Dissertations / Theses: 'Localização Subcelular de proteínas'

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Dantas, Luíza Lane de Barros. "Caracterização do papel da glutamil-tRNA sintetase na localização subcelular de proteínas." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-03082010-081959/.

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Abstract:

Nos organismos eucariotos, aproximadamente 50% das proteínas traduzidas no citoplasma são transportadas para as organelas, onde irão desempenhar suas funções. Com isso, surgiu um intricado sistema de transporte intracelular de proteínas. Nas plantas, a presença de uma segunda organela endossimbionte, o plastídio, tornou este sistema mais complexo e gerou demanda adicional por transporte. Ainda, grande maioria das proteínas mitocondriais e plastidiais são codificadas por genes nucleares e importadas do citosol. O dogma uma proteína-uma localização foi associado ao conceito de um gene-uma proteína na biologia celular. Entretanto, proteínas individuais podem ter mais de uma função, e mais recentemente, proteínas codificadas por um único gene foram identificadas em mais de um compartimento subcelular, o que deu origem ao conceito de duplo direcionamento (DD). Um exemplo bem estudado de DD vem das proteínas da família das aminoacil-tRNA sintetases (aaRS), que participam da síntese protéica ao acoplar o aminoácido ao seu tRNA cognato. Dentre as aaRSs, a glutamil-tRNA sintetase citosólica (GluRS), através de sua extensão N-terminal, parece estar envolvida com outras funções além da tradução. Em Arabidopsis thaliana, há dois genes nucleares que codificam a GluRS, um para uma proteína de duplo direcionamento (DD) e outro para uma proteína citosólica. Resultados recentes em nosso laboratório mostraram que a GluRS citosólica pode estar relacionada ao controle da localização subcelular de proteínas organelares em Arabidopsis. Para verificar um eventual papel desta proteína na localização subcelular de outras proteínas, foram realizados ensaios de duplo-híbrido em levedura, os quais mostraram interação entre a GluRS e a glutamina sintetase (GS) de Arabidopsis thaliana, proteína de DD para mitocôndrias e cloroplastos Esta interação foi confirmada in planta, sendo a sequência da GluRS responsável pela interação localizada na região N-terminal, do resíduo 207 ao 316. Análises filogenéticas apontam que esta região encontra-se ausente nas bactérias e que originou-se provavelmente em Archea, entre 2,6 e 1,8 bilhões de anos. Além disso, observa-se que esta sequência é conservada em fungos, musgos e plantas vaculares, tendo originado-se em Arabidopsis há cerca de 2 bilhões de anos. In eukaryotic organisms, about 50% of cytoplasmic translated proteins are transported to the organelles, where they can play their roles. Thus, a complex system for intracellular transport was established. In plants, the presence of a second endosymbiont organelle, the plastid, turned this system still more intricated and required an additional transport mechanism. Besides, most of organellar proteins are coded by nuclear genes and imported from the cytosol. The one protein-one localization was associated to the idea of one gene-one protein, which has long been established in molecular biology. However, individual proteins can show more than one function, and recently, proteins coded by one single gene were identified in more than one subcellular compartment, which has originated the concept of dual targeting. One of the most studied example of dual targeted proteins is the aminoacyl-tRNA synthetase (aaRS) family, which are related to protein synthesis by attaching the correct amino acid onto the cognate tRNA molecule. Among the aaRSs, cytosolic glutamyl-tRNA synthetase (GluRS), through its N-terminal extension, seems to be involved in other cellular role beyond translation. In Arabidopsis thaliana, there are two genes encoding GluRS, one for a dual-targeted protein and other for a cytosolic protein. Recent results in our laboratory showed that GluRS interacts with proteins destinated to other organelles, which suggest that this protein might have a role in interfering on protein localization in Arabidopsis. In order to gain some information on the role of this protein in subcellular localization, yeast two-hybrid assays were performed. These studies showed the interaction between GluRS and glutamine synthetase (GS), a mitochondrial and chloroplastic dual-targeted protein. This interaction was confirmed in planta. In addition, the GluRS sequence associated to protein interaction was localized at its N-terminal portion, between the residues 207 316. Phylogenetic analysis revealed that this region is absent in bacteria and it probably arose from Archea between 2.6 and 1.8 billion years ago. Also, this sequence is conserved in fungi, moss and all the green plants investigated. Finally, datation analysis showed that this sequence arose in Arabidopsis between 2 and 1.7 billion years ago.

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Chabregas, Sabrina Moutinho. "Caracterização da localização subcelular da proteína THI1 de Arabidopsis thaliana." Universidade de São Paulo, 2002. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-26082002-142944/.

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Abstract:

O produto do gene thi1 de Arabidopsis thaliana está provavelmente envolvido na biossíntese de tiamina (vitamina B1) e na proteção do DNA organelar contra danos. Estudos sobre a biossíntese da tiamina em plantas sugerem uma localização plastidial para este mecanismo, o que está de acordo com a existência de um peptídeo de trânsito cloroplástico (TP) na região N-terminal de THI1. Por outro lado, em leveduras a tiamina é sintetizada em mitocôndrias. Interessantemente, o cDNA de thi1 de A. thaliana complementa uma cepa de levedura com disrupção no gene homólogo thi4. A análise da seqüência de aminoácidos de THI1 revelou a presença de uma região capaz de formar uma estrutura do tipo a-hélice anfifílica, freqüentemente encontrada em preseqüências mitocondriais, localizada logo após o peptídeo de trânsito cloroplástico. O papel desta região na localização da proteína THI1 nas mitocôndrias foi comprovado a partir de ensaios envolvendo construções de genes quiméricos (contendo ou não a putativa seqüência de direcionamento mitocondrial) e um gene repórter (uidA). Estas construções foram introduzidas em plantas de tabaco e a localização da atividade GUS foi determinada nas frações subcelulares das plantas transgênicas. Análise direta da presença de THI1 nas mitocôndrias e cloroplastos de Arabidopsis foi realizada via imunolocalização. Também foram fornecidas evidências que as duas isoformas organelares são codificadas por um único transcrito nuclear. Experimentos de transcrição/tradução in vitro indicaram a ocorrência de dois produtos da tradução a partir de códons de iníciação em fase de leitura. Mutações sítio-específicas na seqüência de thi1 acoplados à experimentos usando a proteína fluorescente verde (GFP) mostraram que a tradução no primeiro AUG determina a localização da proteína nos cloroplastos, enquanto que a tradução no segundo AUG é responsável pelo endereçamento da proteína às mitocôndrias. A análise do contexto para início da tradução revelou que a região em torno do primeiro AUG é mais favorável para a tradução do mRNA de thi1. Além disso, observou-se a presença de uma forte estrutura em "grampo de cabelo" próximo ao segundo códon AUG, indicando um contexto subótimo capaz de interferir na tradução. Estas observações confirmaram os dados obtidos a partir da tradução in vitro na qual a iniciação se dá preferencialmente no primeiro AUG o que pode sugerir uma maior necessidade da proteína nos plastídeos. Arabidopsis thaliana thi1 gene product is probably involved in both thiamine biosynthesis as well as protection of organellar DNA from damage. Studies of thiamine biosynthesis in plants suggest a plastid location for the pathway, which is in agreement with the predicted THI1 N-terminal chloroplastic transit peptide (TP). On the other hand, thiamine is synthesized in mitochondria in yeast cells. Interestingly, A. thaliana thi1 cDNA complements a yeast strain disrupted for the homologous thi4 gene. Analysis of THI1 amino acid sequence revealed the presence of a putative amphiphilic a-helix, which is typical for mitochondrial presequences, located downstream of the chloroplast transit peptide. The role of this sequence on mitochondrial import has been shown by chimeric gene constructs (carrying or not the putative mitochondrial presequence) and the uidA reporter gene. These constructions have been introduced into tobacco plants and the GUS activity has been measured in subcellular fractions of transgenic plants. Direct analysis of THIp in mitochondria and chloroplasts has been done via ImmunoGold labelling experiments. Additional evidence suggested that the two organellar isoforms were encoded by a single nuclear transcript. In vitro transcription/translation experiments revealed the presence of two translational products by a differential usage of two in-frame translational start codons. Coupling site-specific mutations on THI1 encoding sequence with green fluorescent protein (GFP) gene fusions showed that translation initiation in the first AUG directs translocation of THI1 to plastids. However, when translation initiates from the second AUG THI1 is addressed to mitochondria. Analysis of the translation efficiency of thi1 mRNA revealed that the best context for translation initiation is present at the first AUG. In addition, it has been shown a suboptimal context at the second AUG and a strong stem-and-loop structure which is likely to slow translation. These observation confirm the in vitro translation data in which translation occurs preferentially in the first AUG, what could suggest a higher requirement of the protein in plastids.

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Justino, Daniela Morilha Néo. "Expressão heteróloga e localização subcelular de seis proteínas possivelmente envolvidas com a Síndrome de Down." Universidade Federal de São Carlos, 2004. https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/5420.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseDMNJ.pdf: 1396596 bytes, checksum: c40f8c60cc5a4bb8964cfe0ce5adc332 (MD5) Previous issue date: 2004-12-07 Universidade Federal de Minas Gerais Down syndrome (DS) is the most common congenital disease occurring in approximately 1 out of 700 live births. In addition to the full HC21 trisomy, rare individuals with clinically recognized DS have only a partial trisomy, carrying a region common to all patients dubbed as Down Syndrome Critical Region (DSCR). Several genes contained in this portion of the HC21 are probably related to the DS phenotypes. In an attempt to characterize some of the DSCR genes, heterologous expression and subcellular localization analyses were performed for the genes DCRB (DSCR4), c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 and c21orf101. Analyses of the recombinant proteins produced in Escherichia coli showed that most of them remained in the insoluble fraction. DCRB was expressed as a soluble protein in E. coli Rosetta (DE3), purified and subjected to assays for secondary structure analyses. Also, deletion and site directed mutagenesis as well as the production of polyclonal antisera against DCRB were performed. Subcellular localization analyses revealed that the proteins DCRB, c21orf45, c21orf59 and c21orf83-2 were distributed in the cytoplasm of mammalian cells and that c21orf95 and c21orf101 resided in the nucleus. Considering the lack of information concerning these proteins encoded in the DSCR our results allowed a insight into some of the proteins provably involved in Down syndrome. A Síndrome de Down (SD) é o distúrbio genético mais freqüente em humanos, sendo detectado em média um caso a cada 700 nascimentos. Esta anomalia é decorrente principalmente da trissomia total do cromossomo 21 porém, em alguns casos, ocorre a trissomia parcial deste cromossomo o que possibilitou a definição de uma região comum a todos os portadores denominada Região Crítica da Síndrome de Down (DSCR). Nesta região encontram-se vários genes que possivelmente estão relacionados às características fenotípicas apresentadas pelos indivíduos portadores. Entre eles estão os genes estudados neste trabalho: DCRB ou DSCR4 e as ORFS c21orf45, c21orf59, c21orf83-2, c21orf 95 e c21orf101. Com o objetivo de contribuir para os estudos realizados com genes localizados na DSCR foram realizadas a expressão heteróloga em E. coli e a localização subcelular das proteínas codificadas pelos genes descritos acima. Assim, os experimentos de expressão heteróloga em E. coli demonstraram que as proteínas expressas encontram-se na forma insolúvel para a maioria das condições testadas, entretanto foi possível a expressão de uma pequena fração solúvel da c21orf45, c21orf59 e da DCRB quando utilizou-se células da linhagem Rosetta (DE3) o que permitiu que a última proteína fosse purificada em condições nativas e que ensaios iniciais de estrutura secundária fossem realizados. Experimentos de deleção e mutação sítio dirigida também foram realizados com esta proteína assim como a produção de anticorpos policlonais. Estudos da localização subcelular revelaram que quatro das proteínas analisadas (DCRB, c21orf45, c21orf59 e c21orf83-2) são citoplasmáticas enquanto que duas (c21orf95 e c21orf101) são nucleares. Considerando a escassez de informações a respeito dos genes localizados na DSCR, esses resultados vem contribuir para o conhecimento das proteínas possivelmente envolvidas com a Síndrome de Down.

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Possik, Patrícia Abrão. "Localização subcelular da DSCR2, uma proteína relacionada à síndrome de Down." Universidade Federal de São Carlos, 2003. https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/5518.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissPAP.pdf: 4902893 bytes, checksum: 7182a23d47adb7621d018819e69efbfe (MD5) Previous issue date: 2003-10-17 Down Syndrome (DS) is the major cause of mental retardation with a high incidence among human beings. Main features in DS include facial and dermatological features, congenital heart defects as well as immunological, gastrointestinal and endocrine abnormalities. Among a variety of cancer, a 20 fold increased risk of developing leukemia in younger people and an increased risk of testicular cancer is noticeable in DS patients. Most DS patients carry a complete trisomy of chromosome 21, but patients carrying a partial trisomy have also been observed. Analyses of partial trisomy of chromosome 21 have helped determining the minimal regions potentially associated with DS features. The DSCR2 gene located in the so-called Down Syndrome Critical Region 2 (DCR-2) codes a 32.8-kDa leucine-rich protein comprised of 34% hydrophobic amino acid residues. Little is known about the DSCR2 protein characteristics but many assumptions have been made according to in silico predictions. In this work, we used immunocytochemical and fluorescence assays to investigate the subcellular location of the protein encoded by the DSCR2 gene in transfected cells. It was previously suggested that DSCR2 was located in the plasma membrane as an integral protein. Interestingly, we observed this protein in the endoplasmic reticulum of cells. We also studied whether the location of DSCR2 truncated forms had different subcellular distribution and our observations indicate that it is probably not inserted in inner membranes once the fragments lacking the predicted transmembrane helices remained in the ER. We suggest that DSCR2 is located in the cytoplasmic side of endoplasmic reticulum by indirect interaction with the ER membrane or with another protein. A Síndrome de Down (SD) é a aneuploidia mais freqüente e a principal causa de retardo mental na população humana. Os portadores apresentam, além das características faciais e dermatológicas típicas, cardiopatias e anomalias imunológicas, gastrointestinais e endócrinas. Há também um risco de desenvolvimento de leucemia 20 vezes maior que o normal em crianças portadoras da síndrome. Embora essa anomalia seja principalmente resultante da trissomia do cromossomo 21, há casos em que apenas uma região deste aparece em triplicata. Esses casos permitiram mapear uma região crítica comum a todos os portadores da síndrome. O gene DSCR2, localizado na Região Crítica da Síndrome de Down 2 (DCR-2), codifica uma proteína de 32,8 kDa rica em leucina e composta de uma alta porcentagem de resíduos hidrofóbicos. Experimentalmente, pouco se sabe sobre as características desta proteína, mas muitas possibilidades foram levantadas baseadas em sua seqüência de aminoácidos. Neste trabalho, foi estudada a localização subcelular da proteína DSCR2 em células de mamíferos. Estudos anteriores propuseram que a DSCR2 atuaria como uma proteína integral da membrana plasmática. Entretanto, em experimentos com células de mamíferos, nós observamos a proteína DSCR2 no retículo endoplasmático das células. Formas truncadas, construídas com o intuito de entender esta distribuição celular da DSCR2, apresentaram o mesmo padrão de fluorescência da proteína íntegra. Este resultado nos levou a concluir que esta proteína não está inserida na membrana do retículo endoplasmático, uma vez que a ausência dos domínios transmembranas preditos não alterou a sua distribuição subcelular. Desta forma, nós sugerimos que a DSCR2 se localiza associada ao retículo endoplasmático não como uma proteína integral de membrana, mas por algum tipo de interação indireta com a membrana ou com outras proteínas.

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Perino, Elvio Henrique Benatto. "Análise da expressão e localização subcelular das proteínas urease e allantoicase em Colletotrichum graminicola utilizando mutantes URE1:EGFP e ALA1:EGFP." reponame:Repositório Institucional da UFPR, 2017. http://hdl.handle.net/1884/48895.

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Abstract:

Orientadora : Profª. Drª. Chirlei Glienke Coorientadora : Prof. Dr. Holger Bruno Deising Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/05/2017 Inclui referências e anexos Bibliografia: f. 91-100 Resumo: O Brasil destaca-se por ser o terceiro maior produtor mundial de milho, entretanto, apesar desta alta produtividade, esta cultura é afetada por um grande número de doenças. Estas doenças acarretam em perdas na produção, sendo a antracnose uma das doenças fúngicas com maior relevância, de distribuição mundial. O fungo responsável pela antracnose é o Colletotrichum graminicola. Em estudos funcionais de genes associados a virulência e patogenicidade nesta espécie, foi demonstrado que o processo de penetração na planta é atenuado em transformantes com mutação ou deleção dos genes allantoicase e/ou urease (MÜNCH et al, 2011, GLIENKE et al, 2015). Com base nesses trabalhos sugere-se que as enzimas allantoicase e urease são importantes para os estágios iniciais do processo de infecção no hospedeiro por C. graminicola. A fim de determinar em que estágio do desenvolvimento do fungo e onde essas enzimas celulares atuam neste fitopatógeno, foram obtidos e analisados mutantes de C. graminicola para os genes urease e allantoicase (ALA1:eGFP e URE1:eGFP), os quais apresentam fusão dos genes alvo com o gene repórter eGFP. Os mutantes foram caracterizados, sendo selecionados somente aqueles que apresentavam cópia única do cassete inserido no local correto e fluorescência em microscopia. Todos os mutantes apresentando essas características, assim como três ectópicos referentes a cada transformação foram avaliados quanto aos sintomas produzidos em folhas de milho destacadas, localização subcelular através do gene repórter, quanto ao crescimento em meio de cultura com restrição de nitrogênio, bem como a atividade das enzimas urease e allantoicase. Com base nos resultados de microscopia de fluorescência, sugere-se que as enzimas urease e allantoicase estão presentes principalmente no citoplasma de esporos de C. graminicola antes da germinação e formação de apressório, sendo que a fluorescência é fortemente reduzida nos estágios iniciais do processo de infecção, ou seja, em tubos germinativos, em hifas de penetração e biotróficas. Nenhuma fluorescência foi observada em hifas necrotróficas do fungo. Palavras-chave: Zea mays, Colletotrichum graminicola, eGFP, urease, allantoicase. Abstract: Brazil is the third largest producer of maize in the world, however despite this productivity, the culture is affected by a large number of diseases, which lead to losses in production. Anthracnose is one of the main fungal diseases and has a worldwide distribution. The fungus responsible for the anthracnose disease is Colletotrichum graminicola. In functional studies of genes associated with virulence and pathogenicity processes in this specie, it has been shown that the plant penetration process is attenuated in transformants with mutation or deletion of allantoicase and/or urease genes (GLIENKE et al, 2015; MÜNCH et al, 2011). Based on these studies, it is suggested that the enzymes allantoicase and urease are important to the initial penetration stages for C. graminicola. To determine the development stage and the cellular location these enzymes act in this pathogen, the objective was to obtain and analyze C. graminicola mutants (ALA1:eGFP and URE1:eGFP) with fusion of the target genes, allantoicase and urease, with the reporter gene eGFP. The mutants were characterized and only those which presented a single copy of the construct in the right position and fluorescence in microscopy were selected. All the selected mutants and three ectopics for each gene were evaluated by produced symptoms in detached maize leaves, cellular localization through the reporter gene, ability to grow in nitrogen limitation medium, as well as the enzymes activity for urease and allantoicase gene. Based on the results, we conclude that the enzymes urease and allantoicase are present mainly in the cytoplasm of the C. graminicola conidia before germination and appressoria formation, the fluorescence is severely reduced in the initial stage of infection, i.e. in germ tube and biotrophic and penetration hyphae. No fluorescence was observed in necrotrophic hyphae of C. graminicola. Keywordse: Zea mays, Colletotrichum graminicola, eGFP, urease, allantoicase.

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Rodrigues, Kelly Barreto. "Estudo da localização subcelular das proteínas p29 e CP de Pepper ringspot virus e desenvolvimento de clone infeccioso de cDNA do vírus." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2014. http://repositorio.unb.br/handle/10482/18072.

