Academic literature on the topic 'Linha celular tumoral'

Foram estudados e analisados de forma prospectiva os resultados obtidos em 24 pacientes portadores de câncer do reto baixo (tumores situados entre a linha pectínea e os 4cm acima da mesma) operados por via laparoscópica. Somente foram avaliados pacientes portadores de adenocarcinoma, independentemente da idade, do sexo ou da raça do paciente. A observação macroscópica e anatômica dos espécimens extirpados por via laparoscópica permitiu concluir que é possível realizar-se uma excisão total do mesorreto (excisão total perirretal) com as mesmas definições descritas por Heald:l.2 a excisão total perirretal foi obtida em 91,3% dos pacientes operados por via laparoscópica. Em paciente algum registrou-se a ruptura da massa tumoral ou contaminação celular pélvica intra-operatória. A extensão de ressecção linfonodal foi similar à obtida por via laparotômica, com uma média de 12 linfonodos dissecados por espécimen, com um grau de positividade no tecido perirretal de 33,3 % dos pacientes, proporção esta que chega a 72,7% se analisados os pacientes portadores de tumores Dukes C e a 100% para os tumores com baixo grau de diferenciação celular. A proporção de positividade (número de linfonodos com metástases em relação ao número de linfonodos extirpados) variou de um mínimo de 11,11% a um máximo de 75%. A radioterapia pré-operatória não foi óbice para a execução da cirurgia por via laparoscópica: em paciente algum ocorreu qualquer tipo de complicação peroperatória em decorrência da irradiação prévia. Da mesma forma, a irradiação não foi causa de conversão de um método cirúrgico para outro. O índice de recidiva local observado após amputação abdômino-perineal do reto por via laparoscópica com excisão total perirretal em pacientes previamente irradiados foi de 4,2%. Não foram registradas, até o momento, metástases ao nível da introdução dos trocartes.

Introdução: O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres. Atualmente, surgiu diversos estudos que mostram a metformina como uma representante de bons resultados na apoptose de células cancerígenas e na prevenção do tumor. Objetivo: Buscar enumerar os efeitos celulares da metformina e como ela pode auxiliar no tratamento do câncer de mama. Metodologia: Uma revisão sistemática da literatura do período de 01 de janeiro de 2016 até 10 de janeiro de 2018 na base de dados MEDLINE. Os descritores (MeSH) utilizados foram metformin e breastcancer. Foram encontrados 122 artigos dos quais 26 foram inclusos por estarem diretamente relacionado com o tema. Resultados: Umas das primeiras linhas de estudo mostra que a metformina causa a ativação intracelular da AMPK(proteína quinase ativada com monofosfato de adenosina). Esta ativação gera dois efeitos em cascata: a inativação de mTOR (alvo de mamífero da rapamicina) que irá culminar na supressão de RNA mensageiro e a fosforilação da p53 de células mamárias neoplásicas gerando uma apoptose ou autofagia da célula. Outra ação observada da metformina é que ela interfere no ciclo celular por meio da diminuição da ciclina D1, a qual leva a célula da fase G1 para a fase S do ciclo celular. Observou-se também uma inibição da telomerase, impedindo uma reprodução sem controle do tumor. A metformina mostrou-se pró-apoptótica para células tumorais da mama, pois aumenta os níveis celulares de Bax e diminui os níveis de Bcl-2, além de aumentar a concentração intracelular de cálcio em alguns tipos celulares, que irá promover uma turgência da mitocôndria e ativação da apoptose. Outro ponto é que a ação observada no tratamento da diabetes mellitus tipo 2 de reduzir a resistência do organismo à insulina contribui para a prevenção da carcinogênese, dado que ao diminuir a concentração de glicose no sangue, reduz a nutrição das células tumorais. Por fim, estudos clínicos mostraram uma melhora no efeito de quimioterápicos quando associado com metformina, abrindo espaço para sua redução com a preservação dos resultados obtidos. Conclusão: Diversos artigos mostraram os efeitos antineoplásicos da metformina de forma concreta, no entanto ainda faltam estudos clínicos para determinar a real eficácia e a dose necessária para se ter o efeito desejado. Além disso, o sinergismo com alguns quimioterápicos mostra uma boa vertente a ser explorada.

Os linfonodos fazem parte do conjunto de órgãos linfoides pertencentes ao sistema linfático, considerados os filtros da linfa por serem ricos em células de defesa. Uma das causas de seu comprometimento é a invasão de células neoplásicas. A biópsia com posterior exame histológico constitui o exame padrão ouro no diagnóstico. Porém, estudos questionam a eficácia desta técnica, devido a perda da arquitetura celular. Neste sentido, o trabalho teve como objetivo mostrar as diferenças entre linfonodos normais e comprometidos por células tumorais. Para isto, foi utilizado a espectroscopia Raman na caracterização bioquímica de linfonodos normais e comprometidos além de lesões cervicais. Os resultados mostraram uma taxa de sensibilidade de 71,4%, especificidade de 80% e acurácia de 75% na discriminação dos tecidos. Portanto, a espectroscopia Raman se mostrou uma importante ferramenta no auxílio diagnóstico.

El CCU es la segunda causa de muerte en mujeres de nuestro país. Dentro de los primeros mecanismos de defensa del hospedero se encuentra la respuesta inmune de las células NK y su función lítica a expensas de su receptor activador NKG2D, el cual posee como ligandos mica, micb y ulbp (1-6), los cuales se expresan en células transformadas y/o infectadas por virus. Uno de los mecanismos de evasión por parte de la célula tumoral es el clivaje de estas proteínas a través de metaloproteinasas como adam10, adam17 y mmp14. Se analizó la expresión de estos ligandos y metaloproteinasas mediante PCR tiempo real, en lineas celulares de referencia para cáncer cervical como HeLa (positiva para VPH-18) y C33A (negativa para VPH). Se obtuvieron valores representativos de expresion relativa genica con diferencias significativas asi: mmp14 en linea HeLa (p= 0.006); y mica y ulbp-3 en la linea C33A (p= 0.020 y p=0.003 respectivamente). Por lo tanto, se podría sugerir que la expresión de mmp14 se encuentran posiblemente involucrados con la presencia de VPH causante del cancer cervical y la respuesta inmunne innata desarrollada.

<p>O câncer é a segunda principal causa de morte no mundo e entre os muitos avanços recentes na quimioterapia contra a doença, os produtos naturais oriundos de plantas têm desempenhado um papel importante. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade antitumoral de <em>Prosopis juliflora</em> contra células tumorais humanas MDA-MB-231 (tumor de mama) e SKOV-3 (tumor de ovário) para buscar novos medicamentos derivados de fontes naturais. Testes <em>in vitro</em> foram conduzidos com os extratos brutos de folhas e de casca de caule frente as linhagens de células tumorais MDA-MB-231 e SKOV-3 através do teste de citotoxicidade utilizando MTT (3- (4,5-dimetiazol-2il) 2,5-difenil tetrazólio de brometo) através da monitorização após 24, 48 e 72 h de exposição das células tumorais e não tumorais a diferentes concentrações dos extratos (100; 50; 25; 12,5 μg / mL). Os testes de citotoxicidade também foram realizados contra células não tumorais (fibroblastos). O extrato de casca de caule de <em>P. juliflora</em> inibiu a proliferação de células MDA-MB-231 (28,9%) e não inibiu a proliferação de linhas de células SKOV-3. Este extrato apresentou baixa toxicidade frente as células de fibroblasto. Em contraste, o extrato de folhas de <em>P. juliflora</em> não foi ativo em nenhuma linhagem celular testada. O estudo químico para extração e isolamento de compostos ativos oriundo do extrato da casca de caule é recomendado para ensaios <em>in vitro</em> desses compostos para investigar a atividade antitumoral.</p>

