Dissertations / Theses on the topic 'Metilmercurio'

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2014.
Made available in DSpace on 2015-02-05T21:15:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327081.pdf: 1814011 bytes, checksum: 9525d01655f716852e76e8e4db235b3b (MD5) Previous issue date: 2014
Introdução: O metilmercúrio (MeHg) tem sido especulado como contaminante ambiental envolvido em efeitos tóxicos em modelos animais e seres humanos. O objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito protetor da inosina, uma purina endógena, diante dos efeitos promovidos pelo MeHg em camundongos. Métodos: Foram utilizados camundongos Swiss machos adultos (45 - 60 dias). Os animais foram expostos a uma solução de MeHg (40 mg/L) diluída na água de beber, durante 15 dias. A ingestão de líquidos foi monitorada diariamente. Concomitantemente, os animais foram tratados com inosina pela via intraperitoneal (i.p.), em doses de 3, 10, 30 ou 100 mg/kg, uma vez por dia, durante 15 dias consecutivos. No 15º dia, os animais foram submetidos a diferentes testes comportamentais, a fim de avaliar o desempenho motor e coordenação motora (teste da barra giratória, teste da retração dos membros posteriores, teste da caminhada na viga e teste do poste), cada animal foi usado em apenas um teste. Após os testes comportamentais, os animais foram eutanaziados por decapitação e o cerebelo foi coletado para a determinação subsequente dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-1ß, TNF-a e IL-6), anti-inflamatória (IL-1ra) e BDNF, por ELISA, bem como para determinação da atividade da glutationa peroxidase e glutationa redutase. Em outro conjunto de experimentos, os animais foram tratados pela via i.p. com inosina (10 mg/kg) ou uma mistura de inosina (10 mg/kg) e cafeína (3 mg/kg, antagonista não-seletivo de receptores para adenosina), uma vez ao dia durante 15 dias consecutivos, visando investigar o possível envolvimento de receptores de adenosina nos efeitos promovidos pela inosina. Vinte e quatro horas após a última injeção, os animais foram submetidos ao teste da barra giratória e testados frente à manifestação e o grau de retração dos membros posteriores. O efeito da inosina também foi investigado diante dos efeitos hepatotóxicos (atividade sérica de ALT e AST) e genotóxicos (ensaio do micronúcleo) do MeHg, bem como diante das alteraçoes nos níveis séricos de lipídeos (colesterol total, HDL e não-HDL) induzidos pelo MeHg. Resultados: O consumo de líquidos não diferiu entre os grupos avaliados. A inosina (10 mg/kg, i.p.) preveniu parcialmente os efeitos deletérios do MeHg em relação ao desempenho motor no teste da barra giratória, no grau de retração dos membros posteriores e no teste da caminhada na viga. No entanto, a inosina não foi capaz de prevenir os efeitos deletérios do MeHg, observados no teste do poste. A co-administração de inosina (10 mg/kg,i.p.) com cafeína (3 mg/kg, i.p.) reverteu totalmente o efeito protetor da inosina no teste da barra giratória e parcialmente no grau de retração dos membros posteriores. Inosina (10mg/kg, i.p.) foi capaz de previnir a redução nos níveis de IL-6 e o aumento nos níveis de BDNF induzidos pelo MeHg no cerebelo. MeHg (40 mg/L) reduziu a atividade cerebelar da glutationa peroxidase, a qual não foi prevenida pelo tratamento com inosina, mas não afetou a atividade cerebelar da glutationa redutase, quando comparado com o grupo não-exposto. Animais expostos ao MeHg apresentaram níveis cerebelares de Hg total mais elevados, quando comparados com animais não-expostos, o tratamento com inosina (10 mg/kg, i.p.) não preveniu o aumento nos níveis cerebelares de Hg total induzido pela exposição ao MeHg. Além disso, a inosina (10 mg/kg, i.p.) preveniu a redução na atividade sérica da ALT induzida pelo MeHg. Com relação aos níveis séricos de lipídeos, a inosina (10 mg/kg, i.p.) não foi capaz de prevenir o aumento dos níveis de colesterol total induzido pelo MeHg, no entanto, previniu o aumento dos níveis de colesterol não-HDL e promoveu um aumento nos níveis de colesterol HDL, quando comparado com animais expostos ao MeHg tratados com veículo (10 ml/kg, i.p.). Finalmente, a inosina foi capaz de prevenir o efeito genotóxico do MeHg, observado no ensaio do micronúcleo em cultura primária de linfócitos humanos, reduzindo o número de células binucleadas micronucleadas quando comparado com o grupo exposto ao MeHg tratado com veículo (10 ml/kg, i.p.). Conclusões: Em conjunto, os resultados do presente estudo sugerem que a inosina apresenta efeito protetor diante das alterações comportamentais (desempenho motor e coordenação) e bioquímicas no sistema nervoso central induzidas pela exposição ao MeHg. Além disso, esses efeitos parecem ser mediados por receptores de adenosina. A inosina também apresenta efeito protetor contra os efeitos hepatotóxicos e genotóxicos do MeHg, bem como sobre as alterações nos níveis séricos de lipídeos induzidos pelo MeHg. Em síntese, nossos dados demonstram que a inosina foi capaz de prevenir as alterações comportamentais e bioquímicas induzidas pelo MeHg, além disso, contribuem para um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos na toxicidade do MeHg.

Abstract : Introduction: Methylmercury (MeHg) has been speculated as environmental contaminants involved in toxic effects in both animals models and humans. The objective of the present study was to evaluate the protective effect of inosine, an endogenous purine, in face of MeHg-promoted effects in mice. Methods: Were used adult male Swiss mice (45 ? 60 days old). Animals were exposed to MeHg solution (40 mg/L) in drink water during 15 days. Liquid ingestion was monitored daily. Concomitantly, animals received inosine intraperitoneally (i.p.) at doses of 3, 10, 30 or 100 mg/kg, once a day during 15 consecutive days. On the 15th day, animals were submitted to different behavioral tests in order to evaluate motor performance and coordination (rotarod test, hind limb clasping phenomenon, beam walking test and pole test), each animal was used in only one test. After behavioral tests, animals were sacrificed by decapitation and the cerebellum was collected for subsequent measurement of pro-inflammatory (IL-1ß, TNF-a and IL-6), antiinflammatory citokynes (IL-1Ra) and BDNF levels by ELISA, as well as glutatione peroxidase and glutatione reductase activity. In another set of experiments, animals were treated by i.p. route with inosine (10 mg/kg) or a mixture of inosine (10 mg/kg) and caffeine (3 mg/kg, non selective adenosine receptors antagonist), once a day during 15 consecutive days, to investigate the possible involvement of adenosine receptors in the effects promoted by inosine. Twenty-four hours after the last injection animals were submitted to the rotarod test and tested for the manifestation and the degree of hind limb clasping phenomenon. The effect of inosine was also investigated in face of the hepatotoxic (ALT and AST serum activity) and genotoxic (micronucleus assay) effects of MeHg, as well as on the changes in serum lipid levels (total cholesterol, HDL and non-HDL levels) induced by MeHg. Results: Liquid consumptions did not differ between groups. Inosine (10mg/kg, i.p.) partially protected against the deleterious effects of MeHg toward motor performance in the rotarod test, in face of the hind limb clasping phenomenon and in the beam walking test (87 ± 10%; mean=21.57 ± 3.06 s vs 46.88 ± 11.93 s). However, inosine was not able to prevent the deleterious effects of MeHg observed in the pole test. Co-administration of inosine (10 mg/kg, i.p.) with caffeine (3 mg/kg, i.p.) completely prevented inosine protective effect in rotarod test and partially in the hind limb clasping phenomenon. Inosine (10 mg/kg, i.p.) was able to prevented MeHg-induced IL-6 decreased andalso prevented MeHg-induced BDNF increased levels in cerebellum. MeHg (40 mg/L) reduced glutathione peroxidase activity, wich was not prevented by inosine treatment, but did not affect glutathione reductase cerebellar activity when compared with non-exposed group. MeHg-exposed animals exhibited higher total Hg levels in cerebellum when compared to non-exposed animals. Inosine did not prevent total Hg-increased level induced by MeHg in cerebellum. Furthermore, inosine (10 mg/kg, i.p.) prevented the reduction in ALT serum activity induced by MeHg. Regarding serum lipid levels, inosine (10 mg/kg, i.p.) did not prevent MeHg-increased total cholesterol levels, however, was able to prevent MeHg-increased non-HDL cholesterol levels and promoted an increase in HDL cholesterol levels when compared with MeHg-exposed animals treated with vehicle (10 ml/kg, i.p.). Finally, inosine was able to prevent the genotoxic effect of MeHg, observed in the micronucleus assay in primary culture of human limphocytes, reducing the number of binucleated micronucleated cells when compared with the MeHg-exposed group treated with vehicle (10 ml/kg, i.p.). Conclusions: Taken together these results suggest that inosine presents protective effect in face of MeHg-behavioral (motor performance and coordination) and biochemical effects in the central nervous system. Whereas, inosine also presents protective effects against hepatotoxic and genotoxic effects of MeHg, as well as on the changes in serum lipid levels induced by MeHg. In summary, our data demonstrate that inosine was able to prevent behavioral and biochemical changes induced by MeHg, furthermore, contribute to understanding mechanisms mediating MeHg-toxicity.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-09Bitstream added on 2014-06-13T18:44:56Z : No. of bitstreams: 1 diniz_ad_dr_rcla.pdf: 1909303 bytes, checksum: abaf5cdd4f1bb6d87e4352811a8d7e1d (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
A bacia do Rio Negro é um ecossistema que, independentemente de atividade antrópica, possui regiões com quantidades expressivas de mercúrio (Hg) no solo e na água. Alguns estudos demonstraram que elevadas concentrações desse elemento químico ocorrem principalmente nos solos podzolizados. Assim, esse trabalho teve como objetivo estudar a origem e a dinâmica do Hg em dois diferentes sistemas de alteração e pedogênese - Latossolo-Espodossolo - em regiões isentas de impactos da bacia do Rio Negro, Amazonas. Pesquisas de campo e laboratório forneceram dados morfológicos, químicos, físicos e mineralógicos dos sítios estudados. O Hg foi quantificado por frações granulométricas e na fração total do solo (HgT), além de ser analisado por termodessorção. O metilmercúrio e o Hg potencialmente móvel e tóxico foram determinados em amostras representativas dos perfis estudados. Os resultados mostraram que o processo de hidratação mineral ao longo dos Latossolos, que é seguido por um empobrecimento em elementos finos (minerais de argila e óxidos bem cristalizados), contribuiu para uma importante concentração de HgT nos horizontes B dos perfis lateríticos empobrecidos. Além disso, esses perfis possuem a maior quantidade de Hg potencialmente móvel e tóxico (biodisponível), porém menor quantidade relativa de metilmercúrio. Nos Espodossolos, a tendência observada foi de alta concentração do Hg nos perfis da frente de podzolização (transição entre Latossolos e Espodossolos), nos horizontes Bhs e, principalmente, nos horizontes Bh. Nesses horizontes, o mercúrio se apresenta essencialmente na forma semi-móvel e/ou imóvel e o metilmercúrio sofre significativa diminuição. O cálculo do fator do balanço de massa apresentou valores muito superiores a 1, apontando para um alto ganho relativo de HgT no solum das coberturas lateríticas empobrecidas e nos horizontes Bhs e Bh dos Espodossolos
The Negro River Basin is an ecosystem that has regions with very expressively quantities of mercury in soil and water, even in natural systems. Some studies showed that high concentrations of chemical element occur mainly in podzolized soils. Therefore, the aim of this work was to study the origin and the dynamics of Hg in two differents Oxisol – Spodosol systems in the Negro River Basin. Field work and laboratory provided chemical, physical and mineralogical data of the studied sites. The total mercury (HgT) in soil was measured and further examined by thermodesorption. The methylmercury and the potentially mobile and toxic mercury were determined in representative samples. The results showed that the hydration process over Oxisols, which is followed by an impoverishment of the fine elements (clay minerals and well crystallised oxides), contributes to an important concentration of HgT in the B horizons of lateritics profiles. In addition, these profiles have the greatest amount of potentially mobile and toxic mercury, but less amount of methylmercury. In Spodosols, the trend is the high concentration of Hg in the profiles of the podzolization front, in the Bhs horizons and, mainly, in the Bh horizons. In these horizons, the mercury is essentially semi-mobile and/or non mobile and the methylmercury has significant decrease. The mass balance factor presents values higher than 1 and point to a high gain of the HgT in the solum of lateritics soils impoverished, as well in Bhs and Bh horizons of the Spodosols

