Dissertations / Theses on the topic 'Metaboliti'

Gold nanoparticles, or, more in general, metal nanoparticles functionalized with a monolayer of organic ligands, provide a straightforward way to implement and exploit cooperativity mechanisms between the functional groups present in attached ligands, which are kept in close proximity by the monolayer arrangement. A good variety of different species can be easily attached to the nanoparticle surface with different methods and interligand cooperation can be exploited, among the possible applications, for molecular recognition. In this way, monolayer protected metal nanoparticles ca be easily turned in self-organized supramolecular receptors.1,2 It is still difficult, however, to precisely design and control the recognition properties of the monolayers as these depend not only on the chemical structure of the species bound on the surface, but also on the ligands conformation and dynamics. In this work, new approaches to the design of the monolayers were investigated, introducing combinatorial and potentially automatable computer aided synthetic approaches, capable to predict and the properties of the nanoparticles and quickly prepare them. Pre-synthesized and pre-organized binding pockets were also used for the post-synthetic functionalization of gold nanoparticles. Novel nanoreceptors for the detection of biomedically relevant metabolites were developed, which offered several advantages with respect to the previous generation, such as an increased sensitivity and an extended concentration window for the analyte detection via NMR-chemosensing. A new hyperpolarization-based strategy to further enhance the sensitivity of this analytical technique was also conceived and explored.
Gold nanoparticles, or, more in general, metal nanoparticles functionalized with a monolayer of organic ligands, provide a straightforward way to implement and exploit cooperativity mechanisms between the functional groups present in attached ligands, which are kept in close proximity by the monolayer arrangement. A good variety of different species can be easily attached to the nanoparticle surface with different methods and interligand cooperation can be exploited, among the possible applications, for molecular recognition. In this way, monolayer protected metal nanoparticles ca be easily turned in self-organized supramolecular receptors.1,2 It is still difficult, however, to precisely design and control the recognition properties of the monolayers as these depend not only on the chemical structure of the species bound on the surface, but also on the ligands conformation and dynamics. In this work, new approaches to the design of the monolayers were investigated, introducing combinatorial and potentially automatable computer aided synthetic approaches, capable to predict and the properties of the nanoparticles and quickly prepare them. Pre-synthesized and pre-organized binding pockets were also used for the post-synthetic functionalization of gold nanoparticles. Novel nanoreceptors for the detection of biomedically relevant metabolites were developed, which offered several advantages with respect to the previous generation, such as an increased sensitivity and an extended concentration window for the analyte detection via NMR-chemosensing. A new hyperpolarization-based strategy to further enhance the sensitivity of this analytical technique was also conceived and explored.

Diabetic neuropathy one of important complications of diabetes, is associated with neuropathic pain in about 50% of diabetic subjects. Clinical management of neuropathic pain is complex and so far unsatisfactory. To this aim in rats rendered diabetic by streptozotocin injection we have analyzed the effects of the testosterone metabolites, dihydrotestosterone (DHT) and 5α- androstane-3α,17β-diol (3α-diol), on nociceptive and allodynia thresholds. Moreover, molecular and functional parameters in the spinal cord related with pain modulation, such as the levels of glutamate, the expression and phosphorylation of synaptic proteins, the expression of substance P, neuroinflammatory markers and translocator protein, as well as the number of GFAP immunoreactive astrocytes have been analyzed. Finally, the levels of DHT and 3α-diol have been evaluated in spinal cord of steroid treated and untreated animals. Diabetes resulted in a significant decrease in DHT levels in the spinal cord that was reverted by DHT or 3α-diol treatments. In addition, 3α-diol treatment resulted in a significant increase in 3α-diol in the spinal cord over control values. Both steroids show analgesic properties on diabetic neuropathic pain. Interestingly, they exert their effects affecting different pain parameters and possibly by different mechanisms of action. Indeed, DHT treatment counteract the effect of diabetes on mechanical nociceptive threshold, pre- and post-synaptic components, glutamate release, astrocyte immunoreactivity and expression of interleukin-1β, while 3α-diol treatment was effective on tactile allodynia threshold, glutamate release, astrocyte immunoreactivity and the expression of substance P, toll-like receptor 4, tumor necrosis factor-α, transforming growth factor β-1, interleukin-1β and translocator protein. Moreover a DRG primary cell colture experiment was performed in order to demonstrate the 3α-diol specific effect GABA-A-mediated on substance P expression. Altogether these results suggest that testosterone metabolites are potential agents for the treatment of diabetic neuropathic pain.

I probiotici sono definiti come "microrganismi vivi che, se somministrati in quantità adeguate, conferiscono un beneficio alla salute dell'ospite". Al giorno d'oggi, ricercatori e produttori sono alla ricerca di nuovi ceppi probiotici con provata efficacia per specifiche applicazioni al fine di scegliere il ceppo più adatto all'uso richiesto. Coree s.r.l. è un'azienda che si occupa dello screening di nuovi ceppi probiotici per lo sviluppi di alimenti ed integratori alimentari specificamente pensati per la prima fase della vita, dalla nascita allo svezzamento. La matrice alimentare è strettamente correlata all'efficacia probiotica e può essere utilizzata come sistema di somministrazione al fine di colonizzare l'intestino umano. Ad oggi, la somministrazione di probiotici attraverso nuovi alimenti funzionali rappresenta un'opportunità molto interessante per i produttori ed i consumatori. Lo scopo di questo progetto di dottorato è stato quello di studiare se nuovi ceppi probiotici di Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp. fossero in grado di trarre vantaggio dall'interazione con il loro substrato ed esprimere questo sinergismo per migliorarne le caratteristiche benefiche nei confronti dell'ospite in una importante fase della vita, quella dello svezzamento. Alla luce di queste evidenze, la prima parte del dottorato ha indagato se i batteri probiotici, coltivati in matrici alimentari per lo svezzamento, cambiassero le loro proprietà, come l'adesione alla parete intestinale oppure la regolazione di espressione di vari geni da parte delle cellule intestinali umane. Sono stati utilizzati alcuni alimenti convenzionali della fase dello svezzamento, come carota, purea di mela, crema di riso e bevanda a base di avena, per valutare le possibili variazioni in termini di adesività post-fermentazione. I risultati hanno mostrato che i ceppi di Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp., se coltivati nelle matrici sopracitate, erano in grado di migliorare la loro adesività alla mucosa intestinale dimostrando un effetto sinergico tra matrice alimentare e microrganismo probiotico. È stato inoltre dimostrato che la capacità di fermentare determinati alimenti per lo svezzamento e di aderire alle linee cellulari intestinali umane era ceppo-specifica e non correlata al genere dei microrganismi. I dati hanno evidenziato che i ceppi batterici isolati dalle piante possedevano una buona capacità di aderire all'intestino e, quindi, le proprietà di adesione non sono influenzate dall’origine del ceppo. I risultati ottenuti sono stati pubblicati in un articolo scientifico sulla rivista "Advances in Nutrition and Food"(Gennaio 2020). In parallelo, l'approccio Next-Generation Sequencing (NGS) è stato impiegato per studiare i genomi dei nuovi ceppi batterici di proprietà di COREE s.r.l. e valutare l’eventuale presenza di plasmidi, geni di antibiotico-resistenza ed analizzare il profilo metabolico. Durante la fermentazione, i ceppi batterici producono una vasta gamma di metaboliti, alcuni dei quali sono composti biodisponibili e bioattivi con effetti positivi. Pertanto, un approccio metabolomico è stato applicato per fornire ulteriori informazioni sulle proprietà funzionali e nutrizionali della bevanda a base di avena fermentata da ceppi di Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp. L'avena è ampiamente apprezzata per i suoi effetti salutistici nell’adulto e nel bambino, ed attualmente sono disponibili sempre più prodotti alimentari per la fase infantile. Tramite gli strumenti UHPLC-Q-TOF e HPAEC-PAD, è stato determinato l’impatto della fermentazione e della digestione sul profilo dei metaboliti della bevanda vegetale. I risultati hanno mostrato che, nel latte di avena tal quale, le classi di composti più abbondanti erano flavonoidi, acidi fenolici, aminoacidi e steroidi. Dopo la digestione in vitro, i profili metabolici hanno indicato che aminoacidi, peptidi ed acidi fenolici erano le molecole più rilasciate a livello intestinale della bevanda di avena. Successivamente, è stato valutato l'impatto della co-fermentazione di ceppi di Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp. Il processo di fermentazione ha diminuito i livelli di antinutrienti, come lignani ed acido fitico, una classe di composti correlata al malassorbimento di importanti micronutrienti. Il profilo digerito della bevanda di avena fermentata ha presentato un maggiore rilascio di aminoacidi, vitamine, polifenoli e sostanze fitochimiche rispetto alla condizione non fermentata. Secondo quanto riportato dalla letteratura scientifica, la fibra rappresenta la parte più bioattiva dell’avena, formata prevalentemente da β-glucani. La tecnica analitica di cromatografia ionica (HPAEC-PAD) ha permesso di analizzare l'impatto della digestione e della fermentazione sulla sua componente oligosaccaridica. I risultati hanno indicato che i ceppi batterici non hanno modificato il profilo degli oligosaccaridi e che quindi la sua capacità prebiotica è stata preservata. Questi dati sono stati pubblicati sulla rivista "Food Research International" (Febbraio 2021). Successivamente, un modello di assorbimento in vitro con le cellule enterocyte-type Caco-2 ha permesso di esaminare le differenze tra i metaboliti assorbiti della bevanda di avena fermentata e non fermentata. In particolare, la bevanda di avena è stata fermentata da due diversi blend di ceppi probiotici, appartenenti alla stessa specie. Il profilo assorbito della bevanda non fermentata è risultato ricco di aminoacidi e di myo-inositolo. L'acido linoleico, uno degli acidi grassi più abbondanti in Avena S., è stato trovato totalmente non assorbito rivelandosi un potenziale substrato per il microbiota intestinale. Dopo il processo di fermentazione, i risultati hanno mostrato che il profilo dei metaboliti assorbiti non è stato alterato drasticamente ma si è riscontrato un aumento di assorbimento di composti specifici e diversi tra i due blend utilizzati, indicando un effetto della ceppo-specificità. Questo lavoro ha suggerito l’importanza dello starter di coltura nello sviluppo di alimenti fermentati. La fermentazione da specifici ceppi batterici selezionati, anche appartenenti alla stessa specie, ha prodotto due matrici alimentari con simili profili chimici, ma con un effetto diverso sul metabolismo cellulare delle Caco-2. Questi risultati saranno presto sottomessi sulla rivista "Food Research International".
Probiotics are defined as “live microorganisms that, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host”. Nowadays, researchers and producers are looking for probiotic strains with proven efficacy towards specific applications in order to choose the most suitable strain for the required use. Coree s.r.l. is a company dealing with the screening of potential new probiotic strains to be developed in food and food supplements specifically designed for the first phase of the life, from delivery to weaning. Food is strictly correlated to probiotic efficacy and it can be used as a deliver system to colonize the human intestine. To date, the delivery of probiotics through novel functional food represents a very interesting opportunity for manufacturers and customers. The aim of my PhD project was to study if new isolated strains of Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. were able to take advantage of the interaction with their substrate and express this synergism with improved beneficial features to the host by considering an important stage of life, the weaning phase. In light of this evidence, the first part of the Ph.D. investigated whether probiotic bacteria, when grown in weaning food matrices, changed their properties, such as the adhesion to the gut or the regulation of various genes expression by human intestinal cells. We used some conventional complementary foods, such as carrot, apple puree, rice cream, and oat-based beverage, to evaluate the possible variations in terms of post-fermentation adhesiveness. Results showed that Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. strains, when cultured in complementary foods, were able to improve their adhesiveness to the gut mucosa, showing a synergic effect between food matrix and probiotic microorganism. Moreover, it has been demonstrated that the ability to ferment weaning foods and to adhere to the human intestinal cell lines was strain-specific and not correlated to the genus of microorganisms. Furthermore, data have evidenced that bacterial strains isolated from plants possessed good ability to adhere to gut, and, thus, the adhesion properties is not influenced by the origins. These results were published an original article titled “The Synergistic Interaction between Probiotics and Food Affects Their Beneficial Features” on the journal “Advances in Nutrition and Food” (January 2020). In parallel, genome analysis was carried out to new isolated bacterial strains of COREE in order to better characterize their profiles. Next-Generation Sequencing (NGS) approach was used to find the hypothetical presence of plasmids and antibiotic-resistance genes and determine the bacterial fermentation type. During fermentation, bacterial strains produce a wide range of metabolites, some of which are bioavailable and bioactive with health properties that can be absorbed by the gastrointestinal cells and exert their effect at the systemic level. Therefore, metabolomic approach was applied to provide information about the different functional and nutritional properties of oat-based beverage fermented by Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. strains. Oat is widely appreciated for its beneficial properties for adult and infant health, and currently, more food products are available for infant phase. Firstly, we evaluated the metabolites profile of oat beverage following in vitro gastrointestinal digestion by UHPLC-Q-TOF and HPAEC-PAD analysis. The untargeted metabolomics allowed to investigate the profile of metabolites released by oat-based beverage at the end of digestion. The results showed that flavonoids, phenolic acids, amino acids, and steroids were the major class of compounds identified in oat before any treatment. After the in vitro digestion, amino acids, peptides, and phenolic acids were the most released compounds. Afterward, the impact of co-fermentation by Lactobacillus spp. and Bifidobacterium spp. strains on the oat metabolites profile was evaluated. The fermentation process decreased the levels of antinutrients (lignans and phytic acid), a class of compounds that reduces the correct absorption of important micronutrients. Additionally, the digested profile of fermented oat beverage showed a major release of amino acids, vitamins, polyphenols, and phytochemical substances respect to the unfermented condition. Moreover, oat fiber component represents the most bioactive metabolite, consisting predominantly of β-glucans. For this reason, ion chromatography technique (HPAEC-PAD) was used to analyze the impact of digestion and fermentation on the oligosaccharidic component. Data indicated that the bacterial strains did not modify the oligosaccharides profile preserving its prebiotic capacity. These data have been submitted as original article entitled " The combined effect of fermentation of lactic acid bacteria and in vitro digestion on metabolomic and oligosaccharide profile of oat beverage” on the journal “Food Research International”. Successively, a simulated digestion/absorption model by using the enterocytes-type cells (Caco-2) allowed to examine the differences between the absorbed metabolites of fermented and non-fermented food matrix. The assimilated profile of non-fermented oat-based beverage was found rich in amino acids and myo-inositol. The linoleic acid, one of the most abundant fatty acid in Avena S., was found totally unabsorbed revealing as substrate for the intestinal microflora. Regarding the effect of fermentation on the absorbed profiles, results revealed that the bacterial strains did not alter drastically the metabolites profiles but induced few and strain-specificity effects that increased the absorption of specific compounds. This work suggests the relevance of culture starter in the development of fermented functional food. The fermentation by selected bacterial strains, even belonging to the same species, produced two food matrices with similar chemical profiles, but with a rather different effect on host metabolism. These findings are submitting as original article titled " In-vitro assessment of the strain-specific impact of fermented oat on the absorption of different metabolites” on the journal “Food Research International”.