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Abstract:

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-24T20:05:33Z No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-04T12:43:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) Made available in DSpace on 2015-05-04T12:43:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_KellyBarretoRodrigues.pdf: 3583484 bytes, checksum: 01cf3950732343dfd985e0d7fcb94d0d (MD5) Pepper ringspot virus (PepRSV) é um tobravírus e foi originalmente isolado no Brasil de plantas de Capsicum spp., que apresentavam sintomas de manchas anelares. As partículas são alongadas e rígidas e o seu genoma possui dois segmentos de RNA fita simples e senso positivo. Uma particularidade que o distingue de outros vírus conhecidos é a associação constante de suas partículas com as mitocôndrias do hospedeiro. Estudos preliminares in silico da proteína viral p29 de PepRSV sugeriram ser esta a proteína candidata a apresentar alguma interação com mitocôndrias. A capa proteica (CP) é a segunda candidata, por também estar presente na superfície das partículas virais, que se associam com mitocôndrias. Baseando-se nestas premissas, a interação das proteínas virais p29 e CP com a mitocôndria foi estudada, utilizando a estratégia de fusão da proteína-alvo com proteínas fluorescentes GFP ou YFP (Green/Yellow Fluorescent Protein), respectivamente, em vetores binários. Estas construções foram agro-inoculadas em folhas de Nicotiana benthamiana e as localizações subcelulares destas proteínas foram observadas em microscópio confocal. P29-GFP mostrou localização na periferia das células, provavelmente nos plasmodesmas, e a CP possivelmente no núcleo. Para confirmar a localização de p29 nos plasmodesmas, um experimento de co-localização foi realizado com a proteína 30 K de TMV, conhecida por se localizar no plasmodesma, e a co-localização de p29 e 30 K foi detectada. O desenvolvimento de clones infecciosos é uma estratégia padrão para estudar funções gênicas de vírus de RNA e é de vital importância para a elucidação da interação das proteínas virais com as mitocôndrias. Sendo assim, este trabalho também apresenta como objetivo a obtenção do clone de cDNA infeccioso de PepRSV. Para tanto, o RNA 2 foi clonado em vetor binário obtido a partir de um vetor de silenciamento gênico induzido por vírus (VIGS) de TRV contendo o promotor 35S duplicado na região 5´ e da ribozima na extremidade 3´. Para a clonagem do RNA 1, o segmento genômico foi dividido em dois fragmentos, que foram clonados em vetores comerciais, sendo então ligados utilizando sítios de enzimas de restrição. Pretende-se que o fragmento correspondente ao RNA 1 seja substituído pelo RNA 2 previamente inserido no VIGS modificado. Este clone infeccioso também poderá ser utilizado como VIGS para estudo básico de funcionamento de genes da planta. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT Pepper ringspot virus (PepRSV) is a tobravirus and was originally isolated from plants of Capsicum spp., with ringspot symptoms in Brazil. The particles are elongated and rigid and its genome has two segments of single stranded RNA and positive sense. Unique feature that distinguishes it from other known viruses is the specific and organized association of the virus particles with mitochondria of the host cell. Preliminary in silico studies of the viral protein p29 of PepRSV suggested that this is the candidate protein that has some interaction with mitochondria. The coat protein (CP) is the second candidate, since it is also present on the surface of viral particles, which associates with mitochondria. With these assumptions, the interaction of viral proteins p29 and CP with the mitochondria was studied, using the strategy of fusion of the target proteins with fluorescent proteins GFP or YFP (Green / Yellow Fluorescent Protein), respectively, using binary vectors. These constructions were agro-inoculated to Nicotiana benthamiana leaves and the location of both fused proteins was observed with confocal laser microscope. P29-GFP was located in periphery of cells, most likely in plasmodesmata, and CP was probably in nuclei. Aiming to confirm the localization of p29 in plasmodesmata, an experiment of co-localization was performed with 30 K protein of TMV, a movement protein well known to be located in plasmodesma, and colocalization of p29 and 30 K was detected. The development of infectious clones is a standard strategy for RNA viruses to study gene functions and will be critical for elucidating the interaction of viral proteins with the mitochondria. Thus, this work also had the objective of obtaining infectious cDNA clone PepRSV. To this end, the RNA 2 was cloned into binary vector obtained from a vector of virus-induced gene silencing (VIGS) of TRV, which contain the dual 35S promoter in the 5' region and the ribozyme in the 3' end. For cloning of RNA 1, the genome segment was divided into two fragments, which were cloned into commercial vectors and then ligated using restriction enzyme sites. Subsequently, the corresponding RNA fragment 1 will be replaced by the RNA 2 previously inserted in the modified VIGS. This infectious clone can also be used as a VIGS for basic studies of gene function in plants.

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Andrade, Warrison Athanasio Coelho de. "Caracterização parcial e localização subcelular de um fator de troca de nucleotídeos guanina associado à proteína Ras (RasGEF1b) induzido por agonistas de receptores do tipo Toll." Universidade Federal de Minas Gerais, 2008. http://hdl.handle.net/1843/BUOS-9AUG25.

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Abstract:

The guanine nucleotide exchange factors of the Ras protein super family (RasGEFs) are essential cellular components in the process of Ras activation in response to diverse extra cellular stimuli. The rasGEF1b is a highly conserved guanine exchange factor (GEF). In macrophages expression of rasGEF1b mRNA is induced by different TLRs agonists, such as LPS (TLR4), GPImucin (TLR2) and Poli I: C (TLR3). First, by using bioinformatics tolls we analyzed the probable RasGEF1b subcellular localization. The pFLAGCMV2 encoding the recombinant protein FLAGRasGEF1b was used to transfect HEK 293T cells and protein expression evaluated by Western Blot using an anti-FLAG mAb, it showed a protein with apparent molecular weight of 56kDa. By using differential centrifugation, HEK 293T cells were fractioned and the different fractions were recognized using monoclonal antibodies specific to protein of them, using this methodology, we showed that the protein FLAGRasGEF1b was present mostly in the nuclear and heavy membrane fractions. The FLAGRasGEF1b was inserted into a plasmid in fusion with mRFP or YFP fluorescent proteins, and by using confocal microscopy we showed that the proteins were present at early endosome and endolysosome. By using RNA interference (RNAi) we inhibit the expression of FLAGRasGEF1b-YFP, which was capable to activate Ras in HEK 293T cells in vitro. Os fatores de troca de nucleotídeos guanina da proteína Ras (RasGEFs) são componentes celulares essenciais no processo de ativação das RasGTPases em resposta a diversos estímulos extracelulares. O rasGEF1b é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) altamente conservado. A expressão do RNAm do rasGEF1b em macrófagos é induzida por diferentes agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs), tais como LPS (TLR4), GPI-mucin (TLR2) e Poli I:C (TLR3). A predição da provável localização subcelular da proteína RasGEF1b foi realizada inicialmente por meio de análises de bioinformática. A expressão da proteína recombinante em células HEK 293T transfectadas com o plasmídio pFLAGCMV2-RasGEF1b, e análise por Western Blotting utilizando anticorpo monoclonal anti-FLAG, demonstrou uma proteína de massa molecular aparente de 56kDa. Pela técnica de centrifugação diferencial, células HEK 293T foram fracionadas e as diferentes frações foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos, dirigidos contra proteínas das mesmas; utilizando esta metodologia, demonstramos que a proteína FLAGRasGEF1b está presente em maior abundância nas frações de núcleo e membranas pesadas. O DNA do FLAGRasGEF1b foi inserido em um plasmídio em fusão com as proteínas fluorescentes mRFP ou YFP, e por microscopia confocal demonstramos a localização da proteína em endossomos primários e endolisossomos. Pela técnica de RNA de interferência (RNAi), inibimos a expressão da proteína recombinante FLAGRasGEF1b-YFP. Além disso, demonstramos que RasGEF1B é capaz de atuar como fator de troca de guaninas de Ras quando expressa em células HEK 293T in vitro.

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De, Moraes Vanessa Cristine Sousa 1984. "Análise molecular de genes relacionados à síndrome de Pendred em indivíduos com surdez e estudo funcional da proteína pendrina = Molecular analysis of genes related to Pendred syndrome in individuals with deafness and functional study of pendrin protein." [s.n.], 2013. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/316699.

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Orientador: Edi Lúcia Sartorato Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Made available in DSpace on 2018-08-23T15:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeMoraes_VanessaCristineSousa_D.pdf: 4935241 bytes, checksum: ce8c385da6e3872d30f08426c629d34d (MD5) Previous issue date: 2013 Resumo: O alargamento do aqueduto vestibular (EVA) é uma malformação da orelha interna que pode ser identificado por tomografia computadorizada ou ressonância magnética. O EVA é um dos principais sinais clínicos da Síndrome de Pendred (PDS), uma doença genética com padrão de herança autossômico recessivo causada na maioria dos casos por mutações no gene SLC26A4. Além de EVA, o bócio e defeito na organificação do iodeto na tireóide são achados clínicos típicos da PDS. Por sua vez, mutações no gene SLC26A4 têm também sido observadas em indivíduos com surdez não sindrômica associada ao EVA. Recentemente os genes FOXI1 e KCNJ10 também foram implicados na PDS. O gene FOXI1 é um fator de transcrição do gene SLC26A4. Medições electrofisiológicas mostraram que a alteração da pendrina, proteína codificada pelo gene SLC26A4, em modelos animais levava indivíduos à surdez pela falta do potencial endococlear devido à perda de expressão de canais potássio. Sendo atribuído ao gene KCNJ10 a função de manutenção do potencial endococlear. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de mutações nos genes SLC26A4, FOXI1 e KCNJ10 em 60 indivíduos brasileiros portadores de perda auditiva sensorioneural, associada ou não a alterações no aqueduto vestibular. Foram encontradas 14 diferentes alterações no gene SLC26A4, das quais 3 ainda não haviam sido descritas na literatura (P142L, G149R e C282Y) e 4 já haviam sido descritas, porém ainda não haviam sido caracterizadas funcionalmente (T193I, Q413R, L445W e R776C). Dessa forma, foi realizada a análise funcional e a co-localização celular da proteína Pendrina com estas 7 variações alélicas. Não foi encontrada nenhuma evidência de contribuição digênica relacionada ao gene FOXI1 e/ou KCNJ10, uma vez que nenhum paciente desta casuística com alteração no gene SLC26A4 apresentou mutações nesses genes. Além disso, no grupo composto por 30 indivíduos surdos que não apresentam EVA, ficou evidente que o rastreamento do gene SLC26A4 não foi suficiente para explicar a perda auditiva nesses pacientes, uma vez que foram encontradas apenas alterações em um alelo do gene. Por outro lado, no grupo formado por 30 indivíduos surdos que apresentam EVA, o rastreamento do gene SLC26A4 possibilitou o esclarecimento do diagnóstico etiológico da perda auditiva em 5 pacientes que apresentaram mutações nos dois alelos do gene SLC26A4 Abstract: Enlargement of the vestibular aqueduct (EVA) is a malformation of the inner ear that can be identified by computed tomography or magnetic resonance imaging. EVA is the main feature of Pendred syndrome (PDS), a genetic disease with autosomal recessive inheritance pattern, in most cases caused by mutations in the SLC26A4 gene. Besides EVA, goiter and defective organification of iodide in the thyroid are other typical clinical signs of PDS. In turn, SLC26A4 gene mutations have been also observed in patients with non-syndromic deafness associated with EVA. Recently the genes FOXI1 and KCNJ10 were also implicated in the PDS. The FOXI1 gene is a transcription factor of SLC26A4 gene. Electrophysiological measurements in animal models showed that the mutated pendrin, the protein encoded by the SLC26A4 gene, led individuals to deafness by the lack of endocochlear potential due to loss of expression of potassium channels. Being assigned to the KCNJ10 gene the maintenance of endocochlear potential. Thus, the present study aimed to evaluate the occurrence of mutations in SLC26A4, and KCNJ10 FOXI1 genes in 60 Brazilian patients with sensorineural hearing loss, with or without changes in the vestibular aqueduct. We found 14 different mutations in SLC26A4 gene, of which 3 had not yet been described in the literature (P142L, G149R and C282Y) and 4 had already been described, but had not been characterized functionally yet (T193I, Q413R, L445W and R776C). Thus, we performed the functional analysis and cellular co-localization of Pendrin protein with these 7 allelic variants. We found no evidence of digenic contribution related to FOXI1 and/or KCNJ10 genes, since no patient in with mutations in SLC26A4 gene showed mutations in these genes. In addition, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with no EVA was not sufficient to explain the hearing loss in these patients, since mutations were found only in one allele of the gene. On the other hand, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with EVA allowed the elucidation of the etiology of hearing loss in 5 patients with mutations in both alleles of this gene Doutorado Genetica Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular

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Lubini, Greice. "NtCDKG;2, uma proteína multifuncional, relacionada aos processos de transcrição, processamento de RNA e organização do fuso acromático no ciclo celular de Nicotiana tabacum." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-06062017-171202/.

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Abstract:

Os estudos em reprodução e desenvolvimento das plantas, especialmente voltados ao pistilo, são de grande interesse agronômico, econômico e científico. Em nosso laboratório, recentemente, foi identificado e caracterizado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), um inibidor do ciclo celular que atua de forma tecido específica no pistilo de Nicotiana tabacum L. e Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). Foi identificada a proteína NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase 2) como parceira de interação de NtSCI1 (N . tabacum SCI1), em um ensaio de pull-down (STRINI, 2014). A literatura aponta que os inibidores de ciclo celular regulam o ciclo através da inibição de CDK, o que sugere que NtSCI1 possa regular o ciclo celular através da inibição de NtCDKG;2. O presente estudo mostra análises detalhadas da localização de GFP-NtCDKG;2 em células epiteliais de N. benthamiana. Verificou-se que a proteína NtCDKG;2 está presente no nucleoplasma e também co-localiza em speckles nucleares. Em cultura de células BY2 expressando GFP-NtCDKG;2 de forma estável, foi observado que, durante a metáfase e anáfase, a proteína NtCDKG;2 está junto ao fuso acromático. Adicionalmente, ensaios de BiFC (Bi-molecular Fluorescence Complementation) realizados neste trabalho mostram que a interação entre as proteínas NtCDKG;2 e NtSCI1 ocorre em uma região localizada na periferia nucleolar, durante a interfase. Também foram identificadas possíveis isoformas de NtCDKG;2. A possibilidade da ocorrência de isoformas sugere que, de maneira análoga à sua homóloga em humanos, as isoformas resultantes de NtCDKG;2 possam atuar em diferentes processos. Em busca de parceiros de interação de NtCDKG;2, para identificar em que vias esta proteína atua, foi realizado um screening de uma biblioteca de cDNAs de estigmas e estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido em leveduras (Y2H). Através desse ensaio, foram identificados diversos parceiros envolvidos com transcrição e processamento de RNA. Dentre as proteínas identificadas, cuja interação foi confirmada neste trabalho, destaca-se a proteína NtCDKF;1, uma proteína que fosforila o CTD da RNA Polimerase II e, dessa forma, auxilia a transcrição e o splicing cotranscricional (HAJHEIDARI et al., 2012). O presente trabalho mostra também a interação entre NtCDKG;2 e a proteína NtCBP1, uma proteína que possui um papel importante na regulação inicial da transcrição de proteínas mediadoras do crescimento do tubo polínico (LI et al., 2015). xx Adicionalmente, o screening de Y2H possibilitou a identificação da interação entre NtCDKG;2 e NtRanBP1, uma proteína chave na formação do fuso acromático que, em humanos, interage com uma isoforma homóloga a NtCDKG;2, a CDK11p46 (MIKOLAJCZYK et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011). Análises in silico realizadas com a sequência de aminoácidos de NtCDKG;2 apontaram motivos de interação com proteína do tipo F-Box, ciclina, CDK, fosfatase, 14-3-3, BRCA1 e indicaram o local provável de interação do complexo CDK-Ciclina com o respectivo inibidor. Foi testada e comprovada a interação entre NtCDKG;2 e a 14-3-3D, por Y2H, uma parceira de NtSCI1. Outra lacuna que precisava ser preenchida é referente à regulação da expressão de NtSCI1. Com este intuito, foram realizadas análises in silico para identificar elementos cis-regulatórios na sequência genômica de NtSCI1. Essas análises indicaram a presença de importantes elementos cis-regulatórios relacionados à identidade meristemática (como WUSCHEL e AINTEGUMENTA), identidade do carpelo (AGAMOUS, BELL) e progressão do ciclo celular (E2F e CDC5). Algumas considerações podem ser feitas associando os resultados obtidos a estudos feitos paralelamente em nosso laboratório: 1) Compilando a localização de NtCDKG;2 em splicing speckles e sua interação com os diferentes parceiros de interação relacionados à transcrição e splicing, sugere-se que NtCDKG;2 também atue nos processos transcricionais e de splicing. 2) Considerando a localização subcelular de NtCDKG;2 durante as diferentes fases do ciclo celular, às análises in silico dessa proteína que identificaram sua possível interação com BRCA1, além da interação confirmada com a proteína NtRanBP1, é possível sugerir que NtCDKG;2 atue, direta ou indiretamente, na organização do fuso acromático de plantas. 3) Propõem-se que NtSCI1 regule a proliferação celular no pistilo através da interação com NtCDKG;2 que se dá no nucléolo das células. Dessa forma, NtSCI1 prenderia NtCDKG;2 no nucléolo e inibiria sua atuação, como na organização do fuso acromático, o que acarretaria inibição da divisão celular. 4) Devido aos motivos cis-regulatórios encontrados na sequência genômica de NtSCI1 e o efeito que a proteína possui desde as fases iniciais do desenvolvimento do pistilo, sugere-se que a expressão desse gene seja regulada por elementos diretamente envolvidos no controle do término do meristema floral e nas vias de desenvolvimento de órgãos florais. Studies on plant reproduction and development, specifically those related to the pistil, are of great agronomic, economic and scientific interest. In our laboratory, we recently identified and characterized SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), an inhibitor of the cell cycle which acts tissuespecifically in the pistil of Nicotiana tabacum L. and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). The NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase G; 2) protein was identified as an interaction partner of NtSCI1 (N. tabacum SCI1) in a pulldown assay (STRINI, 2014). The literature suggests that cell cycle inhibitors control the cycle through the inhibition of CDKs, indicating that NtSCI1 might control cell cycle by inhibiting NtCDKG;2. This study shows detailed analysis of GFP-NtCDKG;2 localization in leaf cells of N. benthamiana. The analysis shows that NtCDKG;2 is present in the nucleoplasm and also co-localizes with nuclear speckles. In BY2 cell culture stably expressing GFP-NtCDKG;2, it was observed that NtCDKG;2 is at the achromatic spindle during metaphase and anaphase. Additionally, BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) assays performed in this study have shown that the interaction of NtCDKG;2 and NtSCI1 occurs in the nucleolar periphery during interphase. Putative isoforms of NtCDKG;2 were also identified. The possible occurrence of these isoforms suggests that, in a similar way to its human homologue, NtCDKG;2 putative isoforms could act in different processes. To identify in which processes this protein could act, a search for NtCDKG;2 interaction partners was performed through the screening of a N. tabacum stigma and style cDNA library in the yeast two-hybrid (Y2H) system. Several partners identified through this assay have roles in RNA transcription and processing. Among the identified partners with interaction confirmed during this work, stands out the NtCDKF;1 protein, a CDK that phosphorylates the RNA polymerase II CTD, and thus, supports transcription and co-transcriptional splicing (HAJHEIDARI et al., 2012). This study also shows the interaction of NtCDKG;2 with NtCBP1, a protein which has an important role in the transcriptional regulation of genes encoding proteins mediating pollen tube growth (LI et al., 2015). Furthermore, the Y2H screening allowed the identification of the interaction of NtCDKG;2 with NtRanBP1, a key protein in the formation of the achromatic spindle which, in humans, interacts with the CDK11p46 isoform (MIKOLAJCZYK xxii et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011), a homologue of NtCDKG;2. In silico analysis of the amino acid sequence of NtCDKG;2 revealed motifs of predicted interaction with F-box proteins, cyclins, CDKs, phosphatases, 14-3-3s, BRCA1, and also pointed the region where the CDK-cyclin complex might interact with its respective inhibitor. The interaction of NtCDKG;2 with 14-3-3D, a known partner of NtSCI1, was tested and confirmed by Y2H. Another gap that needed to be filled is related to the regulation of NtSCI1 expression. To address this issue, in silico analysis to identify cis-regulatory elements was performed in NtSCI1 genomic region. These analyses revealed the presence of important cis-regulatory elements related to meristem identity (such as WUSCHEL and AINTEGUMENTA), carpel identity (AGAMOUS, BELL), and cell cycle progression (E2F and CDC5). Taken together results from this study and parallel studies performed in our laboratory, a few remarks can be made: 1) Taken the localization of NtCDKG;2 in splicing speckles, and its interaction with different proteins involved in transcription and splicing, it is suggested that NtCDKG;2 also has roles on these processes; 2) Considering the subcellular localization of NtCDKG;2 during the different cell cycle phases, the in silico analysis of this protein that predicts its interaction with BRCA1, and the confirmed interaction with NtRanBP1 protein, it is possible to suggest that NtCDKG;2 has a direct or indirect role in the organization of the achromatic spindle in plants; 3) It is proposed that NtSCI1 regulates cell proliferation in the pistil through its interaction with NtCDKG;2, which occurs in the nucleolus. Thus, NtSCI1 could hold NtCDKG;2 in the nucleolus, inhibiting its actions, such as in the organization of the achromatic spindle, resulting in cell division arrest. 4) Due to the cis-regulatory elements found in the genomic sequence of NtSCI1, and the effect of this protein since the initial stages of pistil development, it is suggested that its expression is regulated by elements directly involved in the control of the floral meristem termination and pathways of floral organ development.

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Silveira, Roberta Maraninchi. "Localização subcelular do vírus da Zika durante a infecção em células humanas." Universidade de São Paulo, 2018. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17136/tde-13092018-105525/.

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O vírus da Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, do gênero Flavivirus transmitido por mosquitos Aedes. Apesar da sua importância emergente na saúde pública, ainda pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares envolvidos no ciclo replicativo do ZIKV em célula humanas. Assim, o objetivo geral deste estudo foi caracterizar a distribuição subcelular do ZIKV na célula hospedeira e elucidar fatores celulares que regulam o tráfego intracelular de proteínas envolvidos nesses processos. Mais especificamente, determinar os compartimentos celulares que servem de plataforma de montagem para o ZIKV. Além disso, também verificar se o funcionamento da maquinaria Endosomal Sorting Complexes Required for Transport (ESCRT) é requerido no ciclo replicativo de ZIKV. Para identificar a localização subcelular do ZIKV, foram utilizados diferentes marcadores celulares, e, de acordo com os resultados, foi demonstrado que com 3 horas pós infecção (h. p. i.) ocorre colocalização de proteínas do ZIKV com um marcador de endossomo primário, enquanto que com 15h p.i. já é possível detectar proteínas virais no Retículo Endoplasmático (RE). Subsequentemente, com 27h p.i. o ZIKV direciona-se para o complexo de Golgi. Juntos, esses resultados indicam o direcionamento do ZIKV através da via secretória ao longo do tempo. Além disso, foi testado o envolvimento da maquinaria dos ESCRTs por meio do silenciamento da expressão da proteína TSG101 de ESCRT-I em células infectadas com ZIKV. Os resultados obtidos, sugerem que ESCRT-I tem participação importante na replicação do ZIKV, ocorrendo a diminuição dos títulos virais quando TSG101 é depletada da célula. Em conjunto, os resultados permitem concluir que ao longo da infecção o ZIKV encontrase associado aos compartimentos da via secretória inicial (RE e complexo de Golgi), e que a proteína TSG101 de ESCRT-I exerce papel importante na replicação viral. Sendo assim, esse estudo possibilitou um melhor entendimento sobre a dinâmica de replicação do ZIKV em células humanas. Zika virus (ZIKV) is an arbovirus of the Flaviviridae family, of the genus Flavivirus that is transmitted by Aedes mosquitoes. Despite its emerging importance in public health, little is known about the molecular mechanisms involved in the replicative cycle of ZIKV in human cells. Thus, the general objective of this study was to characterize the subcellular distribution of the ZIKV in the host cell and to elucidate cellular factors that regulate the intracellular trafficking of proteins involved in these processes. More specifically, to determine the cellular compartments that serve as assembly platforms for the ZIKV. In addition, the study aimed to verify if the functioning of the Endosomal Sorting Complexes Required for Transport (ESCRT) machinery is required in the replicative cycle of ZIKV. In order to identify the subcellular localization of ZIKV, different intracellular markers were used, and, according to the results, it was demonstrated that at 3 hours post infection (h. p. i.) ZIKV proteins colocalize with an early endosome marker, whereas within 15h p.i. it is already possible to detect newlysynthesized viral proteins in the endoplasmic reticulum (ER). Subsequently, within 27h p.i., the ZIKV is directed to the Golgi complex. Together, these results delineate the targeting of ZIKV proteins through the secretory pathway over time. In addition, the involvement of the ESCRT machinery was tested by knocking down the expression of ESCRT-I protein TSG101 in ZIKV-infected cells. The results obtained suggest that ESCRT-I plays an important role in ZIKV replication, with viral titers decreasing when TSG101 levels are depleted in the cell. Together, the results allow us to conclude that ZIKV is associated with the initial secretory pathways (RE and Golgi complex) throughout the infection, and that the ESCRT-I TSG101 protein plays an important role in viral replication. Thus, this study contributes to a better understanding of the dynamics of ZIKV replication in human cells.

