Dissertations / Theses on the topic 'Maturation de l'ARN'

Les recherches présentées dans ce mémoire ont porté sur l'expression des gènes d'histones de type réplication-dépendants. Ces gènes sont particuliers car leurs ARNm sont dépourvus d'introns et de queue poly A en 3', l'extrémité 3' étant générée par coupure endonucléolytique au cours d'un processus de maturation original impliquant plusieurs protéines et la snRNP U7.
Lors d'une première étude, nous avons étudié l'étape initiale de la réaction de maturation qui consiste en la fixation de la protéine HBP sur une structure de l'ARN pré-messager. À partir de mutants de HBP abolissant la fixation sur l'ARN nous avons sélectionné par la technique du triple hybride dans la levure des suppresseurs intragéniques permettant de restaurer cette fixation. La plupart des mutations isolées se situaient dans les domaines N- et C-terminaux de la protéine, en dehors du domaine central impliqué dans l'interaction avec l'ARN. Cette restauration s'effectuait sans perte de spécificité pour la séquence de fixation à l'ARN, suggérant que les domaines N- et C-terminaux sont impliqués dans le processus de reconnaissance de l'ARN.
Dans un second volet de notre étude portant sur la réaction de maturation de l'extrémité 3' de l'ARNm d'histone, nous avons examiné l'impact structural induit par la protéine HBP lors de sa fixation sur les extrémités 3' non traduites des ARNs pré-messagers des histones H4-12, H1t et H2a-614. En utilisant les techniques de sondage en solution nous avons montré que ces extrémités présentent de fortes structures secondaires qui pourraient empêcher l'accès à la particule snRNP U7. Puis, nous avons montré que la fixation de la protéine HBP engendrait des changements de conformation de l'ARN au niveau de la séquence d'hybridation au snRNA U7. Enfin, nous avons pu montrer que ces changements de conformation étaient associés à une amélioration de l'ancrage du snRNA U7 à l'ARN pré-messager. Cependant, ce mécanisme n'est pas généralisable à l'ensemble des gènes d'histones puisque aucune modification importante n'a pu être détectée à l'extrémité 3' non traduite du gène d'histone H2a-614.
Enfin, nous avons étudié la traduction in vitro de l'ARNm H4-12 et montré qu'elle s'effectuait de façon très efficace en l'absence des régions 5' et 3' non codantes, suggérant que l'initiation de la traduction s'effectuerait par recrutement des ribosomes à l'intérieur de la phase codante. Par sondage en solution de l'ARNm entier, nous avons proposé un modèle de repliement secondaire dans lequel la séquence codante est circularisée par l'hybridation de ses extrémités. À l'aide d'ARNs anti-sens nous avons identifié un certain nombre de nucléotides essentiels pour le maintien d'une haute efficacité de traduction. L'ensemble des résultats obtenus lors des expériences de sondage en solution associés à ceux issus des études de traduction in vitro, de « toe print » et de microscopie électronique, ont conduit à l'établissement d'un modèle original permettant d'expliquer la traduction atypique de l'ARNm H4-12. La phase codante recruterait directement deux ribosomes à la manière de 2 sites d'entrée interne du ribosome ou « IRES ». Le premier ribosome serait recruté au niveau du codon d'initiation, le second près de la fin de la phase codante. Par le jeu de changements de conformation et grâce à la circularisation de l'ARNm, le deuxième ribosome pourrait être dirigé très efficacement sur le codon d'initiation. Cet enchaînement des deux ribosomes sur la phase codante permettrait d'expliquer d'une part, la grande efficacité de traduction observée dans le cas de notre modèle H4-12 et d'autre part, le rôle accessoire des séquences non traduites.

Ce projet de recherche vise à caractériser certaines protéines impliquées dans le métabolisme des ARN des virus appartenant à la famille des Flaviviridae. Dans un premier temps, des paramètres de stabilité de l'ARN polymérase du virus de l'hépatite C ont été étudiés. Selon des travaux antérieurs, l'importance du rôle des ions Mg[indice supérieur 2+] ou Mn[indice supérieur 2+] pour l'activité enzymatique de la polymérase virale a été démontré. Afin d'élucider le rôle de ces ions dans l'activité de la protéine ainsi que la changement de conformation due à la liaison des ions en solution, nous avons utilisé la spectroscopie à fluorescence pour évaluer l'interaction entre la protéine et divers ions métalliques. Cette technique, combinés à des essais de dénaturation chimique et thermique, permet de démontrer l'importance des ions métalliques dans la stabilité de la protéine. Nos essais démontrent clairement que la protéine possède une stabilité accrue lorsqu'elle est liée à des ions métalliques. De plus, nos données indiquent que le site actif de la protéine est plus vulnérable aux agents dénaturants que les autres portions de la protéine et des études de mutagenèse ont confirmé l'identité des résidus impliqués dans la liaison du Mg[indice supérieur 2+]. Enfin, l'utilisation de sondes fluorescentes nous permet de démontrer l'apparition de changements conformationnels significatifs suite à la liaison des ions métalliques. Des connaissances approfondies sur la réaction catalysée par l'ARN polymérase du virus de l'hépatite C ainsi qu'une meilleure compréhension des propriétés biochimiques de cette protéine devraient éventuellement mener au développement de stratégies antivirales efficaces. Dans un deuxième temps, une caractérisation de l'activité de la protéine NS3 du virus du Nil occidental a été effectuée afin d'améliorer nos connaissances sur les étapes élémentaires de la réplication de ce virus. La portion carboxy-terminale de la protéine NS3 supporte plusieurs activités: une activité ARN-triphosphatase impliquée dans la synthèse de la structure coiffe ainsi qu'une activité ATPase/hélicase essentielle lors de la réplication de PARN viral. Divers paramètres biochimiques et cinétiques des activités ARN-triphosphatase et ATPase ont été estimés afin de déterminer les conditions optimales, notamment, les besoins en ions métalliques des différentes activités. De plus, une caractérisation approfondie de l'enzyme, qui consiste en la détermination des meilleurs substrats de l'activité hélicase a été effectuée. Nos travaux indiquent que la protéine NS3 du virus du Nil occidental possède une forte processivité et déroule l'ARN double brin des extrémités 3'[flèche vers la droite] 5' et de 5'[flèche vers la droite] 3'. Enfin, les changements conformationnels produits lors de la liaison d'ions métalliques, (en occurence le Mg[indice supérieur 2+]) et les différents substrats de la protéine ont été étudiés, ainsi que l'éventuel effet stabilisateur de leur liaison, et ce en utilisant la spectroscopie à fluorescence et le dichroïsme circulaire. Par ailleurs, les études de caractérisation de la protéine NS3 ont révélé que les activités ARN-triphosphatase et ATPase/hélicase sont inhibées par le tripolyphosphate, une petite molécule qui imite les substrats de la protéine NS3. Le tripolyphosphate pourrait, éventuellement, servir comme modèle pour le développement des agents antiviraux. Cette étude permet de mieux cerner le mode catalytique et le comportement conformationnel en solution des enzymes des virus de la famille de Flaviviridae face aux différents substrats et co-facteurs, pour finalement mieux cibler leur rôle dans la réplication du virus et ainsi développer des stratégies anti-virales.

