (SG), sobrevida livre de progressão (SLP) e resposta global (RG) para todos os pacientes foram 73,8%, 84,3% e 87,7%, respectivamente. IPI, R-IPI e NCCN IPI foram todos preditivos de SG. O IPI NCCN foi capaz de melhor discriminar um grupo de alto risco quando comparado ao de outros índices prognósticos clínicos. Embora PETi- tenha identificado um grupo com melhor SG (89,3% SG para PETi- versus 77,5% para a PETi+)(p = 0,04), a SLP entre os dois grupos não foi prognóstica (p=0,45), com SLP em 30 meses de 87,7%/81,2% para PETi- e PET+, respectivamente. O algoritmo de Hans não foi preditivo de SG, SLP ou RG. Associado à PETi-, ser do CG identificou um grupo de muito bom prognóstico, com SG e SLP de 100% em 48 meses. A análise univariada e multivariada revelou que, além da PETi-, o IPI, R-IPI e IPI do NCCN, juntamente com algumas variáveis que compõem este índice, foram preditivos para o SG, SLP e resposta completa. Este estudo mostrou que os fatores prognósticos clínicos são relevantes na era R-CHOP e a PETI, junto com a CO, foram capazes de identificar um subgrupo de muito bom prognóstico. Nossos resultados necessitam de confirmação
Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common non-Hodgkin lymphoma in our institution (49.5%) and the World Health Organization classification recognizes several subtypes of DLBCL based on morphology, immunohistochemistry (IHC) and molecular analysis. A half of patients remain incurable with standard strategy with anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab) and anthracycline-based chemotherapy. Therefore, it is necessary to identify high risk patients and improve their prognosis. In the pre-rituximab era, the best way to identify this high risk group was based on International Prognostic Index (IPI). More recently, lot of interest on molecular subtypes and aspects that characterize the gene signature of the malignant cells have been published. Patients with gene expression profile from germinal center (GC) seem to show better prognosis than those with Bcells activated signature. Correspondents algorithms based on IHC were proposed and Hans algorithm is the most commonly used. However these prognostic indicators have also been questioned in the rituximab era. In addition to the molecular classification, functional imaging of the tumor cells with 18F-fludeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography PET/CT has been recommended at diagnosis and at the end of treatment to improve accuracy of staging and response evaluation. Although some studies have shown that interim PET may be a prognostic indicator of effectiveness of treatment, there is no agreement and the use of interim PET as a prognostic factor remains controversial. The objective of this study was to investigate the impact of clinical prognostic factors, interim imaging with 18F-FDG PET/CT after 2 cycles of treatment and cell of origin (CO) using Hans\' algorithm as prognostic tools in patients treated with R-CHOP 21. 147 DLBCL patients were analyzed prospectively and clinical data was available in 146 cases. 18 F-FDG interim PET/CT was performed in 111 patients and DLBCL was classified as GC and NGC subtype by IHC using Hans\'s algorithm in 114 patients. With a median follow-up of 42.8 months, overall survival (OS), progression free survival (PFS) and overall response (OR) for all patients were 73.8%, 84.3% and 87.7% respectively. IPI, R-IPI and NCCN IPI were all predictive of OS. NCCN IPI was able to better discriminate a high risk group comparable with other clinical prognostic indexes. Although negative iPET identified a group with better OS (89.3% OS for PETi- versus 77.5% for PETi+)(p=0.04), PFS between the two groups was not prognostic (p=0.45) with a 30 months PFS of 87.7% and 81.2%, for PETi- and PET+, respectively. Hans algorithm was not predictive for OS, PFS or OR. Instead it was, together with PETi- and CG origin, able to predict a very good prognostic group, with both 100% OS/PFS in 48 months. The univariate and multivariate analysis revealed that besides negative interim PET, IPI, R-IPI and NCCN IPI along with some variables that compose this indexes, were predictive for OS, PFS and complete response. This study showed that clinical prognostic factors are relevant in R-CHOP era and PETi, along with CO, were able to identify a very good prognostic subgroup. Our results should be confirmed in others studies

Dissertação de Mestrado em Oncologia apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto
Com o advento da poliquimioterapia e sobretudo após a inclusão das antraciclinas nos esquemas de tratamento, melhorou substancialmente a esperança de vida dos doentes com LDGC-B. Apesar disso, muitos doentes ficam ainda por curar. Nos últimos anos diversos estudos têm sido feitos no sentido de identificar características do doente e/ou do tumor - factores de prognóstico que, presentes no diagnóstico, permitam prever quais os doentes que não vão ficar curados com os tratamentos convencionais.No presente estudo retrospectivo, realizado com base na consulta do processo clínico, foram estudados 116 doentes com idade superior a 15 anos, portadores de linfoma difuso de grandes células B (LDGC-B), admitidos e tratados no IPO Porto de Janeiro de 1990 a 31 de Julho de 1998. Após exclusão de 9 doentes, foram analisados 107 casos. Avaliaram-se características do doente (sexo, idade, presença de sintomas B, estado geral; DHL sérica, presença de anemia, linfopenia, alterações das proteínas séricas, elevação da velocidade de sedimentação e da b2 microglobulina) e do tumor (estadio, localização e número de áreas ganglionares e extraganglionares envolvidas, dimensões da maior massa), o tratamento realizado e a resposta ao mesmo. Posteriormente analisaram-se, separadamente, os 95 doentes tratados em primeira linha com esquemas contendo antraciclinas, no sentido de identificar parâmetros clínicos ou analíticos que permitissem prever a resposta ao tratamento e as sobrevivências global (SG) e livre de doença (SLD). Foi também avaliado o impacto prognóstico do índice de prognóstico internacional (IPI).Concluimos que interferem significativamente na resposta ao tratamento, SG e SLD os seguintes parâmetros, que se comportam como factores de prognóstico: sintomas B, estado geral do doente, estadio Ann Arbor, número de locais extraganglionares envolvidos pelo linfoma, envolvimento de gânglios axilares ou inguinais, DHL sérica, linfopenia, hipoproteinemia e/ou hipoalbuminemia, b2 m ...

Dissertação de Mestrado em Oncologia apresentada ao Instituto de Ciências Biomédicas de Abel Salazar da Universidade do Porto
Com o advento da poliquimioterapia e sobretudo após a inclusão das antraciclinas nos esquemas de tratamento, melhorou substancialmente a esperança de vida dos doentes com LDGC-B. Apesar disso, muitos doentes ficam ainda por curar. Nos últimos anos diversos estudos têm sido feitos no sentido de identificar características do doente e/ou do tumor - factores de prognóstico que, presentes no diagnóstico, permitam prever quais os doentes que não vão ficar curados com os tratamentos convencionais.No presente estudo retrospectivo, realizado com base na consulta do processo clínico, foram estudados 116 doentes com idade superior a 15 anos, portadores de linfoma difuso de grandes células B (LDGC-B), admitidos e tratados no IPO Porto de Janeiro de 1990 a 31 de Julho de 1998. Após exclusão de 9 doentes, foram analisados 107 casos. Avaliaram-se características do doente (sexo, idade, presença de sintomas B, estado geral; DHL sérica, presença de anemia, linfopenia, alterações das proteínas séricas, elevação da velocidade de sedimentação e da b2 microglobulina) e do tumor (estadio, localização e número de áreas ganglionares e extraganglionares envolvidas, dimensões da maior massa), o tratamento realizado e a resposta ao mesmo. Posteriormente analisaram-se, separadamente, os 95 doentes tratados em primeira linha com esquemas contendo antraciclinas, no sentido de identificar parâmetros clínicos ou analíticos que permitissem prever a resposta ao tratamento e as sobrevivências global (SG) e livre de doença (SLD). Foi também avaliado o impacto prognóstico do índice de prognóstico internacional (IPI).Concluimos que interferem significativamente na resposta ao tratamento, SG e SLD os seguintes parâmetros, que se comportam como factores de prognóstico: sintomas B, estado geral do doente, estadio Ann Arbor, número de locais extraganglionares envolvidos pelo linfoma, envolvimento de gânglios axilares ou inguinais, DHL sérica, linfopenia, hipoproteinemia e/ou hipoalbuminemia, b2 m ...