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Vendrame, Rafaela Fadoni Alponti. "Localização e tráfego subcelular de aminopeptidases em adipócitos de ratos obesos e privados de alimento." Universidade de São Paulo, 2013. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41135/tde-22072013-155306/.

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A descoberta de aminopeptidase regulada por insulina (IRAP), a qual hidrolisa peptídeos como ocitocina e vasopressina e é receptora de angiotensina IV, destaca a importância do estudo do envolvimento de peptidases na função endócrina do adipócito. Estudos recentes detectaram alterações das atividades de aminopeptidase neutra e de dipeptidil peptidase IV (DPPIV) no plasma e no hipotálamo e hipocampo na obesidade induzida por glutamato monossódico (MSG). A presente tese propôs (i) a existência de atividades aminopeptidásicas ácida (APA), básica (APB), neutra insensível (APM) e sensível à puromicina (PSA), metionil (MetAP) e DPPIV, além da já conhecida (leucil (LAP)/cistil (CAP)/IRAP), nas frações de membrana plasmática (FM) e de alta (HDM) e baixa (LDM) densidade microssomal de adipócitos isolados do depósito de gordura retroperitoneal; (ii) que suas atividades catalíticas, expressões gênicas e tráfego subcelular seriam diferenciados entre obesos induzidos por MSG, submetidos ou não à privação alimentar e em animais controle sadios, submetidos ou não a privação alimentar; (iii) e influenciadas por insulina, angiotensina II, angiotensina IV e vasopressina. A existência de todas essas aminopeptidases no adipócito foi demonstrada, sendo a APM a que apresenta maior Vmax e maior eficiência catalítica e a APA a maior afinidade. Os animais obesos apresentaram aumento do diâmetro médio dos adipócitos e aumento do lipócrito, caracterizando hipertrofia adipocítica, enquanto os controles privados de alimento tiveram um aumento no número de adipócitos e aumento no lipócrito, caracterizando hiperplasia adipocítica. Pela primeira vez, um perfil variado de atividades aminopeptidásicas distribuídas em diferentes compartimentos subcelulares do adipócito é evidenciado juntamente com a demonstração de diferenças no padrão de distribuição destas atividades entre os ratos obesos e sadios, privados ou não de alimento. Dentre as novas aminopeptidases detectadas no adipócito não há nenhuma com a característica clássica de IRAP. No geral, as alterações das atividades catalíticas nas diferentes situações sob estudo mostram o envolvimento dessas novas aminopeptidases na regulação endócrina do balanço energético (provavelmente via ação hidrolítica sobre angiotensina II e vasopressina) sob modulação por angiotensina IV (APB, APM, DPPIV, LAP/IRAP, MetAP e PSA em animais controle sadios e APB em animais controle privados de alimento), angiotensina II (APB e PSA nos animais obesos) e vasopressina (APB nos animais obesos privados de alimento; e influenciadas em seu tráfego subcelular por angiotensina II (CAP, DPPIV e LAP/IRAP) e angiotensina IV (LAP/IRAP). O tráfego subcelular da conhecida atividade CAP/IRAP mostrou-se suscetível à insulina e vasopressina The discovery of insulin-regulated aminopeptidase (IRAP), which hydrolyzes peptides such as oxytocin and vasopressin and is an angiotensin IV receptor, highlights the importance of the involvement of peptidases in the endocrine function of adipocyte. Recent studies have detected changes in aminopeptidase activities of neutral aminopeptidase and dipeptidyl peptidase IV (DPPIV) in the plasma and in the hypothalamus and hippocampus of rats with obesity induced by monosodium glutamate (MSG). The present thesis proposes (i) the existence of acid (APA), basic (APB), neutral insensitive (APM) and puromycin sensitive (PSA) aminopeptidases, methionyl aminopeptidase (MetAP) and dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), besides the well-known cystyl (CAP) / leucine aminopeptidase (LAP) / IRAP) in plasma membrane (MF) and in high (HDM) and low (LDM) density microsomes of isolated adipocytes from retroperitoneal fat pad; (ii) that their catalytic activities, gene expression and subcellular trafficking were different among MSG-induced obese and healthy control rats (food deprived or not); (iii) and influenced by insulin, angiotensin II and IV, and vasopressin. The existence of all these adypocite aminopeptidases was demonstrated. APM has a highest Vmax and catalytic efficiency, while APA has a highest substrate affinity. The obese animals have increased mean diameter of adipocytes and lipocrit, characterizing hypertrophy, while the food deprived rats had an increased number of adipocytes and lipocrit, characterizing hyperplasia. For the first time, a profile of varied aminopeptidases activities distributed in different subcellular compartments of adipocyte is evidenced together with the demonstration of differences in the distribution pattern of these activities among the obese and healthy rats, food deprived or not. Among these novel aminopeptidases detected in adipocytes there is no one with the classical characteristic of IRAP. In general, changes on catalytic activities in these different situations show the involvement of these novel aminopeptidases in the endocrine regulation of energy balance (probably via hydrolytic action on angiotensin II and vasopressin) under modulation by angiotensin IV (APB, APM, DPPIV, LAP/IRAP, MetAP and PSA in healthy animals and APB in food deprived healthy animals), by angiotensin II (APB and PSA in obese) and by vasopressin (APB in food deprived obese animais); and under influence of by angiotensin II (CAP, DPPIV, LAP/IRAP) and angiotensin IV (LAP/IRAP) on their subcellular trafficking. Subcellular trafficking of the well-known CAP/IRAP was susceptible to insulin and vasopressin

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Vicentini, Renato 1979. "Localização subcelular de proteinas de cana-de-açucar (Sccharum spp.) : caracterização in silico e avaliação funcional." [s.n.], 2008. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/317049.

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Orientador: Marcelo Menossi Teixeira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Made available in DSpace on 2018-08-11T15:42:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vicentini_Renato_D.pdf: 5901500 bytes, checksum: 7c8fe505e4c1675900f96c6643895d32 (MD5) Previous issue date: 2008 Resumo: As células de plantas são altamente organizadas e muitos processos biológicos estão associados com estruturas subcelulares específicas. A localização subcelular é uma característica chave das proteínas, visto que está relacionada com a função biológica. A determinação da localização subcelular usando a predição é uma estratégia altamente desejável, principalmente porque as abordagens experimentais demandam um tempo considerável. Com o objetivo de desenvolver um método para melhorar a predição de localização subcelular, diversos algoritmos foram integrados visando à exploração ótima do potencial de cada um. O desempenho com 90% de exatidão deste novo método foi claramente superior a todos os métodos utilizados em sua criação. Usando esta estratégia foi realizada a primeira análise em larga escala da localização subcelular do proteoma de cana-de-açúcar (com 11.882 proteínas preditas), sendo encontrado que a maioria das proteínas estão localizadas em quatro compartimentos: núcleo (44%), citoplasma (19%), mitocôndria (12%), e extracelular (11%). Adicionalmente foi observado que cerca de 19% das proteínas são localizadas em múltiplos compartimentos. Outros resultados foram capazes de identificar um conjunto de proteínas de cana-de-açúcar que podem apresentar duplo direcionamento pelo uso de variações na extremidade amino. Utilizando expressão transiente em células da epiderme de cebola, foi investigada a localização subcelular de 96 proteínas de cana com fusão a proteína GFP. As construções contendo fusão amino- e carboxi-terminal dos genes foram expressas, e a localização das proteínas de fusão foi detectada por microscopia de fluorescência. É relatado também a caracterização do gene ScBAK1, um receptor do tipo quinase com repetições ricas em leucina, que apresenta similaridade de seqüência com o gene brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. Foi mostrado que transcritos desse gene se acumulam em níveis muito mais altos nas células da bainha do feixe vascular do que nas células do mesófilo, e que a fusão ScBAK1-GFP é localizada na membrana plasmática. Essa distribuição espacial e esse padrão de expressão indicam que a ScBAK1 pode estar potencialmente envolvida em cascatas de sinalização celular intermediadas por altos níveis de açúcar na folha. Ainda considerando estudos de localização subcelular, é conhecido que seqüências de nucleotídeos que flanqueiam o códon de início da tradução afetam a eficiência traducional dos mRNA, e podem indicar a presença de sítios de inicio de tradução (TIS) alternativos. O multi-direcionamento pode ser um reflexo da variabilidade traducional destas outras formas da proteína. Neste estudo foi desenvolvido um método computacional para investigar o uso de TISs alternativos na síntese de novas variantes protéicas que podem apresentar localização subcelular diferente. Visando contribuir para o nosso entendimento da complexidade do genoma da cana-de-açúcar, foi empregada uma análise em larga escala dos TIS nesta espécie. Também é demonstrado que os transcritos com expressão induzida apresentam um forte TIS quando comparados com os reprimidos, e que os transcritos constitutivos possuem uma alta freqüência de TIS alternativos. O mesmo ocorre para os genes com altas taxas evolutivas, e transcritos específicos de folhas e entrenós, levantando a hipótese de que esses genes possam codificar diferentes polipeptídeos Abstract: Plant cells are highly organized and many biological processes are associated with specialized subcellular structures. Subcellular localization is a key feature of proteins, since it is related to biological function. The determination of subcellular localization using computational prediction is a highly desirable strategy because experimental approaches are time-consuming. In order to develop a method for the enhanced prediction of subcellular localization, the outputs of some prediction tools were integrated so as to optimally exploit the potential of each one. The prediction performance (with 90%of accuracy) of this new method was clearly superior to all the methods used to create the predictor. Using this method, the first in silico genome-wide subcellular localization analysis was performed for sugarcane (with 11,882 predicted proteins). It was found that most of the proteins are localized to four compartments: nucleus (44%), cytosol (19%), mitochondria (12%), and secretory destination (11%). It is also shown that about 19%of the proteins are localized to multiple compartments, and that a potential set of sugarcane proteins can show dual targeting by use of N-truncated form of proteins. The subcellular localization of 96 sugarcane proteins fused with GFP were evaluated using transient expression in onion epidermal cells. Constructs containing the Nand C-terminal fusion of genes encoding both endogen and GFP proteins were transiently expressed, and the localization of the fusion proteins were detected by fluorescent microscopy. It was reported the characterization of ScBAK1, a sugarcane leucine-rich repeat receptor-like kinase, with sequence similarity to brassinosteroid insensitive1-associated receptor kinase1. We have found that ScBAK1 transcripts accumulated at higher levels in bundle-sheath than in mesophyll cells. ScBAK1-GFP fusions were localized to the plasma membrane. This spatial distribution and expression pattern indicates that ScBAK1 might be potentially involved in cellular signaling cascades mediated by high levels of sugar in this organ. The nucleotide sequence flanking the translation initiation codon affects the translational efficiency of eukaryotic mRNAs, and may indicate the presence of an alternative translation initiation site (TIS) to produce proteins with different properties. Multi-targeting may reflect the translational variability of these other protein forms. In this study it was also developed a computational method to investigate the usage of alternative TISs for the synthesis of new protein variants that might have different subcellular localization. To contribute to our understanding of the genome complexity of sugarcane, we undertook a genome wide TIS analysis in sugarcane data. It is demonstrated that up-regulated transcripts show a stronger TIS when compared with the down-regulated, and that ubiquitous transcripts have a high frequency of alternative TIS in the next downstream AUG codon. The same occurs for fast-evolving genes, and leaf and internodes specific transcripts, that may encode different polypeptides by N-terminal polymorphism Doutorado Genetica Vegetal e Melhoramento Doutor em Genetica e Biologia Molecular

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Silva, Magna Magalhães. "Caracterização da fosforilação de maspina no desenvolvimento da glândula mamária murina e a correlação com sua localização subcelular." Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42134/tde-08122015-183802/.

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Maspina é uma proteína supressora de tumor e metástase e sua localização subcelular está relacionada ao prognóstico do câncer de mama. Nosso grupo mostrou em MCF-10A que quando fosforilada maspina se acumula no citoplasma. Porém, esta correlação ainda não foi relatada in vivo. Aqui investigamos a expressão, fosforilação e localização subcelular de maspina ao longo do desenvolvimento da glândula mamária murina. Maspina foi detectada no estágio mais tardio da gestação, na lactação e na involução. Os níveis de fosforilação de maspina são maiores no período de lactação do que na involução. Interessantemente, a porcentagem de células que apresenta maspina no núcleo é maior na fase de involução do que na fase de lactação Estes dados mostram que a correlação entre níveis de fosforilação de maspina e localização subcelular também é observada in vivo e que esses processos são reguladas ao longo do desenvolvimento na glândula mamária murina. Maspin is a protein with tumor and metastasis suppressing activity and its subcellular localization is related to breast cancer prognosis. Using MCF-10A cells as a model system, our group demonstrated a correlation between maspin phosphorylation and cytoplasmic accumulation. Here we investigated maspin expression, phosphorylation levels and subcellular localization in vivo during the murine mammary gland development. Maspin was detected in late pregnancy, during lactation and involution. Maspin phosphorylation levels is higher during lactation than during involution. Interestingly, the percentage of cells which present nuclear maspin is higher in the involution than in lactation. These data show that the correlation between maspin phosphorylation and subcellular localization is also observed in vivo and these processes are regulated during murine mammary gland development.

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Moreira, Andréia Estela [UNESP]. "Caracterização molecular parcial e localização subcelular de um isolado brasileiro do vírus do mosaico do feijoeiro do sul dos E.U.A." Universidade Estadual Paulista (UNESP), 2001. http://hdl.handle.net/11449/92532.

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001-02-22Bitstream added on 2014-06-13T20:33:46Z : No. of bitstreams: 1 moreira_ae_me_sjrp.pdf: 1607576 bytes, checksum: 6defec23b76aee9fab3792f6dfc9ab01 (MD5) O presente trabalho descreve a caracterização molecular parcial e a localização subcelular de um isolado brasileiro do vírus do mosaico do feijoeiro do sul dos E.U.A. (southern bean mosaic virus, SBMV, gênero Sobemovirus) encontrado no Estado de São Paulo e aqui intitulado SBMV-BSP. O SBMV-BSP infectou sistemicamente plantas de Phaseolus vulgaris L. 'Rosinha induzindo mosaico, distorção foliar e redução do tamanho da planta. O SBMV-BSP foi purificado à partir de folhas de feijoeiros, cv. Rosinha, infectados produzindo preparações de bom grau de pureza e concentração viral satisfatória (50-70 mg/Kg de folhas infectadas). Por eletroforese em gel desnaturante SDS-PAGE, foi determinada a massa molecular da proteína capsidial com valor estimado em 30 kDa. Um anti-soro para a proteína capsidial foi obtido de galinhas imunizadas com preparações purificadas do vírus (anti-SBMV), sendo este específico e de alto título (1:128.000). Em SDS-PAGE, uma análise comparativa de extratos de planta sadia e infectada evidenciou a presença de uma banda a mais neste último que foi identificada por Western blot utilizando o anti-SBMV como sendo correspondente à proteína capsidial do SBMV-BSP. RNAs de vários tamanhos (4,2 Kb; 3,1 Kb; 2,65 Kb; 2,15 Kb; 1,64 Kb; 1,36 Kb; e 1,0 Kb) foram obtidos do SBMV-BSP purificado, confirmando a heterogeneidade dos RNAs presentes nos virions. Uma sonda molecular não radioativa que reconhece especificamente os RNAs do SBMV-BSP e não reconhece RNAs de planta sadia foi produzida. Através de Northern blot e hibridização com essa sonda todos os fragmentos de RNAs foram detectados também em extratos de plantas infectadas pelo vírus, comprovando pela primeira vez a presença dos RNAs heterogêneos na planta hospedeira. Duas espécies de RNAs de fita dupla foram extraídas a partir de extratos de plantas de feijoeiro infectadas pelo SBMV-BSP,... The present work describes the partial molecular characterization and the subcellular localization of a Brazilian isolated of Southern bean mosaic virus (SBMV, genus Sobemovirus) found in the São Paulo State and designated SBMV-BSP. The SBMV-BSP infected systemically plants of Phaseolus vulgaris L Rosinha inducing mosaic, leaf distortions and reduction of the size of the plant. The SBMV-BSP was purified from infected bean leaves yielding preparations with a good degree of purity and satisfactory virus concentration (50-70 mg/kh of infected leaves). By denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular mass of the coat protein was determined to have an estimated value of 30 kDa. An antiserum for the coat protein was obtained from hens immunized with purified viral preparation (anti-SBMV), having high specificity and title (1:120,000). In SDS-PAGE a comparative analysis of infected and healthy plants showed the presence of an extra band in extracts of infected plants identified by Western blot, using anti-SBMV, as the coat protein of the SBMV-BSP. RNAs of many sizes (4.2 Kb; 3.1 Kb; 2.65 Kb; 2.15 Kb; 1.64 Kb; 1.36 Kb; e 1.0 Kb) were detected in SBMV-BSP purified preparations, confirming the heterogeneity of the RNAs found in virions. A non-radioactive molecular probe was produced which recognizes specifically viral RNAs but does not recognize RNAs from healthy plants. Using Northern blot and hybridization with the specific probe it was shown that the heterogenous RNA fragments were also found in extracts of infected plants providing, for the first time, evidence of their presence in the host plant. Two species of double stranded RNAs (dsRNA) were obtained from extracts of SBMV-BSP infected plants, with sizes of 4.2 Kbp and 1.0 Kbp. In bean leaves, SBMV-BSP particles were seen dispersed in the cytoplasm and sometimes arranged in almost crystalline patterns...(Complete abastract click electronic access below)

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Moreira, Andréia Estela. "Caracterização molecular parcial e localização subcelular de um isolado brasileiro do vírus do mosaico do feijoeiro do sul dos E.U.A. /." São José do Rio Preto : [s.n.], 2001. http://hdl.handle.net/11449/92532.