Nous avons étudié la fixation de la protéine HBP sur une structure en tige-boucle de l'ARN pré-messager d'histone H4-12. À partir de mutations de HBP abolissant la fixation, nous avons sélectionné par la technique du triple hybride dans la levure des suppresseurs intragéniques permettant de restaurer cette fixation. La plupart se situaient dans les domaines N- et C-terminaux de la protéine et n'affectaient pas la spécificité, suggèrant l'implication des domaines dans la reconnaissance de l'ARN. Nous avons ensuite examiné l'impact structural induit par la fixation d'HBP sur les extrémités 3' non traduites d'ARNs pré-messagers d'histones. Par sondage en solution nous avons détecté de fortes structures secondaires qui pourraient empêcher l'accès de la particule snRNP U7. Puis, nous avons montré que la fixation de la protéine HBP engendrait des changements de conformation au niveau de la séquence d'hybridation au snRNA U7 qui étaient associés à une amélioration de l'ancrage du snRNA U7. Ce mécanisme n'est pas généralisable à l'ensemble des gènes d'histones. Enfin, nous avons étudié la traduction in vitro de l'ARNm H4-12 et montré qu'elle s'effectuait de façon très efficace en l'absence des régions 5' et 3' non codantes, suggérant un recrutement du ribosome par la phase codante. Par sondage en solution de l'ARNm, nous avons proposé un modèle de repliement secondaire dans lequel la séquence codante est circularisée. À l'aide d'ARNs anti-sens nous avons identifié des nucléotides essentiels pour le maintien d'une haute efficacité de traduction. Ces résultats associés à ceux issus d'études de traduction in vitro, de " toe print " et de microscopie électronique, ont conduit à l'établissement d'un modèle original expliquant la traduction atypique d'H4-12. La phase codante recruterait directement deux ribosomes à la manière de deux sites d'entrée interne du ribosome (IRES), ils s'enchaîneraient par le jeu de changements de conformation et grâce à la circularisation de l'ARNm
First we studied HBP protein interaction with the hairpin structure of histone H4-12 pre-mRNA. Starting from loss-of binding mutants of HBP, we selected by the yeast three hybrid system, HBP suppressors that restored the interaction for a wild-type hairpin RNA. Most of the selected mutations were located in both N- and C terminal domains of the protein, suggesting that these domains are involved in RNA recognition. Next we analyzed the structural effect of HBP binding to the 3'UTR of several histone pre-mRNA. Structural probing revealed strong secondary structures in the 3'UTR molecules that could prevent U7 snRNP anchoring to the RNA. We also showed that in some cases HBP-binding induced conformational changes at the level of U7 hybridization sequence. These changes were associated to a better annealing of a U7 snRNA transcript. However, this mechanism is not general to all histone-genes. Lastly, we focused on histone translation mechanism. We found that in vitro translation of H4-12 mRNA is highly efficient. Surprisingly, we found that 5' and 3' UTR are dispensable, which suggests that the Open Reading Frame (ORF) alone is able to recruit the ribosome. Using enzymatic and chemical probing we solved the secondary structure of the whole mRNA. The molecule appears to be circular due to hybridization of 5' and 3' sequences. With non-sense RNA designed to inhibit translation we identified essential nucleotides required for a highly efficient translation mechanism. Altogether, the data from in vitro translation, mutagenesis, toe print and electron-microscopy led us to propose a model that explains the highly efficient mechanism of histone translation. First, the ORF might efficiently recruit two ribosomes on Internal Ribosome Entry Sites (IRES). Second, after translation of the histone circular histone-mRNA an efficient recycling process would channel the ribosomes onto the initiation-codon for a new round of translation

La microcine J25 (MccJ25) est un peptide antibactérien inhibiteur de l'ARN polymérase, produit par Escherichia coli AY25 selon la voie ribosomique. Sa structure tridimensionnelle en forme de lasso résulte du clivage d'un précurseur, McjA, et de la formation sur le peptide C-terminal résultant, d'une liaison amide Gly1-Glu8. Nous avons d'abord étudié le mode d'import de MccJ25 dans les bactéries et avons montré in vivo et in vitro qu'elle parasite un transporteur du complexe fer/ferrichrome, FhuA. Ainsi, MccJ25 se lie à FhuA avec un Kd de 1.2 µM, pour former un complexe de stœchiométrie 2:1. La boucle en épingle à cheveu béta définie par les résidus Val11-Pro16 de MccJ25 est nécessaire à cette étape de reconnaissance. Dans un second temps, nous avons étudié la biosynthèse de MccJ25. Nous avons montré par inactivation et complémentation de gènes que les deux protéines, McjB et McjC codées par le cluster génétique de la microcine, sont nécessaires au processus de maturation. McjA, McjB et McjC produites en système recombinant ont permis de montrer que McjB et McjC sont capables de catalyser la conversion de McjA (précurseur linéaire inactif) en MccJ25 dotée d'activité antibactérienne et structurée en lasso. L'étude des similarités de séquences de McjB et McjC indique que McjB serait responsable du clivage protéolytique de McjA et McjC de la formation de la liaison Gly1-Glu8.

Chez les mammifères, près de 8 % ARNm présentent dans leur région 3’ non traduite des éléments riches en en adénines et uridines appelés AREs (AU-rich elements). Ces séquences sont reconnues par des facteurs variés, telles les protéines de la famille de la tristétraproline (TTP) qui régulent la vitesse de dégradation et/ou la traduction de ces ARNm. La protéine Tis11 membre fondateur de la famille TTP, contient des deux doigts de zinc en tandem ( domaine TZF) permettant de fixer les AREs et reconnait ainsi des ARNm codant principalement des cytokines et stimule leur dégradation par un mécanisme encore mal connu. Chez Saccharomyces cerevisae, Cth2 la dégradation d’ARNm contenant des AREs et codant des protéines en relation avec le métabolisme du fer. Afin de mieux comprendre le mécanisme permettant de déstabiliser ces ARNm, nous avons entrepris une analyse structure/fonction de Cth2. Nous avons ainsi identifié un domaine conservé appelé CR1, essentiel pour déstabiliser les ARNm mais non requis pour la fixation des AREs. De manière inattendue, l’expression de mutants dépourvus de ce domaine conduit à une accumulation de transcrits cibles présentant une extension en positon 3’. L’analyse de mutants affectant la machinerie de polyadénylation ainsi que l’observation d’une localisation majoritairement nucléaire de Cth2 ont permis de montrer que l’altération de la maturation 3’ de ces ARNm résulte d’une compétition entre Cth2 et la machinerie de polyadénylation au niveau des ARE. Nos résultats révèlent pour la première fois qu’une protéine apparentée au TTP peut affecter la maturation 3’ des ARNm contribuant ainsi à leur déstabilisation
Almost 8 % of mammalian mRNAs display AU-rich element (ARE) in their3’ untranslated region (UTR). Many are specifically bound by ARE-binding proteins, such as the members of the tristetrapolin family (TTP), that act to modulate mRNA decay and/or translation. HTTP contains a characteristic tandem repeat CCCH zinc finger domain involved in ARE binding. Upon binding hTTP destabilizes its targets such as cytokines encoding mRNAs, but its precise mechanism of action remains poorly understood. In budding yeast, Cth2, has recently been shown as a functional homologue of TTP. Under iron deprivation conditions, Cth2 is expressed, binds to ARE of its mRNAs targets, encoding iron metabolism related proteins, and finally stimulates their decay. To understand the mode of action of Cth2, we undertook a structure-function analysis of this factor. Our analysis identified a conserved region (CR1) that is essential to Cth2 activity but unessential for the ARE binding capacity. Interesting, mutants lacking this region exhibited a novel molecular phenotype with accumulation of 3’ elongated forms of target mRNAs. The analysis of mutants affecting the polyadénylation machinery together with the observation of a predominant nuclear localization of Cth2 indicate that Cth2 has also a function in regulating 3’ end processing of ARE containing mRNAs. For the time, our results show that a TTp-related protein can affect mRNA decay and also regulate the 3’ end processing of its ARE-containing mRNA targets

Nous utilisons le gène de la tropomyosine  de xénope comme modèle moléculaire pour étudier les déterminants de la régulation tissulaire de l'épissage et de la polyadénylation. Ce gène contient dans sa région 3' terminale un exon alternatif, l'exon 9A9', dont l'utilisation, dans l'embryon de xénope, est dépendante de l'environnement tissulaire. Deux séquences, l'une inhibitrice l'autre activatrice, qui régulent l'épissage de cet exon, avait précédemment été identifiées. Afin de caractériser les mécanismes d'action de ces deux séquences, nous avons recherché les facteurs qui contrôlent l'utilisation de l'exon 9A9' via ces dernières. Nous avons identifié la protéine xPTB comme un facteur majeur de la répression de l'exon 9A9' et certains membres de la famille des protéines SR comme des facteurs capables d'activer cet exon. Nous avons par la suite démontré qu'il existe un antagonisme fonctionnel entre la protéine xPTB et la famille des protéines SR dans la régulation de l'exon 9A9'.

