Dissertations / Theses on the topic 'Maladie lysosomale'

Les lysosomes sont des organites intracellulaires contenant de nombreuses enzymes qui permettent la dégradation de macromolécules. Longtemps considérés seulement pour leur rôle dans la digestion intracellulaire, ils sont maintenant reconnus comme intervenant dans de nombreux autres processus biologiques tels que la mort cellulaire. En effet, des travaux récents ont mis en évidence le rôle de certaines protéases lysosomales dans la mort cellulaire de type apoptotique. Dans cette étude, nous nous sommes intéressés à l'implication de protéases lysosomales dans l'induction de la mort cellulaire en utilisant des cellules de patients atteints soit d'I-cell disease, un défaut d'adressage des hydrolases néosynthétisées aux lysosomes soit de céroi͏̈de-lipofuscinoses neuronales (déficit en une enzyme lysosomale particulière). Nos travaux semblent indiquer que la Tripeptidyl peptidase 1 (TPP1) et la Palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1) contribueraient à la signalisation apoptotique du TNFa<br>Lysosomes are cellular organelles which contain numerous enzymes for degradation of macromolecules. For many years, they have been considered as suicide bags that would release unspecific digestive enzymes after uncontrolled cell damage. However, some lysosomal proteases have been recently suggested to act as cell death mediators. This work aimed at analyzing the role of lysosomal proteases in apoptosis. We investigated the implication of lysosomal proteases in cell death by using fibroblasts isolated from patients with either I-cell disease, a lysosomal targeting defect, or neuronal ceroid lipofuscinoses (due to a single lysosomal defect). We have shown that these fibroblasts are partially resistant to TNF-induced cell death as compared to control cells. Our results indicate that Tripeptidyl peptidase 1 (TPP1) and Palmitoyl-protein thioesterase 1 (PPT1), two lysosomal hydrolases, may contribute to TNF-induced apoptosis

La thérapie chaperon représente une approche thérapeutique stratégique et innovante, en particulier dans le traitement des maladies lysosomales. Ces maladies génétiques rares ont une gravité variable, qui peut aller de la létalité avant la naissance jusqu'à la nécessité d‟une prise en charge permanente ; elles apparaissent à tous les stades de la vie. Des mimes du substrat appelé iminosucres, vont agir en allant au coeur du site actif de l'enzyme, stabiliser l'enzyme mutée qui est instable mais non inactive. Paradoxalement, la plupart des chaperons pharmacologiques sont des inhibiteurs de l'enzyme visée mais leur administration à faible concentration leur permet de réaliser leur mission de sauvetage de l'enzyme mutée. Dans cette optique, des recherches effectuées au sein de notre laboratoire ont fait état de la synthèse d'iminosucres, tels que les α-1-C-alkyl iminoxylitols qui sont de très bons inhibiteurs de la β-glucocérébrosidase, l'enzyme défaillante dans la maladie de Gaucher, mais aussi qui doublent l'activité enzymatique résiduelle. Une nouvelle voie de synthèse plus efficace a été réalisée afin d'obtenir plus efficacement ce type d'iminosucres et d'autres dérivés. Ces travaux ont également été l'occasion de développer des iminoxylitols structurellement simplifiés qui agissent comme chaperons pharmacologiques toujours pour le traitement de la maladie de Gaucher. Une partie de ces travaux a aussi été consacrée à la recherche d‟inhibiteurs de la β-galactocérébrosidase, l'enzyme impliquée dans la maladie de Krabbé, et qui pourront agir comme chaperons pharmacologiques. Différentes évaluations pharmacologiques ont été réalisées, notamment des tests d'inhibition et la détermination des effets chaperons.

Les glycosidases sont des enzymes impliquées dans de nombreux processus biologiques. Entre autres, elles sont responsables de la dégradation des déchets polysaccharidiques de nos cellules. Lorsqu'une modification génétique touche un gène qui code pour une de ces enzymes, des pathologies graves regroupées sous l'appellation de " maladies lysosomales " peuvent être déclenchées. L'objectif de ce projet a été de proposer une méthode de synthèse efficace de molécules potentiellement actives spécifiquement sur l'une ou l'autre de ces maladies. Les molécules ciblées sont des inhibiteurs de glycosidases de la famille des aminocyclitols, utilisés dans une stratégie thérapeutique émergente " par molécules chaperonnes ". La méthode de synthèse développée s'appuie sur une étape enzymatique clé utilisant les aldolases comme catalyseurs et répondant aux contraintes environnementales actuelles de la chimie verte. Nous avons atteint nos objectifs grâce à l'utilisation de trois aldolases différentes, produites et purifiées pour la première fois au sein de notre laboratoire. Il s'agit de la fuculose-1-phosphate aldolase F1PA, de la rhamnulose-1-phosphate aldolase R1PA et de la nouvellement découverte fructose-6-phosphate aldolase FSA. La formation d'une quarantaine de nitrocyclitols, de stéréochimies définies, précurseurs des aminocyclitols correspondant, a ainsi été réalisée avec de très bons rendements de synthèse.

Nous avons identifié, un ligand de Wnt, Wnt5a, comme faisant partie intégrante du complexe mTORC1, qui régule la fonction lysosomal et favorise le trafic intracellulaire du cholestérol. En diminuant l’activité de mTORC1 et en activant l’axe autophagie-lysosome, Wnt5a adapte les concentration du cholestérol intracellualire aux besoins de la cellule. Wnt5a favorise l’export du cholestérol depuis les endosomal/lysosomal (LELs) vers le réticulum endoplasmique (RE), limite l’accumulation intracellulaire du cholestérol, et protège contre l’athérosclérose. D’un point de vue mécanistique, Wnt5a se lie aux membranes riches en cholestérol et interagit spécifiquement avec la protéine membranaire Niemann-Pick C1 (NPC1), la protéine soluble Niemann-Pick C2 (NPC2), deux protéines lysosomales qui régulent l’export du cholestérol à partir des LELs. En conséquence, l’absence de Wnt5a inhibe la fonction lysosomale et l’autophagie, ainsi que la sortie du cholesterol hors des LELs. Ceci resulte en l’accumulation de larges corps d’inclusion intracellulaires, de larges LELs riches en cholestérol, d’une diminution du cholestérol au niveau du RE<br>We identified the Wnt ligand, Wnt5a, as a member of the nutrient/energy/stress sensor, mTORC1 scaffolding complex, which drives lysosomal function and promotes cholesterol trafficking. By decreasing mTORC1 activity and by activating the autophagy-lysosomal axis, Wnt5a senses changes in dietary cholesterol supply, promotes endosomal/lysosomal (LELs) cholesterol egress to the endoplasmic reticulum (ER), and protects against atherosclerosis. Moreover, Wnt5a binds cholesterol-rich membranes and specifically interacts with two lysosomal proteins Niemann–Pick C1 and Niemann–Pick C2 that regulate cholesterol export from LELs. Consequently, absence of Wnt5a decoupled mTORC1 from variations in LELs sterol levels, and this resulted in accumulation of large intracellular inclusion bodies, large LELs and low ER cholesterol

Le développement de thérapies ciblées est un enjeu majeur en santé et l’essor des nanovecteurs permet de répondre à ces besoins cliniques. Le premier axe de cette thèse est consacré à l’étude du potentiel thérapeutique de nanoparticules multifonctionnelles pour l’imagerie médicale, la thérapie photothermique et la délivrance de drogue pour le traitement du cancer. Le deuxième axe de recherche s’oriente vers le ciblage thérapeutique actif. L’entreprise NanoMedSyn a pour objectif de développer un ciblage actif du récepteur du mannose 6-phosphate, permettant un meilleur adressage des médicaments et des traitements plus efficaces. Ce type de ciblage peut avoir des retombées multiples pour la thérapie anticancéreuse mais également pour la thérapie des maladies lysosomales qui sont des maladies génétiques rares. NanoMedSyn développe des dérivés synthétiques de glycovecteurs innovants, appelés AMFA, qu’elle exploite en exclusivité. Les AMFA ont une bonne affinité pour le récepteur du mannose 6-phosphate et ont été greffés sur des nanoparticules multifonctionnelles dans le but d’améliorer l’adressage et la thérapie photodynamique biphotonique d’un cancer pédiatrique : le rhabdomyosarcome ; et sur des enzymes lysosomales pour le traitement de maladies lysosomales telle que la maladie de Pompe<br>The development of targeted therapies is a major health issue and the rise of nanovectors makes it possible to meet these clinical needs. The first approach of this thesis is dedicated to the study of the therapeutic potential of multifunctional nanoparticles for medical imaging, photothermal therapy and drug delivery in cancer treatment. The second line of research focuses on active therapeutic targeting. The NanoMedSyn company aims to develop an active targeting of the mannose 6-phosphate receptor, allowing a better addressing of drugs and more effective treatments. This type of targeting may have multiple benefits for cancer therapy but also for the treatment of the lysosomal diseases which are rare genetic diseases. NanoMedSyn develops innovative synthetic derivatives of glycovectors, called AMFA, which it exploits exclusively. AMFA have a good affinity for the mannose 6-phosphate receptor and have been grafted on multifunctional nanoparticles in order to improve addressing and two-photon photodynamic therapy of a pediatric cancer: the rhabdomyosarcoma; and on lysosomal enzymes for the lysosomal diseases treatment such as for Pompe disease

Mucopolysaccharidosis type IIIB (MPSIIIB) is a lysosomal storage disease (LSD) characterized by accumulation of heparan sulfate oligosaccharides (HSO), which results in progressive mental retardation, neurodegeneration and premature death in children. The underlying mechanisms are poorly understood. Coming to a better understanding of the pathophysiology of MPSIIIB has become a necessity to assess the efficacy of gene therapy treatment regarding loss of neuronal plasticity, and to define the best conditions for treatment. To address the link between HSO accumulation and downstream pathological events, new cell models of MPSIIIB were created. First, induced pluripotent stem cells (iPSc) were generated from fibroblasts of affected children, followed by differentiation of patient-derived iPSc into a neuronal progeny. Second, a HeLa cell model was created in which expression of shRNAs directed against a-N-acetylglucosaminidase (NAGLU), the deficient enzyme in MPSIIIB, is induced by tetracycline. Success in the isolation of these different models was pointed by the presence of cardinal features of MPSIIIB cell pathology. Studies in these models showed that: I) HSO excreted in the extracellular matrix modifies cell perception of environmental cues, affecting downstream signalling pathways with consequences on the Golgi morphology. II) Accumulation of intracellular storage vesicles, a hallmark of LSDs is due to overexpression of the cis-Golgi protein GM130 and subsequent Golgi alterations. It is likely that these vesicles are abnormal lysosomes formed in the cis- and medial-Golgi which are misrouted at an early step of lysosome biogenesis, giving rise to a dead-end compartment. III) Other cell functions controlled by GM130 are affected, including centrosome morphology and microtubule nucleation. These data point to possible consequences on cell polarization, cell migration and neuritogenesis.

