Academic literature on the topic 'Maturation de l'ARN'

Les recherches présentées dans ce mémoire ont porté sur l'expression des gènes d'histones de type réplication-dépendants. Ces gènes sont particuliers car leurs ARNm sont dépourvus d'introns et de queue poly A en 3', l'extrémité 3' étant générée par coupure endonucléolytique au cours d'un processus de maturation original impliquant plusieurs protéines et la snRNP U7.
Lors d'une première étude, nous avons étudié l'étape initiale de la réaction de maturation qui consiste en la fixation de la protéine HBP sur une structure de l'ARN pré-messager. À partir de mutants de HBP abolissant la fixation sur l'ARN nous avons sélectionné par la technique du triple hybride dans la levure des suppresseurs intragéniques permettant de restaurer cette fixation. La plupart des mutations isolées se situaient dans les domaines N- et C-terminaux de la protéine, en dehors du domaine central impliqué dans l'interaction avec l'ARN. Cette restauration s'effectuait sans perte de spécificité pour la séquence de fixation à l'ARN, suggérant que les domaines N- et C-terminaux sont impliqués dans le processus de reconnaissance de l'ARN.
Dans un second volet de notre étude portant sur la réaction de maturation de l'extrémité 3' de l'ARNm d'histone, nous avons examiné l'impact structural induit par la protéine HBP lors de sa fixation sur les extrémités 3' non traduites des ARNs pré-messagers des histones H4-12, H1t et H2a-614. En utilisant les techniques de sondage en solution nous avons montré que ces extrémités présentent de fortes structures secondaires qui pourraient empêcher l'accès à la particule snRNP U7. Puis, nous avons montré que la fixation de la protéine HBP engendrait des changements de conformation de l'ARN au niveau de la séquence d'hybridation au snRNA U7. Enfin, nous avons pu montrer que ces changements de conformation étaient associés à une amélioration de l'ancrage du snRNA U7 à l'ARN pré-messager. Cependant, ce mécanisme n'est pas généralisable à l'ensemble des gènes d'histones puisque aucune modification importante n'a pu être détectée à l'extrémité 3' non traduite du gène d'histone H2a-614.
Enfin, nous avons étudié la traduction in vitro de l'ARNm H4-12 et montré qu'elle s'effectuait de façon très efficace en l'absence des régions 5' et 3' non codantes, suggérant que l'initiation de la traduction s'effectuerait par recrutement des ribosomes à l'intérieur de la phase codante. Par sondage en solution de l'ARNm entier, nous avons proposé un modèle de repliement secondaire dans lequel la séquence codante est circularisée par l'hybridation de ses extrémités. À l'aide d'ARNs anti-sens nous avons identifié un certain nombre de nucléotides essentiels pour le maintien d'une haute efficacité de traduction. L'ensemble des résultats obtenus lors des expériences de sondage en solution associés à ceux issus des études de traduction in vitro, de « toe print » et de microscopie électronique, ont conduit à l'établissement d'un modèle original permettant d'expliquer la traduction atypique de l'ARNm H4-12. La phase codante recruterait directement deux ribosomes à la manière de 2 sites d'entrée interne du ribosome ou « IRES ». Le premier ribosome serait recruté au niveau du codon d'initiation, le second près de la fin de la phase codante. Par le jeu de changements de conformation et grâce à la circularisation de l'ARNm, le deuxième ribosome pourrait être dirigé très efficacement sur le codon d'initiation. Cet enchaînement des deux ribosomes sur la phase codante permettrait d'expliquer d'une part, la grande efficacité de traduction observée dans le cas de notre modèle H4-12 et d'autre part, le rôle accessoire des séquences non traduites.