Lors de la transcription de gènes, il y a production d'un pré-ARN messager qui subira plusieurs étapes de maturation pour former l'ARN messager (ARNm) pouvant coder pour une protéine. Une de ces étapes est l'épissage qui consiste à exciser des portions (appelés les introns) pour juxtaposer les autres séquences (les exons), formant ainsi l'ARNm.Lors de l'épissage alternatif, un exon peut parfois être excisé menant à la formation d'un autre isoforme d'ARNm, donc possiblement d'une autre protéine, à partir d'un seul gène. Il est maintenant estimé que plus de 97% des pré-ARNm humains multi-exoniques subissent l'épissage alternatif, permettant ainsi une augmentation considérable de la quantité de protéines codées par les 30 000 gènes humains. Certaines des protéines produites par épissage alternatif peuvent avoir des activités très différentes, voire antagonistes. Ceci est souvent le cas dans l'apoptose, soit la mort cellulaire programmée. Le gène bcl-x, par exemple, peut mener à la formation de deux isoformes majoritaires. Lorsque le site d'épissage 5' proximal est utilisé, il y a formation de Bcl-x[indice inférieur L], codant pour une protéine ayant une activité anti-apoptotique, donc favorisant la survie de la cellule. Par contre, lorsque le site d'épissage 5' distal est utilisé, il y a formation d'un ARNm ayant perdu un exon de 189 nucléotides (nt) qui code pour Bcl-x[indice inférieur s], qui favorisera l'apoptose. L'épissage alternatif de ce pré-ARNm, comme les autres, est évidement bien contrôlé par des séquences présentes sur l'ARN, des facteurs protéiques liant ces séquences et des signaux cellulaires régulant l'activité de ceux-ci. Ma thèse consistait à analyser ces trois aspects et mon travail a mené à la découverte de deux protéines liant le pré-ARNm de bcl-x afin de réguler son épissage, ainsi que d'une région nécessaire à la signalisation cellulaire par la protéine kinase C (PKC). Au début, j'ai aidé à l'identification des hnRNP F et H qui lient une région riche en guanidine, nommée B2G, présente dans l'exon alternatif. Ces protéines lient cet élément et ainsi augmenterait la formation de l'isoforme Bcl-x[indice inférieur s]. Ces résultats sont présentés en annexe. Par la suite, j'ai identifié une région contenant deux éléments antagonistes, soit B1AC et B1u, située 10 nt en amont du site Bcl-x[indice inférieur s]. B1AC augmente l'utilisation de ce site, tandis que B1u fait le contraire, par la liaison de hnRNP K. Cette protéine est souvent fortement exprimée dans certains types de cancer, en accord avec son activité d'inhibition de l'isoforme pro-apoptotique. Ceci est présenté dans la première partie de ma thèse. La deuxième section de ma thèse consiste à l'identification d'une grande région nommée SB1 (361 nt) située au début de l'exon 2. De façon basale, cet élément inhibe le site Bcl-x[indice inférieur s]. Cependant, lors du blocage de l'activité de la PKC par la staurosporine, l'inhibition est perdue entrainant ainsi une forte augmentation de cet isoforme. L'inhibition de la PKC dans les lignées cellulaires cancéreuses n'entraîne pas cet effet sur l'épissage de Bcl-x, suggérant que la voie de signalisation de PKC est déréglée ou non-couplée à la régulation du gène apoptotique Bcl-x dans les cancers. L'avancement de la compréhension de l'épissage alternatif de gènes clés impliqués dans certaines maladies, tel que bcl-x dans le cancer, est primordial pour une meilleure compréhension de celles-ci. Cette thèse présente ma participation dans l'étude de la régulation de l'épissage alternatif de bcl-x .

La levure saccharomyces cerevisiae est le premier organisme eucaryote dont la sequence genomique nucleaire est entierement connue. La determination de cette sequence a ete realisee dans le cadre d'une collaboration internationale. L'une des plus grandes surprises due a ce travail a ete de decouvrir que le tiers seulement des genes de s. Cerevisiae avaient ete caracterises. Cette constatation a ete faite des la publication de la sequence nucleotidique du premier chromosome, chromosome iii. Un projet pilote d'analyse fonctionnelle des phases de lecture ouvertes inconnues a ete mis en place. Dans le cadre de ce projet, nous avons elabore des outils permettant une inactivation rapide et aisee des genes. Basee sur l'amplification par pcr du marqueur de deletion flanque de courtes sequences amont et aval du gene a inactiver, cette methode necessite l'utilisation d'une souche receptrice que nous avons construite, deletee pour le marqueur de selection. Quinze phases de lecture ouvertes du chromosome iii ont ainsi ete inactivees. Quatre genes ont fait l'objet d'une analyse plus approfondie. Pour trois d'entre eux, le role fonctionnel a ete etabli. Nous avons montre que le gene ycr003w code pour une proteine du ribosome mitochondrial et que son inactivation conduit au blocage de la respiration. Nous avons caracterise le gene ycl009c qui code pour la petite sous-unite regulatrice de l'acetolactate synthase et qui n'avait pu etre identifie, jusqu'ici, par des techniques de genetique classique. Enfin, nous avons etabli que le gene ycl031c code pour une proteine essentielle impliquee dans la maturation du precurseur 35s des arn ribosomiques et plus precisement dans la production de l'arn 18s.

L'amyotrophie spinale (SMA) est une maladie neuromusculaire principalement causée par des mutations du gène SMN1 (Survival of Motor Neuron 1). SMN1 est exprimé de manière ubiquitaire et contrôle l'assemblage de petites ribonucléoprotéines nucléaires (snRNP), essentielles à l'épissage du pré-ARNm. Ce qui rend certains MN plus sensibles à l'épuisement de SMN1 n'est pas encore entièrement compris. Nous explorons les origines moléculaires de la sensibilité distincte de différents neurones à la perte de SMN1 dans un modèle de C. elegans en utilisant trois approches :- Nous avons utilisé l'ARNi spécifique des neurones pour éliminer sélectivement l'homologue de SMN1, smn-1, dans les motoneurones ou dans les neurones récepteurs tactiles (TRN) dans les souches qui expriment des rapporteurs fluorescents dans les cellules souhaitées. Dans les deux types de neurones, nous avons observé que lorsque le smn-1 est silencieux, les neurones nés après l'embryon semblent moins robustes que dans les témoins, tandis que les neurones nés à l'embryon présentent une dégénérescence axonale qui précède la disparition neuronale. Les résultats suggèrent le rôle du SMN dans le développement et la maintenance neuronale.-Nous avons exprimé le SMN-1 fusionné à TurboID dans les MN et les TRN pour identifier les interactions protéiques différentielles potentielles impliquées dans le développement/la survie des neurones. Nous avons capturé certaines des interactions connues du SMN-1 dans les deux types de neurones ainsi que d'autres protéines connues pour participer au traitement de l'ARN. L'analyse des résultats de la spectrométrie de masse est toujours en cours.-Les neurones TRN et VD/DD ciblés ont été isolés pour générer des bibliothèques d'ADNc spécifiques aux cellules pour le séquençage du transcriptome à l'aide de Nanopore. Nous sommes en train de préparer suffisamment d'ADNc à partir de cellules isolées pour atteindre l'entrée nécessaire au séquençage Nanopore et d'identifier les changements transcriptomiques en aval après l'épuisement du SMN-1
Spinal muscular atrophy (SMA) is a neuromuscular disease mainly caused by mutations in the SMN1 gene (Survival of Motor Neuron 1). SMN1 is ubiquitously expressed and controls the assembly of small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs), essential for pre-mRNA splicing. What makes some MNs more sensitive to SMN1 depletion is still not fully understood. We are exploring the molecular origins of the distinct sensitivity of different neurons to loss of SMN1 in a C. elegans model using three approaches:-We used neuron-specific RNAi to selectively knock-down the SMN1 homolog, smn-1, in motor neurons or in touch receptor neurons (TRNs) in strains that express fluorescent reporters in the desired cells. In both neuron types, we observed that when smn-1 is silenced, neurons that are born post embryonically appear less robustly than in controls, while neurons which are born embryonically display axonal degeneration that precedes neuronal disappearance. The results suggest the role of SMN both in neural development, and maintenance.-We expressed SMN-1 fused to TurboID in MNs and TRNs to identify potential differential protein interactions involved in neuron development/survival We captured some of the known interactions of SMN-1 in both neuron types as well as other proteins knowns to participate in RNA processing. Analysis of the mass spectrometry results are still ongoing.-Targeted TRN and VD/DD neurons have been isolated to generate cell-specific cDNA libraries for transcriptome sequencing using Nanopore. We are in the process of preparing sufficient cDNAs from isolated cells to reach the needed input for Nanopore sequencing, and identifying downstream transcriptomic changes following SMN-1 depletion