Mercury (Hg) is a toxic metal widely distributed in the environment. The main route of exposure for humans is the diet, where it is presented in inorganic form [Hg(II)] or as methylmercury (CH3Hg). Seafood products, especially large marine predators, and mushrooms are the foods with the highest concentrations of this metal. The need to reduce Hg exposure of the population, especially those living in contaminated areas or those in which seafood products are an important basis of their diets, is a priority. However, it is not an easy task to avoid food contamination or to eliminate the contaminant prior to its consumption. It is therefore necessary to search for alternative ways to reduce exposure to Hg without eliminating from the diet these food products with a high nutritional value. One of these possible ways of action is to reduce selectively the arrival of Hg into the bloodstream after oral intake, without compromising the arrival of other essential elements and using for that purpose compounds whose food safety have been proven. This has been the main objective of this PhD thesis. An initial characterization of the bioaccessible fraction of foods with high Hg contents was carried out to determine the risk associated with their intake. The data show that the amount of Hg that is released during the digestion of the food is lower than the initial content of Hg in the sample and that it is especially affected by the gastric pH and, in the case of seafood products, also by the pepsin and pancreatic lipase concentrations. The evaluation of the molar ratio selenium (Se)/Hg shows that in the bioaccessible fractions, there is usually a molar excess of Se, which according to some studies indicates a lower risk associated to the exposure. Thus, although a significant proportion of these matrices exceed the maximum level for Hg and their intake would exceed the recommended weekly intake, the associated risk may not be so high if, as it has observed in vitro, the arrival of Hg in the systemic circulation is lower than expected and the contribution of Se and its absorption are high. The attempt to decrease the bioavailability of Hg has been addressed by the search for food components or food-grade microorganisms capable of decreasing the bioaccessibility of Hg after digestion or of diminishing its transport through the intestinal wall. Initial approaches have been carried out in vitro using simulated gastrointestinal digestion and cellular models of intestinal epithelium. It has been evidenced that certain types of cellulose, tannic acid, pectin and lignin are food compounds with a high binding capacity to both mercurial forms, which is maintained during gastrointestinal digestion and they are even effective in reducing the bioaccessibility of Hg from seafood products and mushrooms. These treatments do not modify the initial chemical form of Hg; however, they have the disadvantage that in some cases they reduce the bioaccessibility of essential elements. It has also been shown that digestion in the presence of lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus and Saccharomyces cerevisiae also results in a high reduction of the bioaccessibility of Hg in aqueous solution and of Hg present in mushrooms; however, these strategies are not effective reducing the bioaccessibility of Hg present in seafood products. The analysis of the factors that could influence the inefficiency of these microorganisms in seafood products indicates that possibly the form in which Hg is released from the food matrix prevents this metal from being uptaked by bacteria and yeasts. On the other hand, it has been shown that there are dietary components, especially those with thiol groups (cysteine, GSH and homocysteine) and supplements rich in these components, as well as strains of Lactobacillus and S. cerevisiae that can reduce the transport of Hg(II) and CH3Hg through the monolayer of intestinal cells, thus affecting directly the absorption of Hg. ...
El mercurio (Hg) es un metal tóxico ampliamente distribuido en el medio ambiente. La principal vía de exposición para el ser humano la constituye la dieta, donde se presenta en forma inorgánica [Hg(II)] o como metilmercurio (CH3Hg). Dentro de los alimentos que presentan elevados contenidos de este metal destacan los productos pesqueros, especialmente los grandes depredadores marinos, y las setas. La necesidad de reducir la exposición a Hg de la población, especialmente de aquellos grupos que viven en zonas contaminadas o aquellas poblaciones en las que los productos pesqueros son una base importante de sus dietas es una prioridad. Sin embargo, no es una tarea fácil evitar la contaminación del alimento o eliminar el contaminante previo a su consumo. Es por tanto necesario buscar vías alternativas para disminuir la exposición a Hg sin eliminar de la dieta alimentos con un alto valor nutritivo. Entre estas posibles vías de actuación está la de reducir selectivamente la llegada del tóxico a la circulación sanguínea tras su ingesta oral, sin comprometer la llegada de otros elementos esenciales y empleando para tal fin, compuestos cuya seguridad alimentaria esté probada. Este ha sido el objetivo principal de la presente tesis doctoral. Se ha llevado a cabo una caracterización inicial de la fracción bioaccesible de los alimentos con mayores contenidos de Hg para determinar el riesgo asociado a su ingesta. Los datos han mostrado que la cantidad de Hg que se libera durante la digestión del alimento es inferior al contenido inicial de la muestra y que ésta se ve especialmente afectada por el pH de la digestión gástrica y, en el caso de productos pesqueros, por la concentración de pepsina y lipasa pancreática. La evaluación del ratio molar selenio (Se)/Hg muestra que en las fracciones bioaccesibles hay por lo general, un exceso molar de Se, lo que según algunos estudios indica un menor riesgo asociado. Así, aunque una parte importante de estas matrices superan el límite legislado para Hg y su ingesta superaría la ingesta semanal recomendada, puede que el riesgo asociado no sea tan elevado si tal y como se observa in vitro la llegada de Hg a la circulación sistémica es menor de la esperada y el aporte de Se y su absorción son elevados. El intento de disminuir la biodisponibilidad de Hg se ha abordado mediante la búsqueda de componentes alimentarios o microrganismos de grado alimentario capaces de disminuir la bioaccesibilidad del Hg tras la digestión o de disminuir su transporte a través de la pared intestinal. Las aproximaciones iniciales se han llevado a cabo in vitro empleando una digestión gastrointestinal simulada y modelos celulares de epitelio intestinal. Se ha evidenciado que determinados tipos de celulosa, el ácido tánico, la pectina y la lignina son compuestos alimentarios con una elevada capacidad de unión a ambas formas mercuriales, la cual se mantiene durante la digestión gastrointestinal, incluso se muestran eficaces reduciendo la bioaccesibilidad de Hg desde productos pesqueros y setas. Estos tratamientos no modifican la forma química inicial del Hg, sin embargo, presentan el inconveniente de que en algunos casos reducen la bioaccesibilidad de elementos esenciales. Asimismo, se ha puesto de manifiesto que la digestión en presencia de bacterias lácticas del género Lactobacillus y de Saccharomyces cerevisiae también produce una elevada reducción de la bioaccesibilidad del Hg en disolución acuosa y del Hg presente en setas; sin embargo, estas estrategias no son efectivas reduciendo la bioaccesibilidad del Hg presente en productos pesqueros. El análisis de los posibles factores que influyen en la ineficacia de estos microrganismos en productos pesqueros indica que posiblemente la forma en que se libera el Hg de la matriz alimentaria impide que este metal pueda ser captado por bacterias y levaduras. Por otro lado, se ha puesto de manifiesto que existen componentes de la dieta,
El mercuri (Hg) és un metall tòxic àmpliament distribuït en el medi ambient. La principal via d'exposició per a l'ésser humà la constitueix la dieta, on es presenta en forma inorgànica [Hg(II)] o com a metilmercuri (CH3Hg). Dins dels aliments que presenten elevats continguts d'aquest metall destaquen els productes pesquers, especialment els grans depredadors marins, i els bolets. La necessitat de reduir l'exposició a Hg de la població, especialment d'aquells grups que viuen en zones contaminades o aquelles poblacions en les quals els productes pesquers són una base important de les seves dietes és una prioritat. No obstant això, no és una tasca fàcil evitar la contaminació de l'aliment o eliminar el contaminant previ al seu consum. És per tant necessari buscar vies alternatives per disminuir l'exposició a Hg sense eliminar de la dieta aliments amb un alt valor nutritiu. Entre les possibles vies d'actuació està la de reduir selectivament l'arribada del tòxic a la circulació sanguínia després de la seua ingesta oral, sense comprometre l'arribada d'altres elements essencials i emprant per a tal fi, composts amb seguretat alimentària provada. Est ha estat l'objectiu principal de la present tesi doctoral. S'ha dut a terme una caracterització inicial de la fracció bioaccesible dels aliments amb majors continguts de Hg per determinar el risc associat a la seua ingesta. Les dades han mostrat que la quantitat de Hg que s'allibera durant la digestió de l'aliment és inferior al contingut inicial de la mostra i que aquesta es veu especialment afectada pel pH de la digestió gàstrica i, en el cas de productes pesquers, per la concentració de pepsina i lipasa pancreàtica. L'avaluació del ràtio molar seleni (Se)/Hg mostra que en les fraccions bioaccesibles hi ha en general, un excés molar de Se, la qual cosa segons alguns estudis indica un menor risc associat. Així, encara que una part important d'aquestes matrius alimentaries superen el límit legislat per Hg i la seua ingesta superaria la ingesta setmanal recomanada, pot ser que el risc associat no sigui tan elevat si tal com s'observa in vitro l'arribada de Hg a la circulació sistémica és menor de l'esperada i l'aportació de Se i la seua absorció són elevades. S'ha evidenciat que determinats tipus de cel·lulosa, l'àcid tànic, la pectina i la lignina són compostos alimentaris amb una elevada capacitat d'unió a les formes mercurials, la qual es manté durant la digestió gastrointestinal, fins i tot es mostren eficaces reduint la bioaccesibilitat de Hg des de productes pesquers i bolets. Aquests tractaments no modifiquen la forma química inicial del Hg, però presenten l'inconvenient que en alguns casos redueixen la bioaccesibilitat d'elements essencials. Així mateix s'ha posat de manifest que la digestió en presència de bacteris làctics del gènere Lactobacillus i Saccharomyces cerevisiae també produeix una elevada reducció de la bioaccesibilitat del Hg en dissolució aquosa i del Hg present en bolets; no obstant això aquestes estratègies no són efectives reduint la bioaccesibilitat del Hg present en productes pesquers. L'anàlisi dels possibles factors que influeixen en la ineficàcia d'aquests microrganismos en productes pesquers indica que possiblement la forma en que s'allibera el Hg de la matriu alimentaria impedeix que aquest metall pugui ser captat per bacteris i llevats. D'altra banda, s'ha posat de manifest que existeixen components de la dieta, principalment els que presenten grups tiol (cisteïna, GSH i homocisteïna) i suplements rics en aquests components, així com soques de Lactobacillus i S. cerevisiae que poden reduir el transport de Hg(II) i CH3Hg a través de la monocapa de cèl·lules intestinals, afectant d'aquesta forma directament l'absorció de Hg. Aquest efecte també s'observa quan s'avalua el transport del Hg present en la fracció bioaccesible de productes pesquers. L'eficàcia d'alguns compostos i microo
Jadán Piedra, CA. (2017). Estrategias dietéticas para disminuir la biodisponibilidad de mercurio desde alimentos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/90651
TESIS

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2010
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A mitocôndria é a organela responsável pela maior produção líquida de energia na célula. Numerosos estudos já têm demonstrado seu envolvimento na fisiopatologia de vários processos neurodegenerativos, como nas doenças de Alzheimer, Parkinson e Hungtington. Além disso, sabe-se que ela é alvo de toxicantes, tanto exógenos quanto endógenos, como por exemplo, o contaminante ambiental metilmercúrio (MeHg) e as altas concentrações de leucina que acumulam da Doença do Xarope do Bordo (DXB). Sabe-se que o MeHg causa severos danos neurológicos tanto em animais quanto em humanos. A principal forma de intoxicação humana é através da ingesta de peixes contaminados, sendo que o MeHg acumula-se principalmente no sistema nervoso central. A leucina e seu derivado ?-cetoácido, ?-cetoisocaproato são os principais metabólitos acumulados na DXB, e estes parecem ser responsáveis pelos principais sintomas neurológicos, incluindo o prejuízo cognitivo, que os pacientes com esta patologia apresentam. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi de melhor entender os mecanismos patogênicos responsáveis pela neurotoxicidade induzida pela exposição à toxicantes exógenos e endógenos, principalmente em nível mitocondrial, em cérebro de roedores; visto que existe um grande número de evidências na literatura que demonstra que a gênese dos processos neurodegenerativos está intimamente relacionado com deficiências na produção energética mitocondrial. Observou-se que o MeHg causou estresse oxidativo e diminuiu a atividade dos complexos da cadeia respiratória, além de inibir severamente a enzima creatina cinase, tanto em sistemas in vivo como in vitro. Desta forma, o MeHg prejudica a produção de ATP no cérebro, podendo ser uma das causas da neurodegeneração desencadeada por este toxicante. Para proteger das alterações causadas pelo MeHg, compostos de selênio tem sido usados, pois sabe-se que possuem alta afinidade por este toxicante. Desta forma, administramos dois compostos contendo selênio para proteger contra os efeitos causados pelo MeHg, o difenil disseleneto ((PhSe)2) e o selenito de sódio (Na2SeO3), e verificamos que principalmente o (PhSe)2 foi capaz de proteger contra os efeitos do MeHg in vivo. Por outro lado, o Na2SeO3 na dose utilizada foi potencialmente tóxico. Os dois compostos foram capazes de reduzir a deposição do mercurial no cérebro, provavelmente pela formação de um complexo HgSe. Para a leucina, observamos que esta altera a função da cadeia respiratória mitocondrial e impede a formação de memória, este último verificado por análise do LTP no hipocampo de animais injetados intrahipocampalmente com leucina, possivelmente sendo um dos mecanismos responsáveis pelo déficit neurológico em pacientes com a doença da urina de xarope de bordo. Concluindo, podemos observar que tantos toxicantes endógenos como exógenos compartilham de mecanismos que levam ao prejuízo no sistema nervoso central, tendo com um dos alvos a mitocôndria e o metabolismo energético.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2012
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A exposição ao metilmercúrio (MeHg) causa danos neurológicos severos em animais e humanos, no entanto, a fisiopatogenia de tais alterações ainda não está completamente elucidada. Desta forma, investigou-se o efeito da exposição oral ao MeHg em roedores sobre parâmetros comportamentais e bioquímicos, incluindo a fisiologia e morfologia mitocondrial. A exposição repetida (21 dias) ao MeHg (20 e 40mg/L) provocou um comprometimento da memória a curto prazo do tipo discriminativa, fato que foi evidenciado pela habilidade reduzida dos animais em reconhecer um novo objeto no seu ambiente familiar. Este prejuízo cognitivo correlacionou-se com deficiências bioenergéticas no sistema nervoso central (córtex cerebral) e na periferia (plaquetas), as quais foram manifestadas com redução nas atividades da NADH desidrogenase e complexos II e II-III, bem como da creatina cinase mitocondrial (mtCK), no córtex cerebral, e com um aumento no consumo de oxigênio em plaquetas de sangue periférico. Por outro lado, a análise de microscopia eletrônica mostrou uma redução na quantidade de mitocôndrias no córtex cerebral de animais intoxicados. Ainda, foi observado um predomínio de organelas tubulares, sugerindo que a morfologia mitocondrial estaria sendo controlada pelo processo de fusão. Para melhor entender o efeito tóxico do MeHg sobre a função mitocondrial, preparações de córtex cerebral de camundongos foram expostas ao mercurial (0-1500 µM). Este tratamento provocou aumento na produção de H2O2, inibição da redução do MTT e da atividade da NADH desidrogenase, e aumento na formação de lactato, sugerindo que a produção energética cerebral estaria comprometida na presença de MeHg. Considerando que estes tratamentos, in vivo e in vitro com MeHg, induziram disfunção mitocondrial e estresse oxidativo (inibição da enzima mtCK), procurou-se investigar os efeitos da coadministração do composto neuroprotetor difenil disseleneto - (PhSe)2 - (administração subcutânea; 5 µmol/kg) em animais intoxicados com MeHg. O tratamento com (PhSe)2 preveniu as alterações ultraestruturais e o efeito inibitório do mercurial sobre a atividade da mtCK em camundongos expostos ao MeHg. Assim, estes dados em conjunto, indicam que a intoxicação por MeHg compromete a viabilidade celular provavelmente por induzir estresse oxidativo mitocondrial, que posteriormente estimularia o processo de fusão mitocondrial a fim de conservar o status energético cerebral. Adicionalmente, a partir deste trabalho, pode-se propor que, por um lado, o comprometimento do consumo de oxigênio em plaquetas é um marcador sensível e não invasivo do prejuízo energético cerebral induzido pela intoxicação por MeHg, e por outro, que o uso de (PhSe)2 poderia prevenir os efeitos tóxicos deste mercurial orgânico.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017.
Made available in DSpace on 2017-06-27T04:20:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345982.pdf: 1452327 bytes, checksum: d8ebe7044b0f0d5ed2f77874dcef74c9 (MD5) Previous issue date: 2017
O Metilmercúrio (MeHg) é um poluente ambiental produzido por bactérias redutoras no ambiente aquático e bioacumulado na cadeia alimentar aquática. Logo, a principal fonte de exposição do homem ao MeHg ocorre pela ingestão de peixes e frutos do mar contaminados. Uma vez ingerido, o MeHg é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e causar efeitos deletérios ao sistema nervoso central (SNC). O SNC em desenvolvimento é mais susceptível às ações deletérias do MeHg em relação ao do adulto; enquanto que no adulto a exposição causa danos a áreas restritas do SNC, a exposição durante o desenvolvimento causa danos neurológicos mais difusos e generalizados e as consequências destes danos podem persistir até a vida adulta. Por outro lado, os pescados representam uma importante fonte de nutrientes, dentre os quais destacam-se os ácidos graxos poli-insaturados (AGPIs) do tipo ?-3, principalmente os ácidos docosahexaenóico (DHA) e o eicosapentaenoico (EPA), importantes constituintes do SNC. O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos dos AGPI do tipo ?-3 (DHA e EPA), presentes no óleo de peixe, na modulação da neurotoxicidade induzida pela exposição gestacional e lactacional ao MeHg em filhotes com 22 dias de vida e em adultos com 3 meses de idade. Além disto, investigou-se o efeito de uma segunda exposição ao MeHg em animais adultos expostos ao MeHg e/ou aos AGPIs ?-3 durante o desenvolvimento. Fêmeas prenhas de camundongos Swiss foram divididas em 4 grupos experimentais; o grupo i recebeu água potável e ração controle, o grupo ii recebeu solução de MeHg via água de beber e ração controle, o grupo iii recebeu água potável e ração enriquecida com óleo de peixe e o grupo iv recebeu a ração enriquecida com óleo de peixe e a solução de MeHg via água de beber. Os tratamentos foram veiculados durante os períodos gestacional e de lactação (totalizando 6 semanas). No 21º dia pós-natal (PN 21), os animais foram desmamados e 4 filhotes de cada ninhada foram separados para as análises comportamentais, bioquímicas e morfológicas. A coordenação motora dos animais foi prejudicada e a atividade hipocampal da enzima glutationa peroxidase (GPx) foi diminuida pela exposição ao MeHg e a dieta enriquecida com AGPIs ?-3 não foi capaz de reverter estes danos. O perfil lipídico plasmático e parâmetros de estresse oxidativo não foram afetados pelos tratamentos. A exposição perinatal (período de gestação e lactação) isolada à ração enriquecida com óleo de peixe aumentou a atividade do complexo mitocondrial I, sem alterar a atividade do complexo II. Já o imunoconteúdo de proteínas envolvidas na homeostase sináptica, histogênese e a imunomarcação para proteína fibrilar ácida glial (GFAP-gliose) não mostraram alterações significativas nos filhotes expostos perinatalmente ao MeHg e/ou ração enriquecida com óleo de peixe. O efeito a longo prazo do MeHg e/ou ração enriquecida com óleo de peixe foram avaliados em camundongos machos na vida adulta. Os animais foram alimentados com dieta padrão desde o desmame e, a partir da 10ª semana de vida, foram submetidos a uma segunda exposição ao MeHg via gavagem durante 14 dias. Após 24h do término do tratamento na vida adulta, os camundongos foram avaliados por testes comportamentais e, no dia seguinte, conduzida a eutanásia para coleta de sangue e a dissecção do cerebelo e hipocampo. A exposição perinatal ao MeHg per se causou prejuízo na locomoção e exploração e a dieta enriquecida com óleo de peixe combinada ao MeHg no período perinatal protegeu do dano locomotor em adultos. A exposição ao MeHg na fase adulta prejudicou a coordenação, locomoção e exploração, exceto nos animais que já haviam sido expostos perinatalmente ao MeHg, sugerindo uma possível adaptação a este toxicante. A exposição ao MeHg na vida adulta causou hipercolesterolemia nos animais, exceto nos camundongos expostos perinatalmente aos AGPIs ?-3 via dieta materna, sugerindo um efeito benéfico na vida adulta. Ainda, o tratamento com MeHg na fase adulta diminuiu a atividade da GPx cerebelar nos animais, exceto nos que já haviam sido tratados perinatalmente com MeHg. Por fim, a exposição concomitante ao MeHg e à ração enriquecida com óleo de peixe levou a um maior acúmulo de Hg no cerebelo a longo prazo e a reexposição ao MeHg na fase adulta, exacerbou esta resposta. Em conjunto, estes resultados indicam que a exposição perinatal ao MeHg e aos ácidos graxos ?-3 podem modular respostas a longo prazo e a susceptibilidade frente a uma nova exposição ao MeHg em animais adultos.

