Academic literature on the topic 'Membranes plasmique et modèles'

L’assemblage de la protéine FtsZ au niveau de la membrane plasmique est l’une des premières étapes de la division des bactéries. La nature exacte du site de division n’est pas établie. Pour étudier l’influence des lipides membranaires sur la localisation de FtsZ, nous avons élaboré un modèle du feuillet interne de la membrane plasmique d’E. Coli. Un système à 2 lipides (dilauryl-phosphatidylethanolamine (DLPE) et dipalmitoyl-phosphatidylglycerol (DPPG)) et un système à 3 lipides (DLPE, DPPG et cardiolipine (CL)) ont été élaborés avec la technique de Langmuir. Ces systèmes présentent des domaines lipidiques stables dans le temps comme observés en microscopie à l’angle de Brewster et en microscopie à force atomique. Dans le système à 2 lipides, FtsZ s’assemble à l’interface entre le DLPE et les domaines de DPPG et modifie l’organisation de la monocouche. Dans le système à 3 lipides, FtsZ s’assemble préférentiellement sous les domaines de CL<br>Assembly of the protein FtsZ at the cytoplasmic membrane is one of the earliest steps in the division of bacteria such as E. Coli. What constitutes the site at which FtsZ acts is less clear. To investigate the influence of the membrane lipids on FtsZ localization and assembly, we have elaborated a model mimicking the inner leaflet of the bacterial plasmic membrane. A 2-lipid system constituted of dilauryl-phosphatidylethanolamine (DLPE) and dipalmitoyl-phosphatidylglycerol (DPPG) and a 3-lipid system constituted of DLPE, DPPG and cardiolipin (CL) were elaborated with the Langmuir technique. Using Brewster Angle Microscopy and Atomic Force Microscopy, we found that these systems presented time stable lipid domains. In the 2-lipid system, FtsZ was found to assemble at the interface between DLPE and DPPG domains, thus modifying the monolayer organisation. In the 3-lipid system, FtsZ was found to assemble preferentially under CL domains

Le développement d'outils performants de criblage de nouvelles molécules capables d'induire une réponse cellulaire identique à celle d'un ligand (agoniste/ antagoniste, etc...), est un enjeu important pour la recherche pharmaceutique. Les principales cibles utilisées aujourd'hui sont les récepteurs trans-membranaires couplés aux protéines G (RCPG), dont l'activation déclenche une cascade de réactions intracellulaires (signalisation) régulant des fonctions essentielles de la cellule. L'objectif de ce travail de thèse est la détection de l'initiation de la signalisation cellulaire par spectrométrie de fluorescence pour le récepteur d opioïde murin (mDOR) qui induit un changement conformationnel responsable d'un épaississement de sa partie transmembranaire lors de la signalisation, au niveau de la membrane plasmique de cellules eucaryotes in vivo. Ce changement est supposé générer des modifications de phase lipidique de la membrane plasmique lors de cette interaction RCPG/agoniste, avec des redistributions locales de certains lipides comme le cholestérol, conduisant à la génération d'une phase liquide-ordonnée (lo). Pour cela deux nouvelles sondes fluorescentes membranaires de la famille des Pyrènecholestérol ont été synthétisées, le 3b-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-one 1 et le 3b- hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-méthylidène 2. Dans un premier temps la comparaison du comportement de ces sondes vis-à-vis du cholestérol a été analysée dans différentes membranes modèles phospholipidiques. Les données de microcalorimétrie et de RMN-2H indiquent que ces composés induisent des perturbations des lipides comparables à celle du cholestérol. Les données d'absorption, combinées à la propriété hypochromique du chromophore pyrène, ont permis de mettre en évidence un comportement autoassociatif de ces sondes. Nous extrapolons ce résultat à celui du cholestérol car des simulations en dynamique moléculaire déduisaient cette même associativité. Nous retrouvons qu'elle augmente avec le degré d'insaturation des chaînes acyles et qu'elle diminue quand la quantité de cholestérol croît (plus grande miscibilité des sondes dans les membranes enrichies en cholestérol). Dans un deuxième temps la sensibilité du spectre d'émission de fluorescence à la polarité de l'environnement a été vérifiée et mise à profit dans des membranes modèles pour discriminer les membranes en phase ld de celles en phase lo (où la polarité du coeur de la membrane est plus faible). Enfin, l'incorporation de la sonde 2 dans la membrane plasmique de cellules vivantes CHO qui sur-expriment mDOR, a permit le suivi dans le temps, par spectrofluorimétrie et microspectrofluorimétrie, de la perturbation de phase induite par un agoniste de ce récepteur. Les bases d'un criblage sélectif sont donc posées.

