Academic literature on the topic 'MicroARNs (miRs)'

Abstract Circular RNAs (circRNAs) represent a new class of gene products involved in many biological processes. Due to their ability to bind and modulate co-interacting proteins and microRNAs (miRs), circRNAs represent new signaling mediators in cell biology and cancer processes. Recently, we identified circRNAs from the PAX5 oncogene (circPAX5) in B-cells. Given that PAX5 gene products are well established as potent oncogenic regulators of B-cell cancer lesions, we hypothesized that circPAX5 may also be potentially involved in pathogenic processes of B-cell malignancies. In this study, we wanted to understand the role of circPAX5 in B-cell cancer processes and elucidate new potential targets for diagnostic and therapeutic avenues. Using a series of B-cell cancer models and clinical samples, we sequenced, mapped, and profiled circPAX5 expression profiles and found that circPAX5 products are indeed overexpressed in various cancer cell types where the predominant expressed isoform consisted of exons 2 to 5 (circPAX5_2-5) of the PAX5 locus. In addition, we isolated circPAX5 complexes from cancer cells and identified co-interacting small non-coding RNAs, notably microARNs (miRs) by deep sequencing. To further elucidate the functional role of circPAX5 and miR co-interactions, selected miRs from the list were then conditionally overexpressed in B-cells followed by cellular phenotypic assays. Altogether, our results characterize new signaling products and pathways in B-cells. Our data also suggests that circPAX5 products are involved in B-cell cancer processes and could potentially represent new cancer pathways targeted for strategic therapeutic and/or diagnostic strategies in B-cell cancer lesions Citation Format: Danick M. Martin, Brandon Hannay, Alexis Martin, Vanessa Veilleux, Nicholas Finn, Gilles A. Robichaud. Circular RNAs from the PAX5 oncogene are overexpressed in B-cell malignancies and modulate cancer processes. [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2023; Part 1 (Regular and Invited Abstracts); 2023 Apr 14-19; Orlando, FL. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2023;83(7_Suppl):Abstract nr 3812.

Le premier objectif de ce travail était d'identifier les miRs associés aux calcifications vasculaires (CV), de caractériser leur implication dans la minéralisation des CMLVs, et de déterminer leurs gènes cibles. Le second objectif était d’étudier les mécanismes de l’hétérogénéité artérielle en comparant le phénotype des CMLVs carotides et fémorales, et leur réponse aux stimuli pro-athérosclérotiques. Premièrement, nous avons utilisé des artères athéromateuses humaines calcifiées et non calcifiées (Biocoll.ECLAGEN) pour identifier les miRs associés aux CV en combinant une analyse miRNomique (puces microfluidiques) et transcriptomique pour sélectionner des miRs candidats et leurs gènes cibles prédits. Nous avons ensuite validé le rôle fonctionnel des miRs candidats dans la minéralisation cellulaire des CMLVs humaines aortiques. Deuxièmement, nous avons extrait des CMLVs d’artères carotides et fémorales saines (Biocoll.ECLA-H) pour étudier les différences phénotypiques (marqueurs contractiles/inflammatoires, migration, contractilité, captation des lipides) à l’état basal et après stimulation par des cytokines pro-inflammatoires (IL1β, IL6) ou pro-fibrosantes (TGFβ et PDGF). Notre étude a d’abord permis l’identification de 12 miRs associés aux CV. Parmi eux, nous avons montré que l'expression des miR136, miR155 et miR183 était régulée pendant la minéralisation des CMLVs, que leur surexpression induisait la minéralisation des CMLVs et des modifications phénotypiques transcriptionnelles. L'analyse croisée a conduit à l'identification des voies CD73 et Smad3 comme gènes cibles prédits responsables de la fonction pro-minéralisante du miR155. Dans un deuxième temps, l’étude phénotypique comparative des CMLVs carotides et fémorales nous a permis de montrer certaines différences transcriptionnelles, l’expression des marqueurs d’activation (ICAM-1, VCAM-1) était supérieure dans le territoire carotidien, l’expression des marqueurs contractiles (ACTA2, SM22α, SMMHC) était supérieure dans le territoire fémoral. Les expériences préliminaires d’analyse de contractilité et de réponse au stress lipidique suggéraient une tendance à une contractilité et une captation de lipides plus importante dans le territoire fémoral. Nous n’avons pas montré de différence lors de l’analyse des switch phénotypiques et de la migration cellulaire. Ces résultats montrent le bénéfice potentiel de l'inhibition du miR155 pour limiter le développement des calcifications vasculaires dans les lésions athéromateuses des artères périphériques