Les maladies lysosomales forment un groupe hétérogène d’une cinquantaine d’affections qualifiées de « rares ». Actuellement, seulement 9 maladies lysosomales disposent d’un traitement spécifique, principalement par enzymothérapie substitutive, mais les effets bénéfiques sont souvent limités. Le manque de ciblage pour le Récepteur du Mannose 6-Phosphate (RM6P), responsable de l’internalisation dans les lysosomes, expliquerait en partie cette efficacité modérée des enzymes thérapeutiques. Dans ce contexte, nous avons développé une approche de ciblage innovante basée sur des Analogues synthétiques du Mannose 6-Phosphate fonctionnalisés sur l’Aglycone (appelés AMFA) afin de répondre aux besoins non satisfaits par les traitements actuels.Les travaux de cette thèse portent principalement sur la maladie de Pompe, myopathie causée par la déficience d’une enzyme lysosomale, l’Alpha Glucosidase Acide (GAA), responsable de la conversion du glycogène en glucose. Afin d’améliorer l’adressage de l’enzyme thérapeutique aux lysosomes via le RM6P, nous avons fonctionnalisé la GAA recombinante humaine (rhGAA) avec les AMFA. Nos études sur la forme adulte de la maladie ont démontré une augmentation significative de l’internalisation et pour la première fois, chez des souris âgées modèles de la maladie, une restauration de la santé musculaire et une amélioration significative de la fonction motrice ont été observées (article 1). Nous nous sommes ensuite intéressés aux propriétés de la rhGAA-AMFA. Nous avons démontré que l’efficacité de la rhGAA-AMFA n’était pas uniquement due à une meilleure internalisation mais également à une meilleure maturation intracellulaire de l’enzyme (article 2). En effet, nos résultats ont démontré que chez les patients atteints de la maladie de Pompe, il existe une surexpression des phosphatases acides ACP2 et ACP5. Ces phosphatases peuvent détruire le signal mannose 6-phosphate (M6P) naturellement présent sur l’enzyme, ce qui interrompt sa maturation en forme active. L’AMFA, contrairement au M6P, est insensible à cette dégradation et assure donc la stabilité de l’adressage de l’enzyme in vitro, mais également in vivo.L’ensemble de ces résultats suggèrent que le greffage des AMFA sur des enzymes recombinantes représente une nouvelle solution thérapeutique pour le traitement de la maladie de Pompe et potentiellement pour le traitement d’autres maladies lysosomales<br>Lysosomal diseases form a heterogeneous group of about fifty rare diseases. At present, only 9 lysosomal diseases have a specific treatment, mainly by enzyme replacement therapy but the beneficial effects appear often limited. The lack of targeting for the Mannose 6-Phosphate Receptor (M6PR), responsible for internalization into the lysosomes, would partly explain this moderate efficiency of the therapeutic enzymes. In this context, we have developed an innovative targeting approach based on Mannose 6-Phosphate Synthetic Analogues Functionalized at the Aglycone position (called AMFAs) to address the unmet needs of current treatments.The work of this thesis focuses mainly on Pompe disease which is a myopathy caused by the deficiency of a lysosomal enzyme, Acid Alpha Glucosidase (GAA), responsible for the conversion of glycogen into glucose. In order to improve the targeting of the therapeutic enzyme to lysosomes via the M6PR, we have functionalized the human recombinant GAA (rhGAA) with the AMFAs. Our studies on aged mice model of the adult form of the disease have demonstrated a significant increase of the enzyme internalization and for the first time, the restoration of muscle health and the significant improvement in motor function (article 1). We then investigated the properties of rhGAA-AMFA. We have proved that the effectiveness of rhGAA-AMFA is not only due to a better cell uptake but also to a more complete intracellular processing of the enzyme (article 2). Indeed, our results demonstrated that in myoblasts of patients affected by Pompe disease there is an overexpression of ACP2 and ACP5 acid phosphatases. These phosphatases can destroy the mannose 6-phosphate signal (M6P) naturally present on the enzyme, therefore possibly interrupting its processing into the active form. AMFA, unlike M6P, is insensitive to this degradation and thus ensures the stability of enzyme addressing in vitro, but also in vivo.All together, these results suggest that the grafting of the AMFAs on recombinant enzymes represents a new therapeutic solution for the treatment of Pompe disease and potentially for other lysosomal diseases

Les lysosomes contiennent environ soixante hydrolases différentes, qui peuvent dégrader une grande variété de macromolécules. L’activité de ces enzymes est dépendante du pH, maintenu dans les lysosomes entre 4.5 et 5.0 par une pompe à protons : la v-ATPase. Les produits de dégradation sont recyclés dans le cytoplasme par des transporteurs actifs secondaires de la membrane des lysosomes.Les maladies de surcharges lysosomales sont causées par des mutations de gènes codant pour des protéines lysosomales, souvent des enzymes. Elles sont caractérisées par un engorgement des lysosomes avec des agrégats ou des cristaux. Les symptômes associés à ces maladies sont variés, mais la moitié d’entre elles induisent des défauts neurologiques. L’étude de ces maladies a permis d’élucider la fonction de nombreuses enzymes, mais la connaissance des transporteurs lysosomaux reste parcellaire. Peu de ces transporteurs sont ainsi caractérisés au niveau moléculaire.Je me suis intéressé à deux gènes dont la mutation provoque une maladie de surcharge particulière : CLN3 et CLN7. Leur mutation provoque des céroïdes lipofuscinoses neuronales, des maladies de surcharge lysosomales caractérisées par une neurodégénérescence précoce et par l’accumulation dans les lysosomes d’un pigment autofluorescent, la lipofuscine. La mutation de 14 gènes différents cause une céroïde lipofuscinose neuronale. J’ai étudié CLN3 et CLN7 car ils codaient pour des protéines membranaires du lysosome, qui pourraient donc être des transporteurs.Sur CLN7, j’ai effectué des tests de transport en utilisant les acides aminés comme substrats potentiels, sans résultats probants. Concernant CLN3, le contenu métabolique de lysosomes a été étudié par spectrométrie de masse dans des souris WT ou de souris où le gène CLN3 était déficient. Les lysosomes des cellules déficientes contenaient moins de produits de la protéolyse, ce qui suggérait que CLN3 était important pour la protéolyse lysosomale. Cela a été confirmé par des mesures plus directes sur des neurones et des fibroblastes primaires, et sur des fibroblastes immortalisés. Ces résultats pourraient aider à comprendre les premières étapes de la physiopathologie dans les cellules où des gènes CLN sont déficients.Pour accroître le nombre de transporteurs lysosomaux potentiels, j’ai participé à la finalisation d’une étude par protéomique de la membrane lysosomale. Elle a révélé 46 potentiels transporteurs de fonction encore inconnue. Dans cette liste, j’ai étudié TMEM104, SPINSTER, MFSD1, SLC37A2, TTYH3 et SNAT7. Pour ce faire, j’ai d’abord muté les motifs d’adressage de ces protéines pour les rediriger, lors de leur synthèse, vers la membrane plasmique, afin de faciliter leur étude. Aucune fonction claire n’a pu être identifiée par cette approche.SNAT7 appartenait cependant à une famille de transporteurs de glutamine, ce qui était suffisamment encourageant pour envisager d’autres approches. Sa fonction a ainsi été étudiée en développement un nouveau test indirect basé sur la détection d’une surcharge artificielle des lysosomes en acides aminés. Un test fonctionnel plus direct a ensuite été mis au point sur des fractions enrichies en lysosomes en utilisant des acides aminés radiomarqués. Ces deux tests ont montré que SNAT7 était un transporteur spécifique de l’asparagine et de la glutamine.J’ai enfin étudié l’hypothèse suggérant que SNAT7 pourrait jouer dans la nutrition de cellules cancéreuses. En effet, certaines utilisent la glutamine comme nutriment principal à la place du glucose ; mais les apports sanguins en glutamine, dans les tumeurs, sont parfois insuffisants. La glutamine est donc obtenue par macropinocytose de protéines extracellulaires et dégradation lysosomale de ces protéines, avant un recyclage vers le cytoplasme. J’ai montré qu’en l’absence de SNAT7, ce phénomène était bloqué. SNAT7 est donc une cible thérapeutique intéressante pour tenter de bloquer l’approvisionnement des cellules cancéreuses en glutamine<br>Within lysosomes, about sixty different hydrolases degrade macromolecules. This degradation is dependent on the acidity of the lysosomal lumen, which pH ranges between 4.5 and 5.0. The lysosomal pH is maintained by the v-ATPase, a proton pump. Lysosomal degradation generates catabolites, which can be recycled to cytosol by secondary active transporters: lysosomal transporters.The dysfunction of lysosomal proteins leads to lysosomal storage disorders (LSDs), rare inherited metabolic diseases characterised by accumulation of material inside lysosomes. Depending on the mutated gene, symptoms of LSDs vary greatly, although about half of LSD patients display some kind of neurodegenerative symptoms. Studying the physiopathology of LSDs has led to a good understanding of the function of lysosomal enzymes, but the knowledge of lysosomal transporters remain poor, since only a few LSDs has been shown to be linked with a mutation in a lysosomal transporter gene.I focused on two proteins which dysfunction causes a special type of LSDs: CLN3 and CLN7. Mutations in CLN3 and CLN7 cause neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs), a special type of LSD which has mostly neurodegenerative symptoms and which is characterized by the accumulation of a specific pigment inside lysosomes: lipofuscin. There are fourteen NCL genes, but CLN3 and CLN7 are the two only proteins of the family which are resident proteins of the lysosomal membrane, suggesting they might be transporters.Amino acids were screened as possible substrates for CLN7, but none could be shown to be transported. For CLN3, the content in metabolites of lysosomes from Cln3-deficient mice and from WT mice were compared by mass spectrometry, revealing a specific decrease in the amount of catabolites of proteins in lysosomes from Cln3-deficient mice. This suggested a lack of lysosomal proteolysis, which was checked in neurons, in primary fibroblasts and in immortalized fibroblasts. These results suggested that CLN proteins could take part to a metabolic pathway important for lysosomal proteolysis and, more generally, for neuronal health. These results could help improve the understanding of the early steps of NCL physiopathology.To extend the number of candidates for lysosomal transporters, I took part to the validation step of an extensive proteomic study of the lysosomal membrane, which revealed forty-six new candidates for lysosomal transporters. I studied in more details TMEM104, SPINSTER, MFSD1, SLC37A2, TTYH3 and SNAT7. Proteins were overexpressed in HeLa cells to check for lysosomal localization. Then, their putative sorting motifs were mutated to misroute their expression to plasma membrane and to enable their functional study. No function could elucidate for the first five candidates.SNAT7 could not be misrouted to plasma membrane either, but, since it belonged to a family of transporters for glutamine, its function was studied by an indirect assay based on a lysosomal overload in amino acids and a direct transport measure on lysosome-enriched cellular fractions. Thus, SNAT7 was shown to be a lysosomal transporter selective for glutamine and asparagine.The function of SNAT7 is the nutrition of cancer cells was then studied. Many cancer cells use glutamine as their main source of carbon, nitrogen and energy. Because of insufficient blood supply, they use macropinocytosis to uptake extracellular proteins, which degradation in lysosomes generates glutamine. Then, glutamine is recycled to the cytosol. SNAT7 was shown to be critical in this process: in glutamine-dependent cancer cells, when SNAT7 expression is reduced, cells cannot obtain glutamine from extracellular proteins. Thus, blocking SNAT7 is a promising approach to target specifically the metabolism of cancer cells

Les pathologies lysosomales sont des maladies liées au déficit quantitatif ou qualitatif d’une hydrolase ou d’un transporteur à l’origine d’une atteinte multiviscérale potentiellement sévère. Certaines de ces pathologies sont accessibles à des traitements mais ces thérapeutiques sont uniquement symptomatiques et ne guérissent pas les patients. Même si le phénomène de surcharge peut expliquer entre autres la symptomatologie observée, la physiopathologie de ces maladies est complexe et non précisément connue. Une meilleure connaissance de ces pathologies pourrait permettre d’améliorer leur prise en charge globale. L’objectif de ce travail était dans un premier temps d’appliquer des techniques « omiques » dans deux groupes de maladies : les mucopolysaccharidoses et la maladie de Fabry. Cette étude a permis la mise en place d’une méthodologie métabolomique non ciblée basée sur une stratégie analytique multidimensionnelle comportant la spectrométrie de masse à haute résolution couplée à la chromatographie liquide ultra-haute performance et la mobilité ionique. Dans les mucopolysaccharidoses, l’étude des voies métaboliques a mis en évidence des modifications dans le métabolisme de plusieurs acides aminés et du système oxydatif du glutathion. Dans la maladie de Fabry, des modifications ont été observées dans l’expression de l’interleukine 7 et du facteur de croissance FGF2. La deuxième partie du travail s’est intéressée à la modulation de l’autophagie dans la maladie de Fabry. Notre étude a montré une diminution du flux autophagique avec un retard d’adressage de l’enzyme au lysosome dans les cellules Fabry. L’inhibition de l’autophagie permet de diminuer l’accumulation du substrat accumulé (Gb3) et améliore l’efficacité de l’enzymothérapie substitutive. En conclusion ce travail a permis une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques des pathologies lysosomales et a montré la complexité du fonctionnement du lysosome. Ces données permettent d’espérer l’amélioration des stratégies thérapeutiques et diagnostiques dans ces maladies<br>Lysosomal diseases caused by quantitative or qualitative hydrolase or transporter defect induce multiorgan features. Some specific symptomatic treatments are available but they do not cure patients. Pathophysiological bases of lysosomal disease are poorly understood and cannot be due to storage only. A better knowledge of these pathologies could improve their management. The first aim of this study was to apply “omics” strategies in mucopolysaccharidosis and in Fabry disease. This thesis allowed the implementation of an untargeted metabolomic methodology based on a multidimensional analytical strategy including high-resolution mass spectrometry coupled with ultra-high-performance liquid chromatography and ion mobility. Analysis of metabolic pathways showed a major remodeling of the amino acid metabolisms as well as oxidative stress via glutathione metabolism. In Fabry disease, changes were observed in expression of interleukin 7 and FGF2. The second study focused on modulation of autophagy in Fabry disease. In this work, we have shown a disruption of the autophagic process and a delay in enzyme targeting to the lysosome in Fabry disease. Autophagic inhibition reduced accumulation of accumulated substrate (Gb3) and improved the efficiency of enzyme replacement therapy. This work allowed a better knowledge of the physiopathological mechanisms implicated in lysosomal diseases and showed the complexity of lysosome. These data could ameliorate management of these disease and are associated with hope for patients