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Orientador: José Osmar Gaspar Banca: Addolorata Colariccio Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez Resumo: O presente trabalho descreve a caracterização molecular parcial e a localização subcelular de um isolado brasileiro do vírus do mosaico do feijoeiro do sul dos E.U.A. (southern bean mosaic virus, SBMV, gênero Sobemovirus) encontrado no Estado de São Paulo e aqui intitulado SBMV-BSP. O SBMV-BSP infectou sistemicamente plantas de Phaseolus vulgaris L. 'Rosinha" induzindo mosaico, distorção foliar e redução do tamanho da planta. O SBMV-BSP foi purificado à partir de folhas de feijoeiros, cv. Rosinha, infectados produzindo preparações de bom grau de pureza e concentração viral satisfatória (50-70 mg/Kg de folhas infectadas). Por eletroforese em gel desnaturante SDS-PAGE, foi determinada a massa molecular da proteína capsidial com valor estimado em 30 kDa. Um anti-soro para a proteína capsidial foi obtido de galinhas imunizadas com preparações purificadas do vírus (anti-SBMV), sendo este específico e de alto título (1:128.000). Em SDS-PAGE, uma análise comparativa de extratos de planta sadia e infectada evidenciou a presença de uma banda a mais neste último que foi identificada por "Western blot" utilizando o anti-SBMV como sendo correspondente à proteína capsidial do SBMV-BSP. RNAs de vários tamanhos (4,2 Kb; 3,1 Kb; 2,65 Kb; 2,15 Kb; 1,64 Kb; 1,36 Kb; e 1,0 Kb) foram obtidos do SBMV-BSP purificado, confirmando a heterogeneidade dos RNAs presentes nos virions. Uma sonda molecular não radioativa que reconhece especificamente os RNAs do SBMV-BSP e não reconhece RNAs de planta sadia foi produzida. Através de "Northern blot" e hibridização com essa sonda todos os fragmentos de RNAs foram detectados também em extratos de plantas infectadas pelo vírus, comprovando pela primeira vez a presença dos RNAs heterogêneos na planta hospedeira. Duas espécies de RNAs de fita dupla foram extraídas a partir de extratos de plantas de feijoeiro infectadas pelo SBMV-BSP,...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) Abstract: The present work describes the partial molecular characterization and the subcellular localization of a Brazilian isolated of Southern bean mosaic virus (SBMV, genus Sobemovirus) found in the São Paulo State and designated SBMV-BSP. The SBMV-BSP infected systemically plants of Phaseolus vulgaris L "Rosinha" inducing mosaic, leaf distortions and reduction of the size of the plant. The SBMV-BSP was purified from infected bean leaves yielding preparations with a good degree of purity and satisfactory virus concentration (50-70 mg/kh of infected leaves). By denaturing gel electrophoresis (SDS-PAGE), the molecular mass of the coat protein was determined to have an estimated value of 30 kDa. An antiserum for the coat protein was obtained from hens immunized with purified viral preparation (anti-SBMV), having high specificity and title (1:120,000). In SDS-PAGE a comparative analysis of infected and healthy plants showed the presence of an extra band in extracts of infected plants identified by Western blot, using anti-SBMV, as the coat protein of the SBMV-BSP. RNAs of many sizes (4.2 Kb; 3.1 Kb; 2.65 Kb; 2.15 Kb; 1.64 Kb; 1.36 Kb; e 1.0 Kb) were detected in SBMV-BSP purified preparations, confirming the heterogeneity of the RNAs found in virions. A non-radioactive molecular probe was produced which recognizes specifically viral RNAs but does not recognize RNAs from healthy plants. Using Northern blot and hybridization with the specific probe it was shown that the heterogenous RNA fragments were also found in extracts of infected plants providing, for the first time, evidence of their presence in the host plant. Two species of double stranded RNAs (dsRNA) were obtained from extracts of SBMV-BSP infected plants, with sizes of 4.2 Kbp and 1.0 Kbp. In bean leaves, SBMV-BSP particles were seen dispersed in the cytoplasm and sometimes arranged in almost crystalline patterns...(Complete abastract click electronic access below) Mestre

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Pontes, de Lima Rodrigo. "Análise da expressão e localização subcelular dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 do fator de iniciação da tradução eIF4G de Trypanosoma brucei." Universidade Federal de Pernambuco, 2009. https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/6119.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3639_1.pdf: 1283864 bytes, checksum: c19ef1285163584deb577abe247a01c6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Os tripanosomatídeos, agentes causadores de enfermidades de impacto mundial, se destacam dos demais eucariotos por apresentarem um conjunto de processos moleculares únicos, inclusive a ausência de controle da sua transcrição. Dessa forma, o controle de sua expressão gênica deve ocorrer após a transcrição. Assim, um ponto importante de controle é a iniciação da tradução, um processo ainda pouco conhecido nos tripanosomatídeos. Em eucariotos, de forma geral, esta começa com a ligação ao mRNA do complexo eIF4F, formado pelos polipeptídeos: eIF4E, eIF4A e eIF4G. A subunidade eIF4G atua como proteína estruturadora do complexo se ligando às demais subunidades e a outros fatores de tradução. Em Trypanosoma brucei foram identificados cinco homólogos do eIF4G, conservados em Leishmania major, denominados de TbEIF4G1-5. Este trabalho buscou contribuir com a caracterização dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 a partir da amplficação e clonagem dos seus genes, completos e/ou fragmentos contendo seu domínio HEAT central, em vetor de expressão bacteriano. A análise das sequências clonadas apresentou divergências genéticas em relação às descritas na literatura, mas, a princípio, de baixo significado biológico. Em seguida, realizou-se a expressão das respectivas proteínas recombinantes e obtenção de soro policlonal em coelhos. Estes soros foram utilizados em ensaios de western-blot e imunocitoquímica para analisar a expressão das proteínas nativas e sua localização subcelular. Os mesmos genes foram também clonados em vetor plasmidial para superexpressão da proteína recombinante fusionada à EYFP em T. brucei. Observou-se que o TbEIF4G1 é expresso na fase procíclica, mas é raro ou ausente na sanguínea. Já o TbEIF4G2 é expresso raramente ou ausente em ambas as fases. Ambas as proteínas se mostraram exclusivamente citoplasmáticas, o que reforça um papel na tradução que merece ser melhor estudado com as ferramentas, proteínas e anticorpos, produzidos neste estudo

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Souza, Ricardo Gargaro de. "Desenvolvimento de uma estratégia de fusão gênica visando à localização de proteínas em plantas." reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, 2006. http://hdl.handle.net/10183/7406.

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Abstract:

Uma significativa quantidade de proteínas vegetais apresenta-se compartimentalizada nas diversas estruturas celulares. A sua localização pode conduzir à elucidação do funcionamento dos processos biossintéticos e catabólicos e auxiliar na identificação de genes importantes. A fim de localizar produtos gênicos relacionados à resistência, foi utilizada a fusão de cDNAs de arroz (Oryza sativa L.) ao gene da proteína verde fluorescente (GFP). Os cDNAs foram obtidos a partir de uma biblioteca supressiva subtrativa de genes de arroz durante uma interação incompatível com o fungo Magnaporthe grisea. Estes cDNAs foram fusionados a uma versão intensificada de gfp e usados para transformar 500 plantas de Arabidopsis thaliana. Outras 50 plantas foram transformadas com o mesmo vetor, porém sem a fusão (vetor vazio). Foram obtidas aproximadamente 25.500 sementes oriundas das plantas transformadas com as fusões EGFP::cDNAs e 35.000 sementes das transformadas com o vetor vazio, produzindo, respectivamente, 750 e 800 plantas tolerantes ao herbicida glufosinato de amônio. Após a seleção, segmentos foliares das plantas foram analisados por microscopia de fluorescência, visando o estabelecimento do padrão de localização de EGFP. Foram observadas 18 plantas transformadas com a fusão EGFP::cDNAs e 16 plantas transformadas com o vetor vazio apresentando expressão detectável de GFP. Uma planta transformada com uma fusão EGFP::cDNA apresentou localização diferenciada da fluorescência, notadamente nas células guarda dos estômatos e nos tricomas. Após seqüenciamento do cDNA fusionado, foi verificado que esta planta apresentava uma inserção similar a uma seqüência codificante de uma quinase, uma classe de enzimas envolvidas na transdução de sinais em resposta à infecção por patógenos. A significant amount of plant proteins is compartmentalized in different cellular structures. The location of such proteins is essential to understand the function of biosynthetic and catabolic processes and also to help the identification of important genes. To identify the location of gene products related to resistance, rice (Oryza sativa) cDNAs were fused to a gene coding a GFP protein (green fluorescent protein). The cDNAs were obtained from a suppressive subtractive library of rice plants during an incompatible interaction with Magnaporthe grisea fungus. The cDNAs were fused to an enhanced version of gfp and they were used to transform 500 Arabidopsis thaliana plants, yielding 25.500 T1 seeds. Other 50 plants were transformed with the same vector, but without the EGFP::cDNA fusion (empty vector), yielding 35.000 T1 seeds. Seven hundred and fifty and 800 plants were generated from T1 seeds of the EGFP::cDNA fusions and empty vector transformations, respectively. Following herbicide selection, detached leaves were analyzed under a fluorescence microscope to evaluate the pattern of EGFP localization. It was observed that 18 plants transformed with EGFP:cDNA fusion and 16 plants transformed with empty vector showed detectable EGFP accumulation. One plant transformed with EGFP::cDNA showed a unique localization of the fluorescent signal. In this plant, the EGFP expression was predominantly visible at the stomata guard cells and trichomes. After, cDNA sequencing, the cDNA from this plant has shown insert similarity to kinase protein sequence, an enzyme class frequently related to signal transduction in response to pathogenic infections.

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Scarso, Marcela Emanuele. "Identificação e caracterização do papel da glutamil-tRNA sintetase na localização de proteínas cloroplásticas." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-09022012-163312/.

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A regulação da localização de proteínas é um dos aspectos fundamentais na biologia celular vegetal. Os cloroplastos importam mais de 90% de suas proteínas do citosol, portanto, é importante caracterizar os fatores citosólicos que podem estar envolvidos no direcionamento de proteínas para as organelas. Um ensaio de duplohíbrido em leveduras com as proteínas cloroplastidiais HMPPK/TMPPase (TH1) e Glutamina Sintetase (GS) II usados como iscas revelou que a forma citosólica da glutamil-tRNA sintetase - GluRS (At5g26710) de Arabidopsis thaliana interagiu com ambas as proteínas. Estudos de Complementação da Fluorescência Bimolecular (BiFC) confirmaram tais interações in planta. Estudos com deleções na região Nterminal da GluRS mostraram que esta região é responsável pelas interações com HMPPK/TMPPase e GSII. Além disso, seis resíduos de aminoácidos parecem ser cruciais para a interação entre as proteínas. Curiosamente, foi mostrado que a GluRS está envolvida na localização de proteínas em leveduras. A fim de obter mais informações sobre o envolvimento da GluRS ns localização de proteínas nos cloroplastos, foram produzidos plantas de tabaco transgênicas expressando uma proteína quimérica, feita pela fusão do gene codificador da HMPPK/TMPPase, TH1- GFP, e GSII-GFP e posteriormente usados em ensaios de agroinfiltração com RNA de interferência (RNAi) para GluRS. Análises em microscópio confocal mostraram que TH1-GFP e GSII-GFP acumulam no citosol em vez de serem direcionados aos cloroplastos. Neste trabalho, mostramos pela primeira vez que a GluRS está envolvida na localização de proteínas cloroplastidiais em plantas e esse mecanismo é também conservado em Saccharomyces cerevisiae. Regulation of protein localization is one of the key aspects in plant cell biology. Chloroplasts import more than 90% of their proteins from the cytosol, therefore, it is important to identify and characterize cytosolic factors that might be involved in protein delivery to the organelar envelope. A yeast two-hybrid screen with a chloroplastlocalized HMPPK/TMPPase protein and glutamine synthetase (GS), used as baits, revealed that the cytosolic form of the glutamyl-tRNA synthetase (GluRS) (At5g26710) from Arabidopsis thaliana interacted with both proteins. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) studies confirmed such interactions in planta. Deletion studies of GluRS showed that the N-terminal region of the protein is responsible for proteinprotein interactions (PPI) with TH1 and GS. In addition, six amino acid residues appeared to be crucial for PPI. Interestingly, GluRS has been also shown to be involved in regulating protein localization in yeast. In order to gain more information about the involvement of GluRS on protein localization in chloroplasts, we produced transgenic tobacco plants expressing a chimeric protein made by the fusion of TH1- GFP and GSIIGFP and agroinfiltrated with a RNA interference (RNAi) construct against GluRS. Confocal analysis showed that TH1-GFP and GSII-GFP accumulated in the cytosol instead of being targeted to chloroplasts. Here, we show for the same time that GluRS is involved in protein localization in plants and this mechanism is also conserved in Saccharomyces cerevisiae.

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Spoladore, Larissa. "Identificação de interatores putativos envolvidos na localização de proteínas de duplo direcionamento em Arabidopsis thaliana." Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-28062011-153024/.

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Abstract:

A maioria das proteínas organelares são codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas especificamente ao seu destino final. O direcionamento aos diferentes subcompartimentos subcelulares é feito por uma complexa e ampla maquinaria que envolve sequências de direcionamento, proteínas citossólicas e receptores organelares específicos. Entretanto, relativamente pouco se conhece sobre o processo na qual uma proteína recém sintetizada é transportada ao seu destino final. Parte significativa das proteínas destinadas às organelas possui a informação necessária ao seu transporte localizada na extremidade N-terminal. Vários estudos têm buscado caracterizar as etapas que envolvem a localização de uma proteína, desde os estágios iniciais após a sua síntese até os fatores que regulam o seu correto endereçamento. Modificações pós-traducionais, regiões 5-UTR, região C-terminal, transporte por vias alternativas e interações proteína-proteína podem agir na localização subcelular de proteínas. O estudo de redes biomoleculares se tornou um dos focos de estudo da biologia de sistemas e demonstra um enorme potencial na descoberta de diversos processos biológicos, como as interações proteína-proteína. As proteínas que possuem duplo direcionamento (DD) em Arabidopsis thaliana foram analisadas em redes de interação proteína-proteína (PPI) e proteínas que interagem com proteínas de DD foram escolhidas quanto a função e localização para a verificação de um eventual papel dessas proteínas na localização subcelular de outras proteínas. Para tanto, foram realizadas varreduras em ensaios de duplo-híbrido em levedura para os genes de GRF9 (14-3-3) e ATH7 (tiorredoxina tipo h). Os resultados para GRF9 incluem as proteínas peroxidase PRXR1 e dihidrolipoamida acetiltransferase. Já os resultados para ATH7 mostram a interação com glutamina sintetase (AT5G35630.3). A combinação dos estudos in silico com a varredura via duplo-híbrido de levedura abrem novas perspectivas no entendimento do controle da localização subcelular de proteínas. Most organellar proteins are nuclear encoded, synthesized in the cytosol and then targeted to their destination. Specific subcellular targeting is conducted by a complex machinery for the specific localization of the proteins, which includes targeting sequences, cytosolic proteins and specific organelar receptors. However, little is known about the process that happens from the synthesis of a protein and the transport to its final destination. Most organellar proteins contain the information for their localization in the N-terminal sequence. Many studies have searched to characterize the steps involved in protein targeting, from the early stages after its synthesis to the cytosolic factors regulating its correct localization. Post-translational modifications, 5-UTR regions, the C-terminal extension on the protein, alternative transport pathways and proteinprotein interactions may influence the subcellular location of some proteins. The use of biomolecular netwoks has become one of the main focus of systems biology studies and possess a major potential in the discovery of several biological processes, such as protein-protein interactions (PPI). Dual-targeted (DT) proteins in Arabidopsis thaliana were analyzed through a PPI network, and the proteins displaying interactions with DT proteins were selected by their funtion and location. The selected proteins were analyzed for their eventual role in the subcellular targeting of other proteins. Screenings in yeast two-hibrid assays were performed for the genes GRF9 (14-3-3) and ATH7 (h-type thioredoxin). The results for GRF9 include a peroxidase (PRXR1) and dihydrolipamide acetyltransferase. The results for ATH7 include glutamine synthetase (AT5G35630.3). Combination of in silico analysis with yeast two-hibrid screenings provide new perspectives for understanding the control of subcellular localization.

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Araujo, Fabiano Conde. "Expressão e localização das proteínas c-Fos e receptor de estrogênio beta no testículo humano." Universidade Federal de Minas Gerais, 2006. http://hdl.handle.net/1843/MCSC-78PPEN.

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Abstract:

The testes are glands with endocrine and exocrine functions, the latter being characterized by sperm formation, or spermatogenesis. This is under the control of a complex system involving endocrine and paracrine signalization. In view of an interrelationship between the expression of c-Fos and estrogen receptor beta (ERbeta) proteins, this investigation evaluated the expression of the protooncogene c-fos and the immunolocalization of c-Fos, phosphorylated c-Fos and ERbeta proteins in the human testis. Testis tissue was obtained from 12 men undergoing orchiectomy as a treatment for prostate cancer. These patients had received no hormonal, chemo or radiation therapy before the operations. Tissues were stained by immunohistochemistry using the avidin-biotin-peroxidase method, and c-fos RNAm expression was assessed with reverse transcriptase- polymerase chain reaction (RT-PCR). The protooncogene c-fos was expressed in the human testis and both forms of c-Fos proteins were immunoreactive, mainly in germ cells (spermatogonia, spermatocytes and spermatids) and Sertoli cells. ERbeta was primarily present in somatic cells (Leydig, Sertoli and myofibrillar cells). Based on these results, we hypothesized two mechanisms for estrogen actions over spermatogenesis. The first would be mediated by Sertoli cells, where estrogens could alter either gene expression or the transcriptional activity of c-Fos protein. The other is an indirect mechanism, representing the interrelationship between somatic and germ cells. Somatic cells, under estrogen influence, could modify germ cell functions by paracrine/juxtacrine factors, which would change gene expression or the transcriptional activity of c-Fos protein. Os testículos são glândulas com função endócrina e exócrina, sendo que esta última se caracteriza pela formação de gametas masculinos, ou seja, a espermatogênese. Esta se encontra sob a influência de um complexo sistema de sinalização endócrina (sistêmica e parácrina). Considerando uma possível inter-relação entre as proteínas c-Fos e receptor de estrogênios beta (ER-beta), este trabalho verificou a expressão do proto-oncogene c-fos e a imunolocalização das proteínas c-Fos, c-Fos fosforilada e ER-beta no parênquima testicular humano. A amostra foi constituída por 12 homens férteis, portadores de adenocarcinoma prostático, com indicação terapêutica de bloqueio hormonal cirúrgico pela orquiectomia. Nenhum destes havia sido previamente submetido a tratamento hormonal, quimioterapia ou radioterapia. O material foi processado para o estudo imunohistoquímico com o método da avidina-biotina-peroxidase e avaliação da expressão gênica por transcrição reversa e reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). A expressão do proto-oncogene c-fos foi comprovada no testículo humano, e as proteínas c-Fos e c-Fos fosforilada foram localizadas principalmente no epitélio seminífero, tanto nas células germinativas (espermatogônias, espermatócitos e espermátides) quanto nas células de Sertoli. O ER-beta foi expresso principalmente em células somáticas (células de Leydig, Sertoli e mióides). A distribuição encontrada das proteínas c-Fos e ER-beta nos permite supor uma inter-relação entre estas; seja pela ação estrogênica na célula de Sertoli, induzindo a expressão local de c-fos, seja indiretamente, pelos efeitos que o estímulo estrogênico sobre as células somáticas poderia ter sobre a expressão de c-fos no epitélio germinativo.

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Longhi, Mariana Tamazato. "O papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-26042013-090949/.

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Abstract:

Maspina (mammary serpin) foi identificada em 1994 como uma serpina (serine protease inhibitor) que apresenta atividade de supressão tumoral. Foi classificada como uma serpina devido à homologia na sequência de aminoácidos, porém, maspina não apresenta atividade de inibição de serina proteases. Entre os efeitos biológicos de maspina estão a modulação da adesão, a inibição do crescimento e a invasão tumoral, a inibição da angiogênese, o efeito pró-apoptótico e o controle da resposta ao stress oxidativo, propriedades que contribuem para supressão tumoral. Esta diversidade de funções se reflete nos inúmeros ligantes de maspina e na sua localização subcelular, já que é encontrada na membrana plasmática, no citoplasma, núcleo e mitocôndrias. A localização subcelular de maspina guarda importante relação com sua função, já que foi demonstrado que sua localização nuclear está correlacionada com bom prognóstico em diversos tumores e seu efeito supressor de tumor foi observado somente quando maspina está localizada no núcleo. Entre os ligantes de maspina estão a HDAC1, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrina, uPAR e colágeno tipo I e III. O mecanismo molecular envolvido na regulação dessas atividades não foi elucidado, e até o momento, somente um gene e uma proteína de maspina foram descritos, desta forma alterações pós-traducionais devem estar envolvidas na regulação dessas atividades. Com objetivo de verificar se há modificações pós-traducionais em maspina, utilizamos células MCF10A, que expressam grande quantidade dessa proteína, e submetemos seu extrato proteico à separação por gel bidimensional seguido de western blot. Identificamos quatro formas de maspina com a mesma massa molecular (42kDa), mas pontos isoelétricos distintos. Três destas formas são sensíveis ao tratamento com fosfatase ácida, o que sugere que estas sejam fosforiladas. Utilizamos ainda peroxidovanadato de sódio, um potente inibidor de tirosina fosfatase para investigar o papel da fosforilação de maspina em resíduos de tirosina. Através de western blot e imunofluorescência, observamos que o tratamento das células com o inibidor resultou no aumento dos níveis celulares de maspina assim como no seu acúmulo no citoplasma. Deste modo, concluímos que existem três diferentes fosfoformas de maspina em células MCF10A e ainda a inibição de tirosinas fosfatases aumentam os níveis de maspina e resultam no acúmulo da proteína no citoplasma. Esses resultados sugerem que a fosforilação pode estar envolvida na localização subcelular de maspina e na regulação dos seus níveis proteicos na célula. Maspin (mammary serpin) was identified in 1994 as a serpin (serine protease inhibitor) which presents tumor suppressor activity. It was classified as a serpin due to its homology in amino acids sequence; however, maspin doesn\'t exhibit serine protease inhibition activity. Among maspin biological effects are modulation of cell adhesion, inhibition of tumor growth, invasion and angiogenesis, a pro-apoptotic effect and control of oxidative stress response, properties which contribute to tumor suppression. This functional diversity reflects maspin numerous ligands and its subcellular localization, since it is found on the plasma membrane, in the cytoplasm, nucleus and in mitochondria. Maspin subcellular localization is closely related to its function, as its nuclear localization correlates with good prognostic in several tumors and maspin tumor suppressor activity is only observed when it is located in the nucleus. Among maspin ligands are histone H1 deacetylase, IRF6, GST, HSP90 e HSP70, β1 integrin, uPAR and type I and III collagen. The molecular mechanisms involved in the regulation of maspin biological activities are poorly understood. So far, only one gene and one protein have been assigned to maspin, so posttranslational modification should be involved. In order to verify posttranslational modification in maspin, we utilized MCF10A cells, which express great amount of this protein, and we submitted its proteic extract to 2D-SDS-PAGE followed by western blot. We identified four maspin forms with the same molecular mass (42kDa), but different isoelectric point. Three of these forms are sensitive to acidic phosphatase treatment, suggesting that they are phosphorylated maspin forms. We also utilized sodium peroxovanadate, a potent tyrosine phosphatase inhibitor to investigate the role of maspin tyrosine phosphorylation. Through western blot and immunofluorescence analyses, we observed that cell treatment resulted in increase in maspin cellular levels as well as its cytoplasmic accumulation. Thus, we concluded that there are three diferente maspin phosphoforms in MCF10A cells and yet tyrosine phosphatase inhibition increases maspin levels and results in accumulation of the protein in the cytoplasm. These data suggest that phosphorylation may be involved in maspin subcellular localization and regulation of its protein levels in the cell.

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Genovés, Martínez Ainhoa. "Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV)." Doctoral thesis, Universitat Politècnica de València, 2008. http://hdl.handle.net/10251/2401.