Abstract : Methylmercury (MeHg), an organic mercurial, is a well-known toxic compound present in the environment and originated though the methylation of inorganic mercury by sulfate-reducing bacteria in the aquatic environment. MeHg bioaccumulates and biomagnifies in the aquatic food chain; being the fish intake the main source of MeHg exposure. The central nervous system (CNS) is the primary target of MeHg toxicity and the developing brain is highly sensitive to MeHg exposure. Otherwise, fish and shellfish are important sources of several nutrients, such as n-3 fatty acids (PUFAs), particularly the eicosapentaenoic (EPA) and docosahexaenoic (DHA) acids, which play important role in the CNS during pre and postnatal development. We investigated the potential neuroprotective effects of an enriched diet with n-3 fatty acids against the neurotoxic effects of prenatal exposure to MeHg. Animals were exposedin utero until postnatal day (PND) 21 to both MeHg and n-3 fatty acids. Moreover, an additional group received a second MeHg-exposure during adulthood (PND 84). Pregnant mice (GD 1) were randomly settled in 4 experimental groups: (i) Control (tap water and standard chow); (ii) MeHg (diluted in the water); (iii) n-3 enriched diet (tap water and a fish oil enriched-chow) and (iv) n-3+MeHg (a fish oil enriched-chow + MeHg diluted in the water). Treatments were performed throughout gestational and lactation periods (GD 1 to PND 21) and offspring were weaned at PND 21. Twenty-four hours after weaning (PN 22), pups were evaluated through behavioral tests, biochemical, histological and immunohistochemical analyzes. Motor coordination and hippocampal glutathione peroxidase (GPx) activity were impaired by MeHg exposure during development and n-3 enriched-diet was not able to protect these alterations. Perinatal exposure to n-3 enriched-diet per se increased the activity of the mitochondrial complex I, but did not change the activity of complex II. To analyze the long-lasting neurotoxic effects of exposure to MeHg during development and to evaluate the second exposure in the adulthood to MeHg an additional group were made. The animals from each litter were fed with standard diet until PND 70, whereas half of the animals were submitted to a second exposure to MeHg via gavage for 14 days (until PN 84). Twenty-four hours after the last gavage, the adult mice were evaluated by behavioral tests and, on the next day, euthanasia was performed for blood collection and the cerebellum and hippocampal structures were removed for biochemical analyses. Exposure to MeHg during development caused a long-lasting impairment in locomotion and exploration and exposure to n-3 enriched-diet prevented these alterations in adult mice. Exposure to MeHg during adulthood impaired coordination, locomotion and exploration, except in animals that had been exposed previously to MeHg during development, suggesting a possible adaptation to this effect. Interesting, acute exposure to MeHg in adult mice caused hypercholesterolemia, except in mice exposed during the development to n-3 acids via maternal diet, suggesting a long-lasting beneficial effect. Moreover, MeHg treatment to mice during adulthood reduced the activity of cerebellar GPx, except in those animals that had already been exposed perinatally to MeHg. Finally, prenatal exposure to MeHg combined with the n-3-enriched diet increased cerebellar Hg accumulation in adult mice and a second exposure to MeHg exacerbated this effect. Taken together, these results indicate that perinatal exposure to MeHg and n-3 fatty acids may promote a long-lasting behavioral and biochemical modulation on responses and susceptibility to an adult exposure to MeHg in adult animals.

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Dissertacao (Mestrado)
IPEN/D
Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN/CNEN-SP

Orientador: Nádia Regina do Nascimento
Coorientador: Emmanuel Fritsch
Banca: Cristiane Valéria de Oliveira
Banca: Marcelo de Oliveira Lima
Banca: Daniel Marcos Bonotto
Banca: Célia Regina Montes
Resumo: A bacia do Rio Negro é um ecossistema que, independentemente de atividade antrópica, possui regiões com quantidades expressivas de mercúrio (Hg) no solo e na água. Alguns estudos demonstraram que elevadas concentrações desse elemento químico ocorrem principalmente nos solos podzolizados. Assim, esse trabalho teve como objetivo estudar a origem e a dinâmica do Hg em dois diferentes sistemas de alteração e pedogênese - Latossolo-Espodossolo - em regiões isentas de impactos da bacia do Rio Negro, Amazonas. Pesquisas de campo e laboratório forneceram dados morfológicos, químicos, físicos e mineralógicos dos sítios estudados. O Hg foi quantificado por frações granulométricas e na fração total do solo (HgT), além de ser analisado por termodessorção. O metilmercúrio e o Hg potencialmente móvel e tóxico foram determinados em amostras representativas dos perfis estudados. Os resultados mostraram que o processo de hidratação mineral ao longo dos Latossolos, que é seguido por um empobrecimento em elementos finos (minerais de argila e óxidos bem cristalizados), contribuiu para uma importante concentração de HgT nos horizontes B dos perfis lateríticos empobrecidos. Além disso, esses perfis possuem a maior quantidade de Hg potencialmente móvel e tóxico (biodisponível), porém menor quantidade relativa de metilmercúrio. Nos Espodossolos, a tendência observada foi de alta concentração do Hg nos perfis da frente de podzolização (transição entre Latossolos e Espodossolos), nos horizontes Bhs e, principalmente, nos horizontes Bh. Nesses horizontes, o mercúrio se apresenta essencialmente na forma semi-móvel e/ou imóvel e o metilmercúrio sofre significativa diminuição. O cálculo do fator do balanço de massa apresentou valores muito superiores a 1, apontando para um alto ganho relativo de HgT no solum das coberturas lateríticas empobrecidas e nos horizontes Bhs e Bh dos Espodossolos
Abstract: The Negro River Basin is an ecosystem that has regions with very expressively quantities of mercury in soil and water, even in natural systems. Some studies showed that high concentrations of chemical element occur mainly in podzolized soils. Therefore, the aim of this work was to study the origin and the dynamics of Hg in two differents Oxisol - Spodosol systems in the Negro River Basin. Field work and laboratory provided chemical, physical and mineralogical data of the studied sites. The total mercury (HgT) in soil was measured and further examined by thermodesorption. The methylmercury and the potentially mobile and toxic mercury were determined in representative samples. The results showed that the hydration process over Oxisols, which is followed by an impoverishment of the fine elements (clay minerals and well crystallised oxides), contributes to an important concentration of HgT in the B horizons of lateritics profiles. In addition, these profiles have the greatest amount of potentially mobile and toxic mercury, but less amount of methylmercury. In Spodosols, the trend is the high concentration of Hg in the profiles of the podzolization front, in the Bhs horizons and, mainly, in the Bh horizons. In these horizons, the mercury is essentially semi-mobile and/or non mobile and the methylmercury has significant decrease. The mass balance factor presents values higher than 1 and point to a high gain of the HgT in the solum of lateritics soils impoverished, as well in Bhs and Bh horizons of the Spodosols
Doutor

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2007
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Efeitos neurotóxicos do metilimercúrio sobre os parâmetros comportamentais (relacionados à locomoção) e bioquímicos (relacionados ao estresse oxidativo) em modelos experimentais com camundongos adultos. Susceptibilidade sexo-dependente e potencial efeito protetor dos estrógenos.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2017.
Made available in DSpace on 2017-09-05T04:12:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 348185.pdf: 6307419 bytes, checksum: 976aebbc8c18a6da3525304afb32e542 (MD5) Previous issue date: 2017
Inosina é um nucleosídeo purinérgico endógeno, formada a partir da adenosina, em uma reação catalisada pela enzima adenosina deaminase. Já foram descritos efeitos antinociceptivos, anti-inflamatórios, neuroprotetores e antidepressivos para inosina, que podem estar associados à ativação de receptores de adenosina. Contudo, existem poucas evidências na literatura relacionando às vias de sinalização intracelular envolvidas nesses efeitos, bem como de outros mecanismos neuroquímicos associados aos efeitos dessa purina. Baseado nisso, o presente trabalho investigou alguns dos mecanismos associados aos efeitos tipo-antidepressivo de inosina em camundongos e no efeito neuroprotetor da inosina in vitro. Primariamente, um dos objetivos desse trabalho foi investigar a modulação de vias de sinalização intracelular e de receptores glutamatérgicos no efeito tipo-antidepressivo de inosina, através do teste da suspensão pela cauda (TSC), e na atividade locomotora, através do teste do campo aberto (TCA). Adicionalmente, foi verificado o efeito da administração de inosina sobre o imunoconteúdo e fosforilação (ser-133) do fator de transcrição CREB, imunoconteúdo das proteínas sinápticas PSD95 e sinapsina I, bem como da subunidade GluA1 do receptor glutamatérgico AMPA e A1 e A2A dos receptores de adenosina. Nenhum dos tratamentos alterou a locomoção dos animais no TCA. Inosina administrada pela via intraperitoneal (i.p.) induziu um efeito antiimobilidade no TSC nas doses de 1 mg/kg e 10 mg/kg. O efeito tipoantidepressivo de inosina foi abolido pelo pré-tratamento dos animais com U0126 [inibidor de MEK, 5µg/sítio administrado pela via intracerebroventricular (i.c.v.)], KN-62 (inibidor de CaMKII, 1µg/sítio, i.c.v.), H-89 (inibidor de PKA, 1µg/sítio, i.c.v.), wortmanina (inibidor de PI3K, 0,1µg/sítio, i.c.v.), rapamicina (inibidor de mTORC1, 0,2nmol/sítio, i.c.v.), NMDA [agonista dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (NMDAR) 0,1pmol/sítio, i.c.v.] e D-serina (coagonista de NMDAR, 30µg/sítio, i.c.v.). Também foi observado um efeito tipoantidepressivo sinérgico entre doses sub-efetivas de inosina (0,1 mg/kg, i.p.) e AR-A014418 (inibidor de GSK-3b, 0,001µg/sítio, i.c.v.), cetamina (antagonista NMDAR, 0,1 mg/kg, i.p.) ou MK-801 (antagonista NMDAR, 0,001 mg/kg, administrado por gavagem). Contudo, o pré-tratamento com DNQX (antagonista dos receptores AMPA, 2,5 µg/sítio, i.c.v.), não alterou o efeito anti-imobilidade de inosina (10 mg/kg, i.p.). No período de 24 h após a administração de inosina (10 mg/kg, i.p.) foi verificado um aumento de fosforilação de CREB no hipocampo dos animais, sem alterações no imunoconteúdo de CREB nessa estrutura, ou na fosforilação e imunoconteúdo no cortéx pré-frontal (CPF). Também não foram verificadas alterações na fosforilação e imunoconteúdo de CREB no CPF e hipocampo 30 minutos após a administração de inosina. Adicionalmente, não foram encontradas alterações no imunoconteúdo de PSD95, GluA1, sinapsina I e dos receptores A1 e A2A de adenosina no hipocampo e CPF 30 min e 24 horas após a administração de inosina. Esses resultados demonstram o envolvimento da inibição de NMDAR e GSK-3b e da ativação de MEK/ERK 1/2, CaMKII, PKA, PI3K/AKT e mTORC1 no efeito tipo-antidepressivo de inosina. Notavelmente, uma única dose de inosina foi capaz de induzir um aumento na fosforilação de CREB no hipocampo. Outro objetivo desse trabalho envolveu o estudo do potencial neuroprotetor da inosina contra a morte celular induzida por metilmercúrio (MeHg) em cultura primária de astrócitos corticais provenientes de ratos neonatos. O co-tratamento com inosina (50-1000µM) e MeHg (5 µM) por 6 h preveniu a redução na viabilidade celular induzido por esse toxicante, avaliada pelo método de redução do MTT. Não foram verificados efeitos protetores após o co-tratamento por 24 h, mas foi observado um efeito protetor após o pré-tratamento com inosina (50-1000µM) por 24 h seguido do co-tratamento com inosina nas mesmas concentrações e MeHg (5 µM) por 24 h adicionais. O tratamento das culturas celulares com inosina (500 µM) por 6 h, também preveniu o aumento na geração de espécies reativas de oxigênio induzidos por MeHg (5 µM) avaliado pela sonda H2DCFDA. Contudo, não foram verificadas alterações nos níveis de glutationa total e reduzida induzidos pelos tratamentos com inosina e/ou MeHg. O tratamento com inosina estimulou a expressão do RNAm para NQO-1, Nrf2 e BDNF além de aumentar o imunoconteúdo de Nrf2 no núcleo celular. Também foi verificado um aumento transitório na fosforilação de AKT (ser-473) por inosina (500 µM), e o prétratamento com wortmanina (1 µM) preveniu o efeito neuroprotetor de inosina (500 µM) frente à neurotoxicidade do MeHg (5 µM). Não foram verificadas alterações na fosforilação de ERK1/2 após o tratamento com inosina e o prétratamento com U0126 (10 µM) não preveniu o efeito neuroprotetor dessa purina. Adicionalmente, o efeito neuroprotetor de inosina (500 µM) foi prevenido pelo pré-tratamento com MRS1523 (antagonista dos receptores A3 de adenosina, 1µM), mas não foram verificadas alterações pelo pré-tratamento com PSB36, (antagonista dos receptores A1 de adenosina, 10 nM) ou pelo pré-tratamento com SCH58261, (antagonista dos receptores A2A de adenosina, 100 nM). Assim, esses resultados indicam que inosina pode exercer um efeito protetor contra a toxicidade induzida por MeHg em astrócitos, possivelmente ativando o receptor A3 de adenosina e a sinalização de PI3K/AKT, além da ativação do fator de transcrição Nrf2. Em conjunto, os resultados desse trabalho demonstram novos mecanismos moleculares referentes aos efeitos antidepressivos e neuroprotetores de inosina, ressaltando a participação do sistema purinérgico em diferentes processos no sistema nervoso central.