Kao jedna od najstarijih grupa fotoautotrofnih mikroorganizama, cijanobakterije predstavljaju široko rasprostranjene prokariote sa raznovrsnim metaboličkim strategijama u cilju preživljavanja i adaptacije na različite uslove životne sredine. Upravo zbog toga, cijanobakterije su značajne kao producenti različitih biološki aktivnih metabolita. Međutim, većina studija o cijanobakterijama uglavnom je vezana za cijanobakterije vodenih ekosistema. Predmet istraživanja ovog rada jeutvrđivanje diverziteta autohtonih cijanobakterija šumskih ekosistema i karakterizacija odabranih terestričnih cijanobakterijskih predstavnika planinskih područja Srbije izolovanih tokom trogodišnjeg monitoringa kroz utvrđivanje njihovih osnovnih ekofizioloških, biohemijskih i genetičkih karakteristika. Rezultati dobijeni u ovom radu su ukazali na diverzitet zemljišnih cijanobakterija šumskih staništa ispitivanih planinskih područja kao i na njihov metabolički diverzitet, odnosno potencijal produkcije različitih bioaktivnih jedinjenja. Na osnovu taksonomski važnih odlika identifikovano je i okarakterisano 20 cijanobakterijskih sojeva za koje je utvrđeno da pripadaju sledećim rodovima: Nostoc, Anabaena, Tolypothrix, Calothrix, Cylindrospermum, Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium. Identifikacija izolovanih cijanobakterija primenom molekularanog markera 16S rRNK u većini slučajeva (90%) je potvrdila preliminarnu identifikaciju rodova na osnovu morfoloških kriterijuma. U pogledu produkcije biomase dobijeni rezultati su pokazali da je produkcija biomase kod odabranih testiranih cijanobakterijskih sojeva zavisila od primenjenih uslova kultivacije. Utvrđeno je da su azot, glukoza i saharoza delovali u pravcu stimulacije produkcije biomase kod velikog broja sojeva. Najveća produkcija biomase detektovana je kod soja Calothrix M2 u prisustvu azota u medijumu. Kod soja Nostoc T18 zabeleženo je najveće povećanje produkcije biomase u prisustvu glukoze i saharoze u medijumu. Takođe, sadržaj fikobiliproteina bio je povećan kod većine testiranih sojeva u prisustvu glukoze i saharoze u medijumu. Ispitivanjem sadržaja ugljenih hidrata (glukoze, fruktoze i ksiloze) konstatovano je prisustvo sva tri monosaharida kod svih sojeva pri čemu je svaki soj imao specifičan ugljeno-hidratni profil. Sadržaj monosaharida kod svih testiranih sojeva opadao je u sledećem redosledu glukoza ˃fruktoza ˃ ksiloza. Izuzetnu sposobnost produkcije heksoza i pentoza ispoljila su tri soja Nostoc M1, Phormidium T11 i Calothrix M2. Antibakterijska aktivnost intracelularnih ekstrakata registrovana je kod 16 testiranih cijanobakterijskih sojeva i zavisila je od kombinacije cijanobakterijski-bakterijski soj i tipa primenjenog ekstrakta. U odnosu na heksanske ekstrakte, metanolni ekstrakti su pokazali veću efikasnost, ukazujući na prirodu bioaktivnih jedinjenja sa antibakterijskim delovanjem. Najefikasnijim su se pokazali 75% MeOH ekstrakti cijanobakterijskih sojeva Oscillatoria M2,  Calothrix  M2, Lyngbya T7 i Cylindr ospermum K1 koji su ispoljili antibakterijsku aktivnost na 4 testirane bakterije. Hemijskom analizom masno kiselinskog sastava utvrđeno je da je masno kiselinski sadržaj cijanobakterijskih sojeva varirao u zavisnosti od soja. Najznačajniji konstituenti testiranih cijanobakterijskih sojeva bile su 18-to i 16-to ugljenične masne kiseline poput linolne kiseline i α-linoleinske. Najveći sadržaj linolne kiseline detektovan je kod sojeva  Phormidium  T11 i Tolypothrix K11 što ukazuje na sojeve kao potencijalno značajne izvore esencijalnih masnih kiselina. Antiradikalska aktivnost detektovana je kod svih testiranih cijanobakterijskih sojeva. U DPPH eseju, etanolni ekstrakti soja Calothrix M2 ispoljili su najefikasniju sposobnost „hvatanja“ DPPH·radikala dok je u slučaju FRAP metode najveću redukujuću moć imao etanolni ekstrakt soj Cylindrospermum K1. Hemijskom analizom fenolnog sastava kod analiziranih cijanobakterijskih sojeva identifikovano je i kvantifikovano ukupno 21 fenolno jedinjenje. Fenolni sastav je varirao u zavisnosti od soja, a najčešće detektovana fenolna jedinjenja bila su luteolin-7-O-glukozid, bajkalin i kemferol. Soj sa najznačajnijom sposobnošću produkcije fenolnih jedinjenja bio je Phormidium M1 kod koga je identifikovano prisustvo 11 fenolnih jedinjenja. Testirajem toksičnosti intracelularnih ekstrakata u biotestovima   A. salina  ,  D. magna  i D. rerio ukupno 40 % testiranih sojeva ispoljilo je toksičan efekat. Najtoksičnijim sojem se pokazao soj Nostoc T7 koji je ispoljio tok sičnost u sva tri testa. U slučaju biotesta A. salina najtoksičnijim sojevima pokazali su se Nostoc   T7, Oscillatoria M2, Oscillatoria T18 i Nostoc K15. Cijanobakterijski sojevi koji su ispoljili najpotentniju aktivnost u biotestu D. magna bili su   Tolypothrix   K15,  Nostoc  T7 i Calothrix M2.   U biotestu sa embrionima zebrica, soj sa najznačajnijim teratogenim efektom bio je  Cylindrospermum K1. U pogledu uticaja ekstrakta testiranog soja na ekspresiju gena  kod model organizma  D. rerio , Cylindrospermum K1 je ispoljio sposobnost modulacije bioloških procesa poput cirkadijalnog ritma kao i sposobnost p rodukcije jedinjenja sa estrogenim efektom. Rezultati analize toksigeničnosti testiranih cijanobakterijskih sojeva su pokazali da geni mcyB i mcyE koji su uključeni u  produkciju cijanotoksina mikrocistina nisu detektovani ni u jednom od testiranih sojeva. Odsustvo dva gena  iz mcy genskog klastera ukazuje na to da su druga jedinjenja odgovorna za uočen toksični efekat u primenjenim biotestovima. Dobijenirezultati ukazuju na značaj ispitivanja zemljišnih cijanobakterija, s obzirom na to da su rezultati ovog rada  ukazali na velik metabolički diverzitet ispitivanih sojeva i izražen potencijal produkcije različitih bioaktivnih jedinjenja.
As one of the oldest groups of photoautotrophic microorganisms, cyanobacteria represent widespread prokaryotes  with diverse metabolic strategies in order to survive and adapt to different environmental conditions. For this reason, cyanobacteria are significant as producers of various biologically active metabolites. However, most of the studies are mainly related to cyanobacteria of aquatic ecosystems. The subject of the research of this dissertation  is to determine the diversity of autochthonous cyanobacteria of forest ecosystems and to characterize selected terrestrial cyanobacterial representatives of mountainous areas of Serbia isolated during three year monitoring by determining their basic ecophysiological, biochemical and genetic characteristics. The results obtained in this dissertation  have show  the diversity of soil cyanobacteria of forest habitats of the investigated mountain areas as well  as their metabolic diversity and potential to produce  various  bioactive compounds. Based on taxonomically important features, 20 cyanobacterial strains have been identified  to belong to the following genera:  Nostoc, Anabaena, Tolypothrix, Calothrix, Cylindrospermum, Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium. Identification of  the  isolated cyanobacteria using the molecular marker 16S rRNA in most cases (90%) confirmed the preliminary identification of genera based on  morphological criteria. In terms of biomass production, the obtained results showed that the production of biomass in the selected tested cyanobacterial strains  hepended on the applied cultivation conditions. It was found that nitrogen, glucose and sucrose acted towards the stimulation of biomass production in a large number of strains. The largest biomass production was detected in strain Calothrix M2 in the presence of nitrogen in the medium. In the presence of glucose and sucrose in the medium  the highest increase in biomass production was recorded  in  cyanobacterial strain  Nostoc  T18. Also, the content of phycobiliproteins  has been increased in most  of the  tested strains  in the presence of glucose and sucrose in the medium.  Examination of the carbohydrate content (glucose, fructose and xylose)  showed that all three monosaccharides were present in all strains and that each strain had a specific carbohydrate profile  whereby the content of monosaccharides in  all tested strains declined in the following order: glucose ˃ fructose ˃ xylose. Among the tested strains, three strains namely  Nostoc  M1, Phormidium T11 and  Calothrix M2 showed the exceptional ability to produce hexose and pentose. The antibacterial activity of intracellular extracts was recorded in 16 tested cyanobacterial strains and depended on the combination of cyanobacterial-bacterial strain and the type of applied extract. Compared to hexane extracts, methanol extracts showed greater efficiency, indicating on the nature of bioactive compounds with antibacterial activity. The most effective were 75% MeOH extracts of cyanobacterial strains   Oscillatoria   M2,   C alothrix   M2,  Lyngbya  T7 an d Cylindrospermum  K1 which exhibited antibacterial activity on 4 tested bacteria.  Results of the analysis of the fatty  acid composition showed that the fatty acid content of tested cyanobacterial strains varied depending on the strain. The most significant constituents of the tested  cyanobacterial strains were 18 and 16 carbonic fatty acids such as linoleic acid, α-linoleic. The highest content of linoleic acid was detected in two strains,   Phormidium   T11 and  Tolypot hrix K11, indicatin g that these strains can be potentially significant sources of essential fatty acids.  Results of antioxidant  tests showed that all tested strains had antiradical activity. In the case of DPPH assay, ethanolic extracts  of Calothrix M2 exhibited the most effective ability to scavenge DPPH •radical while in the case of the FRAP method,  ethanolic extract of  Cylindrospermum  K1 had  the greatest reduction power. Accordi ng to data obtained from  chemical analysis of  the phenolic composition of the analyzed cyanobacterial strains, a total of 21 phenol compounds were identified and quantified. The phenolic composition varied depending on the strain, and the most frequently detected phenolic compounds were luteolin-7-O-glucoside, baicalin and kaempferol. The strain with the  most  asignificant ability to produce phenolic compounds was Phormidium M1, in which the presence of 11 phenolic compounds was identified.  The results of the toxicity of intracellular extracts obtained in A. salina, D. magna and D. rerio  biotests, showed  that a total of 40% of  the  tested strains exhibited a toxic effect.  The most toxic strain was  Nostoc  T7 due to the fact that it showed toxicity in all three tests. In the case of  A. salina biotest, the most potent strains were  Nostoc  T7, Oscillatoria M2,  Oscillatoria  T18 and Nostoc K15. Cyano bacterial strains that exhibited the most prominent activity  in  D. magna  biotest were   Tolypothrix   K15,  Nostoc  T7 and Calothrix M2. In bi  otest with zebrafish embryos, the strain with the most significant teratogenic effect was Cylindrospermum K1. Regarding the effect of cyanobacterialextract on gene expression in model organism  D. rerio,  cyanobacterial strain  Cylindrospermum  K1  exhibited the ability to modulate biological processes such as circadian rhythm as well as  the ability to produce compounds with an estrogenic effect. The results of the  toxicogenetic analysis of the tested cyanobacterial strains have shown that the genes   mcyB   and  mcyE  involved in the production  of cyanotoxin microcystins have not been detected in any of the tested strains. The absence of two genes from the  mcy  gene cluster indicates  that other compounds are responsible for the observed toxic effect in applied biotests. The obtained results point  out on the importance of the study of soil cyanobacteria, since the obtained results have indicated that the  tested strains possess a large metabolic  diversity and potential to produce various bioactive compounds.

La spettroscopia di risonanza magnetica (MRS) è un metodo non invasivo utile per la diagnosi di alcune patologie legate a variazioni del metabolismo che interessano il sistema nervoso centrale, poiché consente di quantificare i metaboliti presenti nel cervello. La MRS in vivo misura i segnali di molecole presenti in concentrazioni superiori a 1-2 mM per limiti di sensibilità della metodica. Inoltre, per avere un buon rapporto segnale rumore solitamente è necessario utilizzare lunghe procedure di acquisizione. Le concentrazioni dei metaboliti possono essere ricavate in rapporto relativo oppure in valore assoluto. In questo elaborato si riportano alcuni protocolli sviluppati per la determinazione delle concentrazioni metaboliche assolute in vivo, che necessitano di uno standard a concentrazione nota, interno o esterno. In particolare, come riferimento interno si considera il segnale dell’acqua presente all’interno del voxel analizzato; mentre il riferimento esterno consiste in una soluzione campione a concentrazione nota, funzionale all’analisi d’interesse. Nella tesi vengono descritti metodi di calibrazione e correzione dei tempi di rilassamento per la quantificazione dei metaboliti in vivo. Nell’ultimo capitolo, si riportano due studi come esempio di protocolli per la quantificazione dei metaboliti nella diagnosi di tumori al cervello quali il glioma e nello studio di malattie metaboliche, in particolare la malattia di Canavan.

Blue mould caused by Penicillium expansum Link is one of the most destructive rot of pome fruit in all growing areas (Snowdon, 1990; Jones and Aldwinckle, 1991; Tonini,1996) In the past, Penicillium rot has been controlled by fungicide postharvest treatment mainly by thiabendazole (TBZ) and benomyl (Hardenburg and Spalding, 1972), but their intense use produced the appearance of resistant strains with a great reduction of their activity The aims of the present study were to characterize the isolates of Pencillium sp causing blue mold on pear in Italy by physiological and biochemical parameters. In particular differencing also the behavior of isolates to relationship with sensitivity or resistance to TBZ treatments. We have examined the early stage of infection in relation to enzyme activity, local modulation of pH, production of organic acids, and to secondary metabolism of pathogen. The results described here confirm that the majority of P. expansum isolates from pears packing houses are resistant to TBZ, Among the TBZ-resistant isolates scored in this work, different isolates (RR) showed higher percentage of conidial germination on TBZ-amended medium compared to non amended medium. This may indicate a stimulatory effect of TBZ on conidial germination. Therefore TBZ treatments are not only ineffective for controlling P. expansum, but they may also increase the severity of blue mould on fruits. In the absence of fungicide, isolates showed a significant difference for infection severity, R and RR isolates are characterized by higher pathogenic fitness on fruits, producing larger lesions than S isolates. These data are supported by the study with laboratory-induced resistant isolates, which shows the lack of correlation between TBZ resistance and osmotic sensitivity, and highlights the association between TBZ resistance and infection severity (Baraldi et al 2003). Enzymatic screening gave a positive reaction to esterase, urease, pectinase activity, in addition, the pathogen is able to synthesize a complex enzyme act to degrade the main components of the cell wall especially pectin and cellulose. Isolated sensitive and resistant are characterized by a good activity of pectinase, especially from poligactoronase, which, as already reported by several studies (D'hallewin et al, 2004; Prusky et al, 2004), are the basis of degradative process of cell wall. Also, although the measure was minor also highlighted some activities of cellulase, but even note in the production of this kind of cellulase and hemicellulase P. Expansum were not targeted, studies have found no other source of information in this regard. Twenty isolates of Penicillium expansum, were tested in vitro ad in vivo for acid production ability and pH drop. We have found that modulation of pH and the organic acids extrusion were influence to various parameter:  Initial pH: in general, the greatest reduction of pH was observed in isolates grown at pH 7, except for four isolates that maintained the pH of the medium close to 7, the others significantly decreased the pH, ranging from 5.5 to 4.1.. In extreme acid condition (pH 3,0) growth and modulation of pH is most lower respect optimal condition (pH 5,0). Also isolates R and RR have showed a greater adaptation to environmental condition more than isolates S.  Time: although the acidification continues for some days, PH modulation is strongest in early hours (48-72 hours)of inoculation process. Time also affects the quality of organic acids, for example in vitro results showed an initial abundant production of succinc acid, followed to important production of galacturoinc acid.  Substrates: there are many differences for the type of acids produced in vitro and in vivo. Results showed in vivo an abundant production of galacturonic, malic, and citric acids and some unknown organic acids in smaller concentrations. Secondary metabolite analysis revealed intra-specific differences, and patulin was found in all isolates, but most significant reduction was observed between in vitro and in vivo samples. There was no correlation between the concentration of patulin, and the percentage of infected fruits, but sample with a lower infection severity of rotten area than the others, showed a significantly lower mycotoxin concentration than samples with a higher lesion diameter of rotten area. Beyond of patulin was detected the presence of another secondary metabolite, penitrem A.

Blue mould caused by Penicillium expansum Link is one of the most destructive rot of pome fruit in all growing areas (Snowdon, 1990; Jones and Aldwinckle, 1991; Tonini,1996) In the past, Penicillium rot has been controlled by fungicide postharvest treatment mainly by thiabendazole (TBZ) and benomyl (Hardenburg and Spalding, 1972), but their intense use produced the appearance of resistant strains with a great reduction of their activity The aims of the present study were to characterize the isolates of Pencillium sp causing blue mold on pear in Italy by physiological and biochemical parameters. In particular differencing also the behavior of isolates to relationship with sensitivity or resistance to TBZ treatments. We have examined the early stage of infection in relation to enzyme activity, local modulation of pH, production of organic acids, and to secondary metabolism of pathogen. The results described here confirm that the majority of P. expansum isolates from pears packing houses are resistant to TBZ, Among the TBZ-resistant isolates scored in this work, different isolates (RR) showed higher percentage of conidial germination on TBZ-amended medium compared to non amended medium. This may indicate a stimulatory effect of TBZ on conidial germination. Therefore TBZ treatments are not only ineffective for controlling P. expansum, but they may also increase the severity of blue mould on fruits. In the absence of fungicide, isolates showed a significant difference for infection severity, R and RR isolates are characterized by higher pathogenic fitness on fruits, producing larger lesions than S isolates. These data are supported by the study with laboratory-induced resistant isolates, which shows the lack of correlation between TBZ resistance and osmotic sensitivity, and highlights the association between TBZ resistance and infection severity (Baraldi et al 2003). Enzymatic screening gave a positive reaction to esterase, urease, pectinase activity, in addition, the pathogen is able to synthesize a complex enzyme act to degrade the main components of the cell wall especially pectin and cellulose. Isolated sensitive and resistant are characterized by a good activity of pectinase, especially from poligactoronase, which, as already reported by several studies (D'hallewin et al, 2004; Prusky et al, 2004), are the basis of degradative process of cell wall. Also, although the measure was minor also highlighted some activities of cellulase, but even note in the production of this kind of cellulase and hemicellulase P. Expansum were not targeted, studies have found no other source of information in this regard. Twenty isolates of Penicillium expansum, were tested in vitro ad in vivo for acid production ability and pH drop. We have found that modulation of pH and the organic acids extrusion were influence to various parameter:  Initial pH: in general, the greatest reduction of pH was observed in isolates grown at pH 7, except for four isolates that maintained the pH of the medium close to 7, the others significantly decreased the pH, ranging from 5.5 to 4.1.. In extreme acid condition (pH 3,0) growth and modulation of pH is most lower respect optimal condition (pH 5,0). Also isolates R and RR have showed a greater adaptation to environmental condition more than isolates S.  Time: although the acidification continues for some days, PH modulation is strongest in early hours (48-72 hours)of inoculation process. Time also affects the quality of organic acids, for example in vitro results showed an initial abundant production of succinc acid, followed to important production of galacturoinc acid.  Substrates: there are many differences for the type of acids produced in vitro and in vivo. Results showed in vivo an abundant production of galacturonic, malic, and citric acids and some unknown organic acids in smaller concentrations. Secondary metabolite analysis revealed intra-specific differences, and patulin was found in all isolates, but most significant reduction was observed between in vitro and in vivo samples. There was no correlation between the concentration of patulin, and the percentage of infected fruits, but sample with a lower infection severity of rotten area than the others, showed a significantly lower mycotoxin concentration than samples with a higher lesion diameter of rotten area. Beyond of patulin was detected the presence of another secondary metabolite, penitrem A.