Le développement d'outils de criblage de nouvelles molécules capables d'induire une réponse cellulaire identique à celle d'un ligand (agoniste, antagoniste. . . ) est un enjeu important pour la recherche pharmaceutique. Les principales cibles utilisées aujourd'hui sont les récepteurs trans-membranaires couplés aux protéines G (RCPG) dont l'activation déclenche une cascade de réactions intracellulaires (signalisation). L'objectif de ce travail de thèse est la détection de l'initiation de la signalisation cellulaire par spectrométrie de fluorescence pour le récepteur ??opioïde murin (mDOR) qui induit un changement conformationnel responsable d'un épaississement de sa partie transmembranaire lors de la signalisation, au niveau de la membrane plasmique de cellules eucaryotes in vivo. Ce changement est supposé générer des modifications de phase lipidique de la membrane plasmique lors de cette interaction RCPG/agoniste, avec des redistributions locales de certains lipides comme le cholestérol, conduisant à la génération d'une phase liquide-ordonnée (lo). Pour cela deux nouvelles sondes fluorescentes membranaires de la famille des Pyrènecholestérol ont été synthétisées, le 3?-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-one 1 et le 3?-hydroxy-pregn-5-ène-21-(1-méthylpyrényl)-20-méthylidène 2. Dans un premier temps la comparaison du comportement de ces sondes vis-à-vis du cholestérol a été analysée dans différentes membranes modèles phospholipidiques. Les données de microcalorimétrie et de RMN-2H indiquent que ces composés induisent des perturbations des lipides comparables à celle du cholestérol. Les données d'absorption, combinées à la propriété hypochromique du chromophore pyrène ont permis de mettre en évidence un comportement auto-associatif du cholestérol dépendant du degré de saturation des chaînes acyles. De plus ces sondes sont plus idéalement miscibles dans les phases lo. Dans un deuxième temps la sensibilité du spectre d'émission de fluorescence à la polarité de l'environnement a été vérifiée et mise à profit dans des membranes modèles pour discriminer les membranes en phase ld de celles en phase lo (où la polarité du coeur de la membrane est plus faible). Enfin, l'incorporation de la sonde 2 dans la membrane plasmique de cellules vivantes CHO qui sur-expriment mDOR, a permit le suivi dans le temps, par spectrofluorimétrie de la perturbation de phase induite par un agoniste<br>The development of tools for the screening of new receptors’ agonists is a major issue for pharmaceutical research. Currently, the main targets used are the G-protein coupled receptor of the plasma membrane which the activation trigger the signaling pathways involved in many cell functions. The goal of this thesis is the detection, using a spectrofluorometry approach in vivo, of the signaling pathway ignition by the mouse delta opioid receptor (mDOR). DOR is assumed to generate a relocalisation of some lipids (cholesterol) while agonist binding leading to the formation of a liquid-ordered phase (lo). Thus two fluorescent probes have been synthesized, which the 3beta-hydroxy-pregn-5-ene-21-(1-methylpyrenyl)-20-methylidene. Data from calorimetry and RMN-2H studies show that this probe induces the same lipid membranes disturbance than cholesterol. Absorption data of the probe allowed the assessment of a self-association process of cholesterol in model membranes, which is as a function of the acyl-chains saturation degree of phospholipids. Then the polarity sensitive property of the probe has been used to distinguish between ld and lo phases in model membranes. Finally, we incorporated the probes in CHO cells over-expressing mDOR to monitor, by fluorescence spectroscopy, the mean phase state change of the plasma membrane triggered by a mDOR agonist. This is the first step of a new screening approach

L’émergence de souches bactériennes et fongiques de plus en plus résistantes à la désinfection est un problème qui menace le développement et la santé humaine à travers le monde. Parmi les modes d’action possibles de ces traitements, notre intérêt va se porter sur les interactions avec la membrane plasmique dans le but de lyser le micro-organisme. Le premier objectif de cette thèse est donc de développer des molécules avec une structure amphiphile afin d’interagir avec ces membranes. Les azobenzènes sont intéressants à ce titre car leurs deux groupements phényles constituent déjà un squelette carboné apolaire. Le greffage d’une tête polaire sur ces molécules permettra donc de leur conférer des propriétés amphiphiles. Trois familles d’azobenzènes ont été