Academic literature on the topic 'Marquage au tritium'

L'objectif du présent travail est de comparer deux méthodes indépendantes permettant d'estimer, dans les milieux aquatiques, le flux de carbone transitant du compartiment bactérien vers les protozoaires. Les deux méthodes utilisées sont, d'une part, celle basée sur le suivi de la décroissance de radioactivité du matériel génétique bactérien après marquage à la thymidine tritiée (SERVAIS et al., 1985) et, d'autre part, celle de mesure du taux d'ingestion de bactéries fluorescentes (FLB) par les protozoaires. Elles ont été appliquées en parallèle sur des échantillons de la rivière Meuse (Belgique). L'emploi de la première méthode a montré des taux de broutage compris entre 0.002 h-1 et 0.016 h-1 qui représentent en moyenne 72 % des taux de mortalité totale. Une excellente corrélation entre les estimations de flux de broutage obtenues par les deux techniques a été trouvée, mais les valeurs estimées à partir de la méthode FLB sont systématiquement inférieures (d'environ 30% en moyenne) à celles obtenues par l'autre méthode. Une part de cette différence peut vraisemblablement s'expliquer par la non prise en compte par la méthode FLB du broutage par des organismes de taille supérieure à 100 µm.

Dans une premiere partie, nous decrivons que le site d'interaction melibiose/melibiose permease peut etre efficacement cartographie par le substrat de haute affinite 3h-para-azidophenyl--d-galactopyranoside. Des vesicules membranaires contenant la melibiose permease etiquetee poly-histidine ont ete illuminees par lumiere uv. L'analyse de l'incorporation de radioactivite sur la proteine a montre que dix pour cent des sites actifs de la proteine ont ete marques, et que ce marquage est completement inhibe par le melibiose. La purification des peptides marques et la localisation de la radioactivite ont montres que l'arginine-141, comprise dans la boucle cytoplasmique 4-5 de la proteine etait radioactive. L'ensemble du travail suggere fortement que l'arginine-141 fait partie du site de fixation melibiose/melibiose permease, et mets en exergue l'importance de ce domaine dans la fixation du substrat pour les autres transporteurs polytopiques de la meme famille. Dans une deuxieme partie, nous decrivons qu'une methode classique d'hydrogenolyse catalytique peut etre appliquee au marquage par le tritium des 3-(trifluoromethyl)-3-phenyldiazirines. Nous demontrons que cette methode est hautement selective vis a vis de la plupart des groupements facilement reductibles, donnant ainsi la possibilite de marquer des molecules fragiles en derniere etape de synthese avec de tres fortes activites specifiques.

Cette thèse vise à développer de nouvelles méthodes efficaces pour incorporer des isotopes de l’hydrogène dans les molécules organiques complexes, après une introduction portant sur les applications et la synthèse des molécules marquées par le deutérium et tritium. Les méthodes permettant le marquage, par échange isotopique direct, d’hétérocycles azotés par des isotopes de l’hydrogène restent perfectibles, voire inexistantes dans certains cas, malgré la récurrence de ce type de sous-structures dans les molécules d’intérêt pharmacologique. Pour cette raison, la majeure partie de ce travail a consisté au développement de nouvelles méthodes d’incorporation d’atomes de deutérium et de tritium sur des hétérocycles azotés catalysées par des nanoparticules métalliques. Dans un premier chapitre, la mise au point, le champ d’application d’une méthode de marquage mettant en jeu l’utilisation de nanocatalyseurs de ruthénium seront discutés. Dans ce cadre, des calculs théoriques ont permis de rationaliser les regiosélectivités obtenues expérimentalement et d’identifier notamment des intermédiaires clefs inédits. D’un point de vue applicatif, cette méthode a permis de synthétiser des étalons internes deutérés pour la quantification LC-MS mais aussi des molécules complexes tritiées ayant des activités spécifiques élevées en une étape de synthèse. Dans un autre chapitre, la synthèse et la réactivité de nouveaux nanocatalyseurs de nickel permettant de réaliser des échanges isotopiques sélectifs seront discutés
This PhD thesis deals with the development of new efficient methods for the incorporation of hydrogen isotopes into organic molecules, which represents a serious issue especially for drug discovery and drug development processes. After giving an introduction about hydrogen isotopes and their applications in organic molecules, the course will proceed to an overview of different chemical transformations for establishing deuterium or tritium labels on molecular frameworks. The possibilities to label N-heterocycles by hydrogen isotopes through hydrogen isotope exchange (HIE) are still very restricted and even impossible for some representatives despite the strong recurrence of these substructures in numerous biologically active molecules. For this reason, the emphasis of the practical part will lie on the development of new methods for the incorporation of deuterium and tritium on N-heterocycles through metal nanoparticle catalysis. In the first chapter, HIE through ruthenium nanocatalysts will be optimized and the application range will be demonstrated. In this context, DFT-based calculations allowed to explain experimental regioselectivities and to identify new keyintermediates. In terms of application, it was shown that the ruthenium-catalyzed method is useful for the synthesis of deuterium labelled internal standards for LC-MS quantifications and for the tritiation of complex molecules displaying satisfying specific activities. In the next chapter, the synthesis of new nickel nanoparticles and their potential to catalyze selective HIE on N-heterocyclic derivatives will be discussed