2008 - 2009
L’utilizzo delle piante medicinali nasce con l’uomo. Lo studio delle basi scientifiche a supporto del loro utilizzo si è sviluppato e continua a svilupparsi da poco più di un secolo. Lo scopo di questo lavoro di dottorato è di dare supporto all’utilizzo di specie vegetali applicabili in ambito farmacologico per curare determinate affezioni del Sistema Nervoso Centrale derivanti da patologie o dall’uso di sostanze stupefacenti. Molto spesso le sostanze vegetali infatti interagiscono con il sistema nervoso centrale, come accade per gli oppiacei, la coca, la nicotina ed altre specie. I metaboliti secondari provenienti da tre diverse specie di uso non comune (Brugmansia arborea, Espostoa lanata ed Ipomea violacea) sono stati sottoposti ad un attento studio per valutarne l’attività sul Sistema nervoso centrale e cercare di comprendere quale possa essere il loro utilizzo a scopo medico. Queste tre specie vengono utilizzate normalmente nella medicina tradizionale dell’America del Sud, nella maggior parte dei casi con uno scopo rituale. La società attuale ha trasformato queste specie in Smart Drugs togliendo loro il concetto di sacralità attribuitogli per millenni dai primi utilizzatori Brugmansia arborea Lagher. è normalmente consumata sotto forma di infuse e tisane per la costituzione delle “misha” bevande con attività magicocurativa. Già dagli studi precedenti era stato possibile identificare tre alcaloidi presenti nelle specie e la loro attività è stata testata in vitro per verificare la capacità di tali alcaloidi di interagire con recettori per la dopamina e serotonina. Lo studio condotto in questo lavoro si è invece basato sullo studio dei metaboliti secondari provenienti da specie naturalizzate in Italia per comprendere se fossero prodotti gli stessi alcaloidi, in quale quantità e se le diverse condizioni climatiche e territoriali avessero influenzato la loro produzione. Il processo di screening iniziale ha consentito di determinare che la frazione di interesse contenente alcaloidi fosse quella dell’estratto metabolico. Tale estratto è stato saggiato in topi CD1 per verificare la capacità di agire in combinazione con morfina e constatarne gli effetti in trattamenti sia in acuto che in cronico. Lo studio ha dimostrato la capacità di ridurre gli effetti derivanti dalla sindrome di astinenza da oppiacei, dimostrandosi come un ottima alternativa al naloxone rispetto al quale riduce i sintomi somatici di astinenza. Lo stesso studio è stato ripetuto sulla frazione purificata e sui singoli principi attivi. I composti puri hanno però dimostrato una minore efficacia rispetto al complesso. Per dimostrare che l’attività della pianta è strettamente legata ai composti di natura alcaloidea sono stati effettuati inoltre studi in vivo sulle frazioni metanoliche non contenenti gli alcaloidi. Si è dunque dimostrata l’inattività biologica di tali composti di natura non alcaloidea. Per verificare quali effetti avessero gli alcaloidi utilizzati nelle aree cerebrali connesse al sistema dopaminergico della ricompensa coinvolti nella dipendenza da oppiacei, sono state prelevati la corteccia frontale e lo striato Tutti gli esperimnenti sono stati svolti su topi CD1. I risultati hanno dimostrato che i singoli alcaloidi hanno effetti dopaminergici differenti. Il primo di essi è in grado di riportare i valori di dopamina al livello del controllo spiegando almeno in parte l’assenza di una crisi di astinenza altrimenti presente. L’effetto degli altri alcaloidi, che determinano invece un interessante picco di dopamina aprono nuove prospettive di studio per lo sviluppo in ambito medico per la cura di sindromi da ipoproduzione di dopamina come ad esempio il Parkinson. B. arborea ha inoltre mostrato una capacità di ridurre in maniera dose dipendente iperattività motoria. Gli studi di CPL (preferenza di luogo associata alla somministrazione di una sostanza che induce dipendenza) hanno inoltre dimostrato che gli estratti della pianta sono in grado di ridurre la preferenza degli animali utilizzati (topi cd1), per le gabbie in cui vengono trattati con morfina, e che l’associazione tra trattamento e luogo si estingue molto più rapidamente negli animali trattati anche con B. arborea rispetto a quelli trattati con sola morfina. I risultati della somministrazione di B. arborea un’ora prima del trattamento con cocaina hanno dimostrato la capacità di ridurre l’iperattività da cocaina stessa. Si ipotizza dunque l’utilizzo di tale specie, e più precisamente del complesso alcaloideo presente in fiori e foglie, per ridurre le sindromi di astinenza da morfina e favorire il divezzamento da oppiacei. Espostoa lanata Britt. & Rose è utilizzata a scopo magico dagli sciamani per entrare in contatto con il mondo delle anime tramite l’aspirazione dei fumi prodotti dalla sua combustione. Dalla pianta sono stati isolati alcaloidi di natura feniletilamminica. I test bioassay oriented sono stati effettuati in activity cage sugli estratti a polarità crescente (etere di normale sano, etere di petrolio, cloroformio, cloroformio metanolo 9:1, metanolo). L’estratto risultato attivo è stato quello metanolico. Il frazionamento cromatografico dell’estratto attivo ha portato all’identificaizone della tiramina. La presenza di tiramina nella frazione con maggiore attività in activity cage ha dimostrato una capacità di abbattere la capacità locomotoria del 60% rispetto ai controlli con salino ed in modo dose dipendente. La tiramina tal quale non dovrebbe essere in grado di attraversare la barriera ematoencefalica in quantità tale da giustificare la riduzione della coordinazione motoria e le convulsioni tonico cloniche registrate. Questo effetto è stato invece attribuito alla sua coniugazione ad una catena lipidica che ne consente un più agevole trasporto attraverso la BBB (barriera emato encefalica). La tiramina in quanto simpatico-mimetico stimola il rilascio di noradrenalina. La presenza ampiamente discussa in letteratura di recettori specifici (TA1) fa presupporre la sua capacità di funzionare come neurotrasmettitore e di mediatore nell’attivazione della vasocostrizione renale. L’ultima specie presa in esame è stata Ipomea violacea L.. originaria della flora del sud America ma ampiamente diffusa in tutta Europa. La larga diffusione di questa specie negli smart shop e le scarse informazioni presenti in letteratura sulla sua composizione chimica hanno determinato il forte interesse per lo studio di questa specie. Da letteratura risultano presenti nella 4 pianta l’isoergina, che presenta un’attività molto inferiore al suo epimero, la cianoclavina, il lisergolo e l’ergometrina. La caratterizzazione chimica dei composti presenti nella specie da noi studiata ha dimostrato la presenza di swainsonina e lisergolo. L’LSA (Acido lisergico) presente in questa specie dunque causa effetti analoghi all’LSD seppure con effetti notevolmente ridotti. Il test dell’head twich non ha dato esito positivo, dimostrando la sua non attività sui recettori serotoninergici coinvolti nell’head twich 5 THP. Sono state inoltre studiate l’attività motoria, che risulta dose dipendente e la capacità di interazione sociale dei topi CD1 utilizzati per tutti i test. [a cura dell'autore]
VIII n.s.

S obzirom  da su cijanobakterije (modrozelene alge) identifikovane kao jedna odnajperspektivnijih grupa organizama za izolaciju novih i biološki aktivnih prirodnihprodukata, cilj ove teze bio  je utvrđivanje biotehnološkog potencijala  autohtonihfilamentoznih sojeva  cijanobakterija izolovanih sa područja Vojvodine koji pripadajuazotofiksirajućim rodovima  Nostoc  i  Anabaena  i neazotofiksirajućem rodu    Spirulina. Biotehnološki potencijal testiranih sojeva je određen  u smislu produkcije biomase, fikobiliproteinskih pigmenata, masnih kiselina, fenolnih jedinjenja, antioksidanata, antibakterijskih i antikancerogenih agenasa. Dobijeni rezultati su pokazali  da su produkcija biomase i sadržaj fikobiliproteinskih pigmenata kod svih testiranih sojeva zavisili od primenjenih uslova kultivacije, pri  čemu je  kod sojeva roda  Spirulina produkcija biomase bila jače stimulisana primenom kontinualnog osvetljenja, a kod azotofiksirajućih sojeva rodova  Nostoc  i  Anabaena  organskim izvorima ugljenika (glicerolom i glukozom). Kao soj sa najvećim potencijalom za  proizvodnju biomase izdvaja se soj  Spirulina  S1, a za produkciju fikobiliproteina sojevi  Spirulina  S1,  Nostoc 2S1,  Anabaena  Č2 i  Spirulina  S2.  Određivanjem sadržaja masnih kiselina GC-FID metodom utvrđeno je da su  kod svih sojeva  najzastupljenije bile palmitinska, palmitoleinska, oleinska i linolna kiselina, pri čemu su  sojevi roda Spirulina produkovali i  γ-linolensku kiselinu, dok su svi  sojevi rodova  Nostoc  i  Anabaena  produkovali  -linoleinsku kiselinu.  Najzastupljenije fenolne komponente testiranih etanolnih ekstrakata određene HPLC-MS/MS metodom  bile su hinska kiselina i katehin, pri čemu je najveći sadržaj fenolnih jedinjenja registrovan kod soja  Nostoc  2S7B. Hemijskom karakterizacijom ekstrakata kod testiranih sojeva takođe je utvrđen značaj azotnih uslova kultivacije  u cilju povećanja produkcije  fenolnih jedinjenja,  kao i  -linoleinske kiseline. Poređenjem rezultata antioksidantne aktivnosti u korišćenim testovima  DPPH  i FRAP, kao sojevi sa najvećim  antioksidantnim potencijalom izdvajaju se  Spirulina  S1 i Spirulina  S2. Antibakterijska aktivnost metanolnih ekstrakata  registrovana je kod sojeva Nostoc 2S7B, Nostoc 2S1, Anabaena Č2, Anabaena Č5, Spirulina S1 i  Spirulina S2, koji su ispoljili efekat na Gram-pozitivne i Gram-negativne bakterije, pri čemu su  sojevi Anabaena  Č2, Nostoc  2S7B  i  Nostoc  2S1  delovali na najviše bakterijskih sojeva.  Kod svih testiranih sojeva je primenom MTT testa uočena antikancerogena tj. citotoksična aktivnost dimetil sulfoksidnih (DMSO) ekstrakata prema HepG2 ćelijskoj liniji, među kojima su najveću aktivnost  ispoljili sojevi  Nostoc  LC1B i  Nostoc  2S7B.  Primenom bioeseja  Artemia salina, Daphnia magna  i   Danio rerio  konstatovan je mali broj sojeva koji su ispoljili toksičnost na test organizme, dok na ćelijsku liniju  RTL-W1  testirani sojevi nisu ispoljili citotoksičnost  in vitro, što sa aspekta potencijalne biotehnološke primene sojeva ima veliki značaj. Kao najtoksičniji izdvojili su se sojevi  Nostoc  LC1B  i Nostoc S8 koji su ispoljili  toksičnost u sva tri bioeseja. Ispitivanjem toksičnosti in vitro u enzimskim esejima konstatovano je da je manji broj sojeva inhibirao aktivnost enzimaprotein fosfataze 1 (PP1) u odnosu na aktivnost enzima  acetilholinesteraze  (AChE). Primenom Analitičkog hijerarhijskog procesa u grupnom kontekstu, najveću težinu su dobili kriterijumi antikancerogena ativnost, produkcija biomase i sadržaj fikocijanina, navedenim redom. Konačno, u višekriterijumskom kontekstu najbolje rangiran soj jeSpirulina S1, na drugom mestu je soj Spirulina S2, dok je na trećem soj  Nostoc  LC1B.
Cyanobacteria (blue-green algae) have been identified as one  of the most promising groups of organisms for the isolation of new and biologically active natural products, therefore, the aim of this thesis was to determine the biotechnological potential of autochthonous filamentous cyanobacterial strains isolated from  Vojvodina region,  which belong to the N ₂-fixing genera  Nostoc  and  Anabaena  and non-N₂-fixing genus  Spirulina. Biotechnological potential of tested strains was determined using the production of biomass, phycobiliprotein pigments, fatty acids, phenolic co mpounds, antioxidants, antibacterial and anticancer agents. The obtained results showed that the production of biomass and phycobiliprotein pigments, in all tested strains, depended on the cultivationconditions, whereas biomass production was strongly stimulated by continuous light in Spirulina  strains, and by organic carbon sources (glycerol and glucose) in N₂-fixingstrains. The highest potential for biomass production was shown in  Spirulina  S1 strain.On the other hand, the highest potential  for the production of phycobiliproteins wasshown in strains  Spirulina  S1,  Nostoc  2S1,  Anabaena C2 and  Spirulina  S2. By determination of the content of fatty acids using GC-FID method it was found that in allthe tested strains the most common fatty acids were palmit ic, palmitoleic, oleic andlinoleic acid, whereby the strains of the genus  Spirulina produced γ-linolenic acid as well,while all strains of the Nostoc  and Anabaena  genera produced y-linolenic acid. The most frequent phenolic compounds of tested strains determined by using the HPLC-MS/MSmethod were quinic acid and catechin, with the highest content of phenolic compounds registered in Nostoc  strain 2S7B. By chemical characterization of the extracts in the tested strains it was also stated a significance of  the nitrogen cultivation conditions in order toincrease the production of phenolic compounds, as well as  y-linolenic acid. Comparing the results of the antioxidant activity in the DPPH and FRAP tests, it  was shown that strains  Spirulina  S1 and  Spirulina  S2 had the highest antioxidant potential. The antibacterial activity of the intracellular methanolic extracts was registered in strains Nostoc  2S7B,  Nostoc  2S1,  Anabaena  C2,  Anabaena  C5,  Spirulina  S1 and  Spirulina  S2, that  inhibited the growth of  Gram-positive and Gram  -negative bacteria. Using MTT test, anti-cancer ie. cytotoxic activity of  dimethyl sulfoxide  (DMSO) extracts to the HepG2 cell line was detected in all tested strains, however, the highest activity was exhibited in strains Nostoc  LC1B and Nostoc 2S7B . In bioassays Artemia salina,  Daphnia magna  and Danio rerio  a small number of strains exhibited toxicity to the test organisms, while in case of cell line RTL-W1 tested strains did not show  in vitro  cytotoxicity, which is of great importance from the aspect of the potential biotechnological application of thestrains.  Nostoc  LC1B and  Nostoc  S8 strains induced toxicity in all three bioassays, and therefore considered as the most toxic strains. By testing  in vitro  toxicity in enzyme assays, it was found that few strains inhibited the activity of  protein phosphatase (PP1) enzyme in relation to  acetylcholinesterase  enzyme  (AChE) activity. Using the Analytical hierarchical process in the group context, the highest weight was given to the criteria of anticancer  activity, biomass production, and the phycocyanin content, respectively. Finally, in the multi-criteria context, the best-ranked strain is  Spirulina  S1,  Spirulina  strain S2 is on the second place, while Nostoc strain LC1B is the third one.

L’ attività di ricerca del Dottorato di Ricerca in Scienze e Tecnologie Biologiche, XXVII ciclo, si inserisce nell’ambito della chimica delle sostanze naturali ed è rivolta all’isolamento e alla caratterizzazione strutturale dei metaboliti secondari provenienti da matrici vegetali . Le specie oggetto di studio sono piante, utilizzate nella medicina popolare per le loro caratteristiche fitoterapiche, oppure sono impiegate anche nell’alimentazione. L’indagine chimica si è concentrata sulle seguenti specie vegetali: Olea europea L., Gentiana lutea L. e su una varietà autoctona del Molise appartenente alla specie Allium cepa L. Il decotto di foglie di Olea europea, viene utilizzato nella medicina popolare per la nota attività ipotensiva e ipoglicemica. L’estratto delle radici di Gentiana lutea è impiegato per alleviare i disturbi gastrici, inoltre le radici vengono impiegate anche per la realizzazioni di bevande utilizzate come aperitivo e amaro. La specie Allium cepa è nota per l’attività antibatterica che esplica sull’apparato digerente. La purificazione e l’isolamento dei metaboliti secondari è stata realizzata mediante l’utilizzo di tecniche cromatografiche quali: cromatografia su colonna, cromatografia su strato sottile, HPLC (High Pressure Liquid Chromatography), DCCC (Droplet Countercurrent Chromatography). La caratterizzazione strutturale di tutti i composti isolati è avvenuta attraverso tecniche spettroscopiche di Risonanza Magnetica Nucleare con esperimenti monodimensionli (1H-NMR, 13C-NMR) e bidimensionali (COSY, HSQC, HMBC, ROESY). L’analisi ha condotto all’isolamento di diversi metaboliti secondari. Molti composti isolati sono stati sottoposti a test di valutazione dell’attività biologica. Alcuni prodotti hanno mostrato una notevole attività antiossidante e una potenziale capacità di inibire l’enzima xantina ossidasi. Infine alcuni dei composti isolati sono stati analizzati in silico, mediante l’utilizzo di una tecnica innovativa, la ChemGPS. La ChemGPS, ha consentito di realizzare uno studio predittivo sulle eventuali attività biologiche.
The research activity in Biological Sciences and Technology, PhD XXVII cycle, is focused on the chemistry of natural substances. The main aim is isolation and structural characterization of secondary metabolites from plants. The plant species used in this study are useful in folk medicine due to their herbal medicinal properties and edible food plants. The chemical investigation is mainly focused on the following plant species: Olea europea L., Gentiana lutea L. and Allium cepa L., a local variety found in Molise region. The decoction of the leaves of Olea europea, is widely used in folk medicine for hypotensive and hypoglycemic activities. The extract of Gentiana lutea roots is used to relieve an upset stomach. However, the roots are also used for the preparation of beverages. The species Allium cepa is known for its antibacterial activity in the digestive system. The purification and isolation of secondary metabolites was achieved by using chromatographic techniques such as column chromatography, thin layer chromatography (TLC), High Pressure Liquid Chromatography (HPLC), Droplet Countercurrent Chromatography (DCCC). The structural characterization of all isolated compounds was based on spectroscopic techniques using both mono-dimensional and two-dimensional experiments such as, NMRs (Nuclear Magnetic Resonance, i.e. 1H NMR, 13C NMR and COSY, HSQC, HMBC, ROESY, respectively). The analysis led to the isolation of several secondary metabolites. Many compounds were tested for biological activity and some of them showed a remarkable antioxidant activity and a potential inhibition of xanthine oxidase enzyme. Finally, some of the isolated compounds were analyzed in silico, by using a novel technique called ChemGPS. A predictive study on the biological activities was of the isolated test compounds was possible due to this analysis.