Abstract : Inosine is an endogenous purinergic nucleoside formed by the adenosine breakdown in a reaction catalyzed by the enzyme adenosine deaminase. It has been reported antinociceptive, anti-inflammatory, neuroprotective, and antidepressant effects for inosine that may occur through adenosine receptors activation. However, there is little evidence regarding the signaling pathways and others neurochemical mechanisms associated to the effects elicited by this purine. The present study investigated the neurochemical mechanisms associated to inosine antidepressant-like and neuroprotective effects. First, it was investigated, in adult mice, the participation of intracellular signaling pathways and glutamatergic receptors on the inosine antidepressant-like effect, evaluated by tail suspension test (TST) and the locomotor activity was evaluated by the open field test (OPT). Moreover, the effect of inosine administration in the phosphorylation levels and imunocontent of the transcription factor CREB and the imunocontent of synaptic proteins PSD95 and synapsin-I, as well as GluA1 subunit of AMPA receptor and A1 and A2A adenosine receptors was also evaluated. None of the treatments changed the locomotor activity in the OPT. Inosine administered by the intraperitoneal route (i.p.) in the doses of 1 and 10 mg/kg induced an antidepressant-like effect in the TST. The anti-immobility effect of inosine was prevented by pre-treatment of mice with U0126 [MEK inhibitor, 5µg/site administered by intracerebroventricular route (i.c.v.)], KN-62 (CaMKII inhibitor, 1µg/site, i.c.v.), H-89 (PKA inhibitor, 1µg/site, i.c.v.), wortmanin (PI3K inhibitor, 0.1µg/site, i.c.v.), rapamycin (mTORC1 inhibitor, 0.2 nmol/site, i.c.v.), NMDA [agonist of NMDA glutamatergic receptors (NMDAR) 0.1 pmol/site, i.c.v.] and D-serine (NMDAR co-agonist, 30µg/site, i.c.v.). It was also observed a synergic antidepressant-like effect elicited by subeffective doses of inosine (0.1mg/kg, i.p.) and AR-A014418 (GSK-3b inhibitor, 0.001µg/site, i.c.v.), ketamine (NMDAR antagonist, 0.1 mg/kg, i.p.), MK-801 (NMDAR antagonist, 0.001 mg/kg, administered by gavage). However, the pretreatment with DNQX (AMPA receptors antagonist, 2.5 µg/site, i.c.v.), did not changed inosine antidepressant-like effect (10 mg/kg, i.p.). 24 h after inosine administration (10 mg/kg, i.p.) an increase in CREB phosphorylation without alterations in CREB imunocontent was found in mice hippocampus. No alterations in CREB imunnocontent and phosphorylation were found 30 minutes after the administration of inosine. Furthermore, the imunocontent of synaptic proteins (PSD95, GluA1 and synapsin-I), as well as A1 and A2A adenosine receptors, was not altered 30 min and 24 h after inosine administration. These results suggest the participation of NMDAR and GSK-3b inhibition, and MEK/ERK 1/2, CaMKII, PKA, PI3K/AKT and mTORC1 activation in the antidepressant-like effect of inosine in the TST. Moreover, a single administration of inosine was able to induce an increase in CREB phosphorylation in the hippocampus. Another aim of the study was to determine the neuroprotective effect of inosine against methylmercury (MeHg) toxicity in cortical astrocyte primary culture from newborn rats. The co-treatment with inosine (50-1000µM) and MeHg (5 µM) for 6 h prevented the decrease in cell viability induced by MeHg. No protection was observed after the co-treatment with inosine (50-1000µM) and MeHg (5 µM) for 24 h, but a neuroprotective effect, assessed by MTT reduction method, was observed after inosine pretreatment (50-1000µM) for 24 h followed by co-treatment with inosine (in the same concentrations) and MeHg (5 µM) for additional 24 h. Inosine (500 µM) prevented the increase in the oxygen reactive species generation (evaluated by H2DCFDA probe) induced by MeHg (5 µM) for 6 hours, but no changes in the reduced and total glutathione levels were observed. Inosine treatment (500 µM) also induced an increase in NQO-1, Nrf2, BDNF mRNA expression and Nrf2 immunocontent in cell nucleus. It was also observed a transient increase in AKT (ser-473) phosphorylation induced by this purine, and wortmanin pre-treatment (1 µM) prevented the inosine neuroprotective effect. No alterations were observed in ERK 1/2 phosphorylation after the treatment with inosine and the neuroprotective effect of this purine was not prevented by the pre-treatment with U0126 (10 µM). Additionally, the neuroprotection elicited by inosine was prevented by MRS1523 (A3 adenosine receptor antagonist, 1µM), but no changes were observed after the pre-treatment with PSB36 (A1 adenosine receptor antagonist, 10 nM) nor SCH58261 (A2A adenosine receptor antagonist). These results indicated that inosine induced a neuroprotective effect against MeHg in astrocytes that may occur by A3 adenosine receptor and PI3K/AKT activation, and this purine can also activate Nrf2. Taken together, our results showed new mechanisms for inosine antidepressant and neuroprotective effects, reinforcing the participation of the purinergic system in various processes in the central nervous system.

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-04-10. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:21Z : No. of bitstreams: 1 000856765.pdf: 1392951 bytes, checksum: d1210e55adff036e81b754cf61c07e1b (MD5)
Neste trabalho foi desenvolvido um método para determinação seletiva e in situ do metilmercúrio (MeHg) com o uso técnica da técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT- diffusive gradients in thin films) e, também usando a DGT, avaliou-se um método já desenvolvido (baseado no uso da membrana P81) para a determinação de mercúrio (II). Para amostragem da espécie MeHg foi usado um disco ligante baseado no uso da Saccharomyces cerevisiae (levedura) - 20% (m/v) - imobilizada em agarose 3%, o gel de poliacrilamida como meio difusivo (S + P) e o acetato de celulose como membrana filtrante. A membrana de troca catiônica P81 e o gel difusivo de agarose (P81 + A) foram usados na determinação de mercúrio (II). Os dispositivos DGT montados com as três camadas foram imersos em soluções preparadas no laboratório com concentrações conhecidas de MeHg (e/ou Hg (II)). Determinou-se o coeficiente de difusão médio do MeHg (7,03 ± 0,77 x 10-6 cm2 s-1 a 23 ºC) na poliacrilamida. Posteriormente foram avaliados os principais parâmetros que afetam o desempenho da técnica: na faixa de pH 3,5 e 8,5 e força iônica (I), entre, 0,0005 mol L-1 a 0,1 mol L-1 NaCl. As recuperações obtidas de (84 - 98 %) e (84 - 105 %) do analito, no intervalo de pH e I estudadas, indicaram que o método pode ser utilizado em sistemas aquáticos que satisfaçam estas condições. Foram avaliadas também interferências devido à presença de alguns íons concomitantes. Os íons Mn, Cu, Zn, Fe(II) não afetaram a retenção do MeHg pelo ligante, com recuperações de (70 - 87 %). A retenção do ligante S. cerevisiae foi menos tolerável à presença de Pb e Cd com recuperações de (62 ± 5 %) e (54 ± 6 %). O método desenvolvido foi aplicado in situ no Rio Negro (Manaus-AM) no entorno da refinaria de petróleo Isaac Sabbá (Reman). Determinou-se as concentrações medias de MeHg e Hg (II) no local pela técnica DGT. Os resultados...
An in situ method for selective determination of methylmercury (MeHg) was developed in this work by using the diffusive gradients in thin films (DGT) technique. This method was used together with an already evaluated DGT method, based on the use of P81 cationic membrane as binder for determination of mercury (II). To determine MeHg species, it was used a binder disk of Saccharomyces cerevisiae (yeast) - 20% (w / v) - immobilized on agarose 3%, polyacrylamide diffusive layers (S + P) and acetate of cellulose as a filter membrane. The P81 cationic membrane and the diffusion agarose gel (P81 + A) were used for the determination of mercury (II). The DGT devices assembled with the previously described layers were deployed in solutions prepared in laboratory, with known concentrations of MeHg (and / or Hg2+).The average MeHg diffusion coefficient obtained for polyacrylamide equals to 7.03 ± 0.77 x 10-6 cm2 s-1 at 23 °C. It was evaluated the main parameters that affect the technical performance: pH (3.5 - 8, 5) and ionic strength (I) (0.0005 mol L-1 to 0.1 mol L-1 NaCl). The analyte recoveries obtained for the pH range studied (84 - 98%) and I (84 - 105%) indicated that the method can be used in aquatic systems which meet these conditions. The effect of interference due to simultaneous presence of ions was also evaluated. Mn, Cu, Zn, Fe (II) did not affect the retention of MeHg by the binder (70 - 87% recoveries). However, the binder layer was less tolerable to presence of Pb and Cd, noticiable by lower recoveries of 62 ± 5% and 54 ± 6%, respectively. The developed method was applied in situ in Rio Negro (Manaus-AM), nearby the oil refinery Isaac Sabbá (Reman). The average concentrations of MeHg and Hg (II) were determined and the results obtained by DGT on site were (< 0,025 μgL-1) and (< 0,085 μgL-1), respectively

Orientador: Amauri Antonio Menegário
Banca: Carlos Alfredo Suarez
Banca: Marco Tadeu Grassi
Resumo: Neste trabalho foi desenvolvido um método para determinação seletiva e in situ do metilmercúrio (MeHg) com o uso técnica da técnica de difusão em filmes finos por gradiente de concentração (DGT- diffusive gradients in thin films) e, também usando a DGT, avaliou-se um método já desenvolvido (baseado no uso da membrana P81) para a determinação de mercúrio (II). Para amostragem da espécie MeHg foi usado um disco ligante baseado no uso da Saccharomyces cerevisiae (levedura) - 20% (m/v) - imobilizada em agarose 3%, o gel de poliacrilamida como meio difusivo (S + P) e o acetato de celulose como membrana filtrante. A membrana de troca catiônica P81 e o gel difusivo de agarose (P81 + A) foram usados na determinação de mercúrio (II). Os dispositivos DGT montados com as três camadas foram imersos em soluções preparadas no laboratório com concentrações conhecidas de MeHg (e/ou Hg (II)). Determinou-se o coeficiente de difusão médio do MeHg (7,03 ± 0,77 x 10-6 cm2 s-1 a 23 ºC) na poliacrilamida. Posteriormente foram avaliados os principais parâmetros que afetam o desempenho da técnica: na faixa de pH 3,5 e 8,5 e força iônica (I), entre, 0,0005 mol L-1 a 0,1 mol L-1 NaCl. As recuperações obtidas de (84 - 98 %) e (84 - 105 %) do analito, no intervalo de pH e I estudadas, indicaram que o método pode ser utilizado em sistemas aquáticos que satisfaçam estas condições. Foram avaliadas também interferências devido à presença de alguns íons concomitantes. Os íons Mn, Cu, Zn, Fe(II) não afetaram a retenção do MeHg pelo ligante, com recuperações de (70 - 87 %). A retenção do ligante S. cerevisiae foi menos tolerável à presença de Pb e Cd com recuperações de (62 ± 5 %) e (54 ± 6 %). O método desenvolvido foi aplicado in situ no Rio Negro (Manaus-AM) no entorno da refinaria de petróleo Isaac Sabbá (Reman). Determinou-se as concentrações medias de MeHg e Hg (II) no local pela técnica DGT. Os resultados...
Abstract: An in situ method for selective determination of methylmercury (MeHg) was developed in this work by using the diffusive gradients in thin films (DGT) technique. This method was used together with an already evaluated DGT method, based on the use of P81 cationic membrane as binder for determination of mercury (II). To determine MeHg species, it was used a binder disk of Saccharomyces cerevisiae (yeast) - 20% (w / v) - immobilized on agarose 3%, polyacrylamide diffusive layers (S + P) and acetate of cellulose as a filter membrane. The P81 cationic membrane and the diffusion agarose gel (P81 + A) were used for the determination of mercury (II). The DGT devices assembled with the previously described layers were deployed in solutions prepared in laboratory, with known concentrations of MeHg (and / or Hg2+).The average MeHg diffusion coefficient obtained for polyacrylamide equals to 7.03 ± 0.77 x 10-6 cm2 s-1 at 23 °C. It was evaluated the main parameters that affect the technical performance: pH (3.5 - 8, 5) and ionic strength (I) (0.0005 mol L-1 to 0.1 mol L-1 NaCl). The analyte recoveries obtained for the pH range studied (84 - 98%) and I (84 - 105%) indicated that the method can be used in aquatic systems which meet these conditions. The effect of interference due to simultaneous presence of ions was also evaluated. Mn, Cu, Zn, Fe (II) did not affect the retention of MeHg by the binder (70 - 87% recoveries). However, the binder layer was less tolerable to presence of Pb and Cd, noticiable by lower recoveries of 62 ± 5% and 54 ± 6%, respectively. The developed method was applied in situ in Rio Negro (Manaus-AM), nearby the oil refinery Isaac Sabbá (Reman). The average concentrations of MeHg and Hg (II) were determined and the results obtained by DGT on site were (< 0,025 μgL-1) and (< 0,085 μgL-1), respectively
Mestre

En los últimos años ha habido un creciente interés en la utilización de métodos "in vitro" para la detección del potencial tóxico de compuestos químicos que contribuyan en remplazar, reducir y reformar el uso de animales en experimentación. Distintas organizaciones nacionales e internacionales están trabajando en el desarrollo y la validación de métodos "in vitro" que proporcionen el mismo nivel de información que los modelos in vivo. Se estima que entre el 3-28 % de los compuestos químicos existentes son potencialmente neurotóxicos. Respondiendo a la necesidad de impulsar la utilización de métodos "in vitro" en el campo de la neurotoxicología, el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (ECVAM) propuso la elaboración de una base de datos de métodos alternativos para la detección de compuestos químicos potencialmente neurotóxicos.

Los objetivos planteados en este trabajo contemplan estudios bibliométricos y experimentales para (1) la creación de una bases de datos de métodos "in vitro" para la detección de compuestos químicos potencialmente neurotóxicos, (2) para la caracterización de proteínas y la identificación de marcadores de toxicidad mediante herramientas proteómicas utilizando como modelo celular cultivos primarios de células granulares de cerebelo de ratón y como agente tóxico el metilmercurio y (3) la evaluación de los mecanismos de muerte y neuroprotección de células granulares de cerebelo expuestos a metilmercurio.

Tras un estudio bibliométrico, se propusieron 6 métodos in vitro para evaluar el potencial tóxico de compuestos químicos capaces de producir axonopatías y neuropatías retardadas, de alterar la transmisión nerviosa a través de los receptores GABAA, de los canales de sodio dependientes de voltaje y de los receptores ionotrópicos de glutamato, y de la utilización de los cultivos reagreagados de cerebro como modelo celular para la evaluación de neurotoxicidad en general. Estos métodos proporcionan información útil para una futura validación de los mismos (consultable en ecvam-dbalm.jrc.cec.eu.int).