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Los virus de plantas constituyen, en ocasiones, una seria amenaza para numerosos cultivos. A pesar de las numerosas investigaciones realizadas, existe todavía un gran desconocimiento de las rutas y los mecanismos que operan en la invasión viral de los correspondientes huéspedes. Es importante destacar que el bloqueo en el movimiento viral constituye uno de los mecanismos de resistencia natural más frecuentes a los virus. El progreso en el conocimiento de estas etapas del ciclo viral puede llevar a estrategias antivirales. En el presente trabajo se ha pretendido caracterizar estructural y funcionalmente las 5 proteínas codificadas por el genoma del MNSV, haciendo especial hincapié en caracterizar los factores, tanto virales como celulares, que intervienen en el transporte intra e intercelular del virus. Como paso previo y necesario, en el Capítulo 1 de la presente Tesis, se ha obtenido un clon infeccioso del MNSV, denominado pMNSV(Al), a partir del cual se pueden generar transcritos in vitro capaces de reproducir la misma sintomatología que el virus tras la inoculación mecánica sobre el huésped natural (melón). Este clon infeccioso constituye una herramienta molecular indispensable que ha permitido realizar un análisis funcional de los genes virales. Así, mediante técnicas de mutagénesis dirigida sobre el clon pMNSV(Al), se ha obtenido una colección de mutantes que impiden la expresión de cada una de las ORFs del genoma del virus. Además, las mismas modificaciones se han efectuado sobre un clon quimérico, pMNSV(Al)- cp-GFP, en el que se ha sustituido la ORF que codifica la CP viral por el gen testigo de la proteína de fluorescencia verde (GFP). Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las proteínas 29 y 89 estarían implicadas en la replicación del genoma. Por otro lado, la p7A y la p7B participarían en el movimiento célula a célula del virus. Por último, p42 ó CP, además de su papel estructural, es necesaria para la invasión sistémica del virus, siendo capaz Genovés Martínez, A. (2008). Análisis funcional y localización subcelular de las proteínas implicadas en el movimiento intra e intercelular del virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2401 Palancia

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Salton, Gabrielle Dias. "Importância de motivos conservados do fator de início de tradução 2β (elF2β) na síntese de proteínas e na distribuição subcelular desse fator em células humanas". reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, 2011. http://hdl.handle.net/10183/37441.

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Abstract:

Um dos principais reguladores da síntese proteica é o fator 2 do início da tradução de eucariotos (eIF2), formado por três subunidades não idênticas: a, β, e y. As funções citoplasmáticas da subunidade β, essenciais à integridade do processo, estão relacionadas à presença de dois domínios conservados: um deles composto por três blocos de seis a oito resíduos de lisinas e localizado na região amino terminal; e o outro constituído por quatro cisteínas que formam um motivo dedo de zinco localizado na região carboxiterminal. Em Saccharomyces cerevisiae, a expressão de eIF2β desprovido dos blocos de lisinas foi capaz de inibir o crescimento celular. Entretanto, até o momento não são relatados dados em células de mamíferos. Além de sua fundamental função na regulação do processo de síntese proteica no citoplasma, alguns estudos têm demonstrado que as três subunidades de eIF2 apresentam localização nuclear, mas essa também é uma questão ainda pouco explorada. Os resultados apresentados nessa tese mostram que a expressão de eIF2β desprovido dos blocos de lisinas causa uma redução acentuada na síntese proteica e, consequentemente, uma significativa diminuição da proliferação e viabilidade de células humanas. As análises da distribuição subcelular demonstram que eIF2β selvagem superexpresso está localizado no citoplasma, mas é capaz de translocar para o núcleo e acumular no nucléolo de maneira dependedente de ligação a RNA. Tanto os blocos de lisinas, quanto os resíduos de cisteínas mostram-se essenciais à retenção nucleolar de eIF2β. Além disso, sua exportação nuclear é mediada pela exportina CRM1 e é dependente de sua região amino terminal. Considerando os dados obtidos nesse trabalho, pode-se concluir que a ausência dos blocos de lisinas em eIF2β apresenta um efeito antiproliferativo em célula humanas e que a proteína eIF2β deve desempenhar funções no nucléolo relacionadas a algum processo que envolva ligação a RNA. Nesse contexto, podese observar também que, tal como o eIF2β, vários outros eIFs apresentam localização nuclear e participam em diferentes processos que ocorrem no núcleo, e que podem estar relacionados a um mecanismo de checagem da qualidade de mRNAs recém-sintetizados. Assim, os diferentes eIFs atuam em processos vitais à célula no núcleo e, nesse compartimento, também são importantes à regulação da expressão gênica. The eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) is one of the main regulatory molecules in the protein synthesis. It is composed by three non identical subunits a, β, and y: The cytoplasmic functions of the β subunit, that are essential to the integrity of the process, are related to the presence of two conserved domains: one of them composed of three stretches of six to eight lysine residues and located in the amino-terminal region, and the other consisting of four cysteines that form a zinc finger motif located in the carboxyl-terminal portion. In Saccharomyces cerevisiae, the expression of recombinant eIF2β without of the polylysine stretches was able to inhibit cell proliferation, however no data are reported in mammalian cells so far. Additionaly to its fundamental role in regulating the process of protein synthesis in the cytoplasm, some studies have shown that eIF2 may act in the nucleus, but this issue is also still underexplored. Our results indicate a strong reduction in protein synthesis and consequently a significant decrease in cell proliferation and viability when the eIF2β without polylysine stretches is expressed in human cells. Analysis of cellular distribution of eIF2β indicates that it is located in the cytoplasm, but can translocate to the nucleus and accumulate in the nucleolus in a RNA-dependent manner. Both polylysine stretches and cysteine residues are essential for nucleolar retention of this factor. The eIF2β nuclear exclusion is mediated by exportin CRM1 and is dependent of its amino-terminal region. In conclusion, the results presented here show that the absence of polylysine stretches in human eIF2β has an antiproliferative effect in human cells and that the eIF2β protein should play a role related to some processes involving RNA in the nucleolus. In this context, we can also observe that, like eIF2β, others eIFs also present nuclear localization and participate in different processes in the nucleus which can de related to proofreading mechanism of newly synthesized mRNAs. In this way, several eIFs play a role in vital cellular processes in the nucleus and, in this compartment they also are important to regulation of gene expression.

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Martins, Paula Maria Moreira [UNESP]. "Localização sub-celular de proteínas marcadas com GFP em Xanthomonas axonopodis pv. citri por microscopia de fluorescência." Universidade Estadual Paulista (UNESP), 2009. http://hdl.handle.net/11449/87749.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-22Bitstream added on 2014-06-13T19:49:29Z : No. of bitstreams: 1 martins_pmm_me_rcla.pdf: 7124946 bytes, checksum: 0e5fc6b0551611dda7e75caf8cd99fad (MD5) O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e que afeta plantas de citros por todo o mundo. O genoma de Xac foi completamente seqüenciado, o que revelou grandes quantidades de ORFs (~30%) codificando para produtos com função desconhecida (proteínas hipotéticas). Baseando-se no princípio de que muitos eventos bioquímicos acontecem em sítios específicos no interior celular, a localização de proteínas em fusão com GFP tem sido amplamente utilizada para a obtenção de informações valiosas a respeito de suas funções. Para iniciarmos estudos de localização de proteínas hipotéticas em Xac, construímos um vetor integrativo capaz de expressá-las em fusão com o polipeptídio GFP, pPM2a. O vetor de expressão para Xac carrega um cassete promotor/repressor de xilose (xylR/pxyl), o gene gfp, um RBS sintético e um fragmento do gene de α-amilase de Xac, para direcionar a integração do sistema de expressão no lócus amy do cromossomo bacteriano. Mostramos aqui a integração estável do vetor no lócus amy de Xac. Além disso, mutantes de Xac expressando o polipeptídio GFP não apresentam nenhuma alteração em seu fenótipo de patogenicidade para o hospedeiro (laranja doce). Mutantes de Xac expressando versões marcadas com GFP para as proteínas ParB e ZapA, ambas codificadas por Xac, foram utilizadas para a padronização dos estudos de localização subcelular. GFP-ZapAXac apresentou um padrão de localização análogo ao de seu ortólogo presente em Bacillus subtilis: uma estrutura semelhante a uma barra, posicionada no meio do bacilo, onde o septo se desenvolve, orientado perpendicularmente com relação ao eixo longitudinal da célula. Este é o primeiro relato de um estudo de localização realizado em Xac. Ao contrário de GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP não mostrou nenhum padrão de localização, apesar de a fusão... Citrus canker is a disease caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which affects citrus plants worldwide. The genome of Xac was completely sequenced, which unveiled an expressive amount of ORFs (~30%) coding for products of unknown function (hypothetical proteins). Based on the principle that many biochemical events happen at specific sites within the cells, protein localization studies have been extensively used to gather valuable information about function. In order to start subcellular localization studies of hypothetical proteins encoded by Xac using fluorescent microscopy, we constructed an integrative expression vector for GFP-tagging of proteins in this bacterium, pPM2a. The expression vector for Xac carries a xylose repressor/promoter cassette (xylR/pxyl), the gfp gene, a synthetic Ribosome Binding Site (RBS), and a fragment of the α-amylase gene of Xac, to drive the integration of the whole expression system into the amy locus of the bacterial chromosome. We show here stable integration of the expression vector into the amy locus of Xac. Furthermore, Xac mutants expressing the polypeptide GFP do not exhibit any alteration in pathogenicity to the host plant sweet orange. Mutants of Xac expressing GFPtagged versions of ParB and ZapA proteins, both encoded by Xac, were used to standardize the subcellular localization studies. GFP-ZapAXac showed a localization pattern analogous to its ortholog encoded by Bacillus subtilis: a bar-like structure positioned in the middle of the rods, where the septum develops, oriented perpendicularly to the longitudinal axis of the cell. This is the first report of a protein localization study performed in Xac Unlike GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP did not display any detectable localization pattern, despite the fact that we were able to detect the production of the fusion ParBXac-GFP in Western blot experiments... (Complete abstract click electronic access below)

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Martins, Paula Maria Moreira. "Localização sub-celular de proteínas marcadas com GFP em Xanthomonas axonopodis pv. citri por microscopia de fluorescência /." Rio Claro : [s.n.], 2009. http://hdl.handle.net/11449/87749.

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Orientador: Henrique Ferreira Banca: Marco Aurélio Takita Banca: Fernando Carlos Pagnocca Resumo: O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e que afeta plantas de citros por todo o mundo. O genoma de Xac foi completamente seqüenciado, o que revelou grandes quantidades de ORFs (~30%) codificando para produtos com função desconhecida (proteínas hipotéticas). Baseando-se no princípio de que muitos eventos bioquímicos acontecem em sítios específicos no interior celular, a localização de proteínas em fusão com GFP tem sido amplamente utilizada para a obtenção de informações valiosas a respeito de suas funções. Para iniciarmos estudos de localização de proteínas hipotéticas em Xac, construímos um vetor integrativo capaz de expressá-las em fusão com o polipeptídio GFP, pPM2a. O vetor de expressão para Xac carrega um cassete promotor/repressor de xilose (xylR/pxyl), o gene gfp, um RBS sintético e um fragmento do gene de α-amilase de Xac, para direcionar a integração do sistema de expressão no lócus amy do cromossomo bacteriano. Mostramos aqui a integração estável do vetor no lócus amy de Xac. Além disso, mutantes de Xac expressando o polipeptídio GFP não apresentam nenhuma alteração em seu fenótipo de patogenicidade para o hospedeiro (laranja doce). Mutantes de Xac expressando versões marcadas com GFP para as proteínas ParB e ZapA, ambas codificadas por Xac, foram utilizadas para a padronização dos estudos de localização subcelular. GFP-ZapAXac apresentou um padrão de localização análogo ao de seu ortólogo presente em Bacillus subtilis: uma estrutura semelhante a uma barra, posicionada no meio do bacilo, onde o septo se desenvolve, orientado perpendicularmente com relação ao eixo longitudinal da célula. Este é o primeiro relato de um estudo de localização realizado em Xac. Ao contrário de GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP não mostrou nenhum padrão de localização, apesar de a fusão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) Abstract: Citrus canker is a disease caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which affects citrus plants worldwide. The genome of Xac was completely sequenced, which unveiled an expressive amount of ORFs (~30%) coding for products of unknown function (hypothetical proteins). Based on the principle that many biochemical events happen at specific sites within the cells, protein localization studies have been extensively used to gather valuable information about function. In order to start subcellular localization studies of hypothetical proteins encoded by Xac using fluorescent microscopy, we constructed an integrative expression vector for GFP-tagging of proteins in this bacterium, pPM2a. The expression vector for Xac carries a xylose repressor/promoter cassette (xylR/pxyl), the gfp gene, a synthetic Ribosome Binding Site (RBS), and a fragment of the α-amylase gene of Xac, to drive the integration of the whole expression system into the amy locus of the bacterial chromosome. We show here stable integration of the expression vector into the amy locus of Xac. Furthermore, Xac mutants expressing the polypeptide GFP do not exhibit any alteration in pathogenicity to the host plant sweet orange. Mutants of Xac expressing GFPtagged versions of ParB and ZapA proteins, both encoded by Xac, were used to standardize the subcellular localization studies. GFP-ZapAXac showed a localization pattern analogous to its ortholog encoded by Bacillus subtilis: a bar-like structure positioned in the middle of the rods, where the septum develops, oriented perpendicularly to the longitudinal axis of the cell. This is the first report of a protein localization study performed in Xac Unlike GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP did not display any detectable localization pattern, despite the fact that we were able to detect the production of the fusion ParBXac-GFP in Western blot experiments... (Complete abstract click electronic access below) Mestre

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Moura, Mônika Fecury 1979. "Potyvirus: caracterização parcial de espécies em plantas daninhas associadas a cultura do pimentão, avaliação de genótipos de alface e análise subcelular do eIF4E e de proteínas do Lettuce mosaic virus /." Botucatu, 2013. http://hdl.handle.net/11449/105378.

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Orientador: Renate Krause Sakate Coorientador: Marcelo Agenor Pavan Banca: Ivan de Godoy Maia Banca: Valcir Atsushi Yuki Banca: Romulo Fujito Kobori Resumo: Os potyvírus constituem cerca de 90% das espécies conhecidas da família Potyviridae. No Brasil ocasionam sérios entraves em alface (Lactuca sativa L.) e em pimentão (Capsicum annuum L.), onde se pode citar o Lettuce mosaic virus - LMV e o Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), respectivamente. Com o intuito de melhor compreender o reservatório natural de potyvírus em plantas invasoras, amostras foram coletadas em áreas produtoras de pimentão e analisadas utilizando-se antissoro anti-potyvirus (Agdia). Entre estas plantas positivas, destacou-se Solanum americanum Mill, onde foi verificada infecção mista do Cucumber mosaic virus e do Potato virus Y, e Commelina benghalensis L. em que foi encontrado um possível novo potyvírus com a maior identidade de nucleotídeos da proteína capsidial (62%) com a espécie Hardenbergia mosaic virus. Este potyvírus não foi transmitido por extrato vegetal, bem como por afídeos para plantas de pimentão e Nicotiana tabaccum TNN. Na região codificadora para a proteína capsidial do potyvirus não foi encontrado o domínio DAG, relacionado a transmissão por afídeos. Visando encontrar possíveis fontes de resistência ao Lettuce mosaic virus - LMV, genótipos foram inoculados com o isolado LMV-AF-199 (LMV-Most) e o fator de iniciação de tradução eucariótico eIF4E destes genótipos analisado. Em Calona e Salinas-88, conhecidas previamente como portadoras dos genes recessivos mol1 e mol2 foram observados sintomas em todas as plantas inoculadas e verificado o padrão típico do eIF4E1 e eIF4E2, respectivamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) Abstract: The Potyvirus genus corresponds to 90% of known species of the Potyviridae family. In Brazil potyviruses causes serious problems in lettuce (Lactuca sativa L) and in pepper crops (Capsicum annuum L.), which we can highlight Lettuce mosaic virus - LMV and Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), respectively. To increase knowledge about the natural reservoir of potyviruses in weeds, samples were collected from a pepper producer area and analyzed for potyvirus using antiserum anti-potyvirus (Agdia). Solanum americanum Mill was identified as a host for Cucumber mosaic virus and Potato virus Y. In Commelina benghalensis L. a possible new species of potyvirus was found with higher nucleotide identity of the coat protein (62%) with Hardenbergia mosaic virus. This potyvirus could not be transmitted by aphids to sweetpepper and... (Complete abstract click electronic access below) Doutor

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Moura, Mônika Fecury [UNESP]. "Potyvirus: caracterização parcial de espécies em plantas daninhas associadas a cultura do pimentão, avaliação de genótipos de alface e análise subcelular do eIF4E e de proteínas do Lettuce mosaic virus." Universidade Estadual Paulista (UNESP), 2013. http://hdl.handle.net/11449/105378.

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-04-18Bitstream added on 2014-06-13T20:27:47Z : No. of bitstreams: 1 moura_mf_dr_botfca.pdf: 469933 bytes, checksum: eccaa27134acf7a66cc0606cbff1deaa (MD5) Os potyvírus constituem cerca de 90% das espécies conhecidas da família Potyviridae. No Brasil ocasionam sérios entraves em alface (Lactuca sativa L.) e em pimentão (Capsicum annuum L.), onde se pode citar o Lettuce mosaic virus – LMV e o Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), respectivamente. Com o intuito de melhor compreender o reservatório natural de potyvírus em plantas invasoras, amostras foram coletadas em áreas produtoras de pimentão e analisadas utilizando-se antissoro anti-potyvirus (Agdia). Entre estas plantas positivas, destacou-se Solanum americanum Mill, onde foi verificada infecção mista do Cucumber mosaic virus e do Potato virus Y, e Commelina benghalensis L. em que foi encontrado um possível novo potyvírus com a maior identidade de nucleotídeos da proteína capsidial (62%) com a espécie Hardenbergia mosaic virus. Este potyvírus não foi transmitido por extrato vegetal, bem como por afídeos para plantas de pimentão e Nicotiana tabaccum TNN. Na região codificadora para a proteína capsidial do potyvirus não foi encontrado o domínio DAG, relacionado a transmissão por afídeos. Visando encontrar possíveis fontes de resistência ao Lettuce mosaic virus - LMV, genótipos foram inoculados com o isolado LMV-AF-199 (LMV-Most) e o fator de iniciação de tradução eucariótico eIF4E destes genótipos analisado. Em Calona e Salinas-88, conhecidas previamente como portadoras dos genes recessivos mol1 e mol2 foram observados sintomas em todas as plantas inoculadas e verificado o padrão típico do eIF4E1 e eIF4E2, respectivamente... The Potyvirus genus corresponds to 90% of known species of the Potyviridae family. In Brazil potyviruses causes serious problems in lettuce (Lactuca sativa L) and in pepper crops (Capsicum annuum L.), which we can highlight Lettuce mosaic virus – LMV and Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), respectively. To increase knowledge about the natural reservoir of potyviruses in weeds, samples were collected from a pepper producer area and analyzed for potyvirus using antiserum anti-potyvirus (Agdia). Solanum americanum Mill was identified as a host for Cucumber mosaic virus and Potato virus Y. In Commelina benghalensis L. a possible new species of potyvirus was found with higher nucleotide identity of the coat protein (62%) with Hardenbergia mosaic virus. This potyvirus could not be transmitted by aphids to sweetpepper and... (Complete abstract click electronic access below)

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Barros, Andréa Coelho de [UNESP]. "Estudos estruturais com a importina-σ de mamíferos e peptídeos de sequências de localização nuclear (NLS) de proteínas envolvidas no reparo de DNA". Universidade Estadual Paulista (UNESP), 2015. http://hdl.handle.net/11449/144038.

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Made available in DSpace on 2016-09-27T13:39:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-27. Added 1 bitstream(s) on 2016-09-27T13:45:05Z : No. of bitstreams: 1 000869160_20200801.pdf: 948171 bytes, checksum: b1b99c6dc56613330126eb9e2d642cff (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Danos no DNA, podem ocorrer tanto por agentes genotóxicos endógenos quanto agentes exógenos, que podem promover a instabilidade do genoma e levar diretamente a doenças, como por exemplo, o câncer, alterações neurológicas, imunodeficiências e envelhecimento prematuro. Auxiliando na manutenção da estabilidade, as células apresentam uma série de vias de reparo de DNA, as quais realizam o processo em múltiplas etapas para resolver lesões específicas no DNA e manter a integridade do genoma. A importação nuclear é um pré-requisito para as funções das proteínas de reparo do DNA e dentre os mecanismos responsáveis pela regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-α/β é um dos principais mecanismos de deslocamento. A Importina-β (Impβ) atua como o transportador enquanto a Importina-α (Impα) atua como adaptador, reconhecendo as sequências de localização nuclear (NLS) presentes nas proteínas que possuem função no núcleo. Esse trabalho trata especificamente dos estudos estruturais de complexos da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA utilizando técnicas de cristalografia e ensaios de afinidade pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A expressão e purificação da Impα de Mus musculus truncada em sua porção N-terminal foi realizada, bem como a co-cristalização da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA, correspondentes as sequências MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2. Peptídeos mutados em regiões importantes de reconhecimento nuclear para os peptídeos MLH1 e PMS2 também foram selecionados para o desenvolvimento deste projeto. Dados de difração de raios-X foram coletados dos cristais obtidos e processados no intervalo de 2,0-2,8 Å de resolução. Com esses resultados, as estruturas contendo cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2 foram elucidadas. As proteínas do complexo MutLα, a MLH1 e... DNA damage can occur by endogenous and exogenous genotoxic agents, which may promote instability of the genome and directly lead to diseases such as cancer, neurological disorders, immunodeficiencies and even premature aging. Helping in the maintenance of the stability, the cells display a number of DNA repair pathways, which carry out the process in multiple steps to resolve specific DNA damage, and maintain the integrity of the genome. The nuclear import is a pre-requisite for the functions of DNA repair proteins and, among the mechanisms responsible for regulation of nuclear import, the classical pathway constituted by the heterodimer importin-α / β is a major shift mechanisms. Importin-β (Impβ) acts as the carrier while the importin α-(Impα) acts as an adapter recognizing the nuclear localization sequence (NLS) present in proteins that have function into the nucleus.This work concerns specifically the structural studies of complexes with Imp and NLSs peptides from proteins related to DNA repair using crystallographic techniques and binding assays by isotermal titration calorimetry technique (ITC). The expression and purification of Mus musculus Impα truncated at its N-terminal portion was performed, as well as co-crystallization with Impα NLSs peptides of proteins related to DNA repair, the corresponding sequences MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2. Peptides mutated in key regions of nuclear recognition for MLH1 and PMS2 peptides were also selected for this project. X-ray diffraction data collected from crystals were obtained and processed in the range of 2.0-2.8 Å resolution. With these results, the structures containing cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2 were elucidated. The MutLα complex proteins, MLH1 and PMS2, related to the mismatch repair (MMR), bound to the Impα similarly to the T antigen NLS of SV40 in the major binding site. ITC experiments corroborate the crystallographic results, which suggest that both NLSs are classic... FAPESP: 2011/09905-0

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Barros, Andréa Coelho de. "Estudos estruturais com a importina-σ de mamíferos e peptídeos de sequências de localização nuclear (NLS) de proteínas envolvidas no reparo de DNA". Botucatu, 2015. http://hdl.handle.net/11449/144038.