Ce projet de recherche vise à caractériser certaines protéines impliquées dans le métabolisme des ARN des virus appartenant à la famille des Flaviviridae. Dans un premier temps, des paramètres de stabilité de l'ARN polymérase du virus de l'hépatite C ont été étudiés. Selon des travaux antérieurs, l'importance du rôle des ions Mg[indice supérieur 2+] ou Mn[indice supérieur 2+] pour l'activité enzymatique de la polymérase virale a été démontré. Afin d'élucider le rôle de ces ions dans l'activité de la protéine ainsi que la changement de conformation due à la liaison des ions en solution, nous avons utilisé la spectroscopie à fluorescence pour évaluer l'interaction entre la protéine et divers ions métalliques. Cette technique, combinés à des essais de dénaturation chimique et thermique, permet de démontrer l'importance des ions métalliques dans la stabilité de la protéine. Nos essais démontrent clairement que la protéine possède une stabilité accrue lorsqu'elle est liée à des ions métalliques. De plus, nos données indiquent que le site actif de la protéine est plus vulnérable aux agents dénaturants que les autres portions de la protéine et des études de mutagenèse ont confirmé l'identité des résidus impliqués dans la liaison du Mg[indice supérieur 2+]. Enfin, l'utilisation de sondes fluorescentes nous permet de démontrer l'apparition de changements conformationnels significatifs suite à la liaison des ions métalliques. Des connaissances approfondies sur la réaction catalysée par l'ARN polymérase du virus de l'hépatite C ainsi qu'une meilleure compréhension des propriétés biochimiques de cette protéine devraient éventuellement mener au développement de stratégies antivirales efficaces. Dans un deuxième temps, une caractérisation de l'activité de la protéine NS3 du virus du Nil occidental a été effectuée afin d'améliorer nos connaissances sur les étapes élémentaires de la réplication de ce virus. La portion carboxy-terminale de la protéine NS3 supporte plusieurs activités: une activité ARN-triphosphatase impliquée dans la synthèse de la structure coiffe ainsi qu'une activité ATPase/hélicase essentielle lors de la réplication de PARN viral. Divers paramètres biochimiques et cinétiques des activités ARN-triphosphatase et ATPase ont été estimés afin de déterminer les conditions optimales, notamment, les besoins en ions métalliques des différentes activités. De plus, une caractérisation approfondie de l'enzyme, qui consiste en la détermination des meilleurs substrats de l'activité hélicase a été effectuée. Nos travaux indiquent que la protéine NS3 du virus du Nil occidental possède une forte processivité et déroule l'ARN double brin des extrémités 3'[flèche vers la droite] 5' et de 5'[flèche vers la droite] 3'. Enfin, les changements conformationnels produits lors de la liaison d'ions métalliques, (en occurence le Mg[indice supérieur 2+]) et les différents substrats de la protéine ont été étudiés, ainsi que l'éventuel effet stabilisateur de leur liaison, et ce en utilisant la spectroscopie à fluorescence et le dichroïsme circulaire. Par ailleurs, les études de caractérisation de la protéine NS3 ont révélé que les activités ARN-triphosphatase et ATPase/hélicase sont inhibées par le tripolyphosphate, une petite molécule qui imite les substrats de la protéine NS3. Le tripolyphosphate pourrait, éventuellement, servir comme modèle pour le développement des agents antiviraux. Cette étude permet de mieux cerner le mode catalytique et le comportement conformationnel en solution des enzymes des virus de la famille de Flaviviridae face aux différents substrats et co-facteurs, pour finalement mieux cibler leur rôle dans la réplication du virus et ainsi développer des stratégies anti-virales.

Nous avons étudié la fixation de la protéine HBP sur une structure en tige-boucle de l'ARN pré-messager d'histone H4-12. À partir de mutations de HBP abolissant la fixation, nous avons sélectionné par la technique du triple hybride dans la levure des suppresseurs intragéniques permettant de restaurer cette fixation. La plupart se situaient dans les domaines N- et C-terminaux de la protéine et n'affectaient pas la spécificité, suggèrant l'implication des domaines dans la reconnaissance de l'ARN. Nous avons ensuite examiné l'impact structural induit par la fixation d'HBP sur les extrémités 3' non traduites d'ARNs pré-messagers d'histones. Par sondage en solution nous avons détecté de fortes structures secondaires qui pourraient empêcher l'accès de la particule snRNP U7. Puis, nous avons montré