Santos, Sara Isabel Rodrigues dos. "ERBB2 and TWIST1 genes survey in cat mammary tumours: nucleic acids sequences and expression changes." Doctoral thesis, 2015. http://hdl.handle.net/10348/4668.
Abstract:
Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica<br>As causas genéticas do cancro incluem várias alterações genómicas nomeadamente
substituições/amplificações/deleções e epigenéticas que normalmente ocorrem em genes
críticos de cancro, como o ERBB2 e o TWIST1. Nas lesões mamárias de gato (CML), tal como
para o cancro de mama humano (HBC), os marcadores moleculares têm uma importância vital
na categorização dos subtipos de lesões. Neste trabalho de doutoramento foram estudados os
oncogenes ERBB2 e TWIST1 no gato, no que diz respeito ao DNA, RNA e respetivas proteínas
(neste caso, apenas para o ERBB2), os quais podem estar relacionados com o início e progressão
de CML. Deste modo, as potenciais correlações entre os resultados obtidos e as características
das CML foram também analisadas.
Este trabalho de doutoramento começou com a optimização da extracção de DNA
genómico (gDNA) de elevada qualidade a partir de tecidos fixados-em-formalina e embebidosem-
parafina (FFPET), que resultou num protocolo já publicado. O elevado nível da informação
obtida ao longo do trabalho deveu-se à qualidade do gDNA e ao número e tamanho das
sequências amplificadas, tanto nas amostras das lesões como das normais, que permitiu a
deteção de variantes de sequência nos diferentes fragmentos dos genes ERBB2 e TWIST1.
No primeiro estudo conduzido no gene ERBB2 no gato, o fragmento analisado incluiu os
exões 17 a 20. A análise genómica revelou que 2/5 das variantes de sequência (SVs) e 2/6 dos
haplotipos detetados, são exclusivos das amostras de CML. Uma associação promissora foi
ainda identificada entre as variantes de haplotipos e dois fatores de prognóstico de CML:
tamanho do tumor primário e número de massas. A análise bioinformática permitiu concluir
que 4 das SVs detetadas podem ser responsáveis pela ocorrência de transcriptos alternativos e,
consequentemente, de isoformas diferentes da proteína erbB-2.
Num segundo passo, foi possível isolar a região entre os exões 10 a 15 do ERBB2 no gato.
Neste fragmento foi observada uma categorização clara de haplotipos entre o normal e as
CMLs. Foi ainda obtido um modelo de homologia 3D para a proteína erbB-2 do gato. A análise
de 3 SVs não-sinónimas correspondentes a 3 alterações de aminoácidos, provavelmente
responsáveis por danos na estrutura 3D da erbB-2, podendo ainda interferir na interacção entre
a erbB-2 e o anticorpo terapêutico trastuzumab. Foi ainda analisado o status do ERBB2 em gato
tendo-se concluído que não se encontra amplificado, apresentando ainda um nível mais baixo
de expressão nas lesões mamárias em relação às amostras normais. Os baixos níveis de expressão de RNA do gene ERBB2, bem como da proteína foram já indicados como estando
relacionados com malignidade e com mau prognóstico nas CML.
Neste trabalho de doutoramento, foi pela primeira vez caracterizado o gene TWIST1 no
gato, tendo sido sequenciado um fragmento de DNA com 960 bp em amostras normais. O
isolamento e sequenciação de um fragmento de cDNA deste mesmo gene (201 bp) revelam que
o TWIST1 é transcrito no gato, tendo-se observado um elevado grau de similaridade das
sequências de DNA e cDNA desta espécie com o Homem. Foi ainda realizado o mapeamento
físico in silico do gene TWIST1 no ideograma do gato, localizando-se especificamente o gene
no cromossoma A2, banda q21.3.
Na tentativa de compreender o papel das SVs do TWIST1 no processo tumoral mamário
do gato, foram pesquisadas variantes na sequência de DNA do gene, tendo sido detetadas 2
SVs, classificadas como potenciais variantes da linha germinativa, sendo improvável a sua
associação com o processo neoplásico. A análise do mRNA do gene TWIST1 no gato por qRTPCR
revelou um nível mais baixo de expressão nas lesões malignas em comparação com as
benignas. Os nossos resultados sugerem que a função do gene TWIST1 nas CML não está,
provavelmente, relacionado com as SVs encontradas, à semelhança do que o ocorre em HBC.
De uma forma geral, a importância clínica do nível reduzido e/ou da variação na expressão do
TWIST1 durante o processo tumoral, sugere uma maior associação com o “switch” inicial da
neoplasia e da progressão para a metastização.
Em conclusão, este trabalho representa o primeiro esforço na investigação de variantes
de sequência em tecidos normais e em lesões mamárias da espécie Felis catus para ambos os
genes ERBB2 e TWIST1. As SVs, os haplotipos, os transcritos e as alterações detetadas na
proteína do gene ERBB2 analisado e correlacionados com as características clinicopatológicas
das lesões mamárias de gato, revelaram a importância deste gene nas CMLs, tal como ocorre
no Homem e realçam a importância destes estudos moleculares, especialmente nos subtipos
HER2 negativos. Adicionalmente, vários foram os dados obtidos e publicados ao longo deste
trabalho que indicam a utilização dos tumores mamários espontâneos de gata como modelo
para o HBC.