THIS THESIS WORK IS ABOUT THE IDENTIFICATION OF RESISTANT CROPS ABLE TO COUNTERACT THE NEGATIVE EFFECTS POSED BY CLIMATE CHANGE (E.G., DROUGHT) AND TO YIELD WITHOUT LOSSES UNDER SUSTAINABLE MANAGEMENTS PRACTICES. MOREOVER THE AIM IS TO IDENTIFY PLANT SPECIES ABLE TO EXERT BENEFICIAL AND PREVENTIVE PROPERTIES TO SAFEGUARD HUMAN HEALTH. THE IDENTIFICATION OF PLANT SPECIES WITH THESE FEATURES WAS PERFORMED BY EXPLORING THE AFRICAN BIODIVERSITY WHICH IS A SOURCE OF SEMI-DOMESTICATED AND VERY NUTRITIOUS SPECIES. IN PARTICULAR THE WORK FOCUSED ON THE EVALUATION OF GROWTH CAPABILITIES UNDER CONVENTIONAL VS CONSERVATION AGRICULTURE MANAGEMENT (I.E., NO TILLAGE, COVER CROP MAINTENANCE) OF VIGNA UNGUICULATA L. WALP AND CORCHORUS OLITORIUS L. THESE TREATMENTS WERE COUPLED TO NORMAL IRRIGATION VS. LOW WATER REGIME TO TEST THE SUITABILITY OF THE ABOVEMENTIONED SPECIES TO RESIST TO DROUGHT. THE INVESTIGATED PARAMETERS WERE MORPHOLOGY TRAITS, PHOTOSYNTHETIC ACTIVITY, BIOMASS PRODUCED AND THE METABOLIC PROFILE OF THE EDIBLE PORTIONS OF THE PLANTS (I.E., V. UNGUICULATA BEANS AND C. OLITORIUS LEAVES) . RESULTS SHOWED THE SUITABILITY OF BOTH THE CROPS TO BE GROWN UNDER CONSERVATION AGRICULTURE MANAGEMENT, SINCE BOTH AT THE YIELD AND METABOLIC LEVEL THEY DID NOT SHOWED SIGNIFICATIVE DIFFERENCES. AT THE NUTRACEUTICAL LEVELS. DIFFERENT EXPERIMENTS WERE PERFORMED. CORCHORUS OLITORIUS LEAVES WERE EVALUATED FOR THE CONTENT OF ANTIOXIDANT COMPOUNDS, MAINLY POLYPHENOLS. THE CHEMICAL CHARACTERIZATION REVEALED HUGE AMOUNTS OF FLAVONOIDS, ESPECIALLY QUERCETIN DERIVATIVES. INTERESTINGLY THESE COMPOUNDS WERE FOUND TO BE PRESENT EVEN AFTER BOILING, A TRATMENT WHICH LEAVES WERE UNDERGONE TO IN ORDER TO MIMIC THE CONDITION OF CONSUMPTION. MOREOVER, THESE FRACTIONS WERE FOUND TO BE ABLE TO EXERT SELECTIVE CYTOTOXIC PROPERTIES AGAINST A COLON CANCER CELL LINE (CACO-2) WITHOUT DETRIMENTAL EFFECTS ON THE HEALTHY ONE CCD841. THIS BIOACTIVITY DISPLAYED ON THE CACO-2 CELL LINE IS EXPLAINED BY AN INCREASE IN THE REACTIVE OXYGEN SPECIES LEVELS AFTER TREATMENT WITH THE PHENOLIC FRACTIONS AND BY A CONCOMITANT DECREASE IN THE ACTIVITY OF THE GLUTATHIONE INDEPENDENT ANTIOXIDANT ENZYMES. AS FAR AS VIGNA UNGUICULATA IS CONCERNED, THE BEAN OF THIS SPECIES WAS STUDIED IN TERMS OF NEUROPROTECTIVE AND ANTICANCER PROPERTIES. AQUEOUS EXTRACTS OF V. UNGUICULATA BEANS DELAYED CHRONOLOGICAL LIFESPAN IN BUDDING YEAST AS WELL AS IN DROSOPHILA MELANOGASTER LARVAE. MOREOVER THEY WERE ABLE TO RESCUE THE PHENOTYPE OF MUTANT YEAST CELLS OVEREXPRESSING THE ALPHA-SYNUCLEIN GENE. AT THE NEURONAL LEVEL, EXTRACTS WERE FOUND TO INDUCE THE LOCALIZATION OF ALPHA SYNUCLEIN IN CELL CYTOPLASMS INSTEAD OF IN THE PLASMATIC MEMABRANE, A CONDITION THAT POSES A LOWER CYTOTOXICITY. V. UNGUICULATA BEANS WERE FOUND ALSO TO RESCUE THE PHENOTYPE OF HUMAN NEURONES EXPRESSING ALPHA SYNUCLEIN AS A CONSEQUENCE OF A REDUCED LEVEL OF REACTIVE OXYGEN SPECIES PRODUCTION. FURTHERMORE, V. UNGUICULATA EXTRACTS WERE FOUND TO REDUCE THE NUMBER OF DEGENERATING NEURONES IN A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL. V. UNGUIXULATA AQUEOUS EXTRACT WAS STUDIED ALSO FOR ITS ABILITY TO EXERT CYTOTOXIC PROPERTIES AGAINST HUMAN COLON CANCER CELL LINES WITH NO EFFECTS ON THE HEALTHY CELL LINE. THE CYTOTXIC ACTIVITY WAS FOUND TO BE MEDIATED BY A DOWN-REGULATION OF THE EGFR PHOSPHORILATION LEVEL. THESE CANCER PREVENTIVE PROPERTIES WERE FOUND ALSO TO BE ABLE TO SUPPORT THE TREATMENT WITH A CHEMIOTERAPIC DRUG, THE MONOCLONAL ANTIBODY CETUXIMAB, USUALLY EXPLOITED FOR COLON CANCER CHEMOTHERAPETIC CYCLES. IN PARTICULAR, WHEN COLON CANCER CELLS ARE TREATED WITH V. UNGUICULATA BEAN EXTRACT, THE AMOUNT OF THE ADMINISTERED DRUG CAN BE SIGNIFICANTLY REDUCED. OVERALL THESE FINDINGS SUPPORT THE ADOPTION OF AFRICAN INDIGENOUS SPECIES SUCH AS V. UNGUICULATA AND C. OLITORIUS TO SUPPORT AGRICULTURE SUSTAINABILITY ALSO IN FORECAST OF CLIMATE CHANGE AND TO SAFEGUARD HUMAN HEALTH BY ACTING AS NUTRACEUTICAL ELEMENT IN THE DIET.
THIS THESIS WORK IS ABOUT THE IDENTIFICATION OF RESISTANT CROPS ABLE TO COUNTERACT THE NEGATIVE EFFECTS POSED BY CLIMATE CHANGE (E.G., DROUGHT) AND TO YIELD WITHOUT LOSSES UNDER SUSTAINABLE MANAGEMENTS PRACTICES. MOREOVER THE AIM IS TO IDENTIFY PLANT SPECIES ABLE TO EXERT BENEFICIAL AND PREVENTIVE PROPERTIES TO SAFEGUARD HUMAN HEALTH. THE IDENTIFICATION OF PLANT SPECIES WITH THESE FEATURES WAS PERFORMED BY EXPLORING THE AFRICAN BIODIVERSITY WHICH IS A SOURCE OF SEMI-DOMESTICATED AND VERY NUTRITIOUS SPECIES. IN PARTICULAR THE WORK FOCUSED ON THE EVALUATION OF GROWTH CAPABILITIES UNDER CONVENTIONAL VS CONSERVATION AGRICULTURE MANAGEMENT (I.E., NO TILLAGE, COVER CROP MAINTENANCE) OF VIGNA UNGUICULATA L. WALP AND CORCHORUS OLITORIUS L. THESE TREATMENTS WERE COUPLED TO NORMAL IRRIGATION VS. LOW WATER REGIME TO TEST THE SUITABILITY OF THE ABOVEMENTIONED SPECIES TO RESIST TO DROUGHT. THE INVESTIGATED PARAMETERS WERE MORPHOLOGY TRAITS, PHOTOSYNTHETIC ACTIVITY, BIOMASS PRODUCED AND THE METABOLIC PROFILE OF THE EDIBLE PORTIONS OF THE PLANTS (I.E., V. UNGUICULATA BEANS AND C. OLITORIUS LEAVES) . RESULTS SHOWED THE SUITABILITY OF BOTH THE CROPS TO BE GROWN UNDER CONSERVATION AGRICULTURE MANAGEMENT, SINCE BOTH AT THE YIELD AND METABOLIC LEVEL THEY DID NOT SHOWED SIGNIFICATIVE DIFFERENCES. AT THE NUTRACEUTICAL LEVELS. DIFFERENT EXPERIMENTS WERE PERFORMED. CORCHORUS OLITORIUS LEAVES WERE EVALUATED FOR THE CONTENT OF ANTIOXIDANT COMPOUNDS, MAINLY POLYPHENOLS. THE CHEMICAL CHARACTERIZATION REVEALED HUGE AMOUNTS OF FLAVONOIDS, ESPECIALLY QUERCETIN DERIVATIVES. INTERESTINGLY THESE COMPOUNDS WERE FOUND TO BE PRESENT EVEN AFTER BOILING, A TRATMENT WHICH LEAVES WERE UNDERGONE TO IN ORDER TO MIMIC THE CONDITION OF CONSUMPTION. MOREOVER, THESE FRACTIONS WERE FOUND TO BE ABLE TO EXERT SELECTIVE CYTOTOXIC PROPERTIES AGAINST A COLON CANCER CELL LINE (CACO-2) WITHOUT DETRIMENTAL EFFECTS ON THE HEALTHY ONE CCD841. THIS BIOACTIVITY DISPLAYED ON THE CACO-2 CELL LINE IS EXPLAINED BY AN INCREASE IN THE REACTIVE OXYGEN SPECIES LEVELS AFTER TREATMENT WITH THE PHENOLIC FRACTIONS AND BY A CONCOMITANT DECREASE IN THE ACTIVITY OF THE GLUTATHIONE INDEPENDENT ANTIOXIDANT ENZYMES. AS FAR AS VIGNA UNGUICULATA IS CONCERNED, THE BEAN OF THIS SPECIES WAS STUDIED IN TERMS OF NEUROPROTECTIVE AND ANTICANCER PROPERTIES. AQUEOUS EXTRACTS OF V. UNGUICULATA BEANS DELAYED CHRONOLOGICAL LIFESPAN IN BUDDING YEAST AS WELL AS IN DROSOPHILA MELANOGASTER LARVAE. MOREOVER THEY WERE ABLE TO RESCUE THE PHENOTYPE OF MUTANT YEAST CELLS OVEREXPRESSING THE ALPHA-SYNUCLEIN GENE. AT THE NEURONAL LEVEL, EXTRACTS WERE FOUND TO INDUCE THE LOCALIZATION OF ALPHA SYNUCLEIN IN CELL CYTOPLASMS INSTEAD OF IN THE PLASMATIC MEMABRANE, A CONDITION THAT POSES A LOWER CYTOTOXICITY. V. UNGUICULATA BEANS WERE FOUND ALSO TO RESCUE THE PHENOTYPE OF HUMAN NEURONES EXPRESSING ALPHA SYNUCLEIN AS A CONSEQUENCE OF A REDUCED LEVEL OF REACTIVE OXYGEN SPECIES PRODUCTION. FURTHERMORE, V. UNGUICULATA EXTRACTS WERE FOUND TO REDUCE THE NUMBER OF DEGENERATING NEURONES IN A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL. V. UNGUIXULATA AQUEOUS EXTRACT WAS STUDIED ALSO FOR ITS ABILITY TO EXERT CYTOTOXIC PROPERTIES AGAINST HUMAN COLON CANCER CELL LINES WITH NO EFFECTS ON THE HEALTHY CELL LINE. THE CYTOTXIC ACTIVITY WAS FOUND TO BE MEDIATED BY A DOWN-REGULATION OF THE EGFR PHOSPHORILATION LEVEL. THESE CANCER PREVENTIVE PROPERTIES WERE FOUND ALSO TO BE ABLE TO SUPPORT THE TREATMENT WITH A CHEMIOTERAPIC DRUG, THE MONOCLONAL ANTIBODY CETUXIMAB, USUALLY EXPLOITED FOR COLON CANCER CHEMOTHERAPETIC CYCLES. IN PARTICULAR, WHEN COLON CANCER CELLS ARE TREATED WITH V. UNGUICULATA BEAN EXTRACT, THE AMOUNT OF THE ADMINISTERED DRUG CAN BE SIGNIFICANTLY REDUCED. OVERALL THESE FINDINGS SUPPORT THE ADOPTION OF AFRICAN INDIGENOUS SPECIES SUCH AS V. UNGUICULATA AND C. OLITORIUS TO SUPPORT AGRICULTURE SUSTAINABILITY ALSO IN FORECAST OF CLIMATE CHANGE AND TO SAFEGUARD HUMAN HEALTH BY ACTING AS NUTRACEUTICAL ELEMENT IN THE DIET.

Una nuova sostanza psicoattiva (NPS) è definita dall'Ufficio delle droghe e delle tossicodipendenze delle Nazioni Unite (UNODC) come una "sostanza di abuso, in forma pura o in un preparato, che non è controllata dalla Convenzione unica sugli stupefacenti del 1961 o la Convenzione del 1971 sulle sostanze psicotrope, ma che possono rappresentare una minaccia per la salute pubblica”. Ad oggi sono più di 1.100 le molecole identificate come NPS nel mercato illecito e ogni anno compare per la prima volta un numero variabile di nuove alternative. La natura mutante del mercato delle NPS rappresenta uno degli aspetti più impegnativi della lotta contro questi problemi di salute pubblica perché poco si sa circa il profilo tossicologico di queste sostanze quando compaiono per la prima volta. A tal proposito, gli studi metabolici in vitro sono considerati il primo passo nella comprensione della farmacologia delle NPS, consentendo l'individuazione di possibili biomarcatori di consumo. Abbiamo studiato il metabolismo in vitro di tre diverse NPS, due analoghi del fentanil e un catinone sintetico, in due diversi lotti di incubazione secondo un protocollo consolidato. In primo luogo, abbiamo studiato il destino metabolico del fenilfentanil e del b'-fenilfentanil utilizzando previsioni in silico con freeware GLORYx, incubazioni di epatociti umani e spettrometria di massa tandem ad alta risoluzione per cromatografia liquida (LC-HRMS/MS). Abbiamo applicato uno specifico flusso di lavoro mirato/non mirato utilizzando un software di data mining per consentire lo screening rapido e parzialmente automatizzato dei dati grezzi LC-HRMS/MS. Sebbene la struttura simile di fenilfentanil e b'-fenilfentanil, abbiamo osservato diverse differenze nel destino metabolico dei due. La prima differenza è nel numero di metaboliti, infatti abbiamo individuato 13 metaboliti del fenilfentanil e 27 metaboliti del b'fenilfentanil. Inoltre, la formazione in vitro di 4-anilino-fenetilpiperidina, uno dei più comuni metaboliti dell'analogo del fentanil, è stata osservata solo per il fenilfentanil. Le reazioni di idrossilazione sono state preferite per il b'fenilfentanil, mirando alla catena alchilica laterale e agli anelli fenilici. Inoltre, i metaboliti di fase II sono stati trovati solo nel b'-fenilfentanil, come i glucuronidi e i metaboliti O-metilati. Tuttavia, il segnale più intenso è stato prodotto dal metabolita N-dealchilato, i cosiddetti nor-metaboliti, in entrambe le separazioni cromatografiche. Le differenze nel destino metabolico suggeriscono un ruolo importante della catena alchilica laterale degli analoghi del fentanil. È stata applicata una strategia di previsione metabolica estesa in silico per la previsione del 3fuoro-a-pyrrolidovalerophenon (3f-a-PVP), utilizzando tre software gratuiti specifici per ottenere una previsione più completa. La stessa strategia analitica e di data mining è stata quindi applicata per lo studio 3f-a-PVP. La stessa strategia analitica e l'approccio di data mining sono stati applicati con successo per studiare i metaboliti prodotti durante le incubazioni. Dieci metaboliti sono stati identificati dopo 3 ore di incubazione, inclusi metaboliti idrogenati, idrossilati, ossidati e N-dealchilati. Sono stati previsti un totale di 51 metaboliti di fase I e II, di cui 7 sono stati rilevati nelle incubazioni. Suggeriamo acido N-butanoico 3F-α-PVP, pentanolo 3F-α-PVP e 2-ketopirrolidinil-pentanolo 3F-α-PVP come biomarcatori specifici del consumo di 3F-α-PVP. Questa è la prima volta che un acido N-etanoico viene rilevato nella via metabolica di una pirrolidina SC, dimostrando l'importanza di una doppia strategia di data mining mirata/non mirata.
A New Psychoactive Substance (NPS) is defined by United Nation Office of Drugs and Drug Addiction (UNODC) as a “substance of abuse, either in a pure form or a preparation, that is not controlled by the 1961 Single Convention on Narcotic Drugs or the 1971 Convention on Psychotropic Substances, but which may pose a public health threat”. To date, more than 1,100 molecules have been identified as NPS in the illicit market and every year a variable number of new alternatives appears for the first time. The mutating nature of the NPS market represents one of the most challenging aspects of the fight against this public health issues because little is known about the toxicological profile of these substances when they appear for the first time. To this concern, the in vitro metabolic studies are considered the first step in the understanding of the pharmacology of NPS, allowing the individuation of possible biomarkers of consumption. We studied the in vitro metabolism of three different NPS, two fentanyl analogues and one synthetic cathinone, in two different incubation batches according to a consolidated protocol. First, we studied phenylfentanyl and b’-phenylfentanyl metabolic fate using in silico predictions with GLORYx freeware, human hepatocyte incubations, and liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (LC-HRMS/MS). We applied a specific targeted/untargeted workflow using data-mining software to allow the rapid and partially automated screening of LC-HRMS/MS raw data. Although the similar structure of phenylfentanyl and b’-phenylfentanyl, we observed several differences in the metabolic fate of the two analogues. The first difference is in the number of metabolites, in fact we characterized 13 phenylfentanyl metabolites and 27 b’phenylfentanyl metabolites. Furthermore, the in vitro formation of 4-anilino-phenethylpiperidine, one of the most common fentanyl analogue metabolites, was observed only for phenylfentanyl. The hydroxylation reactions were preferred for b’phenylfentanyl, targeting the lateral alkyl chain and the phenyl rings. Moreover, phase II metabolites were found only in b’-phenylfentanyl, such as glucuronides and O-methylated metabolites. However, the most intense signal was produced by the N-dealkylated metabolite, the so called nor-metabolites, in both the chromatographic separations. The differences in the metabolic fate suggest an important role of the lateral alkyl chain of fentanyl analogues. An extended in silico metabolic prediction strategy was applied for the prediction of 3fuoro-a-pyrrolidovalerophenon (3f-a-PVP), using three specific freeware to obtain a more comprehensive prediction. The same analytical and data-mining strategy was then applied for the 3f-a-PVP study. The same analytical strategy and data-mining approach was successfully applied to investigate the metabolites produced during the incubations. Ten metabolites were identified after 3 h incubation, including hydrogenated, hydroxylated, oxidated, and N-dealkylated metabolites. A total of 51 phase I and II metabolites were predicted, among which 7 were detected in the incubations. We suggest 3F-α-PVP N-butanoic acid, 3F-α-PVP pentanol, and 3F-α-PVP 2-ketopyrrolidinyl-pentanol as specific biomarkers of 3F-α-PVP consumption. This is the first time that an N-ethanoic acid is detected in the metabolic pathway of a pyrrolidine SC, demonstrating the importance of a dual targeted/untargeted data mining strategy.

L'improprio ed incontrollato uso degli antibiotici verso i batteri patogeni ha favorito l'insorgenza dei ceppi Multi-Drug Resistant, da cui deriva l urgenza di trovare antibiotici alternativi a quelli già in uso. Recentemente l interesse di molti studiosi è sempre più rivolto alla ricerca di nuove fonti di molecole bioattive e l oceano rimane una fonte ancora poco esplorata di molecole biologicamente attive; la maggior parte delle sostanze marine con attività biologica sono prodotte da invertebrati come poriferi, cnidari, briozoi e nudibranchi, vertebrati come le ascidie, da vegetali quali le alghe e da alcuni sistemi di microrganismi, quali quelli marini, gli estremofili, i simbionti, produttori di metaboliti secondari prodotti per la difesa verso condizioni ambientali non ottimali. La competizione tra microrganismi colonizzatori degli ambienti estremi, come quelli antartici, si prospetta essere un nuovo e promettente orizzonte di ricerca. Lo studio è stato condotto su 833 ceppi batterici isolati da 52 esemplari di Poriferi antartici della Collezione Italiana di Batteri Antartici (CIBAN) da cui dopo un preliminare screening dell attività inibitoria, sono stati estratti da alcuni ceppi molecole ad attività inibitoria, polisaccaridi e pigmenti di cui è stata testata l attività antimicrobica. La percentuale di ceppi antartici attivi nei confronti di almeno un microrganismo bersaglio (19,4 %) è apparsa comparabile con quelle riportate in letteratura riguardanti batteri associati a spugne dei mari temperati o tropicali, per quanto riguarda le conoscenze pregresse sull attività antibiotica di ceppi antartici, la percentuale di batteri attivi determinata nel presente studio è apparsa superiore a quella riportata. Pseudoalteromonas sp., Psychrobacter sp. e Arthrobacter sp. sono le specie che hanno mostrato maggiore attività antibatterica. Nessuna attività antivirale è stata osservata dagli estratti polisaccaridici. La poco conoscenza e nuovi promettenti dati in letteratura suggeriscono di ampliare le ricerche verso tali microrganismi. In linea con la ricerca di sostanze di natura antimicrobica da organismi marini, l attenzione durante il corso di studi si è spostata anche ad altri organismi produttori di polisaccaridi solfati : le alghe, di cui si sta valorizzando la coltivazione per diversi usi, e di cui recenti studi hanno dimostrato il potenziale antivirale. Sette campioni rappresentativi le tre divisioni macroalgali sono state scelte nel seguente studio: Agardhiella sp., Gracilaria sp. e Hypnea musciformis, Chaetomorpha sp. e Ulva lactuca, Padina pavonica e Halopteris filicina. Talli freschi sono stati raccolti tra i mesi di maggio e di luglio nelle coste della Sicilia Nord- Orientale, essiccati o liofilizzati e sottoposti ad estrazione con etanolo. I prodotti sono stati testati per il potenziale antimicrobico. Non è stata osservata alcuna attività antivirale, bensì antibatterica verso batteri Gram-positivi ed antifungina verso C. albicans. Le poche specie prese in esame in questo studio e la possibilità di modificare la solfatazione dei polisaccaridi aumentandone la bio-attività dovrebbe stimolare la ricerca in questo settore.