Au cours de ce travail de thèse, nous avons étudié la structure secondaire du snoRNA U3A de S cerevisiae libre et au sein de la snoRNP U3. Nous avons aussi étudié la structure secondaire des pré-snoRNA U3A et U3B et de l'intron de l'ARN prémessager de l'actine de S cerevisiae. Les résultats obtenus ont permis de proposer des modèles de structure secondaire pour les snoRNA U3 et pré-snoRNA U3 de levures des genres Kluyveromyces, Pichia et Hansenula, d'identifier les motifs et séquences conservés dans ces ARN. Enfin, nous avons réalisé une étude de la relation entre la structure secondaire du pré-snoRNA U3 et son efficacité d'épissage in vitro et in vivo. Nous montrons que le snoRNA U3 de S cerevisiae, qui est impliqué dans les premières étapes de maturation du pré-ARN ribosomique, est constitué de deux domaines. Un domaine 3'qui présente une structure à 4 branches, avec au centre et au sein d'une des hélices, quatre des boîtes phylogénétiquement conservées du snoRNA U3. Ces boîtes constituent comme nous l'avons montré, le site defixation des protéines de la snoRNP U3. Le rôle essentiel du domaine 3' doit être de fixer les protéines. Le domaine 5', de petite taille, comporte deux structures tige/boucle de faible stabilité. Ce domaine comporte deux séquences qui interagissent avec le pré-ARN ribosomique, la boite. A et un segment s'appariant à la région 5' ETS. Une grande partie de cette structuration de l'ARN mature est déjà formée dans l'ARN précurseur. L'intron du pré-snoRNA U3A comporte une longue structure tige/boude centrale et des structures tige/boucle renfermant le site 5' et le site 3' d'épissage. C'est la première structure secondaire complète établie pour un pré-ARN épissé dans un spliceosome. L'observation d'une structure tige/boucle centrale dans l'intron est un argument fort en faveur de l'hypothèse selon laquelle les longs introns chez S cerevisiae doivent avoir une structuration permettant de rapprocher le site 5'et la boîte de branchement afin de favoriser la formation des complexes spliceosomaux. Nous avons apporté d'autres arguments expérimentaux complémentaires en faveur de cette hypothèse, en étudiant l'intron du pré-ARNm de l'actine et en remodelant la région centrale de l'intron du pré-snoRNA U3A. Enfin, l'étude de pré-snoRNA d'autres levures apporte des arguments phylogénétiques enfaveur d'un rôle important de cette structure tige/boucle centrale. D'une manière générale, toutes les caractéristiques structurales du pré-snoRNA U3A sont conservées dans les autres pré-snoRNA U3A que nous avons étudiés, ce qui suggère une importance fonctionnelle de ces caractéristiques structurales. Le remodelage du pré-snoRNA U3A et la production de pré-ARN chimériques entre pré-snoRNA U3A et pré-ARNm de l'actine a montré l'importance de la structure secondaire dupré-ARN pour l'efficacité d'épissage chez S cerevisiae. Un appariement fort du site 5' ou de la boîte de branchement bloque l'épissage, un appariement du site 3' est mieux toléré. La structure secondaire du pré-snoRNA U3A a manifestement été sélectionnée de façon à assurer une forte efficacité d'épissage de ce pré-ARN, malgré une boîte 5' appariée et une boîte de branchement non canonique, d'où sans doute des possibilités de régulation. Nous avons montré l'importance qu'avait, pour le fort taux d'épissage observé, la présence d'une boîte de branchement en simple brin et de manière très inattendue, la présence d'un exon 2 très structuré. Cet exon peut même avoir un effet activateur en cis sur l'épissage d'un intron hétérologue.

Durant ce processus central qu’est la biogenèse des ARNm, la formation de la queue polyA est une étape clé impliquant de nombreuses activités enzymatiques et complexe protéiques. CF IA (Facteur de Clivage 1A) est un complexe macromoléculaire essentiel pour les deux étapes de clivage et de polyadénylation durant la formation de la queue poly(A) à l’extrémité 3’ de l’ARNm de levure. Constitué par les protéines RNA14, RNA15, Pcf11 et CLP1 dans une stœchiométrie supposée 2:2:1:1. Cependant, contrairement au complexe CPF (Facteur de Clivage et de Polyadénylation) qui porte les activités de clivage et de polyadénylation, aucune activité enzymatique n’a pu être associé au CF IA, suggérant un rôle d’architecture via d’une part la liaison à l’ARN et à d’autres complexes d’autre part. Dans ce travail, j’ai pu combiner les données obtenues par différentes approches biophysiques pour apporter des précisions sur l’organisation structurale au sein du CF IA mais également étudier l’importance biologique de certains motifs spécifiques
During this major process which is mRNA biogenesis, the formation of the polyA tail is a key step involving numerous enzymatic activities and protein complex. CF IA (Cleavage Factor IA) is a macromolecular complex essential for both cleavage and polyadenylation steps during the formation of the 3'-end poly(A) tail of the yeast mRNA. Composed by RNA14, RNA15, Pcf11 and CLP1 yeast proteins in an assumed stochiometry of 2:2:1:1. However, unlike CPF (Cleavage and Polyadenylation Factor) complex hosting the both cleavage and polyadenylation activities, no enzymatic activity has been associated to CF IA, suggesting a scaffolding and/or positioning activity through the binding on the one hand to the RNA and on the other hand to other complexes. In this work, I was able to cross-use different biophysical technics to get insights on the structural organization within the CF IA as well as studying the biological importance of some specifics sequences

Les ribosomes sont des complexes nucléoproétiques responsables de la traduction. Chez les eucaryotes, la biogenèse du ribosome est un processus complexe très régulé qui fait intervenir un nombre important de facteurs d’assemblages (~200). La construction d’un ribosome est initiée dans le nucléole puis continue dans le nucléoplasme et se termine dans le cytoplasme. La maturation cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomale implique la dissociation séquentielle des facteurs d’assemblage tardifs et la maturation finale de l’ARNr 18S. Ce processus est catalysé par l’endonucléase Nob1 qui assure la coupure de l’extrémité 3’ du précurseur de l’ARNr 18S (pré-18S) aboutissant à sa forme mature. Ce mécanisme est coordonné par la protéine Pno1 qui est le partenaire de Nob1. Des informations détaillées sur l’architecture des particules pré-ribosomiques nous ont permis de mieux comprendre les différents intermédiaires de la biogenèse. Cependant, certains aspects fonctionnels comme la conformation adoptée par Nob1 pour assurer la coupure du site D du pre-18S reste encore flou. L’objectif de mon travail a été de mieux comprendre les aspects très tardifs de la maturation cytoplasmique du ribosome. Pour ce faire, nous avons redéfini l’organisation modulaire de l’endonucléase Nob1 chez les eucaryotes pour ensuite étudier son mode d’interaction avec son partenaire Pno1. Des tests fonctionnels in vitro ont été effectués pour étudier le rôle de Pno1 dans la régulation de la coupure par Nob1.Nos résultats nous ont permis de montrer que le domaine catalytique de Nob1 adopte une conformation atypique. En effet le domaine PIN est composé de deux fragments (res 1-104 and 230-255) séparé par une boucle interne qui est importante pour la reconnaissance avec son partenaire Pno1. Nos études nous ont également montré que Pno1 inhibe l’activité de Nob1 probablement en reconnaissant directement l’ARNr substrat, masquant ainsi le site de coupure de l’endonucléase. Ces résultats sont complémentaires et cohérents avec les données structurales de cryo-EM de la particule pré-40S humaine récemment publiées. En effet, Nob1 est dans une conformation incapable de couper le pré-ARNr puisque son domaine catalytique se retrouve à une distance d’environ 30Å de son ARN substrat. Ce phénomène implique donc des changements de conformations ou encore la nécessité de protéine accessoire pour déplacer certains facteurs. La protéine Cinap est impliqué dans la maturation de l’ARNr 18S. Nos études d’interaction avec les protéines localisées au niveau de la plateforme (à savoir RPS14, RPS26, le complexe Nob1/Pno1) ont permis de montrer que Cinap pouvait former un complexe tripartite avec l’endonucléase Nob1 et son partenaire Pno1. De plus, Cinap est capable de reconnaitre RPS26 dans un complexe RPS14-dépendant. Il est important de noter que RPS26 est un composant de la petite sous-unité qui remplace Pno1 dans le ribosome mature. De ce fait le recrutement de RPS26 au sein du pré-ribosome nécessite la dissociation de Pno1 et cet échange serait assurée par Cinap. Sur la base des travaux effectués, nous pouvons proposer un modèle de maturation où la formation du complexe Cinap/Pno1 induirait un changement de conformation permettant à Nob1 de reconnaitre son substrat et donc de catalyser la coupure du site D qui aboutit à la maturation de l’ARNr 18S et donc à la production de la sous-unité 40S mature
Ribosomes are translational machineries universally responsible of protein synthesis. In eukaryote, ribosome assembly is a complex and highly regulated process that requires coordinated action of more than 200 biogenesis factors. Ribosome assembly is initiated in the nucleolus, continues in the nucleoplasm and terminates in the cytoplasm. The cytoplasmic maturation events of the small ribosomal subunit are associated with sequential release of the late assembly factors and concomitant maturation of the pre-rRNA. During final maturation of the small subunit, the pre-18S rRNA is cleaved off by the endonuclease Nob1, which activity is coordinated by its binding partner Pno1. Detailed information on pre-ribosomal particle architectures have been provided by structural snapshots of maturation events. However, key functional aspects such as the architecture required for pre-rRNA cleavage have remained elusive. In order to better understand these late steps of cytoplasmic pre-40S maturation, we first redefine the domain organization of Nob1, then study its binding mode with Pno1 using different tools such as sequence analysis, structure prediction and biochemical experiments and, we then performed functional assay to elucidate the role played by Pno1 during the pre-18S rRNA maturation.Our results have shown that eukaryotic Nob1 adopts an atypical PIN domain conformation: two fragments (res 1-104 and 230-255) separated by an internal loop, which is essential for Pno1 recognition. We also found out that Pno1 inhibits Nob1 activity likely by masking the cleavage site. Our findings further support the recently published cryo-EM structure of the pre-40S, where Nob1 displays an inactive conformation. Moreover, 18S rRNA 3’-end cleavage has to happen and this implies structural rearrangement or requirement of some accessory proteins such as Cinap, an atypical kinase involved in pre-18S processing. Studying the interplay between proteins localized in the pre-40S platform (RPS14, RPS26, Nob1/Pno1 complex) has shown that Cinap is able to form a trimeric complex with Nob1 and its binding partner Pno1. Furthermore, Cinap can recognize RPS26 in a RPS14-dependent manner, which had already been studied with its yeast counterpart. It is important to note that RPS26 is the ribosomal protein replacing Pno1 in the mature ribosome. Our finding clearly suggests a mechanism where RPS26 recruitment to the ribosome requires Pno1 dissociation. This exchange would be carried out by Cinap. Therefore, we can suggest a simplified model as follow: upon binding with Pno1, the newly formed complex (Cinap/Pno1) will trigger a conformational change, which will allow the endonuclease Nob1 to reach its substrate (D-site) and perform its cleavage resulting in mature 18 rRNA generation