The first objective of this work was to identify the miRs associated with vascular calcification (VC), to characterise their involvement in the mineralisation of VSMCs, and to determine their target genes. The second objective was to study the mechanisms of arterial heterogeneity by comparing the phenotype of carotid and femoral VSMCs and their response to pro-atherosclerotic stimuli. Firstly, we used calcified and non-calcified human atheromatous arteries (Biocoll.ECLAGEN) to identify VC-associated miRs by combining miRNomic (microfluidic arrays) and transcriptomic analysis to select candidate miRs and their predicted target genes. We then validated the functional role of candidate miRs in cell mineralisation of human aortic VSMCs. Secondly, we extracted VSMCs from healthy carotid and femoral arteries (Biocoll.ECLA-H) to study phenotypic differences (contractile/inflammatory markers, migration, contractility, lipid uptake) in the basal state and after stimulation with pro-inflammatory (IL1β, IL6) or pro-fibrotic cytokines (TGFβ and PDGF). In our study, we first identified 12 miRs associated with VC. Among them, we showed that the expression of miR136, miR155 and miR183 was regulated during VSMC mineralisation and that their overexpression induced VSMC mineralisation and phenotypic transcriptional changes. Cross-analysis led to the identification of the CD73 and Smad3 pathways as predicted target genes responsible for the pro-mineralising function of miR155. Secondly, a comparative phenotypic study of carotid and femoral VSMCs allowed us to demonstrate several transcriptional differences, with higher expression of activation markers (ICAM-1, VCAM-1) in the carotid territory and higher expression of contractile markers (ACTA2, SM22α, SMMHC) in the femoral territory. Preliminary experiments analysing contractility and response to lipid stress suggested a trend towards greater contractility and lipid uptake in the femoral territory. No difference was observed when phenotypic switches and cell migration were analysed. These results demonstrate the potential benefit of miR155 inhibition in limiting the development of VC in atheromatous lesions of peripheral arteries

Les tumeurs de vessie suivent deux voies de progression tumorale. La voie des tumeurs papillaires qui progressent rarement vers des tumeurs invasives mais qui récidivent très fréquemment et la voie des carcinomes in situ (CIS) qui progressent pour envahir le chorion puis le muscle. Les tumeurs infiltrant le muscle sont de mauvais pronostic et les traitements par chimiothérapie restent d’efficacité limitée. Il est alors important d’en comprendre les bases moléculaires. Les microRNAs sont d’importants régulateurs de l’expression post-transcriptionnelle des gènes. Des perturbations de leur expression et/ou de leur activité contribuent au développement tumoral en dérégulant l’expression de gènes clés dans les cancers. Nos travaux ont porté sur l’étude de l’expression et des fonctions des microRNAs dans la carcinogenèse urothéliale. Dans la première partie, nous avons choisi d’étudier, par une approche de gènes candidats, miR-155, un oncomiR dont l’expression dérégulée a été rapportée dans plusieurs cancers mais pas encore dans le cancer de la vessie. J’ai identifié une surexpression significative de ce miARN dans un sous-groupe de cancers invasifs de vessie. Ensuite, j’ai montré par des analyses fonctionnelles, le rôle de miR-155 dans l’invasion et la migration tumorale mais pas dans la prolifération cellulaire. Dans la deuxième partie, nous avons