Le marquage isotopique par le deutérium et le tritium est largement utilisé en chimie, en biologie ainsi qu’en recherche pharmaceutique.De nombreuses méthodes de marquage par échange isotopique permettent d’atteindre des enrichissements isotopiques élevés, mais elles requièrent généralement l’utilisation de conditions drastiques (température élevée, acidité). Ainsi, une méthode générale de marquage, régiosélective et douce, applicable à une grande variété de substrats, reste encore à développer. Dans le premier volet de cette thèse, nous avons montré que des nanoparticules de ruthénium (RuNP@PVP), synthétisées par l’équipe du Pr. Bruno Chaudret (INSA Toulouse), catalysaient avec une grande efficacité la réaction d’échange H/D sur des amines, des pyridines et des indoles par C‒H activation, sous 2 bars de D2 à 55 °C. L’application à la deutération de huit molécules azotées d'intérêt biologique a montré que la réaction était efficace sans pour autant altérer l’intégrité chimique ou stéréochimique des composés. Cependant, le respect de la stéréochimie originelle d’un centre chiral C‒H activé demeurait un problème majeur. Nous avons donc entrepris l’étude de la réactivité des RuNP@PVP sur différentes classes de substrats azotés chiraux (amines, aminoacides et peptides) dans l’eau ou dans des solvants organiques. Nos résultats ont montré sans ambiguïté que la C-H activation des carbones C(sp3) chiraux s’effectuait efficacement, sélectivement et dans tous les cas avec une rétention totale de configuration. La large gamme d’application de cette procédure a été démontrée par le marquage de 3 amines chirales, 14 aminoacides naturels, 3 aminoesters aromatiques et 4 peptides. D’autre part, notre collaboration avec l’équipe du Pr. Romuald Poteau (INSA Toulouse) a permis d’identifier deux mécanismes réactionnels par simulation ab initio en parfait accord avec nos résultats expérimentaux : le mécanisme par métathèse de liaison σ et le mécanisme d’addition oxydante. Ces deux mécanismes impliquent deux atomes de ruthénium voisins agissant ensemble pour conduire à la formation d’un intermédiaire-clé original dimétallacycle à quatre centres.Le second volet de cette thèse est consacré au développement d’une nouvelle méthode de détermination de la conformation et de l’arrangement relatif de petites molécules auto-assemblées. Elle repose sur la synergie entre chimie de marquage, RMN du tritium à l’état solide et modélisation moléculaire. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés au dipeptide diphénylalanine (Phe-Phe) qui, selon le solvant utilisé, peut former des cristaux (structure résolue) ou s’auto-assembler en nanotubes dont la structure atomique reste inconnue. Trois dipeptides Phe-Phe ditritiés sur des positions aromatiques, définies à l’aide de la modélisation moléculaire par le Dr. Yves Boulard (CEA Saclay), ont été synthétisés. La RMN du tritium à l’état solide a permis au Dr. Thibault Charpentier (CEA Saclay) de mesurer, sur des échantillons cristallisés, trois distances inter-tritiums très proches des distances de référence. Cette technique a également mis en évidence un éventuel désordre d’orientation d’un cycle aromatique de Phe-Phe cristallisé. Une modélisation ab initio nous a également incités à entreprendre un double marquage Caryl et Cα de Phe-Phe, ce dernier utilisant les nanoparticules de ruthénium. Les essais de marquage au deutérium avec RuNP@PVP sont très encourageants et des études complémentaires sont en cours dans notre laboratoire pour parvenir au marquage au tritium. Ainsi, nous espérons mettre au point un nouvel outil d’étude structurale permettant d’accéder à la structure atomique de petites molécules intégrées dans des ensembles supramoléculaires complexes (nanotubes, peptides amyloïdes ou membranaires)
Isotopic labeling with deuterium and tritium is extensively used in chemistry, biology and pharmaceutical research.Numerous methods of labeling by isotopic exchange allow high isotopic enrichments but generally require harsh conditions (high temperatures, acidity). As a consequence, a general, regioselective and smooth labeling method that might be applicable to a wide diversity of substrates remains to develop. In the first part of this thesis, we demonstrated that the use of ruthenium nanoparticles, synthesized by Pr. Bruno Chaudret’s team (INSA Toulouse), allowed the mild (2 bar of deuterium gas at 55°C), effective and selective H/D exchange reaction of a large variety of nitrogen-containing compounds, such as pyridines, indoles and primary, secondary and tertiary alkyl amines. The usefulness and the efficiency of this novel methodology was demonstrated by the deuteration of eight nitrogen-containing molecules of biological interest without altering their chemical and stereochemical properties. However, the conservation of the original stereochemistry of an activated chiral C-H center remains a major issue. We studied the reactivity of RuNP@PVP on different categories of nitrogen-containing substrates (amines, aminoacids and peptides) in water or in organic solvents. Our results showed that C-H activation of chiral carbons C(sp3) took place efficiently, selectively and, in all cases, with total retention of configuration. The wide range of applications of this procedure was demonstrated by the labeling of three chiral amines, fourteen aminoacids, three aromatic aminoesters and four peptides. Moreover, our collaboration with Pr. Romuald Poteau’s team (INSA Toulouse) led to the identification of two mechanisms by ab initio simulation in agreement with our experimental results: the σ-bond metathesis mechanism and the oxidative addition mechanism. These two mechanisms imply two vicinal ruthenium atoms leading to the formation an original dimetallacycle key-intermediate with four centers.The second part of this thesis deals with the development of a new method for the determination of the conformation and the relative arrangement of auto-assembled small molecules. It is based on the synergy between labeling chemistry, tritium solid-state NMR and molecular modeling. We focused on the diphenylalanine dipeptide (Phe-Phe) which forms either crystals or self-assembled nanotubes depending on the solvent. If the crystalline atomic structure of Phe-Phe has been solved, the structure of the self-assembled nanotubes of Phe-Phe is still unknown. Three Phe-Phe dipeptides ditritiated on aromatic positions, determined with the help of molecular modeling by Dr. Yves Boulard (CEA Saclay), were synthesized. Tritium solid-state NMR allowed Dr. Thibault Charpentier (CEA Saclay) to measure, on crystallized samples, three inter-tritiums distances very close to the reference distances. This technique also revealed a possible orientational disorder on an aromatic cycle of crystallized Phe-Phe. Ab initio modeling led us to set a double labeling Caryl and Cα on Phe-Phe with ruthenium nanoparticles. Deuteration with RuNP@PVP are very promising and supplementary studies are in progress to perform tritium labeling. We expect to set a new tool of structural study to determine atomic structures of small molecules integrated in supramolecular complexes (nanotubes, amyloid peptides or membranes)