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Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes Coorientador: Agnes Alessandra Sekijima Takeda Banca: Maria Célia Bertolini Banca: Rafael Lemos Miguez Counãgo Banca: Valber de Albuquerque Pedrosa Banca: Lucilene Delazari dos Santos Resumo: Danos no DNA, podem ocorrer tanto por agentes genotóxicos endógenos quanto agentes exógenos, que podem promover a instabilidade do genoma e levar diretamente a doenças, como por exemplo, o câncer, alterações neurológicas, imunodeficiências e envelhecimento prematuro. Auxiliando na manutenção da estabilidade, as células apresentam uma série de vias de reparo de DNA, as quais realizam o processo em múltiplas etapas para resolver lesões específicas no DNA e manter a integridade do genoma. A importação nuclear é um pré-requisito para as funções das proteínas de reparo do DNA e dentre os mecanismos responsáveis pela regulação da importação nuclear, a via clássica constituída pelo heterodímero Importina-α/β é um dos principais mecanismos de deslocamento. A Importina-β (Impβ) atua como o transportador enquanto a Importina-α (Impα) atua como adaptador, reconhecendo as sequências de localização nuclear (NLS) presentes nas proteínas que possuem função no núcleo. Esse trabalho trata especificamente dos estudos estruturais de complexos da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA utilizando técnicas de cristalografia e ensaios de afinidade pela técnica de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). A expressão e purificação da Impα de Mus musculus truncada em sua porção N-terminal foi realizada, bem como a co-cristalização da Impα peptídeos NLSs de proteínas relacionadas ao reparo de DNA, correspondentes as sequências MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2. Peptídeos mutados em regiões importantes de reconhecimento nuclear para os peptídeos MLH1 e PMS2 também foram selecionados para o desenvolvimento deste projeto. Dados de difração de raios-X foram coletados dos cristais obtidos e processados no intervalo de 2,0-2,8 Å de resolução. Com esses resultados, as estruturas contendo cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 e XPG2 foram elucidadas. As proteínas do complexo MutLα, a MLH1 e... Abstract: DNA damage can occur by endogenous and exogenous genotoxic agents, which may promote instability of the genome and directly lead to diseases such as cancer, neurological disorders, immunodeficiencies and even premature aging. Helping in the maintenance of the stability, the cells display a number of DNA repair pathways, which carry out the process in multiple steps to resolve specific DNA damage, and maintain the integrity of the genome. The nuclear import is a pre-requisite for the functions of DNA repair proteins and, among the mechanisms responsible for regulation of nuclear import, the classical pathway constituted by the heterodimer importin-α / β is a major shift mechanisms. Importin-β (Impβ) acts as the carrier while the importin α-(Impα) acts as an adapter recognizing the nuclear localization sequence (NLS) present in proteins that have function into the nucleus.This work concerns specifically the structural studies of complexes with Imp and NLSs peptides from proteins related to DNA repair using crystallographic techniques and binding assays by isotermal titration calorimetry technique (ITC). The expression and purification of Mus musculus Impα truncated at its N-terminal portion was performed, as well as co-crystallization with Impα NLSs peptides of proteins related to DNA repair, the corresponding sequences MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2. Peptides mutated in key regions of nuclear recognition for MLH1 and PMS2 peptides were also selected for this project. X-ray diffraction data collected from crystals were obtained and processed in the range of 2.0-2.8 Å resolution. With these results, the structures containing cNLSs MLH1, PMS2, XPG1 and XPG2 were elucidated. The MutLα complex proteins, MLH1 and PMS2, related to the mismatch repair (MMR), bound to the Impα similarly to the T antigen NLS of SV40 in the major binding site. ITC experiments corroborate the crystallographic results, which suggest that both NLSs are classic... Doutor

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Batista, Wagner Luiz [UNIFESP]. "Dupla localização da proteína de choque térmico Mdj1 em Paracoccidioides brasiliensis, identificação de elementos de transcrição na região 5' intergênica compartilhada pelos genes MDJ1/LON e avaliação da sua expressão gênica." Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), 2006. http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/21211.

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Abstract:

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Paracoccidioides brasiliensis é o fungo dimórfico responsável pela paracoccidioidomicose (PCM). A diferenciação celular do P. brasiliensis de micélio para levedura nos pulmões é essencial para a ocorrência da PCM e é dependente de temperatura. Parte das alterações sofridas pelo fungo está provavelmente relacionada com a expressão de proteínas de estresse (Hsp), pouco conhecidas no P. brasiliensis. Em nosso laboratório foram clonados os genes de P. brasiliensis homólogos aos de duas proteínas mitocondriais de choque térmico: o PbLON, da proteinase Lon, e a porção 5’ do PbMDJ1, da chaperone Hsp40/Mdj1. Estes genes estão ligados por uma região 5’ intergênica comum (ML), o que pode ser relevante em relação à regulação transcricional não apenas porque ambos respondem ao estresse, mas também pela relação funcional. Mdj1p é o membro da família DnaJ localizado na matriz mitocondrial, o qual é essencial na digestão de proteínas desnaturadas pela Lon. Neste trabalho o gene PbMDJ1 de P. brasiliensis foi totalmente caracterizado. Sua sequência apresenta uma ORF de 1659pb, organizada em três exons interrompidos por dois introns. PbMdj1 apresenta 551 aminoácidos com alta similaridade com as homólogas de Blastomyces dermatitidis, Histoplasma capsulatum e Coccidioides immitis. O alinhamento destas sequências permitiu mapear todos os domínios que caracterizam a família da DnaJ, a saber, um domínio J, um domínio rico em G/F e um domínio ligante de zinco organizado em quatro repetições de CXXCXGXG. Para a expressão de PbMdj1 recombinante em bactéria, um fragmento de cDNA de 757pb da região 5´ foi subclonado no vetor pHIS3. A proteína PbMdj1r foi purificada e utilizada na obtenção de anticorpos policlonais de coelho. Em microscopia eletrônica e confocal, os anticorpos anti-PbMdj1r localizaram a molécula na mitocôndria de leveduras de P. brasiliensis Pb18, mas também abundantemente na parede celular e região de brotamento. Em ensaios de “imunoblotting”, os anticorpos revelaram uma proteína nativa de 55 kDa tanto em extratos mitocondriais, com significativo aumento da expressão em condições de estresse térmico, como em uma fração de parede. Sua localização extramitocondrial foi confirmada ainda por citometria de fluxo (FACS). Alguns soros de pacientes com PCM reagiram com a PbMdj1r em “immunoblotting”, sugerindo que os pacientes reconhecem essa proteína durante a infecção. Obervamos que locus cromossômico dos genes MDJ1/LON é comum entre fungos dimórficos e Aspergillus. Na região intergênica 5’ compartilhada pelos genes MDJ1/LON de P. brasiliensis Pb18 e Pb3 foram mapeados e validados 4 elementos de transcrição usando o ensaio de proteção contra DNase I “footprinting” e em experimentos de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Essas regiões abrigam um elemento de choque térmico convencional, dois não-convencionais e outro ligante de AP-1 (ARE), associado ao estresse oxidativo. Foram encontrados motivos similares nos locus correspondente de B. dermatitidis e H. capsulatum. O Pb3, que pertence a uma espécie críptica filogeneticamente distinta, apresentou polimorfismo na região ML. As análises comparativas entre Pb18 e Pb3 mostraram diferenças no número de elementos de transcrição no padrão da regulação transcripcional de PbLON e PbMDJ1 durante a transição de fase. Em Pb18, PbMDJ1 parece ser preferencialmente expresso na fase leveduriforme. Ambos os genes apresentaram aumento nos níveis de transcrição após choque térmico a 42 ºC, porém em Pb3 esse efeito foi mais lento. Este é o primeiro trabalho que detecta elementos de trancrição em P. brasiliensis e pode contribuir significativamente para entendimento da regulação de genes de estresse em fungos dimórficos. As diferenças detectadas em Pb18 e Pb3 quanto à regulação transcricional dos genes aqui estudados e eventualmente outros poderá explicar a distinta relação parasitahospedeiro que os isolados apresentam em camundongos B10.A. Paracoccidioides brasiliensis is the dimorphic fungus responsible for paracoccidioidomycosis in man, who is infected by inhalation of conidia. The cellular differentiation of P. brasiliensis from mycelium (M) to yeast (Y) in the lungs is essential for infection to occur. J-domain (DnaJ) proteins, of the Hsp40 family, are essential cofactors of their cognate Hsp70 chaperones, besides acting as independent chaperones. In the present study, we have cloned and sequenced the heat shock gene PbMDJ1, which encodes an Mdj1 homologue that is a mitocondrial DnaJ in yeasts. The gene sequence consists of an ORF of 1719bp interrupted by three introns and translates 551 amino acid residues. PbMdj1 is organized in modules consisting of a J domain, followed by a glycine/phenylalanine-rich segment and four CXXCXGXG (zinc finger) domains. The C-terminal is not conserved. We expressed a His-tagged N-terminal region of PbMdj1 and used the recombinant protein to immunize rabbits to obtain anti-PbMdj1r serum. Immune-localization was performed using confocal and electron microscopy, and also flow cytometry. We demonstrated the presence of PbMdj1 not only in the mitochondria, where it is apparently sorted, but also in the cell wall of P. brasiliensis. Labeling was abundant throughout the cell wall and especially in the budding regions; however, anti-PbMdj1r did not affect fungal growth in the concentrations tested in vitro, possibly due to the poor access of the antibodies to their target in growing cells. Labeled mitochondria stood preferentially close to the plasma membrane and gold particles were detected in the thin space between them, towards the cell surface. The anti-rPbMdj1 antibodies used in the reactions specifically recognized a single 55 kDa mitochondrial and cell wall (alkaline β-mercaptoethanol extract) component, compatible with the predicted size of the protein devoid of its matrix peptidetargeting signal. This is the first time a DnaJ member has been observed on the cell surface, where its function is speculative. In the present work we show that Mdj1 and the mitochondrial proteinase Lon homologues are heat shock proteins in the P. brasiliensis and that their gene organization is conserved among thermodimorphic fungi and Aspergillus, where the genes are adjacent and have a common 5´region. We mapped and validaded transcription elements in the 5´-shared intergenic (ML) region of MDJ1/LON from P. brasiliensis using both DNAse I protection footprinting and mobility shift assays. Three of them were similar to canonical and nonconventional heat shock elements and one is a putative AP-1 binding domain (ARE), related to oxidative stress. Similar motifs were detected in the correspondent locus of B. dermatitidis and H. capsulatum. Our studies compared P. brasiliensis Pb18 with genetically distinct Pb3, where the ML region is polymorphic outside mapped motifs. In these isolates, different numbers of elements were detected and the pattern of mRNA accumulation of the genes was distinct during phase transition. In Pb18, PbMDJ1 was preferentially expressed in the yeast phase. This is the first study of transcription elements in P. brasiliensis that might help to understand regulation of stress-related genes involved in fungal adaptation to the host. BV UNIFESP: Teses e dissertações

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Bernardes, Natália Elisa. "Estudos estruturais com a importina-α do fungo Neurospora crassa e peptídeos de sequências de localização nuclear (NLS) de proteínas relacionadas ao metabolismo de fungos". Botucatu, 2018. http://hdl.handle.net/11449/154866.

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Abstract:

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes Resumo: A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Na Via Clássica de Importação Nuclear, a proteína Importina-α (Impα) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Impα de Neurospora crassa (NcImpα) e a sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína NcImpα no reconhecimento de NLSs de proteínas de fungos. Além disso, foram reconhecidos prováveis NLSs em proteínas reguladoras do metabolismo de carbono e nitrogênio em fungos. O objetivo desse trabalho é identificar e caracterizar o modo de interação de NLSs de proteínas fúngicas com a NcImpα e verificar possíveis especificidades da proteína NcImpα no reconhecimento de NLSs. Os potenciais peptídeos NLS de proteínas dos fungos filamentosos N. crassa e Aspergillus nidulans foram submetidos a experimentos de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) com a proteína NcImpα, para calcular a afinidade entre as moléculas. Dentre os peptídeos testados, as sequências correspondentes ao potenciais NLS dos fatores de transcrição PAC-3, NIT-2, FLB-3, VOSA e VEA, apresentaram elevada afinidade com a NcImpα, conforme indicado pelos valores de Kd obtidos. Quando submetidos a experimentos de importação ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) Abstract: The communication between the cell nucleus and the cytoplasm happens through transport mechanisms that allow the passage of molecules through pores present in the nuclear envelope. In the classical nuclear import pathway, the protein Importin-α (Impα) acts in the identification of the proteins to be transported to the nucleus from the recognition of nuclear localization sequences (NLS). The first structural characterization studies of N. crassa Impα (NcImpα) and its crystallographic structure showed the presence of regions that may be related to protein specificities in the recognition of fungal NLSs. In addition, NLSs were recognized in proteins related to fungal metabolism. The objective of this work is to identify NLSs in fungal proteins and observe the specificities of the NcImpα protein. Potential NLS peptides of N. crassa were subjected to isothermal titration calorimetry (ITC) experiments with NcImpα to verify and calculate the affinity of the complexes. Among the peptides tested, the sequences corresponding to the potentials NLS of the transcription factors PAC-3, NIT-2, FLB-3, VOSA and VEA, showed high affinity with NcImpα, as indicated by the Kd values obtained. When subjected to functional experiments with HeLa cells, the peptide NIT2-NLS were efficiently transported into the cell nucleus. Crystallization tests were performed to elucidate the structure of the complexes Impα/NLS peptides. A set of data from the NcImpα/ NIT2NLS complex was collected, with 99.71% comp... (Complete abstract click electronic access below) Doutor

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Silva, Anderson Weiny Barbalho. "Localização de proteínas, quantificação de RNAm e papel das citocinas TNF-α e IL-1β no desenvolvimento folicular in vivo e in vitro em bovinos". reponame:Repositório Institucional da UFC, 2016. http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/19315.

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SILVA, Anderson Weiny Barbalho. Localização de proteínas, quantificação de RNAm e papel das citocinas TNF-α e IL-1β no desenvolvimento folicular in vivo e in vitro em bovinos. 2016. 202 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. Submitted by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:32:25Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) Made available in DSpace on 2016-08-30T20:35:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_awbsilva.pdf: 11114380 bytes, checksum: 03441619657fa0d30e6b11bd187ddab7 (MD5) Previous issue date: 2016 The aims of this study were: 1) to investigate the expression and distribution of messengers RNAs and proteins of TNF-α and interleukin 1 systems members in the ovaries of cyclic cows; 2) to evaluate the effects of TNF-α, Dexamethasone and IL-1β, on the survival and activation of bovine primordial follicles in vitro; 3) to characterize the expression profile of TNF-α and IL-1β systems in bovine granulosa cells of preovulatory follicles during ovulation induced by GnRH/LH in vivo; 4) to evaluate the influence of gonadotropins (FSH/LH) in the expression of mRNA for TNF-α system and IL-1β system in cumulus cells cultured in vitro; and 5) to analyze the effect of TNF-α and IL-1β on cumulus cells expansion, ultrastructure integrity of cultured COCs; mRNA expression of HAS-2, CASP3, CASP6 and iNOS of cumulus cells after in vitro culture. Bovine ovaries were processed for immunohistochemistry and Western Blot analyzes for the location of proteins for TNF-α system and interleukin system 1 in preantral and antral follicles. To evaluate the in vitro follicular survival and activation, ovarian tissues were cultured for 6 days in the presence of IL-1β, TNF-α or Dexamethasone at different concentrations. To evaluate the profile of expression of TNF-α and IL-β systems after GnRH treatments in vivo, granulosa cells from bovine preovulatory follicles were collected at different time points. COCs were cultured for 12 and 24h in the presence of gonadotropins, TNF-α and IL-1β. TNF-α system (TNF-α, TNFR1 and TNFR2) and interleukin I system (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI and IL-1RII) were detected in preantral and antral follicles by immunohistochemistry. Variable levels of mRNA for the interleukin 1 system members were observed at different stages of development. Concerning to in vitro culture of bovine ovarian tissue, the presence of TNF-α (10 ng/mL) reduced the follicular survival and increased the number of apoptotic cells, whereas the addition of dexamethasone (10 ng/mL) maintained the follicular ultrastructure. On the other hand, the presence of IL-1β (10 or 50 ng/mL) was able to maintain the percentage of normal follicles and promote the primordial follicles activation. In vivo, an increased expression of mRNA for TNF-α and TNFR1 was observed 12 h after GnRH treatment. Higher levels of mRNA for TNFR2 were observed at 3, 6 and 12 h after GnRH administration. However, it was seen an increase in mRNA levels for IL-1RA 24h after GnRH induction. In vitro, TNF-α and IL-1β did not shown additive effect of cumulus cells expansion. The levels of mRNA for TNF-α, TNFR1 and TNFR2 were increased in COCs cultured for 12 h in the presence of gonadotropins. The presence of gonadotropins increased the mRNA levels for IL-1R1 and IL-1RA in cumulus cells after 24h of culture. The presence of TNF-α reduced levels of HAS-2, CASP3 and CASP6, whereas IL-1β increased levels of mRNA for IL-β, IL-1RA and HAS-2 in cultured cumulus cells. Furthermore, IL-1β increased iNOS expression after 24h of culture. Ultrastructural analysis confirmed the integrity of COCs cultured in presence of TNF-α or IL-1β. In conclusion, TNF-α system members and interleukin-1 system members are differentially expressed in ovarian cells. TNF-α reduces the follicular survival in vitro, while dexamethasone enhances the ultrastructure of cultured follicles. On the other hand, IL-1β promotes the development of primordial follicles in vitro. The expression of TNF-α system and the IL-1 system is regulated by gonadotropins in vivo and in vitro. The presence of TNF-α and IL-1β maintain the normal ultrastructure of cultured COCs. These results indicate an important role of TNF-α and interleukin 1 systems in the regulation of bovine folliculogenesis and ovulation. Os objetivos deste estudo foram: 1) investigar a expressão e a distribuição de RNAs mensageiros e proteínas dos sistemas TNF-α e interleucina 1 em ovários de vacas cíclicas, 2) avaliar os efeitos do TNF-α, Dexametasona e da IL-1β, na sobrevivência e ativação de folículos primordiais bovinos cultivados in situ; 3) caracterizar o perfil de expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1β em células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos, durante a ovulação induzida por GnRH/LH in vivo; 4) avaliar a influência das gonadotrofinas (FSH/LH) na expressão de RNAm para o sistema TNF-α e sistema IL-1β em células do cumulus cultivadas in vitro; e 5) analisar o efeito do TNF-α e da IL-1β na expansão de células do cumulus, na manutenção da integridade ultraestrutural de CCOs; na expressão de RNAm para HAS-2, CASP3, CASP6 e iNOS em células do cumulus após cultivo in vitro. Ovários bovinos foram processados para análises de imunohistoquímica e Western Blot para a localização das proteínas para o sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 em folículos pré-antrais e antrais. Para avaliação da sobrevivência e ativação folicular in vitro, fragmentos ovarianos foram cultivados por 6 dias na presença de IL-1β, TNF-α ou Dexametasona em diferentes concentrações. Células da granulosa de folículos pré-ovulatórios bovinos foram coletadas em diferentes momentos após a administração intramuscular de GnRH para avaliação do perfil de expressão dos sistemas TNF-α e IL-β in vivo. CCOs foram cultivados in vitro por 12 e 24 h na presença de gonadotrofinas, TNF-α e IL-1β. Os resultados da imunohistoquímica mostraram que as proteínas para os membros do sistema TNF-α (TNF-α, TNFR1 e TNFR2) e do sistema interleucina I (IL-1β, IL-1RA, IL-1RI e IL-1RII) foram detectados em folículos pré-antrais e antrais. Foram observados níveis variáveis de RNAm para o sistema interleucina 1 nas diferentes categorias foliculares analisadas. Em relação ao cultivo in vitro de fragmentos ovarianos, a presença de TNF-α (10 ng/mL) reduziu a sobrevivência folicular e aumentou o número de células apoptóticas, enquanto que a adição de Dexametasona (10 ng/mL) ao meio de cultivo manteve a ultraestrutura folicular. Por outro lado, a presença de IL-1β (10 ou 50 ng/mL) foi capaz de manter a percentagem de folículos normais e de promover a ativação dos folículos primordiais. In vivo, um aumento na expressão de RNAm para TNF-α e TNFR1 foi observado 12 h após tratamento com GnRH. Níveis mais elevados de RNAm para TNFR2 foram observados em 3, 6 e 12 h após administração de GnRH. No entanto, foi observado um aumento nos níveis de RNAm para IL-1RA após 24h da indução por GnRH. In vitro, o TNF-α e a IL-1β não apresentaram efeito aditivo à expansão das células do cumulus. Os níveis de RNAm para TNF-α, TNFR1 e TNFR2 foram aumentados em CCOs cultivados por 12 h na presença de gonadotrofinas. A presença de gonadotrofinas aumentou os níveis de RNAm para IL-1R1 e IL-1RA em células do cumulus após cultivo por 24h. O TNF-α reduziu os níveis de RNAm para HAS-2, CASP3 e CASP6, enquanto que a IL-1β elevou os níveis de expressão de IL-β, IL-1RA e HAS-2 em células do cumulus cultivadas. Além disso, a IL-1β aumentou a expressão de iNOS após 24h de cultivo. A análise ultraestrutural confirmou a integridade dos CCOs cultivados na presença de TNF-α ou IL-1β. Em conclusão, os componentes do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 são expressos diferencialmente em células ovarianas. O TNF-α reduz a sobrevivência folicular in vitro, enquanto a Dexametasona mantém a ultraestrutura de folículos cultivados. Por outro lado, a IL-1β promove o desenvolvimento de folículos primordiais in vitro. A expressão do sistema TNF-α e do sistema IL-1 é regulada por gonadotrofinas in vivo e in vitro. A presença de TNF-α e IL-1β mantém a ultraestrutura normal de CCOs cultivados. Estes resultados sugerem um importante papel do sistema TNF-α e do sistema interleucina 1 na regulação da foliculogênese e ovulação em bovinos.