utilisé une approche plus globale. J’ai d'abord effectué une revue extensive de la littérature pour rechercher les miR dont l'expression avait été montrée comme dérégulée dans les cancers de vessie et/ou les miR impliqués fonctionnellement dans ce cancer. J’ai ensuite réalisé une analyse multiparamétrique en intégrant les données d'expression de ces miR, les données anatomopathologiques et moléculaires (stade et grade, statut mutationel de TP53 et FGFR3, phénotype épigénétique MRES et signature CIS) et les données du transcriptome (puces Affymetrix U133 Plus 2.0), des altérations génomiques (puces Illumina 370.000 sondes) et de méthylation (puces Illumina 27.000 sondes). Ce travail m’a permis, d'identifier des miR associés à l'une des deux voies de progression identifiées dans les cancers de vessie et de proposer des cibles candidates de ces miR. La recherche des altérations épigénétiques pouvant affecter l’expression de ces miR a permis d’identifier une association significative entre l’expression d’un miARN (miR-17-5p) et la méthylation d’un promoteur. En revanche les altérations génétiques n’ont été associées à aucune expression de miR. Ce travail propose une liste de très bons candidats miARNs pour lesquels des études fonctionnelles pourront être envisagées au-delà de mon travail de thèse
Bladder tumors are characterized by two progression pathways. The first pathway leads to the developpement of papillary tumors, which are at high risk of recurrence but that rarely progress to invasive tumors. Another pathway involves carcinoma in situ (CIS), which often progresses by first invading the lamina propria and then the muscle. Tumors infiltrating the muscle have a poor prognosis and chemotherapy regimens are of limited benefits. It is yet important to understand the molecular basis underlying these events. The microRNAs are important regulators of post-transcriptional gene expression. Alteration in their expression and /or activity is believed to contribute to tumor development by deregulating the expression of cancer-related genes. Our work has been focused on studying the expression and function of microRNAs in urothelial carcinogenesis. In the first part, we employed a candidate gene approach to study miR-155, a oncomiR whose dysregulated expression has been reported in many cancers, but not in bladder cancer. I identified a significant overexpression of this miRNA in a subgroup of invasive bladder cancers. Next, I demonstrated a role for miR-155 in tumor invasion and migration, without any apparent effect on cell proliferation. In the second part, we used a more comprehensive approach in which I first conducted an extensive review of the literature to search for miR whose expression was already found to be deregulated and/or miR functionally involved in bladder cancer. I then performed a multiparametric analysis by integrating expression data of miR, pathological and molecular data (stage and grade, mutational status of FGFR3 and TP53, MRES epigenetic phenotype and CIS signature) data of the transcriptome (Affymetrix U133 Plus 2.0), genomic alterations (370,000 chips Illumina probes) and methylation (Illumina chips 27,000 probes). This work allowed us to identify miRs associated with one or the other pathway linked to progression of bladder cancer and also, it revealed candidate targets for these miRs. The search for epigenetic alterations capable to affect the expression of those miRs showed significant association between expression of a particular miRNA (miR-17-5p) and the methylation of its promoter. Genetic alterations however, have failed to associate with expression of miR. Finally, this work suggests a list of good candidates miRNAs for which future functional studies should help to get insight into the role of these miRNAs