A imuno-oncologia contemporânea é separada atualmente em quatro grandes categorias: estimulação imune não específica, terapia imune celular, imunização ativa e tratamento com anticorpos monoclonais. Esta revisão tem como escopo principal trazer o estado da arte no uso de anticorpos monoclonais que atuam como inibidores dos pontos de checagem imunológica (IPCI). São sete os IPCIs atualmente em uso clínico: um inibidor do CTLA-4 (ipilimumabe), três inibidores do PD-1 (pembrolizumabe, nivolumabe e cemiplimabe) e três inibidores do PD-L1 (atezolizumabe, avelumabe, durvalumabe). Os dados compilados sugerem que a imunoterapia é efetiva em inúmeros tumores, em diferentes cenários (primeira, segunda ou terceira linhas de tratamento), bem como quando comparado a diferentes regimes terapêuticos (quimioterapia com droga única, quimioterapia com mais de uma droga, inibidores de tirosina cinase e placebo). Em relação aos efeitos adversos associados ao uso dos inibidores dos pontos de checagem imunológica, há muita variação nos estudos clínicos publicados até o presente momento. A imunoterapia do câncer ainda deve responder a inúmeras questões como melhor droga e dose a ser empregada, qual melhor combinação a ser usada, duração ideal dos tratamentos e, por fim, quais são os pacientes que têm maior probabilidade de se beneficiarem do tratamento.

Introdução: O câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) é uma forma generalizada e particularmente agressiva de câncer. Pacientes com CPNPC normalmente apresentam um mau prognóstico, destacando a necessidade crítica do surgimento de novos fármacos para melhorar os resultados clínicos. Neste sentido, os inibidores do ponto de controle imune, tornaram-se a esperança para o CPNPC, constituindo um foco importante de pesquisa e ensaios clínicos para o tratamento. Objetivo: Apresentar os principais inibidores do ponto de controle imune usados no prognóstico do CPNPC. Método: Revisão sistemática da Literatura do período de 25 de Janeiro de 2017 a 25 de Janeiro de 2018 na base de dados PubMed. Os descritores utilizados foram (MESH) checkpoint e NSCLC. Foram apresentados 139 artigos dos quais 15 foram incluídos por estarem diretamente relacionados ao tema. Resultados: Observou-se que tanto os inibidores do ligando de morte celular programado-1 (PD-L1), como os do recetor de morte celular programado-1 (PD-1), impedem a associação do PD-L1 com o seu recetor PD-1, estimulando a atividade de linfócitos citotóxicos contra células tumorais. O Pembrolizumab, inibidor do PD-1 é considerado, tratamento de primeira linha em pacientes com expressão de PD-L1 superior a 50% (23 a 25% dos pacientes), sem mutação do fator de crescimento epidérmico (EGFR) nem translocação da proteína ALK. No subgrupo com mutação do EGFR (comum em pacientes com adenocarcinoma), inibidores Tirosina Quinase são considerados tratamento de escolha. O Durvalumab, inibidor do PDL-1, pode ser utilizado como tratamento adjuvante do estágio III após a quimiorradioterapia. Assim, terapia combinada entre agentes de imunoterapia ou terapia convencional é uma opção promissora para pacientes com expressão de PD-L1 inferior a 50% (75% dos pacientes). Apercebeu-se que, embora, a expressão de PD-L1 esteja associada a um benefício da imunoterapia, ainda é um biomarcador imperfeito que não discrimina completamente quem se beneficiará da terapia. Conclusão: A manipulação de pontos de controle imune, emergiu como uma forma importante e efetiva de imunoterapia. Mas, algumas limitações, incluindo uma heterogeneidade de resposta, probabilidade de recaída devido a mecanismos alternativos de escape imune, e há falta de biomarcadores ideais para prever o resultado e a toxicidade, são preocupantes. Neste sentido, a terapia combinada baseada em biomarcadores, será a estratégia padrão na futura terapia oncológica.