Les maladies de stockage lysosomales sont des affections génétiques rares et graves caractérisées par un déficit d'une ou plusieurs enzymes spécifiques conduisant à l'accumulation des substrats dans le lysosome. Le traitement de ces maladies, par l'enzymothérapie substitutive utilisant des enzymes lysosomales recombinantes, cible le récepteur du mannose 6-phosphate cation-indépendant (RM6P-CI). Le RM6P-CI permet le transport des enzymes porteuses du marqueur M6P vers les lysosomes. Ce marqueur de reconnaissance M6P est cependant sensible à l'hydrolyse par les phosphatases. Nous avons donc entrepris la synthèse d'analogues du M6P fonctionnalisés en position anomère par différents bras espaceurs en vue de leur couplage aux enzymes lysosomales. L'évaluation biologique de ces analogues, appelés AMFA, a montré qu'ils sont très affins pour le RM6P-CI et ne sont pas cytotoxiques. L'affinité pour le RM6P-CI de la cathepsine D-KDEL mutée est augmentée 10 fois par le couplage de l'un de ces analogues. D'autre part, l'activité enzymatique est conservée pour l'enzyme modifiée chimiquement<br>Lysosomal storage diseases are a group of 50 genetically inherited disorders that are characterized by a deficiency of one or more specific lysosomal enzymes which causes an accumulation of substrates inside the lysosome. Enzyme replacement therapy consists in the targeting of recombinant enzymes through the cation-independent mannose 6-phosphate receptor (CI-M6PR) transport. CI-M6PR allows the transport of enzymes carrying the M6P marker towards the lysosomes. The main drawback with the M6P recognition marker is its sensitivity to hydrolysis by phosphatases. Therefore, isosteric analogues of M6P functionalized at the anomeric position by different spacer arms were synthesized. The biological evaluation of these analogues revealed that they are stable in human serum and are recognized by CI-M6PR as well as the M6P itself. Additional studies on living cells showed that none of the prepared analogues is cytotoxic. The conjugation of AMFA-1 to the cathepsin D-KDEL low affinity mutant induced a 10-fold increase of its affinity for the CI-M6PR. The enzymatic activity of chemically modified cathepsin D-KDEL was found fully maintained

Récemment, le concept de chaperon pharmacologique a émergé pour le traitement des maladies lysosomales. Comme inhibiteurs réversibles de glycosidases mutantes impliquées dans ces maladies, les chaperons pharmacologiques sont capables, à des concentrations sub-inhibitrices, de sauver ces enzymes des mécanismes de destruction du réticulum endoplasmique (RE). Ainsi, une partie de l’activité enzymatique est restaurée. Les iminosucres sont connus pour être une classe importante de chaperons pharmacologiques. Au cours de ce travail de thèse, de nouvelles classes d’iminosucres mono- et multivalents ont été conçues et synthétisées. Nos objectifs étaient de mettre en évidence de nouveaux chaperons pour la β-glucocérébrosidase, impliquée dans la maladie de Gaucher, mais également d’identifier de nouveaux inhibiteurs des α-glucosidases du RE impliquées dans la destruction de la protéine déficiente chez les malades atteints de la mucoviscidose. Plusieurs stratégies ont été mises en œuvre: l’utilisation d’une méthodologie de diamination d’alcènes pallado-catalysée, d’une méthodologie permettant la synthèse rapide d’une bibliothèque de composés iminosucres par chimie click ou encore de la multivalence. Une étude poussée sur la multivalence et l’inhibition de glycosidases a également été réalisée en faisant varier des paramètres clés de la multivalence tels que la valence, la charpente, le linker, ou encore la nature des ligands iminosucres. Le premier exemple d’un effet multivalent puissant jusqu’à quatre ordre de grandeur sur l’inhibition de glycosidases a été mis en évidence avec des systèmes iminosucres multivalents basés sur des charpentes de type β-cyclodextrine et fullerène C60<br>Recently an innovative concept for the treatment of lysosomal diseases as emerged called pharmacological chaperone. Pharmacological chaperones are reversible inhibitors of the deficient glycosidases involved in these diseases. These molecules are able, at sub-inhibitory concentrations, to stabilize the enzymes and rescue them from the destruction by the quality control system of the endoplasmic reticulum. A part of the catalytic activity of the enzyme could be restored. Iminosugars are known to be an important class of pharmaceutical chaperones. During this PhD work, novel classes of mono- and multivalent iminosugars were designed and synthesized in order to identify novel pharmacological chaperones for the glycosidase: β-glucocerebrosidase involved in Gaucher’s disease and novel inhibitors of the α-glucosidases involved in the destruction of the defective protein delF508CFTR in cystic fibrosis. Several strategies were applied to achieve this aim. These strategies consist in the use of a synthetic methodology of palladium catalyzed alkenes diamination, the use of an efficient methodology to synthesize a library of novel iminosugars by click chemistry and the use of multivalency. A full study on the impact of multivalency on glycosidases inhibition was also completed by changing crucial structural parameters including valency, scaffold, linker and ligand. The first strong multivalent effect on glycosidases inhibition up to four orders of magnitude was reported with multivalent iminosugars based on β-cyclodextrin or C60 fullerene cores

Dans cette étude, nous avons utilisé le mutant cgl d'Arabidopsis thaliana présentant des N-glycannes oligomannosidiques (Mannose 5) pour la production d'oligosaccharides et d'enzymes lysosomales. Nous avons établi des suspensions cellulaires à partir desquelles, nous avons purifié le mannose (environ 110 μg de mannose par kg de biomasse). L'accroissement des volumes de cultures, sans perte de rendement, permet d'envisager une production à plus grande échelle. Le couplage chimique d'un sucre modèle à une molécule test a été réalisé en vue du couplage de substances pharmacologiques au mannose et leur adressage vers des cellules cibles. Un protocole de transformation génétique du mutant cgl à partir de racines a été testé avec le gène rapporteur gus permettant d'obtenir directement des cals transformés. Nous avons utilisé ce système pour l'expression de la glucocérébrosidase (GBA), enzyme lysosomale déficiente dans la maladie de Gaucher. Différentes constructions génétiques ont été élaborées par addition de signaux permettant la rétention dans le réticulum ou la détection et la purification de la protéine. La présence des ARNm correspondants à la GBA a été mise en évidence dans 95% des lignées testées. En revanche, la protéine n'a pas encore pu être détectée dans nos conditions expérimentales. D'autres cals sont en cours de criblage pour l’expression d'une autre enzyme lysosomale, la sphingomyélinase<br>Ln this study, we used the cgl mutant of Arabidopsis thaliana which presents oligomannosidic (Mannose 5) glycans for the production of oligosaccharides and lysosomal enzymes. Cell suspensions of the cgl mutant were established and allowed purification of mannose (110 μg / 1 kg of biomass). The increase in culture volume, without a loss in yield, indicates the possibility of production on a larger scale. Chemical ligation of a model sugar to a test molecule was carried out with a view to linking pharmacological substances to mannose and to addressing the se substances to the target cells. A genetic transformation protocol from roots was set up with rapporter gene gus in order to obtain directly the transformed calli. This system was used for beta-glucosidase acid expression (GBA), which is a deficient lysosomal enzyme in Gaucher disease. Various genetic constructions were built using peptide signals which allow reticulum retention or protein detection and purification. The mRNA presence corresponding to the GBA was revealed in 95% of the tested lines. Conversely, the protein was not yet detected in our experimental conditions. Other calli are under selection for the expression of another lysosomal enzyme, the sphingomyelinase

La cystinose (MIM 21980) est une maladie de surcharge lysosomale héréditaire rare caractérisée par un efflux défectueux de cystine hors des lysosomes. Le gène impliqué dans la cystinose code pour une protéine transmembranaire lysosomale, la cystinosine, qui fonctionne comme un co-transporteur de cystine et de protons. De plus, la cystinosine, possède deux motifs d’adressage aux endosomes tardifs et aux lysosomes: un classique, le motif GYDQL dans sa partie C-terminale, et un nouveau signal conformationnel dans la boucle située entre les 5ème et 6ème domains transmembranaires. La première partie de mon projet de thèse vise à caractériser le trafic intracellulaire de la cystinosine. L’adressage des protéines de la membrane lysosomale à ces organelles peut se faire par deux voies, la voie directe (intracellulaire) et la voie indirecte (via la membrane plasmique), médiées par les complexes AP (AP- 1 à AP -4 et probablement récemment décrit AP- 5). Grâce à l’utilisation de la technique du double hybride, nous avons identifié une forte interaction entre le motif GYDQL et la sous-unité μ3 du complexe AP3. Par ailleurs, nous avons montré que la déplétion d'AP-3 dans des cellules HeLa conduit à une augmentation de localisation de la cystinosine-GFP à la membrane plasmique ainsi que à la rétention de la protéine chimère, proteine CD63 dont le signal d’adressage a été remplace par celui de la cystinosine (CD63-Cter-GFP), dans l’appareil de Golgi. Ces résultats confirment l’importance de la voie directe AP-3–dépendante dans l’adressage de la cystinosine au lysosome. La deuxième partie de mon projet a consisté à caractériser un éventuel nouveau rôle de la cystinosine. Grâce à une approche de protéomique, nous avons montré que la cystinosine interagissait avec divers membres de la voie mTORC1: les Rag GTPases RagA et RagC, les composantes du complexe Ragulator et la v -ATPase, pompe à protons couplant l’hydrolyse de l’ATP avec le transport de protons. Lors de la stimulation par des acides aminés, l’hétérodimère actif de Rag GTPases et le complexe pentamérique Ragulator recrutent mTORC1 à la surface des lysosomes, à proximité de son activateur Rheb, déclenchant la cascade de signalisation. En outre, il a été récemment montré que l'interaction, dépendante des acides aminés, entre la v-ATPase et le complexe Ragulator-Rag est nécessaire pour l’activation de mTORC1. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que la cystinosine et la v-ATPase pourraient fonctionner ensemble dans un mécanisme lysosomal de détection d'acides aminés appelé "inside-out". En effet, nous avons montré que l'absence de cystinosine a un impact à la fois sur le recrutement de mTORC1 aux lysosomes et sur le positionnement de ces organelles en réponse à la déprivation puis à l’ajout des acides aminés, ce qui démontre le double rôle de ce transporteur d'acides aminés. Ce rôle nouvellement décrit de la cystinosine pourrait aider à mieux comprendre la physiopathologie de la cystinose, conduisant ainsi à l'amélioration des traitements existants<br>Pas de résumé en anglais

Les maladies lysosomales sont des maladies hereditaires de surcharge liees au deficit de l'activite de certaines hydrolases. Elles se presentent sous des formes cliniques de gravite tres plupart des genes des enzymes lysosomales permet une nouvelle approche de la physiopathologie de ces affections par une etude des relations entre le genotype et le phenotype clinique oubiochimique. Trois lipidoses lysosomales ont ainsi ete abordees : la maladie de sandhoff (gm2-gangliosidose due au defaut de la chaine d ela -hexosaminidase), la maladie de fabry (lipidose a trihexosyl-ceramide, due au deficit en -galactosidase a) et le cesd o polycorie cholesterolique de l'adulte (surcharge en ester de cholesterol par deficit de la lipase acide). Les defauts moleculaires de la maladie de sandhoff ont ete etudies au travers d'une famille consanguine, facilitant ainsi l'etude de larelation genotype-phenotype. La transition 1514g a (arg 505 gln) sur le gene de la chaine de la -hexosaminidase rend l'enzyme thermolabile et donne une forme adulte de la maladie de sandhoff. Une autre transition, 619ag (ile 207 val), a egalement ete mise en evidence sur les deux alleles des patients et d'un des parents. Deja decrite et consideree comme une mutation, cette transition apparait en fait n'etre qu'un polymorphisme relativement frequent. Nous avons decrit deux jumelles monozygotes, heterozygotes pour la maladie de fabry, pathologie liee au chromosome x. Celles-ci presentaient sur le gene de l'-galactosidase a une mutation pontuelle 10182ga (asp 231 asn). Une jumelle etait atteinte, l'autre etait asymptomatique. L'etude du statut d'inactivation du chromosome x chez les deux soeurs a montre un profil d'inactivation en miroir en accord avec la discordance des phenotypes. Les defauts moleculaires du gene codant pour la lipase acide lysosomale (lipa) ont ete etudies chez deux patients presentant un cesd. Une nouvelle mutation 233ct qui introduit un codon stop premature est decrite. L'etude in situ de l'activite residuelle de la lipase acide effectuee en parallele a montre qu'il n'existait pas de correlation directe simple entre les lesions moleculaires du gene lipa, les phenotypes biochimiques et les phenotypes cliniques.