synthétisées afin d’évaluer leurs propriétés antibactériennes et antifongiques. Un autre objectif de la thèse est de fournir les premières hypothèses sur le mode d’action des antibactériens synthétisés. Plus particulièrement, leur capacité à interagir avec des membranes plasmiques biomimétiques de bactéries a été évaluée. La première famille (AzoOH) comportant un groupement hydroxyle comme tête polaire a montré de bonnes propriétés biologiques mais une faible capacité à interagir avec les membranes plasmiques. La seconde famille (AzoPEG), avec une tête polaire de type triéthylène glycol a montré de médiocres activités biologiques, et une capacité à interagir avec les membranes plasmiques n’ont pas été améliorées. La troisième famille (AzoTAI) avec une tête polaire de type triméthylammonium a montré d’excellentes propriétés biologiques, une capacité à s’adsorber aux interfaces hydrophiles/hydrophobes et une interaction spécifique avec les lipides membranaires bactériens. L’interaction entre les AzoTAI à plus longue chaîne (6 carbones) et la phosphatidylethanolamine est particulièrement favorable. De manière globale, parmi les composés synthétisés, seule la famille des AzoTAI est capable d’interagir avec la membrane plasmique des bactéries et cette interaction est corrélée à l’activité antibactérienne. Néanmoins, même si ces composés constituent de bons candidats pour la lyse des microorganismes, leur activité cytotoxique vis-à-vis des cellules humaines pourrait limiter leurs applications dans le domaine médical<br>The emergence of bacterial and fungal strains more and more resistant to disinfection is a threat to the development of nations and human health around the world. Amongst the mechanism of action, we will focus on the interaction between the molecule and the plasmic membrane for the lysis of the microorganism. The first goal of this work is to synthetize amphiphilic molecules to interact with bacterial membrane Azobenzene are interesting because their two phenyl group give them an apolar moiety, the next step is a grafting of a polar head to make them become an amphiphile molecule. Three types of azobenzene were synthetized to evaluate their antibacterial properties and their antifungal properties. The second goal of this work is tounderstand how they interact with the plasmic membranes. To perform this, we tested the azobenzenes on biomimetic models of plasmic membranes. The first group of compounds (AzoOH) with an alcohol group as polar head showed good biological properties but have a poor potential to interact with plasmic membrane. The second group of compounds (AzoPEG) with a triethylene-glycol type polar head have mediocre biological activities, and their ability to interact with the membrane were not enhanced. The third group of compounds (AzoTAI) with a trimethylammonium type polar head showed very good biological activities, and strong interaction with bacterial membrane lipid. These antibacterial activities are correlated to their interaction with bacterial lipids. It also has good abilities to adsorb themselves to hydrophilic/hydrophobic interfaces. However, their cytotoxic activity on human cells can be a severe drawback with their use

Il est aujourd'hui bien connu qu'il existe des compartimentations latérales au sein même de la membrane, définissant des domaines. Une grande attention a été portée ces dernières années à des domaines membranaires particuliers, les " rafts ". Ces domaines enrichis en cholestérol et sphingolipides seraient impliqués dans certains processus de signalisation cellulaires qui nécessitent un transfert de l'information à la fois spécifique et efficace, comme c'est le cas notamment des RCPG. Dans cette étude, le rôle de l'environnement lipidique sur l'activité de deux RCPG, les récepteurs humains µ et d aux opioïdes (hMOR et hDOR) a été recherché. Des fractions enrichies en cholestérol (DRM) ont été analysées après extraction à froid en TX-100 de membranes cellulaires et la présence des récepteurs hMOR ou hDOR a été recherchée. Les données indiquent que peu de hDOR et hMOR sont retrouvés dans ces fractions à l'état basal, mais la redistribution d'une partie de ces récepteurs dans les DRM, dépendante de l'association des récepteurs aux protéines G, est observée après activation par leur ligand agoniste. Les données de pharmacologie obtenues après modulation de la teneur en cholestérol des membranes contenant ces récepteurs ont montré clairement un effet de la déplétion en cholestérol sur la fonctionnalité de hMOR et hDOR. Enfin, pour mieux cerner le rôle du cholestérol dans la distribution et