Resumos escolhidos para publicação. Nessa edição, os títulos foram: Amifostina reduz ativação da MAPK p38 durante a sinalização da apoptose em células da medula óssea irradiadas in vivo; Aumento do controle do carcinoma de próstata com irradiação de vesículas seminais em pacientes de risco intermediário e de alto risco; Toxicidade urinária tardia em pacientes com carcinoma de próstata tratados com radioterapia conformada; Estudo da viabilidade de realização de braquiterapia de alta taxa de dose em próstata com utilização de anestesia local; Nanotecnologia: perspectivas de aplicações em oncologia; O enfermeiro nas orientações ao paciente submetido à radioterapia; Validação de um espectro de 6MV e 15MV para um acelerador linear Varian Clinac 2300 C/D para a utilização em planejamentos radioterápicos com simulação de Monte Carlo; O uso de TLD LiF na dosimetria in vivo em radioterapia; Avaliação do planejamento tridimensional (3D) de pacientes com prótese femoral no tratamento de câncer de próstata; Proposta de consenso de sistematização de condutas no tratamento do câncer de próstata com radioterapia conformacional em 3 dimensões; Carcinoma de pequenas células de colo de útero: relato de caso; Abordagem preventiva integrada de enfermagem e odontologia dos pacientes em radioterapia de cabeça e pescoço no Hospital do Servidor Público Estadual de São Paulo (HSPE); O câncer e a sexualidade da mulher; Câncer de mama: impactos da mastectomia; Tratamento adjuvante do câncer gástrico com radioquimioterapia: experiência da Liga Norte Rio-Grandense Contra o Câncer/LNRCC; Análise da dose na pele para o feixe de fótons de 6MV para diferentes posicionamentos clínicos; Medidas do fator rendimento para campos de elétrons colimados em tratamentos individualizados; Dosimetria pós-implante de próstata com Iodo- 125: experiência do Hospital Sírio-Libanês (SP); Braquiterapia de baixa taxa de dose no câncer de próstata; Avaliação das doses de nêutrons em aceleradores lineares clínicos; Estudo da dose no músculo cardíaco devido à radioterapia do câncer de mama; Remodelamento cardíaco em ratos wistar irradiados: uma análise temporal; Fisioterapia durante a radioterapia em mulheres em tratamento por câncer de mama; Balão retal para radioterapia de próstata - benefício ou detrimento?; Situação das instalações com PET no Brasil; Controle de qualidade de placas de SR-90 para uso dermatológico; Rede brasileira de calibração de ativímetros; Velocidade de PSA não é fator preditivo significante na evolução do câncer de próstata em população heterogênea; Avaliação preliminar de pacientes com câncer de próstata submetidos à 3D-CRT; Dosimetria para construção do filtro utilizado em radioterapia intra-operatória de mama; Análise da distribuição de dose para a utilização de materiais superficializadores em feixes de elétrons; Efeitos adversos tardios da radioterapia na função sexual feminina; Uma sucinta determinação de desempenho de uma unidade de teleterapia de quilovoltagem - "Stabilipam II Siemens”; Avaliação de margens no planejamento tridimensional de câncer de pulmão; Comparação entre planejamentos convencional e conformacional utilizados em tratamento de tumores de cabeça e pescoço com invasão de cavidade nasal; Modelo em ratos Wistar para avaliação morfológica de efeitos cardíacos radioinduzidos; Radioterapia conformacional nos adenocarcinomas de próstata - experiência da Liga Norte Rio-Grandense Contra o Câncer; Avaliação imunológica em pacientes com câncer de mama tratados com quimioterapia e radioterapia; Avaliação dos danos em SNC causados pela radioterapia através da quantificação de transferência de magnetização; Respostas celulares ao estresse genotóxico causado pela radiação ionizante em linhagens de glioma proficientes e mutantes para o gene TP53; Construção de uma fonte de referência de dosimetria, utilizando placa de 90Sr da rotina do serviço de radioterapia; Verificação de dose em radioterapia de câncer de cabeça e pescoço utilizando dosimetria termoluminescente; Diferentes técnicas de tratamento da fossa supraclavicular avaliadas por dosimetria termoluminescente; Comparação da distribuição de dose para campos alargados e irregulares em acelerador linear de 10 MV; Radioterapia conformacional em adenoma de hipófise: experiência do serviço de radioterapia do HC-FMRP-USP; Como reduzir os custos financeiros de um serviço de radioterapia em uma oficina de moldagem; Influência da colimação usada em campos de elétrons para a complementação de dose em região cervical posterior; Cálculo de Monte Carlo para a determinação da atividade de fonte de 192Ir imersa em Solução Fricke; Paracoccidiodomicose linfático-abdominal simulando neoplasia primária das vias biliares; Câncer de testículo: dose testicular na irradiação abdominopélvica e paraaórtica; Dose testicular durante radioterapia conformacional em 3 dimensões (RTC3D) de câncer de próstata (CAProst); Braquiterapia de alta taxa de dose no tratamento de tumor de colo uterino com envolvimento vaginal distal e resposta completa à radioterapia externa: qual a dose e a extensão vaginal necessárias no tratamento?; Análise do sistema de tratamento de malformação arteriovenosa com radiocirurgia; Perfil dos atendimentos de radioterapia de urgência no Instituto Nacional de Câncer (INCA); Cuidados de radioterapia em paciente com obesidade mórbida e adenocarcinoma de endométrio; Planejamento radioterápico com campos moduladores para o câncer de mama; Avaliação retrospectiva da eficácia da radioterapia como segunda linha neo-adjuvante em pacientes com câncer de mama localmente avançado que falharam ao tratamento primário com antraciclínicos; Câncer de mama em homens: análise de 66 casos; Cutaneous metastasis from renal cell carcinoma: a case report; Radioterapia com intensidade modulada (IMRT) em câncer de colo uterino: regressão e mobilidade tumoral; Correlação entre achados de ressonância magnética pélvica pré-operatória e peça cirúrgica em pacientes com neoplasia de colo uterino: estudo preliminar; Estudo comparativo nas técnicas de tratamentos radioterápicos convencional e conformacional em pacientes com neoplasia gástrica; Verificação da função de anisotropia da fonte de 192Ir utilizada pelo sistema de planejamento de braquiterapia; Radioterapia em tumores sincrônicos de bexiga e próstata: comparação entre planejamento conformacional e radioterapia com intensidade modulada (IMRT); Avaliação das alterações no desenvolvimento dentário após irradiação em crianças com rabdomiossarcoma [RMS] de cabeça e pescoço [CP]; Estudo sobre a reutilização do cerrobend; Linfoma cutâneo: irradiação de toda a pele; Radiocirurgia com acelerador linear: experiência do Hospital Araújo Jorge de 158 pacientes utilizando Sistema de Microlâminas Brainlab®; Objeto simulador (Phantom) antropomórfico para o controle de qualidade de radiocirurgia estereotáxica; Avaliação postal com TLD para a radiocirurgia; Resultados preliminares do uso de heterojunções de polianilina-silício em dosimetria; Desenvolvimento de um plugin para planejamento computadorizado de tratamentos com campos de radiação irregulares; Determinação de distribuições de doses radioterápicas através de dosimetria termoluminescente e simulação Monte Carlo; Alças intestinais na proximidade do volume de planejamento de radioterapia conformacional de câncer de próstata: uma inclusão subestimada; Perfis de campos filtrados para feixes de fótons de 6MV medidos com o Dosímetro Fricke Gel modificado; Determinação das doses administradas em irradiação de corpo inteiro e estudo de uma metodologia para dosimetria in vivo em radioterapia; Medida de dose de nêutrons em labirintos de salas de aceleradores lineares médicos; Calibração de dosímetros TL em feixes de elétrons aplicados à radioterapia; Simulação da distribuição de doses absorvidas pelo coração de ratos tipo Wistar utilizando o código MCNP.

Introdução: Foram preparados três complexos de vanádio com ácidos orótico e glutâmico, em suas formas aniônicas, e foi testada sua citotoxicidade in vitro para fibroblastos pulmonares humanos (MRC-5), carcinoma hepatocelular humano (HepG2) e adenocarcinoma colorretal humano (Caco-2). Objetivo: Descrever a síntese e caracterização de novos complexos de vanádio com ácidos orótico e glutâmico e testar sua atividade antitumoral contra HepG2 e Caco-2. Método: Os complexos foram formulados como VO (oro), VO (α-glu) e VO (γ-glu) com base em análises químicas, termogravimétricas e espectros no infravermelho. Resultados: O ensaio de resazurina demonstrou sua citotoxicidade contra as linhagens celulares HepG2 e Caco-2 com o IC50 variando de 7,90 a 44,56 μmol.L-1. Os perfis de citotoxicidade indicam que as linhas tumorais apresentam maior atividade que as células MRC-5, com índices de seletividade variando de 1,58 a 8,96. Conclusão: Os três complexos tiveram melhor atividade in vitro do que a cisplatina, tanto para linhagens celulares normais como cancerosas. Os valores de IC50 são de duas a seis vezes melhores para as linhagens celulares cancerosas e de cinco a sete vezes melhores para as linhagens celulares normais. Este estudo indica que os complexos obtidos são promissores candidatos a fármacos antitumorais.

Mestrado em Biologia Aplicada<br>O osteossarcoma é o tipo mais comum de tumor ósseo maligno de alto grau que ocorre em crianças e adolescentes, sendo caracterizado por baixa resposta aos tratamentos atuais. A diminuição da eficácia dos quimioterápicos, devida à resistência adquirida pelas células tumorais, torna necessário encontrar novos fármacos que melhorem o resultado dos tratamentos. A fisetina é um flavonóide com reconhecidas propriedades antioxidantes e antiinflamatórias e referenciada pelas suas capacidades anticancerígenas e antiinvasivas. O objetivo deste estudo consiste em avaliar o efeito citotóxico da fisetina em células MG-63, isolado e combinado com etoposido, a par da sua influência na progressão do ciclo celular. Para tal, a linha de osteossarcoma humano MG-63 foi tratada com diferentes concentrações de fisetina, etoposido e combinações ao longo de 48h. Os efeitos citotóxicos foram analisados através de três ensaios distintos: o ensaio 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazólio (MTT), o ensaio violeta de cristal (CV) e o ensaio clonogénico. O ciclo celular foi analisado por citometria de fluxo e os níveis de expressão dos genes que regulam este ciclo foram determinados por qPCR. Os compostos isolados e combinados apresentaram um efeito negativo na proliferação celular, induziram alterações na dinâmica do ciclo celular das células MG-63 e aumentaram a percentagem de células em fase G2. Os níveis de expressão de CDK1 (p<0,05) e CDK2 foram diminuídos pela fisetina e pela combinação com menor concentração de etoposido. Estas observações apontam a fisetina como um potencial agente contra o osteossarcoma em terapias combinadas. No entanto, são necessários mais estudos para clarificar o modo de ação deste flavonóide no osteossarcoma.<br>Osteosarcoma is the most common type of high-grade malignant bone tumor occurring in children and adolescents, being characterized by having poor response to current therapeutics. The diminished effectiveness of cytotoxic drugs due to acquired resistance leads to the necessity of finding new therapeutic agents with improved outcome. Fisetin is a flavonoid with recognized antioxidant and anti-inflammatory properties and has been reported to possess anticancer and anti-invasive capabilities. The aim of this study is to evaluate the cytotoxic effects of fisetin in MG-63 cells, alone and in combination with etoposide, and its influence on cell cycle progression. For this, MG-63 human osteosarcoma cell line was treated with different concentrations of fisetin, etoposide and combinations for a period of 48 h. Three different assays were used to analyze the cytotoxic effects: the 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay, the crystal violet (CV) assay and the clonogenic assay. Cell cycle was assayed by flow cytometry and expression levels of the cell cycle genes were analyzed by qPCR. Isolated and combined compounds showed negative effects on cell proliferation, induced alterations on cell cycle of MG-63 cells and increased the percentage of cells in G2 phase. Expression levels of CDK1 (p<0,05) and CDK2 were decreased by fisetin and combination with less concentration of etoposide. These observations point to fisetin as a potential agent against osteosarcoma in combination therapies. However, further studies are needed to clarify the mode of action of this flavonoid in osteosarcoma.