El linfoma difuso de células grandes (LDCGB) es la neoplasia linfoide agresiva más frecuente en el mundo occidental. Sin embargo, es una entidad nosológica heterogénea de difícil caracterización por técnicas convencionales. Por otro lado, desde los años ochenta sabemos que es una enfermedad con potencial curativo. La introducción de la inmunoquimioterapia con rituximab (IQTR) ha supuesto el mayor avance en el tratamiento de este tipo de linfoma, incrementando las tasas de remisión y de forma más importante la supervivencia de los pacientes. No obstante, un 25-30% de los pacientes serán refractarios al tratamiento o recaerán. En este grupo de pacientes es prioritaria la identificación de factores pronósticos clínicos y biológicos que permitan caracterizar grupos de riesgo y establecer posibles dianas terapéuticas. Esta tesis doctoral ha permitido profundizar un poco más en la caracterización biológica, clínica y pronostica del LDCGB. El primer trabajo ha contribuido a estudiar los LDCGB de origen primario extraganglionar como una variante particular con características diferentes de las formas ganglionares. Así estos pacientes presentan con mayor frecuencia características pronosticas favorables al diagnóstico (estadio temprano, niveles séricos bajos de LDH, e IPI de bajo riesgo), así como en la evolución (tasa de RC, SLP y SG superior). La segunda contribución del primer trabajo yace en cuestionar el papel de la inmunoquimioterapia en el tratamiento de los LDCGB extraganglionares. En esta entidad, quizás por las características iniciales de buen pronóstico, no observamos un incremento significativo de la supervivencia en aquellos pacientes tratados con IQTR. Ello podría suponer una ausencia de beneficio en estos pacientes, o simplemente que el número de pacientes para las diferentes localizaciones extraganglionares no es suficiente para detectar las diferencias que existen. En el segundo trabajo hemos estudiado la reproducibilidad de la caracterización molecular del LDCGB mediante técnicas de inmunohistoquímica. En la actualidad, los estudios de expresión genotípica (GEP) han permitido dividir al LDCGB en dos subgrupos centrogerminal (CGB) y activado (ABC) con impacto en el pronóstico, teniendo este último una menor supervivencia. Sin embargo, estas técnicas no son aplicables a la práctica clínica habitual dada su complejidad y elevado coste. Por ello, se han realizado intentos de remedar esta información utilizando diferentes algoritmos inmunohistoquímicos (Hans, Colomo, Muris, Choi y Tally) basados en la información extraída de los GEP. Estos algoritmos han establecido dos grupos inmunofenotípicos centrogerminal (CGB) y no-CGB. Sin embargo, nuestros resultados cuestionan el valor de los estudios de inmunohistoquímica como remedo de los perfiles de expresión genotípica. Aunque se encontró una correlación significativa entre los GEP y los diferentes algoritmos inmunohistoquímicos los valores predictivo negativo y positivo fueron relativamente bajos para los cinco algoritmos utilizados. De hecho, 30-50% de los LDCGB de origen CGB y 15-25% de los ABC fueron incorrectamente localizados por la inmunohistoquímica. Además, en términos de supervivencia global ninguno de los 5 algoritmos fue capaz de definir grupos con impacto en el pronóstico.
Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL), although considered a single category in the WHO classification, most likely includes different clinicopathologic entities difficult to separate with the standard techniques. From the clinical standpoint, the introduction of the immunochemoterapy in the treatment of DLBCL has dramatically improved the outcome of these patients with respect to chemotherapy alone. However, a significant proportion of these patients (20-30%) is refractory or eventually relapses. Nowadays, the identification of factors, either biological or clinical, that could recognize poor risk patients is a priority. Different prognostic factors for response and survival have been described in DLBCL, but in the rituximab era, the role of the biological prognostic factors is yet to be determined. In this sense, the first paper studies the main characteristics of the DLBCL extranodal primary origin. These patients more frequently show favorable prognostic features at diagnosis (early stage, low serum LDH and IPI low risk), as well as in evolution. Moreover, this paper questions the role of the immunochemotherapy in the extranodal DLBCL treatment. We observed lack of benefit in these patients, or simply the number of patients for different extranodal sites is not sufficient to detect differences. In the second paper we studied the reproducibility of the DLBCL molecular characterization by means of immunohistochemical studies. Currently, gene expression profiling studies (GEP) have allowed to separated the DLBCL in two subgroups, germinal centre (GCB) and activated (ABC) with the latter having a poorer outcome. However, molecular techniques are not applicable to the routine clinical practice because of its complexity and high cost. Therefore, attempts have been made to mimic this information using different algorithms immunohistochemical (Hans, Colomo, Muris, Choi and Tally) based on information extracted from the GEP. Nevertheless, in the present study none of the five immunohistochemical algorithms were able to accurately predict the GEP subtype or to separate molecular groups with prognostic value. In summary, this study allows to characterize the DLBCL-EN as a variant of good prognosis with a limited benefit of the immunochemotherapy. On the other hand, the DLBCL stratification based on immunohistochemical algorithms (GCB and non-GCB) should be viewed very cautiously.

La presente tesis incluye dos trabajos: PRIMER TRABAJO High microvessel density determines a poor outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus chemotherapy Cardesa-Salzmann et al. Haematologica. 2011; 96(7):996-1001. RESUMEN: Introducción: El linfoma difuso de células grandes (LDCG) es una enfermedad heterogénea a nivel clínico y a nivel molecular. Estudios de expresión génica han demostrado que el microambiente tumoral afecta la supervivencia y que la “signatura” relacionada con angiogénesis es desfavorable. La contribución histopatológica de la densidad microvascular a la supervivencia de los pacientes con LDCG tratados con inmunoquimioterapia es desconocida. El propósito de este estudio fue evaluar el impacto pronóstico de la densidad microvascular tisular en dos series independientes de LDCG tratados con inmunoquimioterapia. Material y métodos: 147 pacientes del proyecto internacional Leukemia Lymphoma Molecular Profiling Project ((LLMPP) (cohorte de “entrenamiento”) y 118 pacientes del grupo catalán de estudio de linfomas (GELCAB) (cohorte de validación) fueron incluídos en el estudio. Las tinciones inmunohistoquímicas para la microvasculatura tisular fueron realizadas con CD31 y cuantificadas con un sistema de análisis de imagen computarizado. El score estromal previamente definido en 110 pacientes del LLMP mediante estudios de expresión génica fue utilizado para analizar correlaciones con los datos obtenidos de microvasculatura tisular. Resultados: La densidad microvascular correlaciona significativamente con el score estromal. (r=0.3209; P<0.001). Los pacientes con una alta densidad microvascular demuestran una supervivencia global significativamente inferior tanto en la “cohorte de entrenamiento” (4-year OS 54% vs. 78%; P=0.004) como en la “cohorte de validación” (57% vs. 81%; P=0.006). En el análisis multivariante en ambos grupos la densidad microvascular fue un factor pronóstico desfavorable independiente del IPI [cohorte de entrenamiento: IPI (riesgo relativo 2.7; p=0.003); densidad microvascular (riesgo relativo 1.96; P=0.002); cohorte de validación: IPI (riesgo relativo 4.74; p<0.001); densidad microvascular (riesgo relativo 2.4; p=0.016)]. Conclusiones: Estos hallazgos realzan el impacto de la angiogénesis en la supervivencia de los pacientes con LDCG así como el interés de evaluar tratamientos antiangiogénicos en ensayos clínicos. SEGUNDO TRABAJO A new biologic prognostic model based on immunohistochemistry predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Blood 2012; 120(11):2290-6. Perry AM, Cardesa-Salzmann et al RESUMEN Los factores biológicos que predicen supervivencia en pacientes con LDCG como célula de origen y “signaturas” estromales fueron descubiertos por estudios de expresión génica. El objetivo del estudio fue intentar simular estos hallazgos y crear un nuevo modelo pronóstico biológico basado en inmunohistoquímica. 199 pacientes con LDCG de novo tratados con R-CHOP u otras combinaciones de inmunoquimioterapia (125 en una cohorte de entrenamiento, 74 en una cohorte de validación) fueron incluídos en el estudio. A partir de tejido parafinado se construyeron arrays de tejidos y a cada factor pronóstico adverso se le concedió un punto (subtipo no-GCB, SPARC <5%, densidad microvascular elevada). Este modelo usando los tres marcadores biológicos demostró ser altamente predictivo de supervivencia global y de supervivencia libre de enfermedad tanto en la cohorte de entrenamiento como en la cohorte de validación tras ajustar para el IPI. Este nuevo modelo identifica a dos grupos de pacientes, uno con una puntuación biológica baja (0-1) y un pronóstico favorable y otro con una puntuación biológica elevada (2-3) y pronóstico desfavorable. Este modelo pronóstico biológico puede usarse conjuntamente con el IPI para estratificar a pacientes para tratamientos ajustados a su riesgo biológico.
