Dissertations / Theses on the topic 'Metilazione DNA'

La regolazione dell’espressione genica è un processo molto complesso e finemente controllato da fattori multipli, tra i quali quelli epigenetici hanno richiamato l’attenzione nell’ultima decade. I meccanismi di regolazione epigenetica comprendono la metilazione del DNA a livello delle isole CpG nella regione del promotore del gene e le modifiche istoniche post-traduzionali, quali acetilazioni e metilazioni. Questa serie di elementi di regolazione concorre a determinare uno stato di impacchettamento della cromatina più o meno rilassato, che influenzerà la trascrizione di geni critici, per esempio nello sviluppo o nelle neoplasie. Gli ambiti nei quali lo studio del profilo epigenetico ha assunto maggiore rilievo sono effettivamente quello oncologico e quello del differenziamento di cellule staminali, due contesti nei quali si è svolto il mio programma di Dottorato, nel quale ho seguito in parallelo più progetti presentati nella tesi in modo indipendente. La ricerca in campo tumorale è centrata sull’indagine di nuovi marcatori e sull’individuazione di profili epigenetici specifici per un determinato tumore che possano aiutare la diagnostica precoce, la classificazione e la sorveglianza dell’evoluzione clinica della neoplasia. In questo contesto si inserisce il progetto finalizzato alla costruzione di quadri associativi di metilazione in due tumori cerebrali, il glioblastoma (GBM) e l’oligodendroglioma (ODG). La casistica di GBM e di ODG in dotazione è stata valutata dal punto di vista della metilazione dei promotori di geni (MGMT, EMP3,..) con funzioni oncosoppressive e trovati ipermetilati anche in altri tumori o localizzati in regioni citologicamente instabili, per poter correlare questi dati con la risposta terapeutica nel caso del GBM o con i dati di perdita di eterozigosità (LOH) 1p19q nel caso dell’ODG. Parallelamente all’individuazione di marcatori epigenetici in ambito oncologico, la ricerca si sta muovendo anche nell’indagine di nuove potenziali terapie farmacologiche antitumorali su base epigenetica. In questo contesto, con lo scopo di approfondire le relazioni tra i meccanismi alla base della regolazione epigenetica, ci si è riproposti di valutare la correlazione tra il meccanismo di metilazione/demetilazione del DNA e quello di acetilazione/deacetilazione istonica e la loro vicendevole influenza nel determinare silenziamento genico piuttosto che riattivazione dell’espressione di geni ipermetilati. Sono stati usati farmaci epigenetici demetilanti, quali Azacitidina e Decitabina, inibitori della istone deacetilasi, quali la Tricostatina A, e inibitori della via di sintesi di molecole, le poliammine, coinvolte nella regolazione dell’espressione genica con modalità ancora da precisare in modo definitivo. Sebbene i meccanismi di regolazione epigenetica vengano studiati per lo più nel cancro, a causa delle gravi conseguenze che una loro disregolazione porta in termini di silenziamento di geni oncosoppressori, essi sono implicati fisiologicamente anche nel differenziamento di cellule staminali. Gli ultimi due progetti trattati nella tesi si contestualizzano in questo ambito. In particolare viene presentata la messa a punto di una metodologia di immunoprecipitazione sequenziale della cromatina finalizzata all’individuazione di due modificazioni istoniche associate alla stessa regione di DNA. Le modifiche hanno riguardato i marcatori rappresenatativi di cromatina trascrizionalmente repressa H3K27me3 (trimetilazione della Lys27 dell’istone H3) e di cromatina trascrizionalmente attiva H3K24me2 (dimetilazione della Lys4 dell’istone H3) che definiscono i domini detti bivalenti, associati a geni che codificano per fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo in cellule embrionali staminali, mantenendoli pronti per un veloce indirizzamento verso l’ attivazione trascrizionale. Il ruolo che la regolazione epigenetica svolge durante il differenziamento di cellule staminali non è ancora noto con precisione. È chiaro però che la memoria della linea cellulare verso la quale si differenzia una cellula staminale adulta, implica l’utilizzo di modifiche epigenetiche, quali la metilazione del DNA e correlati pattern di metilazione e acetilazione istonica. L’ultimo progetto, trattato, è stato finalizzato a verificare il coinvolgimento dell’epigenetica e in particolare della metilazione dei promotori di fattori trascrizionali precocemente attivati durante il differenziamento verso il fenotipo muscolare cardiaco di cellule staminali umane derivate da tessuto adiposo (ADSCs).