Des glycoside hydrolases (EC. 3. 2. 1. X) (GH) lysosomales dont la fonction consiste en l'hydrolyse de composés glycosylés cellulaires sont impliquées dans des maladies génétiques humaines regroupées sous le terme de "maladies lysosomales". Nous avons effectué des études structurales et fonctionnelles sur certaines de ces GH lysosomales afin de mieux comprendre la physiopathologie des maladies de surcharge métabolique très invalidantes les impliquants. Une vaste étude sur différentes GH, utilisant un même mécanisme catalytique (rétention de la configuration anomérique), incluant des GH lysosomales, a été menée en collaboration avec des spécialistes de modélisation moléculaire. L'analyse de la séquence primaire des protéines par la méthode HCA (Hydrophobic Cluster Analysis) de prédiction 2D, et l'exploitation des banques de donnnées sur des GH cristallisées, ont conduit à la proposition d'un modèle structural de type tonneau (α/ß)8, commun à toutes les enzymes dans le clan des brins ß4 et ß7 du tonneau ont été localisés. Les éléments structuraux et fonctionnels du site catalytique de cinq GH lysosomales : la glucocérébrosidase (maladie de gaucher), l'α-L-iduronidase (mucopolysacharidose de type I), la ß-galactosidase (ganglyosidose GM1), la ß-glucuronidase (syndrome de Sly) et a ß-mannosidase (ß-mannosidose) ont été caractérisés. L'impact structural et fonctionnel de mutations génétiques a été analysé. Nous avons ensuite exploité les prédictions de modélisation effectuées sur ces enzymes pour mieux caractériser les acides aminés, catalyseurs acide-bases et nucléophile, de la glucocérébrosidase et l'α-L-iduronidase humaine ; des protéines pour lesquelles une thérapie enzymatique est développée. A l'aide d'une stratégie de biologie cellulaire basée sur une mutagénèse substitutive des acides aminés suspectés et une expression des protéines recombinantes, mutées et non mutées, dans un système cellulaire hétérologue, nous avons obtenu une invalidation totale de l'activité catalytique des enzymes. Nous avons montré que la perte d'activité n'était pas liée à un défaut de biosynthèse et de maturation des protéines mutées, mais des mutations introduites. Aussi, nous avons été en mesure d'impliquer très fortement les acides glutamiques 235 et 340 de glucocérébrosidase et les acides glutamiques 182 et 299 de l'α-L-iduronidase dans la fonction catalytique de ces GH. Nous avons ainsi apporté une validation expérimentale à nos prédictions. L'ensemble de nos travaux de modélisation moléculaire et d'analyse de relation structure-fonction souligne ici l'importance d'une complémentarité entre les approches de prédictions de structure et les approches de vérifications expérimentales pour la connaissance du fonctionnement catalytique de GH lysosomales impliquées dans des maladies génétiques<br>Glycosyl hydrolases (GH) are a widespread group of enzymes. Several lysosomal strorage diseases characterized by a severe handicap are due to deficiences in GH. A structural biology study concerning the numerous enzymes belonging to clan GH-A of GH was performed. Clan GH-A includes 5 human enzymes implicated in lysosomal diseases : glucocerebrosidase, α-L-iduronidase, ß-galactosidase, ß-glucuronisade and ß-mannosidase. Predictions concerning the active site structure of these enzymes were made by Hydrophobic Cluster Analysis (HCA), a bidimensional analytical method permitting to compare highly divergent protein sequences. We found that all the active sites may have a similar 3D structures consisting af an (α/β)8 barrel. In particular, a pair of glutamic acid residues, presumed to directly participate in the enzymatic hydrolysis, was identified. Finally, analysis of mutations described in patients was in agreement with the predictions. Next, we performed site-directed mutagenesis studies to obtain experimental evidence supporting our HCA predictions. These studies concerned the glutamatic acid residues supposed to be involved in the catalytic activity of glucocerebrosidase and α-L-iduronidase. Substitution of these glutamatic acids by alanine residues led to complete inactivity of the mutant proteins without affecting their folding/processing. These data further support that Glu235/Glu340 and Glu182/Glu299 play a key role in th enzymatic activity of glucocerebrosidase and α-L-iduronidase, respectively. In conclusion, our work shows that strutural biology and mutagenesis studies may be highly complementary for a better understanding of the structure/function relationship in enzymes involved in severe genetic diseases

Mon travail, realise grace a une bourse d'etude de l'association vaincre les maladies lysosomales, a pour but l'etude de la structure et de la fonction de plusieurs glycosyl-hydrolases dont les defficiences sont a l'origine de maladies lysosomales. Dans cette optique, l'exploitation des informations disponibles dans les banques de donnees de proteines m'a permis d'analyser le domaine catalytique de 5 glycosyl-hydrolases lysosomales : la -galactosidase (maladie de landing), la -glucuronidase (maladie de sly), la -glucocerebrosidase (maladie de gaucher), la -mannosidase (mannosidose) et l'-l-iduronidase (maladie de hurler-scheie). Mon etude a montre que toutes ces enzymes sont apparentees par leur fonction et leur structure. Elles adopteraient un repliement tri-dimentionnel (3d) en forme de tonneau (/)8. Les 8 brins formeraient un feuillet parallele dont les extremites c-terminales porteraient des acides amines importants dans la fonction hydrolase. Ces acides amines sont en outre conserves pour les quelques 200 sequences de proteines de la super famille a laquelle appartiennent ces 5 glycosyl-hydrolases lysosomales. Enfin, certaines mutations responsables des maladies causees par la deficience de ces enzymes sont localisees avant, dans ou apres un des 8 brins portant le site catalytique. Le travail d'analyse de sequence mene sur les enzymes lysosomales m'a amene a automatiser en grande partie la gestion des donnees issues des logiciels de recherche blast et fasta. Le systeme ainsi cree repose sur deux logiciels, visual blast et visual fasta, qui rendent l'analyse de sequence beaucoup plus simple a realiser. Non seulement ils permettent une meilleure gestion des resultats de blast et fasta mais ils integrent egalement plusieurs outils d'analyse supplementaires permettant une etude des resultats a la fois approfondie et rapide. Ces outils permettent a l'utilisateur de travailler directement sur les resultats de blast (fasta), sans recourir a des programmes externes. Entierement graphique, visual blast et visual fasta permettent a l'utilisateur neophyte d'aborder l'analyse de sequence avec beaucoup plus de facilite, et l'utilisateur experimente beneficie d'un systeme performant pour realiser des analyses detaillees des resultats de blast et fasta.

La maladie de Fabry est une maladie génétique lysosomale causée par une mutation dans le gène GLA codant pour la protéine alpha-galactosidase A. Cette déficience a pour effet de mener à l’accumulation de plusieurs métabolites dans les liquides biologiques et différents organes. Les patients présentent, entre autres, de l’acroparesthésie, des angiokératomes, des problèmes ophtalmologiques, ainsi que des problèmes rénaux, cardiaques et du système nerveux central pouvant mener à une mort prématurée, si le patient n’est pas traité. Afin de permettre un dépistage, un diagnostic et un suivi adéquat des patients, plusieurs biomarqueurs spécifiques à la maladie sont utilisés. Présentement, le dépistage à haut risque est fait à l’aide du globotriaosylcéramide (Gb[indice inférieur 3]), du globotriaosylsphingosine (lyso- Gb[indice inférieur 3]) et de ses analogues. Toutefois, il arrive que ces biomarqueurs ne soient pas retrouvés en quantité élevée chez certains patients, d’où l’intérêt de continuer les investigations pour trouver d'autres biomarqueurs qui seraient plus spécifiques face à la sévérité et à la progression de la maladie. Une récente étude métabolomique effectuée par spectrométrie de masse en temps de vol a mis en évidence la présence de plusieurs biomarqueurs qui n’avaient pas encore été identifiés chez les patients Fabry. Parmi ceux-ci, se trouve une classe de biomarqueurs appelés les isoformes méthylés du Gb[indice inférieur 3] (masse/charge (m/z): 1150, 1148, 1122, 1120, 1094, 1066, and 1038). Ceux-ci présentent un intérêt particulier puisqu'ils semblent faire partie de la voie métabolique entre le Gb[indice inférieur 3] et le lyso-Gb[indice inférieur 3]. Les objectifs de ce projet sont donc: 1) de développer et de valider une méthode d’analyse quantitative des isoformes méthylés et non-méthylés du Gb[indice inférieur 3] et de la créatinine urinaire par spectrométrie de masse en tandem; 2) de doser ces biomarqueurs sur une large cohorte de patients atteints de la maladie de Fabry et de contrôles sains; 3) de comparer la concentration des isoformes méthylés du Gb[indice inférieur 3] urinaire avec la concentration de Gb[indice inférieur 3] non- méthylés et; 4) d’identifier s’il y a des corrélations entre lesdits biomarqueurs quantifiés et l’âge, le sexe, le traitement et le génotype des patients. Une méthode de quantification par spectrométrie de masse en tandem a été développée et validée, en multiplex avec la créatinine urinaire. En plus d’avoir le potentiel d’aider au dépistage à haut risque, ces biomarqueurs ont permis d’établir des corrélations avec la réponse au traitement et nos résultats montrent qu’ils sont anormalement excrétés chez les patients portant la mutation à variante cardiaque p.N215S, pour qui les niveaux de Gb[indice inférieur 3] non-méthylés sont habituellement normaux.

La maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise par l’accumulation dans le cerveau d’agrégats extracellulaires et intraneuronaux (Aβ et Tau). Dans la cellule, la principale voie de dégradation des protéines agrégées est la voie lysosomale-autophagique, qui est altérée de façon précoce chez les patients Alzheimer. Des études récentes de mon laboratoire ont montré que ce dysfonctionnement serait à la fois la cause et la conséquence de l’accumulation du précurseur direct de l’Aβ, appelé C99 ou APP-CTFβ. De par sa toxicité, le C99 semble donc jouer un rôle crucial dans l’étiologie de la maladie. Son accumulation se produit majoritairement dans les compartiments endolysosomaux mais de façon intéressante, un marquage extracellulaire associé au C99 a également été observé à des stades plus avancés de la maladie ou en présence d’un inhibiteur de la γ-sécrétase (enzyme clivant le C99 en Aβ). Le premier axe de mon travail de thèse a donc consisté à étudier l’efficacité d’une restauration du système lysosomal-autophagique sur l’accumulation du C99. Dans ce but, nous avons utilisé une stratégie virale visant à exprimer le facteur de transcription EB (TFEB) dans un modèle murin de la MA (3xTg-AD). Ce facteur est le principal régulateur de la biogenèse lysosomale et de l’autophagie. Deux approches ont été testées cherchant à exprimer le TFEB avant ou après le début de l’accumulation du C99, grâce à une injection de virus exprimant le TFEB, soit en intracérébroventriculaire dès la naissance, soit par stéréotaxie à l’âge de 4 mois. Ces études ont montré une réduction importante de l’accumulation intraneuronale du C99 chez les souris 3xTg-AD, que ce soit via l’approche "préventive" ou "curative". Le deuxième axe de mon travail de thèse a cherché à comprendre l’origine du marquage extracellulaire observé dans le cerveau et associé au C99. Nous avons émis l’hypothèse que ce marquage correspondrait à des exosomes enrichis en C99. Les exosomes sont des vésicules extracellulaires, d’origine endosomale et sécrétées par les cellules, ayant déjà été décrites comme transportant des protéines neurotoxiques. Grâce à des approches pharmacologiques, immunocytochimiques et génétiques, nous avons confirmé cette hypothèse et mis en évidence la présence de C99 et de son dérivé le C83 (APP-CTFα) dans les exosomes purifiés à partir de modèles cellulaires ou murins de la MA, sous forme monomérique et oligomérique. Nos travaux montrent également que la charge des exosomes en oligomères est fortement amplifiée en présence d’une inhibition de la γ-sécrétase, expliquant ainsi le marquage extracellulaire. En conclusion, mes travaux de thèse (1) proposent une potentielle stratégie thérapeutique, basée sur l’activation du TFEB et visant à empêcher l’accumulation du C99, (2) montrent la présence de monomères et d’oligomères de C99 dans les exosomes ainsi qu’un lien entre la γ-sécrétase et l’oligomérisation. Les futures études devront déterminer le rôle exact de ces exosomes enrichis en C99<br>Alzheimer’s disease (AD) is characterized by the pathological accumulation of extracellular and intracellular aggregates (Aβ and Tau) in the brain. AD is also associated with an early alteration of the major degradation pathway of aggregated proteins, the autophagic-lysosomal pathway. Recent works have suggested that this defectcouldbothbeacauseandaconsequenceofearlyintraneuronalaccumulation of C99 (also named as APP-CTFβ), the direct precursor of Aβ. Due to its toxicity, C99 could be a possible key player of AD etiology. The accumulation of this product occurs mainly within organelles of the endolysosomal network, but our recent observations also indicate an extracellular accumulation of C99 in later stages of the disease, or in conditions where the Aβ-generating enzyme, γ-secretase, is blocked. The first aim of my PhD project was to investigate the possible beneficial effect of restoringlysosomal-autophagicfunctiononC99accumulation. Tothisend, weused a viral strategy to overexpress TFEB, a master regulator of both lysosome biogenesis and autophagy, in a mouse model of AD (3xTg-AD mouse). Two approaches were tested aiming to express TFEB either before or after the beginning of C99 accumulation, by injecting AAV-TFEBs into the ventricles of newborn mice or by stereotaxic injection into 3 month-old mice, respectively. These studies have shown a strong TFEB-mediated reduction of C99 accumulation when using both the preventive and curative approach. The aim of the second part of my PhD work was to understand the reasons of the extracellular accumulation of C99. We postulated that this C99-associated immunostaining could correspond to exosomal-associated C99. Exosomes are nanosizedvesiclesofendocyticoriginthatarereleasedfromcellsandknowntotransport neurotoxic proteins. In our study based on pharmacological, immunocytochemical and genetic approaches, we have confirmed this hypothesis and have shown the presence of C99, and of its direct derived-fragment C83 (APP-CTFα), existing as both monomers and oligomers, in exosomes purified from AD cell and mouse models. Moreover, our data have shown that the levels of these APP-CTFs are strongly increased by γ-secretase inhibition, thus explaining the higher levels of extracellular staining in γ-secretase treated animals. In conclusion, my PhD work shows 1) a new potential therapeutic strategy based on TFEB activation aiming to reduce early C99 accumulation and 2) the presence of monomeric and oligomeric C99 in exosomes in AD models and a link between γ-secretase inhibition and oligomerisation. Future studies are needed to elucidate the exact role of these C99-enriched exosomes in AD