this doctoral dissertation contains two studies: A) High microvessel density determines a poor outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with rituximab plus chemotherapy Cardesa-Salzmann et al. Haematologica. 2011; 96(7):996-1001. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is a clinically and molecularly heterogeneous disease. Gene expression profiling studies have shown that the tumor microenvironment affects survival and that the angiogenesis-related signature is prognostically unfavorable. The contribution of histopathological microvessel density (MVD) to survival in DLBCL remains unknown. The purpose was to assess the prognostic impact of histopathological MVD in two independent series of patients with DLBCL treated with immunochemotherapy. 147 patients from the LLMPP (training series) and 118 patients from the GELCAB (validation cohort) were included in the study. Microvessels were immunostained with CD31 and quantified with a computerized image analysis system. The stromal scores defined in 110 LLMPP cases were used to analyze correlations with MVD. MVD significantly correlated with the stromal score. Patients with high MVD showed significantly poorer overall survival (OS) than those with low MVD both in both cohorts. In multivariate analysis, in both groups high MVD was a statistically significant unfavorable prognostic factor independent of international prognostic index (IPI).These findings highlight the impact of angiogenesis in the outcome of patients with DLBCL and the interest of evaluating antiangiogenic drugs in clinical trials. b) A new biologic prognostic model based on immunohistochemistry predicts survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma. Perry AM, Cardesa-Salzmann et al. Blood 2012; 120(11):2290-6. Biologic factors that predict the survival in DLBCL, such as cell of origin and stromal signatures, have been discovered by gene expression profiling. We attempted to simulate these findings and create a new biologic prognostic model based on immunohistochemistry. We studied 199 patients (125 in the training set, 74 in the validation set) with de novo DLBCL treated with rituximab and chemotherapy. 1 point was awarded for each adverse prognostic factor: nongerminal center B cell-like, SPARC < 5%, and MVD quartile 4. The model was highly predictive of OS and EFS in multivariate analysis in both cohorts. This new biologic prognostic model could be used with the IPI to stratify patients for risk-adapted therapies.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A via Janus Kinase (JAK) e do transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) desempenham papéis importantes na patogênese de neoplasias hematopoiéticas. A ativação da via JAK2/STAT3 promove o crescimento e sobrevivência celular em uma variedade de linfomas humanos. Há uma necessidade de compreender a participação da via JAK2/STAT3 em linfomas caninos difusos de grandes células B e do potencial terapêutico dos inibidores de JAK no tratamento dessa doença. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de JAK2-STAT3 em linfomas difusos de grandes células B e o impacto do uso de inibidores de JAK2 como AZD1480 e CYT387 no crescimento in vitro dessa linhagem tumoral. Foi realizada técnica de imuno-histoquímica com os anticorpos anti-STAT3 e anti-STAT3 fosforilado (p-STAT3) em linfonodos acometidos por linfoma difuso de grandes células B e comparado à linfonodos normais e reativos. Para avaliação do efeito terapêutico dos inibidores de JAK2 (AZD1480 e CYT387) foi realizado ensaio de viabilidade celular pelo método de azul de tripan utilizando linhagens celulares de linfoma difuso de grandes células B (CLBL-1) e análise de apoptose por citometria de fluxo utilizando o sistema Annexin V. Houve aumento significativo na expressão de STAT3 e p-STAT3 em linfomas difusos de grandes células B em comparação com linfonodos normais. Ambos os fármacos inibiram o crescimento celular em proporções dependentes da dose administrada e houve um aumento significativo nas taxas de apoptose das células tratadas com inibidores de JAK-2 em comparação ao grupo controle tratado com DMSO. Este é o primeiro estudo a avaliar a via JAK2/STAT3 em linfomas difusos de grandes céluslas B canino e esses dados permitem compreender e explorar o potencial terapêutico dos inibidores de JAK permitindo estudos futuros da eficácia clínica desses fármacos na oncologia veterinária
The Janus Kinase (JAK) and signal transducer and activator of transcription (STAT) pathway play important roles in the pathogenesis of hematologic malignancies. Activated JAK2-STAT3 signaling pathway promotes the growth and survival of a variety of lymphomas in human. There is a great demand for understanding JAK-STAT pathway in canine diffuse large B cell lymphoma (DLBCLs) and evaluating the therapeutic potential of JAK inhibitors. Our study aims to evaluate the expression of JAK2-STAT3 pathway in canine DLBCLs and to assess the impact of AZD1480 and CYT387, two novel JAK inhibitors, on canine DLBCL cell growth. Immunohistochemistry was performed in canine DLBCLs, normal and reactive lymph nodes with primary antibodies against STAT3 and phosphorylated STAT3 (p-STAT3). To evaluate the therapeutic effect of novel JAK inhibitors, canine DLBCL cell line CLBL-1 was treated with either AZD1480 or CYT387 and trypan blue viability assay was performed post treatment. There was a significant increase in expression of STAT3 and pSTAT3 in canine DLBCLs compared with the normal lymph node. Both AZD1480 and CYT387 inhibited canine DLBCL cells in a dose dependent manner. This is the first study to evaluate the JAK2/STAT3 pathway in canine DLBCLs. The knowledge of JAK2-STAT3 activity in canine DLBCLs enables us to understand and explore the therapeutic potential of JAK inhibitors. The dose dependent cell growth inhibition by novel JAK inhibitors in this study will lead into the future studies of the underlying mechanism

[spa] El linfoma B difuso de célula grande (LBDCG) constituye un grupo heterogéneo de linfomas desde el punto de vista biológico y clínico. En torno al 20-40% de los pacientes recaen por lo que es importante buscar marcadores pronósticos para tratar de forma diferencial aquellos casos menos susceptibles de ser curados con tratamiento convencional. Con este propósito, hemos estudiado distintos marcadores pronósticos en una serie homogéneamente tratada con R-CHOP con o sin radioterapia para evaluar su capacidad de influir en nuestras decisiones de manejo terapéutico. Desde el punto de vista de los factores relacionados con el tratamiento, la dosis intensidad relativa (DIR) es ampliamente conocida en linfoma Hodgkin pero hay menos evidencias en LBDCG. Mediante este trabajo analizamos la DIR tanto en una cohorte tratada con R-CHOP21 como con R-CHOP14. En nuestra serie no encontramos diferencias en términos de respuesta y supervivencia entre los pacientes tratados con R-CHOP21 o R-CHOP14, lo cual coincide con lo reportado en los ensayos fase III. Se observó una tendencia a una mayor tasa de reducción de DIR en el grupo de RCHOP14. Sin embargo, el impacto de la reducción de la DIR en la respuesta y supervivencia se observó únicamente en el grupo de R-CHOP21. Por tanto, si evitáramos la reducción de la DIR, los regímenes de R-CHOP21 y R-CHOP14 serían equivalentes en términos de respuesta y supervivencia. En pacientes tratados con RCHOP21 se recomiendan, por tanto, medidas de soporte para evitar estas reducciones. Desde el punto de vista de factores clínicos, se han propuesto numerosos índices pronósticos. El más importante y mayormente usado es el índice pronóstico internacional (IPI), posteriormente validado en la era de Rituximab (R-IPI). Sin embargo, el R-IPI a pesar de ser un buen índice, carece de la habilidad de identificar un grupo de muy alto riesgo en la era de Rituximab: el grupo de alto riesgo del R-IPI tiene una supervivencia global (SG) y supervivencia libre de progresión (SLP) a los 4 años mayor del 50%. En los últimos años, se han hecho esfuerzos para intentar mejorar la habilidad discriminativa del IPI, como el NCCN-IPI. En la era pre-Rituximab también se generó el Tumor Score (TS) considerando exclusivamente variables relacionadas con el tumor. En el presente trabajo, se realizó la validación del TS en la era de Rituximab y se confirmó que todas las variables incluidas en el TS original mantenían un papel pronóstico independiente. Asimismo, el TS demostró una mejor identificación de los pacientes de alto riesgo en comparación con el IPI o el NCCN-IPI. Por otra parte, generamos por primera vez un nuevo índice pronóstico con la inclusión de variables del hemograma (ratio linfocitos/monocitos y amplitud de la distribución eritrocitaria) y la beta-2-microglobulina al diagnóstico que es de fácil obtención en la práctica clínica. En comparación con el R-IPI, este nuevo índice demostró una mejor identificación del subgrupo de muy mal pronóstico tanto para SLP como para SG. Asimismo, con este nuevo índice se confirmó un mejor poder discriminativo tanto para SLP como SG. Por último, desde el punto de vista biológico, estudios previos sugieren que los microRNAs (miRNAs) podrían tener un potencial papel pronóstico en pacientes con linfoma. Nosotros identificamos 3 miRNAs (miRNA-1244, miRNA-193-5p y miRNA- 1231) con papel pronóstico tanto para SLP como para SG. Estos pacientes podrían ser susceptibles de ser tratados con mayor o menor intensidad o con la adición de nuevos fármacos.