El metilmercurio (MeHg) es un contaminante ambiental con toxicidad selectiva para el SNC y en particular para las células granulares de cerebelo. El análisis proteómico de extractos proteicos procedentes de cultivos primarios de células granulares de cerebelo de ratón expuestos de forma prolongada a concentraciones subcitotóxicas de metilmercurio permitió identificar dos proteínas, la succinil CoA:3-cetoácido-CoA-transferasa I y la isoforma no muscular de la cofilina, cuya expresión disminuyó e incrementó en presencia de metilmercurio, respectivamente. La exposición prolongada de los cultivos primarios de células granulares de cerebelo a MeHg produce una muerte neuronal apoptótica tiempo y concentración dependiente que cursa por mecanismos no excitotóxicos, independientes de la activación de caspasa 3 y parcialmente dependientes de la liberación de la proteasa lisosomal catepsina D. Además la exposición a MeHg produjo un incremento de la peroxidación lipídica. En nuestro modelo experimental la muerte neuronal fue protegida por antioxidantes de amplio espectro hecho que sugiere que la muerte podría deberse al incremento de ROS intracelular.
"Evaluation and development of alternative methods for prediction of neurotoxicity. Proteomic approach to methylmercury induced neurotoxicity":

In the last years there has been a growing interest in using "in vitro" methods to detect toxic potentially chemical compounds, contributing in replacement, reduction and refinement animal use in life science research. Several organizations are working together to develop and validate alternative methods. Responding to the necessity to promote alternative methods in the neurotoxicity field, European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) proposed the elaboration of an alternative methods database to detect chemical compounds potentially neurotoxic.

The goals of this thesis include both bibliographic and experimental studies to (1) create a database for "in vitro" methods to detect neurotoxic chemical compounds, (2) to identify toxic biomarkers by using proteomics techniques in primary cultures of mouse cerebellar granule cells exposed to methylmercury (MeHg) and (3) to evaluate cell death and neuroprotection mechanisms involved in long-term MeHg toxicity in primary cultures of mouse cerebellar granule cells.

As a result of the bibliographic study, 6 "in vitro" methods were proposed to evaluate neurotoxic potency of chemical compounds capable to produce axonopaties and delayed neuropaties, to affect neurotransmission through GABAA receptors, voltage dependent sodium channels or ionotropic glutamate receptors, or to produce neuronal and glial neurotoxicity. All this methods supplied useful information to a future method validation (now available in ecvam-dbalm.jrc.cec.eu.int).

Methylmercury is an environmental contaminant with special toxicity to Central Nervous System (SNC) and in particular to cerebellar granule cells. A proteomic approach revealed that long-term MeHg exposure to primary cultures of cerebellar granule cells induced a subexpression of succinilCoA:3-ketoacidCoA transferase I (SCOT), enzyme implicated in the ketone body catabolism, and an overexpression of non-phosphorylated cofilin, an actin binding protein involved in the regulation of actin dynamics. On the other hand, long-term MeHg exposure to primary cultures of cerebellar granule neurons produced time- and concentration-dependent apoptotic cell death. This cell death was not an excitotoxic death and was independent of caspasse 3 activation but was partially dependent of lysosomal cathepsin D. Moreover, MeHg exposure produced an increased in lipid peroxidation. In this experimental model, neuronal cell death was protected by antioxidants of wide spectrum, suggesting that this apoptotic cell death could be due to the increased of intracellular reactive oxygen species (ROS).

Los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), especialmente el Omega 3 y 6 se encuentran en grandes cantidades en el aceite de Plukenetia volubilis L. “Sacha Inchi”, estos PUFAS se trasforman en el organismo en DPA, DHA y ARA respectivamente, estos son componentes estructurales importantes en SNC y participan en su desarrollo. Numerosos trabajos concluyen que la dieta suplementada con PUFAs reducen la neurotoxicidad del metilmercurio. El presente trabajo busca evaluar el efecto neuroprotector del aceite de Plukenetia volubilis L. “Sacha Inchi” sobre la neurotoxicidad inducida por metilmercurio (MeHg) en ratas crías expuestas durante el periodo de gestación y lactancia. Para ello se utilizaron ratas nulíparas separadas aleatoriamente en cinco grupos: N°1(DMSO), N°2 (DMSO + aceite de Plukenetia volubilis L. a una dosis de 2 mL/Kg/día), N°3 (DMSO + MeHg a una dosis de 0,75 mg/Kg/día + aceite de Plukenetia volubilis L. a una dosis de 2 mL/Kg/día), N°4 (DMSO + MeHg a una dosis de 0,75 mg/Kg/día + aceite de Plukenetia volubilis L. a una dosis de 4 mL/Kg/día) y el N°5 DMSO + MeHg a una dosis de 0,75 mg/Kg/día). El MeHg y DMSO se administraron en el agua de bebida y el aceite de Plukenetia volubilis L. “sacha inchi” por vía Orogástrica. Con los objetivo de evaluar la capacidad de aprendizaje las ratas crías con tres meses de edad se sometieron al test de discriminación condicional en un laberinto en Y, para evaluar el daño tisular se utilizó la técnica de fijación del cerebelo en parafina con Eosina – Hematoxilina y el estrés oxidativo se evaluó midiendo el MDA utilizando la técnica del TBARs. Todos los resultados tienen significancia estadística y demuestran que la dieta suplementada con aceite de Plukenetia volubilis L. “sacha inchi” disminuye los efectos tóxicos del Metilmercurio en la capacidad de aprendizaje, daño tisular y estrés oxidativo.
Polyunsaturated fatty acids (PUFAs), especially Omega 3 and 6 are found in large quantities in the oil Plukenetia volubilis L. "Sacha Inchi" these PUFAs are transformed in the body in DPA, DHA and ARA, respectively, are structural components important in CNS and participate in its development. Numerous studies conclude that the diet supplemented with PUFAs reduce the neurotoxicity of methylmercury. This paper evaluates the neuroprotective effect of Plukenetia volubilis L. "Sacha Inchi" oil on methylmercury-induced neurotoxicity in offspring exposed during periods of pregnancy and lactation rats. Neurotoxicity was induced by methylmercury chloride (MeHgCl). For this, nulliparous rats were randomly separated into five groups: No. 1 (DMSO), No. 2 (DMSO + L. Plukenetia volubilis oil 2 ml / kg / day), No. 3 (DMSO + 0.75 mg MeHgCl / Kg / day + L. Plukenetia volubilis oil 2 ml / kg / day), No. 4 (DMSO + MeHgCl 0.75 mg / Kg / day + L. Plukenetia volubilis oil 4 mL / kg / day) and No. 5 MeHgCl DMSO + 0.75 mg / kg / day). The MeHgCl and DMSO were administered in the drinking water and Plukenetia volubilis L. "sacha inchi" oil by orogastric via. With the aim of evaluating the learning ability of rats offspring with three months , In this study they were underwent with the conditional discrimination test in a Y maze, in order to assess tissue damage clamping technology cerebellum was used in paraffin eosin - hematoxylin and oxidative stress was evaluated by measuring MDA using TBARs technique. All results are statistically significant and show that diet supplemented with Plukenetia volubilis L. "sacha inchi" oil reduces the toxic effects of methylmercury in learning ability, tissue damage and oxidative stress. Keywords: oil Plukenetia volubilis L., sacha inchi, Methylmercury, neurotoxicity, neuroprotection, learning, pregnancy and lactation.
Tesis

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências
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Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2016.
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A neurotoxicidade do metilmercúrio (MeHg) em indivíduos adultos é relativamente conhecida, contudo são escassos os trabalhos que analisam os estudos sobre a ação desse metal em duas estruturas do SNC durante o desenvolvimento. Este trabalho teve como objetivo relacionar os efeitos do MeHg sobre a organização estrutural e ultraestrutural do mesencéfalo e cerebelo, bem como identificar sua ação nos processos de proliferação e diferenciação celular, utilizando como modelo experimental embriões de Gallus domesticus. Os embriões foram tratados in ovo no 3° dia de incubação (E3) com uma única dose de metilmercúrio (MeHg) (0,1 µg diluído em 50 µL de salina) e analisados no 10° dia de incubação (E10). Os embriões do grupo controle foram tratados somente com 50 µL de solução salina.As análises morfológicas e morfométricas do mesencéfalo e cerebelo foram realizadas a partir de secções histológicas coradas com HE. A quantificação e imunolocalização de proteínas relacionados ao ciclo celular (ciclina E; p21 e p53), diferenciação celular (NeuN; TubulinaIII e GFAP), proliferação celular (fosfohistona H3) e dano ao DNA(?PH2Ax), bem como relacionados a dinâmica mitocondrial (Drp-1 eMfn-1) foram obtidos a partir de técnicas de imuno-histoquímica e citometria de fluxo. Foram realizados ensaios de detecção do MeHg através do espectrofotômetro de absorção atômica e análises por microscopia eletrônica de transmissão, para investigar alterações ultraestruturais. Os resultados mostraram deposição de Hg no mesencéfalo e cerebelo. A exposição ao MeHg provocou aumento da expressão da p21 no mesencéfalo e p53 no cerebelo, e significativa redução da expressão da ciclina E e de fosfohistona H3, sugerindo parada no ciclo celular e da proliferação celular. No grupo tratado foram observadas alterações ultraestruturais, sendo as mais evidentes nas mitocôndrias das células do mesencéfalo e principalmente do cerebelo. Os insultos ao ciclo e a estrutura celular alteraram os processos de diferenciação, provocando uma diminuição no número das células das linhagens neural e glial. Este estudo revelou que os insultos do MeHg no cerebelo foram mais severos do que no mesencéfalo, demonstrando que a toxicodinâmica do MeHg é dependente do período do desenvolvimento, podendo comprometer funções importantes para a sobrevivência do embrião.

Abstract : Neurotoxicity of Methylmercury (MeHg) has been studied for years, but their relationship with the development of two CNS structures (midbrain and cerebellum) is highly unusual. This study aimed to analyze the effects of MeHg in the structural and ultrastructural organization and its influence on the processes of proliferation, differentiation and cell cycle of the midbrain and cerebellum of Gallus domesticus embryos. The embryos were treated in ovo on the 3rd day of incubation (E3) with a single dose of methylmercury (MeHg) (0.1ug in 50 uL of diluted saline) and analyzed on the 10th day of incubation (E10). The control group embryos were treated only with 50 uL saline solution. The morphological and morphometric analysis of the midbrain and cerebellum sections were taken from histological sections stained with hematoxylin-eosin. The quantification and immunolocalization of proteins related to cell cycle (Cyclin E, p21and p53), cell differentiation (NeuN; tubulin III and GFAP), cell proliferation (phosphohistone H3) and DNA damage (yPH2Ax) and related mitochondrial dynamics (Drp-1 and Mfn-1) were obtained from immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Metal detection assays were conducted using the atomic absorption spectrophotometer and analysis by transmission electron microscopy to investigate ultrastructural changes. The results showed deposition of Hg in the midbrain and cerebellum. Exposure to MeHg caused increased p21 expression in the midbrain and p53 in the cerebellum, and significant reduction in the expression of cyclin E and phosphohistone H3, suggesting cell cycle arrest and cell proliferation. Ultrastructural changes were observed, being more evident in the mitochondria of cells of the midbrain and especially of cerebellum. The insults to the cycle and the cellular structure altered the processes of differentiation, causing a decrease in the number of cells of neural and glial lineages. This study revealed that MeHg insults in the cerebellum were more severe than in the midbrain, demonstrating that the toxicology of MeHg is dependent on the developmental period and could compromise functions important for the survival of the embryo.

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-01Bitstream added on 2015-03-03T12:07:03Z : No. of bitstreams: 1 000795671_20160821.pdf: 721307 bytes, checksum: 7c0b1ee81748d2373add262929c0759e (MD5) Bitstreams deleted on 2016-08-22T16:41:52Z: 000795671_20160821.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-08-22T16:42:30Z : No. of bitstreams: 1 000795671.pdf: 2066497 bytes, checksum: 74f68f5bb7a4ba785eb3b376c7185a0d (MD5)
Desde o final dos anos 80, a questão do comportamento do mercúrio no ambiente amazônico e sua toxicidade vêm sendo discutidos por pesquisadores brasileiros e estrangeiros na tentativa de se determinar o verdadeiro risco que este elemento apresenta para o ecossistema. Embora muitos avanços tenham sido obtidos num intenso esforço de três décadas, a ausência de um grande programa de mapeamento e monitoramento da contaminação por mercúrio em todo território amazônico dificulta a precisa determinação dos caminhos que este metal percorre antes de constituir um perigo ao ser humano. No ambiente aquático, o mercúrio pode ser metilado por processos biológicos e/ou químicos. Dentre as espécies de mercúrio, o metilmercúrio (MeHg) é a mais tóxica, o que se deve a sua elevada estabilidade, solubilidade lipídica e propriedades iônicas que lhe permite atravessar membranas de organismos vivos. A metilação do mercúrio e o subsequente acúmulo na biota é maior no ambiente aquático que no terrestre e pode ser considerada a etapa chave para o entendimento do ciclo do Hg. O interesse no estudo ecotoxicológico do MeHg se deve principalmente ao fato de ser uma neurotoxina, tendo a tendência de bioacumular e biomagnificar, tornando-se um risco para a saúde humana. A principal via de contaminação nos seres humanos é através da ingestão de alimentos, principalmente peixes. Neste trabalho, foi realizado um estudo na região no do rio Madeira na área de influência da Usina Hidrelétrica de Jirau, determinando a concentração de mercúrio total e orgânico em amostras de água, solo e sedimento, e verificou-se que tais valores estão abaixo dos níveis preconizados pela legislação brasileira, não evidenciando contaminação pontual deste metal na bacia antes do enchimento do lago. Além disso, estudou-se a formação do MeHg utilizando águas, solos e sedimentos provenientes de três bacias da região amazônica (águas claras – rio Tocantins GO, águas brancas – rio Madeira RO e águas escuras – rio Negro AM), na presença de Hg0 e Hg2+ ao longo de 25 dias, analisando pH, condutividade, potencial redox (EH) e oxigênio dissolvido (OD), verificando uma relação inversamente proporcional entre formação de mercúrio orgânico e os parâmetros medidos durante o estudo.
Since the end of the 1980s, the behavior of mercury in the Amazonian environment, as well as its potential toxicity, has been investigated by scientists from both Brazil and elsewhere in order to try to determine the true risks that this element poses to the ecosystem and human health. Despite substantial advances over three decades, the absence of adequate mapping and monitoring of mercury contamination throughout the Amazon region has hindered identification of the precise routes by which the metal is transported before it could constitute a hazard to humans. In the aquatic environment, mercury can be methylated in biological and chemical processes. Amongst the various mercury species, methylmercury (MeHg) is the most toxic, due to its high stability, lipid solubility, and ionic properties, which enable it to traverse the membranes of living organisms. The methylation of mercury and its subsequent accumulation in biota is greater in the aquatic than in the terrestrial environment, and it is vital to understand this key step in the Hg cycle. Interest in ecotoxicological studies of MeHg is largely driven by the fact that the compound is a neurotoxin that can become bioaccumulated and biomagnified, and therefore represent a threat to human health. The main route for human uptake of MeHg is through the ingestion of foods, especially fish. The present work concerns a study of a region of the Madeira River influenced by the Jirau hydroelectric facility. The concentrations of total and organic mercury were determined in samples of water, soil, and sediment. The values obtained were below the permissible levels established by Brazilian legislation, and there was no evidence of contamination in the river basin due to emissions of mercury from point sources, prior to filling of the reservoir. Investigation was also made of the formation of MeHg, employing water, soil, and sediment obtained from three basins in the Amazon region, characterized by the presence of clear water (Tocantins River in Goiás State), white water (Madeira River in Rondônia), and black water (Negro River in Amazônia). The experiments were performed over a period of 25 days, using Hg0 and Hg2+, with measurement of pH, conductivity, redox potential (EH), and dissolved oxygen (DO). Inversely proportional relationships were observed between the formation of organic mercury and the measured parameters.