Le récepteur du mannose-6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI) permet l'endocytose puis le transfert de molécules porteuses du marqueur M6P vers les lysosomes. Pour améliorer à la fois l'affinité pour le RM6P-CI et la stabilité du résidu M6P, nous avons procédé à la synthèse d'analogues isostères stables et fonctionnalisés en position anomère pour permettre un couplage efficace à des molécules d'intérêt thérapeutique. Tout d'abord un couplage à des enzymes recombinantes humaines a été réalisé. Le remodelage de la partie oligosaccharidique de l'enzyme lysosomale GAA, dont la déficience est responsable de la maladie de Pompe, a permis de mettre en évidence que la néoglycoGAA est reconnue efficacement par les RM6P-CI et que son activité enzymatique est totalement conservée. Deuxièmement, le couplage de ces analogues du M6P à des porphyrines en vue de la thérapie photodynamique des cancers est envisagé. Le modèle mis au point en série du mannose a permis de valider notre approche de ligation de saccharides à des photosensibilisateurs par des méthodes évitant après couplage les étapes classiques de déprotection des saccharides. L'étude biologique menée sur les porphyrines glycosylées préparées a démontré leur cytotoxicité photoinduite<br>The cation independent mannose-6-phosphate receptor (CI-M6PR) allows the endocytosis and the transfer of molecules bearing the M6P marker to lysosomes. To improve both the affinity for the CI-M6PR and stability of the M6P residue, we carried out the synthesis of isosteric M6P analogues functionalized at the anomeric position to allow efficient coupling to molecules of therapeutic interest. First, the coupling on human recombinant enzymes was performed. The remodelling of the oligosaccharide part of the lysosomal enzyme GAA, whose deficiency is responsible for Pompe disease, helped to highlight the neoglycoGAA is recognized efficiently by CI-M6PR and its enzymatic activity is completely preserved. Second, the coupling of these analogues of M6P to porphyrins for photodynamic therapy of cancer was considered. The model developed in the mannose series has validated our strategy of ligation of saccharides to photosensitizers. The employed methods avoid the conventional steps of deprotection of saccharides after coupling. The biological study with the prepared glycosylporphyrins demonstrated the photoinduced cytotoxicity

La maladie de Fabry est une maladie héréditaire de surcharge, dont la transmission est liée au chromosome X qui résulte d'un déficit de l'[alpha]-galactosidase A. Le déficit enzymatique mène à une augmentation de glycosphingolipides, notamment le globotriaosylcéramide (Gb[indice inférieur 3]), dans les tissus et fluides biologiques. Le Gb[indice inférieur 3] est donc un biomarqueur ou indicateur de la présence de cette maladie chez les patients Fabry. Nous voulions évaluer la faisabilité de procéder à un projet pilote de recherche en vue d'un dépistage néonatal urinaire de la maladie de Fabry.La variation de l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]/créatinine urinaire chez des enfants normaux dans la période néonatale jusqu'à l'âge de 6 mois est inconnue. Cette constatation nous a conduits au questionnement suivant : existe-t-il une variation dans la quantité du Gb[indice inférieur 3]/créatinine urinaire excrétée chez des enfants normaux de 0 à 6 mois de vie? Afin de répondre à cette question, nous avons procédé à une étude permettant de doser le Gb[indice inférieur 3]/créatinine chez des enfants normaux par spectrométrie de masse en tandem et ce, en comptant sur la collaboration des parents à effectuer un total de treize prélèvements d'urine pendant une période de 6 mois. Nous avons d'ailleurs évalué ladite collaboration des parents à nous faire parvenir les échantillons d'urine de leur bébé durant cette période. Nous avons utilisé une méthode par spectrométrie de masse en tandem avec des échantillons d'urine séchée sur papier filtre pour analyser simultanément le Gb[indice inférieur 3] total urinaire et la créatinine à différents temps soit 2, 3, 4, 6, 10, 14, 21, 28 jours, de même qu'à 2, 3, 4, 5 et 6 mois chez 37 filles et 39 garçons normaux. Le traitement quantitatif des données de la créatinine et du Gb[indice inférieur 3] urinaire a été fait par le logiciel QuanLynx (Waters). Nous avons divisé la variable du temps en quatre périodes pour les fins d'analyses statistiques : (1) < 6 jours; (2) 6-29 jours; (3) 30-90 jours; (4) > 90 jours. Nous avons procédé à des analyses statistiques comparatives du rapport Gb[indice inférieur 3]/créatinine de 728 échantillons pour les deux cohortes en fonction du temps. Une analyse de variance a été faite pour évaluer l'effet de l'âge et du sexe sur le rapport du logarithme du Gb[indice inférieur 3]/créatinine urinaire et l'effet de l'âge et du sexe sur la quantité d'excrétion de la créatinine urinaire seulement. Nous avons observé un effet significatif de l'âge sur la créatinine (p < 0.0001). En ce qui concerne les résultats du rapport du Gb[indice inférieur 3]/créatinine, il y a une augmentation non significative de la médiane dans les périodes 1 et 2 pour les garçons (Période 1: Médiane 53.9; Min-Max 0 - 369.3 [micro]g/mmol créatinine; Période 2: Médiane 92.5; Min-Max 0 - 611.1 [micro]g/mmol créatinine ; p = 1.0000). Chez les filles, l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]/créatinine est plus élevé à la naissance et présente une tendance à l'accroissement entre les périodes 1 et 2 (Période 1: Médiane 59.5; Min-Max 0 - 669.9 [micro]g/mmol créatinine; Période 2: Médiane 96.1; Min-Max 0 - 456.1 [micro]g/mmol créatinine ; p = 1.0000). Par ailleurs, l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]/créatinine chez les garçons diminue de façon significative entre les périodes 2 et 4 (Période 2: Médiane 92.5; Min-Max 0 - 611.1 [micro]g/mmol créatinine; Période 4: Médiane 14.6; Min-Max 0 - 158.5 [micro]g/mmol créatinine ; p < 0.0001); au niveau des filles, il y a une diminution non significative de la médiane de la période 2 à la période 3 (Période 2 : Médiane 96.1; Min-Max 0 - 456.1 [micro]g/mmol créatinine ; Période 3 : Médiane 35.6; Min-Max 0 - 254.4 [micro]g/mmol créatinine p = 0.2290) et une légère augmentation à la période 4 (Période 4 : Médiane 42.7; Min-Max 0 - 617.2 [micro]g/mmol créatinine). Ainsi, nous pouvons constater qu'il existe une grande variabilité de l'excrétion du Gb[indice inférieur 3]

Résumé : Calnuc est une protéine ubiquitaire qui lie le calcium et qui est présente au réseau trans-golgien (TGN) ainsi qu'aux endosomes. Notre groupe a précédemment mis en évidence le rôle de Calnuc dans le transport de Low density lipoprotein receptor-related protein 9 (LRP9), un récepteur aux lipoprotéines de faible densité qui cycle entre le TGN et les endosomes. Les récepteurs lysosomiaux au mannose-6-phosphate (MPR) et Sortiline sont bien caractérisés et empruntent également cette voie. À l'image de LRP9, nous avons montré que Calnuc prévient leur dégradation aux lysosomes en participant à leur recyclage à partir des endosomes vers le TGN. En fait, Calnuc est importante pour l'activation et l'association membranaire de Rab7, une petite protéine G qui recrute ensuite le complexe Rétromère responsable du transport rétrograde des récepteurs. La glycoprotéine lysosomiale Ceroid lipofuscinosis neuronal 5 (CLN5) est également impliquée dans ce processus. La structure et la fonction de cette dernière n'étant pas clairement définies, nous avons établi qu'elle est synthétisée sous forme d’une glycoprotéine transmembranaire de type II, mais son domaine N-terminal cytoplasmique et son segment transmembranaire sont rapidement éliminés suivant le clivage du peptide signal de manière à former une protéine CLN5 mature fortement associée à la membrane par une hélice amphipathique (AH). La compréhension des propriétés de base de CLN5 est particulièrement pertinente puisque la protéine est impliquée dans certaines variantes de céroïdes-lipofuscinoses neuronales (NCL), une maladie neurodégénérative rare causée par une surcharge des lysosomes. D'ailleurs, nos données indiquent que les mutants pathologiques de CLN5 dépourvus de cette AH perdent leur association membranaire, sont retenus au réticulum endoplasmique et sont rapidement dégradés. En raison de la similitude des fonctions de Calnuc et de CLN5 au niveau du triage endosomial, nous avons exploré le lien entre les deux protéines. Calnuc cytosolique et CLN5 luminale semblent former un complexe, par l'intermédiaire de la protéine transmembranaire CLN3, de façon à influencer l'activité de Rab7. CLN3 étant aussi associée aux NCL, nous avons finalement exploré la potentielle implication de Calnuc dans la maladie. L'absence de Calnuc entraîne des phénotypes cellulaires typiques des NCL comme un engorgement des lysosomes, une accumulation de matériel autofluorescent et une augmentation de l'autophagie. Les niveaux protéiques de Calnuc sont diminués dans toutes les lignées de fibroblastes de patients atteints de NCL disponibles ce qui indique que Calnuc pourrait être impliquée dans certains types de NCL. La présente thèse couvre donc la découverte de la fonction de Calnuc dans le transport intracellulaire, jusqu'à son implication potentielle dans les NCL, de même qu'une étude topologique de CLN5.<br>Abstract : Calnuc is a ubiquitous Ca2+-binding protein present on the trans-Golgi network (TGN) and endosomes. We previously highlighted the role of Calnuc in the transport of Low density lipoprotein receptor-related protein 9 (LRP9), a low density lipoprotein (LDL) receptor that cycles between the TGN and endosomes. Lysosomal receptors mannose-6-phosphate receptor (MPR) and Sortilin are well-characterized and also use the TGN-to-endosome trafficking pathway. Similarly to LPR9, we showed that Calnuc prevent their degradation in lysosomes by acting in their recycling from endosomes to the TGN. In fact, Calnuc is a important for the activation and the membrane association of Rab7, a small G protein which then recruit the Retromer complex known to be responsible for the retrograde transport of receptors. Lysosomal glycoprotein Ceroid lipofuscinosis neuronal 5 (CLN5) is also involved in this process. Because its structure and function have not yet been clearly defined, we established that it is synthesized as a type II transmembrane (TM) glycoprotein, but its cytoplasmic N-terminus and TM segment are rapidly removed following signal-peptide cleavage to generate mature CLN5 which is tightly associated to membrane through an amphipathic helix (AH). The understanding of the basic properties of CLN5 is particularly important given that CLN5 is involved in some variants of neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL), a rare neurodegenerative disease caused by lysosomal overload. Moreover, our data indicate that CLN5 pathological mutants deprived of AH lose their membrane association, are retained in the endoplasmic reticulum, and are rapidly degraded. Based on the similarity featured by Calnuc and CLN5 in endosomal sorting, we explored the link between these two proteins. Cytosolic Calnuc and luminal CLN5 seem to form a complex, through the transmembrane protein CLN3, in order to influence the activity of Rab7. As CLN3 is also associated with NCL, we finally explored the potential involvement of Calnuc in this disease. Canuc depletion leads to typical NCL phenotypes such as lysosome enlargement, accumulation of autofluorescent material and of an increased of autophagy induction. Canuc's levels are decreased in all fibroblasts cell lines of NCL patients available indicating that Calnuc could be involved in some types of NCL. This thesis thus covers the discovery of the function of Calnuc in intracellular transport up to its potential involvement in the NCL, as well as a topological study CLN5.