Mon travail de thèse s’est focalisé sur l’étude du rôle des miARN comme modulateurs de l’expression des gonadotropines en réponse à un traitement par la GnRH. Dans un premier temps, nous avons étudié les miARN-132 et -212 fortement induits en réponse à la GnRH dans les cellules gonadotropes. Nous démontrons que l’induction de la production de FSH par la GnRH est dépendante de l’activation des miR-132/212 dans les cellules hypophysaires de rat et dans la lignée cellulaire gonadotrope LβT2. Nous montrons à l’aide de cette lignée que l’élévation de miR-132/212 inhibe l’expression de la lysine déacétylase SIRT1, favorisant ainsi l’acétylation inhibitrice d’un répresseur transcriptionnel de la FSH, conduisant donc à l’activation de l’expression de la FSH (Lannes et al, 2015). J’ai ensuite étudié l’action d’un miARN fortement inhibé en réponse à la GnRH, miR-125b. Nous démontrons que miR-125b bloque la signalisation Gαq/11 en réprimant plusieurs effecteurs de cette voie, sans réguler la voie Gαs. Lors de l'exposition à la GnRH, miR-125b est inactivé par transfert d’un groupement méthyle par l’ARN méthyltransférase NSun2, activée par phosphorylation Gαs/PKA-dépendante. Nous observons que l’induction demiR-132 et de la phosphatase PP1α en réponse à la GnRH dépend de la voie Gαq/11 et est induite par l’inactivation de miR-125b. Nous démontrons que NSun2 est une cible de miR-132 et que la phosphorylation de NSun2 est supprimée par la phosphatase PP1α. Des analyses cinétiques nous ont permis de décrypter le mécanisme de désensibilisation à la stimulation GnRH. Lors de la phase d’induction par la GnRH, l’activation de la voie Gαs/PKA inactive miR-125b permettant une levée d’inhibition de la voie Gαq/11 et par là, l’induction des gènes des gonadotropines, de miR-132 et PP1α. L’activation de ces derniers contribue à l’inactivation de NSun2 et à un retour de miR-125b à son état d'équilibre permettant de nouveau l’inhibition de la voie Gαq/11 et donc de l’expression des gonadotropines (Lannes et al, 2016). Notre étude montre pour la première fois le rôle crucial d’une boucle de régulation entre deux miARN dans le mécanisme de la désensibilisation de la réponse à la GnRH. Le caractère ubiquitaire des acteurs de cette boucle de régulation laisse penser qu’elle pourrait jouer un rôle plus général. Les travaux complémentaires effectués montrent que la GnRH induit la sécrétion de plusieurs miARN. In vitro, nous avons démontré que la GnRH provoque une libération calcium-dépendante de miR-125b et de miR-132 dans le milieu extracellulaire par les cellules gonadotropes. In vivo, nous mettons en évidence chez la rate et la femme, une augmentation sérique des miARN-125b et -132 au moment de la décharge ovulante de LH induite par la GnRH. Ces résultats suggèrent que la cellule gonadotrope hypophysaire est capable d’émettre un message original, sous la forme de miARN, dans la circulation sanguine. Mes travaux de thèse éclairent le rôle clé joué par les miARN dans la réponse de la cellule gonadotrope à la stimulation prolongée à la GnRH. Ils mettent en évidence l’effet bloquant d’un seul miARN, miR-125b sur la signalisation liée à la protéine Gαq/11, une voie activée par nombre de récepteurs. Ils révèlent l’existence d’une boucle de régulation responsable de la désensibilisation à la GnRH mais qui pourrait être plus largement répandue. Enfin, la sécrétion des miARN dans la circulation sanguine induite par la GnRH que nous mettons en évidence pour la première fois ouvre des perspectives particulièrement intéressantes sur la nature du signal généré par les cellules gonadotropes et permet d’envisager l’existence de nouveaux tissus cibles
GnRH is a hypothalamic neurohormone that stimulates synthesis and release of the pituitary gonadotropins, LH and FSH. Mammalian GnRH receptor lacks a C-terminal tail and is thus not submitted to homologous desensitization. Desensitization of gonadotrope cells to sustained exposure to GnRH relies on post-receptor mechanisms operating at different levels of the Gαq/11-mediated signalling pathway. GnRH was shown to modulate the expression of microRNAs (miRNAs), a new class of signalling regulators composed of small single-stranded RNAs that regulate gene expression at a post-transcriptional level. The purpose of my PhD thesis was to investigate the role of miRNAs in contributing to the regulation of gonadotrope cells by GnRH and notably to its desensitization effect. I first demonstrated that a GnRH-induced rise in miR-132 and miR-212 