Oxygen and nitrogen-derived free radicals play an important role in the pathogenesis of several human diseases including neurodegeneration, chronic inflammation, cancer and cardiovascular disorders such as atherosclerosis, ischemic heart disease and hypertension. Epidemiological and experimental studies suggest the hypothesis that oxidative modifications of the endothelium and low-density lipoproteins (ox-LDLs) are crucial targets for the lipid-induced initiation and progression of atherogenesis; therefore, the preservation of the endothelial antioxidant capacity and the inhibition of LDL peroxidation by specific antioxidants are an attractive strategy to prevent and possibly to treat atherosclerosis and other related cardiovascular disorders. Baicalein (from Scutellaria baicalensis G.), (-)-bilobalide (Ginkgo biloba L.), eupatorin (Eupatorium semiserratum DC.), galangin (propolis), magnolol (Magnolia officinalis L.), myricetin (Myrica rubra S.Z.), oleuropein (Olea europaea L.) and silybinin (Silybum marianum L.) are plant-derived compounds widely used in traditional medicine: the aim of this study was to investigate their radical-scavenging capacity, in order to prevent ox-LDLs generation and endothelial dysfunction, using different in vitro and ex vivo assays. Antiradical properties were firstly analysed using both 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and oxygen radical absorbance capacity (ORAC) scavenging assays, in that these methods rely on either single electron transfer or hydrogen atom transfer reaction kinetics. The DPPH assay was set in a final concentration range of 10^-7–10^-2 M, confirming a remarkable reducing capacity for each phenolic compound, especially for myricetin, oleuropein and baicalein. The ORAC detection proved that oleuropein, myricetin and magnolol are the most active compounds. In both DPPH and ORAC assays, the compound (-)-bilobalide did not show any noteworthy antioxidant activity. Oxidation of LDLs may provide the crucial link between plasma LDL and atherogenesis: for this reason, the antioxidant effect of each compound was studied on the susceptibility of human LDLs to oxidation. A determination of the extent of LDL oxidation was pointed out spectrophotometrically by measuring the formation of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), after incubation with 10 microM CuSO4, and by monitoring the oxidation kinetics profile of LDL particles at 234 nm. Free radical damage to lipids results in the production of malondialdehyde (MDA), which reacts with thiobarbituric acid under conditions of high temperature and acidity generating a chromogen; the lowest levels of TBARS, measured as nMol MDA/mg LDLs, were observed for oleuropein 2.5 microM and baicalein 5.0 microM. The kinetic of LDL oxidation was studied using the lag time index. Magnolol, oleuropein and myricetin (0.5 microM) exhibited a significantly higher LDL protection degree than the other polyphenols, with a considerable prolongation of the lag phase. Besides these evaluations, we used human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) primary cultures to investigate ROS production. The HUVECs represent an interesting model which plays a pivotal role in the study of different patophysiological processes, including arterial disease. The protective function of antioxidants towards oxidative stress was measured in a range from 0.01 microM to 5 microM through the dichlorofluorescin assay, a fluorimetric probe used to evaluate the intracellular peroxides generation. ROS detection was carried out both in basal conditions and after 500 microM H2O2 addition, as an external oxidative stimulus. In basal conditions, the phytoconstituents showed a mild antioxidant activity, even at different specific concentrations, highlighting an heterogeneous trend. Under H2O2-induced oxidative stress, galangin 5 microM showed higher antioxidant activity, and myricetin showed a significant antioxidant profile at 0.01 microM, 0.1 microM and 5 microM, even if in a less extent. The results suggest the polyphenolics as a possible strategy against the oxidative stress-related disorders as atherosclerosis. This encourages the future research of plant-derived compounds as effective antioxidant agents, in order to decrease ox-LDLs production in vivo and to provide a suitable basis for novel pharmacological development against free radicals damage.
Le specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto rivestono un ruolo importante nella patogenesi di numerose malattie, tra le quali la neurodegenerazione, l’infiammazione cronica, il cancro e le malattie cardiovascolari come l’aterosclerosi, le cardiopatie ischemiche e l’ipertensione. Studi sperimentali ed epidemiologici suggeriscono l’ipotesi che le modificazioni ossidative a carico dell’endotelio e delle lipoproteine a bassa densità (ox-LDL) rappresentano un fattore di cruciale importanza per l’iniziazione e la progressione dei processi aterosclerotici; preservare perciò l’integrità endoteliale e inibire la perossidazione delle LDL rappresenta una valida strategia per prevenire e, probabilmente, trattare l’aterosclerosi ed altri disordini cardiovascolari. Baicaleina (estratta da Scutellaria baicalensis G.), (-)-bilobalide (Ginkgo biloba L.), eupatorina (Eupatorium semiserratum D.C.), galangina (propoli), magnololo (Magnolia officinalis L.), miricetina (Myrica rubra S.Z.), oleuropeina (Olea europaea L.) e silibinina (Silybum marianum L.) sono composti di origine vegetale ampiamente utilizzati in medicina tradizionale nella cura di svariate malattie. Lo scopo di questo studio è stato focalizzato sulla determinazione della loro capacità antiradicalica, al fine di prevenire la formazione di ox-LDL ed attenuare la disfunzione endoteliale, ricorrendo all’impiego di diversi saggi in vitro ed ex vivo. Le proprietà antiradicaliche dei metaboliti secondari sono state inizialmente studiate ricorrendo ai saggi: a) dell’1,1-difenil-2-picrilidrazile (DPPH) scavenging assay, e b) dell’oxygen radical absorbance capacity (ORAC) assay. Si tratta di metodi che si avvalgono di cinetiche di reazione basate sul trasferimento di singolo elettrone o mediante cessione di un atomo di idrogeno. Il DPPH scavenging assay è stato eseguito entro un intervallo di concentrazioni compreso tra 10^-7 M e 10^-2 M confermando una notevole capacità riducente per ciascun composto polifenolico, specialmente per miricetina, oleuropeina e baicaleina. L’analisi ORAC ha indicato come oleuropeina, miricetina e magnololo siano i composti più attivi. In entrambi i protocolli, il composto (-)-bilobalide non ha mostrato alcuna attività degna di nota. I processi di ossidazione delle LDL potrebbero, di fatto, rappresentare il nesso cruciale tra LDL plasmatiche ed aterogenesi: per questa ragione l'effetto antiossidante di ciascun composto è stato studiato in relazione alla suscettibilità delle LDL umane all'ossidazione. La determinazione del grado di ossidazione delle LDL è stata rilevata misurando la formazione di specie reattive dell’acido tiobarbiturico (TBARS), a seguito dell’incubazione con CuSO4 10 microM e monitorando il profilo cinetico di ossidazione delle LDL a 234 nm. I danni radicalici provocati a carico della frazione lipidica si traducono nella produzione di malondialdeide (MDA), una molecola in grado di reagire con l'acido tiobarbiturico in condizioni di alta temperatura ed acidità generando un addotto cromogeno; i composti oleuropeina 2.5 microM e baicaleina 5 microM hanno evidenziato i minori valori di TBARS, misurati come nMol MDA/mg LDL. Il profilo cinetico delle LDL trattate con ciascun fitocostituente è stato studiato ricorrendo all'indice di lag time. Alla concentrazione di 0.5 microM il magnololo, l’oleuropeina e la miricetina hanno mostrato un grado di protezione delle LDL significativamente più elevato rispetto agli altri polifenoli, con un notevole prolungamento della fase di latenza. Successivamente, si è passati allo studio delle colture primarie di cellule endoteliali umane isolate da vena ombelicale (HUVEC), per indagare la produzione di ROS. Le HUVEC rappresentano infatti un modello di fondamentale importanza nello studio di diversi processi patofisiologici correlati al sistema vascolare. L’attività degli antiossidanti nei confronti dello stress ossidativo è stata misurata nell’intervallo di concentrazione 0.01 - 5 microM mediante il saggio della diclorofluorescina, una sonda fluorimetrica impiegata per valutare la produzione intracellulare di perossidi. La determinazione delle specie reattive dell’ossigeno è stata condotta sia in condizioni basali, sia dopo l'aggiunta di H2O2 500 microM. In condizioni basali, i fitocostituenti hanno mostrato una modesta attività antiossidante mentre in condizioni di stress ossidativo indotto da H2O2, la galangina 5 microM ha dimostrato un più spiccato carattere antiossidante; anche la miricetina ha mostrato un profilo antiossidante significativo a 0.01 microM, 0.1 microM e 5 microM, anche se di minore entità. I risultati ottenuti in vitro suggeriscono che i polifenoli rappresentano una classe di composti naturali in grado di contrastare le disfunzioni ossidative legate all’aterosclerosi. Tali evidenze sperimentali incoraggiano la ricerca futura di derivati vegetali come efficaci agenti dotati di attività antiossidante anche in vivo, al fine di limitare la produzione di ox-LDL e fornire un adeguato presupposto per lo sviluppo di farmaci contro i danni provocati dalle specie radicaliche, in particolare a livello cardiovascolare.

Fusarium verticillioides è responsabile della fusariosi della spiga in mais e della contaminazione della granella con micotossine. Sono state individuate le regioni geniche e i geni candidati per la resistenza a Fusarium dal confronto tra una linea di mais resistente (CO441) e una suscettibile (CO354), impiegando tre diversi approcci: analisi QTL, analisi trascrittomica (RNASeq) e analisi metabolomica. 184 famiglie F2:3 (CO441xCO354) sono state valutate in due diversi ambienti nell’anno 2011 e inoculate artificialmente con due diverse tecniche (forchetta e stuzzicadente). E’ stata rilevata una significativa variazione genotipica in risposta all’infezione. Sulla base di una mappa preliminare di linkage molecolare contenente 74 marcatori microsatelliti polimorfici, sono stati determinati 8 QTLs comuni alla resistenza alla fusariosi della spiga e alla riduzione della contaminazione da fumonisine. Sono stati considerati geni candidati per la resistenza i geni differenzialmente espressi, risultanti dall’ RNASeq, in semi di mais CO441 prima e 72 ore dopo l’infezione. I metaboliti putativi correlati alla resistenza sono stati rilevati tramite high resolution LC-MS in entrambe le linee di mais. I geni candidati e i metaboliti mappano in pathway coinvolti nei meccanismi di difesa: fenilalanina, tirosina e triptofano biosintesi, fenilpropanoidi e flavonoidi biosintesi, metabolismo dell’acido linoleico e α-linolenico. Abbondanti trascritti derivano dalla biosintesi dei terpenoidi e dei diterpenoidi. Nei geni candidati verranno ricercati polimorfismi fra le due linee di mais e che andranno ad arricchire la mappa di linkage molecolare.
Fusarium verticillioides is responsible for Fusarium ear rot in maize and mycotoxin contamination of grain. Genomic regions and candidate genes for resistance to Fusarium were detected through the comparison of resistant (CO441) and susceptible (CO354) maize lines, by following three different approaches: Quantitative Trait Locus (QTL), transcriptomic (RNASeq) and metabolomic analyses. 184 F2:3 families (CO441xCO354) were evaluated in two different environments in 2011 and artificially infected with two side-needle inoculation methods (pin-bar and toothpick). Significant genotypic variation in response to infection was detected. On the basis of a genetic draft map containing 74 polymorphic SSRs markers, 8 common QTLs for Fusarium ear rot resistance and fumonisin contamination reduction were revealed. Candidate genes for resistance resulted from differentially expressed genes before and 72 hours post infection of CO441 kernels through RNASeq technology. Putative metabolites related to resistance were detected through high resolution LC-MS in both maize lines. Candidate genes and metabolites mapped in pathways involved in defense mechanism: phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis, linoleic and α-linolenic acid metabolism. Abundant genic transcripts derived from terpenoid and diterpenoid biosynthesis. Candidate genes will be screened for polymorphisms between the two maize lines in order to enrich the linkage map.

Fusarium verticillioides è responsabile della fusariosi della spiga in mais e della contaminazione della granella con micotossine. Sono state individuate le regioni geniche e i geni candidati per la resistenza a Fusarium dal confronto tra una linea di mais resistente (CO441) e una suscettibile (CO354), impiegando tre diversi approcci: analisi QTL, analisi trascrittomica (RNASeq) e analisi metabolomica. 184 famiglie F2:3 (CO441xCO354) sono state valutate in due diversi ambienti nell’anno 2011 e inoculate artificialmente con due diverse tecniche (forchetta e stuzzicadente). E’ stata rilevata una significativa variazione genotipica in risposta all’infezione. Sulla base di una mappa preliminare di linkage molecolare contenente 74 marcatori microsatelliti polimorfici, sono stati determinati 8 QTLs comuni alla resistenza alla fusariosi della spiga e alla riduzione della contaminazione da fumonisine. Sono stati considerati geni candidati per la resistenza i geni differenzialmente espressi, risultanti dall’ RNASeq, in semi di mais CO441 prima e 72 ore dopo l’infezione. I metaboliti putativi correlati alla resistenza sono stati rilevati tramite high resolution LC-MS in entrambe le linee di mais. I geni candidati e i metaboliti mappano in pathway coinvolti nei meccanismi di difesa: fenilalanina, tirosina e triptofano biosintesi, fenilpropanoidi e flavonoidi biosintesi, metabolismo dell’acido linoleico e α-linolenico. Abbondanti trascritti derivano dalla biosintesi dei terpenoidi e dei diterpenoidi. Nei geni candidati verranno ricercati polimorfismi fra le due linee di mais e che andranno ad arricchire la mappa di linkage molecolare.
Fusarium verticillioides is responsible for Fusarium ear rot in maize and mycotoxin contamination of grain. Genomic regions and candidate genes for resistance to Fusarium were detected through the comparison of resistant (CO441) and susceptible (CO354) maize lines, by following three different approaches: Quantitative Trait Locus (QTL), transcriptomic (RNASeq) and metabolomic analyses. 184 F2:3 families (CO441xCO354) were evaluated in two different environments in 2011 and artificially infected with two side-needle inoculation methods (pin-bar and toothpick). Significant genotypic variation in response to infection was detected. On the basis of a genetic draft map containing 74 polymorphic SSRs markers, 8 common QTLs for Fusarium ear rot resistance and fumonisin contamination reduction were revealed. Candidate genes for resistance resulted from differentially expressed genes before and 72 hours post infection of CO441 kernels through RNASeq technology. Putative metabolites related to resistance were detected through high resolution LC-MS in both maize lines. Candidate genes and metabolites mapped in pathways involved in defense mechanism: phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, phenylpropanoid and flavonoid biosynthesis, linoleic and α-linolenic acid metabolism. Abundant genic transcripts derived from terpenoid and diterpenoid biosynthesis. Candidate genes will be screened for polymorphisms between the two maize lines in order to enrich the linkage map.

La presenza di pesticidi nelle acque di falda è emersa come un importante problema ambientale negli ultimi decenni. In base a “Rapporto nazionale pesticidi nelle acque - Dati 2015-2016” (ISPRA, 2018), in Italia, gli erbicidi triazinici e i loro metaboliti sono tra le sostanze identificate con più frequenza nelle acque, sebbene l’atrazina sia stata bandita nel 1992 e l’utilizzo di terbutilazina sia sottoposto a severe restrizioni. Lo scopo di questo progetto è valutare e quantificare la presenza di atrazina, terbutilazina e dei loro metaboliti nelle acque di falda in aree maidicole italiane. I risultati dimostrano come le molecole oggetto di studio siano state frequentemente individuate nei campioni di acqua di falda, anche se a concentrazioni inferiori al limite stabilito dalla Commissione Europea. Considerando che l’utilizzo di questi erbicidi è proibito o fortemente regolamentato, è interessante valutare il loro comportamento in una scala temporale pluriennale al fine di mettere in evidenza la contaminazione delle acque di falda dovute all’uso diffuso e alla persistenza ambientale di tali molecole.
The presence of pesticides in groundwater has emerged as an important environmental issue in the last decades. According to “Rapporto nazionale pesticidi nelle acque - Dati 2015-2016” (ISPRA, 2018), in Italy triazine herbicides and their metabolites are among the substances most frequently detected in water. While terbuthylazine is still used under restriction, atrazine was banned in 1992. The aim of research project is to investigate the presence of atrazine, terbuthylazine and their metabolites in groundwater in Italian maize-growing areas in order to supply data and information on the groundwater quality. The results show that atrazine, terbuthylazine and their metabolites were often detected in groundwater, even if their concentrations were below the limit established by European Commission. Considering these molecules are banned or heavily regulated, it is interesting to evaluate their behavior on a multiannual time scale in order to highlight the groundwater contamination due to the widespread use and to the environmental persistence of these substances.

La presenza di pesticidi nelle acque di falda è emersa come un importante problema ambientale negli ultimi decenni. In base a “Rapporto nazionale pesticidi nelle acque - Dati 2015-2016” (ISPRA, 2018), in Italia, gli erbicidi triazinici e i loro metaboliti sono tra le sostanze identificate con più frequenza nelle acque, sebbene l’atrazina sia stata bandita nel 1992 e l’utilizzo di terbutilazina sia sottoposto a severe restrizioni. Lo scopo di questo progetto è valutare e quantificare la presenza di atrazina, terbutilazina e dei loro metaboliti nelle acque di falda in aree maidicole italiane. I risultati dimostrano come le molecole oggetto di studio siano state frequentemente individuate nei campioni di acqua di falda, anche se a concentrazioni inferiori al limite stabilito dalla Commissione Europea. Considerando che l’utilizzo di questi erbicidi è proibito o fortemente regolamentato, è interessante valutare il loro comportamento in una scala temporale pluriennale al fine di mettere in evidenza la contaminazione delle acque di falda dovute all’uso diffuso e alla persistenza ambientale di tali molecole.
The presence of pesticides in groundwater has emerged as an important environmental issue in the last decades. According to “Rapporto nazionale pesticidi nelle acque - Dati 2015-2016” (ISPRA, 2018), in Italy triazine herbicides and their metabolites are among the substances most frequently detected in water. While terbuthylazine is still used under restriction, atrazine was banned in 1992. The aim of research project is to investigate the presence of atrazine, terbuthylazine and their metabolites in groundwater in Italian maize-growing areas in order to supply data and information on the groundwater quality. The results show that atrazine, terbuthylazine and their metabolites were often detected in groundwater, even if their concentrations were below the limit established by European Commission. Considering these molecules are banned or heavily regulated, it is interesting to evaluate their behavior on a multiannual time scale in order to highlight the groundwater contamination due to the widespread use and to the environmental persistence of these substances.