No que diz respeito à avaliação do gene TWIST1 em CMLs, os níveis baixos de expressão
observados nas lesões malignas estão de acordo com evidências recentes em HBC. O
comportamento similar do gene nas duas espécies é encorajador para a prossecução da sua
investigação, na tentativa de melhor caracterizar os padrões de expressão ao nível do RNA e da proteína em CMLs. Mais uma vez, os resultados apresentados nesta tese reúnem evidências
para uma análise comparativa direita entre as lesões mamarias de gato e o cancro de mama humano.<br>The genetic causes of cancer include genomic sequence switches/amplifications/deletions
and epigenetic alterations that often occur in cancer critical genes as ERBB2 and TWIST1
oncogenes. In cat mammary lesions (CML), as for human breast cancer (HBC), the molecular
markers are greatly important to categorise lesion subtypes that define clinical and therapeutic
groups. In this PhD work, cat ERBB2 and TWIST1 oncogenes were studied, concerning DNA,
RNA and protein alterations (this last one, only for ERBB2), which may be related with the
initiation and progression of CML. Therefore, the potential correlations between the data
achieved and CMLs clinicopathological features were also analysed.
This PhD work started with the optimization of genomic DNA (gDNA) extraction with
high quality from formalin-fixed paraffin-embedded tissues (FFPET) that resulted in a
published protocol. The high standard in the obtained data was achieved by the gDNA quality
and by the number and size of the genomic sequences amplified, from several CMLs and cat
disease free samples. The large genomic sequences amplified allowed the detection of several
sequence variants from several fragments of ERBB2 and TWIST1 genes.
In the first study of cat ERBB2, the total fragment analysed included exons 17 to 20. The
genomic analysis revealed that 2/5 of sequence variants (SVs) and 2/6 of the haplotypes
detected, were exclusive of CML samples. A promising association was identified between
variant haplotypes and two CMLs prognostic factors: primary tumour size and number of
masses. Bioinformatics analysis indicated that 4 SVs might be responsible for alternative
transcripts and, consequently, for different erbB-2 protein isoforms.
In a second step, cat ERBB2 genomic sequence from exons 10 to 15 was completely
obtained. Also, for the first time a tri-dimensional homology model for erbB-2 cat protein was
accomplished. In ERBB2 DNA fragment, an undoubtedly haplotype categorisation
distinguishes the normal from CML samples. The analysis of the 3 non synonymous SVs
detected revealed to correspond to 3 amino acid changes, proposed to be probably damaging
for cat erbB-2 tri-dimensional structure and may interfere with the interaction between erbB-2
protein and the therapeutic antibody trastuzumab. It was also analysed the expression status of
cat ERBB2, showing no DNA amplification and a lower mRNA and protein expression levels
in mammary lesions than in normal samples. Additionally, ERBB2 RNA and erbB-2 protein
low expression levels were indicated as being correlated with malignity and worse clinical
outcome of the mammary lesions.
In this PhD work, for the first time, it was characterized the cat TWIST1 gene. A genomic
fragment from the cat TWIST1 gene was isolated and sequenced in cat normal samples. The
isolation and sequencing of a cat TWIST1 complementary DNA fragment (201 bp), also
demonstrated that this is a transcribed gene, showing the cat TWIST1 sequences a high
similarity with the human counterpart. In this work it was also in silico physically mapped
TWIST1 gene in the cat G-banding ideogram, namely in chromosome A2, band q21.3.
In an attempt to understand TWIST1 gene SVs role in cat mammary oncology, we
searched for variants in TWIST1 DNA sequence. We detected 2 SVs, classified as potential
germline variants, being improbable its association with neoplasia. The cat TWIST1 mRNA
analysis by qRT-PCR revealed lower expression levels in malignant than in benign mammary
lesions. Our results suggest that the role of TWIST1 gene in CML is probably not related with
the observed genomic changes as referred for HBC studies. Generally, the clinical importance
of the low and/or variable TWIST1 expression levels during the multistep process, point toward
a major association with the initial “switch” to neoplasia and with the final progression toward
metastasis.
In conclusion, this work represents the first attempt to examine genomic sequence
variants in normal tissues and mammary lesions from Felis catus, to both genes, ERBB2 and
TWIST1. The SVs, haplotypes, transcripts and the protein changes disclosed in ERBB2 gene,
associated to the CML clinicopathological features, revealed the importance of these molecular
studies in CML analysis, as it happens in human and highlight the importance of these
molecular studies, particularly for HER2 negative subtypes. Additionally, several were the
outcomes from this work indicating the use of cat naturally occurring mammary tumours as
model for human breast oncology.
Considering the TWIST1 evaluation in CML, the lower RNA expression levels observed
in malignant lesions are in agreement with the recent evidences for HBC. The similar behaviour
of the gene in the two species encourages the development of new investigation, trying to deeper
characterize its expression patterns at the level of RNA and Protein in CMLs. Once again, the
results shown in this thesis gather evidences for a straightforward comparative analysis between
cat mammary tumour lesions and human breast cancer.