L’accumulation cérébrale progressive de peptides amyloïdes générés à partir du clivage du précurseur du peptide amyloïde (APP) par les sécrétases est un mécanisme central de la maladie d’Alzheimer. C’est pourquoi, améliorer la compréhension de la régulation et de l’homéostasie du métabolisme de l’APP est devenu primordial. Partant de ce constat, nous avons supposé qu’une partie de la réponse pourrait être apportée par la caractérisation de nouveaux acteurs du métabolisme de l’APP. De part leurs rôles cruciaux dans le cerveau (développement, plasticité et réparations) et dans le métabolisme de l’APP (&#945;-sécrétases), les ADAMs sont des protéines d’intérêt dont certaines fonctions ou rôles restent à déterminer. Précédemment, par une approche transcriptomique ciblant la famille des ADAMs dans des cerveaux de patients et de contrôles, ADAM30 a été retrouvée sous-exprimée dans le cerveau des patients atteints de la pathologie. Dans deux modèles cellulaires nous avions constaté que la sous-expression d’ADAM30 entraînait une augmentation de tous les produits du métabolisme de l’APP comme chez les patients. Le résultat opposé a été obtenu lors de la sur-expression d’ADAM30 dans ces cellules. Pour tenter de répliquer ces résultats dans un modèle plus proche de la physiopathologie humaine, nous avons développé un modèle de souris triples transgéniques surexprimant l’APPSweInd et ADAM30 de manière conditionnelle. Dans ce modèle nous avons observé et mesuré une diminution des dépôts amyloïdes dans le cerveau des souris exprimant ADAM30. Dans un second temps puisqu’il avait été montré au laboratoire qu’ADAM30 ne module pas l’activité des sécrétases et ne clive pas directement l’APP, nous avons cherché à déterminer les substrats d’ADAM30 dans le cadre du métabolisme de l’APP. Par une approche systématique nous avons pu déterminer que la Cathepsine D (CTSD) et l’Insuline Receptor Substrat 4 (IRS4) sont deux substrats potentiels d’ADAM30. Dans nos modèles cellulaires et de souris, nous avons pu constater qu’ADAM30 est capable de cliver et d’activer la CTSD. L’activité de la CTSD semble nécessaire pour l’action d’ADAM30 sur le métabolisme de l’APP. Nous avons pu déterminer que l’action spécifique d’ADAM30 pour la CTSD est dépendante de la séquence d’adressage au lysosome située dans l’extrémité C-terminale de l’APP. Comme la CTSD est une protéine Lysosomale, ADAM30 pourrait favoriser spécifiquement l’activation de la CTSD augmentant ainsi la dégradation de l’APP au sein de la voie endosome/lysosome. Ce mécanisme limiterait l’entrée de l’APP dans son métabolisme et donc la production de peptides amyloïdes. Afin de mieux comprendre la spécificité d’action d’ADAM30 pour la CTSD et l’APP, nous avons commencé à travailler sur le rôle potentiel d’IRS4 et la relation entre la voie de signalisation de l’Insuline et le métabolisme de l’APP. Nos travaux nous ont donc permis de mettre en évidence un nouvel acteur du métabolisme de l’APP, ADAM30, intervenant dans la régulation et la dégradation de ce dernier et ainsi d’améliorer notre compréhension des mécanismes de régulations fins impliqués dans le processus physiopathologique de la maladie d’Alzheimer<br>Progressive intra-cerebral accumulation of amyloid peptides formed after sequential cleavage of the amyloid peptide precursor (APP) by secretases , is a central mecanism for Alzheimer’s disease. Therefore, a better understanding of APP regulation and homeostasy is now crucial. With this background, we postulate that the characterization of new actors in the APP metabolism could provide a more subtle understanding of this APP metabolism and trafficking. From their obvious implication in brain (development, plasticity and repair) and in APP metabolism (&#945;-secretases), ADAMs (A Disintegrin And Metalloprotease) are an important protein proteins family which still have some undetermined function or role. Previously, a transcriptomic approach targeting ADAMs family bas been done at the laboratory on Alzheimer’s patient or control brains and found ADAM30 as under-expressed in Alzheimer’s patient brains. On cellular models, we confirmed that ADAM30 under-expression was associate with an increase in production/secretion of all the APP metabolim byproducts. Opposite results were found with ADAM30 over-expression. To replicate those results in another model closest to human pathophysiology, we have developed a triple transgenic mice model over-expressing APPSweInd and conditionally over-expressing ADAM30. In this model, we have observed and measured a decrease in amyloid deposits in mice brains over-expressing ADAM30. Secondly, because ADAM30 did not modulate secretase activities and did not cleave APP directly, we decided to determine ADAM30 substrats in the APP metabolism context. With a systematic approach, we have determined that Cathepsin D (CTSD) and Insulin Receptor Substrat 4 (IRS4) are two ADAM30 potential substrats. In our cellular models, we have found that ADAM30 is able to cleave and activate CTSD. This CTSD activity is required for ADAM30 action on APP metabolism. We have determined that ADAM30 specific action for CTSD is dependent on lysosome adressing sequence localised in APP C-terminal part. CTSD is a lysosomal protein and so ADAM30 would make CTSD specific activation easier. This mecanism would be able to increase APP degradation in endosome/lysosome pathway and reduce APP entry in its metabolism. To better understand ADAM30 specific action on CTSD and APP, we begin to investigate the potential role of IRS4 and the relation between insulin signaling pathway ans APP metabolism. Combined together, those data suggest that ADAM30 is a new APP metabolism actor, involved in an early APP regulation and degradation pathway dependent on lysosome activation. This study participate in a better understanding of the fine mecanism regulations involved in Alzheimer’s disease pathophysiological process

La Maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise par une perte progressive de synapses et de neurones. La perte de synapses est un marqueur précoce corrélant de façon significative avec le déclin cognitif des patients. Comment le peptide amyloïde Abeta issu du clivage de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) peut induire ces pertes est toujours sujet à débat. Nous avons étudié ce mécanisme dans les souris APPxPresenilin1 knock-in (APPxPS1-KI) qui développent une perte de neurones dans le champ CA1 de l’hippocampe. Nous avons observé que cette perte de neurones est précédée d’une perte de synapses dans la stratum radiatum du CA1. Nous avons montré que ces pertes ne sont pas induites par un stress du réticulum endoplasmique et n’avons pas observé de dépression de l’activité synaptique ou d’augmentation de la dépression à long terme. Des altérations de la morphologie des épines dendritiques sont observées avant la perte de synapses et de neurones associées à un déficit de potentialisation à long terme et des troubles de la mémoire spatiale. Des altérations similaires de la forme des épines sont observées dans les biopsies de patients atteints de MA. Dans les souris ces altérations modifient la compartimentalisation électrique et biochimique de l’épine potentiellement impliquée dans la potentialisation à long terme. Dans les corps cellulaires des souris APPxPS1-KI, une accumulation d’Abeta est observée dans les lysosomes. Une modification du système lysosomal est également observée dans les biopsies de patients. Les altérations du système lysosomal sont spécifiquement observées dans les souris APPxPS1-KI et pourraient être impliquées dans les pertes de synapses et de neurones<br>Alzheimer’s Disease (AD) is characterized by a progressive loss of synapses and neurons. The loss of synapses is an early marker significantly correlating with cognitive decline in patients. How the Amyloid Precursor Protein (APP) cleavage product Amyloid Beta (Abeta) can trigger synapse and neuron loss remains debated. We investigated this mechanism in APPxPresenilin1 knock-in (APPxPS1-KI) mice that were previously shown to present with a loss of pyramidal neurons in the CA1 hippocampus. We observed that this loss of neurons was preceded by a loss of synapses in the stratum radiatum of CA1. We showed that these losses were not induced by an endoplasmic reticulum stress and we did not observe depression of synaptic activity or increase of long-term depression. Alterations of dendritic spine morphology were observed before the loss of synapses and neurons along with a deficit of long-term potentiation and spatial memory troubles. Similar dendritic spines morphological alterations were observed in cortical biopsies from AD patients. In mice, these alterations changed electrical and biochemical compartmentalization of the spines, potentially implicated in long-term potentiation. In APPxPS1-KI neuronal cell bodies, an accumulation of Abeta was observed in the lysosomes. A modification of the lysosomal system was also observed in biopsies from patients. The alterations of the lysosomal system were specifically observed in APPxPS1-KI mice and could be implicated in the loss of synapses and neurons

Les lysosomes sont importants pour la survie et la fonction des cellules du système nerveux central et en particulier des neurones. Le mécanisme de la reformation des lysosomes est crucial pour maintenir une quantité adéquate de lysosomes fonctionnels dans les cellules. La spatacsine, qui joue un rôle dans le ce mécanisme est impliquée dans la paraplégie spastique de type SPG11 ; une maladie caractérisée par des troubles moteurs et cognitifs sévères. L’utilisation de modèles cellulaires de cette pathologie permet d’étudier les mécanismes physiopathologiques à l’origine d’altérations de la reformation des lysosomes. J’ai montré que la perte de fonction de la spatacsine est responsable de l’accumulation de lipides dans les lysosomes. Ces accumulations sont constituées de gangliosides et de cholestérol et sont présentes dans les autolysosomes perturbant leur recyclage en lysosomes, notamment en empêchant le recrutement de protéines impliquées dans le mécanisme. Les accumulations de gangliosides rendent les neurones à l’exposition au glutamate ce qui suggère que ces altérations pourraient avoir un rôle dans la neurodégénérescence. J’ai aussi montré que l’absence de spatacsine provoque une dérégulation de l’import de Ca2+ extracellulaire par le « store-operated calcium entry » ce qui conduit à altération de l’homéostasie calcique. L’inhibition de l’import de calcium par le SOCE permet de réduire les accumulations de lipides et de rétablir partiellement le recyclage des lysosomes. Ainsi, l’absence de spatacsine induit une altération de l’homéostasie calcique qui participe à l’accumulation de lipides dans le système lysosomal ce qui est délétère pour la survie des neurones<br>Lysosomal dysfunctions are involved in a large number of neurodegenerative diseases highlightingthe crucial function of lysosomes in neuron survival and function. The mechanism of lysosomereformation from autolysosomes allow cells to maintain the ool of functional lysosomes.Disruptions of this rocess are involved in athologies affecting the central nervous system. Inparticular, spatacsin that lays a role in lysosome recycling is implicated in hereditary spasticparaplegia type SPG11, a severe disease characterized by motors and cognitive alterations. Thispathology is caused by loss of function mutations in SPG11, encoding spatacsin. The study ofSPG11 cellular models gives the opportunity to decipher the hysiopathological mechanismsunderlying lysosomal reformation disruptions.During my thesis, I showed that loss of spatacsin function induces lipid accumulation in lysosomesand articularly in autolysosomes both in fibroblasts and neurons from Spg11-/- mice. Gangliosidesand cholesterol are among lipids that accumulate in autolysosomes impairing lysosomal membranerecycling by disrupting the recruitment of keys roteins. Neurons with ganglioside accumulationsare more sensitive to glutamate induced neuronal death, suggesting that these accumulations areinvolved in neurodegeneration. These results could be of great importance since accumulations ofgangliosides in lysosomes arise in many diseases.I also showed that loss of spatacsin disrupts extracellular calcium import by the store-operatedcalcium entry (SOCE) leading to an increase in cytosolic calcium levels. Lysosomal calcium contentis also increased in Spg11-/- cells and calcium release from lysosome by TRPML1 is reduced.Inhibiting SOCE and stimulating lysosomal calcium release by TRPML1 reduced lipidsaccumulations in lysosomes and artially restored lysosome reformation.Our data suggest that absence of spatacsin is responsible for a disruption of calcium homeostasisthat contributes to lipid accumulation in autolysosomes, disturbing reformation of lysosomes fromautolysosomes. Inhibiting gangliosides synthesis could be used as a therapeutic strategy. However,understanding how loss of function of spatacsin alters these cellular athways will allow thedevelopment of targeted therapeutic approaches

Ce travail porte sur l'étude du transport axonal rétrograde de deux protéines modèles : la glucose oxydase et la β-galactosidase. Le but est de vérifier les conditions dans lesquelles des protéines peuvent être capturées par des terminaisons nerveuses et, par transport (axonal et transsynaptique), migrer jusqu'au système nerveux central. L'ensemble de ce travail s'inscrit dans une problématique visant à faire pénétrer dans le cerveau des protéines qui soient douées d'activité biologique, pour palier à des déficits enzymatiques dans le système nerveux, ou qui servent de transporteur à des molécules bio-actives, leur permettant ainsi de contourner la barrière hémato-encéphalique. Peu de travaux ont été consacréss à ces approches au cours de la dernière décennie. Apres injection intramusculaire des enzymes modèles dans le muscle gastrocnémien de souris, leur éventuel transport axonal a été déterminé en dosant dans diverses parties anatomiques, dans des sections nerveuses et dans le cerveau : 1) l'activité résiduelle par dosage immunoenzymatique, et 2) la radioactivité associée à ces protéines (marquées préalablement avec du 14C-saccharose). Les résultats montrent une faible activité enzymatique associée au nerf sciatique ainsi qu'un faible pourcentage de radioactivité (moins de 0,2%) associée également à la moelle épinière et au cerveau. Ces résultats sont en faveur d'un transport axonal rétrograde de protéines permettant à celles-ci de contourner la barrière hémato-encéphalique. Etant donné l'absence de récepteurs permettant une capture efficace de ces protéines modèles, il semble qu'elles puissent être capturées par pinocytose par les terminaisons nerveuses.