In the EU the use of hormonal substances is prohibited in cattle fattening to avoid consumer exposure to unforeseeable risks from the intake of hormone residues and their metabolites. National Surveillance Plans for steroid abuse adopted the detection of the parent compound in urine and other sample matrices but, in spite of the progress in analytical techniques which allows to obtain very low detection limits for individual residues, this strategy may be unsuccessful; the use of natural hormones or of hormone precursors, the use of a combination of different active principles either at very low dosages or of unknown chemical structure are a few examples of procedures to escape the analytical controls. So effective surveillance and monitoring of the ban requires not only the availability of validated analysis methods for screening and confirmation of hormone residues in urine and other sample matrices but also knowledge about the absorption, biotransformation and excretion kinetics of illegally administered hormones, as well as endogenous levels of hormones in these sample matrices and also to develop complementary screening tests based on the biological action(s) of the substance(s) under investigation. Aim of the thesis was to study the application of traditional analytical methods like LC/MS-MS , RIA and ELISA to detect to study the pattern of excretion of some urinary steroids in calves as marker of illicit treatments. In the first part of this thesis is presented a preliminary assessment of physiological concentrations of testosterone (T) and epitestosterone (epiT) in urine of veal calves. Current methods to detect the misuse of natural androgens in cattle do not involve evaluation of urinary content of testosterone (T) because no validated physiological levels are set and threshold values cannot be fixed. In man urinary excretion of epiT occurs at similar or slightly lower concentration than that of T. Because of after exogenous T administration urinary epiT remains rather constant or decreases, while T increases, a threshold value of the ratio T/epiT = 6, in urine, was established as a limit for doping control in athletes. To evaluate whether urinary ratios could be useful for surveillance of exogenous hormone treatments also in calves urine samples were collected from control calves and from calves treated with oestradiol plus testosterone or oestradiol plus boldenone and urinary concentration of T and epiT was assessed by LC-MS/MS analysis. In all urine samples collected from control and treated animals the epiT concentrations were by far greater than T. EpiT may be considered one of the major urinary metabolites of T. Thus when the T/epiT ratio was calculated using the same approach adopted for doping control in man, no significant differences could be observed between treated and control calves. It is likely that the paramount difference between E and T concentrations masked the effect of treatment. Recent data, suggested that in calves repeated treatments with natural hormones could cause a time-course reduction of urinary E . Adopting the E/T ratio, the reduction of E urinary excretion can be confirmed in Testosterone treated calves (A) but still no evident in Boldenone treated ones. The second part of this thesis deals with the identification of administation of a glucocorticoids like dexamethasone, (DXM) which is often illegally used as a growth promoters. To identify indirect biomarkers of illicit treatments, the urinary ratio between 6beta-hydroxycortisol (6beta-OHF) and cortisol (F), was measured in urines obtained from bulls experimentally treated per os and intramuscuarly (im) with different DXM dosages. Dexamethasone, given per os at low doses elicited an early and lasting significant reduction of 6beta-OHF/F. No significant variations were seen in urines from bulls given DXM intramuscularly. These results suggest 6beta-OHF/F as a rapid, non invasive, screening test for oral, low-dose, long-term corticosteroid treatment in cattle. The last part regards the results of a study aiming to clarify the natural occurrence and the metabolism of boldenone in cattle. The residue profiles of 17?-/17?-boldenone conjugated (17?/?-Bol) and ADD were investigated by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in urine of male veal calves fed two commercial milk replacers, with different content of phytosterols and administered with 17?-Bol and ADD per os. The presence of conjugate 17?-Bol, ubiquitous and at higher concentrations in urine from control calves receiving the milk replacer with the greater amount of plant sterols support the theory that 17?-Bol is diet-related. In urine from treated animals the much higher17?-Bol levels were not modified by the production from diet precursors. The results confirmed the urinary excretion of 17?-Bol is due to exogenous administration of 17?-Bol. The discontinuous rate of elimination of both 17?- and 17?-Bol, despite the daily administration of 17?-Bol plus ADD, indicates the necessity for further research to detect other urinary boldenone metabolites to strength surveillance strategy. To identify metabolites as in vivo markers to support the thesis of exogenous administration, a further approach to the in vitro biotransformation of 17?-Bol and ADD was performed using different subcellular fractions obtained from both liver and kidney of untreated cattle. Metabolites obtained from incubated parent compounds were separated by liquid chromatography (HPLC) elution and successively identified by mass spectrometry (LC-MS/MS) detection. The bovine liver was the target tissue of the main metabolic reaction transforming 17?-Bol to ADD and viceversa. The analysis of the incubation extracts detected thepresence of polar hydroxylated (m/z 303) derivates of 17?-Bol, 17?-Bol and ADD. The results indicated that the urinary excretion profile in vivo of 6?-hydroxy-17?-Bol, 16?-hydroxy-17?-Bol and 6?-hydroxy-17?-Bol could be studied together with 17?- and 17?-BOLD as putative markers of 17?-Bol treatment in cattle. Preliminary results of investigation regarding the presence of the hydroxylated metabolites in urine of calves treated with boldenone shown, even though additional studies are in due course, candidate 6?-hydroxy-17?-Bol as new potential marker of anabolic abuse of boldenone.

Negli ultimi anni sono state pubblicate diverse normative, tra le quali ritroviamo la Decisione 2015/495 che ha emesso una lista di contaminanti con problematiche emergenti. Tra questi vi è il Triallate, erbicida pre-emergenza sul quale è stato basato questo progetto. In questo elaborato sono stati messi a confronto i risultati di uno studio triennale, il cui obiettivo era quello di monitorare le concentrazioni nelle acque di falda di due metaboliti del Triallate (DIPA e TCPSA), con i dati emersi dai modelli previsionali (FOCUS-Pearl) e verificare se tali dati erano concordi o se i valori della modellistica fornivano una tutela largamente protettiva nei confronti dell’ambiente, in sede di registrazione.
Recently, several regulations have been published, among which we find Decision 2015/495 which contains a list of contaminants with emerging problems. Among these we find Triallate, an herbicide on which this project was based. In this paper, the results of a three-year study on two metabolites of Triallate (DIPA and TCPSA) were compared with the data emerging from models (FOCUS-Pearl ). At the end we check if these data were in agreement or if the values ​​of the modeling provided a largely protective protection towards the environment.

Negli ultimi anni sono state pubblicate diverse normative, tra le quali ritroviamo la Decisione 2015/495 che ha emesso una lista di contaminanti con problematiche emergenti. Tra questi vi è il Triallate, erbicida pre-emergenza sul quale è stato basato questo progetto. In questo elaborato sono stati messi a confronto i risultati di uno studio triennale, il cui obiettivo era quello di monitorare le concentrazioni nelle acque di falda di due metaboliti del Triallate (DIPA e TCPSA), con i dati emersi dai modelli previsionali (FOCUS-Pearl) e verificare se tali dati erano concordi o se i valori della modellistica fornivano una tutela largamente protettiva nei confronti dell’ambiente, in sede di registrazione.
Recently, several regulations have been published, among which we find Decision 2015/495 which contains a list of contaminants with emerging problems. Among these we find Triallate, an herbicide on which this project was based. In this paper, the results of a three-year study on two metabolites of Triallate (DIPA and TCPSA) were compared with the data emerging from models (FOCUS-Pearl ). At the end we check if these data were in agreement or if the values ​​of the modeling provided a largely protective protection towards the environment.

non disponibile
For several years proteomics research has been expected to lead to the finding of new markers that will translate into clinical tests applicable to samples such as serum, plasma and urine: so-called in vitro diagnostics (IVDs). Attempts to implement technologies applied in proteomics as 2DE, Immuno Blotting, Mass Spectrometry have initiated constructive discussions on opportunities and challenges inherent in such a translation process also with respect to the use of multi-marker profiling approaches and pattern signatures in IVD. It is mandatory to fulfil requirements in routine IVD, including disease prevention, diagnosis, prognosis, and treatment monitoring or follow up among others. To fulfill IVD requirements, it is essential to provide diagnostic tests that allow for definite and reliable diagnosis tied to a decision on interventions (prevention, treatment, or non treatment), meet stringent performance characteristics for each analyte (in particular test accuracy, including both precision of the measurement and trueness of the measurement), and provide adequate diagnostic accuracy, i.e., diagnostic sensitivity and diagnostic specificity, determined by the desired positive and negative predictive values which depend on disease frequency. The fulfilment of essential IVD requirements is mandatory in the regulated environment of modern diagnostics. Addressing IVD needs at an early stage can support a timely and effective transition of findings and developments into routine diagnosis. IVD needs reflect features that are useful in clinical practice. This helps to generate acceptance and assists the implementation process. The medical need for relevant biomarkers is enormous. This is particularly true for the many types of cancer, but other diseases such as Type 1 diabetes (DMT1) also lack useful and adequate diagnostic markers with high specificity and sensitivity. Despite advances in imaging technologies for early detection of diseases, proteomic and peptidomic multiplex techniques and metabolomics statistical analysis have evolved in recent years.

U doktorskoj disertaciji je rađena analiza produkcije i procena stabilnosti sekundarnih metabolita cijanobakterija. U analizi pigmenata cijanobakterija kao biomarkera u paleoklimatskoj rekonstrukciji poslužio je nov model analize-AMMI model, koji pruža značajan doprinos odabiru odgovarajućih biomarkera u paleoklimatiskoj rekonstrukciji. Analizom produkcije MOSA i MOMA 15 vodenih i zemljišnih cijanobakterija NSCCC sposobnost produkcije MOSA je uočena kod 8, a MOMA kod svih sojeva. Kultivacija u različitim pH vrednostima podloge i različitim temperaturnim uslovima nije pokazala znatan uticaj na produkciju MOSA. Produkcija MOMA je bila izraženija u baznoj sredini (pH 9.0) i na višim temperaturama (30-35 °C). UV svetlost se pokazala kao najznačajniji faktor i inicirala je najveću produkciju MOSA i MOMA kod svih sojeva. Veća koncentracija azota u podlozi nije uticala na povećanje produkcije MOSA kod većine analiziranih sojeva, dok je znatno uticala na povećanje produkcije MOMA kod svih analiziranih sojeva.Analizom produkcije pigmenata 19 lesnih cijanobakterija NSCCC prisustvo fikobilina i MOSA je uočeno u svim analiziranim kulturama, dok sposobnost produkcije MOMA nije uočena u dve kulture lesnih cijanobakterija NSCCC. Tokom posmatranog vremenskog perioda uočena je razgradnja ukupnih fikobilina u kontrolnim uslovima rasta, dok za isti vremenski period nije došlo do degradacije MOSA i MOMA u kontrolnim uslovima.Procenom stabilnosti MOSA i MOMA delovanjem abiotičkih faktora (različitih pH i temperaturnih vrednosti podloge, različitog vremena izlaganja UV svetlosti) utvrđeno je da su MOSA i MOMA pokazali izraženu stabilnost na testirane abiotičke faktore. Procenom stabilnosti pigmenata nakon delovanja biotičkih faktora primetna je intenzivnija razgradnja ukupnih fikobilina posmatrano u zavisnosti od vremena, do postizanja potpune degradacije u pojednim kulturama lesnih cijanobakterija, dok je uočeno da su MOSA i MOMA pokazali stabilnu strukturu i u testu biodegradabilnosti nije došlo do njihove degradacije.Analizom prisustva MOSA i MOMA u lesnom sedimentu i biološkim lesnim pokoricama njihovo prisustvo je uočeno u svim analiziranim uzorcima. Takođe, korišćenjem LC-MS(/MS) metode utvrđeno je prisustvo scitonemina u 10 terestričnih kultura NSCCC.Analizom toksičnosti i produkcije mikrocistina, cilindrospermopsina i saksitoksina lesnih cijanobakterija NSCCC dobijeni su negativni rezultati. Razvojem novih metoda za detekciju cijanotoksina u terestričnim ekosistemima potrebno je proveriti dobijene rezultate. Procenom stabilnosti mikrocistina referentnog soja Microcystis aeruginosa PCC 7806, uočena je njegova izrazita stabilnost tokom vremenskog perioda od 96 h u kontrolnim uslovima i delovanjem tri bakterijska soja.Shodno dobijenim rezultatima, UV zaštitni pigmenti su mnogo podesniji za paleoklimatsku rekonstrukciju od fikobilina s obzirom da molekuli MOSA i MOMA imaju postojaniju strukturu i da nisu degradirani tokom posmatranih stresnih uslova. Usled nemogućnosti detekcije cijanotoksina lesnih cijanobakterija, i pored izražene stabilnosti mikrocistina referentnog soja, cijanotoksini se ne mogu smatrati biomarkerima cijanobakterija u geološkim istraživanjima.Postavljanje BLOCDUST teorije i otkriće stabilnosti MOSA i MOMA i njihove upotrebe kao pouzdanih biomarkera u paleoklimatskoj rekonstrukciji predstavlja osnovu za mnoga buduća istraživanja od neprocenjivog naučnog značaja, pogotovo u paleoklimatskoj rekonstrukciji lesa. Predloženi scenario se može smatrati osnovom u paleoklimatskoj rekonstrukciji.
This PhD thesis analyzed the production and stability of cyanobacterial secondary metabolites. The results describe the effects of pH, temperature and light source combined with the effects of medium nitrogen content on the production of the MOSA and MOMA compounds of aquatic and soil cyanobacterial strains through AMMI model. The application of the AMMI model represents a significant contribution to the selection of appropriate biomarkers in the paleoclimatic reconstructions because it reveals the increased production of certain secondary metabolites in certain environmental conditions. MOSA compounds were observed in 8 out of 15 soil and aquatic cyanobacterial strains, while MOMA compounds were found in all 15 strains. Results show that exposure to UV light induced a higher synthesis of both pigments. The production of the MOSA compounds was clearly increased by UV irradiation and other treatments did not show a significant impact on its production. The production of MOMA compounds was increased by several stress factors including pH (pH 9.0), temperature (30-35 °C), nitrogen content and UV irradiation. A higher concentration of nitrogen in the medium did not influence the increase in the production of MOSA compounds in most of the analyzed strains, while it significantly influenced the increase in the production of MOMA in all analyzed strains.By analyzing the production of pigments in 19 loess cultures, phycobilins and MOSA were present in all examined loess isolates, while presence of MOMA was not detected in two samples from China. In control conditions, it was observed degradation of phycobilins depending on time, but MOSA and MOMA showed a stable structure.Stability assessment of the MOSA and MOMA by the treatment with abiotic factors (different pH and temperature values of the medium, different time of exposure to UV light) revealed their pronounced stability on tested abiotic factors. Considering unstable structure of phycobilins in the presence of bacterial strains, phycobilins cannot be considered as biomarkers in loess studies. Detected results indicate that MOSA and MOMA have stable core structures resistant to bacterial strains, which makes them potentially good biomarkers for paleoclimatic reconstruction.Moreover, the presence of MOSA and MOMA compounds was confirmed in loess sediment samples and BLC. Also, the LC-MS(/MS) method revealed the presence of scytonemin in 10 terrestrial cyanobacterial cultures.Testing of the toxicity of loess cyanobacterial cultures and their ability to produce microcystins, cylindrospermopsin and saxitoxins, negative results were obtained. The development of new methods for detection of cyanotoxins in terrestrial ecosystems is necessary in order to revise obtained results. By assessing the stability of microcystins of the reference strain of Microcystis aeruginosa PCC 7806, its pronounced stability was observed over a 96 h in control conditions and in the presence of three bacterial strains.Due to MOSA and MOMA narrow environment and organism specificity, as well as its structural stability, these metabolites are designated with a strong potential to be used as a cyanobacterial biomarker in paleoclimatic research. Due to the inability to detect cyanotoxins in loess cyanobacteria, despite the pronounced stability of the microcystin of the reference strain, cyanotoxins cannot be considered as adequate biomarkers of cyanobacteria in geological research.The production of the MOSA and MOMA compounds across examined stress conditions, and further, their presence in loess samples and BLCs indicate the potential of these compounds to be regarded as biomarkers in paleoclimatic research of lacustrine/marine and loess sediments. Setting up the BLOCDUST theory and determining stability of MOSA and MOMA compounds and their aplication as a convinient biomarkers of cyanobacteria in paleoclimatic reconstruction provides the foundation for many future research of invaluable scientific significance, especially in the paleoclimatic reconstruction of loess. The proposed scenario can be considered as one of the basic model for paleoclimatic reconstruction.

Le aflatossine sono potenti sostanze cancerogene presenti in natura. L'aflatossina b1 viene poco degradata nel rumine ed è escreta nel latte come aflatossina M1 con un carry over del 1-3%. Nel presente lavoro è stata studiata l'apparizione delle aflatossine nel sangue conseguente all'ingestione orale di un bolo contaminato per verificare come queste tossine sono assorbite nel tratto digestivo delle vacche da latte. La comparsa nel plasma e nel latte attraverso una mucosa tipicamente non di assorbimento per determinare il possibile meccanismo che regola l'assorbimento delle aflatossine è stato un ulteriore oggetto di studio. Un'altra prova è stata effettuata con vacche da latte per studiare il carry-over dell'aflatossina B1 nel latte in relazione al livello produttivo e alle cellule somatiche, come indicatore di processi infiammatori nella mammella. La capacità sequestrante di diversi tipi di adsorbenti è stata comparata in prove in vitro condotte in differenti condizioni sperimentali. Anche il comportamento del complesso aflattosina-adsorbente nel tratto digestivo di vacche in lattazione è stato studiato in vivo per mezzo della misurazione della presenza di aflatossina M1 nel latte. Una prova in vivo è stata effettuata per verificare l'effetto che la pellettatura o la semplice miscelazione di adsorbenti nei mangimi può avere nel migliorare l'efficienza di sequestro.
Aflatoxins are the most potent natural carcinogenic compound present in nature. Aflatoxin B1 is poorly degraded in the rumen and is excreted in milk as aflatoxin M1 with a carry-over rate of 1-3%. The present work investigated rate and schedule of aflatoxins plasma appearance following an oral contaminated bolus to verify how these toxins are absorbed in the gastro-intestinal tract of dairy cows. Aflatoxins plasma and milk appearances were also investigated using a non-absorbing mucosa to understand the possible aflatoxins absorption mechanism through mucous membranes. A trial was carried out in lactating dairy cows to study the carry over of ingested aflatoxin B1 in milk as aflatoxin M1 in relation to milk yield and somatic cells count, the latter as indicator of udder inflammatory processes. sequestering capacity of different kinds of mycotoxins sequestering agents were compared in vitro trial carried out at different experimental conditions. The behaviour of the aflatoxins-adsorbents complexes through digestive tract of lactating dairy cows were also investigated in vivo by measuring appearance of aflatoxin M1 into milk. An in vivo trial was conducted to verify if effect of pelletizing or simply mixing processes is useful to improve mycotoxins sequestering agents efficacy in dairy cow nutrition.