La regolazione dell’espressione genica è un processo molto complesso e finemente controllato da fattori multipli, tra i quali quelli epigenetici hanno richiamato l’attenzione nell’ultima decade. I meccanismi di regolazione epigenetica comprendono la metilazione del DNA a livello delle isole CpG nella regione del promotore del gene e le modifiche istoniche post-traduzionali, quali acetilazioni e metilazioni. Questa serie di elementi di regolazione concorre a determinare uno stato di impacchettamento della cromatina più o meno rilassato, che influenzerà la trascrizione di geni critici, per esempio nello sviluppo o nelle neoplasie. Gli ambiti nei quali lo studio del profilo epigenetico ha assunto maggiore rilievo sono effettivamente quello oncologico e quello del differenziamento di cellule staminali, due contesti nei quali si è svolto il mio programma di Dottorato, nel quale ho seguito in parallelo più progetti presentati nella tesi in modo indipendente. La ricerca in campo tumorale è centrata sull’indagine di nuovi marcatori e sull’individuazione di profili epigenetici specifici per un determinato tumore che possano aiutare la diagnostica precoce, la classificazione e la sorveglianza dell’evoluzione clinica della neoplasia. In questo contesto si inserisce il progetto finalizzato alla costruzione di quadri associativi di metilazione in due tumori cerebrali, il glioblastoma (GBM) e l’oligodendroglioma (ODG). La casistica di GBM e di ODG in dotazione è stata valutata dal punto di vista della metilazione dei promotori di geni (MGMT, EMP3,..) con funzioni oncosoppressive e trovati ipermetilati anche in altri tumori o localizzati in regioni citologicamente instabili, per poter correlare questi dati con la risposta terapeutica nel caso del GBM o con i dati di perdita di eterozigosità (LOH) 1p19q nel caso dell’ODG. Parallelamente all’individuazione di marcatori epigenetici in ambito oncologico, la ricerca si sta muovendo anche nell’indagine di nuove potenziali terapie farmacologiche antitumorali su base epigenetica. In questo contesto, con lo scopo di approfondire le relazioni tra i meccanismi alla base della regolazione epigenetica, ci si è riproposti di valutare la correlazione tra il meccanismo di metilazione/demetilazione del DNA e quello di acetilazione/deacetilazione istonica e la loro vicendevole influenza nel determinare silenziamento genico piuttosto che riattivazione dell’espressione di geni ipermetilati. Sono stati usati farmaci epigenetici demetilanti, quali Azacitidina e Decitabina, inibitori della istone deacetilasi, quali la Tricostatina A, e inibitori della via di sintesi di molecole, le poliammine, coinvolte nella regolazione dell’espressione genica con modalità ancora da precisare in modo definitivo. Sebbene i meccanismi di regolazione epigenetica vengano studiati per lo più nel cancro, a causa delle gravi conseguenze che una loro disregolazione porta in termini di silenziamento di geni oncosoppressori, essi sono implicati fisiologicamente anche nel differenziamento di cellule staminali. Gli ultimi due progetti trattati nella tesi si contestualizzano in questo ambito. In particolare viene presentata la messa a punto di una metodologia di immunoprecipitazione sequenziale della cromatina finalizzata all’individuazione di due modificazioni istoniche associate alla stessa regione di DNA. Le modifiche hanno riguardato i marcatori rappresenatativi di cromatina trascrizionalmente repressa H3K27me3 (trimetilazione della Lys27 dell’istone H3) e di cromatina trascrizionalmente attiva H3K24me2 (dimetilazione della Lys4 dell’istone H3) che definiscono i domini detti bivalenti, associati a geni che codificano per fattori di trascrizione che regolano lo sviluppo in cellule embrionali staminali, mantenendoli pronti per un veloce indirizzamento verso l’ attivazione trascrizionale. Il ruolo che la regolazione epigenetica svolge durante il differenziamento di cellule staminali non è ancora noto con precisione. È chiaro però che la memoria della linea cellulare verso la quale si differenzia una cellula staminale adulta, implica l’utilizzo di modifiche epigenetiche, quali la metilazione del DNA e correlati pattern di metilazione e acetilazione istonica. L’ultimo progetto, trattato, è stato finalizzato a verificare il coinvolgimento dell’epigenetica e in particolare della metilazione dei promotori di fattori trascrizionali precocemente attivati durante il differenziamento verso il fenotipo muscolare cardiaco di cellule staminali umane derivate da tessuto adiposo (ADSCs).

Il trapianto di cellule staminali emopoietiche rappresenta la terapia di scelta per numerose patologie ematologiche. Tuttavia, la mortalità da trapianto (non relapse mortality-NRM), ha limitato per lungo tempo il suo utilizzo in pazienti di età >65 anni. L’età non può più essere considerata una controindicazione assoluta al trapianto e il suo utilizzo in fasce di età un tempo ritenute non idonee è in sensibile aumento. La NRM è legata a tre ordini di complicanze: immunologiche (malattia del trapianto contro l’ospite, Graft versus-Host Disease -GVHD-), infettive e tossiche. La tossicità d’organo è direttamente correlata alla intensità del condizionamento che quindi viene ridotta in caso di comorbidità e nel paziente anziano. Tuttavia, ridurre l’intensità del condizionamento significa anche aumentare il rischio di ripresa della malattia ematologica di base e quindi tale aggiustamento deve essere fatto in funzione di indici di invecchiamento e di comorbidità, al fine di non ridurre la potenzialità curativa del trapianto. Per valutare le comorbidità abbiamo uno score altamente predittivo (Hematopoietic Cell Transplant-Comorbidity Index, di Sorror), mentre per valutare l’invecchiamento c’è una grande necessità clinica di marcatori innovativi di età biologica. Il presente lavoro ha l’obiettivo di valutare, nei pazienti sottoposti a trapianto allogenico di cellule staminali emopoietiche per tutte le indicazioni ematologiche, lo stato di metilazione del DNA, indice di età biologica. Lo scopo è di correlare l’epigenoma al rischio trapiantologico del singolo individuo.
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a well-established therapy for several life-threatening hematological disorders, mostly malignancies. However, non-relapse mortality (NRM) has limited its use in patients aged over 65 years. Nowadays age cannot be considered an absolute contraindication for this treatment and the use of transplantation, in patient groups once considered unsuitable, is increasing significantly. NRM is due to three types of complications: immunological (graft versus host disease), infectious and toxic. Organ toxicity is directly related to the intensity of conditioning which is therefore reduced in case of comorbidities and in elderly patients. However, reducing the intensity of chemotherapy also means increasing the risk of relapse of the underlying haematological disease and therefore this adjustment must consider aging and comorbidity indexes in order not to reduce the curative potential of the transplant. To evaluate comorbidities we have a highly predictive score (the Comorbidity Index Score by Sorror, HCT-CI), while to evaluate aging there is a great clinical need to apply innovative biological age markers. The present work aims to evaluate the state of DNA methylation, a biological age index, in the setting of patients undergoing allogeneic haematopoietic stem cell transplantation for all haematological indication. The aim is also to correlate the epigenome with the transplant risk of the single individual.