La maladie de Pompe est une maladie lysosomale causée par des mutations sur l'enzyme α-glucosidase acide (GAA), responsable de la dégradation du glycogène lysosomal. Le déficit en GAA provoque l'accumulation de glycogène dans de multiples tissus, conduisant à une maladie neuromusculaire complexe avec une morbidité et mortalité élevées. En plus des symptômes connus, nos études montrent que le déficit en GAA affecte l’activation et le fonctionnement des cellules immunitaires chez les patients et le modèle murin de la maladie de Pompe. En particulier, nous avons observé une suractivation des cellules T effectrices, ainsi qu’un défaut dans l’induction et la fonction des cellules T régulatrices (Tregs). De plus, les souris atteintes de la maladie de Pompe présentent de l’inflammation tissulaire précoce, ce qui pourrait contribuer à la physiopathologie de la maladie. Ces résultats pourraient ouvrir des nouvelles voies pour étudier des stratégies qui retardent la progression de la maladie. Dans une deuxième série d'expériences, nous montrons qu'une thérapie génique ciblée au foie avec un transgène GAA sécrétable conduit à une meilleure correction de la maladie dans un modèle murin immunodéficient de la maladie, par rapport au traitement enzymatique substitutif existant. Étant donné que les Treg jouent un rôle essentiel dans la thérapie génique ciblée au foie, en induisant une tolérance immunitaire vers les transgènes hépatiques, de futures études devront évaluer l'impact des altérations immunitaires associées à cette maladie sur l'efficacité de la thérapie génique<br>Pompe disease is a lysosomal storage disease caused by mutations on the enzyme acid α-glucosidase (GAA), responsible for degrading lysosomal glycogen. GAA deficiency causes the accumulation of glycogen in multiple tissues, particularly in muscles and central nervous system, leading to a complex neuromuscular disease with high morbidity and mortality. In addition to the known symptoms, our studies in Pompe disease patients and mice show that GAA deficiency affects the activation and function of immune cells, particularly of T cells, leading to a higher activation of effector cells and impaired induction and suppressive function of regulatory T cells (Tregs). Moreover, Pompe disease mice present tissue inflammation at early stages of the disease, altogether suggesting that alterations in the immune system could contribute to the disease pathophysiology. These findings could open new venues to investigate strategies that delay the progression of the disease. In a second set of experiments we show that liver-directed gene therapy with a secretable GAA transgene results in superior disease rescue in an immunodefficient Pompe disease mouse model, when compared to the current enzyme replacement therapy. Because Tregs play an essential role in liver-directed gene therapy, by inducing immune tolerance towards hepatic transgenes, future studies will have to evaluate the potential impact of immune alterations associated to Pompe disease on the efficacy of liver-targeted gene transfer<br>La enfermedad de Pompe es una enfermedad lisosomal (lysosomal storage disease, LSD) causada por mutaciones en la enzima α-glucosidasa ácida (GAA), que hidroliza el glucógeno en glucosa en los lisosomas. La disfunción de esta enzima causa la acumulación de glucógeno en múltiples tejidos, principalmente en células musculares y neuronas. Como resultado, los pacientes desarrollan hipertrofia cardíaca, debilidad muscular, insuficiencia respiratoria, alteraciones cognitivas y muerte prematura por paro cardiorrespiratorio. Actualmente la enfermedad de Pompe se trata con terapia de reemplazo enzimático (Enzyme replacement therapy, ERT) con GAA recombinante humana (rhGAA). Este tratamiento ha demostrado corregir la patología cardíaca y extender la esperanza de vida de los pacientes. Sin embargo, la eficacia de la ERT en los músculos respiratorios y esqueléticos es parcial, y nula en el sistema nervioso central (SNC). Además, la proteína rhGAA es altamente inmunogénica, por lo que el tratamiento no es efectivo en ciertos pacientes. Otros inconvenientes son el elevado coste de la ERT y la necesidad de infusiones continuadas a lo largo de la vida del paciente. En este estudio mostramos que la terapia génica dirigida al hígado mediante vectores adeno-asociados (AAV) expresando una versión modificada de la GAA revierte de forma significativa la enfermedad a nivel de la musculatura esquelética y del SNC, en un modelo animal de la enfermedad de Pompe. Además, mostramos que este tratamiento es superior en eficacia al tratamiento estándar por ERT, incluso a dosis reducidas de vector AAV. Con tal de comprender mejor los mecanismos de acción de estos dos tratamientos, hemos llevado a cabo un estudio farmacocinético de los niveles de GAA en circulación y en múltiples tejidos en los dos casos. Dicho estudio muestra que niveles reducidos pero constantes de GAA en circulación proporcionados por el hígado permiten una mayor acumulación de GAA en los tejidos en comparación a la ERT, mejorando así la eficacia del tratamiento. Debido a que las reacciones inmunes contra el vector AAV y el transgén son un obstáculo importante en la aplicación clínica de la terapia génica, y a que alteraciones en los lisosomas han demostrado tener un impacto sobre el sistema inmune en diferentes modelos, también hemos estudiado el sistema inmune en el caso de la enfermedad de Pompe. Mediante estos estudios, hemos observado que la acumulación de glucógeno en los lisosomas de células inmunes está asociada a una mayor activación de estas células, tanto en pacientes como en ratones con enfermedad de Pompe, y particularmente en las células T. Además, ratones con enfermedad de Pompe presentan inflamación en los tejidos ya en las primeras etapas de la enfermedad. Por otra parte, mostramos que el mayor estado de activación de las células T podría deberse a alteraciones en el metabolismo de estas células, como resultado de las alteraciones lisosómicas. Finalmente, los ratones con enfermedad de Pompe presentan un defecto en la inducción de células T reguladoras Foxp3+ (Tregs), y estas células tienen un menor potencial inhibidor en comparación con Tregs de ratones sanos. Alteraciones en el sistema inmunitario podrían contribuir a la fisiopatología de la enfermedad. Por lo tanto, estos hallazgos podrían abrir nuevos caminos para investigar estrategias que retrasen la progresión de la enfermedad. Además, las Tregs juegan un papel esencial en la terapia génica dirigida al hígado, mediante la inducción de tolerancia inmune hacia transgenes expresados por hepatocitos. Por lo tanto, futuros estudios deberán evaluar el impacto de las alteraciones inmunitarias asociadas a la enfermedad de Pompe sobre la eficacia de la terapia génica<br>La malaltia de Pompe és una malaltia lisosomal (lysosomal storage disease, LSD) deguda a mutacions en l'enzim α-glucosidasa àcida (GAA), que hidrolitza el glicogen en glucosa als lisosomes. La disfunció d'aquest enzim causa l'acumulació de glicogen en múltiples teixits, principalment en cèl·lules musculars i neurones. Com a resultat, els pacients presenten hipertròfia cardíaca, debilitat muscular, insuficiència respiratòria, alteracions cognitives i mort prematura per aturada cardiorespiratòria. Actualment, la malaltia de Pompe és tractada amb teràpia de reemplaçament enzimàtic (Enzyme replacement therapy, ERT) amb GAA recombinant humana (rhGAA). Aquest tractament ha demostrat corregir la patologia cardíaca i estendre l'esperança de vida dels pacients. No obstant, l'eficàcia de l'ERT en els músculs respiratoris i esquelètics és parcial, i nul·la en el sistema nerviós central (SNC). A més, la proteïna rhGAA és altament immunogènica, de manera que el tractament no és efectiu en certs pacients. Altres inconvenients són l'elevat cost de l'ERT i la necessitat d'infusions continuades al llarg de la vida del pacient. En aquest estudi mostrem que la teràpia gènica dirigida al fetge mitjançant vectors adeno-associats (AAV) expressant una versió modificada de la GAA millora de forma significativa la malaltia a nivell de la musculatura esquelètica i del SNC, en un model animal de la malaltia de Pompe. A més, mostrem que aquest tractament és superior en eficàcia al tractament estàndard per ERT, fins i tot a dosis reduïdes de vector AAV. Per tal de comprendre millor els mecanismes d'acció d'aquests dos tractaments, hem dut a terme un estudi farmacocinètic dels nivells de GAA en circulació i en múltiples teixits en ambdós casos. Aquest estudi mostra que nivells reduïts però constants de GAA en circulació proporcionats pel fetge permeten una major acumulació de la GAA en els teixits en comparació a la ERT, millorant així l'eficàcia del tractament. Degut a que les reaccions immunes contra el vector AAV i el transgèn són un obstacle important en l'aplicació clínica de la teràpia gènica, i a que alteracions en els lisosomes han demostrat tenir un impacte sobre el sistema immune en differents models, també hem avaluat el sistema immune en el cas de la malaltia de Pompe. Mitjançant aquests estudis, hem observat que l'acumulació de glicogen en els lisosomes de les cèl·lules immunes està associada a una major activació d'aquestes cèl·lules en pacients i ratolins amb malaltia de Pompe, particularment en les cèl·lules T. A més, ratolins amb malaltia de Pompe presenten inflamació dels teixits ja en les primeres etapes de la malaltia. D’altra banda, hem observat que el major estat d'activació de les cèl·lules T podria ser degut a alteracions en el metabolisme d'aquestes cèl·lules, com a resultat de les alteracions lisosomals. Finalment, els ratolins amb malaltia de Pompe presenten un defecte en la inducció de cèl·lules T reguladores Foxp3+ (Tregs), i aquestes cèl·lules tenen un menor potencial inhibidor en comparació amb les Tregs de ratolins sans. Alteracions en el sistema immunitari podrien contribuir a la fisiopatologia de la malaltia. Per tant, aquestes observacions podrien obrir nous camins a l’hora d’investigar estratègies que retardin la progressió de la malaltia. A més, les Tregs juguen un paper essencial en la teràpia gènica dirigida al fetge, mitjançant la inducció de tolerància immune cap a transgens expressats per hepatòcits. Per tant, futurs estudis hauran d'avaluar l'impacte de les alteracions immunitàries associades a la malaltia de Pompe sobre l'eficàcia del tractament per teràpia gènica

Les glycannes des glycoprotéines sont impliqués dans de multiples processus biologiques, tels que l'inflammation, l'immunité, le développement et la reproduction. Ils sont responsables des nombreuses propriétés physicochimiques, immunologiques et biologiques des glycoprotéines. Ils peuvent, de fait, moduler les propriétés pharmacologiques des glycoprotéines recombinantes thérapeutiques. Leur importance a également été démontrée par la sévérité des présentations cliniques et les taux de morbidité / mortalité de CDG. Cependant, la médecine moderne manque cruellement d'outils glycobioanalytiques permettant l'exploration de ces métabolismes, à grand échelle. Les objectifs de notre thèse étaient donc fondés sur la mise au point d'approches et d'outils glycobioanalytiques, basés sur l'utilisation de la spectrométrie de masse appliqués à l'étude de la glycosylation d'une glycoprotéine d'intérêts biologiques, l'a-mannosidase lysosomale (LAMAN), et à l'étude de fluides biologiques d'intérêts, tels que le plasma sanguin et l'urine, qui regorgent de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques spécifiques, formés au cours de pathologie congénitales de la biosynthèse (CDG) et du catabolisme (glycoprotéinoses) des glycoprotéines. La première partie de notre travail de thèse a consisté en la caractérisation structurale de la glycosylation de la LAMAN bovine, qui constitue notre modèle d'étude de la LAMAN humaine et de la pathogénése moléculaire de l'a-mannosidose. Nous avons pu déterminer la structure détaillée d'une vingtaine de N-glycannes ainsi que leur positions sur six des huit sites de glycosylation de la LAMAN bovine. Les résultats obtenus constituent un base solide pour l'étude de la glycosylation de la LAMAN humaine recombinante, dédiée à l'évaluation de son efficacité thérapeutique dans le traitement expérimental de l'a-mannosidose. La seconde partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point de méthodologies de glycomique dédiées au profilage et à la caractérisation structurale de glycobiomarqueurs urinaires diagnostiques des glycoprotéinoses. Dans un premier temps, nous décrivons une méthode de profilage complet des oligosaccharides et de glycoasparagines urinaires perméthylés, par MALOI-TOF-MS, reflets du catabolisme Iysosomal de glycoprotéines cellulaires, par la microanalyse de 20 µL d'urine de patients. Dans un second temps, appliquée, à l'étude des oligosaccharides urinaires d'un patient atteint d'une ß-mannosidose, nous avons pu identifier et partiellement caractériser neuf nouvelles structures, jamais décrites chez l'homme. Enfin, la dernière partie de notre travail de thèse a consisté en la mise au point d'une approche glycobioanalytique globale permettant d'explorer les processus de g!ycosylation des protéines. Dans cette étude, nous décrivons une méthode de profilage rapide du N- et du O-glycome des glycoprotéines sériques totales par MALOI-TOF-MS, par la microanalyse de 30 µL de sérum, permettant la détection et la caractérisation de glycofonnes anormales, formées au cours des CDG. Appliquées au sérum de patients souffrant de CDG-lla et d'une déficience en protéine COG 1, cette stratégie a permis de mettre en évidence et de caractériser de précieux glycobiomarqueurs diagnostiques de ces maladies<br>Glycoprotein-derived glycans are involved in numerous biological processes , such as inflammation, immunity. development and reproduction. They are responsible for numerrous physicochemical, immunological and biological properties of glycoproteins, and, they can modulate the pharmacological properties of therapeutic recombinant glycoproteins. Their importance has been demonstrated by the severity of the clinical pictures and the high level of morbidity and mortality of patients suffering from congenital disorders of glycosylatlon (COG). Therefore, in the field of clinical chemistry, there is a lack of glycobioanalytica! tools for the exploration of the glycoprotein-derived glycan metabolism. Then, the objectives of our thesis was founded on the development of glycobioanalytical approaches, relied on mass spectrometry, applied to the study of the glycosylation of biologically interesting glycoproteins, such as LAMAN, or biological fluids, such as blood plasma and urine, known to contain numerous specific diagnostic and/or prognostic glycobiomarkers, yielded during congenital defect in the biosynthesis (CDG) and in the catabolism (glycoproteinoses) of glycoprotein-derived glycans. The first step of our thesis consisted in the site-specifie glycosylation analysis of bovine LAMAN, whlch constltutes our model of study of the human enzyme and of the molecular pathogenesis of a-mannosidosis. The detailed structures as well as their distribution within six of eight glycosy!ation:sites were determined. These results constitute a solid basis of work for the site-specific glycosylation analysis of the human recombinant LAMAN, in order to evaluate its therapeutic efficiency in the experimental treatment of a-mannosidosis. The second step of our thesis consisted in the elaboration of mass spectrometry methodologies for the profiling as well as the structural characterization of ths urinary oligosaccharides an glycoasparagmes, as valuable glycoprotemoses-assoclated glycobiomarkers. Applled to the mass profilinïg of urinary oligosaccharides of a patient suffering from ß-mannosidosis, nine new structures, never described in man, were identified and partially characterized. Finally, the last part of our thesis consisted in the elaboration of a global glycobloanalytlcal methodology, enablrng the exploratIon of g/ycosylation prccesses of cellular proteins. ln this study we described a.rapid mass spectrometric strategy for the structural characterization of N- and O-glycan chams ln the dlagnosis of genetlc defects in glycan blosynthesis. Applied to patients suffering from CDG-lla and CDG-llg ,valuable diagnostic glycobiomarkers were identified