Lors de la dégradation du peroxyde d'hydrogène en eau et dioxygène catalysée par les hémoenzymes à fer de type catalase et peroxydase, il se forme à l'échelle de la milliseconde un intermédiaire réactionnel radicalaire porté par la porphyrine. Dans le cas de l'enzyme modèle utilisée, la catalase de foie de bœuf, il a été montré par des études de spectroscopie RPE que ce radical est ensuite délocalisé sur un résidu tyrosyle de la chaîne polypeptidique. A ce jour, on ne connaît pas l'exacte localisation du résidu impliqué, donc le rôle de ce site d'oxydation alternatif.
Par ailleurs, il a été montré au laboratoire que l'identification et la quantification des radicaux formés sur les acides aminés d'une protéine par l'attaque de radicaux hydroxyle sont possibles. Cette méthode est basée sur le marquage au tritium des résidus acides aminés. Notre approche est basée sur la génération de radicaux hydroxyle par radiolyse de l'eau. Les radicaux hydroxyle formés arrachent un hydrogène sur la chaîne latérale des acides aminés et génèrent ainsi un radical carboné. Il est ensuite “réparé” in situ par un composé, le sel sodique de l'acide phénylphosphinique tritié, qui permet d'introduire un atome de tritium à la place de l'hydrogène précédemment arraché. Cet atome de tritium sert de marqueur pour détecter les sites de formation des radicaux.
Nous avons donc utilisé les propriétés de réparation du vecteur tritié pour identifier quelle est la tyrosine impliquée dans les transferts d'électrons de la BLC. Même s'il a été montré par RPE que la disparition du radical porté par la tyrosine est effective en présence de l'agent de réparation, les études de marquage n'ont pas abouti à déterminer l'exacte localisation du radical. Une des raisons invoquées est le manque d'efficacité de l'agent de réparation pour transférer son atome d'hydrogène. C'est pourquoi d'autres composés capables eux aussi de fournir un atome d'hydrogène par voie radicalaire ont été synthétisés puis testés sur ce système enzymatique par une étude de spectroscopie RPE.
En parallèle, nous avons voulu comprendre les mécanismes d'action des ces mêmes composés sur un système modèle en générant des radicaux sur la tyrosine en solution par radiolyse de l'eau. La méthode consiste à produire dans une solution aqueuse de tyrosine des radicaux hydroxyle, qui vont former les radicaux tyrosyle. Les radicaux ainsi générés peuvent être ensuite réparés par un atome de deutérium fourni par un donneur. L'incorporation en deutérium et la régiosélectivité de l'attaque sont ensuite analysées par spectrométrie de masse et RMN 2H. L'irradiation de solution de tyrosine en présence des différents composés choisis s'est révélée difficile à analyser, en raison notamment de la difficulté à déterminer la proportion de radicaux hydroxyle réagissant avec l'agent réparateur au lieu de la tyrosine, mais surtout en raison de l'incorporation inattendue de deutérium dans la tyrosine en l'absence de tout agent de transfert. Ce phénomène jusqu'alors inconnu a, dès lors, retenu toute notre attention. Nous avons alors focalisé nos travaux sur la compréhension des processus intervenant dans l'autoréparation de la tyrosine et ainsi proposé un mécanisme pour expliquer nos observations.