in rat primary pituitary culture cells and in the LβT2 murine gonadotrope cell line was necessary for efficient stimulation of FSH production. We then showed that the miR-132/212-mediated action of GnRH involved a posttranscriptional decrease of SIRT1, a lysine deacetylase. The lower level of SIRT1 allowed an increase in the acetylated form of FOXO1, a transcriptional repressor of Fshb, leading to its exit from the nucleus and to an increase in FSH expression (Lannes et al, 2015). Then, I focussed on the involvement of miR-125b, a miRNA that was strongly inhibited in response to GnRH. We showed that miR-125b blocked the Gαq/11 signalling pathway, through the repression of several effectors of this pathway, without affecting the Gαs signalling pathway. Upon exposure to GnRH, miR-125b was inactivated by methylation on adenosine by the NSun2 RNA methyltransferase. This later enzyme was activated by a Gαs/PKA-dependent phosphorylation. We observed that the induction of miR-132 and PP1α phosphatase in response to GnRH depends on a Gαq/11 activation allowed by the inactivation of miR-125b. We demonstrated that NSun2 is a target of miR-132 and that phosphorylation of NSun2 is suppressed by PP1α. Kinetic analyses enabled us to decipher the desensitization mechanism to GnRH stimulation. During the induction phase, the Gαs/PKA activation led to lower miR-125b levels, allowing Gαq/11 signalling and hence, transcriptional activation of gonadotropins genes. Co-activation of miR-132 and PP1α contributed to the inactivation of NSun2 and a return of miR-125b back to its equilibrium state leading to Gαq/11 signalling inhibition and therefore, to the arrest of gonadotropins expression (Lannes et al, 2016). Our study shows for the first time the crucial role of a miRNAs regulatory loop in the GnRH-induced mechanism of desensitization. The ubiquitous nature of the actors of this regulatory loop suggests that it may play a more general role. Additional works carried out showed that GnRH induces the secretion of several miRNAs. In vitro, we demonstrated that the GnRH causes a calcium-dependent release of miR-125b and miR-132 in the extracellular medium by the gonadotrope cells. In vivo, we highlighted a miRNA-125b and -132 increase in serum at the time of the ovulating LH surge induced by GnRH in rats and women. These results suggest that the pituitary gonadotropic cell is capable of transmitting an original message in the form of miRNA, into the bloodstream. My PhD work unravels the key role played by miRNAs in the gonadotrope cells response to GnRH-sustained stimulation. They highlight the blocking effect of a single miRNA, miR-125b on the Gαq/11 signalling, a pathway activated by many other membrane receptors. They indicate the existence of a regulation loop responsible for the desensitization to GnRH but which could be more widespread. Finally, the secretion of miRNAs in blood flow induced by the GnRH that we show for the first time opens up particularly interesting perspectives on the nature of the signal generated by the gonadotrope cells and allows to consider the existence of new target tissues

Notre étude a porté, d'une part sur l'effet du bicalutamide, un inhibiteur du récepteur aux androgènes, sur la réponse de trois lignées de cancer de prostate en association avec les rayonnements ionisants, d'autre part sur la recherche d'une corrélation entre l'expression des microARN miR-210 et miR-373 sur la tolérance à l'hypoxie et la réponse au rayonnement.Nous montrons que le bicalutamide induit un effet cytostatique et cytotoxique dans la lignée LNCaP, qui exprime le récepteur aux androgènes. Les lignées DU145 et PC3, qui n’expriment pas ou peu le récepteur, sont sensiblement plus résistantes mais sont cependant affectées par les concentrations élevées de bicalutamide. Cette sensibilité résiduelle suggère l'existence d'un mécanisme secondaire, indépendant de la voie de signalisation du récepteur aux androgènes. L'inhibition de la prolifération produite par le bicalutamide s'accompagne d'un blocage du cycle cellulaire en phase G1 avec une augmentation de l’expression de la protéine p27 et une diminution