[eng] Diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) is a heterogeneous subtype from a biological and clinical point of view. Around 20-40% of the patient´s relapse, so it is important to identify a high-risk population that could benefit from different therapeutic approaches. For this purpose, we have analyzed different prognostic markers in a series homogeneously treated with R-CHOP with or without radiotherapy to evaluate their capacity to influence our therapeutic decisions. Regarding factors related to the treatment, the relative dose intensity (RDI) is a wellknown prognostic factor in Hodgkin lymphoma, but scarce information has been published in DLBCL. Our study analyzed the prognostic impact of RDI in two cohorts of DLBCL patients treated with R-CHOP21 or R-CHOP14 to evaluate its differential impact when increasing dose density. In our series there were no differences in terms of response or survival between patients treated with R-CHOP21 or R-CHOP14, which coincides with reported phase III clinical trials. A higher rate of RDI reduction was observed in the R-CHOP14 group. However, the impact of RDI reductions on response and survival was only observed in the R-CHOP21. We can conclude that R-CHOP21 and R-CHOP14 are equivalent regimens in terms of response and survival only if RDI reductions are avoided. For patients receiving R-CHOP21 we recommend using clinical and support measures in order to avoid RDI reductions. Regarding clinical factors, several scores have been developed. The International Prognostic Index (IPI), lately validated in the rituximab era (R-IPI), has been the most widely used. However, despite being a good prognostic score, it cannot identify a very high-risk subset in the Rituximab era: the high-risk group of R-IPI has a 4-year overall survival (OS) and progression free survival (PFS) higher than 50%. Several attempts have been made to try to improve R-IPI such as the NCCN-IPI. Also, in pre-Rituximab era the Tumor Score (TS) was reported exclusively considering tumor-related variables. In our study, the validation of TS was performed and we confirmed that all variables included in the original TS retain an independent prognostic role. Likewise, TS showed a better identification of patients with high risk prognosis compared to IPI or NCCN-IPI. On the other hand, a new prognosis score including complete blood count variables (lymphocytes/monocytes ratio and red blood cell distribution width) and beta-2- microglobulin at diagnosis is presented for the first time, which is readily available in a real-life practice without additional tests. Compared to R-IPI, this score showed better high-risk assessment for both PFS and OS. Furthermore, better risk discrimination for PFS and OS was confirmed with the new score compared to IPI. Finally, regarding biological factors, previous studies suggest that microRNAs (miRNAs) could have a potential prognostic role in patients with lymphoma. We identified 3 miRNAs (miRNA-1244, miRNA-193-5p and miRNA-1231) with prognostic significance for PFS and OS. These patients could be susceptible to be treated with more or less intensity or with the addition of new drugs.
[cat] El limfoma B difús de cèl·lula gran (LBDCG) constitueix un grup heterogeni de limfomes des del punt de vista biològic i clínic. Al voltant del 20-40% dels pacients recauen, per la qual cosa, és important buscar marcadors pronòstics per tractar de forma diferencial aquells casos menys susceptibles de ser curats amb tractament convencional. Amb aquest propòsit, hem estudiat diferents marcadors pronòstics en una sèrie homogèniament tractada amb R-CHOP amb o sense radioteràpia per avaluar la seva capacitat d’influir en les nostres decisions de maneig terapèutic. Des del punt de vista dels factors relacionats amb el tractament, la dosi intensitat relativa (DIR) és àmpliament coneguda en limfoma Hodgkin però hi ha menys evidències en LBDCG. Mitjançant aquest treball analitzem la DIR tant en una cohort tractada amb R-CHOP21 com amb R-CHOP14. En la nostra sèrie no trobem diferències en termes de resposta i supervivència entre els pacients tractats amb RCHOP21 o R-CHOP14, la qual cosa coincideix amb el reportat en els assajos fase III. Es va observar una tendència a una major taxa de reducció de DIR en el grup de RCHOP14. No obstant, l’impacte de la reducció de la DIR en la resposta i supervivència es va observar únicament en el grup de R-CHOP21. Per tant, si evitéssim la reducció de la DIR, els règims de R-CHOP21 i R-CHOP14 serien equivalents en termes de resposta i supervivència. En pacients tractats amb R-CHOP21 es recomana, per tant, mesures de suport per evitar aquestes reduccions. Des del punt de vista de factors clínics, s’han proposat nombrosos índexs pronòstics. El més important i majorment utilitzat és l’índex pronòstic internacional (IPI), posteriorment validat en l’era de Rituximab (R-IPI). No obstant, l’R-IPI tot i ser un bon índex, manca de l’habilitat d’identificar un grup de molt alt risc en l’era de Rituximab: el grup d’alt risc de l’R-IPI té una supervivència global (SG) i supervivència lliure de progressió (SLP) als 4 anys major del 50%. En els últims anys, s’han fet esforços per intentar millorar l’habilitat discriminativa de l’IPI, com l’NCCN-IPI. En l’era pre- Rituximab també es va generar el Tumor Score (TS) considerant exclusivament variables relacionades amb el tumor. Al present treball, es va realitzar la validació del TS en l’era de Rituximab i es va confirmar que totes les variables incloses en el TS original mantenien un paper pronòstic independent. Així mateix, el TS va demostrar una millor identificació dels pacients d’alt risc en comparació amb l’IPI o l’NCCN-IPI. D’altra banda, generem per primera vegada un nou índex pronòstic amb la inclusió de variables de l’hemograma (ràtio limfòcits/monòcits i amplitud de la distribució eritrocitària) i la beta-2-microglobulina al diagnòstic que és de fàcil obtenció en la pràctica clínica. En comparació amb l’R-IPI, aquest nou índex va demostrar una millor identificació del subgrup de molt mal pronòstic tant per SLP com per SG. Així mateix, amb aquest nou índex es va confirmar un millor poder discriminatiu tant per SLP com SG. Finalment, des del punt de vista biològic, estudis previs suggereixen que els microRNAs (miRNAs) podrien tenir un potencial paper pronòstic en pacients amb limfoma. Nosaltres identifiquem 3 miRNAs (miRNA-1244, miRNA-193-5p i miRNA- 1231) amb paper pronòstic tant per SLP com per SG. Aquest pacients podrien ser susceptibles de ser tractats amb major o menor intensitat o amb l’addició de nous fàrmacs.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
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Os linfomas constituem um grupo heterogêneo de desordens malignas com diferentes comportamentos clínicos, distintos fatores patológicos e características epidemiológicas. O Linfoma Folicular (LF) e o Linfoma Difuso de Grande Célula B (LDGC) são os mais freqüentes tipos de neoplasia linfóide de células B maduras. Na atual classificação OMS para os linfomas, a histologia permanece como importante parâmetro para a classificação, embora o diagnóstico destas neoplasias também possa ser baseado na informação combinada do imunofenótipo, genótipo e manifestações clínicas, as quais por si só fornecem informações suficientes para a conduta clínica. A translocação (14;18)(q32;q21) é uma nas anormalidades citogenéticas mais bem caracterizadas em doenças linfoproliferativas B periféricas, sendo detectável em aproximadamente 90% dos LF e 20% dos LDGC dependendo do teste diagnóstico utilizado. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo padronizar a detecção da translocação t(14;18)(q32;q21) através da reação de PCR multiplex, assim como estabelecer uma relação entre as características imunofenotípicas e moleculares, por citometria de fluxo e reação em cadeia da polimerase, respectivamente, nos LF e LDGC avaliados. A partir da avaliação das características citomorfológicas e imunofenotípicas, 83 amostras de origens variadas foram caracterizadas: Hiperplasia Reacional (10), Linfoma da Zona do Manto (20), Linfoma Folicular (38) e Linfoma de Grande Célula B (15). A pesquisa da t(14;18) relativa ao ponto de quebra em MBR foi realizada em 35 amostras de LF e em 10 de LDGC e a alteração foi revelada em 65,5% das amostras de LF em 30% das amostras de LDGC. Seis casos (15%) sem classificação do tipo de linfoma B pela citomorfologia e a imunofenotipagem confirmaram a translocação pela PCR, revelando a importância desta metodologia na classificação do tipo de linfoma.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior
O linfoma difuso de grandes cÃlulas B (LDGCB) corresponde a 50 % dos casos de linfoma nÃo-Hodgkin (LNH). Seu tratamento de escolha à a quimioterapia de associaÃÃo, em especial o esquema CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona), considerado o tratamento inicial padrÃo dos LDGCB. VariaÃÃes deste esquema, como o protocolo CHOP-Bleo (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina, prednisona e bleomicina) tem sido utilizadas com a intenÃÃo de se obter maiores taxas de remissÃo completa pelos pacientes. No Brasil, pouco se conhece a respeito da incidÃncia, do comportamento clÃnico, da resposta Ãs terapÃuticas utilizadas e da sobrevida de pacientes com LDGCB. Este estudo teve como objetivos traÃar o perfil epidemiolÃgico dos pacientes portadores de linfoma difuso de grandes cÃlulas B, atendidos no Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio (HUWC), com data de primeiro atendimento de janeiro de 1989 a dezembro de 2003, e que fizeram uso dos esquemas quimioterÃpicos CHOP e/ou CHOP-Bleo; avaliar a eficÃcia e seguranÃa terapÃutica dos esquemas propostos atravÃs da anÃlise do tipo de resposta terapÃutica, achados clÃnicos e laboratoriais destes pacientes. A coleta dos dados foi realizada a partir dos prontuÃrios mÃdicos dos 31 pacientes analisados. Destes, 21 (67,74%) eram do sexo masculino e 10 (32,26%) do feminino, com idade mÃdia de 45,81  16,3 anos. A ocupaÃÃo trabalhador agrÃcola representou 25,82% (8/31). O estÃdio III da classificaÃÃo de Ann Arbor foi o mais freqÃente (32,26%), mas apenas 45% dos pacientes apresentaram sintomas B. A lactato desidrogenase (LDH) sÃrica de 49% dos pacientes encontrava-se elevada à Ãpoca do diagnÃstico, sendo que outros 16% dos pacientes nÃo apresentavam resultado desta enzima em seus prontuÃrios. Quanto ao IPI, 71% foram classificados como de risco baixo e intermediÃrio, 13% de alto risco intermediÃrio, nenhum dos pacientes do estudo apresentou IPI compatÃvel com de alto risco e em 16% dos pacientes nÃo foi possÃvel estabelecer a classificaÃÃo devido à ausÃncia de dados nos prontuÃrios. Quanto à utilizaÃÃo dos protocolos quimioterÃpicos, 58% (18/31) dos pacientes fizeram uso do esquema CHOP, 36% (11/31) utilizaram CHOP-Bleo e 6% (2/31) utilizaram os dois esquemas quimioterÃpicos. Entre os pacientes que utilizaram o esquema CHOP, 78% atingiram a remissÃo completa (RC), 17% apresentaram recidiva da doenÃa e apenas 5 % foram a Ãbito. No grupo que utilizou o esquema CHOP-Bleo, 63% atingiram a RC, 18% apresentaram recidiva da doenÃa e 19% foram a Ãbito. Os 2 pacientes que utilizaram os dois esquemas como tratamento apresentaram recidiva da doenÃa. Os valores de LDH dos pacientes apÃs a quimioterapia apresentam-se reduzidos tanto em pacientes que atingiram a remissÃo completa como naqueles que tiveram recidiva. Verificamos que a sobrevida global (SG) e a sobrevida livre de doenÃa (SLD) nÃo foram influenciadas pelo estÃdio clÃnico e LDH inicial dos pacientes. A regressÃo logÃstica nÃo mostrou significÃncia estatÃstica quando analisou a remissÃo completa dos pacientes a partir dos resultados das variÃveis em estudo pÃs QT, com exceÃÃo da proporÃÃo de reduÃÃo da LDH e a resposta ao tratamento. Os resultados mostraram a eficÃcia e seguranÃa dos esquemas terapÃuticos CHOP e CHOP-Bleo em nossa populaÃÃo de estudo. Os resultados demonstram ainda que se faz necessÃrio o estudo epidemiolÃgico de diferentes populaÃÃes com LDGCB para que haja seguranÃa na escolha de esquemas quimioterÃpicos, bem como a uniformidade em descrever e classificar os linfomas e os seus fatores prognÃstico por parte dos patologistas e oncologistas.
Diffuse Large B-Cell Lymphomas (DLBCL) corresponds to 50% of non-Hodgkinâs lymphomas (LNH). Their treatment of choice is the association chemotherapy, in special the CHOP therapy (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine and prednisone) considered the standard treatment initial of the DLBCL. Variations of this therapy, with the CHOP-Bleo protocol (cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, prednisone and bleomycin) have been used with the intention of obtaining complete response rates for the patients. In Brazil, little is known about the incidence, clinical behavior, response to therapy and survival of the patients with DLBCL. This study aimed to set out the epidemiological profile of patients with diffuse large B-Cell lymphomas, who received medical care at Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio (HUWC), outline in Cearà state, with the first attendment from January 1989 to December 2003, who the used the CHOP and/or CHOP-Bleo therapy; Evaluating the security and efficiency of the protocols proposed by analysis of the kind of therapeutical response, clinical and laboratorial outcomes of these patients. The data collection was performed from medical recording of the 31 patients analyzed. These, 21 (67,74%) were the men and 10 (32,26%) women. The average age was 45,81  16,3 anos. Agriculturists represented 25,82% (8/31) of all patients. The stage III the Ann Arbor classification were the most frequent (32,26%), but only 45% of the patients had B symptoms. The values of lactate dehydrogenises (LDH) enzyme were elevated in 49% of the patients at diagnosis, but in 16% of the patients these values at diagnosis were unknown. As much as the IPI, 71% were classified as an IPI low and intermediate risk, 13% as an IPI intermediate-high risk, none of the study patients showed as an IPI high risk and 16% there is not possible the classification to establish due to the data is unknown. As much as the chemotherapy protocols used, 58% (18/31) of the patients was received CHOP chemotherapy, 36% (11/31) CHOP-Bleo chemotherapy and 6% (2/31) received CHOP associated with CHOP-Bleo chemotherapy. Among the patients who used CHOP chemotherapy, 78% was achieving complete response (CR), 17% was achieving relapse of the disease and only 5% were the death. In the group who used CHOP-Bleo chemotherapy, 63% was achieving RC, 18% was achieving relapse of the disease and 19% died. The 2 patients who used CHOP and CHOP-Bleo chemotherapy were achieving relapse of the disease. The values of the LDH after chemotherapy showed decreased in patients with RC as much as the relapsed patients. We verified that the overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) were not influenced by the clinic stage and initial values of the LDH patients. The logistic regression did not show statistical differences when the complete response was analyzed comparing to outcomes the studied variables after QT, except for the proportion of reduction of LDH levels and response to the treatment. The results stress the security and efficiency of the protocols CHOP e CHOP-Bleo in our study population. The data obtained also the need epidemiological studies in different DLBCL populations for the security in the choice chemotherapy, well as standardized the classification and description of the DLBCL and prognoses factures by pathologists and oncologists.

Trabalho final de mestrado integrado em Medicina (Biologia Molecular/Hemato-Oncologia), apresentado à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
O Linfoma Difuso de Grandes Células B é o mais comum dos subtipos de Linfoma não-Hodgkin, representando cerca de 30 a 58 % dos casos destas neoplasias. Tal como em outros linfomas, a via do fator de transcrição nuclear kB (NF-kB) está envolvida no seu processo oncogénico. Após ativação, o NF-kB é translocado do citoplasma para o núcleo celular, acionando a transcrição génica de fatores antiapoptóticos. Desta forma, a desregulação da via do NF-kB confere às células cancerígenas vantagem na sobrevivência por inibir a apoptose, sendo responsável pelo desenvolvimento de vários Linfomas não-Hodgkin e sendo essencial para o Linfoma Difuso de Grandes Células B. A inativação do NF-kB conseguida pela inibição da IKK ou pela inibição da degradação proteasómica do IkB surge assim como potencial estratégia terapêutica neste tipo de linfomas. O objetivo desta investigação foi avaliar o potencial terapêutico de um inibidor da IKK (Parthenolide) e de um inibidor do proteasoma (MG-262) no Linfoma Difuso de Grandes Células B, em monoterapia e em associação com a quimioterapia convencional. Pretendeu-se ainda clarificar os mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade induzida por estes fármacos. Uma linha celular de Linfoma Difuso de Grandes Células B, as células Farage, foi testada na ausência e na presença de doses crescentes de Parthenolide e MG-262, em monoterapia e em associação com a Vincristina, fármaco anticancerígeno do esquema de tratamento convencional. O efeito antiproliferativo foi avaliado pelo Teste metabólico da resazurina. O tipo de morte celular foi investigado por Citometria de Fluxo (pela dupla marcação celular com Anexina V e Iodeto de Propídeo e pela análise do ciclo celular) e por Microscopia Ótica (usando a coloração May-Grünwald-Giemsa). A expressão da Caspase 3, molécula reguladora da apoptose, foi analisada por Citometria de Fluxo utilizando um anticorpo monoclonal marcado com um fluorocromo. Este método foi utilizado para avaliar a expressão do NF-kB fosforilado e de conjugados de ubiquitina, de forma a esclarecer o efeito farmacodinâmico do Parthenolide e do MG-262, respetivamente. Os resultados obtidos mostram que o Parthenolide e o MG-262, tanto em monoterapia como em combinação com a Vincristina, reduziram a viabilidade celular de modo dependente da dose e do tempo de exposição, induzindo morte celular predominantemente por apoptose. Um efeito antiproliferativo sinérgico foi observado quando a Vincristina foi usada em combinação com o MG-262, sugerindo um benefício clínico. A diminuição do NF-kB fosforilado e o aumento dos conjugados de ubiquitina traduzem a inibição da IKK e do proteasoma, respetivamente pelo Parthenolide e MG-262, confirmando o efeito inibitório da via do NF-kB por estes dois fármacos. Assim, este estudo sugere que o Parthenolide e o MG-262 podem constituir novas abordagens terapêuticas no Linfoma Difuso de Grandes Células B.