La maturation 3’ des pré-ARNm constitue une étape majeure dans la régulation post-transcriptionnelle de l’expression des gènes, indispensable à la stabilité, l’export vers le cytoplasme et la traduction des ARNm. Elle est composée de deux réactions : un clivage à l’extrémité 3’ suivie de l’addition d’une queue poly(A). Des études ont montré que la maturation en 3’ est inhibée en réponse aux dommages de l’ADN. Cependant, la cellule a mis en place des mécanismes compensatoires qui permettent à certains pré-ARNm d’être correctement maturés assurant ainsi le maintien de son intégrité. Les travaux que nous avons menés ont mis en évidence un mécanisme de résistance à l’inhibition de maturation en 3’ du pré-ARNm codant pour le suppresseur de tumeur p53. Ce mécanisme fait intervenir l’hélicase DHX36 qui déplie une structure secondaire appelée G-quadruplexe située en aval du site de clivage. Par ailleurs dans une deuxième étude, nous avons montré que la maturation en 3’ maintenue du pré-ARNm p53 en réponse aux dommages de l’ADN, est découplée du processus de transcription, contrairement au pré-ARNm TBP dont la maturation 3’ est inhibée en réponse aux dommage de l’ADN. Ce découplage a lieu grâce à un clivage co-transcriptionnelle du pré-ARNm p53 au niveau de la chromatine qui entraîne sa libération dans le nucléoplasme où il subit sa maturation en 3’. Une étude à grande échelle nous a permis de montrer que ce mécanisme de maturation en 3’ survenant dans le nucléoplasme est associé au maintien d'une maturation en 3’ efficace en réponse aux dommages de l’ADN
The 3’-end processing of pre-mRNA, a key step in the post-transcriptional gene expression regulation, is essential for mRNA stability, export and translation. This process is a two-step reaction composed of a cleavage at the 3’-end followed by the addition of a poly(A) tail. Studies have shown that pre-mRNA 3’-end processing is inhibited in response to DNA damage. However, compensatory mechanisms exist to allow some pre-mRNA to be properly processed at their 3’-end in order to maintain cell integrity. For instance, in response to DNA damage, the 3’-end processing of the pre-mRNA coding for the tumor suppressor p53 is able to escape from its inhibition. In the present work, we have shown that the underlying mechanism involves the DHX36 helicase that unwinds a secondary structure called G-quadruplex located downstream of the cleavage site of the p53 pre-mRNA. Moreover, in a second study, we have shown that the maintained p53 pre-mRNA 3’-end processing in response to DNA damage is uncoupled from the transcription process, unlike the inhibited TBP pre-mRNA 3’-end processing. This uncoupling takes place through a co-transcriptional cleavage of p53 pre-mRNA from the chromatin and its release in the nucleoplasm where it undergoes its 3’-end processing. A genome-wide study allowed us to show that the pre-mRNA 3’-end processing occurring in the nucleoplasm is associated with a maintained 3’end processing in response to DNA damage

La maturation terminale des anticorps (Ac) entraîne la production d'Ac, d'une part d'isotypes diversifiés, par le mécanisme de commutation de classe (CSR), et d'autre part de forte affinité pour l'antigène, par l'introduction d'hypermutations somatiques (SHM). Ces deux voies reposent sur l'introduction de modifications dans le locus génétique codant les Ac. L'étude de patients présentant des défauts de maturation terminale des anticorps a largement contribué à la compréhension de ces mécanismes. L'analyse de souris invalidées a permis d'impliquer le système de réparation des mésappariements (MMR) dans ces voies, mais très peu de données dont disponibles chez l'Homme à ce sujet. Le but de cette thèse a été d'étudier l'implication du MMR dans les mécanismes de CSR et SHM chez l'Homme. Pour ce faire, nous avons analysé 18 patients portant des mutations homozygotes ou bi-alléliques de gènes codant différents facteurs du MMR : PMS2, MLH1 et MSH6. Nous avons mis en évidence un défaut de CSR in vivo et in vitro chez ces patients, indiquant que les facteurs du MMR sont des acteurs de cette voie. L'étude des différentes étapes du CSR a montré que PMS2 est impliqué dans la génération de cassures double-brin dans l'ADN, alors que MSH6 pourrait avoir un rôle supplémentaire en aval de cette étape. De plus, nos résultats indiquent que MSH6, mais non PMS2 et MLH1, intervient dans le mécanisme d'introduction des SHM. L'étude de mutants naturels humains, bien que complexe, nous a permis de mettre en évidence des rôles des facteurs du MMR dans les mécanismes de maturation terminale des Ac
Antibody (Ab) maturation relies on two mechanisms: Class Switch Recombination (CSR) and Somatic Hypermutations (SHM), both occuring through DNA rearrangements in the gene encoding Ab. The CSR results in the production of different isotypes of Ab and the introduction of SHM leads to the production of Ab with increased affinity for the antigen. The analysis of patients suffering from Ab maturation defects has provided new insights into the mechanisms underlying CSR and SHM. The study of knockout mice suggested that the Mismatch Repair (MMR) machinery is involved in these mechanisms, however very little is known about this in humans. The aim of this work was to study the involvement of MMR factors in the human Ab maturation process. We analysed 18 patients carrying homozygous or biallelic mutations of different MMR genes : PMS2, MLH1 or MSH6. We showed that CSR is defective in these patients in vivo and in vitro, leading to the conclusion that MMR factors are actors of the CSR mechanism. The study of the different steps of CSR showed that PMS2 is responsible for the introduction of DNA breaks, whereas MSH6 could play an additional role downstream of this step. Moreover, our data reveal that MSH6, unlike PMS2 and MLH1, is involved in the introduction of SHM. The study of natural human mutants, though complex, provide evidence that MMR factors play a role in the Ab maturation mechanisms