Alcohol addiction is thought to depend on molecular and cellular adaptations in the brain that result from chronic drug exposure (Fitzgerald and Nestler, 1995 ). This suggests that chronic alcohol abuse involves stable changes in the brain at the molecular and cellular levels responsible for long-lasting alterations in behavior. One of the candidate molecules involved in such mechanisms is brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Aberrant regulation of BDNF has been implicated in the development of psychiatric disorders, including schizophrenia, depression, anxiety and alcohol addiction (Moonat et al., 2010). Multiple actions of ethanol on BDNF gene expression and signalling have been described. Nevertheless the considerable complexity within the BDNF gene itself and the multiple mRNAs encoded by up to 9 potential exons is further complicated because of its epigenetic regulation by methylation of BDNF promoters. The knowledge of the promoter that may be differentially regulated during various states of ethanol exposure and a detailed analysis of the effects of different ethanol exposure treatments on mRNA expression is required to understand the biological basis of addiction. This will lead to more effective treatments and eventually to cures and preventive measures to treat alcohol addiction. The aim of this work was to evaluate the effects of ethanol on CpG islands of BDNF exon IX gene in regulating its expression, both “in vivo” and “in vitro”. Rat cerebellar granule cells in culture were exposed to acute ethanol, chronic ethanol or ethanol withdrawal. Our results demonstrate that ethanol exposure increases, the abundance of BDNF exon IX transcript in the three different treatment conditions. We then tested the ability of acute ethanol to alter exon IX methylation by using MSP PCR. Similarly to the effect induced by the two DNA methylation inhibitors, zebularine and RG-108, exposure of cultured neurons to 100 mM ethanol for 3h significantly increased the unmethylated state of BDNF exon IX that was about 2.5 folds grater than the methylated state. This epigenetic action of ethanol was observed also in the hippocampus of male rats treated with increasing doses of ethanol (0.8; 1.6 or 3.0 g/kg; i.p.) tested 1; 3 and 5h after injection. Ethanol induced a significant time and dose dependent increase in BDNF exon IX unmethylated DNA levels, compared with control, which showed a positive correlation with BEC. The increased unmethylated state was accompanied by a corresponding increase in the abundance of BDNF exon IX transcript. The increase in mRNA was dose dependent with the maximal effect at 3.0 g/kg 3h after injection. These results provide the first evidence for an alternative way of ethanol to alter BDNF gene expression. Thus, ethanol induced changes in CpG DNA methylation of BDNF gene seems to be an additional mechanism to implement homeostatic protective actions to prevent adverse effects of ethanol. The ability of ethanol to induce up regulation of BDNF may play a pivotal role and could result from a number of intracellular responses that include the epigenetic mechanism here described. Fitzgerald and Nestler, (1995). Clinical Neuroscience 3(3):165-73. Moonat et al., (2010). Cellular and Molecular Life Sciences 67(1):73-88.

Rhabdomyosarcoma (RMS) is a highly aggressive pediatric soft-tissue sarcoma. It is mainly classified into two major subtypes characterized by alveolar (ARMS) and embryonal (ERMS) histologies. ARMS are characterized by a more aggressive behavior with a higher tendency to present metastasis at diagnosis and to relapse after treatment. Approximately 80% of ARMS harbour the reciprocal chromosomal translocation t(2;13)(q35;q14) and, less commonly, the variant translocation t(1;13)(p36;q14), in which PAX3 and FOXO1, or PAX7 and FOXO1 genes, respectively, are juxtaposed. Unfortunately, no such specific genetic aberrations are known in ERMS, and myogenic factors as myogenin and MyoD1 are the only diagnostic indicators that can be used. Despite aggressive multimodal therapies, the prognosis of high-risk RMS patients has not been improved, with a 5-year overall survival rate less than 20-30%, which prompts a need for new therapeutic strategies. In the last decade many scientific studies have demonstrated that gene expression signature distinguishes PAX3-FOXO1 positive RMS from PAX3-FOXO1 negative, but the reasons of the different expression are still unknown. Aberrant DNA methylation patterning is a hallmark of cancer and could be responsible for the different gene expression of RMS tumor subtypes. We performed genome-wide methylation profile by microarray experiments followed by Reduced-Representation Bisulfite Sequencing (RRBS). Microarray analysis demonstrated a different methylation profile between PAX3-FOXO1 positive and negative RMS, besides among metastatic and non-metastatic RMS. We confirmed HOXC11 as one of the gene differentially methylated between PAX3-FOXO1 positive and negative RMS cell lines using in vitro demethylating agents and bisulfite sequencing. Unfortunately, we did not validate the result in the cohort of RMS biopsies. Moreover, we performed another analysis on microarray data comparing metastatic vs non-metastatic RMS. We found an elevated numbers of differentially methylated regions (DMRs) and many of them map to promoter regions of genes implicated in tumors development. In particular we found DMRs linked to clustered protocadherins, known as tumor suppressor genes. We confirmed a different expression pattern of PCDHA4, as well as a different methylation level of its promotorial region, comparing metastatic and non-metastatic RMS samples. Nevertheless, the methylation status and the expression level of PCDHA4 did not have significant correlation with clinical features and are not a predictor of poor prognosis in RMS. Then, we performed an RRBS sequencing, in order to validate data obtained with microarray platforms. We observed a very low concordance between the two approaches, probably caused by a low quality DNA used in microarray experiments. The RRBS sequencing had demonstrated again that PAX3-FOXO1 positive and negative RMS have a different methylation pattern. Moreover, we demonstrated that GADD45G and NELL1, already described as tumor suppressors in other cancers and often downregulated by methylation processes, had also an involvement in RMS biology. Our experiments confirmed an epigenetic regulation by DNA methylation for GADD45G and NELL1 and that their expression were correlated to RMS histology, presence of fusion status and IRS group staging. Furthermore, GADD45G and NELL1 expression levels affect the progression free survival of RMS patients suggesting their association with a poor prognosis. In conclusion, we demonstrated that GADD45G and NELL1 could be novel potential biomarkers in RMS and we evidenced that the DNA methylation pattern in RMS could be interesting for new therapeutic strategies. We hope that our efforts could contribute to a better molecular classification of RMS tumors and to the identification of new targets for improving standard therapy.