La thèse est centrée sur l'application de la réduction en phase homogène de déhydropeptides, catalysée par des complexes chiraux du rhodium. Dans la première partie de la thèse, trois déhydroenképhalines protégées ont été synthétisées. Les diastéréoisomères de la ⁵Leu-enképhaline et de la R-²Ala-⁵Leu-enképhaline protégés ont chacun été obtenus stéréosélectivement par hydrogénation asymétrique des trois déhydropentapeptides. L'ytterbium dans l'ammoniac liquide a été utilisé comme nouveau réactif pour la déprotection sélective des diastéréoisomères de la ⁵Leu-enképhaline protégée par les groupements Z, Ts et Me. La seconde partie de la thèse traite du marquage stéréosélectif de peptides par le deutérium ou le tritium. La deutération de ⁴déhydroPhe-⁵Leu-enképhaline protégée a livré les deux diastéréoisoméres bisdeutérés avec dans chaque cas une forte pureté diastéréoisomérique. Deux peptides, inhibiteurs de collagènases bactériennes, ont également été marqués stéréosélectivement par le deutérium ou le tritium. Des différences significatives entre tritiation et deutération sont à noter
The thesis deals with some applications of asymmetric homogeneous hydrogenation of dehydropeptides, catalyzed by rhodium complexes. Ln the first part, three protected dehydroenkephalins have been prepared and reduced, leading stereoselectively to end-protected diastereomers of ⁵Leu-enkephalin and R-²Ala-⁵Leu-enkephalin. Ytterbium in liquid ammonia has been used as a new reactive for selective deprotection of the diastereomers of ⁵Leu-enkephalin (protecting groups: Z, Ts and Me). Ln the second part, the ⁴dehydroPhe-⁵Leu-enkephalin was specifically labelled with deuterium. Reduction of this substrat has been performed with high diastereoselectivity. Two peptides, competitive inhibitors of bacterial collagenases were also specifically labelled with deuterium or tritium by homogeneous catalytic reduction. Revelant differences between tritiation and deuteration were found