Streptococcus pneumoniae est un pathogène majeur de l'homme qui pose un problème de santé publique du fait de sa variabilité antigénique et de sa capacité à acquérir des gènes de résistance aux antibiotiques. En fait, cette bactérie peut développer un état physiologique transitoire régulé génétiquement (la compétence), lors duquel elle peut internaliser et intégrer dans son chromosome par recombinaison homologue de l'ADN exogène (transformation génétique naturelle). Nous avons montré que la compétence (et donc la transformation) pouvait être induite par des antibiotiques couramment utilisés en thérapie (Prudhomme, Attaiech et al. Science 2006). Ainsi, l'utilisation mal contrôlée d'antibiotiques peut augmenter le pouvoir pathogène de S. Pneumoniae en favorisant les transferts génétiques. J'ai ensuite travaillé sur le devenir de l'ADN transformant après son internalisation. J'ai tout d'abord tenté d'identifier la/les nucléase(s) qui peuvent agir sur cet ADN. Les différentes approches utilisées n'ont pas abouti mais parmi les candidats testés, j'ai pu montrer que Pms et CoiA influent sur l'efficacité du système général de réparation des mésappariements (Hex) et j'ai étudié RadC pour laquelle nous avons proposé une révision de l'annotation pfam (Attaiech, et al. J. Bact. 2008). Nous avons ensuite déterminé que la protéine majeure du complexe d'éclipse (forme protégée de l'ADN internalisé) est SsbB (Morrison et al. J. Bact. 2007). Toutefois, en poursuivant la caractérisation de ce complexe, nous avons pu montrer que la méthode de purification utilisée n'est pas adaptée pour connaître sa composition protéique exhaustive
During my doctorate, I studied different aspects of genetic transformation in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. This bacterium can naturally develop a transient physiological state, named competence, in which it is able to internalize and integrate exogenous DNA into its chromosome by homologous recombination. We showed that antibiotic treatment can induce competence and transformation, thus enabling genetic plasticity and increasing pathogenicity of S. Pneumoniae (Prudhomme, Attaiech et al. Science 2006). Then, my work concentrates on the fate of DNA after internalization during the process of transformation. First, I have analysed several mutants with the aim of identifying the nuclease(s) that can degrade internalized DNA. So far, I have been unable to identify this nuclease. However, among the tested candidates, CoiA and Pms have been implied in the mismatch repair process and we showed that, despite the original annotation, there is no evidence of a role of RadC in connection with repair and/or recombination. This permitted a revision of the Pfam annotation (Attaiech et al. J. Bact. 2008). Finally, we focused on the protection of internalized DNA and showed that the major protein component of the eclipse complex (EC, a nucleocomplex in which internalized DNA is protected) is the competence-induced protein SsbB (Morrison et al. J. Bact. 2007). I have done further biochemical experiments on the characteristics of EC and show that the support used during purification exhibits strong affinity for a lot of protein. That implies that the real nature of the EC has to be discovered

La vigne est une plante cultivée dans le monde entier dont l’importance économique est principalement liée à la production de vin. La baie de raisin est également l’un des principaux modèles d’étude pour les fruits non-climatériques notamment pour l’étude des mécanismes contrôlant le mûrissement des baies. Le développement de la baie de raisin est caractérisé par deux phases de croissance séparées par une phase de latence se produisant au moment de la véraison. La baie de raisin est composée de trois tissus principaux: la peau, la pulpe et les graines. La peau et la pulpe présentent une structure et une composition en métabolites distinctes et contribuent de manière différente à la qualité du vin, la pulpe fournissant essentiellement le sucre, les acides aminés et organiques alors que la peau est riche en anthocyanes. A l'heure actuelle, les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la maturation des baies de raisin sont encore mal compris. Si l'ABA, le sucre et différents facteurs de transcription jouent un rôle important dans le contrôle de cette phase de développement, les mécanismes épigénétiques, en particulier la méthylation de l’ADN, apparaissent aussi comme des régulateurs importants du développement et du mûrissement des fruits charnus. Dans ce contexte, Le projet de thèse présenté vise à analyser le rôle de la méthylation de l’ADN (1) dans la maturation des baies de raisin et (2) dans la synthèse des anthocyanes en utilisant comme système modèle des cellules de baie de raisin cultivées in vitro.La culture in vitro de baies de raisin en présence d’inhibiteurs de la méthylation de l'ADN, aboutit à une inhibition de la maturation, suggérant que la méthylation de l’ADN joue un rôle crucial pour cette étape du développement chez la vigne. La pellicule et la chair de baies de raisin récoltées à divers stades de développement ont ensuite été analysées séparément pour déterminer les variations des transcriptomes, de l’abondance de différents métabolites, et de la méthylation de l'ADN. Les principaux résultats indiquent des variations des métabolites et du transcriptome, avec des spécificités liés au tissu analysé. En outre, l'analyse des variations de méthylation de l'ADN à deux stades de développement dans chacun de ces deux tissus révèle l’existence de variations de méthylation spécifiques à chaque tissu, tandis que les variations communes aux deux tissus restent limitées. Ces résultats suggèrent un contrôle de la méthylation de l’ADN spécifique à chaque tissu lors de la maturation de la baie. Cependant les régions différentiellement méthylées identifiées dans chaque tissu, ne sont pas associées à des gènes exprimés différentiellement au cours de la maturation des baies, ce qui pose la question du rôle de la méthylation de l’ADN dans le contrôle de l’expression génique dans les baies.Pour analyser le rôle de la méthylation de l’ADN dans le contrôle de la synthèse des anthocyanes, nous avons utilisé des suspensions de cellules de raisin du génotype Gamay Teinturier (GT), connues pour accumuler des anthocyanes lorsqu’elles sont cultivées à la lumière. L’utilisation de la zébularine, un inhibiteur de la méthylation d’ADN, permet de stimuler l’accumulation d'anthocyanes dans les cellules GT en présence de lumière, et de l’induire à l’obscurité. Les traitements à la zébularine provoquent en outre une limitation de la croissance cellulaire, une modification de l’accumulation des sucres solubles et acides organiques ainsi qu’une reprogrammation importante du transcriptome. Ces résultats suggèrent un effet général de la zébularine sur les cellules GT plutôt qu’un effet spécifique sur l’accumulation d’anthocyanes.Dans l'ensemble, les résultats indiquent que la méthylation de l'ADN est importante pour le contrôle de la maturation des fruits de la vigne, bien que les mécanismes qui sous-tendent les variations de la méthylation et leurs rôles dans les différents tissus de la baie de raisin restent à préciser
Grapevine is a worldwide cultivated fruit crop with high economic importance mainly because of its usage for vine production. Grape berry is also one of the main models for non-climacteric fruits to study the mechanisms controlling the ripening process. Grape berry development is characterized by two phases of rapid size increase separated by a lag phase at the time of ripening induction. Grape berries are composed of three main tissues, the peel, the pulp and the seeds. Peel and pulp present distinct structure and metabolite composition and contribute in a different way to wine quality, the pulp providing sugar, amino and organic acids whereas the peel is important for anthocyanins and other phenolic compound abundance. At the present time, the molecular mechanisms involved in the control of grape berry ripening are still poorly understood. Recent results indicate that both ABA and sugar may be important signals together with various transcription factors. In addition, epigenetic mechanisms are now emerging as important regulators of fleshy fruit development, DNA methylation being critically important for tomato, sweet range and strawberry ripening.The present project aims at analyzing the potential role of DNA methylation in the control grape berry ripening. It also investigates the potential role of DNA methylation in the synthesis of anthocyanins, a compound of primary importance in peel of red grape berries, using in vitro grown fruit cells. To address these questions, grape berries cultivated in vitro were treated with DNA methylation inhibitors. Treatments resulted in delayed and reduced grape berry ripening, therefore sustaining the idea that DNA methylation plays critical roles at this developmental step. Grape berries harvested at various developmental stages were then dissected and each tissue was separately analyzed for transcriptomic, metabolic and DNA methylation variations. Main results indicate significant and distinct metabolic and transcriptomic variations consistent with each tissue following specific modifications during ripening. In addition, analysis of DNA methylation variations at two developmental stages in each tissue indicates both common and tissue specific changes in DNA methylation patterns during fruit ripening. A very small proportion of DMRs is found similarly in the pup and the peel, but most are tissue specific, also consistent with tissue specific control at this developmental phase. Of note, among the different DMRs identified in each tissue, only a few were associated with differentially expressed genes (DEG) during ripening, whereas most were not, questioning the general role of DNA methylation in the control of gene expression at this developmental transition in grape.As Anthocyanins are the most abundant polyphenolic compounds in the skin of red grape berries, we used grape cell suspensions of the Gamay Teinturier genotype, that are known to accumulate anthocyanins when grown in light conditions, to analyze the potential role of DNA methylation in their synthesis. GT cells cultivated in light conditions were treated with the DNA methyltransferase inhibitor zebularine, they accumulate higher quantities of anthocyanins. Of note, GT cells grown in the absence of light do not accumulate anthocyanins. However, zebularine was sufficient to induce anthocyanin accumulation in the absence of light. Zebularine treatments had significant additional effects on grape cells including, cell growth limitation, and modification of soluble sugar, organic acid or stilbene accumulation, together with important transcriptomic reprogramming, consistent with a general effect on cells rather than a specific effect on anthocyanin accumulation.Taken together, results are consistent with DNA methylation being important in the control of grape fruit ripening, although the precise mechanisms underlying methylation variations and roles in grape berries remain to be deciphered