Il rabdomiosarcoma (RMS) è una sarcoma pediatrico dei tessuti molli altamente aggressivo. Viene classificato principalmente in due sottotipi, caratterizzati da istologia alveolare (RMSA) o embrionale (RMSE). Nei RMSA si osserva un comportamento più aggressivo e una maggiore tendenza a presentare metastasi alla diagnosi e alla ricaduta dopo trattamento. Circa l'80% dei RMSA presentano la traslocazione cromosomica reciproca t(2; 13) (q35; q14) e, meno comunemente, la variante t(1; 13) (p36; q14), in cui i geni PAX3 e FOXO1, o PAX7 e FOXO1, rispettivamente, sono giustapposti. Purtroppo, non si conoscono aberrazioni genetiche specifiche nei RMSE e i fattori miogenici, come miogenina e MyoD1, sono gli unici indicatori diagnostici che possono essere utilizzati. Nonostante l’applicazione di terapie aggressive multimodali, la prognosi dei pazienti affetti da RMS, della categoria alto rischio, non è migliorata, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 20-30%. Questo dato indica la necessità di sviluppare nuove strategie terapeutiche. Nell’ultimo decennio molti studi scientifici hanno dimostrato che in base al profilo di espressione genica è possibile distinguere RMS PAX3-FOXO1-positivi e PAX3-FOXO1-negativi, ma le ragioni di questa diversa espressione sono ancora sconosciute. L’anomala metilazione del DNA è un indicatore di neoplasia e potrebbe essere la causa responsabile della diversa espressione genica dei due sottotipi di tumore. In questo studio, per mezzo di esperimenti di microarray, abbiamo realizzato un’analisi dello stato di metilazione del DNA su tutto il genoma, proseguendo poi con esperimenti di sequenziamento sfruttando la tecnica Reduced-Representation Bisulfite Sequencing (RRBS). L’analisi dei risultati ottenuti con gli esperimenti di microarray ha dimostrato, non solo un profilo di metilazione diverso tra i RMS PAX3-FOXO1-positivi e negativi, ma anche tra i RMS metastatici e non metastatici. Abbiamo confermato che il gene HOXC11 risulta essere differenzialmente metilato tra linee cellulari di RMS PAX3-FOXO1-positive e negative, sfruttando trattamenti con agenti demetilanti in vitro e sequenziamento del DNA dopo conversione con bisolfito; purtroppo, non abbiamo confermato il risultato nella coorte di biopsie di RMS. Inoltre, abbiamo effettuato un'ulteriore analisi sui dati di microarray confrontando i RMS metastatici con i non metastatici. Abbiamo trovato un elevato numero di regioni differenzialmente metilate (DMR) e molte di queste sono risultate coincidere con le regioni promotoriali di geni implicati nello sviluppo di tumori; in particolare, abbiamo trovato DMR connesse alla famiglia delle clustered protocaderine, note come geni soppressori di tumore. Abbiamo poi confermato un diverso profilo di espressione del gene PCDHA4, così come un diverso stato di metilazione a livello della sua regione promotoriale, confrontando campioni di RMS metastatici e non metastatici. Tuttavia, lo stato di metilazione e il livello di espressione di PCDHA4 non hanno dimostrato una correlazione significativa con le caratteristiche cliniche del RMS. Il gene PCDHA4 non risulta quindi essere un predittore prognostico nel RMS. Successivamente, abbiamo effettuato un sequenziamento RRBS, al fine di validare i dati ottenuti con le piattaforme dei microarray. Ne è risultata una bassa concordanza tra i due approcci, probabilmente a causa della bassa qualità del DNA utilizzato negli esperimenti di microarray. Il sequenziamento RRBS ha dimostrato ancora una volta che i RMS PAX3-FOXO1-positivi hanno un profilo di metilazione diverso dai RMS PAX3-FOXO1-negativi. Inoltre, abbiamo dimostrato che GADD45G e NELL1, già descritti come soppressori tumorali in altri tipi di tumore e spesso regolati in maniera negativa da processi di metilazione, sono anche coinvolti nella biologia del RMS. Con i nostri esperimenti abbiamo confermato una regolazione epigenetica, mediata dalla metilazione del DNA ,per i geni GADD45G e NELL1, e come la loro espressione sia correlata alla istologia del RMS, alla presenza dei geni di fusione e alla stadiazione in gruppi IRS. Inoltre, abbiamo dimostrato che i livelli di espressione di GADD45G e NELL1 influenzano la sopravvivenza libera da progressione di malattia nei pazienti affetti da RMS, suggerendo la loro associazione con una prognosi sfavorevole. In conclusione, il nostro lavoro ha dimostrato che GADD45G e NELL1 potrebbero essere nuovi potenziali biomarcatori nel RMS, evidenziando come il profilo di metilazione del DNA nel RMS potrebbe favorire lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. Ci auguriamo che i nostri sforzi possano contribuire ad una migliore classificazione molecolare dei tumori nei pazienti affetti da RMS e alla identificazione di nuovi bersagli farmacologici per una terapia più mirata.