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular<br>Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine<br>Os tumores mamários espontâneos são as neoplasias mais frequentes na cadela, possuindo uma elevada heterogeneidade biológica e histomorfológica. Aproximadamente metade de todos os tumores mamários em cães são malignos, apresentando um elevado potencial de metastização para nódulos linfáticos ou outros órgãos, como, por exemplo, o pulmão. A transformação maligna está associada a uma glicosilação anormal, o que resulta na síntese e expressão alterada de determinantes de carbohidratos. Grande parte da investigação em humanos sobre cancro da mama é efectuada em linhas celulares estabelecidas de carcinoma da mama, como modelos in vitro, uma vez que têm a capacidade de proliferar indefinidamente. Contudo, tendo em conta que a interacção entre o tumor e o organismo deve ser considerada, subsiste a necessidade de confirmação dos resultados em modelos animais. De forma a aprofundar o conhecimento da biologia dos tumores da mama de cadela, foram estabelecidos dois modelos experimentais, um in vitro e outro in vivo. Na primeira parte do trabalho, foram estabelecidas três linhas celulares de tumores mamários caninos um adenoma e dois carcinomas complexos partindo de fragmentos de tumores colhidos, no acto da cirurgia. Observou-se a presença de células do tipo epitelial e mioepitelial, após imunomarcação in vitro para os filamentos intermediários. Após a heterotransplantação destas linhas celulares em ratinhos nude, verificou-se que elas não eram tumorigénicas. Numa segunda parte do trabalho, foi feita a caracterização in vitro e in vivo de uma linha celular previamente estabelecida, derivada de um carcinoma ductal infiltrativo de mama de cadela. As células aderem ao fundo do frasco como uma fina monocamada, possuem um tempo de duplicação de 32,6±1,4 horas e, quando crescem em agar, formam um agregado único e volumoso. Os ensaios de mobilidade celular mostraram que estas células conservam a sua arquitectura tipo célula epitelial e têm a capacidade de se mover entre as duas margens de uma lesão artificial de forma compacta e unidireccional. Estas células apresentam imunoreactividade para a E-caderina e um índice de proliferação elevado. Um painel de anticorpos para os filamentos intermediários foi usado para determinar a origem da linha celular, observando-se uma intensa imunoreactividade para a citoqueratina AE1/AE3, característica das células epiteliais. A CK14 é expressa em 25-50% das células e a vimentina também apresenta um elevado nível de expressão, que se encontra descrito como normal em células em cultura. Estas células têm também imunomarcação para os carbohidratos sLex, Lex e Lea, podendo esta expressão aberrante ter um papel fundamental nos mecanismos de metastização à distância, facilitando a interacção positiva com o órgão alvo e mostrar-se relevante como marcador tumoral de prognóstico. Ensaios in vivo demonstraram que estas células cresciam quando inoculadas subcutaneamente no panículo da glândula mamária de ratinhos nude fêmeas. As massas tumorais eram histologicamente idênticas às lesões tumorais da mama de onde derivavam e, quando os tumores heterotransplantados foram colocados em cultura, a expressão dos filamentos intermediários e dos carbohidratos não se alteraram. De forma a identificar os tecidos metastáticos alvo, foi feita a injecção endovenosa na veia caudal dos ratinhos, observando-se metastização para os nódulos linfáticos, pulmão, coração, baço, rim e fígado. A tumorigenicidade e metastização observada nos ratinhos nude, bem como a mobilidade da linha celular in vitro, propõem um fenótipo agressivo para estas células. De uma forma geral, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os tumores mamários caninos constituem um excelente modelo para o estudo do cancro da mama humano.<br>Spontaneous mammary tumors are the most common neoplasia in the female dog and have a high biological and histomorphological heterogeneity. Approximately one-half of all mammary tumors in dogs are malignant and have a great potential to metastasize to the regional lymph nodes or other organs such as the lungs. Malignant transformation is associated with abnormal glycosylation, resulting in the synthesis and expression of altered carbohydrates determinants. In humans, the majority of breast cancer research is conducted using established breast cancer cell lines as in vitro models because they have the ability to proliferate indefinitely. However, the interaction between the tumor and the host organism must be taken into consideration, so the results need to be confirmed using animal models. In order to have an in depth view of the biology of canine mammary tumors, two experimental models, one in vitro and another in vivo, were established. In the first part of this work, three canine mammary carcinoma cell lines were established - one complex adenoma and two complex carcinomas - using fragments of tumors excised during a surgical procedure performed on a female dog. After the in vitro immunostaining for intermediate filaments, the presence of epithelial and mioepithelial cells was determined. When these cell lines were heterotlansplanted in nude mice it was noted that they were not tumorigenic. In the second part of the work an in vitro and in vivo characterization of a previously established cell line was made, derived from a canine mammary ductular carcinoma. These cells adhered to the bottom of the flask as a compact thin monolayer, had a doubling time of 32,6±1,4 hours and when they were grown in agar they formed a unique large aggregate. Cell motility assay showed that these cells conserved an epithelial-like architecture and had the ability to move between the edges of an artificial wound in a compact front of migration, with the cells moving unidirectionally. These cells had immunoreactivity for E-cadherin and showed a high proliferative index. A panel of antibodies for intermediate filaments was used to evaluate the origin of the cell line and it showed intense immunoreactivity for AE1/AE3 keratin which is a characteristic feature of epithelial cells. CK14 was expressed in 25-50% of the cells and vimentin also showed a high level of expression, which can be normal in culture tissues. These cells also immunostained for the carbohydrates sLex, Lex and Lea, and this aberrant expression may also play a fundamental role in the molecular mechanisms of metastization to distant organs, facilitate positive interactions within the target organ and could be useful as a prognostic tumour marker. In vivo assays showed that these cells grew when inoculated subcutaneously in the mammary fat pad of female nude mice. Tumour masses were histologically identical to the mammary tumour lesions they derived from, and when heterotransplanted tumours were cultured, the expression of intermediate filaments and carbohydrates was not altered. To look for metastatic target tissues we performed an intravenous injection in the tail vein of the mice. These cells metastasized to lymph nodes, lungs, heart, spleen, kidney and liver. The tumorigenicity and metastization observed in nude mice, as well as the motility of this cell line in vitro are suggestive of an aggressive phenotype for these cells. On the whole, the results obtained from this work suggest that canine mammary tumours are good models for the study of human breast cancer.