La biogenese des ribosomes met en jeu des machineries recrutees au niveau des genes ribosomiques en fin de mitose. Ces machineries sont peu connues chez les mammiferes. Dans cette etude, nous avons identifie une nouvelle proteine nucleolaire humaine, nop52. Nous avons clone nop52 par criblage d'une banque d'expression. La sequence de nop52 montre qu'elle est conservee et homologue d'une proteine de levure, rrp1 (rrna processing protein 1), impliquee dans l'exclusion de l'its2 de l'arnr. Nop52 se localise dans le composant granulaire du nucleole pendant l'interphase, a la peripherie des chromosomes pendant la mitose et dans les pnb (pre nucleolar body) a la transition telophase/g1. Nous demontrons que les proteines impliquees dans la maturation des arnr forment differents pnb selon qu'elles participent aux etapes precoces ou tardives. Nous avons etabli qu'il existe un ordre de recrutement de ces proteines dans le nucleole et nous proposons que leur cinetique d'adressage est en rapport avec leur fonction. Nous avons suivi par microscopie 4-d dans des cellules vivantes, la formation des pnb et l'assemblage du nucleole. Nos donnees montrent que : les pnb se forment a la peripherie des chromosomes et restent attaches a la chromatine condensee. La fibrillarine et nop52, presentent une cinetique differente d'adressage vers le nor. Cet adressage se fait par des flux a partir des pnb et non par fusion des pnb avec le nucleole comme il etait communement admis. Les pnb contenant la fibrillarine ont une duree de vie plus courte que ceux contenant nop52. Nous proposons que l'assemblage et le desassemblage des pnb controlent le recrutement des proteines dans le nucleole, et nous suggerons que les pnb sont des sites de retention dependants de la presence de pre-arnr. Enfin, nous avons observe le regroupement des territoires chromosomiques differents dans un seul domaine nucleolaire. Cette etude permet de mieux comprendre l'assemblage d'un domaine fonctionnel du noyau : le nucleole.

La @résistance aux anticancéreux résulte souvent de l'expression de la P-gp, une protéine à efflux codée par le gène MDR1 dont les mécanismes de régulation sont encore mal connus. Au cours de ce travail l'effet de modifications épigénétiques sur le phénotype nucléaire et l'expression du gène MDR1 a été analysé dans des cellules de carcinome pulmonaire sensibles H69WT et résistantes à la chimiothérapie H69VP. Différentes techniques ont été développées pour étudier la texture de la chromatine (cytométrie par analyse d'images), le cycle cellulaire (cytométrie en flux), les modifications post-traductionnelles des histones (western blot, AUT-PAGE) et les mécanismes de régulation du gène MDR1 (RT-PCR en temps réel, ChIP, MSP, COBRA). Il apparaît que les cellules H69VP surexprimant le gène MDR1 présentent, comparativement à leurs homologues sensibles H69WT, des altérations texturales nucléaires correspondant à un aspect " décondensé " de la chromatine. L'inhibition des histones désacétylases par la trichostatine A (TSA) modifie la supra-organisation de la chromatine dont la texture manifeste alors une décondensation progressive dans les cellules sensibles et transitoire dans les cellules résistantes. Ces modifications de la structure chromatinienne semblent refléter les variations du taux d'acétylation des histones H3 localisées au niveau du promoteur MDR1. La TSA induit une surexpression du gène MDR1 dans les cellules H69WT et une diminution de son expression dans les cellules H69VP. Cette régulation apparaît de nature transcriptionnelle et n'est pas liée à une modification de la stabilité de l'ARNm MDR1. L'inhibition de la synthèse protéique de novo réduit mais ne supprime pas l'effet de la TSA sur l'expression du gène MDR1. Ces résultats suggèrent que la TSA modifie l'expression et la fixation à l'ADN d'un ou plusieurs facteurs de transcription impliqués dans la régulation de ce gène de résistance. D'autre part, la modulation différentielle de l'expression du gène MDR1 par la TSA ne correspond pas à une différence de méthylation basale du promoteur MDR1, ni à des variations de l'état de méthylation de ce promoteur au cours du traitement par la TSA. Toutefois, la TSA modifie le profil épigénétique du promoteur MDR1 au niveau duquel elle induit une hyperacétylation des histones H3 et H4, progressive dans les cellules H69WT et transitoire pour les histones H3 dans les cellules H69VP. Enfin, malgré ses effets inverses sur l'expression du gène MDR1 dans les deux lignées cellulaires, la TSA augmente le recrutement du facteur co-activateur PCAF au niveau du promoteur de ce gène. Nos résultats suggèrent l'intérêt que pourraient présenter les inhibiteurs des HDACs dans le traitement des cancers multi-résistants
@Multidrug resistance often results from the expression of P-gp, an efflux pump encoded by the MDR1 gene. However molecular mechanisms that regulate MDR1 gene remain poorly understood. This study examined the consequences of epigenetic modifications on nuclear phenotype and MDR1 gene expression in lung carcinoma cell lines sensitive (H69WT) and resistant to chemotherapy (H69VP). H69VP resistant cells overexpressing MDR1 gene display nuclear texture alterations, as compared with H69WT sensitive cells, underlining a more uniform distribution of chromatin. Treatment with trichostatin A (TSA), a histone deacetylase inhibitor, induces a progressive and transient chromatin decondensation in sensitive and resistant cells respectively. These modifications seem to reflect variations of H3 acetylation levels on the MDR1 promoter. TSA up-regulates MDR1 gene expression in H69WT cells and down-regulates its expression in H69VP cells through a transcription mechanism without affecting MDR1 mRNA stability and independently of MDR1 promoter methylation and PCAF recruitment to the MDR1 inverted CCAAT box. Translation inhibition reduces these modulations without suppressing them, suggesting that TSA modifies the expression and DNA binding of transcription factors implicated in the regulation of MDR1 gene. These findings indicate that HDAC inhibitors may represent potential anticancer drugs in multidrug resistant tumors