l'activité des récepteurs, l'influence d'un autre stérol, l'ergostérol, a été étudié. Une modulation éventuelle de l'activité du récepteur hDOR par l'épaisseur de la membrane a été analysée en reconstituant le récepteur dans des liposomes ayant des lipides de longueur de chaînes variables<br>Numerous evidences show the existence of lateral heterogeneities within the plasma membranes defined as lipid domains. Among these, lipid rafts, have been extensively studied. They are characterised by an enrichment in cholesterol and sphingolipids, and are depicted as fluid plaforms that segregate membrane components involved in a particular signaling process, like signal transduction of GPCR, promoting the specificity and the efficiency of the response. Here we study the role of the lipidic environment on the activity of two GPCRs, namely human mu and delta opioid receptors (hMOR and hDOR). Cholesterol, which is a main component implicated in the formation of rafts, was here the subject of a particular interest. Membranes fractions that were enriched in cholesterol (DRM) were analysed after cold extraction by TX-100 of cellular membranes. The data we obtained show that hMOR and hDOR are found in DRM at a basal state. In contrast, when activated by an agonist, a relocalisation of a fraction of these receptors is observed in DRM and we show that this phenomenon is dependant of the association of these receptors with G-proteins. The analysis of pharmacological properties of hDOR and hMOR upon cholesterol depletion show clearly that some pool of receptors need cholesterol for function. To complete these data, we next examined whether this effect was due to direct interactions of the receptors with cholesterol or membrane thickness. To test this assumption, we have investigate the effect of ergosterol on hMOR and hDOR pharmacology and the acyl-chain length of the phospholipids on the function of the reconstituted hDOR

L’extraordinaire cohérence de la membrane plasmique est la résultante des interactions moléculaires de faible énergie existant entre les différents constituants qui la composent. De fait, les molécules s'organisent et ségrégent en fonction de leurs affinités respectives, formant des hétérogénéités locales au sein de la membrane. En regard de cette organisation, les questions fondamentales sont de comprendre sur quelles échelles spatio-temporelles ses hétérogénéités prennent place et d’identifier en quoi une telle organisation contribue-t-elle à réguler les grandes fonctions d’une cellule. Afin d’apporter une réponse à ces questions, il nous fallait dans une premier temps établir et valider une approche expérimentale robuste permettant d’identifier et de décrire les hétérogénéités locales de la membrane plasmique. Une utilisation systématique de la FCS à rayons variables a permis d’établir notamment le rôle fondamental de certains lipides dans la génération de ces hétérogénéités. Le second volet de cette étude a été essentiellement consacré à explorer l’impact d’une telle organisation membranaire sur différentes fonctions fondamentales de la physiologie d’une cellule. Ainsi, les partitionnements observés ont un effet important dans la signalisation en modulant l'intensité du signal provenant d'un stimulus externe. En d'autres termes, si les molécules conservent leur capacité de signaler, il apparaît clairement que cette microorganisation dynamique de la membrane en contrôle l’amplitude. En conclusion, nos résultats ont permis d'éclaircir certains points fortement débattus et de soulever plusieurs questions qui feront l'objet d'analyses ultérieures comme : le couplage entre les deux feuillets membranaires, l'impact des échanges membrane/cytoplasme de constituants ou le recyclage membranaire sur la régulation des fonctions cellulaires<br>The extraordinary coherence of the plasma membrane results from molecular interactions of weak energy between the membrane components. In fact, the molecules organize and segregate according to their respective affinities, creating local heterogeneities within the plasma membrane. Regarding this organisation, fundamental questions are to understand on which spatio-temporal scales these heterogeneities take place and to identify to what extent such dynamic organization contributes to control basic cellular functions. In order to answer these questions, it was necessary in the first time to establish and validate a robust experimental approach making possible the identification and description of the plasma membrane heterogeneities. A systematic use of the FCS performed at variable wait of observation has