Nutrition plays a key role in many aspects of health, indeed epidemiological studies provide evidence that diet can play essential roles in reducing the risk of chronic diseases. Accumulating evidence indicates that dietary compounds (phytochemicals) from fruit and vegetables can modulate multiple cancer-inflammation pathways which are relevant for chemoprevention and are commonly deregulated by epigenetic mechanisms in cancer cells, including drug detoxification, cell cycle regulation, apoptosis induction. Epigenetic refers to heritable alterations in gene expression that do not involve modification of the underlying genetic DNA sequence. Although epigenetic changes are heritable in somatic cells, these modifications are also potentially reversible, which makes them attractive and promising avenues for tailoring cancer preventive and therapeutic strategies. The aim of this study was to investigate the antiproliferative potential of a Cactus pear pigment extract (Indicaxanthin) to assess the phenotypic effects on colorectal cancer cell lines and to investigate the biological function and/or epigenetic mechanisms for Indicaxanthin’s activity. The antiproliferative effects of Indicaxanthin (Ind), were investigated on a number of human cancer cell lines including hepatocarcinoma cells (HepG2, Ha22T, HUH 7), breast cancer cells (MCF7), cervix epithelial carcinoma (HeLa) and colorectal carcinoma cells (Caco2, LOVO1, DLD1, HT29, HCT116). Ind caused a clear dose-dependent decrease in the proliferation of Caco2, with minor effect on the other cell lines. Flow cytometric analysis showed a pro-apoptotic effect of the pigment at 48h in Caco2 cells. Incubation of proliferating Caco2 cells with Ind (10μl to 100μl ) remarkably reduced the global DNA 5-methyl cytosine methylation and caused a stable demethylation of the tumor suppressor p16INK4a gene promoter, with reactivation of the silenced mRNA expression and accumulation of p16INK4a protein. A decrease of the hyperphosphorylated retinoblastoma protein in favour of its hypophospohrylated status was observed, with unaltered level of the cycline-dependent kinase CDK4. Analysis of cell distribution in the cell cycle phases after Ind treatment showed arrest of Caco2 cells in the S- G2/M- phase. The effect of Ind on LINE-1 methylation levels in the other colorectal cancer cell lines was therefore explored as well as the effect of Ind on promoter methylation status of other genes implicated in colon carcinogenesis. Ind is able to alter the methylation status on global and specific gene level. To rationalize the mechanism of DNA methylation changes induced by Ind, the effect of the phytochemical on the activity and the level of DNA methyltransferase (DNMT) was evaluated. Ind induced a dose-dependent inhibition of DNMT activity on Caco2 cells, while did not affect DNMT1 and DNMT3b level. However a significant increment of DNMT3a was evident in Caco2 cell line. Aberrant expression of DNMTs and their isoforms has been found in many types of cancer and their contribution to aberrant DNA methylation has been proposed. Following this hypothesis, the effect of Ind on the expression of DNMT splice variant, was investigated. The expression of DNMT increased appreciably only in some cell lines with respect to only some DNMT genes after Ind treatment. DNA demethylation may take place as an active mechanism by the activity of specific enzymes. In order to assess whether Ind is able to induce an alteration in DNA demethylase expression, which may explain the effects of Ind on DNA methylation in the tested cell lines, the effect of Ind on the DNA demethylase expression was investigated. Ind induced an increased expression of some enzymes with demethylating activity (TET2, MBD4) relatively only in some cell lines. In this work it appears that the phytochemical Indicaxanthin induces different effects (both epigenetic and biochemical) on colorectal cancer cell lines tested (reduction of proliferation, induction of apoptosis, induction of cell cycle arrest, change in DNA methylation, alteration of gene expression). The effects brought by Ind, are often variable depending on the cell line used, such phenomenon can be attributed to the cell lines themselves. Furthermore from in silico molecular imaging tests, in this study it was supposed that epigenetic effects of Ind are not mediated by a direct alteration of DNMT expression, rather by an influence of Ind on their activities. Then, Ind binding the DNMT and altering their methyltransferase function could cause an imbalance of global DNA methylation.

Alterazione dell’espressione genica sono alla base di numerose patologie, incluse quelle del sistema cardiovascolare. Meccanismi simili a quelli che regolano l'espressione genica nello sviluppo del cuore sono alla base dei meccanismi che si verificano nella ipertrofia e scompenso cardiaco. Pertanto, studiare i meccanismi regolatori che governano lo sviluppo e l'adattamento del cuore a stimoli fisiopatologici é di particolare importanza. L'epigenoma -la somma di modificazioni chimiche su DNA e proteine istoniche - sta emergendo come un meccanismo di regolazione chiave durante lo sviluppo del cuore e nelle malattie cardiache. Lo scopo della tesi è stato di chiarire il ruolo delle modificazioni epigenetiche, con particolare attenzione alla metilazione del DNA, nella regolazione del programma trascrizionale cardiaco. Pertanto usando un approccio genome-wide abbiamo studiato il ruolo della metilazione e idrossimetilazione del DNA nel cuore. Abbiamo trovato che l’ ipertrofia cardiaca é associata con alterazioni del profilo genomico di metilazione del DNA, e,in particolare, con un incremento di metilazione del DNA sui promotori di geni coinvolti nel rimodellamento metabolico del cuore. Screening dell’espressione di geni coinvolti nella metilazione del DNA ha rivelato che il gene Uhrf1 - che codifica per un cofattore epigenetico assente in tessuti sani e in cellule post-mitotiche - è fortemente riespresso in cardiomiociti ipertrofici. Silenziamento in vivo di Uhrf1 con vettori adeno-associati (AAV9) ha portato a una ridotta la disfunzione cardiaca e mitocondriale in topi sottoposti a sovraccarico pressorio. Infine abbiamo valutato il profilo di idrossimetilazione del DNA di cardiomiociti embrionali, neonatali, adulti e ipertrofici. Questo studio ha definito l’importanza della modulazione dinamica del DNA idrossimetilato nel regolare il programma trascrizionale dei cardiomiociti sia nello sviluppo che nell’ipertrofia.