Au cours du développement post-natal, le microbiote intestinal interagit intimement avec l'hôte et module à la fois la différenciation de l'épithélium intestinal et la maturation du système immunitaire. Hôte commun de la microflore commensale intestinale de l'Homme et des animaux à sang chaud, E. Coli s'établit dans le tractus digestif dès les premières heures ou jours qui suivent la naissance. E. Coli est alors une des espèces bactériennes dominantes de la flore du nouveau-né avant de devenir la bactérie aérobie facultative prédominante au sein du microbiote adulte. Certaines souches commensales de E. Coli sont capables d'induire des dommages à l'ADN dans les entérocytes. La génotoxicité des ces souches résulte de la production d'une toxine, la Colibactine, synthétisée à partir de synthases de polycétides et de peptides non ribosomaux. Cette voie de biosynthèse est codée par un îlot génomique appelé pks. Plusieurs études épidémiologiques récentes montrent que plus de 30% des jeunes enfants âgés de trois jours sont colonisés par des E. Coli qui portent l'îlot pks. Afin d'analyser les effets à long terme de la colonisation précoce des nouveau-nés par des souches de E. Coli génotoxiques, nous avons développé un modèle animal expérimental qui mime la transmission naturelle des E. Coli du microbiote de la mère au nouveau-né. Pour cela, des femelles rats gestantes sont gavées avec une souche commensale humaine génotoxique (E. Coli WT), son mutant isogénique non génotoxique (E. Coli DeltaclbA) ou le mutant complémenté (E. Coli DeltaclbA+clbA) pour lequel la production de la Colibactine a été restaurée. Après la naissance, la transmission des souches bactériennes et la persistance de la colonisation chez les nouveau-nés ont été évaluées. En parallèle, les dommages à l'ADN occasionnés par ces souches sur l'épithélium intestinal ont été comparés sur une période de 100 jours. Enfin, le développement et la maturation de l'épithélium intestinal ainsi que sa fonction de barrière ont été analysés sur cette même période. Les souches de E. Coli, produisant ou non la Colibactine, sont transmises à la descendance et colonisent de manière stable le tractus digestif tout au long de la vie de l'animal. Dès le deuxième jour après la naissance, des cassures double-brin de l'ADN (CDB) ont été observées dans les entérocytes des ratons colonisés par la souche de E. Coli WT ou E. Coli DeltaclbA+clbA complémentée mais sont absentes chez les nouveau-nés colonisés par le mutant E. Coli DeltaclbA. Si de manière surprenante, aucune CDB n'a été détectée chez ces rats devenus adultes (100 jours), une fraction des cellules en mitose présente en revanche des signes de persistance des CDB : des ponts anaphasiques sont observés chez les animaux adultes colonisés par des souches génotoxiques. L'étude des conséquences du portage à long terme de souches génotoxiques sur le développement de l'épithélium intestinal, a révélé une augmentation significative de la prolifération et de l'apoptose des entérocytes corrélée avec une augmentation de la vitesse de migration de ces cellules épithéliales le long de l'axe crypte-villosité chez les animaux exposés à des souches génotoxiques depuis la naissance. De plus, une augmentation du nombre des cellules entéroendocrines et des cellules de Paneth a été constatée chez ces mêmes animaux. Les répercussions des perturbations précédemment observées sur la fonction de la barrière intestinale ont été analysées ex vivo en chambres de Ussing et montrent une augmentation de la perméabilité intestinale chez les rats colonisés depuis la naissance par des souches génotoxiques en comparaison à des animaux colonisés par le mutant non génotoxique. Ainsi, la colonisation du nouveau-né par des E. Coli génotoxiques altère non seulement le développement et la maturation de l'épithélium intestinal à l'âge adulte mais également son intégrité. Ces modifications ont clairement des conséquences physiopathologiques pour l'hôte qui dépassent une prédisposition au développement de cancers colorectaux
During early development, intestinal microbiota intimately interacts with the host gastrointestinal (GI) tract and modulates epithelial cell differentiation and immune system maturation. Escherichia coli is one of the first bacteria colonizing the GI tract of mammals and humans within a few days after birth and become the predominant facultative anaerobic bacteria in the adult microbiota. Certain commensal E. Coli are able to induce DNA damage in eukaryotic cells. Genotoxicity of such E. Coli strains is known to result from Colibactin synthesis, an hybrid peptide polyketide product able to induce DNA double strand breaks in enterocytes. The biosynthesis pathway of Colibactin is encoded by a genomic island called pks. Several recent epidemiologic studies showed that more thirty per cent of three days old infants are colonized by E. Coli pks+. To analyze the long-term effects of colonization early in life by genotoxic E. Coli strains, we developed an animal model that mimics the natural transmission of E. Coli from the mother' to the neonate through direct contact with the maternal microbiota. Pregnant WISTAR rats were fed with a human genotoxic wild-type commensal E. Coli (E. Coli WT), an isogenic non-genotoxic mutant (E. Coli DeltaclbA), or an isogenic complemented mutant (E. Coli DeltaclbA+clbA) for which genotoxicity was restored. After delivery, pups' colonization and DNA-damages in enterocytes were monitored during 100 days. In addition, we analyzed gut development and maturation over the same period. E. Coli strains, producing or not Colibactin, were transmitted to the offspring and stably colonized the gut. DNA double strand breaks (DSBs) were observed in enterocytes of newborn rats colonized by E. Coli WT or E. Coli DeltaclbA+clbA complemented strain but were absent in newborn rats colonized by E. Coli DeltaclbA mutant. Interestingly, such genotoxicity was not detected in adults but a mitotic cells pool present signs of DSBs' persistence: with an an increased in number of anaphasic bridges was observed unin adult animals colonized since birth by genotoxic strains. In adult animals, tThe numbers of proliferating and apoptotic cells along were also significantly increased in the intestinal crypts of rats exposed to genotoxic E. Coli strains as compared to non-genotoxic E. Coli DeltaclbA mutant and this was correlated with an increase of intestinal epithelial cells migration along the crypt-villus axis in rats colonized with the genotoxic E. Coli strains. MoreoverIn addition, the numbers of enteéroendocrines cells and Paneth cells were increased in small intestine of the same animals. Finally, ex-vivo analysis of the intestinal barrier using Ussing chambers demonstrated that paracellular permeability to 4kDa dextran-FITC flux was increased in rats colonized by the genotoxic E. Coli strains as compared to rats colonized by the isogenic non-genotoxic DeltaclbA mutant. The genotoxicity of commensal E. Coli colonizing the newborns has long-lasting consequences on intestinal epithelium integrity, development and maturation at adulthood. These bacteria could be of major concerns since they are increasingly isolated from neonates in Europe and the USA

La tomate (Solanum lycopsersicum), qui forme un clade monophylétique restreint au sein de la large famille des Solanacées, est utilisée comme modèle pour l’analyse du génome, et le développement du fruit. A ce jour, de nombreux efforts ont été consacrés à l'analyse de la diversité génétique des espèces de tomate. Cependant peu de travaux ont porté sur l'analyse de la diversité épigénétique, alors qu’il est aujourd’hui admis que les processus épigénétiques jouent un rôle essentiel dans la diversité phénotypique. Dans un premier temps, le niveau de méthylation de l'ADN a été comparé dans les feuilles et les fruits de différentes variétés de tomates sauvages et cultivées. Puis la famille des gènes Enhancer of zeste (E (z)) a été analysée. Chez la tomate, cette famille comprend deux gènes fonctionnels ainsi qu’un pseudogène. Finalement la stabilité épigénétique reste un facteur majeur pouvant avoir un impact essentiel sur les stratégies de sélection végétales. En outre nous avons fait une caractérisation fine des différents aspects du développement du fruit et de la maturation
Tomato (Solanum lycopsersicum) which forms a small monophyletic clade within the large Solanaceae family has been chosen as a model system for studying the Solanaceae genome, fruit development and ripening. At that time, many efforts have been devoted to the analysis of the genetic diversity of tomato species, little work has focused on the analysis epigenetic diversity in this clade, although there is a general agreement that epigenetic processes play essential role in the phenotypic diversity in animal and plant system. As first step, DNA methylation level was analyzed in leaves and fruits of various wild and cultivated tomato species.Additionally, the Enhancer of zest (E(z)) gene family has been analyzed. In tomato, the E(z) family consists in two functional genes (SlEZ1, SlEZ2) and in a pseudogene (SlEZ3). In addition, the epigenetic stability is an important consideration that could have a significant on strategies for crop breading. Finally, we made a fine characterization of the different aspects of fruit development and ripening
All’interno della grande famiglia delle Solanacee è stato scelto il pomodoro (Solanum lycopsersicum) come sistema modello per studio dello sviluppo e maturazione del frutto. Molti sforzi sono stati fatti per analizzare la diversità genetica delle specie di pomodoro, pochi lavori invece riguardano l’analisi della diversità epigenetica, sebbene ci sia accordo sul fatto che processi epigenetici giochino un ruolo essenziale nella diversità fenotipica dei sistemi animali e vegetali. Inizialmente è stato analizzato il livello di metilazione del DNA in foglie e frutti delle diverse specie di pomodoro selvatico e coltivato. Inoltre, è stata analizzata la famiglia genica Enhancer of Zeste (E (z)). In pomodoro la famiglia E(z) consiste di 2 geni funzionali SlEZ1, SlEZ2 e di uno pseudogene SlEZ3. Inoltre la stabilità epigenetica è importante in quanto può avere un impatto sulle strategie di miglioramento genetico delle specie coltivate. Infine è stata condotta una attenta caratterizzazione dei meccanismi cellulari dello sviluppo del frutto e della sua maturazione