Diffuse Large B-cell Lymphoma is the most common type of non-Hodgkin lymphoma, accounting for about 30 to 58% of all cases. As in other lymphomas, the nuclear transcription factor kB (NF-kB) pathway is involved in the oncogenic process. After activation, NF-kB translocates from the cell cytoplasm to the nucleus where it participates in gene transcription, resulting in the expression of antiapoptotic factors. Therefore, the deregulation of NF-kB pathway plays a role in the development of several non-Hodgkin lymphomas as it confers cancer cells a survival advantage by inhibiting apoptosis, being critical in Diffuse Large B-cell Lymphoma. The inactivation of NF-kB by inhibiting IKK or the degradation of IkB in the proteasome might be a new therapeutic strategy in this kind of lymphomas. The aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of an IKK inhibitor (Parthenolide) and a proteasome inhibitor (MG-262) in Diffuse Large B-cell Lymphoma, both in monotherapy and in association with conventional chemotherapeutic drugs. We also intended to clarify the molecular mechanisms involved in the cytotoxicity induced by these drugs. We used the Farage cells, a Diffuse Large B-cell Lymphoma cell line, tested in absence and presence of increasing concentrations of Parthenolide and MG-262, both in monotherapy and in association with Vincristine, an anticarginogenic drug used in the conventional therapeutic regimen. The antiproliferative effect was assessed by the resazurin metabolism assay. The type of cell death was investigated by flow cytometry (with Annexin V and Propidium Iodide double staining and cell cycle analysis) and optical microscopy (using May-Grünwald-Giemsa staining). The expression of the apoptosis-regulating molecule Caspase 3 was assessed by flow citometry using an antibody labeled with a fluorescent probe. This same methodology was used to measure the expression of phosphorilated NF-kB and ubiquitin conjugates in order to evaluate the pharmacodynamic effect of Parthenolide and MG-262, respectively. The results obtained showed that Parthenolide and MG-262, either alone or in association with Vincristine, induced cell death mainly by apoptosis in a time- and dose-dependent manner. A synergistic antiproliferative effect was observed when Vincristine was used in combination with MG-262, suggesting a clinical benefit. The observed decrease in phosphorylated NF-kB and the increase in ubiquitin conjugates are related with IKK and proteasome inhibition, respectively by Parthenolide and MG262, which confirms the effects of these drugs on NF-kB pathway inhibition. This study suggests that Parthenolide and MG-262 might be used as a new therapeutic approach in Diffuse Large B-Cell Lymphoma.

Orientação: Pedro Faísca ; co-orientação: Joaquim Henriques
Linfoma é relatado como sendo o tumor hematopoiético mais comum em cães. Os Macrófagos associados ao tumor (MAT) representam um dos componentes celulares mais abundantes no microambiente tumoral e principais contribuintes para a inflamação relacionada ao tumor. Os MAT reúnem uma série de funções (por exemplo, a promoção da proliferação de células tumorais e angiogénese, a remodelação da matriz extracelular, a inércia da imunidade adaptativa), que em última análise, têm um impacto importante na progressão da doença. Neste estudo prospetivo, 31 amostras previamente diagnosticados e caracterizada como canino DLBCL foram coradas com MAC 387, a fim de avaliar infiltração TAM. Todas as amostras foram processadas de acordo com a técnica validada usada atualmente pelo Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil, Lisboa. Os resultados não mostraram nenhuma correlação entre a expressão do MAC 387 e sobrevivência. Da mesma forma, não foi encontrada correlação entre altos valores de TAM e fatores intrínsecos da doença. Apesar disso, microambiente tumoral não deve ser descartada como alvo para novos estudos prospetivos. Este trabalho alerta para a falta de marcadores específicos da linhagem mielóide.
Lymphoma is reported to be the most common hematopoietic tumor in dogs. Tumor-associated macrophages (TAM) represent one of the most abundant cell components in the tumor environment and key contributors to cancer-related inflammation, summarize a number of functions (e.g., promotion of tumor cell proliferation and angiogenesis, matrix turnover, repression of adaptive immunity), which ultimately have an important impact on disease progression. In this prospective study, 31 samples previously diagnosed and characterized as canine DLBCL were stained with MAC 387 in order to evaluate TAM infiltration. All the samples were processed according to the validated technique currently used by Instituto Português de Oncologia de Francisco Gentil, Lisboa. The results showed no correlation between expression of MAC 387 and survival. In the same way no correlation was found between high TAM and intrinsic factors of the disease. In spite of this, tumoral microenvironment shouldn’t be discarded as target for new prospective studies. This work warns to the lack of specific markers of myeloid line.

O linfoma representa um grupo heterógeno de neoplasias com origem na alteração maligna das células linfoides. Dependendo do tipo de células afetadas e do grau de desenvolvimento da doença, o linfoma pode apresentar diferentes comportamentos biológicos e prognósticos. Em cães, o linfoma é o tumor hematopoiético mais comum, apresentando várias semelhanças com o linfoma não-Hodgkin em humanos. Cerca de 70% dos casos de linfoma no cão têm origem em células B, sendo o linfoma B difuso de células grandes um dos subtipos mais comuns. Apesar do linfoma B difuso de células grandes constituir uma neoplasia de alto grau, tem-se verificado melhorias na abordagem terapêutica e consequentemente no prognóstico. Não obstante, a maioria dos cães que são submetidos a quimioterapia e atingem remissão completa, eventualmente apresentam uma recidiva tumoral. A avaliação do número de células neoplásicas que permanecem num paciente durante ou após ser submetido a tratamento, ou seja, o grau de doença mínima residual, permite correlacionar com a possibilidade de remissão clínica ou recidiva tumoral. Um aumento da quantificação da doença mínima residual durante o tratamento quimioterápico é indicativo de uma inadequada eficácia do mesmo. Por sua vez, caso se verifique o aumento da quantificação da doença mínima residual após tratamento, é possível inferir acerca de uma possível recidiva. A deteção da doença mínima residual em animais com linfoma B difuso de células grandes é feita com recurso a várias técnicas, no entanto, a citometria de fluxo demonstrou ser relevante em cães com a referida patologia. Em Medicina Veterinária, a citometria de fluxo tem-se revelado de grande utilidade na análise e caracterização imunofenotípica do linfoma maligno na espécie canina. Quanto ao linfoma B difuso de células grandes, esta técnica tem permitido avaliar a infiltração neoplásica em amostras de sangue periférico, medula óssea e linfonodos.
Lymphoma represents a heterogeneous group of neoplasms arising from the transformation of malignant lymphoid cells. Depending upon the type of cells affected and the degree of the development of the disease, lymphoma is associated with different behaviour and prognosis. In dogs, lymphoma is considered the most common hematopoietic malignant neoplasm, presenting several similarities with non-Hodgkin's lymphoma, in humans. About 70% of lymphoma cases may have originated in B cells with diffuse large B-cell lymphoma is one of the most common subtypes. Although diffuse large B-cell lymphoma is a high-grade neoplasia, improvements have been observed nowadays in treatment and therefore in its prognosis. However, most patients that undergo chemotherapy and achieve complete remission then might eventually relapse. The quantification of minimal residual disease which is the neoplastic cells that remain in a patient after or under a chemotherapy treatment, allows to correlate with clinical remission or relapse. If the quantification of minimal residual disease found to be high under therapy that indicates an inadequate treatment response. Otherwise if the quantification of minimal residual disease found to be high after therapy it could represent an eventual relapse. The quantification of minimal residual disease in animals with diffuse large B-cell lymphoma is performed by several different techniques, however, flow cytometry has demonstrated to be relevant in dogs with this specific neoplasm. In veterinary medicine, flow cytometry has shown to be very useful in the immunophenotypic analysis and characterization of lymphoma within dogs. About the diffuse large B cell lymphoma, these technique has allowed the evaluation of neoplasm infiltration in the peripheral blood, bone marrow and lymphnodes.