Le modificazioni epigenetiche del DNA giocano un ruolo rilevante nella regolazione dell’espressione genica nella maggior parte degli organismi. Nei Metazoa, sia nei vertebrati che negli invertrebrati, tra i vari meccanismi epigenetici, la metilazione del DNA è essenziale durante il lo sviluppo embrionale e nel controllo dell’espressione genica. Di conseguenza, le cellule differenziate stabiliscono un pattern stabile e univoco di metilazione del DNA che regola l’espressione genica tessuto-specifica. Tuttavia, la metilazione del DNA è un meccanismo poco studiato nei molluschi. L’organismo selezionato nel presente lavoro di dottorato appartiene al phylum Mollusca, ed è Mytilus galloprovincialis. Per studiare questo processo, abbiamo esaminato il genoma di Mytilus e rilevato tre gruppi principali di proteine DNMT, tre membri di MBD e una proteina TET, che sono stati sottoposti ad analisi di filogenesi e caratterizzazione dei domini proteici. Abbiamo poi studiato l’espressione di questi geni sia durante lo sviluppo embrionale che in tessuti adulti, e analizzato la dinamica dei livelli di metilazione globale del DNA durante l’embriogenesi. In aggiunta, il ruolo della metilazione del DNA durante l’embriogenesi, è stato caratterizzato mediante l’utilizzo di inibitori specifici per le proteine DNMT1 e TET. Inoltre, poiché la metilazione agisce anche nel modulare la plasticità fenotipica in risposta ai cambiamenti ambientali, abbiamo iniziato a studiare se l’esposizione a specifici contaminanti emergenti (EC) può influenzare il pattern di metilazione del DNA negli embrioni di M. galloprovincialis attraverso una tecnica innovativa: il sequenziamento Methyl-RAD. In conclusione, i nostri risultati forniscono un primo studio della metilazione del DNA responsabile del corretto sviluppo di Mytilus galloprovincialis fornendo informazioni fondamentali per una migliore comprensione del complesso ruolo svolto da questo meccanismo nelle attività regolative del genoma nei bivalvi.
Epigenetic modifications play a key role in regulating gene expression in all organisms. In metazoans among various epigenetic mechanisms, DNA methylation influences embryonic development and gene expression in both vertebrates and invertebrates. As a consequence, differentiated cells develop a stable and unique DNA methylation pattern that regulates tissue-specific gene transcription: a critical mechanism for development. DNA methylation, however, remains poorly investigated in mollusks. Therefore, we decided to investigate the mechanisms underlying this process in the marine bivalve Mytilus galloprovincialis and belonging to the phylum Mollusca. To shed light on this process, we first screened its genome detecting two major groups of DNMT enzymes, three MBD members, and one TET protein, which were subject to phylogenetic studies and protein domain characterization. We then investigated the expression of these genes both during development and in different adult tissues together with the dynamics of global DNA methylation levels during embryogenesis. In addition, the role of DNA methylation during its embryogenesis was further assessed by the use of specific inhibitors for DNMT1 and TET. Interestingly, we found similar to other vertebrates and invertebrates that embryos treated with these inhibitors display delayed or arrested development: a likely consequence of altered DNA methylation. As DNA methylation functions also promote phenotypic plasticity, we started to investigate if exposure to specific emerging contaminants (ECs) can influence DNA methylation patterns in Mytilus galloprovincialis embryos by taking advantage of an innovative technique, the Methyl-RAD sequencing. In conclusion, our findings provide the first insight into DNA methylation responsible for the proper development of Mytilus galloprovincialis giving fundamental information to better understand the complex role played by this mechanism in regulating genome activity in bivalves.

Nel presente lavoro di tesi sono riportati i risultati di un innovativo progetto di ricerca longitudinale nell'ambito della psicobiologia. I recenti progressi nel campo dell'epigenetica sono stati applicati allo studio delle conseguenze di esperienze avverse precoci sullo sviluppo socio-emozionale in bambini nati fortemente pretermine. La nascita pretermine costituisce un fattore di rischio per lo sviluppo socio-emozionale, in parte per l'esposizione ad eventi stressanti (es.: dolore neonatale) durante l'ospedalizzazione in terapia intensiva neonatale (TIN). L'epigenetica si riferisce a processi biochimici altamente sensibili alle esperienze ambientali e che alterano la funzione di trascrizione di specifici geni, senza modificare la struttura della sequenza di DNA. Il candidato ha sviluppato un razionale clinicamente rilevante per la ricerca epigenetica comportamentale della prematurità. Inoltre il progetto di ricerca ha dimostrato che il livello di esposizione a procedure dolorose si associa a esiti avversi sul piano temperamentale e della risposta allo stress a tre mesi e che tale associazione è mediata da alterazioni epigenetiche a livello del gene che codifica per il trasportatore della serotonina. Le implicazioni teoriche, cliniche ed etiche di questi risultati sono trattate nella sezione conclusiva. Il progetto di epigenetica comportamentale della prematurità fornisce una nuova prospettiva teorica ed empirica sul tema dell’interazione tra genetica ed ambiente.
In the present work, the candidate reports the results of an innovative longitudinal research project in the field of psychobiology. The recent epigenetic progresses have been applied to the study of the consequences of early adverse event exposures on the socio-emotional development of very preterm infants. Preterm birth is a major concern for socio-emotional development, partly due to the exposure to adverse stressful stimulations (i.e., skin-breaking procedures) during the Neonatal Intensive Care Unit (NICU) stay. Epigenetics refers to biochemical processes which are sensitive to environmental cues and which alter the transcriptional activity of specific genes without changing the DNA structure. The candidate has developed a clinically relevant rationale for preterm behavioral epigenetics (PBE). The research project has demonstrated that the early exposure to high levels of skin-breaking procedures during NICU stay associate with non-optimal temperamental profile and stress regulation at 3 months of age. This association was mediated by epigenetic modifications (DNA methylation) of the stress-related gene encoding for serotonin transporter. The theoretical, clinical and ethical implications of these findings are discussed further in the final section of the thesis. The PBE project provides a new framework for the issue of the interconnections between nature and nurture.