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Lubini, Greice. "Caracterização do Gene NtCDKG;2 Expresso no Pistilo de Nicotiana tabacum L." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-22042013-141248/.

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Abstract:

A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

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Pereira, Ana Carolina Vieira Zakir. "Análise funcional do fator de transcrição DREB6A de feijão (Phaseolus vulgaris L.) pela superexpressão em Arabidopsis thaliana." Universidade de São Paulo, 2014. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/64/64133/tde-03112014-162950/.

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Abstract:

Estresses abióticos como seca, alta salinidade e baixas temperaturas, afetam o crescimento e a produtividade em culturas de interesse comercial como o feijoeiro comum. Proteínas DREB (Dehydration Responsive Element Binding) são fatores de transcrição que regulam genes específicos envolvidos na tolerância ao estresse abiótico. Para determinar como as plantas toleram condições ambientais adversas, variedades tolerantes, biologia molecular e bioinformática podem ser aplicadas para identificar e caracterizar genes que controlam mecanismos de adaptação a estresses. Baseado nas informações disponíveis nos bancos de dados públicos, a sequência da Orf completa do gene Phvul.009G029600.1| PACid:27146455 contendo 1062 pb foi encontrada e usada para o desenho dos primers e para o sequenciamento. A nova sequência é muito similar ao AtRAP2.4 e foi nomeada como PvDREB6A, segundo a análise filogenética. Ferramentas de predição mostraram que a sequência apresenta 354 aminoácidos e possui uma cópia do domínio AP2, que se dobra em uma estrutura com três ?-folhas e uma ?-hélice apresentando resíduos importantes e motivos específicos de reconhecimento e de ligação ao DNA. Além disso, um peptídeo trânsito foi detectado na porção N-terminal com um sítio de clivagem no resíduo 52. A interação deste fator de transcrição com seu domínio de ligação ao DNA foi validada por Electro Mobility Shift Assay (EMSA). A localização subcelular da proteína foi realizada e expressão da Green Fluorescent Proteín (GFP) foi detectada no núcleo. A transformação genética para a superexpressão do gene PvDREB6A em plantas de Arabidopsis thaliana Columbia-0 e mutantes nocaute para o gene AtRAP2.4 (Salk_020767C) foi realizada. Quatro eventos com cópia única e melhor expressão do gene PvDREB6A denominados Col-0/pFEC2.1 #1, Salk_020767C/pFEC2.1 #13.1, Salk_020767C/ pFEC2.1 #19.7 e Salk_020767C/ pFEC2.1 #23.7, foram selecionados. O evento Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 mostrou melhor expressão do gene PvDREB6A e foi visualizado sob luz UV. A análise funcional revelou que as plantas transgênicas submetidas ao déficit hídrico, à alta salinidade e ao frio, apresentaram maior taxa de sobrevivência. Plantas transgênicas superexpressando o gene PvDREB6A apresentaram menor taxa de desidratação e de vazamento de eletrólitos quando submetidas a estresses abióticos. Uma análise da expressão de genes relacionados à tolerância foi conduzida. A quantificação revelou que a expressão de 18 genes: AtDC1.2, AtUSP, AtKIN1, AtERF69, AtGolS3, AtMT2A, AtCAP160, AtNTR1.7, AtGPR7, AtPDC2, AtLTI78, AtCOR15a, AtCOR15b, AtCOR47, AtCOR413, AtLEA6, AtLEA9 e AtLEA14, relacionados a tolerância a seca, sal e frio foram up-regulated devido à superexpressão do gene PvDREB6A de feijoeiro nas plantas transgênicas Abiotic stresses like drought, high salinity and low temperatures affect growth and productivity in crops of economic interest such as common bean. DREB (Dehydration Responsive Element Binding) proteins are transcription factors that activate specific genes involved in tolerance to abiotic stress. To generate new information on the research for drought and other abiotic stresses, tolerant varieties, molecular biology and bioinformatics can be applied to identify and characterize genes that control plant defense and adaptation mechanisms to water deprivation, to excessive salt and to high/low temperature. Based on public databases, a common bean DREB sequence was found and an in silico study was carried out. A complete Orf sequence Phvul.009G029600.1 |PACid:27146455 containing 1062 bp was found and used for primer design and sequencing. The new sequence was very similar to AtRAP2.4 and named as PvDREB6A, according to phylogenetic analysis. Prediction tools showed that the deduced 354 aa sequence has one copy of the AP2 domain, folding in a three ?-sheets and one ?-helix structure, and presenting important residues and motifs for DNA contacting and binding specificity. In addition, a chloroplast transit peptide was detected at the N-terminal region with cleavage site in the 52 residue. Binding activity of this transcription factor was validated by Electro Mobility Shift Assay (EMSA). Subcellular localization was verified by transient expression of PvDREB6A::GFP in Nicotiana benthamiana and the expression of GFP was detected at the nucleus. Genetic transformation for overexpression of PvDREB6A gene in Arabidopsis thaliana wild type and knockout mutant for AtRAP2.4 gene was conducted. Four single copy events with better expression of the PvDREB6A named Col-0/pFEC2.1 #1, Salk_020767C/pFEC2.1 #13.1, Salk_020767C/pFEC2.1 #19.7 and Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 were selected. The event Salk_020767C/pFEC2.1 #23.7 showed the best expression of PvDREB6A and was visualized under UV light. Functional analysis, revealed that transgenic plants under water deficit, high salt, and cold showed higher survival rate. Transgenic plants overexpressing the PvDREB6A exhibited lower water loss rate and electrolyte leakage rate under abiotic stress. A gene expression analysis with tolerant-related genes was conduted. The quantification revealed that 18 genes, AtDC1.2, AtUSP, AtKIN1, AtERF69, AtGolS3, AtMT2A, AtCAP160, AtNTR1.7, AtGPR7, AtPDC2, AtLTI78, AtCOR15a, AtCOR15b, AtCOR47, AtCOR413, AtLEA6, AtLEA9 e AtLEA14, related to drought, salt and cold tolerance, were up-regulated due to the overexpression of PvDREB6A from common bean in the transgenic plants

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Spoladore, Larissa. "Componentes genéticos que afetam a via de direcionamento de proteínas organelares em Arabidopsis thaliana." Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11151/tde-27062016-094405/.

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Nos eucariotos, a evolução dos sistemas de transporte molecular foi essencial pois seu alto grau de compartimentalização requer mecanismos com maior especificidade para a localização de proteínas. Com o estabelecimento das mitocôndrias e plastídeos como organelas da célula eucariota, grande parte dos genes específicos para sua atividade e manutenção foram transferidos ao núcleo. Após a transferência gênica, a maioria das proteínas passaram a ser codificadas pelo núcleo, sintetizadas no citosol e direcionadas às organelas por uma maquinaria complexa que envolve receptores nas membranas das organelas, sequências de direcionamento nas proteínas e proteínas citossólicas que auxiliam o transporte. A importação depende em grande parte de uma sequência na região N-terminal das proteínas que contém sinais reconhecidos pelas membranas organelares. No entanto, muito ainda não é compreendido sobre o transporte de proteínas organelares e fatores ainda desconhecidos podem influenciar o direcionamento sub-celular. O objetivo deste trabalho foi a caracterização da General Regulatory Factor 9 (GRF9), uma proteína da família 14-3-3 de Arabidopsis thaliana potencialmente envolvida no direcionamento de proteínas organelares, e a geração de um genótipo para ser utilizado na obtenção de uma população mutante para genes que afetam o direcionamento da proteína Tiamina Monofosfato Sintetase (TH-1). Após experimentos in vivo e in planta, foi observado que GRF9 interage com as proteínas duplo-direcionadas Mercaptopyruvate Sulfurtransferase1 (MST1) e a Thiazole Biosynthetic Enzyme (THI1), e com a proteína direcionada aos cloroplastos TH-1. Experimentos de deleção e interação in vivo mostraram que a região Box1 de GRF9 é essencial para a interação com THI1 e MST1. Com a finalidade de dar continuidade a caracterização da GRF9 e para realização de testes com relação a sua função no direcionamento de proteínas organelares foi gerada uma linhagem homozigota que superexpressa GRF9. Plantas expressando o transgene TH-1 fusionado a Green Fluorescent Protein (GFP) em genótipo deficiente na TH-1 (CS3469/TH-1-GFP) foram obtidas para a geração de população mutante que possibilitará a descoberta de componentes genéticos ainda desconhecidos e responsáveis pelo direcionamento de proteínas aos cloroplastos. In Eukaryotes, the evolution of molecular transport in the cell was essential due to their increase in compartmentalization, which requires more specific mechanisms for the correct localization of proteins. With the establishment of mitochondria and plastids as organelles, a great number of their genes, either specific for their metabolic functions or maintenance of their own transcription/translation processes, were transferred to the nucleus of the cell. These transfers caused most of the organellar proteins to be coded by the nucleus, then synthesized in the cytosol and targeted to the organelles by a complex machinery which involves membrane receptors in the organelles, targeting sequences in the proteins, and cytosolic proteins which assist them with the transport. Protein import depends greatly on an N-terminal sequence in proteins which has recognizable signals for the organellar membrane receptors. However, much is still not understood about the transport of organellar proteins, and unknown factors may still influence subcellular targeting. The goal of this work was the characterization of General Regulatory Factor 9 (GRF9), a protein of the 14-3-3 family in Arabidopsis thaliana potentially involved in the targeting of organellar proteins, and generating a genotype to be used in obtaining a mutant population for genes affecting the targeting of the protein Thiamine Requiring 1 (TH-1). After in vivo and in planta experiments it was observed that GRF9 interacts with the dual-targeted proteins Mercaptopyruvate Sulfurtransferase1 (MST1) and Thiazole Biosynthetic Enzyme (THI1), and with the chloroplast targeted protein TH-1. Deletion experiments followed by in vivo interaction assays showed that Box 1 region of GRF9 is essential for the interaction with THI1 and MST1. For the continuing characterization of GRF9 and for following tests of its function in the targeting of organellar proteins, a homozygous line was generated overexpressing GRF9. Plants expressing the transgene TH-1 fused to the Green Fluorescent Protein (GFP) in a TH-1 deficient genotype (CS3469/TH-1-GFP) were obtained for the generation of a mutant population which will allow the discovery of genetic components still unknown responsible for targeting proteins to the chloroplasts.

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Silva, Olivia Beloto da. "A PKA modula a localização do SGLT1 e indiretamente a recuperação do pHi, no tratamento com alta concentração de glicose." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42137/tde-17092012-110833/.

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Esse estudo avaliou o efeito da glicose sobre a atividade da PKA e sua interação com o SGLT1 e os trocadores Na+/H+ (NHE1 e NHE3). As células HEK-293 foram transfectadas com hSGLT1 wild type (WT) ou mutante (S418H) e tratadas 20 dias com DMEM contendo glicose 5 mM ou 25 mM. Foi avaliada a expressão de hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 e PKA. Foi avaliada a expressão de hSGLT1+GFP e SGLT2 na membrana, com ou sem H-89, Manose, Sucrose e Filipina. Foi avaliada a velocidade de recuperação do pH intracelular (dpHi/dt), onde a solução de NH4Cl foi substituída por uma solução de glicose 5 ou 25 mM ou ambas as soluções na vigência de H-89 ou S3226. Esses dados indicam que o aumento do AMPc pela glicose altera a expressão e atividade dos SGLTs e NHEs. Nossos experimentos utilizando a transfecção do SGLT1 demonstraram que as células regulam a distribuição de SGLT1 e 2 na membrana, frente ao aumento extracelular desse substrato e que as vias ativadas pela glicose afetam a capacidade de recuperação do pH intracelular (pHi), através do NHE3. This study evaluated the effect of glucose on the PKA activity and its interaction with SGLT1 and the Na+/H+ exchanger (NHE1 and NHE3). The HEK-293 cells were transfected with hSGLT1 wild type (WT) or mutant (S418H) and treated 20 days with DMEM containing glucose 5 mM or 25 mM. The hSGLT1, hSGLT1+GFP, NHE1, NHE3 and PKA expression was analyzed. The surface hSGLT1+GFP and SGLT2 expression with or without H-89, Manose, Sucrose and Filipina was evaluated. The pHi recovery rate (dpHi/dt) was analyzed replacing the NH4Cl solution to glucose 5 or 25 mM solution or both with H-89 or S3226. These data indicate that the glucose increases the cAMP concentration and alters the expression and activity of SGLTs and NHEs. Our experiments using SGLT1 transfection demonstrated that, in the treatment with high glucose concentration, HEK-293 cells regulate the SGLT1 and 2 cellular distribution and that the pathways activated by glucose impair the pHi recovery rate, through the NHE3.

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Nascimento, Paula Hespanholo 1984. "Padrão de distribuição e localização de expressão das proteínas VILIP-1, receptor sensor de cálcio e receptor metabotrópico do glutamato 1 em tecidos de pacientes com epilepsia do lobo temporal." [s.n.], 2012. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/310395.

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Orientador: Lília Freira Rodrigues de Souza Li Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Made available in DSpace on 2018-08-20T19:22:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_PaulaHespanholo_M.pdf: 1475049 bytes, checksum: f1ec759ca189c1e3404667fb1ce01abc (MD5) Previous issue date: 2012 Resumo: A esclerose hipocampal está associada à epilepsia de lobo temporal medial (ELT) e causa expressão alterada de receptores tais como o Receptor Metabotrópico de Glutamato (mGluR1). Contudo, ainda há controvérsias se sua expressão está aumentada ou diminuída em ELT. O Receptor Sensor de Cálcio (CASR), outro receptor da mesma família do mGluR1, é expresso em hipocampo, mas seu papel no cérebro ainda é desconhecido. VILIP-1 é uma proteína sensora de cálcio neuronal (NCS) expressa predominantemente no cérebro e em humanos e sua expressão foi mapeada por imunoistoquímica na subpopulação de neurônios piramidais em CA1 e CA4 de hipocampo. Sugere-se também que a ativação de mGluR possa regular a expressão de VILIP-1 durante a plasticidade hipocampal. No entanto, não há estudos associando VILIP-1 e esclerose hipocampal. Nós hipotetizamos que além do mGluR1, o CASR e o VILIP-1 estão associados a esclerose hipocampal em ELT. O objetivo deste trabalho foi analisar o padrão de expressão de VILIP-1, CASR e mGluR1, em hipocampo de pacientes com ELT submetidos a amigdalohipocampectomia. Nossos resultados demonstraram a presença de EH nos tecidos hipocampais de pacientes com ELT com redução no número de neurônios em CA1 e presença de intensa gliose. Pela análise da expressão dos transcritos VILIP-1, CASR e mGluR1 em hipocampo total utilizando PCR em tempo real não encontramos diferença na expressão dos RNAs mensageiros dos pacientes quando comparado com os controles. Entretanto, quando comparamos a expressão protéica em hipocampo de pacientes e controles, utilizando o método de imunoistoquímica, encontramos não somente redução significativa no número de neurônios presentes em CA1 de pacientes, mas também redução importante nos neurônios positivamente marcados para VILIP-1, CASR e mGluR1. Estes achados sugerem que não apenas mGluR1, mas também CASR e VILIP-1, estão associados à EH em pacientes com ELT Abstract: Hippocampal sclerosis (HS) is associated to temporal lobe epilepsy (TLE) and cause altered expression of neurotransmitter receptors such as metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1). However, whether its expression level is increased or decreased in temporal lobe epilepsy is still controversial. Calcium-sensing receptor (CASR), another receptor from the same family of mGluR1, is expressed in hippocampus, but its role in brain is unknown. VILIP-1, a neuronal calcium sensing protein (NCS) is expressed predominantly in brain and in humans its expression was identified by immunohistochemistry in subpopulations of pyramidal neurons in CA1 and CA4 in hippocampus. Activation of mGluR1 is suggested that may regulates VILIP-1 expression during hippocampal plasticity. However, there are no studies associating VILIP-1 and hippocampal sclerosis. We hypothesized that not only mGluR1 but also VILIP and CASR is involved in hippocampal sclerosis in TLE patients. The objective of this study was to analyze the pattern of expression of VILIP-1, CASR and mGluR1 in hippocampal tissues from patients with TLE who underwent amygdalohippocampectomy. Our results demonstrated the presence of hippocampal sclerosis in hippocampal tissues in patients with TLE with reduction in the number of neurons in CA1 and gliosis. By the expression analysis of the transcripts of VILIP-1, CASR and mGluR1 in total hippocampus using real time PCR, we did not find differences on mRNAS expression of patients compared with controls. However, when we compared the protein expression from hippocampi from patients with controls, by immunohistochemistry, we not only found an important reduction on neuron cell number in patients, but also an important reduction on positively stained neurons for VILIP-1, CASR and mGluR1, suggesting that not only mGluR1, but also CASR and VILIP1 are associated to HS in patients with TLE Mestrado Saude da Criança e do Adolescente Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

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Abbad, Samantha Vieira. "Caracterização de um Novo Gene da Família F-box Expresso no Pistilo de Nicotiana tabacum L." Universidade de São Paulo, 2012. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-23042013-091421/.

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Abstract:

O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.

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Martins, Pedro de Almeida. "Previsão da localização subcelular de proteínas humanas com base em aprendizagem automática." Master's thesis, 2017. http://hdl.handle.net/10451/27610.

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Abstract:

Tese de mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional (Bioinformática) Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2017 Conhecer a localização subcelular de um dado produto génico (i.e., onde a proteína codificada pelo gene está localizada) é particularmente importante para a anotação funcional das proteínas. Para lidar com o aumento exponencial do número de proteínas descobertas recentemente, foram desenvolvidos métodos computacionais capazes de prever a localização subcelular de proteínas. Uma vez que as proteínas localizadas em determinados compartimentos intracelulares possuem características em comum, os algoritmos de aprendizagem automática podem ser úteis para essa previsão. O objectivo principal deste estudo foi prever a localização subcelular de prote ínas codificadas por 800 genes humanos envolvidos no tráfego da CFTR (regulador de condutância transmembranar de fibrose quística), uma proteína que, quando mutada, causa a doença genética Fibrose Quística.Neste projecto foram analisados os resultados de diferentes algoritmos de classificação disponíveis no MEKA, assim como diferentes métodos de construção de vectores representativos de proteínas. Por um lado, estes vectores foram construídos seguindo duas abordagens baseadas em Gene Ontology (GO): (1) valor 1-0 (presença ou ausência do termo GO) e (2) frequência dos termos GO. Por outro lado, foram consideradas três dimensões distintas dos vectores - 10165-D (todos os termos GO distintos para as proteínas em estudo), 429-D (termos GO essenciais obtidos pelo classificador mEN) e 87-D (termos GO essenciais obtidos pelo classificador mLASSO). Após a extracção dos termos GO e construção dos vectores representativos das proteínas, a localização subcelular das proteínas foi prevista através de três métodos de transformação do problema - Binary Relevance (BR), ClassifierChain (CC) e Label Cardinality (LC) - juntamente com três classificadores single-label - SMO, PART e J48. Estes classificadores foram avaliados através dos métodos 10-fold cross-validation e Leave-one-out cross-validation. Os sete melhores modelos de previsão criados pelo MEKA atingiram uma taxa global de sucesso entre 69,2 e 72,3% (overall actual accuracy) e 76,1 e 80,3% (overall locative accuracy). To know the subcellular localization of a given gene product (i.e., where the protein codified by the gene is located) is particularly helpful to the functional annotation of proteins. In order to better deal with the exponential increase of newly discovered proteins, several computational methods, capable of predicting proteins' subcellular localization, were developed. Since proteins located in particular intracellular compartments share certain common features, Machine Learning (ML) algorithms are useful to predict it. The goal of this study was to predict the subcellular localization of proteins encoded by 800 human genes involved in CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) traffic, a protein that, when mutated, causes Cystic Fibrosis, a genetic disease. On this project we analyzed different classification algorithms available in MEKA, as well as different methods of construction of vectors representative of proteins. On one hand, the vectors were built following two approaches based on Gene Ontology (GO): (1) 1-0 Value (presence or absence of GO terms) and (2) term-frequency (number of occurences of individual go terms). On the other hand, three different dimensions of the vectors were considered: 10165-D (all distinct GO terms), 429-D (essencial GO terms selected by mEN classifier) and 87-D (essencial GO terms selected by mLASSO classifier). After extracting the GO terms and building the vectors, the subcellular localization of proteins was predicted using three methods of problem transformation - Binary Relevance (BR), Classifier Chain (CC) and Label Cardinality (LC) _ along with three single-label classifiers - SMO, PART and J48. These classifiers were evaluated by the methods of the 10-fold cross-validation and Leave-one-out cross-validation. The seven best predictive models created by MEKA achieved an overall success rate between 69.2 and 72.3% (overall actual accuracy) and between 76.1 and 80.3% (overall locative accuracy).

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Gomes, Dulceneia Maria Eugénia. "Expressão e localização subcelular de aquaporinas SIP de Vitis vinifera e Olea europaea." Master's thesis, 2008. http://hdl.handle.net/1822/9547.