Les processus moléculaires mis en jeu lors de maladies de surcharge lysosomale (MSL) et qui conduisent à des dysfonctions neuronales sont peu connus. Afin de mieux comprendre comment s’opèrent ces dysfonctions neuronales associées à la mucopolysaccharidose de type VII (MPS VII), une MSL causée par la déficience en l’activité enzymatique de la ß-glucuronidase, nous avons généré des neurones humains MPS VII à partir cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Grâce à la reprogrammation des fibroblastes de patients MPS VII, nous avons généré et caractérisé des neuroprécurseurs dérivés d’iPSC (NSC) et des neurones. Les iPSC MPS VII ont été positives pour les tests de pluripotence (activité de la phosphatase alcaline, expression des marqueurs de pluripotence SSEA3, TRA-2-49 et Nanog par immunofluorescence et expression des gènes de pluripotence SOX2, Oct4 et Lin28 par qRT-PCR, formation des corps embryonnaires et génération de cellules dérivées des trois feuillets embryonnaires in vivo par la formation de tératomes) et présentaient un caryotype normal. Les NSC dérivés d’iPSC exprimaient les marqueurs Nestin et SOX2, et ont été utilisés pour générer des neurones. Les neurones MPS VII exprimaient des marqueurs neuronaux comme MAP2, formaient des synapses et présentaient une activité calcium-dépendante.Afin d’identifier les dysfonctions moléculaires présentes dans la MPS VII, nous avons comparé les NSC et les neurones, avec ou sans milieu conditionné contenant l’enzyme recombinante humaine de la ß-glucuronidase (rhGUS), enzyme actuellement utilisée en phase 1/2, de chez Ultragenyx. Cette enzyme est internalisée par les cellules, rejoint leurs lysosomes et corrige les dysfonctions lysosomales de la MPS VII, restaurant ainsi un phénotype cellulaire physiologique (phénomène aussi appelé ‘enzyme replacement therapy’ (ERT)). Ces diverses conditions nous permettent d’éviter la variabilité clonale des iPSC, et de mieux identifier les déficiences neuronales, corrigées par l’ERT, qui sont associées à la MPS VII<br>The molecular pathways linking lysosomal storage diseases (LSD) to neuronal dysfunction are poorly understood. To better understand neuronal dysfunction associated with mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII), a LSD due to deficiency in ß-glucuronidase activity, we generated human MPS VII neurons from induced pluripotent stem cells (iPSC). Starting from MPS VII patient fibroblasts, iPSC-derived neural stem cells (NSC) and neurons were generated and characterized. MPS VII iPSC were positive for pluripotency tests (alkaline phosphatase activity, expression of pluripotency markers SSEA3, TRA-2-49 and Nanog by immunostaining and pluripotency gene SOX2, Oct4 and Lin28 expression by qRT-PCR, embryonic bodies formation and generation of cells derivated from the three germ layers in vivo by teratoma formation) and had a normal karyotype. IPSC-derived NSC expressed the markers Nestin and SOX2, and were used to generate neurons. MPS VII neurons expressed mature neuronal markers as MAP2, formed synapses and displayed a calcium-dependent activity. To identify molecular defects in MPS VII, we compared NSC and neurons, with or without conditioned medium containing a recombinant human ß-glucuronidase (rhGUS), enzyme currently used in phase 1/2, from Ultragenyx. This enzyme is taken up by cells, reaches their lysosoms and corrects MPS VII lysosoms dysfunctions, restoring cells to healthy phenotype (phenomena also called enzyme replacement therapy (ERT)). Our assays allow us to circumvent clonal variability associated with iPSC, and to better identify neuronal defects, corrected by ERT, which are associated with MPS VII disease

La mucopolysaccharidose de type VII (MPS VII) est une maladie génétique de surcharge lysosomale provoquée par une déficience en β-D-glucuronidase (β-glu). β-glu est impliquée dans la cascade de dégradation et de recyclage des glycosaminoglycannes (GAGs). Sa déficience provoque une accumulation vésiculaire de GAGs non dégradés engendrant in fine la mort cellulaire. Notre but est de développer et de tester la pertinence des vecteurs adénoviraux canins helper-dépendant (HD-CAV-2) pour traiter la neurodégénération provoquée par la MPS VII dans le cadre d'une thérapie génique dans le SNC de chien. Parce que les vecteurs CAV-2 transduisent préférentiellement les neurones et qu'ils sont transportés de manière rétrograde le long des axones, leurs distributions dans tout le SNC permettraient de délivrer largement la β-glu dans tout le parenchyme cérébral. Nous avons alors étudié la sureté, la durée d'expression, l'efficacité et la possible réversion du phénotype après injections dans le SNC de chiens MPS VII d'un HD-CAV-2 exprimant le gène humain de la GUSB : HD-RIGIE. Des études préliminaires ont montré la faisabilité du transfert des vecteurs HD-CAV-2 dans le SNC, qu'ils induisaient une réponse immunitaire minimale et qu'ils transduisaient préférentiellement, efficacement et largement les neurones.Nous avons produit un HD-RIGIE de qualité pour les injections intracérébrales et nous avons analysé son efficacité sur l'accumulation de GAGs non dégradés. Les injections de HD-RIGIE montrent une augmentation générale de l'activité β-glu dans tout le SNC des chiens MPS VII (sites d'injections et structures éloignées comme le cortex) et ce 1 mois ou 4 mois après les injections. L'analyse de la GFP confirme une distribution globale de HD-RIGIE dans le SNC d'animaux de grande taille. De plus, grâce aux propriétés intrinsèques de la β-glu (transport rétrograde et phénomène de libération/recapture), nous avons observé une diminution générale de l'accumulation vésiculaire neuronale des GAGs non dégradés dans tout le parenchyme cérébral. D'autre part grâce à la stratégie d'isolement et de non vaccination des chiens MPS VII, nous n'observons ni de réponse immunitaire humorale, ni d'aggravation de l'inflammation du parenchyme<br>Mucopolysaccharidosis type VII (MPS VII) is a rare inherited lysosomal storage disease caused by β-D-glucuronidase (β-glu) deficiency. β-glu is involved in the physiological turnover of glycosaminoglycans (GAGs). Its deficiency causes accumulation of undegraded GAGs inside vesicles leading to cell death. Our goals are to develop and test the clinical relevance of helper-dependant (HD) canine adenovirus type 2 (CAV-2) vectors to treat neural degeneration caused by MPS VII in a dog model. Because CAV-2 targets preferentially neurons and traffics via axons, the distribution of the transgene throughout the CNS will allow widespread delivery of the missing lysosomal enzyme in these disorders with a minimum number of injections. We tested a HD-CAV-2 vector expressing the human GUS gene in the canine model of MPS VII for their safety, efficacy, duration of expression and possible reversion of the MPS VII induced symptoms.A previous study based on HD-CAV-EGFP vector injections in MPS VII-/- and healthy dogs showed that we are now able to inject HD-CAV-2 in the dog brain, have a minimal induction of the immune response, an efficient transduction of the neurons and an efficient biodistribution of transduced cells. After the production of a suitable vector (HD-RIGIE) for injections in the CNS of MPS VII dogs we analysed its efficiency on GAGS storage in neurons.Injections of HD-RIGIE showed after 1 month or 4 months post injections a widespread increase in general level of β-glu activity, in the sites of injections and in distant areas such as cortex. Analysis of GFP, also permit to observe a widespread biodistribution of the vector. Because of β-glu property of cross-correction we observed a global decreased in GAGs storage in the entire MPS VII brains. Finally, the dogs did not present humoral immune response and no aggravation of inflammation

L'X-ALD et la P-NALD sont deux maladies peroxysomales, métaboliques et neurodégénératives rares. L'X-ALD et la P-NALD résultent de déficiences respectives en ABCD1 et ACOX1. Ces deux maladies dans leurs formes sévères sont associées à des phénomènes de démyélinisation inflammatoire du SNC. Au niveau des lésions, des signes d'oxydation et une mort cellulaire sont observés. L'accumulation des AGTLC plasmatiques et tissulaires est le critère biochimique commun à ces deux maladies. Dans un premier temps, nous avons caractérisé une lignée d'oligodendrocytes murins 158N afin de l'utiliser comme modèle. Cette lignée qui présente des caractéristiques d'oligodendrocytes matures (expression des protéines de myéline MOG, MBP, PLP) possède aussi des peroxysomes fonctionnels possédant les protéines Abcd1 et Acox1. Ensuite, nous avons étudié les effets cytotoxiques et pro-oxydants des AGTLC (C24:0 et C26:0), ainsi que l'incidence de l'extinction d'Abcd1 et d'Acox1 par siRNA sur l'équilibre RedOx et la mort cellulaire. Les effets des AGTLC sur les caractéristiques biophysiques de la membrane cytoplasmique ont aussi été abordés. Par ailleurs, des marqueurs du stress oxydant ont été recherchés sur des plasmas des patients atteints de différentes formes d'X-ALD. In vitro, nous avons montré que l'accumulation d'AGTLC dans les cellules 158N induit une surproduction d'espèces radicalaires de l'oxygène et de l'azote et une perturbation des défenses anti-oxydantes (catalase, SOD, GSH). Ceci s'accompagne d'une peroxydation lipidique, d'une carbonylation des protéines et d'une dégradation de l'ADN. L'extinction d'Abcd1 et d'Acox1 par des siRNA augmente la production d'espèces radicalaires et potentialise le stress oxydant induit par les AGTLC. Sur les plasmas de patients atteints de différentes formes d'X-ALD, comparativement à des sujets sains, nous avons montré l'accumulation des produits de peroxydation lipidiques (7-hydroxycholestérols, HODEs). Le taux de ces deux produits est corrélé avec la sévérité de la maladie: CCALD>AMN>Addison>ACALD. Les AGTLC induisent aussi la mort des cellules 158N par un processus non apoptotique. Cette mort cellulaire est caractérisée par: une perturbation rapide du calcium intracellulaire, une diminution du pH, une chute du potentiel transmembranaire mitochondrial associée à des modifications structurales des mitochondries, une déstabilisation des lysosomes et une formation de figures d'autophagie. Les AGTLC perturbent aussi la fluidité membranaire. Par ailleurs, les AGTLC n'affectent pas l'expression des protéines majeures de la myéline PLP et MBP. Ces travaux ont mis en évidence un lien direct entre l'accumulation des AGTLC, le stress oxydant et l'induction de mort cellulaire faisant intervenir les lysosomes. La déficience en Abcd1 et Acox1 favorise le stress oxydant. En accord avec les résultats obtenus in vitro, la mise en évidence de marqueurs de peroxydation lipidiques dans le plasma de malades atteints d'X-ALD conforte l'hypothèse d'une intervention du stress oxydant dans cette pathologie.