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2017
Os grandes progressos obtidos na identificação do genoma humano revolucionaram a forma como se abordam, atualmente, as patologias de foro oncológico (1). O objetivo deste estudo foi estudar, ao nível do diagnóstico e da terapêutica, as neoplasias linfóides que afetam, principalmente, as células B maduras. Neste trabalho, foi utilizada a última classificação dos tumores do tecido hematopoiético e linfático, da Organização Mundial de Saúde, publicada em 2016. Esta abordagem, baseada em múltiplos parâmetros, foi validada em inúmeros estudos e apresentada como sendo altamente reprodutível e de uso vantajoso na investigação clínica. Atendendo a que, este tema, engloba numerosas entidades, foram desenvolvidas as mais relevantes, quer pela sua taxa de frequência, quer pelas suas particularidades clínicas. Nomeadamente, a leucemia linfocítica crónica, a leucemia a tricoleucocitos, o linfoma folicular, o linfoma difuso de grandes células B, o linfoma do manto, o linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin e o mieloma múltiplo (2). As técnicas de citometria de fluxo, têm sido o método preferencial para a determinação da linhagem celular e análise da maturação das células nas neoplasias hematológicas. Permitem detetar e quantificar antigénios celulares de superfície, citoplasmáticos e nucleares. Para identificar as alterações genéticas, técnicas de citogenética como a hibridação in situ por imunofluorescência, a cariotipagem espectral e a hibridação genómica comparativa, são utilizadas preferencialmente (3,4). Neste trabalho, foram discutidas as terapias convencionais, confrontando-as com as estratégias terapêuticas emergentes. A disponibilidade de novos fármacos, mais específicos, aumentou significativamente a qualidade de vida e a sobrevivência dos doentes com neoplasias linfóides. Aos agentes quimioterápicos convencionais, foram adicionados fármacos específicos tais como: anticorpos monoclonais (rituximab), imunomoduladores (talidomida e lenalidomida), inibidores do proteossoma (bortezomib), inibidores da tirosina cinase de Bruton (ibrutinib) e inibidores da B cell lymphoma protein 2 (venetoclax), entre outros (5). A investigação, no futuro, orientando-se para uma medicina de precisão, deve procurar identificar, com acuidade, as alterações genéticas responsáveis pelas diversas neoplasias linfóides e continuar a desenvolver estratégias terapêuticas cada vez mais específicas (5).
In recent years we have witnessed a substantial development in the identification of the human genome. This, led to a revolution on the approach of oncologic disorders and their therapeutics (1). The aim of this study is to characterize the current status of the lymphoyd neoplasms that affect mostly mature B cells. In this work was used the World Health Organization (WHO) classification of Tumors of hematopoietic and lymphatic tissue, updated in 2016. The multiparameter approach to classification, adopted by the World Health Organization, has been validated in international studies as being highly reproducible and enhancing the interpretation of clinical and translational studies. Among the numerous entities that fit into B cell mature lymphomas, we have selected eight taking into account its high frequency and/ or its clinical particularities. These are chronic lymphocytic leukemia, hairy cells leucemia,follicular lymphoma, large B cells diffuse lymphoma, mantle cells lymphoma, Burkitt’s lymphoma, multiple myeloma, and Hodgkin’s lymphoma (2). The flow citometry technics, has been the preferred method to determine cell lines and examine maturation process of neoplasic cells (3). To identify genetic transformations, citogenetic technics such as immunofluorescence in situ hybridization, spectral karyotyping and comparative genomic hybridization are used (4). The standard therapy, and the correlation with new specific drugs for each of this disorders was discussed. The availability of new specific drugs increased the lifespan of the pacients and improved their quality of life. To convencional chemmoterapic agents, better targeted drugs have been added, such as monoclonal antibodies (rituximab), immunomodulatory agents (thalidomide, lenalidomide), proteossom inhibitor (bortezomib), Bruton’s tirocinase inhibitor (ibrutinib), B cell lymphoma 2 protein inhibitor (venetoclax), among others (5). Future research, heading towards precision medicine, should seek to better identify each particular genetic alteration of lymphoid neoplasms and continue to improve increasingly specific therapeutic strategies (5).

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2018
O diagnóstico de uma neoplasia maligna durante a gravidez é um acontecimento muito raro. Por sua vez, os linfomas são a quarta neoplasia maligna mais frequentemente diagnosticada durante a gravidez, sendo o diagnóstico de um Linfoma Não Hodgkin (LNH) – no qual se inclui o Linfoma de Grande Células B Primário do Mediastino (LGCBPM) - mais raro do que o de um Linfoma de Hodgkin (LH). Apresenta-se o caso clínico de uma mulher de 31 anos diagnosticada com um LGCBPM (estadio II) às 23 semanas de gestação, na sequência de toracalgia intensa, tosse produtiva persistente e astenia de agravamento progressivo. A marcha diagnóstica consistiu na realização de análises sanguíneas, telerradiografia de tórax e biópsia da lesão suspeita. O estadiamento incluiu a realização adicional de ressonância magnética abdomino-pélvica e tomografia computorizada cervical e torácica. Foi tratada com quatro ciclos de quimioterapia, tendo recebido todos os ciclos durante a gestação. O recém-nascido nasceu, às 37 semanas, saudável e com um peso adequado à idade gestacional, na sequência de uma cesariana electiva. Sendo este diagnóstico raro, a discussão do caso clínico motivou uma revisão dos dados da literatura acerca do LGCBPM durante a gestação, na tentativa de uniformizar a abordagem diagnóstica e tratamento destas doentes e de perceber as particularidades obstétricas das mesmas. Os dados e estudos existentes e disponíveis ainda são insuficientes, sendo necessários mais estudos para que possa ser dada uma melhor resposta a esta situação clínica.
The diagnosis of cancer during pregnancy is something very rare in medical practice. In particular, lymphomas are the fourth more frequently diagnosed malignant neoplasms during pregnancy. The diagnosis of Non-Hodgkin Lymphoma (NHL), which includes the Primary Mediastinal Large B-Cell Lymphoma (PMLBCL), is even less frequent than the diagnosis of an Hodgkin Lymphoma (HL). In this paper is reported the case of a 31 year old woman diagnosed with PMLBCL (Stage II) during the 23rd week of pregnancy, who presented with intense chest pain, persistent sputum productive cough and asthenia. The diagnostic evaluation of the patient included further examination, such as blood tests, chest radiograph and biopsy of the main lesion. In order to perform staging of the neoplasm, an abdmomino-pelvic magnetic resonance and cervical and thoracic computorized tomography were performed. The patient was treated with four chemotherapy cycles, all of wich administered during pregnancy. The newborn was born at the 37th week of pregnancy, healthy and with a normal weight for the gestacional age, from an elective C-Section. Given the rarity of this diagnosis, the case report discussion allowed for a review on PMLBCL during pregnancy, which attempted to standardize the diagnostic approach and treatment of these patients. It was also important to understand the obstetrical particularities of these patients. The available studies and data revealed to be yet insufficient, which makes awareness of the necessity of further studies on the subject, in order for a better clinical response to these cases.

Tese de Doutoramento do Programa de Doutoramento em Ciências da Saúde, ramo de Tecnologias da Saúde, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra.