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Abstract:

Dissertação de mestrado em Genética Molecular A existência de uma membrana biológica permeável à água foi proposta há mais de 100 anos antes de ser descoberta a sua estrutura básica. Contudo, a velocidade reduzida da difusão simples da água através da bicamada lipídica sugeriu a existência de uma via adicional mediada, um factor proteico cuja expressão pode variar nos diferentes tipos de células. A descoberta das aquaporinas como canais que aumentam 10 a 100 vezes a permeabilidade da membrana à água é relativamente recente e conduziu à atribuição do prémio Nobel da Química a Peter Agre em 2003 "for discoveries concerning channels in cell membranes". As aquaporinas pertencem à família de proteínas MIP (major intrinsic protein) e encontram-se presentes em todas as formas de vida. Nas plantas as aquaporinas são agrupadas em 4 sub-famílias, PIPs (plasma membrane intrinsic proteins), TIPs (tonoplast intrinsic proteins), NIPs (nodulin26-like intrinsic proteins) e SIPs (small and basic intrinsic proteins). Mais recentemente, as SIPs e as aquaporinas de mamíferos AQP11 e AQP12, foram reclassificadas como membros de uma nova super-família de aquaporinas intracelulares; no entanto a maioria dos critérios ainda se baseiam na análise da estrutura primária das proteínas devido à escassez de informação sobre a sua localização e função. O presente trabalho incluiu um estudo in silico de sequências aminoacídicas de proteínas SIP de videira e oliveira identificadas e clonadas no seio do nosso grupo de investigação, bem como de sequências aminoacídicas disponíveis nas bases de dados de SIPs de Arabidopsis e do milho e das aquaporinas de mamífero AQP11 e AQP12. Os resultados obtidos permitiram comparar as proteínas, que partilham algumas semelhanças ao nível de sequências aminoacídicas específicas, e discutir os critérios da sua inclusão numa super-família de aquaporinas intracelulares. Em particular foi investigada a presença do sinal de miristoilação (sp) na extremidade Nterminal das proteínas, cuja função pode estar relacionada com o seu direccionamento e em mecanismos de transdução de sinal. Este péptido sinal foi identificado unicamente nas SIP1 da oliveira (OeSIP1;1 e OeSIP1;2), videira (VvSIP1) e numa SIP1 do milho (ZmSIP1;1). O trabalho experimental contemplou ainda o estudo da localização subcelular das aquaporinas VvSIP1 e OeSIP1;1, bem como a funcionalidade da sequência sinal de N-miristoilação. Com efeito, estudos prévios desenvolvidos no nosso grupo mostraram que a expressão em ovócitos das aquaporinas VvSIP1 e VvSIP1-sp não aumentou a permeabilidade à água, sugerindo que estas não são direccionadas para a membrana plasmática e/ou não são canais de água eficientes. As aquaporinas VvSIP1 e OeSIP1;1, assim como as construções VvSIP1-sp e OeSIP1;1-sp cujo sinal de N-miristoilação foi removido, foram fundidas com a proteína fluorescente GFP e expressas em 2 sistemas heterólogos distintos, ovócitos de Xenopus e levedura. A observação das preparações ao microscópio de fluorescência sugeriu que as aquaporinas VvSIP1 e OeSIP1.1 são direccionadas para a membrana plasmática nos ovócitos de Xenopus e para o retículo endoplasmático no modelo de levedura. Em Saccharomyces cerevisiae não se observaram diferenças significativas nos sinais de fluorescência quando as sequências sp foram removidas das proteínas VvSIP1 e OeSIP1;1, ao contrário dos resultados obtidos no modelo de Xenopus, sugerindo que o péptido sinal não afecta o direccionamento das aquaporinas SIP em leveduras. Os resultados contraditórios obtidos com os 2 modelos de expressão são comparados e discutidos com a informação escassa e recente disponível na literatura relativamente à localização e função das aquaporinas SIP. The existence of a biological membrane permeable to water was proposed more than one hundred years ago, even before the discovery of its basic structure. However, the reduced rate of water transport by simple diffusion through the lipid bilayer suggested the existence of an additional path for water trafficking, mediated by a protein differently expressed in several cell types. The discovery of aquaporins as channels increasing 10 to 100-fold the water membrane permeability is relatively recent and was awarded with the Nobel Price in Chemistry to Peter Agre in 2003 “for discoveries concerning channels in cell membranes”. The aquaporins belong to the MIP (major intrinsic protein) proteins family and are widespread in nature. In plants, aquaporins are grouped in four sub-families, PIPs (plasma membrane intrinsic proteins), TIPs (tonoplast intrinsic proteins), NIPs (nodulin26-like intrinsic proteins) and SIPs (small and basic intrinsic proteins). More recently, both SIPs and the mammal aquaporins AQP11 and AQP12 were reclassified as members of a new super-family of subcellular aquaporins, regardless of the majority of classification criteria still being based on the analysis of the proteins primary structure due to the lack of information about its cellular localization and function. The present study includes an in silico analysis of the aminoacidic sequences of SIPs from grape (Vitis vinifera) and olive tree (Olea europaea), two of which have been identified and cloned in our laboratory (VvSIP1 e OeSIP1;1), as well as the sequences available in the database from Arabidopsis and maize SIPs, and the mammal aquaporins AQP11 and AQP12. Results showed that the proteins share some similarities at the level of the specific aminoacidic sequences and allowed us to discuss the criteria of their inclusion in a new super-family of subcellular aquaporins. Particularly, the presence of a myristoylation signal (sp) in the proteins N-termini extremity, whose function could be related to its membrane targeting and signal transduction, was investigated. This signal peptide was only identified in SIP1 proteins from olive (OeSIP1;1 and OeSIP1;2), grapevine (VvSIP1) and in one SIP1 from maize (ZmSIP1;1). The study of the subcellular location of VvSIP1 and OeSIP1;1 aquaporins cloned in our laboratory, as well as the functionality of the Nmyristoylation signal sequence, is also included in the present thesis. Previous studies developed in our group showed that the expression in oocytes of VvSIP1 and VvSIP1-sp aquaporins did not increase water permeability, suggesting they are not targeted to the plasma membrane and/or they are not efficient water channels. VvSIP1 and OeSIP1;1 aquaporins, as well as the VvSIP1-sp and OeSIP1;1-sp constructions, which N-myristoylation signal had been removed, were fused with the fluorescent protein GFP and expressed in two distinct heterologous systems, Xenopus oocytes and yeast. Observation under a fluorescence microscope showed that VvSIP1 and OeSIP1.1 aquaporins are targeted to the plasma membrane in the Xenopus oocytes and to the endoplasmic reticulum in the yeast. Contrarily to the results obtained in the Xenopus model, in Saccharomyces cerevisiae no significant differences in the fluorescent signals were observed when the sp sequences were removed from the VvSIP1 and OeSIP1;1 proteins, suggesting that the signal peptide does not affect the targeting of SIP aquaporins in yeast. The differing results obtained with the two expression models are compared and discussed with the recent and scarce information available in the literature about the localization and function of the SIP aquaporins. Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - projecto POCI/AGR/56378/2004

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Coelho, André da Soledade Carruna. "Characterization of the effect of cartilage acidic protein (CRTAC) on human monocytes THP-1 cells." Master's thesis, 2016. http://hdl.handle.net/10400.1/9871.

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Abstract:

Dissertação de mestrado, Biotecnologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016 Cartilage acidic protein 1 (CRTAC1) is an extracellular matrix protein of chondrogenic tissue associated with several diseases, such as multiple sclerosis. crtac duplicates emerged in teleost fish as a result of the teleost specific whole genome duplication. The poorly characterized function of CRTAC’s was the starting point of the present study. RT-PCR and Western blot analysis demonstrated that the HEK 293 cell line expresses human (h) CRTAC1. In silico analysis of the protein using bioinformatic tools indicated that hCRTAC1 and sea bass (Dicentrarchus labrax, dl) CRTAC1 and CRTAC2 proteins is most likely located in mitochondria, lysosomes, golgi apparatus and endoplasmic reticulum. Western blot analysis of subcellular fractions of HEK 293 cells indicated that hCRTAC1 is present in the nucleus, endoplasmatic reticulum and mitochondria. Trypan blue exclusion assay with THP-1 cells, indicated that dlCRTAC1 has an inhibitory effect on cell proliferation, did not promote cell death and increased cell adherence with an IC50 of 78.45ng/mL and dlCRTAC2 at 95.50ng/mL after 72 hours of cells incubation. In Hanging drop assays, dlCRTAC1 (30ng/mL) increased the size of THP-1 spheroids and the circularity of the spheroids increased when incubated with dlCRTAC1 (3 and 30ng/mL) and hCRTAC1 (3 and 30ng/mL), for 72 hours. Wound scratch assays with HEK 293 cells, indicated that dlCRTAC1 (0.03ng/mL), dlCRTAC2 (300ng/mL) and hCRTAC1 (0.03 and 0.3ng/mL) inhibited wound healing and that dlCRTAC1 (30ng/mL) and hCRTAC1 (300ng/mL) promoted wound healing, after 18 hours of incubation. In motility assays with macrophage, dlCRTAC1 (300ng/mL) increased cell motility and dlCRTAC2 (30ng/mL) inhibited macrophage motility. These results suggest that CRTAC proteins inhibit THP-1 cells proliferation but promote their adhesion and aggregation and dlCRTAC1 increased and dlCRTAC2 inhibited macrophage motility. Wound healing assays with HEK293 cells revealed that low concentrations of CRTAC inhibited wound healing and higher concentrations promoted wound healing. A proteína acídica da cartilagem 1 (CRTAC1), também conhecida por proteína expressa por condrócitos 68 kDa (CEP-68), é uma proteína da matriz extracelular da camada condrogénica da cartilagem, utilizada como marcador in vitro para diferenciação entre condrócitos e osteoblastos. Esta proteína encontra-se presente noutros locais do corpo humano, existindo dois transcritos variantes: CRTAC1-A (presente na cartilagem e pulmões) e CRTAC1-B (presente no cérebro, olho, cristalino do olho e na glândula pineal). Esta proteína tem um peso molecular de 68 kDa e é constituída por 661 aminoácidos, incluindo um péptido de sinal de 27 aminoácidos, localizado na zona N-terminal. É constituída por vários domínios, dos quais: um domínio integrina N-terminal, que contém quatro motivos FG-GAP; seguido de um domínio ASPIC/UnbV; e um domínio EGF (do inglês, epidermal growth factor) C-terminal. Encontra-se ainda ao longo da sua sequência proteica um motivo RDG. Os motivos FG-GAP (FG, motivo conservado fenilalanina-glicina; GAP, motivo conservado glicina-alanina-prolina) são encontrados na zona N-terminal de α e β integrinas, uma família de proteínas que medeia a interação célula-célula e célula- matriz extracelular. Os motivos tripeptídicos RGD (motivo conservado arginina-glicina-ácido aspartático), em comum com os motivos FG-GAP, estão presentes em muitas integrinas e ligantes de integrina. O domínio ASPIC/UnbV encontra-se também associado a interações célula a célula e célula a matriz extracelular. A presença dos motivos FG-GAP 3 e 4, tal como o domínio EGF e a natureza acídica da proteína, são responsáveis pela sua capacidade de se ligar a catiões divalentes como o cálcio. A CRTAC1 foi inicialmente patenteada como biomarcador de fratura óssea e lesão da cartilagem e, numa segunda patente, como biomarcador e alvo terapêutico de várias doenças, tais como: problemas cardiovasculares, hematológicos, gastrointestinal, urológicos, doenças respiratórias, problemas inflamatórios, distúrbios neurológicos e vários tipos de cancro. A CRTAC1-B é um antagonista endógeno dos receptores Nogo-1, cuja neutralização está associada à regeneração axonal após a lesão, e pacientes que sofrem de esclerose múltipla (uma desordem desmielinizante auto-imune do sistema nervoso central, causada pelo acúmulo de moncócitos nesses locais) revelam uma presença incomum desta proteína no líquido cefalorraquidiano. Contudo, ainda não é conhecida a função destas proteínas nem o seu papel no desenvolvimento destas patologias. A análise filogenética, com proteínas de diversas espécies, revelou que estas proteínas são ancestrais, uma vez que se encontram presentes deste as cianobactérias até aos vertebrados. No ramo dos vertebrados, surge um cluster correspondente à CRTAC1 (presente em teleósteos e tetrápodes) e outro cluster (presente em teleósteos) que corresponde a uma proteína ortologa, denominada de CRTAC2, que difere pela ausência do domínio EGF C-terminal. A existência de duas formas de CRTAC em teleósteos é consistente com a hipótese de que o genoma dos peixes teleósteos foi submetido a um evento específico de duplicação total do genoma. As características altamente conservadas e sua manutenção durante os processos evolutivos sugeres que estas proteínas possuem funções vitais que são comuns pelos vários em filos. A proteína CRTAC1 dos teleósteos possui alta similaridade na sequência de aminoácidos à semelhança das regiões N-terminal e média da CRTAC1 humana (hCRTAC1), indicando que estas podem ter funções semelhantes. A CRTAC1 e CRTAC2 possuem uma distribuição tecidular generalizada de transcritos e proteínas, sendo encontrados no sistema nervoso (glândula pituitária, cérebro e espinal medula), gónadas, fígado, rim, coração, músculo e estruturas calcificadas. Estudos de hibridação in situ em pituitárias de S. auratus, demonstram uma grande quantidade de RNAm de CRTAC2 em pequenas células de forma irregular com grandes núcleos adjacentes ao tecido neurohipofisários, entre os lóbulos anterior e posterior. A libertação de CRTAC2 a partir da glândula pituitária de S. auratus pode sugerir que esta proteína, para além de ser uma proteína de matriz extracelular, pode também ter também funções endócrinas. A estrutura ancestral e conservada das proteínas CRTAC indica que estas devem ter uma função importante, que ainda não foi caracterizada, sendo este o ponto de partida deste estudo. A análise por RT-PCR e Western blot demonstram que a linha celular HEK 293 expressa a proteína hCRTAC1. A localização subcelular in sílico da proteína hCRTAC1 e das proteínas de robalo (Dicentrarchus labrax, dl) CRTAC1 e CRTAC2 indicam que as CRTACs podem estar presentes nas mitocôndrias, lisossomas, aparelho de Golgi e no retículo endoplasmático. A análise por Western blot de fracções subcelulares de células HEK 293, sugere fortemente que a hCRTAC1 poderá estar presente no núcleo, retículo endoplasmático e nas mitocôndrias. O teste de exclusão de Trypan Blue com células THP-1, indica que a dlCRTAC1 tem um efeito inibidor da multiplicação celular (IC50) na concentração de 78.45ng/mL e a dlCRTAC2 a 95.50ng/mL, no entanto, não foi observada morte celular, mas sim o aumento da aderência celular. O ensaio de MTS indica que a dlCRTAC1 inibe a proliferação celular. Nos ensaios de hanging drop, a dlCRTAC1 aumenta o tamanho dos agregados de células THP-1 e a circularidade dos agregados aumenta quando incubadas com a dlCRTAC1 e a hCRTAC1. Os ensaios de wound scratch com células HEK 293, indicam que a dlCRTAC2 inibe a capacidade de cicatrização enquanto que a dlCRTAC1 e a hCRTAC1 promovem esta capacidade. No ensaio de motilidade com macrófagos, a dlCRTAC1 aumenta a motilidade celular e a dlCRTAC2 inibe a motilidade destas células. Estes resultados sugerem que as CRTACs inibem a proliferação de células THP-1, mas promovem a sua capacidades de adesão e agregação; inibem (em baixas concentrações) e promovem (em concentrações mais elevadas) a capacidade de cicatrização de culturas de células HEK 293 em monocamada; e que a dlCRTAC1 promove a motilidade dos macrófagos enquanto que a dlCRTAC2 inibe a motilidade dos mesmos.

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Ribeiro, Diana Margarida da Costa. "Optimization of transient expression procedures in Catharanthus roseus and Arabidopsis thaliana for subcellular localization studies." Master's thesis, 2010. http://hdl.handle.net/1822/15963.

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Abstract:

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-Empreendedorismo em Plantas Aromáticas e Medicinais Nowadays, the availability of much gene sequence information demands the development of tools for their fast characterization at the protein level, where function actually resides. Here, the interest in the characterization of certain of the known Arabidopsis class III peroxidase (Prx) genes, as well as the interest in the characterization of candidate genes implicated in the metabolism of the anticancer terpenoid indole alkaloids of Catharanthus roseus, has led to the need of establishing transient expression procedures for these two species. Therefore, the main goal of this work was the development and optimization of simple/fast, efficient and reproducible transient expression protocols for subsequent subcellular localization studies of proteins coded by Prx genes, and for characterization of candidate genes provided from omic approaches, namely implicated in the regulation, biosynthesis or transport of the valuable alkaloids from C. roseus. A complementary goal was to investigate the subcellular localization and sorting determinants of Prxs, namely the vacuolar sorting capacity of a C-terminal amino acid sequence extension (CTE) present in vacuolar Prxs, using as examples the well characterized and most abundant vacuolar Prx from C. roseus leaves, CrPrx1, and the most abundant Prx in the leaves of Arabidopsis, AtPrx34. For this, already available CrPrx1-GFP fusions and newly generated AtPrx34-GFP fusions were used in the transient expression assays. The successful establishment of protocols for PEG-mediated transformation of both Arabidopsis and C. roseus mesophyll protoplasts was achieved and validated as excellent transient expression systems. Transient expression by Agrobacterium infiltration of Arabidopsis and C. roseus leaves was also attempted, but it was only successful with in vitro C. roseus plants. However, promising insights were made into the development of this technique. Expression of CrPrx1-GFP fusions in Arabidopsis and C. roseus protoplasts using the established protocols confirmed the vacuolar localization of this Prx. Additionally the CrPrx1 signal peptide (SP) and CTE were confirmed as sorting determinants that target GFP to the ER and vacuole, respectively. The characterization of the subcellular localization and sorting determinants of AtPrx34 was not elucidated, possibly due to malfunctioning of the vector plasmid used for protoplast infiltration. In fact, upon agroinfiltration of in vitro C. roseus plants, it was possible to observe sorting to the ER of an SPAtPrx34-GFP fusion coded by a construct harboured in a binary vector plasmid, different from the one used for protoplast transformation. Thus, a resolution of the subcellular sorting of AtPrx34 should be possible in the near future. The transient expression assays described in the present study were highly reproducible, resulted in very satisfactory transformation efficiencies, and constitute a reliable and inexpensive methods that can be performed in most labs, and that are suitable test-systems to characterize genes of unknown function. This is also the the first time a transient expression system for C. roseus protoplasts is reported, using a PEGmediated transformation protocol. Actualmente, a disponibilidade de inúmeras sequências genómicas exige o desenvolvimento de ferramentas para uma rápida caracterização ao nível protéico, onde de facto reside a função. Neste trabalho a caracterização de determinados genes de Peroxidases de Classe III (Prx) de Arabidopsis, assim como o interesse na caracterização de possíveis genes envolvidos no metabolismo de alcalóides indólicos terpenóides anticancerígenos de Catharanthus roseus, impulsionou a necessidade de estabelecer procedimentos de expressão transiente para estas duas espécies. Consequentemente, o objectivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento e optimização de protocolos de expressão transiente simples/rápidos, eficientes e reproduzíveis para estudos de localização subcelular de proteínas codificados por genes Prx, e para a caracterização de possíveis genes obtidos de abordagens omicas, nomeadamente implicados na regulação, biossíntese ou transporte de alcalóides relevantes de C. roseus. Como objectivo complementar investigar a localização subcelular e sinais de direccionamento de Prxs, designadamente a capacidade de direccionamento vacuolar da extensão C-terminal aminoacídica (CTE) presente em Prxs vacuolares, utilizando como exemplos a Prx vacuolar mais abundante e estudada presente nas folhas de C. roseus, Crprx1, e a Prx mais abundante nas folhas de Arabidopsis, AtPrx34. Para tal, fusões CrPr1-GFP já disponíveis e fusões AtPrx34-GFP recém geradas foram utilizadas em procedimentos de expressão transiente. O estabelecimento com sucesso de protocolos de transformação mediada por PEG para protoplastos de mesófilo de Arabidopsis e C. roseus foi alcançado e validado como um excelente sistema de transformação transiente. Transformação transiente por infiltração com Agrobacterium de folhas de Arabidopsis e C. roseus foi abordado, mas apenas foram obtidos resultados positivos com plantas de C. roseus in vitro. Todavia progressos promissores foram realizados para o desenvolvimento desta técnica. Expressão de fusões CrPrx1-GFP em protoplastos de Arabidopsis e C. roseus utilizando os protocolos estabelecidos confirmaram a localização vacuolar desta Prx. Adicionalmente o péptido sinal (SP) e a extensão C-terminal (CTE) de CrPrx1 foram confirmados com sinais determinantes que direccionam a GFP para o RE e o vacúolo, respectivamente. A caracterização da localização subcelular e sinais de direccionamento de AtPrx34 não foram elucidados, possivelmente devido a uma irregularidade funcional do vector plasmídeal utilizado na transformação de protoplastos. De facto, após agroinfiltraçao de plantas C. roseus in vitro, foi possível observar o direccionamento para o RE da fusão SPAtPrx34-GFP codificada por um constructo incluído em vector binário, diferente do vector utilizado na transformação de protoplastos. Portanto, a caracterização do direccionamento subcelular da AtPrx34 poderá ser possível num futuro próximo. Os procedimentos de expressão transiente descritos no presente estudo manifestaram-se bastante reproduzíveis, resultando em níveis satisfatórios de eficiência de transformação, e constituem métodos fidedignos e de baixo custo que podem ser realizados na maioria dos laboratórios, e são sistemas-teste convenientes para caracterizar genes de função desconhecida. Foi também reportado pela primeira vez um sistema de transformação transiente em protoplastos de C. roseus, utilizando um protocolo de transformação mediada por PEG. Palavras-chave: Catharanthus roseus, Arabidopsis, transformação mediada por PEG, Agroinfiltração, fusões-sGFP, localização subcelular, via secretora, sinais de direccionamento, vacúolo, microscopia confocal.

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Dissertations / Theses on the topic 'Localização Subcelular de proteínas'

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