que la fixation de la protéine HBP engendrait des changements de conformation au niveau de la séquence d'hybridation au snRNA U7 qui étaient associés à une amélioration de l'ancrage du snRNA U7. Ce mécanisme n'est pas généralisable à l'ensemble des gènes d'histones. Enfin, nous avons étudié la traduction in vitro de l'ARNm H4-12 et montré qu'elle s'effectuait de façon très efficace en l'absence des régions 5' et 3' non codantes, suggérant un recrutement du ribosome par la phase codante. Par sondage en solution de l'ARNm, nous avons proposé un modèle de repliement secondaire dans lequel la séquence codante est circularisée. À l'aide d'ARNs anti-sens nous avons identifié des nucléotides essentiels pour le maintien d'une haute efficacité de traduction. Ces résultats associés à ceux issus d'études de traduction in vitro, de " toe print " et de microscopie électronique, ont conduit à l'établissement d'un modèle original expliquant la traduction atypique d'H4-12. La phase codante recruterait directement deux ribosomes à la manière de deux sites d'entrée interne du ribosome (IRES), ils s'enchaîneraient par le jeu de changements de conformation et grâce à la circularisation de l'ARNm
First we studied HBP protein interaction with the hairpin structure of histone H4-12 pre-mRNA. Starting from loss-of binding mutants of HBP, we selected by the yeast three hybrid system, HBP suppressors that restored the interaction for a wild-type hairpin RNA. Most of the selected mutations were located in both N- and C terminal domains of the protein, suggesting that these domains are involved in RNA recognition. Next we analyzed the structural effect of HBP binding to the 3'UTR of several histone pre-mRNA. Structural probing revealed strong secondary structures in the 3'UTR molecules that could prevent U7 snRNP anchoring to the RNA. We also showed that in some cases HBP-binding induced conformational changes at the level of U7 hybridization sequence. These changes were associated to a better annealing of a U7 snRNA transcript. However, this mechanism is not general to all histone-genes. Lastly, we focused on histone translation mechanism. We found that in vitro translation of H4-12 mRNA is highly efficient. Surprisingly, we found that 5' and 3' UTR are dispensable, which suggests that the Open Reading Frame (ORF) alone is able to recruit the ribosome. Using enzymatic and chemical probing we solved the secondary structure of the whole mRNA. The molecule appears to be circular due to hybridization of 5' and 3' sequences. With non-sense RNA designed to inhibit translation we identified essential nucleotides required for a highly efficient translation mechanism. Altogether, the data from in vitro translation, mutagenesis, toe print and electron-microscopy led us to propose a model that explains the highly efficient mechanism of histone translation. First, the ORF might efficiently recruit two ribosomes on Internal Ribosome Entry Sites (IRES). Second, after translation of the histone circular histone-mRNA an efficient recycling process would channel the ribosomes onto the initiation-codon for a new round of translation

La microcine J25 (MccJ25) est un peptide antibactérien inhibiteur de l'ARN polymérase, produit par Escherichia coli AY25 selon la voie ribosomique. Sa structure tridimensionnelle en forme de lasso résulte du clivage d'un précurseur, McjA, et de la formation sur le peptide C-terminal résultant, d'une liaison amide Gly1-Glu8. Nous avons d'abord étudié le mode d'import de MccJ25 dans les bactéries et avons montré in vivo et in vitro qu'elle parasite un transporteur du complexe fer/ferrichrome, FhuA. Ainsi, MccJ25 se lie à FhuA avec un Kd de 1.2 µM, pour former un complexe de stœchiométrie 2:1. La boucle en épingle à cheveu béta définie par les résidus Val11-Pro16 de MccJ25 est nécessaire à cette étape de reconnaissance. Dans un second temps, nous avons étudié la biosynthèse de MccJ25. Nous avons montré par inactivation et complémentation de gènes que les deux protéines, McjB et McjC codées par le cluster génétique de la microcine, sont nécessaires au processus de maturation. McjA, McjB et McjC produites en système recombinant ont permis de montrer que McjB et McjC sont capables de catalyser la conversion de McjA (précurseur linéaire inactif) en MccJ25 dotée d'activité antibactérienne et structurée en lasso. L'étude des similarités de séquences de McjB et McjC indique que McjB serait responsable du clivage protéolytique de McjA et McjC de la formation de la liaison Gly1-Glu8.