Le aflatossine sono potenti sostanze cancerogene presenti in natura. L'aflatossina b1 viene poco degradata nel rumine ed è escreta nel latte come aflatossina M1 con un carry over del 1-3%. Nel presente lavoro è stata studiata l'apparizione delle aflatossine nel sangue conseguente all'ingestione orale di un bolo contaminato per verificare come queste tossine sono assorbite nel tratto digestivo delle vacche da latte. La comparsa nel plasma e nel latte attraverso una mucosa tipicamente non di assorbimento per determinare il possibile meccanismo che regola l'assorbimento delle aflatossine è stato un ulteriore oggetto di studio. Un'altra prova è stata effettuata con vacche da latte per studiare il carry-over dell'aflatossina B1 nel latte in relazione al livello produttivo e alle cellule somatiche, come indicatore di processi infiammatori nella mammella. La capacità sequestrante di diversi tipi di adsorbenti è stata comparata in prove in vitro condotte in differenti condizioni sperimentali. Anche il comportamento del complesso aflattosina-adsorbente nel tratto digestivo di vacche in lattazione è stato studiato in vivo per mezzo della misurazione della presenza di aflatossina M1 nel latte. Una prova in vivo è stata effettuata per verificare l'effetto che la pellettatura o la semplice miscelazione di adsorbenti nei mangimi può avere nel migliorare l'efficienza di sequestro.
Aflatoxins are the most potent natural carcinogenic compound present in nature. Aflatoxin B1 is poorly degraded in the rumen and is excreted in milk as aflatoxin M1 with a carry-over rate of 1-3%. The present work investigated rate and schedule of aflatoxins plasma appearance following an oral contaminated bolus to verify how these toxins are absorbed in the gastro-intestinal tract of dairy cows. Aflatoxins plasma and milk appearances were also investigated using a non-absorbing mucosa to understand the possible aflatoxins absorption mechanism through mucous membranes. A trial was carried out in lactating dairy cows to study the carry over of ingested aflatoxin B1 in milk as aflatoxin M1 in relation to milk yield and somatic cells count, the latter as indicator of udder inflammatory processes. sequestering capacity of different kinds of mycotoxins sequestering agents were compared in vitro trial carried out at different experimental conditions. The behaviour of the aflatoxins-adsorbents complexes through digestive tract of lactating dairy cows were also investigated in vivo by measuring appearance of aflatoxin M1 into milk. An in vivo trial was conducted to verify if effect of pelletizing or simply mixing processes is useful to improve mycotoxins sequestering agents efficacy in dairy cow nutrition.

La dialisi extracorporea, o emodialisi, è il metodo per ripulire il sangue meccanicamente mediante circolazione extracorporea, in modo da rimuovere sostanze che normalmente sarebbero eliminate dai reni e viene praticata quando la funzionalità renale di un individuo è in parte o totalmente compromessa. Durante una singola seduta di terapia dialitica il paziente può essere esposto a una quantità d'acqua che varia tra i 100 e i 120 litri. L’attività di tesi si inserisce nel contesto della cosiddetta “emodialisi sostenibile”, che ha tra gli obiettivi principali la riduzione del consumo idrico. Un metodo efficace in tal senso potrebbe essere rappresentato da sistemi di rigenerazione online dell’effluente che permetterebbero il ricircolo del liquido di dialisi. Alla base dello sviluppo di un sistema di questo tipo vi è l’analisi e la caratterizzazione del liquido di dialisi in termini di elettroliti e di tutte le altre specie in esso presenti (tossine uremiche, proteine ecc.). Obiettivo di questa tesi è l’analisi sperimentale della composizione del liquido di dialisi pre e post filtro tramite una tecnica avanzata di indagine quale la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR). La spettroscopia NMR è un metodo basato sulle proprietà magnetiche dei nuclei di alcuni atomi/isotopi, il cui scopo è quello di ricavare informazioni sulla frequenza di risonanza dei nuclei attivi (come H e 13C) in risposta a un determinato campo magnetico. Esaminando gli spettri NMR dei dialisati è stato possibile caratterizzare qualitativamente le piccole molecole (zuccheri, amminoacidi, osmoliti, acidi organici ecc.) presenti nei diversi campioni. Inoltre dall’osservazione dei dati si possono apprezzare importanti differenze tra pazienti dializzati affetti da patologia diabetica rispetto a pazienti dializzati non diabetici. La spettroscopia NMR è risultata essere un metodo efficace per lo studio dei campioni di fluido, in quanto richiede una preparazione strumentale semplice e veloce.

Agli ellagitannini (ET), tannini condensati tipici di molti tipi di frutta, tra cui frutti rossi e melograno, sono attribuite svariate attività biologiche positive per la salute umana ancora poco sostanziate da chiare evidenze scientifiche. La chiave per comprendere questa variabilità potrebbe risiedere nella biotrasformazione che gli ET subiscono dopo l’ingestione: nell’intestino vengono trasformati nei metaboliti derivati, le urolitine. In relazione alla tipologia di urolitine prodotte dall’uomo sono stati individuati tre fenotipi metabolici: metabotipo A, tipico di soggetti che producono in prevalenza urolitina A; metabotipo B, di soggetti che producono anche isourolitina A ed urolitina B; metabotipo 0, di coloro che non producono urolitine. Nel presente elaborato, che si inserisce nel più ampio progetto di ricerca NIKE, sono stati testati gli effetti putativi dei metabotipi in colture primarie di macrofagi, una tipologia cellulare plastica e ubiquitaria che riveste un ruolo centrale nella risposta immunitaria. I macrofagi sono stati attivati in senso classico (M1) o alternativo (M2) e supplementati per sei giorni con due diverse combinazioni di urolitine, per ricalcare i metabotipi A e B, in concentrazioni coerenti con quelle plasmatiche date dal consumo di alimenti ricchi in ET. Parallelamente sono stati coltivati anche macrofagi non attivati come controllo. Al termine del trattamento, si è proceduto all’analisi del profilo di espressione genica con tecnologia microarray a genoma intero per indagare le basi molecolari del supposto effetto antinfiammatorio dei metaboliti testati. Il trascrittoma dei macrofagi è risultato essere influenzato in maniera differente dai due metabotipi: il trascrittoma degli M1 è stato minimamente influenzato dalla supplementazione, mentre negli M2 il metabotipo A ha indotto cambiamenti significativi in un considerevole numero di trascritti, mostrando un miglioramento delle proprietà antinfiammatorie macrofagiche.

La globalizzazione del mercato agroalimentare ha determinato una crescente attenzione da parte dei consumatori verso i prodotti alimentari, non solo in termini di qualità e di sicurezza, ma anche di origine geografica. Infatti, il territorio d’origine ha un forte impatto sull’alimento, dovuto alle condizioni pedoclimatiche che ne determinano le caratteristiche. Poiché non esistono dei metodi analitici di routine per l’autenticazione della provenienza geografica, lo scopo del progetto di ricerca è quello di determinare l’origine geografica e l’autenticità degli alimenti mediante profiling dei composti fenolici e steroli, grazie all’applicazione di tecnologie omiche, tecniche statistiche e chemometriche. La componente fenolica e/o steroli dei campioni, viene analizzata tramite cromatografia liquida (UHPLC) accoppiata ad uno spettrometro di massa (Q-TOF-MS). I dati così ottenuti, vengono elaborati mediante statistica multivariata. L’applicazione combinata di avanzate tecnologie omiche e tecniche statistiche chemometriche ha portato come risultato l’effettiva identificazione della provenienza geografica e autenticità di numerose matrici alimentari. I dati ottenuti dimostrano che i metaboliti secondari possiedono proprietà discriminanti. L’approccio di metabolomica UHPLC/Q-TOF-MS combinato a una statistica multivariata risulta essere adeguato per identificare potenziali markers. Il lavoro attuale è focalizzato sulla ricerca di nuovi metaboliti che, insieme a fenoli e steroli possano confermare la potenza di questo approccio.
Nowadays, food traceability is a growing consumer interest worldwide. Food traceability could be considered a fundamental tool for ensuring safety and high quality of food. Food quality is based not only on the safety and integrity of food, but also on the authenticity, the genuineness of the raw material and the geographical origin. The aim of the work was to investigate the potential of untargeted metabolomics to ensure the authenticity and traceability of foods. Secondary metabolites, like polyphenols and sterols, could be conveniently used to meet this goal due to their chemical diversity and their responses to environmental stimuli. Samples were analyzed through UHPLC-ESI/QTOF-MS. The obtained data were subjected to multivariate statistical analysis. The obtained results showed that secondary metabolites can be efficiently used for authenticity and traceability purposes, with regards to cultivars and geographical origin. These information confirm the role of environmental factors in shaping the actual profile of secondary metabolites in plant foods. The markers found could be used for a target quantification method, a less expensive and less sophisticated analysis, in order to provide an efficient tool that could help to guarantee food quality on routine basis.

La globalizzazione del mercato agroalimentare ha determinato una crescente attenzione da parte dei consumatori verso i prodotti alimentari, non solo in termini di qualità e di sicurezza, ma anche di origine geografica. Infatti, il territorio d’origine ha un forte impatto sull’alimento, dovuto alle condizioni pedoclimatiche che ne determinano le caratteristiche. Poiché non esistono dei metodi analitici di routine per l’autenticazione della provenienza geografica, lo scopo del progetto di ricerca è quello di determinare l’origine geografica e l’autenticità degli alimenti mediante profiling dei composti fenolici e steroli, grazie all’applicazione di tecnologie omiche, tecniche statistiche e chemometriche. La componente fenolica e/o steroli dei campioni, viene analizzata tramite cromatografia liquida (UHPLC) accoppiata ad uno spettrometro di massa (Q-TOF-MS). I dati così ottenuti, vengono elaborati mediante statistica multivariata. L’applicazione combinata di avanzate tecnologie omiche e tecniche statistiche chemometriche ha portato come risultato l’effettiva identificazione della provenienza geografica e autenticità di numerose matrici alimentari. I dati ottenuti dimostrano che i metaboliti secondari possiedono proprietà discriminanti. L’approccio di metabolomica UHPLC/Q-TOF-MS combinato a una statistica multivariata risulta essere adeguato per identificare potenziali markers. Il lavoro attuale è focalizzato sulla ricerca di nuovi metaboliti che, insieme a fenoli e steroli possano confermare la potenza di questo approccio.
Nowadays, food traceability is a growing consumer interest worldwide. Food traceability could be considered a fundamental tool for ensuring safety and high quality of food. Food quality is based not only on the safety and integrity of food, but also on the authenticity, the genuineness of the raw material and the geographical origin. The aim of the work was to investigate the potential of untargeted metabolomics to ensure the authenticity and traceability of foods. Secondary metabolites, like polyphenols and sterols, could be conveniently used to meet this goal due to their chemical diversity and their responses to environmental stimuli. Samples were analyzed through UHPLC-ESI/QTOF-MS. The obtained data were subjected to multivariate statistical analysis. The obtained results showed that secondary metabolites can be efficiently used for authenticity and traceability purposes, with regards to cultivars and geographical origin. These information confirm the role of environmental factors in shaping the actual profile of secondary metabolites in plant foods. The markers found could be used for a target quantification method, a less expensive and less sophisticated analysis, in order to provide an efficient tool that could help to guarantee food quality on routine basis.

Gli estratti ottenuti da piante medicinali sono costituiti per lo più da miscele complesse di composti attivi chimicamente differenti, anche conosciuti come metaboliti secondari. L’attività biologica dei prodotti naturali non è da attribuire a un singolo composto, ma piuttosto alla moltitudine di molecole che agiscono in sinergia tra loro. Per questa ragione la determinazione di tutti i costituenti attivi rappresenta un punto cruciale per assicurare l’efficacia, attendibilità e sicurezza nell’uso dei prodotti medicinali a base di piante. Ancora oggi, il controllo di qualità ed autenticità delle materie prime vegetali è ostacolato dalla mancanza di metodi analitici validati e dalla limitata disponibilità di standard di riferimento. I metodi di analisi per gli estratti vegetali e per i prodotti nutraceutici devono essere costantemente messi a punto ed aggiornati, dal momento che sempre nuove combinazioni di sostanze vengono impiegate in nuove formulazioni. Questo progetto di Dottorato di ricerca si è basato sullo sviluppo e successiva applicazione di metodi innovativi per l’analisi di metaboliti secondari di origine vegetale. Particolare attenzione è stata rivolta all’analisi di piante di interesse farmaceutico (Cannabis sativa L., and Spathodea campanulata P. Beauv.) e nutraceutico (Morus alba L., Aloysia polystachya Griseb. et Moldenke). Oggetto di questa dissertazione sono anche i diversi saggi in-vitro, messi a punto per valutare l’attività biologica degli estratti in analisi. Nel primo Capitolo, è stata applicata la spettroscopia NMR per la determinazione dei principali cannabinoidi non psicoattivi presenti nelle infiorescenze femminili di Cannabis da fibra. Il metodo analitico è stato sviluppato e validato in conformità alle linee guida internazionali. Questa tecnica trova applicazione nel monitoraggio del materiale vegetale di partenza, per garantire una migliore riproducibilità nei test biologici e per assicurare efficacia e sicurezza nell’uso di prodotti farmaceutici derivati. Come proseguimento del lavoro, metodi separativi e non separativi per l’analisi dei cannabinoidi sono stati discussi e messi a confronto per comprenderne potenzialità e svantaggi. Alcune varietà di C. Sativa sono state selezionate per la preparazione di estratti ricchi in cannabinoidi non psicoattivi, di cui è stata valutata l’attività antiproliferativa su modelli cellulari. Nel secondo Capitolo, è presentato uno studio di caratterizzazione della composizione chimica di varietà di gelso Italiane, quali fonti di principi attivi nel contesto di nuovi approcci terapeutici per il diabete mellito. Questo studio, primo nel suo genere, prevede di selezionare le cultivar più idonee alla produzione di estratti standardizzati a base di attivi ipoglicemizzanti. Le proprietà antiglicative e antidiabetiche di estratti di foglie di gelso sono state testate e diverse strategie per ritardare il rilascio dei componenti attivi sono state sviluppate al fine di potenziarne le capacità terapeutiche. Nel terzo Capitolo è stata analizzata la composizione chimica di S. campanulata, mediante HPLC-ESI-MS2. L’obiettivo principale è stato quello di individuare i composti responsabili della documentata inibizione di H. pylori e fare luce sui meccanismi alla base dell’attività biologica. Nel quarto Capitolo è stata indagata la composizione fenolica di A. polystachya, mediante tre differenti tecniche MS accoppiate all’HPLC. Il metodo di analisi è stato sviluppato e validato per l’identificazione dei principali metaboliti, e alcuni di essi sono stati identificati per la prima volta in questa pianta.
Plant extracts mainly consist in complex mixtures of chemically different bioactive compounds also known as secondary metabolites. In most cases, the bioactivity of natural products is not ascribable to a single compound, but rather to a multitude of them acting in a synergistic way. In this view, the complete definition of all the phytochemical constituents represents a key point to ensure the efficacy, reliability, and safety in the use of herbal medicines. Even today, the quality and authenticity assessment of herbal raw materials is frequently impaired by the lack of validated analytical methods and by the limited availability of certified references. Techniques for the analysis of herbal extracts and nutraceuticals need to be developed and upgraded continuously since different combinations of ingredients are employed in new formulations. In view of the above, the current PhD project was focused on the development and application of innovative analytical methods for the analysis of plant bioactive secondary metabolites. Particular attention was paid to plants of pharmaceutical (Cannabis sativa L., and Spathodea campanulata P. Beauv.) and nutraceutical interest (Morus alba L., Aloysia polystachya Griseb. et Moldenke). Different in-vitro assays for the bioactivity evaluation of these plants’ extracts were also the object of this PhD Thesis. In Chapter 1, the NMR technique was applied for the determination of the main non-psychoactive cannabinoids in fiber-type Cannabis female inflorescences. The analytical method was developed and fully validated to show compliance with international requirements. This technique finds application in the monitoring of the plant material, to guarantee a better reproducibility for biological assays, and to ensure the efficacy and safety of Cannabis-derived products. As a continuation of this project, the potentialities and drawbacks of separation and non-separation methods for the analysis of cannabinoids were considered and compared. Finally, C. sativa non-psychoactive varieties were selected for the preparation of cannabinoids rich extracts to evaluate their antiproliferative activity, by using cellular models. In Chapter 2 the chemical composition of Italian mulberry was investigated, as a source of phytochemicals in the context of new therapeutic approaches for diabetes mellitus. The first aim was to assess the quality of the plant material in comparison to Far Eastern Asia cultivations, where mulberry has been considered as a medicine for the treatment of diabetes for decades. The antiglycative capacity and hypoglycaemic effect of leaf extracts were evaluated on different in vitro models, to understand the potentialities of mulberry for the therapy of hyperglycaemia. Finally, the development of novel strategies for delaying the release of mulberry active constituents and enhancing therapeutic results will be discussed and are intended as the conclusion of this research project. In Chapter 3 the chemical composition of S. campanulata was investigated by HPLC-ESI-MS2, to clarify which are the most active components responsible for the inhibition of H. pylori growth. The aim was also to disclose the mechanisms underlying the biological activity. In Chapter 4 the phenolic composition of A. polystachya was investigated by means of three different MS techniques coupled to HPLC. The analytical method was developed and validated for the identification of metabolites and some phenylpropanoids were detected in this plant for the first time.

I PCB sono prodotti industriali, ormai banditi dalla Convenzione di Stoccolma (Maggio 2001), che per le loro doti di stabilità chimica e fisica sono stati ampiamente utilizzati come fluidi dielettrici nei trasformatori e nei condensatori elettrici, oltre che come fluidi idraulici, veicolanti o diluenti sinergici dei pesticidi, plastificanti, ritardanti di fiamma, fungicidi, componenti di vernici. In conseguenza di un così vasto impiego, di un frequente improprio smaltimento, e della loro elevata persistenza ambientale, i PCB sono ormai contaminanti ambientali ubiquitari. Una volta immessi nell’ambiente, i PCB si legano essenzialmente alla frazione organica di suolo e sedimenti. Negli ambienti terrestri tendono quindi ad essere immobilizzati nel terreno, mentre negli ambienti acquatici hanno maggior mobilità, perché sono trasportati dalle correnti marine ed adsorbiti al particolato sospeso. All’interno della catena alimentare manifestano caratteristiche di bioaccumulo e biomagnificazione. In conseguenza di queste loro caratteristiche la principale via espositiva a tali inquinanti per l’uomo è quella alimentare e un importante contributo all’assunzione attraverso la dieta è rappresentato dal consumo di prodotto ittico. Sulla base dei dati sperimentali ottenuti per l’animale e delle proprietà chimico-fisiche dei PCB, è ragionevole attendersi che questi composti, lipofili, si accumulino preferibilmente nei tessuti grassi. Una volta nell’organismo possono essere metabolizzati in sostanze altrettanto dannose. Tra queste rivestono una particolare importanza i metaboliti ossidrilati (PCB-OH), che si formano attraverso la via del citocromo P450 mediante ossidazione. Per le loro caratteristiche chimico-fisiche in parte vengono escreti attraverso le feci e/o l’urina e in parte sono trattenuti nel corpo per l’elevata lipofilicità. I PCB ossidrilati sono stati caratterizzati nel siero umano e nel biota negli utimi cinque/dieci anni, e la loro azione si e’ dimostrata essere ad esempio, quella di alterare la fosforilazione ossidativa mitocondriale, avere azione simil-ormonale sia estrogenica e/o antiestrogenica , e competere con la tiroxina (T4) per il suo legame alla transtiretina (TTR), proteina trasportatrice che normalmente, in assenza di composti tossici, lega l’ormone tiroideo (T4). Alcuni PCB-OH hanno infatti un’affinita’ di legame dieci volte superiore alla tiroxina T4 per la transtiretina. A causa delle difficoltà presentate dalle modalità di analisi, i dati relativi ai livelli di tali inquinanti nel pesce disponibili in letteratura sono scarsi. La necessità di raccogliere maggiori informazioni a riguardo è invece resa necessaria dal fatto che il consumo di pesce rappresenta una delle principali vie di esposizione per l’uomo. In tale contesto si è messo a punto e si è validato un metodo analitico ad elevata specificità, sensibilità, poco costoso e rapido, per la determinazione della concentrazione di PCB-OH in prodotti ittici di interesse alimentare e una volta validato il metodo analitico si sono determinate le concentrazioni di questi inquinanti nel siero delle specie ittiche. Si è infine stimata, sia pur con evidenti approssimazioni, quale potesse essere l’esposizione alimentare a PCB-OH derivante dal consumo delle specie ittiche alimentari per le quali erano disponibili dati di contaminazione, al fine di verificare se la concentrazione ad essa associata fosse in un range di concentrazioni associabili ad un effetto tossicologico.