Une écriture simplifiée du bilan azoté pour la culture du blé d'hiver a été proposé en région Lorraine. Deux années d'expérimentation avec l'isotope 15N ont permis de justifier certains termes de ce bilan simplifié en confirmant, en particulier, l'indépendance des fournitures en azote du sol, par rapport à la dose apportée. Les conditions de variation du coefficient apparent d'utilisation (CAU) de l'azote de l'engrais ont été étudiées, notamment en fonction du temps de présence de l'engrais dans le sol. Par ailleurs, les résultats acquis suggèrent que le CAU est dépendant de la biomasse élaborée au moment des apports d'azote, donc des capacités d'absorption du peuplement. On propose en conclusion de tester une méthodologie opérationnelle des apports d'azote qui prenne en compte, non seulement le stade phrénologique, mais également l'état de croissance du peuplement

Notre objectif consiste à identifier les causes de variation des différents termes de l'équation d'efficience de l'engrais (by = Po + CAU. X) afin d'en améliorer la prévision pour le calcul de la fertilisation azotée du blé d'hiver. Pour les besoins en azote, nos résultats montrent l'importance de l'objectif de rendement prévisionnel, dont les variations sont expliquées par les caractéristiques des sols et du climat. Les besoins en azote par unité de production (b en kg N/quintal de grain) varient en fonction des variétés et des années. Le ratio B (azote absorbe/matière sèche des parties aériennes) est beaucoup plus stable que b. Sa valeur est d'environ 1,7 kg N,q de matière sèche. Le test de différents modèles pour prévoir la valeur du terme po (azote absorbe en l'absence de fertilisation) montre que l'élément déterminant est la teneur en azote organique du sol. L’utilisation de modèles de minéralisation dynamique (azodyn) permet d'améliorer la prévision des quantités d'azote minéral présentes dans le sol à la récolte. Pour le coefficient apparent d'utilisation de l'azote (CAU) nos résultats montrent que le facteur principal est la vitesse de croissance instantanée du peuplement au moment de l'apport d'azote. L’utilisation de l'isotope 15 N montre que le coefficient réel d'utilisation (CRU) est déterminé par la rapidité d'absorption par la culture après la fertilisation. Les quantités organisées sont stables et indépendantes du fonctionnement du peuplement. Les quantités d'azote minéral de l'engrais dans le sol à la récolte sont nulles, le défaut de bilan étant du a des pertes par voies gazeuses.

Un dosage radioimmunologique specifique du zinniol a ete au point; les etapes de ce travail ont ete les suivantes: - synthese d'une molecule immunogene (conjugue zinniol-proteine porteuse). - obtention d'anticorps specifique (4 ci/mmole). - mise au point du dosage radioimmunologique valide du point de vue de sa specificite, de sa reproductibilite et de sa sensibilite (limite de detection 0,14 nn/essai). Cet outil a permis de realiser des dosages sur des plantes infectees. Ces resultats inedits montrent que la molecule est emise tres rapidement dans les tissus infectes (12 h apres inoculation).