made possible to establish the fundamental implication of certain classes of lipids in the generation of these heterogeneities. The second focus of this study was primarily devoted to explore the impact of such membrane organization on various fundamental cellular functions. Thus, molecular partitioning has an important effect signal delivery by modulating the intensity of the outcome signal. In other terms, if the molecules preserve their capacity to signal, it clearly appears that this dynamic micro-organization of the membrane controls the amplitude of the signal. In conclusion, our results have allowed us to clarify debated points but also to raise several news questions which will the subject of future studies like the coupling between the two membrane leaflets, the impact of the membrane component exchanges/cytoplasm or membrane recycling on the regulation of cellular functions

La protéine transactivatrice Tat joue un rôle crucial dans la multiplication du VIH-1. Elle a un rôle établi dans la transcription virale. Elle possède de plus la propriété d'être sécrétée par les cellules infectées. Elle peut ensuite pénétrer par endocytose dans les cellules non-infectées, où elle va provoquer divers dysfonctionnements. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que Tat est sécrétée directement à travers la membrane plasmique en utilisant un mécanisme de sécrétion non conventionnel. Nous avons montré que le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PI(4,5)P2, est responsable du recrutement de Tat sur le feuillet interne de la membrane plasmique. En effet, Tat se fixe au PI(4,5)P2 avec une grande spécificité et une forte affinité. Cette interaction de stochiométrie 1:1 implique un triplet de résidus basiques de Tat (résidus 49-51). Elle est stabilisée par l'insertion membranaire de la chaîne latérale du Trp11. Ce mécanisme de fixation original restreint la fixation de Tat au PI(4,5)P2 membranaire mais permet aussi une très haute affinité. Celle-ci va permettre à Tat d'être sécrétée mais aussi de déplacer des protéines cellulaires du PI(4,5)P2. D'autre part, nous avons élucidé le mécanisme moléculaire permettant l'insertion de Tat dans la membrane endosomale. Elle est induite par le pH acide (pH~5. 3) de ces compartiments. Ce pH acide est détecté par un système "sensor" impliquant Tat-Glu2, résidu acide qui est relié par un pont salin avec un triplet d'Arg (55-57). La protonation de Glu2 rompt les ponts salins, permettant l'exposition du Trp11 et l'insertion membranaire de Tat, préalable à sa translocation vers le cytosol<br>The HIV-1 transactivating factor Tat, plays a critical role in HIV-1 pathogenesis. It is strictly required for viral transcription. It can also be secreted by infected cells. Once in the bloodstream, it can enter the cytosol of uninfected cells by endocytosis and dramatically affect their biological activity. Here, we provide evidence that Tat is directly secreted through the plasma membrane using an unconventional secretion pathway. We found that phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate, PI(4,5)P2, is responsible for Tat recruitment to the inner leaflet of the plasma membrane, thereby allowing its membrane insertion and translocation. We observed, using a variety of biophysical techniques, that Tat binds specifically and with a very high affinity to a single molecule of PI(4,5)P2. This interaction is mediated by a triplet of basic residues (residues 49-51), and is stabilized by the concomitant membrane insertion of the side chain of Tat-Trp11. This original mechanism restricts Tat binding to membrane embedded PI(4,5)P2, but also enables very tight binding. This high affinity allows Tat to be secreted and to displace cell proteinsƒnƒnfrom the plasma membrane. We also elucidate the molecular mechanism responsible for Tat insertion into the endosome membrane. This insertion is triggered by the low pH (pH ~5. 3) present within the endosome lumen. Acidic pH is detected by a sensor made of Glu2 and an Arg triplet (55-57) that are connected by a salt bridge. Glu2 protonation at low pH will destabilize the salt bridge, thereby allowing Trp11 exposure and enabling membrane penetration. This is the first step of the membrane translocation process that will allow Tat delivery to cytosol