Chez les mammifères, près de 8 % ARNm présentent dans leur région 3’ non traduite des éléments riches en en adénines et uridines appelés AREs (AU-rich elements). Ces séquences sont reconnues par des facteurs variés, telles les protéines de la famille de la tristétraproline (TTP) qui régulent la vitesse de dégradation et/ou la traduction de ces ARNm. La protéine Tis11 membre fondateur de la famille TTP, contient des deux doigts de zinc en tandem ( domaine TZF) permettant de fixer les AREs et reconnait ainsi des ARNm codant principalement des cytokines et stimule leur dégradation par un mécanisme encore mal connu. Chez Saccharomyces cerevisae, Cth2 la dégradation d’ARNm contenant des AREs et codant des protéines en relation avec le métabolisme du fer. Afin de mieux comprendre le mécanisme permettant de déstabiliser ces ARNm, nous avons entrepris une analyse structure/fonction de Cth2. Nous avons ainsi identifié un domaine conservé appelé CR1, essentiel pour déstabiliser les ARNm mais non requis pour la fixation des AREs. De manière inattendue, l’expression de mutants dépourvus de ce domaine conduit à une accumulation de transcrits cibles présentant une extension en positon 3’. L’analyse de mutants affectant la machinerie de polyadénylation ainsi que l’observation d’une localisation majoritairement nucléaire de Cth2 ont permis de montrer que l’altération de la maturation 3’ de ces ARNm résulte d’une compétition entre Cth2 et la machinerie de polyadénylation au niveau des ARE. Nos résultats révèlent pour la première fois qu’une protéine apparentée au TTP peut affecter la maturation 3’ des ARNm contribuant ainsi à leur déstabilisation
Almost 8 % of mammalian mRNAs display AU-rich element (ARE) in their3’ untranslated region (UTR). Many are specifically bound by ARE-binding proteins, such as the members of the tristetrapolin family (TTP), that act to modulate mRNA decay and/or translation. HTTP contains a characteristic tandem repeat CCCH zinc finger domain involved in ARE binding. Upon binding hTTP destabilizes its targets such as cytokines encoding mRNAs, but its precise mechanism of action remains poorly understood. In budding yeast, Cth2, has recently been shown as a functional homologue of TTP. Under iron deprivation conditions, Cth2 is expressed, binds to ARE of its mRNAs targets, encoding iron metabolism related proteins, and finally stimulates their decay. To understand the mode of action of Cth2, we undertook a structure-function analysis of this factor. Our analysis identified a conserved region (CR1) that is essential to Cth2 activity but unessential for the ARE binding capacity. Interesting, mutants lacking this region exhibited a novel molecular phenotype with accumulation of 3’ elongated forms of target mRNAs. The analysis of mutants affecting the polyadénylation machinery together with the observation of a predominant nuclear localization of Cth2 indicate that Cth2 has also a function in regulating 3’ end processing of ARE containing mRNAs. For the time, our results show that a TTp-related protein can affect mRNA decay and also regulate the 3’ end processing of its ARE-containing mRNA targets

Nous utilisons le gène de la tropomyosine  de xénope comme modèle moléculaire pour étudier les déterminants de la régulation tissulaire de l'épissage et de la polyadénylation. Ce gène contient dans sa région 3' terminale un exon alternatif, l'exon 9A9', dont l'utilisation, dans l'embryon de xénope, est dépendante de l'environnement tissulaire. Deux séquences, l'une inhibitrice l'autre activatrice, qui régulent l'épissage de cet exon, avait précédemment été identifiées. Afin de caractériser les mécanismes d'action de ces deux séquences, nous avons recherché les facteurs qui contrôlent l'utilisation de l'exon 9A9' via ces dernières. Nous avons identifié la protéine xPTB comme un facteur majeur de la répression de l'exon 9A9' et certains membres de la famille des protéines SR comme des facteurs capables d'activer cet exon. Nous avons par la suite démontré qu'il existe un antagonisme fonctionnel entre la protéine xPTB et la famille des protéines SR dans la régulation de l'exon 9A9'.