Mestrado em Medicina e Oncologia Molecular<br>Master Degree Course in Molecular and Oncology Medicine<br>Os tumores mamários espontâneos são as neoplasias mais frequentes na cadela, possuindo uma elevada heterogeneidade biológica e histomorfológica. Aproximadamente metade de todos os tumores mamários em cães são malignos, apresentando um elevado potencial de metastização para nódulos linfáticos ou outros órgãos, como, por exemplo, o pulmão. A transformação maligna está associada a uma glicosilação anormal, o que resulta na síntese e expressão alterada de determinantes de carbohidratos. Grande parte da investigação em humanos sobre cancro da mama é efectuada em linhas celulares estabelecidas de carcinoma da mama, como modelos in vitro, uma vez que têm a capacidade de proliferar indefinidamente. Contudo, tendo em conta que a interacção entre o tumor e o organismo deve ser considerada, subsiste a necessidade de confirmação dos resultados em modelos animais. De forma a aprofundar o conhecimento da biologia dos tumores da mama de cadela, foram estabelecidos dois modelos experimentais, um in vitro e outro in vivo. Na primeira parte do trabalho, foram estabelecidas três linhas celulares de tumores mamários caninos um adenoma e dois carcinomas complexos partindo de fragmentos de tumores colhidos, no acto da cirurgia. Observou-se a presença de células do tipo epitelial e mioepitelial, após imunomarcação in vitro para os filamentos intermediários. Após a heterotransplantação destas linhas celulares em ratinhos nude, verificou-se que elas não eram tumorigénicas. Numa segunda parte do trabalho, foi feita a caracterização in vitro e in vivo de uma linha celular previamente estabelecida, derivada de um carcinoma ductal infiltrativo de mama de cadela. As células aderem ao fundo do frasco como uma fina monocamada, possuem um tempo de duplicação de 32,6±1,4 horas e, quando crescem em agar, formam um agregado único e volumoso. Os ensaios de mobilidade celular mostraram que estas células conservam a sua arquitectura tipo célula epitelial e têm a capacidade de se mover entre as duas margens de uma lesão artificial de forma compacta e unidireccional. Estas células apresentam imunoreactividade para a E-caderina e um índice de proliferação elevado. Um painel de anticorpos para os filamentos intermediários foi usado para determinar a origem da linha celular, observando-se uma intensa imunoreactividade para a citoqueratina AE1/AE3, característica das células epiteliais. A CK14 é expressa em 25-50% das células e a vimentina também apresenta um elevado nível de expressão, que se encontra descrito como normal em células em cultura. Estas células têm também imunomarcação para os carbohidratos sLex, Lex e Lea, podendo esta expressão aberrante ter um papel fundamental nos mecanismos de metastização à distância, facilitando a interacção positiva com o órgão alvo e mostrar-se relevante como marcador tumoral de prognóstico. Ensaios in vivo demonstraram que estas células cresciam quando inoculadas subcutaneamente no panículo da glândula mamária de ratinhos nude fêmeas. As massas tumorais eram histologicamente idênticas às lesões tumorais da mama de onde derivavam e, quando os tumores heterotransplantados foram colocados em cultura, a expressão dos filamentos intermediários e dos carbohidratos não se alteraram. De forma a identificar os tecidos metastáticos alvo, foi feita a injecção endovenosa na veia caudal dos ratinhos, observando-se metastização para os nódulos linfáticos, pulmão, coração, baço, rim e fígado. A tumorigenicidade e metastização observada nos ratinhos nude, bem como a mobilidade da linha celular in vitro, propõem um fenótipo agressivo para estas células. De uma forma geral, os resultados obtidos neste trabalho sugerem que os tumores mamários caninos constituem um excelente modelo para o estudo do cancro da mama humano.<br>Spontaneous mammary tumors are the most common neoplasia in the female dog and have a high biological and histomorphological heterogeneity. Approximately one-half of all mammary tumors in dogs are malignant and have a great potential to metastasize to the regional lymph nodes or other organs such as the lungs. Malignant transformation is associated with abnormal glycosylation, resulting in the synthesis and expression of altered carbohydrates determinants. In humans, the majority of breast cancer research is conducted using established breast cancer cell lines as in vitro models because they have the ability to proliferate indefinitely. However, the interaction between the tumor and the host organism must be taken into consideration, so the results need to be confirmed using animal models. In order to have an in depth view of the biology of canine mammary tumors, two experimental models, one in vitro and another in vivo, were established. In the first part of this work, three canine mammary carcinoma cell lines were established - one complex adenoma and two complex carcinomas - using fragments of tumors excised during a surgical procedure performed on a female dog. After the in vitro immunostaining for intermediate filaments, the presence of epithelial and mioepithelial cells was determined. When these cell lines were heterotlansplanted in nude mice it was noted that they were not tumorigenic. In the second part of the work an in vitro and in vivo characterization of a previously established cell line was made, derived from a canine mammary ductular carcinoma. These cells adhered to the bottom of the flask as a compact thin monolayer, had a doubling time of 32,6±1,4 hours and when they were grown in agar they formed a unique large aggregate. Cell motility assay showed that these cells conserved an epithelial-like architecture and had the ability to move between the edges of an artificial wound in a compact front of migration, with the cells moving unidirectionally. These cells had immunoreactivity for E-cadherin and showed a high proliferative index. A panel of antibodies for intermediate filaments was used to evaluate the origin of the cell line and it showed intense immunoreactivity for AE1/AE3 keratin which is a characteristic feature of epithelial cells. CK14 was expressed in 25-50% of the cells and vimentin also showed a high level of expression, which can be normal in culture tissues. These cells also immunostained for the carbohydrates sLex, Lex and Lea, and this aberrant expression may also play a fundamental role in the molecular mechanisms of metastization to distant organs, facilitate positive interactions within the target organ and could be useful as a prognostic tumour marker. In vivo assays showed that these cells grew when inoculated subcutaneously in the mammary fat pad of female nude mice. Tumour masses were histologically identical to the mammary tumour lesions they derived from, and when heterotransplanted tumours were cultured, the expression of intermediate filaments and carbohydrates was not altered. To look for metastatic target tissues we performed an intravenous injection in the tail vein of the mice. These cells metastasized to lymph nodes, lungs, heart, spleen, kidney and liver. The tumorigenicity and metastization observed in nude mice, as well as the motility of this cell line in vitro are suggestive of an aggressive phenotype for these cells. On the whole, the results obtained from this work suggest that canine mammary tumours are good models for the study of human breast cancer.