Il est possible de perméabiliser la membrane plasmique des cellules par des agents chimiques (tels que les polyéthylènes glycols ou le diméthylsulfoxyde) ou par des agents physiques (tels que les ultrasons ou les impulsions électriques). Cette perméabilisation peut être réversible ou non, ce qui signifie qu’après la perméabilisation, la membrane retrouve son intégrité et ses propriétés d’hémi-perméabilité ou pas. Ces techniques peuvent être utilisées pour faire rentrer des médicaments ou des acides nucléiques dans les cellules ou pour générer des fusions cellulaires. Une approche récente, la dynamique moléculaire, utilise des simulations numériques pour prédire les effets des agents perméabilisants sur les membranes à l’échelle moléculaire, et permet d’apporter de nouvelles données pour comprendre les mécanismes moléculaires, encore peu connus à ce jour.Les impulsions dites « classiques » en électroperméabilisation, de l’ordre de la dizaine de millisecondes à la centaine de microsecondes et d’amplitude de champ de l’ordre de 100 kV/m, perméabilisent la membrane plasmique uniquement. Cependant, récemment, des impulsions plus courtes, dites impulsions nanoseconde (quelques nanosecondes) et de plus grande amplitude de champ (de l’ordre de 10 MV/m) ont été utilisées et permettent d’affecter également les membranes des organites cellulaires. Les travaux de cette thèse portent dans un premier temps sur les effets perméabilisants d’un agent chimique (le diméthylsulfoxyde, DMSO) en comparant les modèles prédictifs de la dynamique moléculaire avec des expériences in vitro sur des cellules. Le modèle numérique prédit trois régimes d’action en fonction de la concentration du DMSO. Utilisé à faible concentration, il y a déformation de la membrane plasmique. L’utilisation d’une concentration intermédiaire entraîne la formation de pores membranaires et les fortes concentrations de DMSO ont pour conséquence la destruction de la membrane. Les expériences in vitro faites sur des cellules ont confirmé ces résultats en suivant l’entrée de marqueurs de perméabilisation. Cette étude a été comparée avec la perméabilisation par un agent physique (les impulsions électriques). Dans un deuxième temps, ces travaux traitent du développement et de l’utilisation d’un nouveau dispositif d’exposition des cellules aux impulsions nanoseconde qui permet d’appliquer des champs électriques très élevés et d’observer par microscopie leurs au niveau cellulaire. Pour finir, ce dispositif a été utilisé avec des impulsions nanoseconde pour générer des pics calciques dans de cellules souches mésenchymateuses qui présentent des oscillations calciques spontanées liées à leur état de différenciation. Ces pics induits sont dus à la libération de calcium stocké dans les organites et/ou à la perméabilisation de la membrane plasmique permettant l’établissement d’un flux de calcium intramembranaire. Il est aussi possible d’utiliser des impulsions microseconde pour générer des pics calciques dans ces cellules. Dans ce cas, les pics calciques ne sont dus qu’à la perméabilisation de la membrane plasmique. En jouant sur l’amplitude des champs électriques appliqués et sur la présence ou l’absence de calcium externe, il est possible de manipuler les concentrations calciques cytosoliques en mobilisant le calcium interne ou externe. Une des particularités de ces nouveaux outils est de pouvoir être déclenchés et arrêtés instantanément, sans réminiscence, contrairement aux molécules chimiques permettant de produire des pics calciques. Ces outils pourraient donc permettre de mieux comprendre l’implication du calcium dans des mécanismes comme la différenciation, la migration ou la fécondation<br>It is possible to permeabilize the cellular plasma membrane by using chemical agents (as polyethylen glycols or diméthylsulfoxyde) or physical agents (as ulstrasounds or electric pulses). This permeabilization can be reversible or not, meaning that after the permeabilization, the membrane recovers its integrity and its hemi-permeable properties. These techniques can be used for the uptake of medicines or nucleic acids or to generate cellular fusions. A recent approach, the molecular dynamics, uses numerical simulations to predict the effects of permeabilizing agents at the molecular scale, allowed generating of new data to understand the molecular mechanisms that are not completely known yet.The pulses so called “classical” in electropermeabilization, from the range of the ten of milliseconds to the hundred of microseconds and with a field amplitude in the range of 100 kV/m, can only permeabilize the plasma membrane. However, more recently, shorter pulses, so called nanopulses (few nanosecondes) and with an higher field amplitude (in the range of 10 MV/m) have been used and allow to affect also cellular organelles membranes.This thesis is, in a first time, about the permeabilizing effects of a chemical gent (the diméthylsulfoxyde, DMSO) by comparing predictive models from molecular dynamics with experiments in vitro on cells. The numerical model predicts three regimes of action depending on the DMSO concentration. Used at low concentration, there is a plasma membrane deformation. The use of an intermediate concentration lead to membrane pores formation and higher DMSO concentrations resulted in membrane destruction. The experiments done in vitro on cells confirmed these results using the following of permeabilization markers. This study has been compared to permeabilization due to a physical agent (electric pulses).Secondly, it is about the development and the use of a new cell exposure device for nanopulses that permit to apply very high electric fields and to observe induced cellular effects simultaneously by microscopy.To finish, this device has been used with nanopulses to generate calcium peaks in mesenchymal stem cells that are presenting spontaneous calcium oscillations in correlation to their differentiation state.. These induced peaks are due to the release of the calcium stored in organelles and/or to plasma membrane permeabilization leading to a intramembrane calcium flux establishment. It is also possible to use microsecond pulses to generate calcium peaks in these cells. In this case, the calcium peaks are due to the plasma membrane permeabilization . By changing the amplitude of the applied electric fields and the presence or the absence of external calcium, it is possible to manipulate cytosolic calcium concentrations by mobilizing internal or external calcium. One feature of these new tools is to be triggered and stopped instantly without reminiscence, unlike chemical molecules permitting the production of calcium peaks. These tools could therefore lead to a better understanding of the involvement of calcium in mechanisms such as differentiation, migration or fertilization

Les proteines de la membrane plasmique contribuent a la communication entre les cellules et leur environnement. Par consequent, leur expression a la surface cellulaire doit etre finement regulee pour repondre aux changements de l'environnement extracellulaire. L'endocytose permet de controler le taux de nombreuses proteines de membrane. Il a ete montre ces dernieres annees qu'un des mecanismes mis en jeu dans le controle de l'endocytose tant chez la levure que chez les mammiferes est leur modification prealable par fixation covalente d'ubiquitine. Dans le cadre de ce travail, l'uracile permease, codee par le gene fur4, a ete utilisee comme proteine modele pour etudier les signaux et les mecanismes qui controlent l'endocytose ubiquitine dependante des proteines de membrane plasmique chez la levure s. Cerevisae. Ce transporteur subit une endocytose constitutive qui est acceleree en condition de stress et qui conduit a sa degradation dans la vacuole. Nous avons montre qu'une region pest, situee dans l'extremite n-terminale de l'uracile permease est importante pour son endocytose. Les sequences de type pest, riches en prolines, acides glutamiques, serines et threonines, sont des signaux de degradation conditionnels qui sont reconnus apres activation. Dans le cas de l'uracile permease, nous avons montre que la phosphorylation des serines de la region pest, constitue un signal declenchant son ubiquitination et son internalisation consecutive. Nous avons egalement etabli que deux residus lysines situes juste en amont de la region pest, constituent les deux sites de fixation des chaines d'ubiquitine sur l'uracile permease. Par ailleurs, nous avons determine que les kinases yck1p et yck2p, deux isoformes de la famille caseine kinase i regulent l'endocytose de l'uracile permease. D'une part, elles sont directement impliquees dans la phosphorylation de la region pest. D'autre part, elles exercent un controle negatif sur l'etape d'internalisation de la proteine ubiquitinilee et agissent egalement plus en aval en controlant son acheminement jusqu'a la vacuole. En conclusion, cette etude a permis d'avancer dans la comprehension des signaux et des mecanismes qui controlent l'endocytose ubiquitine dependante des proteines de membrane plasmique chez la levure, des connaissances qui etaient encore tres limitees lorsque ce travail a debute. Il reste encore beaucoup a decouvrir sur la reconnaissance de ces proteines par la machinerie d'ubiquitination et d'internalisation. Les mutants de l'uracile permease construits au cours de ce travail et qui ont permis d'analyser le signal d'endocytose de ce transporteur constitueront de nouveaux outils pour analyser ces mecanismes.