Lors de la transcription de gènes, il y a production d'un pré-ARN messager qui subira plusieurs étapes de maturation pour former l'ARN messager (ARNm) pouvant coder pour une protéine. Une de ces étapes est l'épissage qui consiste à exciser des portions (appelés les introns) pour juxtaposer les autres séquences (les exons), formant ainsi l'ARNm.Lors de l'épissage alternatif, un exon peut parfois être excisé menant à la formation d'un autre isoforme d'ARNm, donc possiblement d'une autre protéine, à partir d'un seul gène. Il est maintenant estimé que plus de 97% des pré-ARNm humains multi-exoniques subissent l'épissage alternatif, permettant ainsi une augmentation considérable de la quantité de protéines codées par les 30 000 gènes humains. Certaines des protéines produites par épissage alternatif peuvent avoir des activités très différentes, voire antagonistes. Ceci est souvent le cas dans l'apoptose, soit la mort cellulaire programmée. Le gène bcl-x, par exemple, peut mener à la formation de deux isoformes majoritaires. Lorsque le site d'épissage 5' proximal est utilisé, il y a formation de Bcl-x[indice inférieur L], codant pour une protéine ayant une activité anti-apoptotique, donc favorisant la survie de la cellule. Par contre, lorsque le site d'épissage 5' distal est utilisé, il y a formation d'un ARNm ayant perdu un exon de 189 nucléotides (nt) qui code pour Bcl-x[indice inférieur s], qui favorisera l'apoptose. L'épissage alternatif de ce pré-ARNm, comme les autres, est évidement bien contrôlé par des séquences présentes sur l'ARN, des facteurs protéiques liant ces séquences et des signaux cellulaires régulant l'activité de ceux-ci. Ma thèse consistait à analyser ces trois aspects et mon travail a mené à la découverte de deux protéines liant le pré-ARNm de bcl-x afin de réguler son épissage, ainsi que d'une région nécessaire à la signalisation cellulaire par la protéine kinase C (PKC). Au début, j'ai aidé à l'identification des hnRNP F et H qui lient une région riche en guanidine, nommée B2G, présente dans l'exon alternatif. Ces protéines lient cet élément et ainsi augmenterait la formation de l'isoforme Bcl-x[indice inférieur s]. Ces résultats sont présentés en annexe. Par la suite, j'ai identifié une région contenant deux éléments antagonistes, soit B1AC et B1u, située 10 nt en amont du site Bcl-x[indice inférieur s]. B1AC augmente l'utilisation de ce site, tandis que B1u fait le contraire, par la liaison de hnRNP K. Cette protéine est souvent fortement exprimée dans certains types de cancer, en accord avec son activité d'inhibition de l'isoforme pro-apoptotique. Ceci est présenté dans la première partie de ma thèse. La deuxième section de ma thèse consiste à l'identification d'une grande région nommée SB1 (361 nt) située au début de l'exon 2. De façon basale, cet élément inhibe le site Bcl-x[indice inférieur s]. Cependant, lors du blocage de l'activité de la PKC par la staurosporine, l'inhibition est perdue entrainant ainsi une forte augmentation de cet isoforme. L'inhibition de la PKC dans les lignées cellulaires cancéreuses n'entraîne pas cet effet sur l'épissage de Bcl-x, suggérant que la voie de signalisation de PKC est déréglée ou non-couplée à la régulation du gène apoptotique Bcl-x dans les cancers. L'avancement de la compréhension de l'épissage alternatif de gènes clés impliqués dans certaines maladies, tel que bcl-x dans le cancer, est primordial pour une meilleure compréhension de celles-ci. Cette thèse présente ma participation dans l'étude de la régulation de l'épissage alternatif de bcl-x .

La levure saccharomyces cerevisiae est le premier organisme eucaryote dont la sequence genomique nucleaire est entierement connue. La determination de cette sequence a ete realisee dans le cadre d'une collaboration internationale. L'une des plus grandes surprises due a ce travail a ete de decouvrir que le tiers seulement des genes de s. Cerevisiae avaient ete caracterises. Cette constatation a ete faite des la publication de la sequence nucleotidique du premier chromosome, chromosome iii. Un projet pilote d'analyse fonctionnelle des phases de lecture ouvertes inconnues a ete mis en place. Dans le cadre de ce projet, nous avons elabore des outils permettant une inactivation rapide et aisee des genes. Basee sur l'amplification par pcr du marqueur de deletion flanque de courtes sequences amont et aval du gene a inactiver, cette methode necessite l'utilisation d'une souche receptrice que nous avons construite, deletee pour le marqueur de selection. Quinze phases de lecture ouvertes du chromosome iii ont ainsi ete inactivees. Quatre genes ont fait l'objet d'une analyse plus approfondie. Pour trois d'entre eux, le role fonctionnel a ete etabli. Nous avons montre que le gene ycr003w code pour une proteine du ribosome mitochondrial et que son inactivation conduit au blocage de la respiration. Nous avons caracterise le gene ycl009c qui code pour la petite sous-unite regulatrice de l'acetolactate synthase et qui n'avait pu etre identifie, jusqu'ici, par des techniques de genetique classique. Enfin, nous avons etabli que le gene ycl031c code pour une proteine essentielle impliquee dans la maturation du precurseur 35s des arn ribosomiques et plus precisement dans la production de l'arn 18s.