O cancro da tiróide é a neoplasia mais comum do sistema endócrino. Os carcinomas da tiróide que derivam das células foliculares englobam os carcinomas bem-diferenciados (WDTC), os carcinomas pouco diferenciados (PDTC) e os carcinomas indiferenciados ou anaplásicos (ATC). Os WDTC subdividem-se em carcinomas papilares (PTC) e foliculares (FTC). Os ATC representam 2-3 % dos carcinomas da tiróide, sendo considerados os tumores mais agressivos da tiróide, para os quais não existem actualmente terapêuticas eficazes. O nosso grupo identificou, em estudos anteriores, os genes TP53, RAS, CDKN2A (p14ARF/p16INK4A) e CDKN2B e (p15INK4B) e vias relacionadas, como desempenhando papéis essenciais no desenvolvimento de ATC. As proteínas p15INK4B e p16 INK4A funcionam como supressores tumorais inibindo as CDK4/6 e levando à paragem do ciclo celular. O Palbociclib inibe as CDK4/6, sendo esperado que a sua acção compense a perda funcional dos genes CDKN2A e CDKN2B. Por outro lado, mutações no gene HRAS conduzem à activação constitutiva da via MAPK-ERK e, consequentemente, ao desenvolvimento tumoral. A isoforma HRAS tem de ser farnesilada para adquirir actividade oncogénica, representando um alvo molecular do composto Tipifarnib, um inibidor da farnesil transferase (FTI). O objectivo principal deste projecto foi identificar novas terapêuticas direccionadas para alvos moleculares específicos envolvidos no desenvolvimento de ATC, tendo sido estudados dois novos compostos, o Palbociclib e o Tipifarnib. Para estudo do seu efeito nas diferentes linhas celulares foram realizados ensaios de viabilidade metabólica celular (pelo método MTS), ensaios de ciclo e morte celular (por citometria de fluxo) e viabilidade celular (pelo método de exclusão com azul de tripano). Foram usadas três linhas celulares de ATC: C643 (mutações nos genes TP53, HRAS e delecção dos genes CDKN2A e CDKN2B), T238 (mutações nos genes TP53, CDKN2A, BRAF e PIK3CA) e T235 (mutação no gene BRAF); uma linha celular de PTC designada BCPAP (mutações nos genes BRAF e TP53); e células normais de tiróide PCCL3. Nos ensaios de ciclo celular e de viabilidade celular realizados com o Palbociclib observou-se, respectivamente, um aumento significativo de células na fase G0/G1 do ciclo celular e uma diminuição do número de células viáveis ao longo do tempo, nas linhas celulares de ATC e PTC, mas não nas células normais de tiróide. Nos ensaios realizados com o Tipifarnib observou-se um efeito do composto apenas na linha celular de ATC, com mutação no gene HRAS, que consistiu no aumento significativo de células na fase G2/M e na diminuição do número de células viáveis ao longo do tempo. Os resultados preliminares do Tipifarnib quanto à expressão do mRNA de genes envolvidos na regulação do ciclo celular sugeriram, em concordância com os resultados dos ensaios de ciclo celular, que este composto levou à paragem do ciclo na transição G2/M, pelo aumento observado na expressão dos genes CCNA2, CDK2 e CDC2. Os resultados deste estudo sugerem que o Palbociclib e o Tipifarnib poderão ter um papel importante na inibição da progressão tumoral. A continuação deste trabalho poderá contribuir para clarificar quais os mecanismos de acção e a relevância destes compostos como terapêuticas para os ATC.<br>Thyroid cancer is the most common malignancy of the endocrine system. Thyroid carcinomas, which derivate from follicular cells include well-differentiated carcinomas (WDTC), poorly differentiated carcinomas (PDTC) and undifferentiated or anaplastic carcinomas (ATC). The WDTC are subdivided into papillary carcinomas (PTC) and follicular carcinomas (FTC). ATC represent 2-3% of thyroid carcinomas, being considered the most aggressive thyroid tumours, for which there are currently no effective therapies. In previous studies, our group identified the genes TP53, RAS, CDKN2A (p14ARF/p16INK4A), CDKN2B, (p15INK4B) and related pathways as playing essential roles in the development of ATC. The p15INK4B and p16 INK4A proteins act as tumour suppressors by inhibiting CDK4/6 and leading to cell cycle arrest. Palbociclib inhibits CDK4/6, so it is expected that its action compensates the functional loss of CDKN2A and CDKN2B genes. On the other hand, HRAS gene mutations lead to constitutive activation of the MAPK-ERK pathway, and thus to tumour development. The HRAS isoform have to be farnesylated to acquire oncogenic activity, representing a molecular target for Tipifarnib compound, a farnesyl transferase inhibitor (FTI). The main objective of this project was to identify novel therapies directed at specific molecular targets involved in the development of ATC. In particular, we aimed to study the effect of two compounds, Palbociclib and Tipifarnib, in ATC cell lines. Metabolic cell viability (MTS assay), cell cycle and death (flow cytometry) and cell viability (trypan blue exclusion method) were assessed to study the effect of these compounds on the different cell lines. Three ATC cell lines were used: C643 (with TP53 and HRAS gene mutations and deletion of CDKN2A and CDKN2B genes), T238 (with TP53, CDKN2A, BRAF and PIK3CA gene mutations) and T235 (with BRAF gene mutation); one PTC cell line designated BCPAP (with BRAF and TP53 gene mutations); and normal thyroid cells (PCCL3 cells). In the cell cycle and viability assays performed with Palbociclib, a significant cell arrest in the G0/G1 phase and a decreased number of viable cells through time, were observed in ATC and PTC cell lines. These effects were not observed in normal thyroid cells. In the study of Tipifarnib, significant effects were only observed in the ATC cell line with an HRAS mutation, which consisted in an arrest in the G2/M phase of cell cycle, and in a decrease in the number of viable cells through time. Preliminary results of the study of Tipifarnib effect in mRNA expression of genes involved in cell cycle regulation (CCNA2, CDK2 and CDC2 genes), were in agreement with the results obtained in the cell cycle assays, suggesting that this compound led to cycle arrest in the G2/M transition. The results of this study suggest that Palbociclib and Tipifarnib may play a major role in inhibiting tumour progression. The continuation of this work may help to clarify the mechanisms of action and the relevance of these compounds as therapies for ATC.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia para as Ciências da Saúde<br>O cancro da mama é uma doença genética e celular de carácter multifatorial, na qual a desregulação génica desempenha um papel fulcral na sua iniciação e progressão. As linhas celulares de ratazana (RNO) têm, devido à similaridade mecanística da tumorigénese verificada entre Homem (HSA) e RNO, vindo a ser utilizadas como modelos em vários estudos de carácter fundamental e no desenvolvimento de novas terapias. A caracterização das linhas celulares usadas como modelos, é fundamental na seleção dos modelos celulares mais adequados para determinado estudo e para a interpretação correta de qualquer resultado. Neste trabalho caracterizou-se citogeneticamente e ao nível da expressão dos genes Mycn e Erbb2 uma linha celular tumoral comercial de RNO, proveniente de um adenocarcinoma mamário, denominada CLS-ACI-1. Os resultados obtidos mostram que a linha CLS-ACI-1 apresenta, pelo menos, três subclones e um complemento cromossómico quase triploide, caracterizado pela presença de alterações cromossómicas estruturais e numéricas. Alguns dos cromossomas alterados na linha CLS-ACI-1, encontram-se recorrentemente alterados noutras linhas tumorais de RNO e, em cromossomas homólogos, alterados no cancro da mama humano. Uma análise in silico utilizando várias bases de dados revelou a existência de 29 genes potencialmente afetados pelos "breakpoints" e que se encontram envolvidos em vários processos celulares (e.g. ciclo, proliferação, estabilidade genómica, vias WNT, RAS e MAPK). Posteriormente analisou-se a expressão relativa e regulação epigenética dos oncogenes MYCN e ERBB2 (envolvidos na tumorigénese humana) por "Real-Time Reverse Transcription - quantitative" PCR na linha em estudo. No que diz respeito ao gene Mycn, a análise revelou que este se encontra sobrexpresso na linha CLS-ACI-1 (181 vezes superior a uma linha normal). A sobrexpressão detetada pode ser explicada pela possível amplificação génica evidenciada pela caracterização citogenética e pela análise in silico dos "breakpoints" das alterações cromossómicas detetadas. No que diz respeito à sua regulação, este gene não parece encontrar-se diretamente regulado por metilação das citosinas, à semelhança do que foi descrito em HSA e Mus musculus. No entanto, o aumento significativo observado após remoção da 5-azacitidina pode ser consequência de alterações ao nível da (des)metilação de genes envolvidos na regulação da expressão do Mycn. Por sua vez o Erbb2 não apresentou na linha CLS-ACI-1 variação biologicamente significativa de expressão, o que não seria expectável pelos dados citogenéticos, que evidenciam o ganho de cópias do cromossoma onde este gene se localiza. Quando o genoma da linha CLS-ACI-1 foi globalmente desmetilado, verificou-se um aumento da expressão do gene, o que é indicativo de que o Erbb2 se encontrava transcripcionalmente suprimido, por metilação das citosinas; tal como em algumas linhas de HSA e MMU. Este aumento continuou após remoção da 5-azacitidina, o que é indicativo de mecanismos compensatórios na linha tumoral em análise. Os resultados obtidos permitem concluir que a linha CLS-ACI-1 é um bom modelo para o estudo do cancro da mama, pois apresenta similaridade a nível citogenético com rearranjos cromossómicos recorrentes no cancro da mama humano. Esta linha é, também, um bom modelo para o estudo epigenético dos oncogenes Mycn e Erbb2, pois o seu perfil de regulação é similar ao descrito em HSA.<br>Breast cancer is a genetic and cellular disease characterized by a multi-factorial nature, being gene deregulation one of its widespread marks. Due to the mechanistic similarity verified between the tumoral process in human (HSA) and rat (RNO), cell lines derived from RNO tumours can be successfully applied in breast cancer fundamental research and new therapy development. For a cell line to reach its full potential as a model, it should be properly characterized, as that characterization enable the choice of the most appropriate cell lines to a specific study and the correct result interpretation. In this work, the commercial RNO tumour cell line CLS-ACI-1, derived from a breast adenocarcinoma, was cytogenetically characterized and an expression analysis of the Mycn and Erbb2 genes was also performed. Our results show that, at least, three sub-clones are present in the CLS-ACI-1 cell line. A near triploid chromosomal content was detected, in which several structural and numerical alterations were present. Some of these chromosomes are recurrently implicated in chromosomal alterations in RNO tumour cell lines, and those homologous HSA chromosomes, have been implied in human breast cancer. An in silico analysis was performed in several databases and it revealed that 29 genes were potentially affected by CLS-ACI-1's breakpoints. Those genes have been associated to several cellular processes (e.g. cycle, proliferation, genomic stability and WNT, RAS and MAPK pathways). Afterwards, the relative expression and the epigenetic regulation of MYCN and ERBB2 oncogenes (implied in human tumourigenesis) was analyzed by Real-Time Reverse Transcription - quantitative PCR (RT-qPCR), in the tumour cell line under study. The RT-qPCR analysis revealed that the gene Mycn presents a 181 times-fold expression increase in the cell line CLS-ACI-1. This expression increment can be explained by the possible gene amplification (indicated by the cytogenetic characterization) and by the deregulation of several regulatory genes (revealed by the in silico analysis). Mycn does not seems to be directly epigenetically regulated by DNA methylation. This lack of epigenetic regulation, through cytosine methylation, have been described in HSA and Mus musculus (MMU). The significant expression increase, detected 10 days after 5-azacytidine removal, can be due to (de)methylation changes of several genes implied in Mycn regulation. In the CLS-ACI-1 cell line, Erbb2 doesn't show significant biological expression variation. These results are the opposite of what was expected, as the cytogenetic results show a copy gain of the chromosome where Erbb2 is located. After CLS-ACI-1's global genome demethylation, a gene expression increase was detected. This indicates that Erbb2 is transcriptionally suppressed by DNA methylation, as described in HSA and MMU. Erbb2 gene up-fold expression was also verified after removal of 5-azacytidine, indicating the existence of compensatory mechanisms in CLS-ACI-1 cell line. The similarity of the chromosomal rearrangements detected in this cell line with those described in human breast cancer and the similar epigenetic regulation, of the Mycn and Erbb2 genes, with the epigenetic marks described in HSA, render the CLS-ACI-1 tumor cell line as a well suited in vitro model for human breast cancer research.