de l’expression de la protéine HER2. L'association concomitante au bicalutamide se traduit par un effet radioprotecteur dans la lignée LNCaP. Cette observation nous conduit à déconseiller l’association concomitante du bicalutamide avec la radiothérapie, notamment en cas d’irradiation hypofractionnée.Facteur bien connu de radiorésistance dans les tumeurs solides, l'hypoxie est associée à un mauvais pronostic dans les cancers de la prostate. Nos données montrent qu'en sus de l'induction de marqueurs classiques comme HIF-1α, CA9 et VEGF, l'hypoxie promeut l’expression du microARN miR-210, (mais non de miR-373) indépendamment de l’expression du récepteur aux androgènes. Les données suggèrent que miR-210, dont l'expression apparaît corrélée à la résistance à l'hypoxie, pourrait constituer un bon biomarqueur pronostique dans le cancer de la prostate. En revanche, l’inhibition de l’expression de miR-210 n'a aucun effet sur la radiosensibilité des cellules en condition d’hypoxie
The first aim of our study was to evaluate the effect of the association between bicalutamide, an androgen receptor inhibitor, and ionizing radiation in three prostate cancer cell lines. The second aim was to examine a possible a correlation between the expression of miR-210 or miR-373, the tolerance to hypoxia tolerance and the responses to radiation.We found that bicalutamide produced cytostatic and cytotoxic effects in the androgen receptor- positive LNCaP cell line. The androgen receptor-negative DU145 and PC3 cell lines were more resistant to bicalutamide. However, these cell lines were affected by high bicalutamide concentration with the same endpoints as for LNCaP cells. The inhibition of proliferation by bicalutamide was associated with G1 cell cycle phase arrest, increased expression of p27KIP1 protein, and decreased expression of HER2 protein. Last but not least, bicalutamide elicited a marked radioprotective effect in LNCaP cells when associated with concomitant irradiation. This result suggests that bicalutamide and radiotherapy should not be delivered in close temporal proximity, especially in case of hypofractionated radiotherapy protocols.Hypoxia is a well known radioresistance factor in tumors and is associated with a bad prognosis in prostate cancer. In this study, we found that hypoxia promotes the expression of HIF-1α, CA9, VEGF and miR-210 but not miR-373 in prostate cancer cell lines irrespective of their androgen receptor status.Our findings suggest that miR-210 expression is correlated with resistance to hypoxia and could be used as a prognostic marker in prostate cancer. Conversely, miR-210 inhibition did not impact the radiation susceptibility of PC3 prostate cancer cell line under hypoxia

La découverte récente d'adipocytes bruns fonctionnels chez les humains adultes a conduit à envisager leur utilisation afin d’augmenter la dépense énergétique dans de potentiels traitements contre l'obésité et les maladies associées. Par ailleurs, des ilots d’adipocytes bruns, appelés adipocytes "brite" (brown in white), émergent dans le tissu adipeux blanc après une exposition au froid ou une stimulation des récepteurs β3-adrénergiques. En utilisant les cellules hMADS, nous avons identifié plusieurs miARNs régulés pendant le « britening ». miR-125b et let-7i ont des niveaux d’expression plus bas dans les adipocytes « brites ». Des analyses fonctionnelles utilisant un « mimic » de miR-125b ou un inhibiteur ont révélé que miR-125b agit comme un frein sur le « brunissage » des cellules hMADS en altérant leur respiration ainsi que leur contenu mitochondrial. In vivo, nous avons montré que miR-125b et let-7i sont moins exprimés dans le tissu adipeux brun par rapport au tissu adipeux blanc. La stimulation des récepteurs β3-adrénergiques ou l'exposition au froid induit une diminution d’expression des miARNs dans les deux tissus et est associée à l'activation du tissu adipeux brun et au recrutement des adipocytes « brites ». Nous avons constaté que l’injection de miR-125b ou let-7i dans le tissu adipeux blanc sous-cutané inhibait l’expression de gènes du « brunissage » induite par la stimulation de la voie β3-adrénergique. En conclusion, nos observations ont montré que miR-125b et let-7i jouaient un rôle important dans la modulation des adipocytes « brites » et des adipocytes « bruns » en ciblant l’expression de gènes mitochondriaux et en diminuant la biogenèse mitochondriale