Nel presente lavoro di tesi sono riportati i risultati di un innovativo progetto di ricerca longitudinale nell'ambito della psicobiologia. I recenti progressi nel campo dell'epigenetica sono stati applicati allo studio delle conseguenze di esperienze avverse precoci sullo sviluppo socio-emozionale in bambini nati fortemente pretermine. La nascita pretermine costituisce un fattore di rischio per lo sviluppo socio-emozionale, in parte per l'esposizione ad eventi stressanti (es.: dolore neonatale) durante l'ospedalizzazione in terapia intensiva neonatale (TIN). L'epigenetica si riferisce a processi biochimici altamente sensibili alle esperienze ambientali e che alterano la funzione di trascrizione di specifici geni, senza modificare la struttura della sequenza di DNA. Il candidato ha sviluppato un razionale clinicamente rilevante per la ricerca epigenetica comportamentale della prematurità. Inoltre il progetto di ricerca ha dimostrato che il livello di esposizione a procedure dolorose si associa a esiti avversi sul piano temperamentale e della risposta allo stress a tre mesi e che tale associazione è mediata da alterazioni epigenetiche a livello del gene che codifica per il trasportatore della serotonina. Le implicazioni teoriche, cliniche ed etiche di questi risultati sono trattate nella sezione conclusiva. Il progetto di epigenetica comportamentale della prematurità fornisce una nuova prospettiva teorica ed empirica sul tema dell’interazione tra genetica ed ambiente.
In the present work, the candidate reports the results of an innovative longitudinal research project in the field of psychobiology. The recent epigenetic progresses have been applied to the study of the consequences of early adverse event exposures on the socio-emotional development of very preterm infants. Preterm birth is a major concern for socio-emotional development, partly due to the exposure to adverse stressful stimulations (i.e., skin-breaking procedures) during the Neonatal Intensive Care Unit (NICU) stay. Epigenetics refers to biochemical processes which are sensitive to environmental cues and which alter the transcriptional activity of specific genes without changing the DNA structure. The candidate has developed a clinically relevant rationale for preterm behavioral epigenetics (PBE). The research project has demonstrated that the early exposure to high levels of skin-breaking procedures during NICU stay associate with non-optimal temperamental profile and stress regulation at 3 months of age. This association was mediated by epigenetic modifications (DNA methylation) of the stress-related gene encoding for serotonin transporter. The theoretical, clinical and ethical implications of these findings are discussed further in the final section of the thesis. The PBE project provides a new framework for the issue of the interconnections between nature and nurture.

La deregolazione della espressione genica rappresenta il segno distintivo delle neoplasie. Sebbene le lesioni geniche sono state oggetto delle più importanti ricerche scientifiche in campo oncologico degli ultimi anni, i ricercatori stanno acquisendo sempre maggiori certezze sul fatto che le modificazioni epigenetiche a livello del DNA giochino un ruolo di primo piano nel processo di oncogenesi. Tali modificazioni si verificano a livello della cromatina nucleare, senza alterare in alcun modo la sequanza nucleotidica delle basi azotate da cui è composto il DNA stesso, e si manifestano attraverso dei pattern specifici di espressione genica che risulta ereditabile attraverso successive divisioni cellulari. Allo stato attuale delle conoscenze, il marcatore epigenetico meglio noto è la metilaizone del DNA. L’iniziale scoperta di un livello ridotto di metilazione globale del DNA nei tumori, è stato subio accompagnato dalla identificazione di loci ipermetilati a livello dei geni oncosoppressori. Attualmente è inoltre noto che il pattern di metilazione del DNA si verifica in un background di complessità strutturale cromatinica ed è influenzato dalla modificazione della struttura degli istoni, comunemente alterati nelle cellule neoplastiche. Tutti gli studi oncologici si propongono come obiettivo la precoce identificazione delle lesioni neoplastiche e la determinazione del rischio evolutivo in termini prognostici. La possibilità di individuare zone di ipermetilazione del DNA è da considerarsi pertanto un promettente strumento diagnostico in campo oncologico dal momento che aberranti eventi di metilazione intervengono frequentemente all’interno del DNA delle cellule neoplastiche, verificandosi precocemente nel processo di oncogenesied è possibile che specifici pattern di ipermetilazione siano presenti in differenti neoplasie. Marcatori molecolari di metilazione possono inoltre essere utilizzati per ottimizzare le classificazioni delle neoplasie, per predire la prognosi dei pazienti oncologici e la risposta alla terapia. L’aspetto sicuramente più significativo è che in virtù della loro natura dinamica e della loro potenziale reversibilità, le modificaizoni epigenetiche possono rappresentare dei bersagli terapeutici nella cura delle neoplasie. Dal momento che interessanti studi molecolari hanno individuato la presenza dei marcatori epigenetici anche nelle neoplasie urologiche ed, in particolare, anche in quelle del rene, nel nostro lavoro abbiamo analizzato lo stato di metilazione globale e di acetilazione istonica in 50 carcinomi renali a cellule chiare sottoposti ad interventi di chirurgia radicale, allo scopo di valutare il loro valore diagnostico e prognostico, accanto ai consueti parametri clinico-patologici. Dal nostro studio è emerso che la percentuale media di metilazione globale del DNA era significativamente maggiore nel tessuto neoplastico rispetto a quello sano, mentre la acetilazione istonica è risultata minore nelle cellule neoplastiche rispetto a quelle non neoplastiche del parenchima renale circostante. Sebbene non sia emersa una correlazione statisticamente significativa con la sopravvivenza, il livello di metilazione globale del DNA è risultato maggiore nei pazienti con carcinomi di grado istologico peggiore indicando che, al di là del grado istologico di Fuhrman, il pattern di metilaizone globale e di acetilazione istonica rappresentino dei possibili marcatori di aggressività nei carcinomi renali a cellule chiare.