Orientador: Ademir dos Santos
Co-orientadora: Luciana Camargo de Oliveira
Banca: André Gustavo Ribeiro Mendonça
Banca: Gustavo Rocha de Castro
Banca: Marcos Fernando de Souza Teixeira
Banca: Maria Olimpia de Oliveira Rezende
Resumo: Desde o final dos anos 80, a questão do comportamento do mercúrio no ambiente amazônico e sua toxicidade vêm sendo discutidos por pesquisadores brasileiros e estrangeiros na tentativa de se determinar o verdadeiro risco que este elemento apresenta para o ecossistema. Embora muitos avanços tenham sido obtidos num intenso esforço de três décadas, a ausência de um grande programa de mapeamento e monitoramento da contaminação por mercúrio em todo território amazônico dificulta a precisa determinação dos caminhos que este metal percorre antes de constituir um perigo ao ser humano. No ambiente aquático, o mercúrio pode ser metilado por processos biológicos e/ou químicos. Dentre as espécies de mercúrio, o metilmercúrio (MeHg) é a mais tóxica, o que se deve a sua elevada estabilidade, solubilidade lipídica e propriedades iônicas que lhe permite atravessar membranas de organismos vivos. A metilação do mercúrio e o subsequente acúmulo na biota é maior no ambiente aquático que no terrestre e pode ser considerada a etapa chave para o entendimento do ciclo do Hg. O interesse no estudo ecotoxicológico do MeHg se deve principalmente ao fato de ser uma neurotoxina, tendo a tendência de bioacumular e biomagnificar, tornando-se um risco para a saúde humana. A principal via de contaminação nos seres humanos é através da ingestão de alimentos, principalmente peixes. Neste trabalho, foi realizado um estudo na região no do rio Madeira na área de influência da Usina Hidrelétrica de Jirau, determinando a concentração de mercúrio total e orgânico em amostras de água, solo e sedimento, e verificou-se que tais valores estão abaixo dos níveis preconizados pela legislação brasileira, não evidenciando contaminação pontual deste metal na bacia antes do enchimento do lago. Além disso, estudou-se a formação do MeHg utilizando águas, solos e sedimentos provenientes de três bacias ...
Abstract: Since the end of the 1980s, the behavior of mercury in the Amazonian environment, as well as its potential toxicity, has been investigated by scientists from both Brazil and elsewhere in order to try to determine the true risks that this element poses to the ecosystem and human health. Despite substantial advances over three decades, the absence of adequate mapping and monitoring of mercury contamination throughout the Amazon region has hindered identification of the precise routes by which the metal is transported before it could constitute a hazard to humans. In the aquatic environment, mercury can be methylated in biological and chemical processes. Amongst the various mercury species, methylmercury (MeHg) is the most toxic, due to its high stability, lipid solubility, and ionic properties, which enable it to traverse the membranes of living organisms. The methylation of mercury and its subsequent accumulation in biota is greater in the aquatic than in the terrestrial environment, and it is vital to understand this key step in the Hg cycle. Interest in ecotoxicological studies of MeHg is largely driven by the fact that the compound is a neurotoxin that can become bioaccumulated and biomagnified, and therefore represent a threat to human health. The main route for human uptake of MeHg is through the ingestion of foods, especially fish. The present work concerns a study of a region of the Madeira River influenced by the Jirau hydroelectric facility. The concentrations of total and organic mercury were determined in samples of water, soil, and sediment. The values obtained were below the permissible levels established by Brazilian legislation, and there was no evidence of contamination in the river basin due to emissions of mercury from point sources, prior to filling of the reservoir. Investigation was also made of the formation of MeHg, employing water, soil, and sediment obtained from three basins ...
Doutor

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015.
Made available in DSpace on 2016-10-19T13:18:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 337736.pdf: 2749407 bytes, checksum: 83fc4df7953d4ab58a50f4b11d22723d (MD5) Previous issue date: 2015
Os efeitos neurotóxicos do metilmercúrio (MeHg) são bem conhecidos, mas informações mais detalhadas sobre a sua ação durante o desenvolvimento embrionário ainda são escassas. Este estudo teve como objetivo caracterizar os efeitos do MeHg sobre a organização ultraestrutural e sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento das camadas da medula espinhal, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo. No terceiro dia embrionário (E3), os embriões foram tratados in ovo com uma única dose de cloreto de metilmercúrio (ClMeHg) (0,1 µg diluído em 50 µL de salina) e avaliados no décimo dia embrionário (E10). As análises morfológicas e morfométricas da medula espinhal foram realizadas a partir de secções histológicas coradas com HE. A localização e quantificação dos marcadores relacionados ao ciclo celular e dano ao DNA foram obtidos a partir de técnicas de imunohistoquímica e citometria de fluxo. Adicionalmente, foram realizados o ensaio de TUNEL, para a identificação de células em apoptose e análise por microscopia eletrônica de transmissão, para investigar possíveis danos ultraestruturais. Nossos resultados mostraram significativa deposição de mercúrio nas três camadas da medula espinhal, as quais apresentaram alteração na expressão de marcadores relacionados ao controle do ciclo celular, proliferação e morte celular. O aumentado número de células ?H2A.X-positivas observado na camada de manto indica dano ao DNA, o qual pode ser a causa do aumento na expressão de p21 e consequente retenção do ciclo celular na fase G1. A exposição ao MeHg também causou alterações nos componentes subcelulares das células da medula espinhal, principalmente nas mitocôndrias que apresentaram edemas e rupturas de membranas, além do aparecimento de formas mitocondriais incomuns cup-like (em cálice) e donut-like (em anel). Esses danos podem estar associados com o aumento da morte celular na camada do manto, a qual parece ser mais afetada após a exposição ao MeHg. A redução da proliferação associada a aumento da morte celular, mostraram que uma única dose de MeHg foi capaz de perturbar mecanismos celulares essenciais causando redução na espessura das camadas da medula espinhal. Do ponto de vista toxicológico, estes resultados são importantes porque mostram que a exposição ao MeHg, in ovo, altera a medula espinhal em desenvolvimento e pode levar a possíveis comprometimentos neuromotores na vida pós-natal.

Abstract : The neurotoxic effects of methylmercury (MeHg) are well known, but more detailed information on its action during embryonic development are still scarce. This study aimed to characterize the effects of MeHg on the ultrastructural organization and on the molecular and cellular mechanisms involved in the development of spinal cord layers, using Gallus domesticus embryos as a model. At third embryonic day (E3), the embryos were treated in ovo with a single dose of methylmercury chloride (ClMeHg) (0.1 µg diluted in 50 µL saline) and evaluated at the tenth embryonic day (E10). The morphological and morphometric analyses of the spinal cord were taken from histological sections stained with HE. The localization and quantification of the cell cycle related and DNA damage markers were performed by immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Additionally, TUNEL assay was used to apoptosis identification and transmission electron microscopy was conducted to investigate ultrastructural damage. Our results showed significant mercury deposition in the three spinal cord layers, which had alterations in expression of markers related to cell cycle control, proliferation and cell death. The increased number of ?H2A.X-positive cells observed in the mantle layer indicates DNA damage, which may be the cause of the p21 expression increased and consequent cell cycle arrest in G1 phase. The MeHg exposure also caused changes on subcellular components of spinal cord cells, mainly in mitochondria that showed swelling and membrane disruptions, beyond the appearance of unusual cup-like and donut-like shapes. These damage may be associated with increased cell death in the mantle layer, which appears to be the most affected layer after the MeHg exposure. The decreased cell proliferation associated to the increased cell death showed that a single dose of MeHg was able to disrupt essential cellular mechanisms, causing reduction in thickness of the spinal cord layers. From a toxicological point of view, these results are important because showed that in ovo MeHg exposure changes the developing spinal cord and can leads to potential neuromotor impairments in the postnatal life.

Atualmente a biodisponibilidade de doses baixas de metilmercurio (MeHg) pelo consumo de peixe é muito generalizada. Por outro lado, a vitamina A (VitA) é um nutriente essencial com uma alta presença entre os consumidores globais na dieta normal, alimentos processados e suplementos. O MeHg e um conhecido neurotóxico, mesmo em doses baixas, com a capacidade de afetar diversos órgãos e produzir efeitos deletérios na saúde, especialmente em mulheres gravidas, onde pode desencadear alterações sistêmicas e no neurodesenvolvimento após o nascimento. Adicionalmente, nosso laboratório demostrou com sucesso em modelos animais, os efeitos pró-oxidantes e alterações comportamentais produzidos pela suplementação com VitA em doses consideradas seguras. No entanto, apesar de serem conhecidos os efeitos biológicos do MeHg e da VitA de forma individual, nenhum estudo da literatura avaliou seus efeitos combinados. Então, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos de uma dose baixa e ambientalmente relevante de MeHg coadministrada com uma dose de suplementação de VitA em ratas gestantes e lactantes sobre o comportamento e tecidos das mães e seus filhotes. Trinta ratas Wistar gravidas (entre 7 e 8 por grupo) foram suplementadas oralmente com azeite mineral (controle), MeHg (0,5 mg/Kg/dia) e palmitato de retinol (7500 μg RAE/Kg/dia) individualmente ou em combinação, desde o início da gestação (GD 0) até o desmame dos filhotes (DPN 21). Nem as mães nem os filhotes apresentaram alterações morfológicas, sistêmicas, toxicológicas ou metabólicas provocadas pelo tratamento de co-exposição MeHg-VitA No entanto, foram encontradas modulações de atividades enzimáticas nas enzimas glutationa- dependentes em forma tecido-específica, assim como efeitos deletérios/benéficos em termos da peroxidação lipídica. Por último, o tratamento MeHg-VitA foi capaz de alterar o processo de aprendizado associativo na etapa neonatal, sem modular o neurodesenvolvimento dos filhotes. Além disso, não produziu alterações comportamentais em idades posteriores, mas afetou a resposta de aprendizado de maneira sexo-dependente. Em conclusão, o tratamento MeHg-VitA sob nosso paradigma de exposição pode modular reações nocivas/benéficas em termos da toxicidade tanto em mães como filhotes, dependendo do tecido estudado, e produzir efeitos in vivo em combinação (MeHg+VitA) completamente diferentes dos efeitos individuais dos compostos. Nossos resultados no modelo animal mostram a importância do cuidado na alimentação de gestantes e lactantes para evitar alterações na saúde da futura criança pelo consumo inadvertido destes compostos em combinação. As respostas pró-oxidantes podem levar a efeitos a nível celular. Além disso, recomendamos mais trabalhos sobre metabolitos ativos do palmitato de retinol que podem ter efeitos benéficos durante casos de intoxicação com MeHg em doses baixas, especialmente no sistema nervoso. As implicações epidemiológicas de nossos resultados ainda são desconhecidas, por tanto são requeridos mais estudos epidemiológicos de seguimento e hábitos alimentares nas populações materna e infantil ao nível mundial.
Actually, low-dose methylmercury (MeHg) bioavailability through fish consumption is ubiquitous. In contrast, vitamin A (VitA) is an essential nutrient with a high presence among global consumers in the regular diet, processed foods, and supplements. MeHg is a well-known neurotoxin, even at low doses, capable of affecting other organs and produce deleterious effects on health, especially in pregnant women, where it can unleash systemic and neurodevelopmental alterations after birth. Additionally, our lab successfully demonstrated, in an animal model, pro-oxidant effects and behavioral disturbances produced by VitA supplementation at doses considered as safe. However, although individual biological effects of the previous compounds are well known, no study in literature evaluated their effects in combination. Thus, the aim of the present work was to investigate the effects of an environmentally relevant low-dose of MeHg co-administered with a supplementation dose of VitA in pregnant and lactating rats on maternal and offspring behavior and tissues. Thirty Wistar female pregnant rats were orally supplemented with mineral oil (control), MeHg (0,5 mg/Kg/day) and retinyl palmitate (7500 μg RAE/Kg/day) either individually or in combination from the beginning of gestation (GD 0) until weaning (DPN 21). Neither dams nor their offspring presented morphological, systemic, toxicological or metabolic disturbances caused by co-exposition treatment MeHg-VitA. But, showed tissue-specific modulations of enzymatic activities in glutathione-dependent enzymes, and deleterious/beneficial effects regarding lipid peroxidation Finally, MeHg-VitA treatment was able to alter associative learning in neonatal stage, with no modulation of pup´s neurodevelopment. Also, it did not produce behavioral alterations at later age, however, affected learning response in a sex-dependent manner. In conclusion, MeHg-VitA treatment under our exposure paradigm can modulate harmful/beneficial reactions in terms of toxicity either for dams and their offspring depending of the studied tissue, and produce in vivo effects in combination (MeHg+VitA) completely differents from individual effects of the compounds. Our results in animal model shows the importance regarding the care in food consumption in pregnant and lactating, to avoid health disturbances in the future infant due to unadverted consumption of these compounds in combination. Pro-oxidant responses can lead to effects at cellular level. Furthermore, we recommend more studies regarding active metabolites of retinyl palmitate which can have beneficial effects during cases of low-dose MeHg intoxication, especially in the nervous system. Epidemiological implications of our results are still unknown, for that more follow-up and food habits epidemiologic studies are required among maternal and infant populations worldwide.