The recent discovery of functional brown adipocytes in adult humans has led to the consideration of their use to increase energy expenditure in the treatment of obesity and associated metabolic disorders. Furthermore, in rodents and humans, islands of thermogenic adipocytes, termed “brite” (brown in white) adipocytes, emerge within white adipose tissue after cold exposure or β3-adrenergic receptor stimulation. Using hMADS cells, we identified several miRNAs regulated during “britening” including miR-125b and let-7i which showed lower levels in brite adipocytes. Functional analysis using miR-125b mimic or miR-125b inhibitor transfection revealed that miR-125b-5p acts as a brake of the browning of hMADS cells by impairing respiration rate as well as their mitochondrial content. miR-125b and let-7i levels were lower in brown compared to white adipose tissue. In vivo, we showed that both miRNAs levels were down regulated in mice sub-cutaneous white and brown adipose tissues upon β3-adrenergic receptors stimulation or cold exposure, which is associated with BAT activation and brite adipocyte recruitment. We found that injection of both miRNA mimics in subcutaneous white adipose tissue inhibited β3-adrenergic-induced brown adipocyte markers expression. Altogether, our observations showed that miR-125b and let-7i played an important role in the modulation of brite and brown adipocytes function targeting oxygen consumption and mitochondrial gene expression

La spermatogenèse est un processus cyclique de différenciation aboutissant à la production de spermatozoïdes haploïdes, à partir de spermatogonies diploïdes. Ce processus est soumis à de nombreuses régulations, notamment au niveau post-transcriptionnel. Les microARN (miARN) sont de petits ARN non codant de 20 à 25 nucléotides, impliqués dans le contrôle de multiples processus biologiques, telles que la prolifération, l’apoptose et la différenciation. Afin d’étudier si les miARN pouvaient jouer un rôle dans la spermatogenèse, nous avons dans un premier temps, caractérisé les miARN exprimés lors de ce processus. Ainsi, nous avons montré que miR-34c avait une expression préférentielle dans la lignée germinale. Par ailleurs, l’expression de miR-34c n’est pas contrôlée par P53 dans les cellules germinales au contraire des cellules somatiques. Nous avons ensuite constaté que la surexpression de miR-34c dans les cellules HeLa provoquait une réorientation du transcriptome de ces cellules vers un profil germinal, ainsi que l’apparition de certains gènes préférentiellement exprimés dans le testicule. Puis, nous avons identifié les cibles de miR-34c pertinentes dans la différenciation germinale. TGIF2 et NOTCH2 constituent des cibles directes de ce miARN, impliquées dans des voies de régulation de la spermatogenèse (respectivement la voie du TGFβ et la voie Notch). Ces résultats établissent une connexion inédite entre un miARN, miR-34c, et la spermatogenèse. De plus, des cellules Souches Embryonnaires déjà engagées vers la lignée germinale (cellules ES VASA+) voient leur phénotype accentué par la surexpression de miR-34c
Spermatogenesis is a cyclic process in which diploid spermatogonia differentiate into haploid spermatozoa. This process is highly regulated, notably at the post-transcriptional level. MicroRNAs (miRNAs), single stranded non coding RNA molecules of about 20-25 nucleotides, are implicated in the regulation of many important biological pathways such as proliferation, apoptosis and differentiation. We wondered whether miRNAs could play a role during spermatogenesis. First, miRNA expression repertory was tested in germ cells and we present data showing that miR-34c was highly expressed only in these cells. Moreover, in male gonads, miR-34c expression is largely P53-independent, in contrast to somatic cells. The exploration of the expression profile of HeLa cells over-expressing