Dissertação de mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016<br>A MGP é uma proteína de matriz extracelular inicialmente descoberta no esqueleto de bovinos, e posteriormente associada à cartilagem e sistema vascular de diversos vertebrados. Recentemente, a MGP foi implicada no cancro, associando‐se a vários tumores. Contudo, o seu papel nesses tumores nunca foi decifrado, tendo‐se apenas demostrado o seu envolvimento em mecanismos de migração celular e angiogénese em glioblastomas e na proliferação e invasão celular no cancro da mama. Num trabalho desenvolvido no nosso laboratório, descobriu‐se que a MGP estava sobre‐expressa em tumores colorretais (CCR), atualmente um dos mais incidentes e mortais. Com o objetivo de estudar o papel da MGP no CCR, utilizámos a linha celular HT‐29, onde se verificou uma elevada expressão de MGP. Transfetámos estas células de forma estável com vetores contendo siRNAs anti‐MGP. Selecionámos 2 clones celulares, R1E e R3C, que sobreexpressavam diferentes siRNAs, e analisámos a expressão genética, particularmente da MGP, assim como a capacidade proliferativa, migratória e invasiva destes clones. Verificou‐se uma redução significativa da MGP ao nível do mRNA (73,6% e 85%,) e proteína (63,6% e 34,3%) nos clones R1E e R3C versus células wild-type (WT), assim como na capacidade proliferativa (35,8% e 51,9%) e migratória (37,2% e 46,4%), respetivamente. Relativamente à capacidade invasiva, o clone R1E foi atualmente o único analisado, verificando‐se um aumento de aproximadamente 6 vezes. Os resultados sugerem que a MGP está envolvida em mecanismos proliferativos, migratórios e invasivos nestas células, evidenciando o seu potencial como alvo terapêutico no CCR. Baseados na literatura, postulámos uma possível interação da MGP com proteínas de matriz extracelular, local onde a MGP é secretada, interferindo com vias de sinalização associadas à Notch, BMPs ou Vitronectina. Analisada a expressão de genes associados a estas vias, concluímos que tanto a Notch como a PI3K/AKT associada à Vitronectina, poderiam estar envolvidas nos efeitos observados.