Grape, wine and oenology by-products are rich in polyphenols and in particular flavonoids: flavonols, anthocyanins, flavanols and proanthocyanidins. Those molecules are plants secondary metabolites and may also contribute to the bitterness and astringency of grapes and wines. In recent years, epidemiological studies have revealed the great potential of polyphenols and flavonoids in human diet on protection against cancers, infections, their role in anti-aging and also against the development of several chronic diseases such as cardiovascular diseases (CVDs) or diabetes. Their role for human health is attributed mainly to their antioxidant, anti-inflammatory, antimicrobial activities. Therefore these bio-compounds could find promising applications in pharmaceutical, nutraceutical and food industries as active ingredients in supplements with antioxidant activity, value-added ingredients in fortified foods or as natural dyes and preservatives. The aim of this research is to investigate the contents of chemical metabolites in several unique Vitis vinifera varieties and hybrids, and to examine their potential for oenological, nutraceutical and industrial applications. Modern spectrophotometry, chromatography and mass spectrometry (MALDI/MS, LC/MS, GC/MS) analytical techniques were applied in order to achieve the aims of the research. Nine Vitis vinifera italian native grape varieties from Friuli Venezia Giulia and Veneto regions, were investigated for their enological potential, by studying the main classes of polyphenols and aroma compounds of grapes and their organoleptic wine characteristics. In addition 32 hybrid varieties (21 red, 11 white) that belong to the CRA-VIT Grapevine Germplasm Collection located in Conegliano (TV) were studied to evaluate their nutraceutical and industrial potential. The study of anthocyanins of red hybrids showed that some varieties (e.g. Seibel 8357) have rich content of pigments and are therefore attractive for the production of natural dyes that are used in the food and pharmaceutical industry. Moreover, some varieties (Bacò 1 and Seibel 10878) were also found interesting for their triglycerides content in grape seed oil with high linoleic acid content (up to 70%), which is essential fatty acid effective in reducing LDL cholesterol. The nutraceutical potential of hybrid varieties was investigated by studying grape seed proanthocyanidins. Oligomeric and polymeric proanthocyanidins with different degree of galloylation were determined in grape seed extracts suggesting potential application of the extracts as antioxidants in nutraceutical products and also as oenological tannins. Eventually, a new methodology was established for grape metabolome study based on High-Resolution Mass Spectrometry (HR-MS) analysis and the “suspect screening analysis” approach. This method was proved to be very effective due to the ability to identify hundreds of compounds in one single run and also individual classes of grape polyphenols
L’uva, il vino ed i sottoprodotti dell’industria enologica sono ricche fonti di polifenoli e flavonoidi, quali flavonoli, antociani, flavanoli e proantocianidine. Questi composti determinano le caratteristiche sensoriali delle uve e dei vini, come il colore, il sapore e l’astringenza. Numerosi studi epidemiologici hanno dimostrato che questi composti esercitano un’azione benefica sulla salute umana e proteggono dall’insorgere di patologie croniche e degenerative soprattutto a carico dell’apparato cardiovascolare, grazie alle loro proprietà antiossidanti, anticancro, antinfiammatorie ed antimicrobiche. Questi biocomponenti, una volta estratti dalle varie parti della pianta, possono trovare importanti applicazioni come principi attivi di supplementi farmaceutici con attività antiossidante, ingredienti a valore aggiunto in alimenti fortificati, coloranti e conservanti naturali per l’industria alimentare. Lo scopo della ricerca è quello di studiare, mediante le moderne tecniche analitiche di spettrofotometria, cromatografia e spettrometria di massa (MALDI/MS, LC/MS, GC/MS), i metaboliti nelle uve di alcune varietà di Vitis vinifera e di viti ibride ad oggi poco conosciute al fine di individuarne le potenzialità enologiche, nutraceutiche ed industriali. Sono state valutate le potenzialità enologiche di nove varietà di V. vinifera appartenenti a vitigni autoctoni del Friuli Venezia Giulia e del Veneto, attraverso lo studio delle principali classi di polifenoli e aromi delle uve e dei principali parametri chimici e profili organolettici dei vini. Inoltre, sono state studiate le uve di 32 varietà di viti ibride (21 rosse e 11 bianche) presenti nella collezione del Germoplasma viticolo del CRA-VIT al fine di valutarne le potenzialità per i loro impieghi industriali e nella nutraceutica. Lo studio degli antociani delle varietà ibride rosse ha evidenzato alcune varietà particolarmente ricche di pigmenti (es. il Seibel 8357) e quindi interessanti per la produzione di coloranti naturali che vengono impiegati in particolare nell’industria alimentare e farmaceutica. Lo studio dei trigliceridi dell’olio di vinaccioli delle uve ibride ha evidenziato che in generale queste varietà hanno un elevato contenuto di acido linoleico (superiore al 70%), un acido grasso essenziale avente la proprietà di diminuire i livelli di colesterolo LDL, ed alcune varietà particolarmente interessanti per la loro produttività (Bacò 1 e Seibel 10878). Le potenzialità nutraceutiche di queste varietà sono state investigate anche studiando le proantocianidine negli estratti di vinaccioli. Sono state determinate numerose proantocianidine oligomere e polimere aventi diversi gradi di galloilazione, utilizzabili, oltre che come preparati antiossidanti, anche come tannini enologici per la chiarifica di mosti e vini. Infine, è stato sviluppato un nuovo metodo per lo studio della metabolomica dell’uva mediante analisi di spettrometria di massa ad alta risoluzione (HR-MS) con un approccio di “suspect screening analysis”. Il metodo è risultato molto efficace, ed ha permesso l’identificazione di centinaia di metaboliti con una singola analisi, incluse diverse classi di polifenoli dell’uva

Metabolite essentiality is an important topic in systems biology and as such there has been increased focus on their prediction in metabolic networks. Specifically, two related questions have become the focus of this field: how do we decrease the amount of gene knock-out workloads and is it possible to predict essential metabolites in different growth conditions? Two different approaches to these questions: interaction-based method and constraints-based method, are conducted in this study to gain in depth understanding of metabolite essentiality in complex metabolic networks. In the interaction-based approach, the correlations between metabolite essentiality and the metabolite network topology are studied. With the idea of predicting essential metabolites, the topological properties of the metabolite network are studied for the Mycobacterium tuberculosis model. It is found that there is strong correlation between metabolite essentiality and the degree and the number of shortest paths through the metabolite. Welch’s two sample T-test is performed to help identify the statistical significance of the differences between groups of essential metabolites and non-essential metabolites. In the constraint-based approach, essential metabolites are identified in-silico. Flux Balance Analysis (known as FBA), is implemented with the most advanced in-silico model of Chlamydomonas Reinhardtii, which contains light usage information in 3 different growth environments: autotrophic, mixotrophic, and heterotrophic. Essential metabolites are predicted by metabolite knock out analysis, which is to set the flux of a certain metabolite to zero, and categorized into 3 types through Flux Sum Analysis. The basal flux-sum for metabolites is found to follow a exponential distribution, it is also found that essential metabolites tend to have larger basal flux-sum.

The tricarboxylic acid (TCA) cycle is one of the central pathways in respiration and also plays an important role in a variety of metabolic processes including the synthesis of secondary metabolites and the provision of carbon skeletons for ammonium assimilation and amino acid biosynthesis. Effective regulation of these multiple demands on the TCA cycle is likely to be very important for plant fitness. One way that this regulation could be achieved is through metabolite channelling. This occurs when metabolites are transferred between enzyme active sites without diffusing into the bulk aqueous phase of the cell, and is known to be important in regulating demands in metabolic pathways. Although there is evidence that metabolite channelling exists in animals, there have been no attempts to investigate it in plant. The first aim of this thesis was therefore to investigate whether metabolite channelling exists in the plant TCA cycle. Isotope dilution experiments were developed to investigate metabolite channelling, and were able to show that metabolite channelling was present between certain enzymes of the TCA cycle in both S. tuberosum and A. thaliana mitochondria. The second aim of the thesis was investigate whether metabolite channelling is important in regulating the TCA cycle in plant mitochondria. The pattern of metabolite channelling did not change in mitochondria isolated from the light and the dark, or from mitochondria with increased or decreased TCA cycle rates, but it was not possible to say whether the metabolite channelling altered in a quantitative fashion. Overall the thesis provides the first direct evidence of channelling in the TCA cycle in plants, and further work should help to elucidate what role, if any, it plays.

Background: The metabolic syndrome is associated with an increased risk of diabetes and vascular disease. In order to understand the pathophysiological processes underlying such risk, it is necessary to develop a better understanding of normal fat metabolism and abnormalities associated with the syndrome. The hypothesis tested in this thesis is that specific abnormalities in adipose tissue and muscle fat metabolism characterise the metabolic syndrome. Methods: Fasting biochemical parameters were measured in a cohort of overweight men with and without the metabolic syndrome. Stable-isotope labeling and arterio-venous difference measurements were conducted in 18 men to elucidate pathways of exogenous and endogenous fat metabolism under fasting and postprandial conditions in adipose tissue and skeletal muscle. In addition, a pilot study of the effects of heat and electrical stimulation on adipose tissue metabolism was undertaken. Results: Cohort study - The prevalence of the metabolic syndrome depended on the definition used. Total cholesterol and apoB were greater in those with the metabolic syndrome than in those without. There was no difference in fasting NEFAs. Metabolic investigation - There was significant postprandial uptake of NEFA from the circulating NEFA pool by adipose tissue. Chylomicrons were confirmed as the preferred substrate of LPL. There was preferential uptake of FAs derived from chylomicron hydrolysis. There was release of NEFA across muscle. In the metabolic syndrome, adipose tissue NEFA output is lower during fasting and falls less following a meal than in the healthy obese. Clearance of dietary-derived TG is lower across both adipose tissue and muscle in the metabolic syndrome. Pilot study – Heat increased measures of lipolysis whereas electrical stimulation had no effect. Conclusions: Fat metabolism in individuals with the metabolic syndrome is characterised by metabolic inflexibility but not insulin resistance.

Progesterone metabolites as allopregnanolone, isoallopregnanolone and tetrahydrodeoxy-corticosterone (THDOC) are increased in the luteal phase of the menstrual cycle, throughout pregnancy and during stress. Allopregnanolone and THDOC are neurosteroids with 3α-hydroxy, 5α-configurations and positive modulating effect on the GABAA receptor. They have similar properties and effect, and share the same binding sites on the GABAA receptor. Isoallopregnanolone has a 3β-hydroxy, 5α-configuration and a diverse effect as a proposed antagonist to both allopregnanolone and THDOC. Neurosteroids are thought to exert their effect predominantly at extrasynaptic GABAA receptors, containing for example α4- or α5-subunits. Such receptors are involved in the tonic response. Different subunits have diverse distribution pattern in the brain and are involved in different functions. The α5-subunit, mainly expressed in the hippocampus, is involved in learning, while α4 is more widespread and involved in e.g. anxiety and anaesthesia. The aim of the present thesis was to contribute to the knowledge about selected progesterone metabolites and their effects on learning and tolerance development, as well as their metabolism. Also basic characteristics between different α-subunits of the GABAA receptor were evaluated. The thesis shows that the effect of bicuculline and pentobarbital is not dependent on the α-subunit isoform of the GABAA receptor expressed in oocytes. Acute tolerance developed after allopregnanolone-induced anaesthesia with a decrease at both mRNA and protein levels of the GABAA receptor α4-subunit in the thalamus VPM nucleus. A negative correlation between the α4 mRNA and the increased dose of allopregnanolone needed to maintain the anaesthesia level was also shown. In addition, allopregnanolone induces a learning impairment in the Morris water maze test, when high concentrations of allopregnanolone are present in the brain. This impairment is not possible to reverse by isoallopregnanolone. In α5β3γ2L-transfected HEK-293 cells THDOC induces a baseline shift of its own and also potentiate the GABA-current. Neither of those THDOC effects can be inhibited by isoallopregnanolone. Instead isoallopregnanolone shows an agonistic effect on the THDOC-potentiation of the GABA-response. The main allopregnanolone metabolites identified, 5α-DHP and isoallopregnanolone, as well as allopregnanolone itself are mainly localized to the brain after an i.v. injection. After an isoallopregnanolone injection there is a more even distribution of the given steroid and the metabolites between plasma and brain. There is an epimerisation between isoallopregnanolone and allopregnanolone and vice versa. In conclusion, the present thesis shows that the α4-subunit in the thalamus VPM nucleus is likely to be involved in the acute tolerance development against allopregnanolone and that allopregnanolone-induced learning impairment is likely to be hippocampus dependent. The lack of antagonistic effect of isoallopregnanolone on the THDOC-induced α5β3γ2L-GABAA response, together with epimerisation of isoallopregnanolone to allopregnanolone, could explain why isoallopregnanolone does not work as an antagonist to the allopregnanolone-induced learning impairment in a hippocampus dependent learning task.

Chronic renal failure (CRF) is associated with loss of lean body mass, a high incidence of malnutrition, and with insulin resistance. CRF is often complicated by metabolic acidosis. Metabolic acidosis is known to alter both protein and carbohydrate metabolism. A series of studies have been undertaken to investigate the effect of metabolic acidosis on protein metabolism in both normal and CRF human subjects, and to study whether metabolic acidosis in CRF affects insulin sensitivity. Protein turnover was studied using the technique of primed constant infusions of L-[1-¹³C]leucine. Normal subjects were studied before and after ammonium chloride induced metabolic acidosis. Acidosis was associated with increased protein turnover and amino acid oxidation. In CRF subjects, correction of acidosis with sodium bicarbonate decreased protein turnover and amino acid oxidation. The effect of acidosis in CRF on insulin mediated carbohydrate metabolism was studied using the technique of the hyperinsulinaemic euglycaemic clamp. Insulin sensitivity increased with correction of acidosis. By combining L-[1-¹³C]leucine infusions with hyperinsulinaemic euglycaemic clamps, the response of protein metabolism to hyperinsulinaemia was measured before and after correction of acidosis. The presence of acidosis did not impair the ability of insulin to modulate protein metabolism. There is therefore, dissociation between the effects of acidosis in CRF on insulin mediated carbohydrate metabolism and insulin mediated protein metabolism. In summary, metabolic acidosis increases protein catabolism in both normal and CRF man and may contribute to the loss of lean body mass characteristic of CRF. Insulin resistance in CRF improves with correction of acidosis. However the effects of acidosis on protein metabolism are not mediated via alterations in insulin sensitivity.

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of the infectious disease Tuberculosis, is one of the most successful human pathogen. The disease remains a global health priority due to the spread of HIV and multidrug resistant strains. Therefore, there is a need to extend the understanding of the physiology and pathogenicity of M. tuberculosis in order to develop new therapies, antimicrobial drugs and vaccines. Mycobacterium possesses a unique cell envelope responsible for the reduced susceptibility to antibiotics and pathogenicity due to the high lipid content. It is composed by the plasma membrane, an unusual lipid-rich cell wall and an outermost layer known as the capsule. Moreover, other complex metabolites play a role in M. tuberculosis virulence such as inorganic polyphosphate, a polymer involved in stringent response and long term survival. In this study, a transposon mutant library was generated in order to identify new genetic determinants related to cell envelope; furthermore, specific mutants strains were generated to investigate the role of MmpL factors in mycolic acids transport, to test the role of a group of ABC-transporters in capsule biosynthesis and also to assess the function of exopolyphosphatases in survival under stress and nutrient limitation condition.

I prodotti di IV gamma sono le verdure e gli ortofrutticoli freschi che, dopo la raccolta, sono sottoposti a processi tecnologici di minima entità finalizzati a garantirne la sicurezza igienica e la valorizzazione, seguendo le buone pratiche di lavorazione. La bioprotezione può essere inclusa nelle strategie naturali per la protezione degli alimenti che possono garantire la sicurezza alimentare e prolungare la durata di conservazione di numerosi prodotti alimentari. La bioprotezione si basa sull'utilizzo di microrganismi benefici in grado di controllare la presenza di altri microrganismi mediante la produzione di metaboliti specifici.

An important group of inherited metabolic disorders in man produce abnormal excretion of organic acids in the urine. Diagnosis is usually based on identification of the abnormal metabolites, working back from there to characterise the defect at enzymatic level. The chirality of these metabolites may be significant in that the different enantiomers of a substance usually have different metabolic origins. Thus, knowledge of the chirality of a metabolite aids in the understanding of the mechanism of the disorder. The chirality of a number of urinary metabolites in inherited metabolic disease was examined using gas chromatography-mass spectrometry, most of the analyses being performed using single ion monitoring. This analytical method requires the use of chiral reference compounds of known configuration. Chiral lactic and glyceric acids are available commercially, but a range of chiral beta-hydroxy acids were prepared by the reduction of the corresponding beta-ketocarboxylic acid esters with fermenting baker's yeast. After hydrolysis of the esters, separation of the enantiomers is based on their reaction with a suitable chiral reagent to form a volatile mixture of the diastereoisomers which are resolved by gas-liquid chromatography using a capillary column with a non-chiral stationary phase. Information from the analysis of the chiral standards was used to assign the absolute configuration of the following urinary metabolites; lactic acid in an unusual case of lactic aciduria, glyceric acid in the glyceric acidurias, beta-hydroxybutyrate in ketonuria, beta-hydroxyvalerate in propionic acidaemia, 2-methyl beta-hydroxybutyrate in beta-ketothiolase deficiency and beta-hydroxyadipic acid in hydroxydicarboxylic aciduria. The biochemical significance of the chirality of each of these metabolites is discussed. The assigning of configuration to urinary beta-hydroxyvalerate in propionic acidaemia, 2-methyl beta-hydroxybutyrate in beta-ketothiolase deficiency and beta-hydroxyadipic acid in hydroxydicarboxylic aciduria represents original work and has helped to elucidate the metabolic origins of these compounds.

La presente tesi conduce alla realizzazione di un metodo analitico efficace prendendo lo spunto iniziale nel lavoro di ricerca svolto da Stephane Moularat, brevettato nel 2012, che ha messo a punto uno schema algoritmico a risposta binaria considerando 16 diversi metaboliti prodotti dalle muffe ed altri 4 composti di natura sesquiterpenica. La risposta positiva o negativa, dovuta alla presenza o meno dei composti indagati nell’aria dell’ambiente campionato, porta ad un risultato definito come Indice di Contaminazione Fungina (ICF). Tale risultato viene dunque tradotto nella presenza (ICF > 0) o assenza (ICF < 0) di muffa nell’ambiente sottoposto all’analisi.