Vários estudos mostram que algumas regiões da Amazônia sofrem impacto por mercúrio (Hg), decorrente de processos naturais e antrópicos. O Parque Nacional do Jaú - PNJ, é o único Parque do Brasil que protege toda a bacia de um rio de água escura (Rio Jaú), terras inundáveis e reservas tropicais, condições que favorecem a metilação do Hg na biota aquática, portanto, expondo a população ribeirinha à contaminação e tornando a região passível de impactação natural por Hg. Estudos preliminares de dietas de préescolares de comunidades do PNJ, têm demonstrado concentrações preocupantes de Hg. O presente estudo avaliou as concentrações de Hg total, de micronutrientes (Ca, Fe, K, Na, Se e Zn) e de macronutrientes (proteínas, lipídeos, cinzas, energia e carbohidratos) em dietas de pré-escolares da região do PNJ e outras comunidades próximas. Avaliou-se também os níveis de Hg total e MeHg em amostras de cabelos dessas crianças e também, cabelos de crianças residentes em vários bairros da cidade de Manaus e pescados mais consumidos por essa população. A partir desses resultados, foi possível fazer uma avaliação nutricional das dietas e à exposição ao Hg e MeHg de crianças do PNJ e comunidades próximas, e da cidade de Manaus, AM. A quantificação de Hg total e MeHg foi feita por espectrometria de absorção atômica com geração de vapor frio (CV AAS). A determinação dos micronutrientes foi feita pela técnica de ativação neutrônica (AAN) e os macronutrientes, de acordo com as metodologias preconizadas pela AOAC (USA). Todos os métodos foram desenvolvidos e validados, quanto à precisão e exatidão, por meio da análise de materiais de referência com valores certificados para os elementos determinados. Além disso, foi realizada a avaliação das fontes de incerteza para a determinação de Hg e MeHg sendo calculada a incerteza padrão expandida. Os teores obtidos para Hg total nas amostras de dietas e Hg total e MeHg em cabelos do PNJ, estiveram bem acima dos valores encontrados em diferentes localidades da região Amazônica, bem como de localidades próximas ao PNJ. Para muitas crianças os valores de ingestão para Hg, ultrapassou-se o valor de 5 μg de Hg/kg de peso corpóreo/semana (PTWI). As crianças da cidade de Manaus apresentaram teores muito menores de Hg nas amostras de cabelo, ao contrário do PNJ, mesmo sendo ecossistemas interligados. Concluise, portanto, que para a população que possui maior capacidade de escolha de produtos alimentícios fornecedores de proteínas, a ingestão de peixe é menor e conseqüentemente a ingestão de Hg também. Os resultados obtidos pela técnica de AAN forneceram valores de concentração confiáveis para elementos nutricionalmente importantes como Ca, Fe, K, Na, Se e Zn, os quais foram comparados aos valores de DRIs (Dietary Reference Intakes). De uma maneira geral, verificou-se prevalência de inadequação com relação aos micronutrientes e déficit protéico-calórico, para as dietas analisadas no presente estudo. Isso vem confirmar o alto nível de risco e a vulnerabilidade dessa população às deficiências nutricionais e à contaminação por Hg. Vários fatores externos podem influenciar a vulnerabilidade da população aos efeitos tóxicos do MeHg, tais como: idade, sexo, estado nutricional e de saúde, ingestão e interação dietética. Objetivando avaliar também a influência do processo de cocção na perda de nutrientes e de Hg total, em uma tentativa de contribuir para futuros estudos nutricionais, avaliou-se o teor de Hg e dos micronutrientes Ca, Fe, K, Na, Se e Zn em espécies de pescados mais consumidos pela população da cidade de Manaus e comunidades próximas, preparadas sob diferentes formas de cocção (in natura, cozido, frito e assado). Verificou-se que a variabilidade na perda dos elementos minerais e do Hg, para cada processo de cocção, parece estar mais em função da espécie do que a forma de preparo. Verificou-se também, que as espécies predadoras apresentaram os maiores teores de Hg e Se, conforme era esperado. Discute-se a correlação entre Hg e Se em peixes. Conclui-se que, embora as pesquisas atuais concordem que possa existir um BG (nível básico) de Hg na Amazônia, a exposição contínua ao Hg pela via alimentar, mesmo considerando os baixos teores do metal encontrados em algumas espécies de peixes, permitem supor que no decorrer do tempo esta situação possa se agravar, principalmente em comunidades cuja dieta não é diversificada apresenta deficiências nutricionais sérias e se constitua principalmente de pescado. O presente estudo pretendeu também, além da avaliação do estado nutricional e da exposição ao Hg de crianças do Parque Nacional do Jaú e da cidade de Manaus, AM, contribuir de forma a subsidiar futuras ações de políticas públicas.
Studies show that some regions of the Amazon region suffer mercury (Hg) impacts as a direct result of both natural and anthropogenic processes. Jaú National Park (PNJ) is the only National Park in Brazil that protects an entire black water basin (Jaú River), flood land and tropical reserve. These conditions favor Hg methylation in the aquatic biota. This in turn, exposes riverine populations to Hg contamination as well as the adjacent regions. Preliminary studies of pre-school diets from PNJ communities have shown that these diets have a worrisomely high Hg content. The present study assessed total Hg content, micronutrients (Ca, Fe, K, Na, Se and Zn) and macronutrients (proteins, lipids, ash, energy, carbohydrate) in pre-school diets in the PNJ and surrounding communities. Furthermore, total and MeHg levels were also determined in hair samples of these children as well as those living in several neighborhoods of the city of Manaus. Included in this determination were the fish most consumed by these populations. From these results it was possible to evaluate the nutritional content of the diets and the exposure of the children to Hg and MeHg. Cold vapor atomic absorption spectrometry was used to quantify total and MeHg. Micronutrient determination was performed using neutron activation analysis technique (NAA) and Macronutrient through AOAC methodologies (USA). All analytical methods were developed and validated for precision and accuracy by means of reference materials analyses with certified values for the elements determined. Furthermore, the uncertainty sources for Hg and MeHg determination were assessed and the expanded uncertainties were calculated. Total Hg levels in diets and total and MeHg levels for hair samples, were well above those values found in different localities of the Amazon region. This also holds true for those surrounding areas of the JNP. For many children Hg intake values passed the 5 μg Hg/body weigh/week (PTWI). Children of the city of Manaus presented much lower Hg levels in hair samples in contrast to those of the PNJ even though both groups shared the same ecosystem. It can thus be concluded that populations that have a wider choice of food products for protein, have a lesser intake of fish and as a consequence less Hg intake. Obtained NAA results furnished reliable concentration values for important nutritional elements, mainly Ca, Fe, K, Na, Se and Zn. From these values the daily intake was calculated and compared to the DRIs (Dietary reference intakes). In general, the diets analysed in this study presented inadequate and deficient protein-caloric levels, confirming these populations´ high risk and vulnerability to nutritional deficiencies and to Hg exposure. Several external factors can obviously influence the vulnerability of these populations to the toxic effects to MeHg such as: age, sex, health and nutritional status, intake and dietary interaction. In order to evaluate the influence of the cooking processes (in natura, cooked, fried, baked) regarding micronutrient and total Hg losses, in order to contribute to future nutritional studies, Hg levels and micronutrients in fish species most consumed by Manaus residents and surrounding communities were assessed. Micronutrients and Hg loss variability through the different cooking processes seem to be more related to fish species rather than cooking process. Furthermore, predatory species presented higher Hg and Se levels as was expected. The Hg and Se correlation in fish is also discussed. Although research shows a high Hg background in the Amazon the continuous exposure through food can in time worsen especially in communities that do not have diet diversification, have serious nutritional deficiencies and whose diets are mainly fish. It is hoped that this study can also contribute to future public political actions and policies in terms of reducing dietary hazards due to Hg and MeHg exposure.

Degut a la necessitat d’estudis sistemàtics per a l’establiment de mètodes eficaços per a la determinació d’espècies de mercuri en matrius ambientals i biològiques complexes, que assegurin la inalterabilitat de les mateixes durant la seva manipulació, aspectes que són avui dia els punts més febles en l’especiació analítica, l’objectiu de la present Tesi es basa en l’optimització de mètodes analítics per a estudiar l’especiació de mercuri en mostres del medi aquàtic mitjançant la tècnica acoblada HPLC-UV-CV-AFS. Dins d’aquest marc, la Tesi aborda uns objectius específics que es descriuen a continuació: - Optimització de totes les condicions experimentals implicades en la determinació de mercuri inorgànic i metilmercuri mitjançant CV-AFS establint, en primer lloc, les condiciones òptimes de detecció i, a continuació, estudiant la separació de les espècies mitjançant cromatografia de líquids en fase inversa; tot establint els paràmetres de qualitat per al mètode analític proposat. - Modificació i/o optimització del mètode analític per tal de determinar altres espècies de mercuri que de manera poc habitual es puguin trobar en mostres ambientals i/o biològiques. - Desenvolupament d’un mètode de preconcentració on-line per a l’especiació de mercuri en aigües. - Establiment dels efectes de pretractament en la determinació de mercuri en mostres de sediments. - Aplicació de la metodologia analítica desenvolupada a mostres ambientals i biològiques (aigües, sediments i biota) prèviament estudiant diferents mètodes d’extracció d’espècies emprant materials de referència. Els resultats obtinguts dins del tres primers objectius es mostren i es discuteixen al Capítol 3 de la present memòria; els estudis realitzats per a l’avaluació dels efectes de pretractament de mostra en sediments es descriuen al Capítol 4, i l’últim capítol descriu l’aplicació a mostres ambientals i biològiques del medi aquàtic. Als annexos I i II s’inclouen els articles científics publicats fins al moment. L’Annex I consta d’un article sobre la determinació de Hg2+ i MeHg+ en aigües contaminades mitjançant HPLC-UV-CV-AFS, mentre que a l’Annex II es troba un review sobre materials de referència certificats per a l’especiació de mercuri en matrius biològiques i ambientals.
In the present thesis, analytical methodology has been developed for mercury speciation in aquatic samples. The first part of the work consists of the optimization of the method for the separation of the species by the technique HPLC-UV-CV-AFS, another part focuses on the effects of sample pretreatment for the determination of total mercury and its species in sediments, and finally the last part consists of the application of the developed methodology to environmental and biological aquatic matrices (water, sediment and biota). Obtained results in the first part of the work are shown and discussed in Chapter 3; studies about sample pretreatment in sediments are described in Chapter 4; and the last part of the work is described in Chapter 5. Appendix I includes an article about the determination of Hg2+ and MeHg+ in polluted waters by HPLC-UV-CV-AFS, while Appendix II includes a review of certified reference materials for mercury speciation in environmental and biological matrices.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015.
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Os efeitos neurotóxicos do metilmercúrio (MeHg) são bem conhecidos, mas informações mais detalhadas sobre a sua ação durante o desenvolvimento embrionário ainda são escassas. Este estudo teve como objetivo caracterizar os efeitos do MeHg sobre a organização ultraestrutural e sobre os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento das camadas da medula espinhal, utilizando embriões de Gallus domesticus como modelo. No terceiro dia embrionário (E3), os embriões foram tratados in ovo com uma única dose de cloreto de metilmercúrio (ClMeHg) (0,1 µg diluído em 50 µL de salina) e avaliados no décimo dia embrionário (E10). As análises morfológicas e morfométricas da medula espinhal foram realizadas a partir de secções histológicas coradas com HE. A localização e quantificação dos marcadores relacionados ao ciclo celular e dano ao DNA foram obtidos a partir de técnicas de imunohistoquímica e citometria de fluxo. Adicionalmente, foram realizados o ensaio de TUNEL, para a identificação de células em apoptose e análise por microscopia eletrônica de transmissão, para investigar possíveis danos ultraestruturais. Nossos resultados mostraram significativa deposição de mercúrio nas três camadas da medula espinhal, as quais apresentaram alteração na expressão de marcadores relacionados ao controle do ciclo celular, proliferação e morte celular. O aumentado número de células ?H2A.X-positivas observado na camada de manto indica dano ao DNA, o qual pode ser a causa do aumento na expressão de p21 e consequente retenção do ciclo celular na fase G1. A exposição ao MeHg também causou alterações nos componentes subcelulares das células da medula espinhal, principalmente nas mitocôndrias que apresentaram edemas e rupturas de membranas, além do aparecimento de formas mitocondriais incomuns cup-like (em cálice) e donut-like (em anel). Esses danos podem estar associados com o aumento da morte celular na camada do manto, a qual parece ser mais afetada após a exposição ao MeHg. A redução da proliferação associada a aumento da morte celular, mostraram que uma única dose de MeHg foi capaz de perturbar mecanismos celulares essenciais causando redução na espessura das camadas da medula espinhal. Do ponto de vista toxicológico, estes resultados são importantes porque mostram que a exposição ao MeHg, in ovo, altera a medula espinhal em desenvolvimento e pode levar a possíveis comprometimentos neuromotores na vida pós-natal.

Abstract : The neurotoxic effects of methylmercury (MeHg) are well known, but more detailed information on its action during embryonic development are still scarce. This study aimed to characterize the effects of MeHg on the ultrastructural organization and on the molecular and cellular mechanisms involved in the development of spinal cord layers, using Gallus domesticus embryos as a model. At third embryonic day (E3), the embryos were treated in ovo with a single dose of methylmercury chloride (ClMeHg) (0.1 µg diluted in 50 µL saline) and evaluated at the tenth embryonic day (E10). The morphological and morphometric analyses of the spinal cord were taken from histological sections stained with HE. The localization and quantification of the cell cycle related and DNA damage markers were performed by immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Additionally, TUNEL assay was used to apoptosis identification and transmission electron microscopy was conducted to investigate ultrastructural damage. Our results showed significant mercury deposition in the three spinal cord layers, which had alterations in expression of markers related to cell cycle control, proliferation and cell death. The increased number of ?H2A.X-positive cells observed in the mantle layer indicates DNA damage, which may be the cause of the p21 expression increased and consequent cell cycle arrest in G1 phase. The MeHg exposure also caused changes on subcellular components of spinal cord cells, mainly in mitochondria that showed swelling and membrane disruptions, beyond the appearance of unusual cup-like and donut-like shapes. These damage may be associated with increased cell death in the mantle layer, which appears to be the most affected layer after the MeHg exposure. The decreased cell proliferation associated to the increased cell death showed that a single dose of MeHg was able to disrupt essential cellular mechanisms, causing reduction in thickness of the spinal cord layers. From a toxicological point of view, these results are important because showed that in ovo MeHg exposure changes the developing spinal cord and can leads to potential neuromotor impairments in the postnatal life.

Há décadas a exposição ao mercúrio é alvo de estudos toxicológicos devido ao alto potencial de danos a saúde humana. Na região amazônica os primeiros estudos reportavam a exposição ocupacional pelo uso nos garimpos de ouro, entretanto recentemente destacam-se os estudos relacionados a exposição ambiental que ocorre na região decorrente do consumo de peixes contaminados com mercúrio. Muitos estudos se concentram em populações ribeirinhas residentes na região do rio Tapajós, onde o consumo de peixes é frequente e o metil-mercúrio (MeHg) contido nos peixes é o responsável pela exposição dessas pessoas ao metal. O MeHg apresenta efeitos tóxicos relevantes sobre o sistema cardiovascular, e muitos grupos de pesquisa buscam elucidar os mecanismos que expliquem tais efeitos. Alguns estudos apontam uma diminuição significativa na disponibilidade do óxido nítrico (NO) após exposição ao organometal, o que poderia contribuir para uma alteração da fisiologia cardiovascular uma vez que o NO é um modulados desse sistema. O NO é sintetizado pela óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) e sua atividade pode ser alterada por vários fatores, dentre eles, os polimorfismos nos genes que codificam essa proteína, são eles: T-786C na região promotora, 27-pb VNTR no intron 4 e Glu298Asp no exon 7. Neste sentido, o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos dos polimorfismos da eNOS sobre a síntese de NO entre os indivíduos expostos a metilmercúrio. Foram analisadas amostras de sangue de 214 voluntários com idade entre 15 e 84 anos, dos quais 103 homens e 111 mulheres. A concentração de mercúrio no sangue (Hg sangue) total variou de 1,7 a 179,3 µg/L e a concentração plasmática de nitrito variou entre 85,7 e 695,8 M. Foram determinados os valores de pressão arterial sistólica (PAS), pressão arterial diastólica (PAD), índice de massa corporal (IMC) e freqüência cardíaca (FC) de todos os voluntários. A PAS média foi de 119,8 mmHg e a média da PAD foi 71,8 mmHg. O IMC médio foi de 24,5 Kg/m2 e a FC média foi 70,4 batimentos por minuto (bpm). Não foram observadas diferenças entre os grupos, segundo genótipos dos três polimorfismos, quanto às características dos voluntários: idade, PAS, PAD, IMC, FC, Hg sangue e as concentrações plasmáticas de nitrito. Quando os polimorfismos foram estudados isoladamente foi observado que o alelo C na região promotora, o alelo 4b no intron 4 e o alelo Glu no exon 7 apresentaram-se associados a concentrações reduzidas e nitrito plasmático. Quando a população foi estratificada com base na concentração de Hg essa associação desapareceu, provavelmente mascarada pelas altas concentrações do metal. Entretanto quando foram estudados os haplótipos pode ser observada novamente a associação desses mesmos alelos com a diminuição da concentração do nitrito, confirmando os achados iniciais. O haplótipo mais frequente na população combina os alelos selvagens para todos os polimorfismos (T, 4b e G) e o haplótipo menos freqüente combina os alelos variantes. O haplótipo associado à menor concentração plasmática de nitrito combina os alelos selvagens (C, 4b e G), confirmando os primeiros resultados. Essa abordagem haplotípica é muito útil na observação de efeitos mais discretos uma vez que é possível observar os efeitos dos três polimorfismos agindo simultaneamente sobre uma variável, nesse caso o óxido nítrico. O presente estudo sugere que os fatores genéticos exercem grande influência sobre a produção e biodisponibilidade de NO e que esses fatores combinados com a exposição ambiental ao Hg podem agir de maneira sinérgica, aumentando a suscetibilidade aos efeitos cardiotóxicos do metal através da modulação da atividade da eNOS.
The mercury (Hg) exposure has been target of toxicological studies due the high potential of damage to human health. In the Amazon region the first studies reported the occupational exposure due the use in gold mining, however, recently become relevant the studies about the environment exposure due the fish intake in the riparian population. Several studies have been concentrated in the riparian community in the Tapajós river region, where the fish consumption is frequent and the methylmercury content in fish is responsible to exposure of this people. The MeHg presents toxic effects in the cardiovascular system and many researches groups try to elucidate the mechanisms that explain this effects. Some studies report a significant reducing in nitric oxide (NO) production after the Hg exposure, which could contribute to an altered physiology of the cardiovascular system, once the NO is a modulating factor of this system. The NO is produced by the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and its activity can be altered by many factors like polymorphisms in gene that codify this protein, among this: : T-786C in the promoter region, 27-pb VNTR in intron 4 and Glu298Asp in exon 7. In this regard, the present study mean to evaluate the effects of the eNOS polymorphisms over the NO synthesis among the Hg exposed subjects. In this work, the whole blood samples of 214 volunteers were analyzed for determination of Hg concentration, nitrite plasma concentration and genotyping. The age of the volunteers varied between 15 and 84 years old, including 103 men and 111 women. The blood mercury concentration varied between 1.7 and 179.3 µg/L and the nitrite plasma concentration varied between 85.7 and 695.8 M. Was determinate the systolic arterial pressure (SAP), diastolic arterial pressure (DAP), body mass index (BMI) and heart rate (HR). The SAP mean was 119.8 mmHg and the DAP mean was 71.8 mmHg. The BMI mean was 24.5 Kg/m2 and the HR mean was 70.4 beats per minute. There was no difference among the groups of the three polymorphisms according the volunteers characteristics: age, DAP, SAP, BMI, HR, blood Hg concentration and nitrite plasma concentration. When the polymorphisms were observed separately the reduced nitrite plasma concentration was associated with the presence of the alleles: C in promoter region, 4b in intron 4 and G in exon 7, however there is lack of association when the volunteers were grouped according the blood Hg concentration, probably due a mask effect of the high Hg concentration. When these three polymorphisms were observed simultaneously, in analysis of the haplotypes, the association between the same alleles and the nitrite plasma concentration was observed again, confirming the initial findings. The commonest haplotype in the volunteers combine the alleles of the three polymorphisms (T, 4b and G) and the less frequent haplotype combine the three variants alleles. There was an association between the haplotype C, 4b and G and reduced nitrite plasma concentration, according the result of the polymorphisms separately. The haplotype analysis is too interesting to observe discrete effects, once is possible to analyze the effects of the three polymorphisms acting simultaneously above one variable, in this case, nitric oxide production. The present study suggest that genetic factors could exert a relevant influence above the NO production and bioavailability and that this factors combined with environmental Hg exposure can acting synergic, increasing the susceptibility to Hg cardiovascular effects, through the modulation of the eNOS activity.