Dissertação de mestrado em Química Farmacêutica Industrial, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra<br>Xanthones or xanthen-9-ones (dibenzo-g-pirone) comprise an important class of oxygenated heterocycles whose role is well-known in Medicinal Chemistry. The biological activities of this class of compounds are associated with their tricyclic scaffold but vary depending on the nature and/or position of the different substituents. To obtain more structural diversity and quantities for biological assays, suitable and efficient synthetic processes are necessary. Different synthetic methodologies, “classical” and “non-classical”, namely microwave assisted organic synthesis, heterogeneous catalysis and a combination of heterogeneous catalysis with microwave irradiation, were applied to obtain new xanthone derivatives. Thus, this thesis reports the synthesis and structure elucidation of seven new compounds: 1,3-dihydroxy-5-methoxyxanthone (X1), 1-hydroxy-3-mesyloxy-5-methoxyxanthone (X2), 1-hydroxy-5-methoxy-3-(3-methylbut-2-enyloxy)xanthone (P1), 1-hydroxy-5-methoxy-4-(3-methylbut-2-enyl)-3-(3-methylbut-2-enyloxy)xanthone (P2), 1-hydroxy-5-methoxy-4-(3-methylbut-2-enyl)-6’,6’-dimethyl-’,5’-dihydropyran(2’,3’:3,2) xanthone (P3), 1-hydroxy-5-methoxy-6’,6’-dimethyl-’,5’-dihydropyran(2’,3’:3,2)xanthone (P4) and 1-hydroxy-5-methoxy- 6’,6’-dimethyl-’,5’-dihydropyran(2’,3’:3,4)xanthone (P5), as well as the evaluation of their antitumor activity. The synthesized xanthones and respective derivatives with prenyl units were structurally elucidated by spectroscopic methods including IR, NMR (1H, 13C, HSQC and HMBC) and HRMS. Their biological activity was evaluated by a screening assay for inhibition of growth of human tumor cell lines.<br>As xantonas ou xanten-9-onas (dibenzo-g-pirona) constituem uma importante classe de heterociclos oxigenados com um papel bem conhecido na Química Medicinal. As atividades biológicas desta classe de compostos estão relacionadas com o seu esqueleto tricíclico e variam consoante a natureza e/ou posição dos diferentes substituintes. De forma a obter maior diversidade estrutural e quantidades para ensaios biológicos, são necessários processos sintéticos adequados e eficientes. Diferentes metodologias sintéticas, “clássicas” e “não-clássicas”, nomeadamente síntese orgânica assistida por micro-ondas, catálise heterogénea e a combinação de catálise heterogénea com radiação micro-ondas, foram aplicadas para obter novos derivados xantónicos. Assim, esta tese descreve a síntese e elucidação estrutural de sete novos compostos: 1,3- di-hidroxi-5-metoxixantona (X1), 1-hidroxi-3-mesiloxi-5-metoxixantona (X2), 1-hidroxi-5-metoxi-3- (3-metilbut-2-eniloxi)xantona (P1), 1-hidroxi-5-metoxi-4-(3-metilbut-2-enil)-3-(3-metilbut-2- eniloxi)xantona (P2), 1-hidroxi-5-metoxi-4-(3-metilbut-2-enil)-6’,6’-dimetil-4’,5’di-hidropirano(2’,3’:3,2) xantona (P3), 1-hidroxi-5metoxi-6’,6’-dimetil-4’,5’-di-hidropirano(2’,3’:3,2)xantona (P4) e 1-hidroxi-5- metoxi-6’,6’-dimetil-4’,5’-di-hidropirano(2’,3’:3,4)xantona (P5), assim como a avaliação da sua atividade antitumoral. As xantonas e os respetivos derivados prenilados sintetizados foram caraterizados estruturalmente por métodos espetroscópicos, nomeadamente IV, RMN (1H, 13C, HSQC e HMBC) e EM de alta resolução. A sua atividade biológica foi avaliada através de um screening para a inibição de crescimento de linhas celulares tumorais humanas.

Dissertação de mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra<br>Um dos conceitos mais motivantes na área da Oncobiologia é a teoria das células estaminais tumorais (CSC), a qual defende que uma minoria de células transformadas, com propriedades estaminais, constituem a origem da renovação celular neoplásica, pelo que são determinantes no seu comportamento biológico. No cancro de mama canino (CMC) são poucos os estudos acerca da existência de CSC. No entanto, caso as células estaminais/progenitores sejam de facto o alvo da transformação neoplásica na glândula mamária canina, como foi proposto para o cancro de mama humano, a elucidação das vias moleculares que regulam a actividade das CSC e a sua interacção com o microambiente, fornecerá potenciais alvos terapêuticos para esta doença. Usando uma abordagem in vitro (três linhas celulares mamárias caninas), identificámos células com propriedades estaminais, através do ensaio de formação de mamosferas. Foi também realizada caracterização fenotípica por citometria de fluxo, imunofluorescência e western blot, assim como estudos funcionais. Foi ainda avaliada, pela técnica da imuno-­‐histoquímica, a expressão de marcadores de CSC (ALDH1, CD24, CD44) numa série de 112 casos de CMC. Os nossos resultados referentes às linhas celulares parecem refletir a heterogeneidade verificada nos tumores mamários caninos, visto apresentarem diferentes características fenotípicas e propriedades funcionais. No que diz respeito ao fenótipo estaminal, as linhas celulares apresentaram padrões de expressão diferentes. A citometria demonstrou que a linha CMT-­‐3p, a mais invasiva, apresentou enriquecimento no fenótipo CD44+/CD24low. Todas as linhas celulares apresentaram actividade da ALDH e foram capazes de crescer em condições independents de ancoragem, como esferóides, estando o fenótipo CD44+CD24-­‐ /lowALDH1+aparentemente relacionado com esta capacidade. Por outro lado, no nosso modelo in vitro, a transição epitelial-­‐mesenquimatosa não parece estar associada a características de células estaminais, uma vez que a linha celular que apresentou mais marcadores mesenquimais foi a que patenteou menos marcadores de CSC. No que diz respeito aos carcinomas mamários caninos, o CD44 (81,1%) foi o marcador observado mais frequentemente, sendo incomum nos carcinomas sólidos. O CD24 apresentou expressão rara, enquanto a expressão da ALDH1 foi observada frequentemente tanto nas células epiteliais como estromais. Não se observou qualquer associação entre o fenótipo CSC e um comportamento biológico mais agressivo. Pelo contrario, a expressão da ALDH1 encontrou-­‐se significativamente associada com melhor prognóstico. Os nossos resultados reforçam a teoria das CSC neste modelo animal; no entanto, consideramos essenciais estudos adicionais in vitro e in vivo no sentido de descortinar o seu significado biológico nesta complexa doença.<br>One of the most motivating concepts that is being explored in the human cancer research field is the cancer stem cell (CSC) hypothesis, which states that a minority of transformed cells, with acquired stem or progenitor properties, are the source of tumour cell renewal and thereby determine tumour behaviour. In canine mammary cancer (CMC), few studies have focused on the existence of cancer stem cells. If stem/progenitor cells are the targets for transforming events in canine mammary gland, as proposed for human breast cancer, the elucidation of the molecular pathways that regulate self-­‐renewal activity of cancer stem cells and their interaction with the microenvironmental niche will provide potential therapeutic targets for this disease. Through an in vitro approach (three mammary tumour cell lines), we have identified cells with stem-­‐like properties, by using a mammosphere formation assay. A phenotypical characterization by flow cytometry, immunofluorescence and western blot has also been performed, as well as functional assays. In addition, we have evaluated the immunohistochemical expression of CSC markers (ALDH1, CD24, CD44) in a series of 112 canine mammary carcinomas. Our results showed that these cell lines reflect the heterogeneity of canine mammary cancer, as they display different phenotypical characteristics as well as functional properties. With regard to CSC phenotype, cell lines exhibited distinct expression patterns. Flow cytometry showed that CMT-­‐3p, the most invasive cell line, was highly enriched for the CD44+/CD24low CSC phenotype. All cell lines presented ALDH activity and were able to grow as spheroids in anchorage-­‐independent conditions, with CD44+CD24-­‐/lowALDH1+ phenotype apparently related with this capacity. On the other hand, in our in vitro model, epithelial mesenchymal transition (EMT) was not necessarily associated with stem-­‐cell traits, given that CMT-­‐2p, the cell line that presented more mesenchymal markers, was the cell line that expressed less CSC markers. Concerning to canine mammary carcinomas, CD44 (81.1%) was the CSC marker most frequently observed, being rarely found in solid carcinoma subtype. CD24 was infrequent, while ALDH1 expression was frequently observed both in epithelial and stromal cells. No association was observed between CSC markers expression and aggressive tumour behaviour. In fact, a positive epithelia ALDH1 expression was significantly associated with better overall and disease-­‐free survival. Our results further consolidate the stem cell theory in this animal model; however, additional studies are required in order to unravel its biological significance in this complex disease.