A radioterapia é uma das modalidades de tratamento mais comummente utilizada para o tratamento do cancro, tanto de tumores sólidos como de tumores com origem hematopoiética. O cancro do pulmão é um tumor sólido, com uma das taxas de incidência e de mortalidade mais elevadas em todo mundo. O linfoma difuso de grandes células B é um tumor hematopoiético e o tipo mais comum de linfoma- não Hodgkin. Este trabalho teve como um dos objetivos determinar e caraterizar os efeitos intracelulares da radioterapia em linhas celulares de cancro do pulmão de pequenas células (H69) e de não pequenas células (A549 e H1299) e de linfoma difuso de grandes células B (Farage). Para este propósito, foram determinados os efeitos da radiação ionizante na viabilidade, na proliferação, na sobrevivência e nos mecanismos de morte celular. Realizaram-se os ensaios do azul tripano, do Alamar Blue®, clonogénico, estudos de citometria de fluxo, através da dupla marcação com anexina V e com iodeto de propídeo, da marcação das proteínas BAX e BCL-2, das alterações no potencial de membrana mitocondrial e estudos de morfologia celular com a coloração May-Grünwald Giemsa. Para além disto, foram também avaliados, por citometria de fluxo, os efeitos da radiação ionizante no stresse oxidativo, no que respeita à produção intracelular de peróxidos, de radical superóxido e da defesa anti-oxidante glutationa reduzida. Os danos no DNA foram determinados pelo ensaio cometa, e a expressão da proteína P53 total e fosforilada foi avaliada por western blot. Paralelamente constituiu outro objetivo deste trabalho a avaliação dos efeitos da radioterapia no sistema imunitário de doentes com cancro do pulmão e com linfoma difuso de grandes células B. Para a concretização deste objetivo foram incluídos neste estudo 8 doentes de cancro do pulmão e 9 doentes de linfoma difuso de grandes células B. Após a colheita de sangue periférico foram determinadas as contagens leucocitárias pela realização de um leucograma, as contagens linfocitárias e das células T reguladoras com recurso a Lymphogram® e imunofenotipagem, respetivamente. Foram ainda avaliadas trinta e quatro citocinas e quimiocinas, relevantes na resposta do sistema imunitário, através do kit comercial ProcartaPlexTM Immunoassay Magnetic Beads. A radiação ionizante induziu diminuição da proliferação, da viabilidade e da sobrevivência celular em todas as linhas celulares. No entanto, a sobrevivência ajustou-se a modelos de agressão celular distintos. Enquanto as linhas celulares H1299 e Farage apresentaram uma resposta correspondente que se ajustou ao modelo linear quadrático, as linhas celulares H69 e A549 apresentaram uma resposta correspondente ao modelo de um só alvo um só toque, portanto, ao modelo linear. Após exposição à radiação ionizante, o tipo de morte celular preferencial foi dependente da dose e, presumivelmente, do perfil de expressão de P53. Assim a expressão P53Wild, das células Farage e A549, foi associada a morte celular por apoptose, enquanto a ausência de expressão, verificada nas células H1299, e a produção de uma proteína mutada, descrita nas H69, foi associada a morte celular por necrose, particularmente com as doses mais elevadas. Além disso, nas linhas celulares Farage e A549 os níveis de expressão da proteína P53 com a irradiação tanto no que respeita à proteína total como à forma fosforilada aumentam. De forma complementar verificou-se que a despolarização de membrana mitocondrial e o aumento da razão BAX/BCL-2 indicam que a morte celular por apoptose, típica das células P53Wild, parece ser ativada pela via intrínseca. Relativamente ao ciclo celular verificou-se bloqueio nas fases G0/G1 e na fase S nas linhas celulares Farage e A549 enquanto as linhas celulares H1299 e H69 progrediram nas referidas fases mas ficaram comprometidas mais tardiamente na fase G2/M. Estes dados reforçam a importância do perfil molecular na resposta à radiação ionizante. Finalmente, o stresse oxidativo e os danos no DNA destacaram-se como processos de grande importância associados aos efeitos da radiação ionizante. Paralelamente, o estudo de patologia humana realizado no âmbito desta Tese revelou que a resposta do sistema imunitário ao tratamento por radioterapia foi dependente do tipo de cancro em estudo. A avaliação do leucograma dos doentes com cancro do pulmão evidenciou alterações nos leucócitos, linfócitos e monócitos a meio do tratamento com radioterapia. No entanto, não se observaram diferenças significativas no leucograma dos doentes com linfoma difuso de grandes células B. Do mesmo modo, nos doentes com cancro do pulmão observaram-se alterações no linfograma no que respeita às células B, às células Natural Killer e às células Natural Killer citotóxicas. Por outro lado, nos doentes com linfoma difuso de grandes células B verificaram-se alterações a nível das células T reguladoras induzidas. Relativamente às citocinas e às quimiocinas associadas ao perfil Th1 destacou- se o aumento da concentração de interferão γ nos doentes com linfoma difuso de grandes células B. Os doentes com cancro do pulmão apresentaram um perfil Th1 mais acentuado do que os doentes com linfoma difuso de grandes células B, o que se concluiu pelos níveis superiores de IL-2, de INF-γ e de IL-1β. Paralelamente, o perfil Th2 caracterizou-se pela maior concentração de IL-5, no sangue periférico dos doentes com linfoma difuso de grandes células B. Finalmente, destacou-se o aumento da concentração de IL-27 e de IL-7 nos doentes com cancro do pulmão. Com este trabalho foi possível concluir que a resposta à radioterapia é dependente das caraterísticas celulares e moleculares das células tumorais em estudo. O melhor conhecimento e compreensão das caraterísticas moleculares do tumor e dos mecanismos de resposta ao tratamento constituem uma mais-valia na decisão terapêutica e na avaliação do prognóstico. Para além disto, o microambiente tumoral, bem como a atuação do sistema imunitário sobre células tumorais no contexto da radioterapia, podem condicionar a resposta à terapêutica e a sobrevivência a longo termo.
Radiotherapy is one of the most common modalities used for treating both solid tumors and hematopoietic origintumors. Lung cancer is a solid tumor, with on of the higher incidence and mortality rates worldwide. Diffuse large B-cell lymphoma is a hematopoietic tumor being the most common type of lymphoma non-Hodgkin. One of the aims of this work was to determine and characterize the intracellular effects of radiotherapy in cell lines of small cell lung cancer (H69), non-small cell lung cancer (A549 and H1299) and diffuse large B cell lymphoma (Farage). For this purpose, we determined the effects of ionizing radiation on viability, proliferation, survival and cell death mechanisms. For this, trypan blue assay, Alamar Blue® assay, clonogenic studies, flow cytometry studies, using the double staining with Annexin V and propidium iodide, labelling BAX and BCL-2 proteins, alteration of mitochondrial membrane potential, and cell morphology studies, with May Grünwald-Giemsa staining, were performed. Furthermore, we also evaluated by flow cytometry, the effects of ionizing radiation in the oxidative stress regarding production of intracellular peroxides, superoxide radicals and of the anti-oxidant defense glutathione. The DNA damage was determined by the comet assay, and the expression of phosphorylated and total P53 protein was assessed by Western blot. Alongside, another aim of this study was to evaluate the effects of radiation on the immune system of patients with lung cancer and with diffuse large B cell lymphoma. To achieve this goal eight lung cancer patients and nine diffuse large B cell lymphoma patients were included in this study. After collecting peripheral blood, leukocyte counts were determined as well as the lymphocyte counts and the regulatory T cells using the Lymphogram® and immunophenotyping, respectively. We also evaluated thirty four cytokines and chemokines relevant to the response of the immune system through the commercial kit ProcartaPlex™ Immunoassay Magnetic Beads. Ionizing radiation induced a decrease in proliferation, viability and cell survival in all cell lines. However, survival was adjusted to different cellular injury models. While H1299 and Farage cell lines had a response that correspondes to the linear quadratic model, H69 and A549 cell lines showed a response set to the model of one touch one target, íe the linear model. After exposure to ionizing radiation, the preferred type of cell death observed was dose dependent and, presumably, P53 profile expression dependent. Thus, expression of P53Wild in Farage and A549 cells was associated with cell death by apoptosis while no P53 expression observed in H1299 cells, and production of a mutated protein, described for H69, was associated with cell death by necrosis, particularly at higher doses. In addition, the A549 and Farage cell lines the level of P53 protein and of phospohorilated P53 protein augmented. Complementarily, the depolarization of the mitochondrial membrane potential and the increase in BAX/BCL-2 ratio indicates that cell death by apoptosis, typical of P53Wild cells, seem to be activated by the intrinsic pathway. For the cell cycle a blockage in G0/G1 and S phase was observed in A549 and in Farage cell lines while H69 and H1299 cell lines progressed in these phases but were compromised later in G2/M phase. These findings underscore the importance of the molecular profile in response to ionizing radiation. Finally, the oxidative stress and DNA damage stood out as very important processes in the effects of ionizing radiation. Parallelly, the study of human pathology performed within this Thesis revealed that the immune system response to radiotherapy was dependent on cancer type. The assessment of leucocyte cout of lung cancer patients showed changes in leukocytes, lymphocytes and monocytes during treatment with radiation. However, no significant differences in leucocytes were found in diffuse large B cell lymphoma patients. Similarly, in lung cancer patients changes were observed in limphogram with respect to B cells, Natural Killer cells and cytotoxic Natural Killer cells. Furthermore in patients with diffuse large B cell lymphoma there were changes in the induced regulatory T cells. Regarding cytokines and chemokines associated with Th1 profile, we observed an increase in interferon-γ concentration in diffuse large B cell lymphoma patients. Lung cancer patients showed a stronger Th1 profile than patients with diffuse large B cell lymphoma, which is confirmed by the higher levels of IL-2, INF-γ and IL-1β. In parallel, the Th2 profile was characterized by the highest concentration of IL-5 in the peripheral blood of diffuse large B cell lymphoma. Finally, there was an increase in IL-27 concentration and in IL-7 in lung cancer patients. We can concluded that the response to radiation is dependent on the cellular and molecular characteristics of the tumor cells under study. Better knowledge and understanding of the molecular characteristics of the tumor and mechanisms of response to treatment is an asset concerning the therapeutic decision and prognosis evaluation. In addition, tumor microenvironment, as well as the activity of the immune system on tumor cells in the context of radiotherapy, may contribute to better therapeutic outcome and survival in the long term.