Estudiamos los efectos que la exposición Metilmercurio (MeHg) y los bifenilos policlorados PCB153 y PCB126, durante la gestación y lactancia, a tiene sobre la capacidad de aprendizaje en ratas adultas y la relación de las alteraciones causadas con la función de la vía glutamato-óxido nítrico-GMP cíclico en el cerebro. Tanto el MeHg como los PCBs (de la familia de los hidrocarburos aromáticos halogenados) son contaminantes de gran persistencia en el medio ambiente. Se incorporan a la cadena trófica y se concentran especialmente en pescados, mariscos y mamíferos marinos, lo cual supone la exposición de la población humana a estas sustancias. Estos contaminantes son neurotóxicos asociados alteraciones cognitivas y motoras en niños y animales de laboratorio y existe preocupación ante los posibles efectos que la exposición a mezclas de los mismos, caso frecuente en la dieta, pueda tener. Se sabe que estas sustancias producen alteraciones en el citoesqueleto, estrés oxidativo, alteraciones de membrana y de transduccion de señales, disminución en la síntesis de proteínas y alteraciones en la neurotransmisión (dopamina, GABA, glutamato). El sistema nervioso en desarrollo es muy vulnerable a los neurotóxicos debido a la ausencia de barrera hematoencefálica y a los procesos de desarrollo que son regulados por señales químicas. Estos estudios se llevaron a cabo en ratas nacidas de madres expuestas durante la gestación y la lactancia (G7-PND21) a: Vehículo (control): 5g Transgel y DMSO (5 ul/Kg/día); MeHg, Chloride: 0,5 mg/kg/día; PCB153: 1 mg/Kg/día PCB126: 100 ng/Kg/día; PCB153+MeHg: 1 y 0,5 mg/kg/día respectivamente; PCB126+MeHg: 100 ng y 0,5 mg/kg/día respectivamente. La exposición perinatal a MeHg, PCB153 o PCB126 disminuye la capacidad de las ratas para aprender la tarea del laberinto en Y y la función de la vía Glu-NO-GMPc en cerebelo a los 3 meses de edad. Sin embargo, la exposición a combinaciones de MeHg con PCB153 o PCB126 no afecta a la capacidad de aprendizaje en el laberinto en Y ni la función de la vía Glu-NO-GMPc a esta edad. Realizamos estos mismos estudios en ratas de 8 meses para determinar la influencia de la edad: En las ratas control, tanto la función de la vía Glu-NO-GMPc como la capacidad de aprendizaje en el laberinto en Y se deterioran fisiológicamente con la edad. En las ratas expuestas prenatalmente a PCB153, PCB126, MeHg o PCB126 + MeHg la función de la vía Glu-NO-GMPc y la capacidad de aprendizaje no disminuyen a los ocho meses en comparación con los tres meses de edad, ya que están a los tres meses están al nivel de ratas más viejas. Para profundizar en el mecanismo molecular de las alteraciones observadas realizamos cultivos de neuronas granulares de cerebelo La exposición a MeHg, PCB126 o PCB153 in vitro reduce la activación de la vía glutamato-óxido nítrico-GMPc por NMDA en neuronas de cerebelo en cultivo reproduciendo los resultados obtenidos en cerebelo in vivo. Sin embargo, las combinaciones de PCBs con MeHg ensayadas no reproducen los resultados obtenidos in vivo. En el estudio de los mecanismos por los que estos compuestos alteran la función de la vía Glu-NO-GMPc hemos comprobado que la exposición crónica a PCB153 o PCB126 in vitro aumenta los niveles basales de GMPc. La exposición crónica in vitro a PCB153 o a MeHg reduce la activación de la guanilato ciclasa soluble por NO, pudiendo ser esta la causa de la disminución de la función de la vía Glu-NO-GMPc. El PCB126 disminuye la función de la vía Glu-NO-GMPc sin afectar la activación de la guanilato ciclasa por el NO, indicando que los mecanismos por los que el PCB126 y el PCB153 afectan la función de esta vía son diferentes.
Prenatal exposure to polychlorinated biphenyls (PCBs) or methyl-mercury contaminating food may affect brain development, leading to long-term alterations in cognitive function. Both types of contaminants, PCBs and methyl-mercury, are often present in the same food samples, especially fish in some polluted areas. Exposure to combinations of neurotoxicants may exert different effects on the developing nervous system than exposure to individual contaminants. Developmental exposure (during pregnancy and lactation) to PCB126 or PCB153 impairs learning ability when the rats are 3 months old. Impairment of learning seems to be a consequence of impairment of the function of the glutamate-nitric oxide-cGMP pathway in brain in vivo. The aims of the present work were 1) to assess whether perinatal exposure to MeHg also affects the function of the glutamate-NO-cGMP pathway in brain in vivo as analyzed by in vivo brain microdialysis and/or the ability to learn the Y maze task when the rats are 3 months old, and 2) to assess whether perinatal exposure to combinations of MeHg with PCB153 or PCB126 potentiates, decreases or does not modify the effects of the individual neurotoxicants. Perinatal exposure to PCB126, PCB153 or MeHg impaired the function of the glutamate-NO-cGMP pathway in cerebellum and learning ability. However, co-exposure to PCB126+MeHg or PCB153+MeHg did not impair the pathway or learning ability. Performing the same experiments on 8 months old rats we observed that Y maze performance and the function of the glutamate-NO-cGMP pathway in 3-months-old exposed rats is similar to 8-month-old control rats, but do not worsen with age, suggesting an acceleration of aging effects in this pathway and task performance by exposure to these neurotoxicants. We have also used cerebellar granule cells cultures to assess molecular effects on the Glu-NO-cGMP pathway in vitro. In vitro chronic exposure to these neurotoxicants does reduce the function of the Glu-NO-cGMP pathway, but the combination of PCBs with MeHg do not reproduce the protective effect observed in vivo. This could be due to the absence of astrocytes in culture or the modulatory effects of synapses and signal transduction pathways triggered in vivo that cannot be reproduced in our in vitro model.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Methylmercury (MeHg) is a highly toxic environmental contaminant that can be accumulated on several tissues, inducing cellular dysfunction on various organs, especially in the central nervous system (CNS). The mechanisms involved in the uptake, accumulation and toxicity of mercury (Hg) remain unclear. However, it has been suggested that the neurotoxicity mediated by MeHg induces changes in both glutamatergic system and calcium homeostasis. Indeed, the literature reports that calcium per se is able in inducing cellular damage. Thus, mercury and calcium can exert distinct or linked toxic effect that lead to mitochondrial and cellular dysfunction. The purpose of this study was to analyze the mechanisms of uptake and accumulation of mercury on liver slices exposed to MeHg or MeHg-Cysteine complex, as well as to compare the mitochondrial and cellular toxicity caused by both forms of MeHg. Moreover, this work examined the role of glutamatergic system on the toxicity mediated by MeHg in slices of cerebral cortex from rats and the effects of calcium exposure in mitochondria sustained with different energetic substrates. Our results showed that the mercury uptake was higher in the slices exposed to the MeHg-Cys complex that MeHg exposed slices. Indeed, the pretreatment with methionine (Met) (for 15 min.) reduced Hg uptake in liver slices. Likewise, mitochondria isolated of liver slices showed similar effect on Hg uptake. Parameters as free radical generation; oxygen consumption and mitochondrial function/Cell viability were more affected by MeHg-Cys complex than MeHg alone. Met pre-treatment was effective in preventing the MeHg or MeHg-Cys-induced toxicity in both liver slices and mitochondria. In cortical brain slices, the neurotoxicity induced by MeHg was verified only at higher concentration tested and after 2 or 5 hours of exposure. In addition, compounds that potentially modulate glutamatergic system (MK-801, guanosine, organo selenium compounds) were effective in preventing the MeHg-induced free radical generation. In mitochondria isolated from liver, Ca2+ caused an inhibition on the complex I activity; however, calcium did not alter the mitochondrial complex II activity. At low concentration, calcium exposure caused a small decrease in the mitochondrial membrane potential (ΔΨm) in Malate/Glutamate (Ma/Glu) and Succinate (Succ)-supported mitochondria. On the order hand, higher calcium levels were associated with a total ΔΨm loss in both Mal/Glu and Succ-oxidizing mitochondria. The mitochondrial redox state (NADP(H) and GSH pool) and oxygen consumption were extremely affected by calcium exposure only in Succ-supported mitochondria. Indeed, calcium caused an increase in free radical generation in mitochondria sustained with complex II substrate when compared to Mal/Glu-supported mitochondria. Taken together, our data collaborate to understanding the molecular mechanisms involved on the toxicology of mercury and calcium and consequently provide basis for further investigations on the role of Ca2+ and mercury in mitochondrial dysfunctions. In addition, the results obtained here may contribute to the discovery of new therapeutic agents capable of preventing or minimizing the damage induced by MeHg intoxication.
O metilmercúrio (MeHg) é um contaminante ambiental altamente tóxico que pode ser bioacumulado em diferentes tecidos e consequentemente induzir disfunções celulares em diversos órgãos, especialmente no sistema nervoso central (SNC). Os mecanismos pelos quais o mercúrio (Hg) entra nos tecidos, se acumula e causa toxicidade em células e organelas ainda não se encontram totalmente elucidados. No entanto, estudos têm sugerido que a neurotoxicidade mediada pelo MeHg envolve alterações no sistema glutamatérgico e na homeostase do cálcio. Por outro lado, sabe-se que o cálcio (Ca2+) per se causa efeitos tóxicos nas células e principalmente em mitocôndrias. Assim o Hg e o Ca2+ podem induzir efeitos distintos ou interligados, os quais geralmente culminam com disfunção mitocondrial e morte celular. Com base nestes parâmetros, o presente trabalho visa elucidar os possíveis mecanismos moleculares envolvidos na captação e no acúmulo de Hg em fatias hepáticas expostas a forma livre de MeHg+ ou à forma complexada MeHg-Cisteína (MeHg-Cys), bem como, relacionar estes aspectos com a toxicidade celular e mitocondrial causada por ambas as formas de MeHg. Também foi alvo deste estudo a investigação do papel do sistema glutamatérgico na toxicidade mediada pelo MeHg em fatias de córtex cerebral de ratos e os efeitos do cálcio em mitocôndrias isoladas e sustentadas com diferentes substratos energéticos. Com relação à captação de Hg, nossos resultados mostram que fatias expostas ao complexo MeHg-Cys acumulam mais Hg que fatias expostas ao MeHg sozinho. Também foi observado que o pré-tratamento (15 min) com metionina (Met) reduziu significativamente a captação e o acúmulo de Hg nas fatias. Resultados similares foram verificados em mitocôndrias isoladas dessas fatiais. Nos parâmetros bioquímicos: geração de radicais livres, consumo de oxigênio e viabilidade celular/atividade mitocondrial, o complexo MeHg-Cys causou efeitos mais tóxicos quando comparado com o MeHg sozinho. O pré-tratamento com Met foi efetivo em prevenir as alterações mediadas por ambas as formas de mercúrio testadas. Os efeitos neurotóxicos do MeHg em fatias de córtex cerebral foram observados apenas nas maiores concentrações usadas e após 2 ou 5 horas de exposição. A utilização de compostos que possivelmente modulam a homeostase glutamatérgica (MK-801, guanosina e compostos orgânicos de selênio) preveniram os efeitos induzidos por MeHg na geração de radicais livres. Os efeitos do cálcio foram analisados em mitocôndrias isoladas e sustentadas com o substrato energético do complexo mitocondrial I: Malato/Glutamato (Mal/Glu) e do complexo II Succinato (Succ). Os resultados obtidos mostram que o cálcio inibiu a atividade complexo I; mas não alterou a atividade complexo II. Em baixas concentrações o cálcio causou uma pequena diminuição no potencial de membrana (ΔΨm) nas mitocôndrias sustentadas com Mal/Glu ou Succ. Por outro lado, uma perda total do potencial foi observada quando as mitocôndrias, sustentadas com ambos os substratos, foram expostas a altas concentrações de cálcio. A exposição ao cálcio causou uma redução no potencial redox (conteúdo NADP(H) e GSH) e no consumo de oxigênio nas mitocôndrias sustentadas com Succ quando comparado com as que receberam Mal/Glu. A geração de radicais livres foi aumentada em mitocôndrias expostas ao cálcio e sustentadas com Succ quando comparadas com as mitocôndrias sustentadas com substrato do complexo I. De forma geral, nossos resultados colaboram para a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na citotoxicidade induzida por MeHg e por cálcio, bem como para um melhor entendimento sobre o papel destes elementos na indução de disfunção mitocondrial. Além disso, os resultados obtidos poderão contribuir para a descoberta de novos agentes terapêuticos usados para prevenir ou minimizar danos teciduais associados à intoxicação humana por MeHg.