Deregulation of gene expression is a hallmark of cancer. Although genetic lesions have been the focus of cancer research for many years, it has become increasingly recognized that aberrant epigenetic modifications also play major roles in the tumorigenic process. These modifications are imposed on chromatin, do not change the nucleotide sequence of DNA, and are manifested by specific patterns of gene expression that are heritable through many cell divisions, The best-known epigenetic marker is DNA methylation. The initial finding of global hypomethylation of DNA in human tumors was soon followed by the identification of hypermethylated tumor-suppressor genes. Moreover, we now know that DNA methylation occurs in a complex chromatin network and is influenced by the modifications in histone structure that are commonly disrupted in cancer cells. Early detection and risk assessment remain high priorities in oncology. Detection of hypermethylated DNA is considered a promising diagnostic tool in cancer because aberrant methylation events are abundant in tumors, occur early in the tumorigenic process, and different cancers exhibit specific hypermethylation patterns DNA methylation markers can also be used for disease classification, and to predict prognosis and response to therapy. Because of their dynamic nature and potential reversibility, epigenetic modifications are appealing therapeutic targets in cancer. We investigated global methylation and histone acetylation in 50 conventional clear cell renal carcinomas, treated with radical nephrectomy, to assess their possible role as diagnostic biomarkers. The features considered in this study were patient age, tumor size and grade, percentage of 5-methylcytosine and Acetyl-Histone (Lys 9) expression in tumor tissue. All considered parameters were correlated with patient specific survival. The mean percentage of global cellular methylation in tumoral tissue was significantly higher compared to normal peritumoral tissue, while the intensity of cellular methylation was significantly higher in normal tissues than in tumoral tissue. The mean percentage of histone cellular acetylation in tumoral tissue was significantly lower compared to normal peritumoral tissue, while the intensity of mean acetylation in neoplastic tissue was similar to the normal tissue. Fuhrman grade resulted to be statistically significant for prognosis. Global DNA methylation and histone acetylation in tumoral tissue did not correlate with survival. The percentage of global DNA methylation was significantly higher in grades 3 and 4 tumors. Fuhrman grade is still considered the most important factor for patient survival; the percentage of global methylation increases with increasing Fuhrman grade; global hypermethylation and histone hypoacetylation can have a role as markers of aggressiveness.

SOMMARIO La transizione epitelio mesenchimale (EMT) indotta dal TGFβ1 è dipendente dalla produzione di ROS nucleari e dall’azione coordinata di due enzimi demetilanti, LSD1 and JMJD2A. TGFβ1 induce la fosforilazione e la mobilitazione nucleare dei fattori di trascrizione Smad 2-3, che legano JMJD2A e rimuovono un complesso repressore, enucleato da LSD1, dal promoter TGFβ1 attivato (Snail zinc finger protein 1 gene, SNAIL1). Allo stesso tempo, LSD1 rilasciato dai promoters attivati sotto stimolo del TGFβ1 si associa con la forma non fosforilata di Smad2-3 e reprime stabilmente la trascrizione dei geni TGFβ1 silenziati (WNT Inhibitory Factor 1, WIF1). La redistribuzione di LSD1 è contrassegnata da cicli di ROS nucleari e l’ossidazione del DNA è essenziale per l’attuarsi della EMT.
ABSTRACT TGF-β1-induced Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) is dependent on nuclear ROS and the coordinate action of two histone lysine demethylases, LSD1 and JMJD2A. TGF-β1 induces phosphorylation and nuclear mobilization of the transcription factor(s), SMAD2-3, which binds JMJD2A and removes a repressor complex enucleated by LSD1 at the TGF-β1-activated promoter (Snail zinc finger protein 1 gene, SNAIL1). Conversely, LSD1 released from activated promoter(s) upon TGF-β1 challenge, associates with non-phosphorylated SMAD2-3 and stably represses transcription of TGF-β1-silenced genes (WNT Inhibitory Factor 1, WIF1). LSD1 redistribution is marked by cycles of nuclear ROS and DNA oxidation is essential for the establishment of EMT.

The genetics of neurodegenerative diseases has an important role to clarify the pathogenetic mechanism, the diagnosis and finally the therapeutic and ethical implications. Up to now, the genetics of familial forms of Frontotemporal dementia (FTD) is mainly related to 3 genes: the microtubule-associated protein tau (MAPT) progranulin (GRN) and the last hexanucleotide expansion (G4C2) repeats in the open reading frame of chromosome 9 (C9orf72). The study describes clinical cases carrying mutations in these genes and, particularly, carriers of the Cys139Arg in GRN gene to clarify the pathogenic role of the mutation. Moreover, we investigated the methylation levels of the 5’CpG-island in C9orf72 promoter near the G4C2 repeat expansion in 86 Italian subjects: 45 FTLD patients (17 expansion carriers, 28 non carriers) and 41 controls. Our study reveals that hypermethylation of the CpG island is expansion-specific, since in any of the 69 non carriers (patients and controls) a high level of methylation was observed. Moreover, the study shows that DNA methylation is not a major modifying factor for disease. Further validation will be necessary to confirm the role of this or other epigenetic mechanisms in the C9orf72 linked diseases.

L’argomento della tesi verte sui tumori testicolari a cellule germinali (TTCG) ed ha come scopi principali la valutazione: i) del ruolo dei riarrangiamenti AZFc del cromosoma Y come fattore di rischio per lo sviluppo di tale patologia; ii) degli effetti del trattamento citotossico sulla ripresa della spermatogenesi e sul genoma/epigenoma spermatico. Il lavoro di tesi fornisce informazioni aggiuntive in merito ai tumori testicolari a cellule germinali (TTCG) con possibili applicazioni nella pratica clinica. La conferma del ruolo della delezione gr/gr nella suscettibilità allo sviluppo di tale patologia, ha permesso di individuare una categoria di pazienti per i quali sarebbe consigliato un follow-up con cadenza periodica. Inoltre, stimola ulteriore ricerca per quanto concerne le duplicazioni parziali AZFc che secondo il nostro lavoro conferiscono un rischio significativo nei soggetti con alterata spermatogenesi. Per tutti coloro che hanno sviluppato TTCG e sono stati trattati, proponiamo l’utilizzo dell’SDF come biomarcatore di danno al DNA spermatico indotto da trattamento citotossico. A tale proposito, è opportuno rivalutare il tempo di attesa oltre il limite temporale di 2 anni che viene attualmente consigliato al paziente oncologico per la ricerca di una gravidanza spontanea. L’introduzione nella pratica clinica di tale biomarcatore permetterebbe, quindi, di monitorare il danno genomico, in modo tale da poter fornire informazioni personalizzate ai pazienti oncologici riguardo la tempistica più appropriata per la ricerca di un concepimento naturale.