miR-34c showed a shift towards testis lineage and the presence of preferentially expressed in testis genes. Furthermore, we identified miR-34c direct target genes (TGIF2 and NOTCH2) that are involved in germ lineage differentiation control (TGFβ and Notch pathway respectively). These results established a link between a miRNA miR-34c and spermatogenesis. Moreover, in ES cells over-expressing DDX4 gene (VASA-ES cells), already primed and engaged in the germ cell lineage, ectopic expression of miR-34c has a more drastic effect. We could detect an up-regulation of germ specific genes. These data suggest that miR-34c could play a role by enhancing the germinal phenotype of cells already committed in this lineage

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est une hémopathie maligne causée par l‘apparition du chromosome Philadelphie dans la cellule souche hématopoïétique (CSH), conduisant à l‘expression de la protéine de fusion BCR-ABL1. L‘activité tyrosine kinase dérégulée de cette oncoprotéine provoque l‘activation de plusieurs voies de signalisation critiques dans la leucémogenèse. Si les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) ciblant BCR-ABL1 représentent des traitements dans l'ensemble très efficaces, plusieurs études montrent que les cellules leucémiques les plus immatures de la moelle osseuse y sont insensibles. Cette thèse propose de compléter les connaissances relatives aux effets de BCR-ABL1 dans la cellule, et plus généralement aux propriétés des CSH de LMC. Notre intérêt s‘est focalisé sur le rôle potentiel des microARN. Dans un premier travail, nous nous sommes intéressés à l‘effet de l‘activité BCR-ABL1 sur le protéome et sur l‘expression des microARN dans la lignée cellulaire K562. Les résultats montrent que BCR-ABL1 régule l'expression d'un microARN fréquemment surexprimé dans les cancers, miR-21. Cet effet dépend du facteur de transcription STAT5, cible bien connue de l'activité kinase de BCR-ABL1. Dans une seconde partie, nous avons montré que dans la moelle osseuse des patients LMC, la fraction cellulaire enrichie en cellules souches (les cellules CD34+CD38low) exprime quatre microARN particuliers: mir-10a, mir-150, miR-155 et miR-146a. Deux de ces microARN (miR-150 et miR-155) sont trouvés spécifiquement dans les cellules des patients, et pas dans celles des individus sains
In chronic myeloid leukemia (CML), the activity of the constitutively active tyrosine kinase BCR-ABL1 drives the activation of the PI3K/AKT, JAK/STAT, and RAS/RAF/MEK/ERK pathways. Among other consequences, activated or inhibited transcription factors induce important modifications of the CML cells gene expression pattern that could impact cell cycle control, apoptosis and genetic instability, leading to the expansion of the oncogene-transformed cells and to the acquisition of potentially harmful de novo mutations. However, indirect BCR-ABL1-dependant regulations might also occur, for instance through the action of microRNAs (miRNAs). Among the ~2000 miRNAs reported in humans, numerous species are up- or down-regulated in various cancer models. In the context of CML however, there is no clear consensus regarding the role of specific miRNAs, despite several studies. The first aim of this thesis was to study the effects of a clinically relevant concentration of imatinib, a tyrosine-kinase inhibitor (TKI) that blocks BCR-ABL1, on the CML cell line K562: both the microRNA expression profile and the cells proteome were analyzed. Using microarray hybridization, RT-qPCR experiments and a functional assay, we identified miR-21 as one of the most significantly down-regulated microRNA in cells that were treated with imatinib. In parallel, a semi-quantitative proteomic approach identified the tumor suppressor programmed cell death protein 4 (PDCD4) as the most over-expressed protein in imatinib-treated cells. We showed that miR-21 can bind to PDCD4 3'UTR and decrease its expression. The STAT5 - miR-21 - PDCD4 pathway was conserved in CML primary CD34+ cells, and to some extent in acute myeloid leukemia (AML) models as well; the known functions of miR-21 and PDCD4 suggest that their regulation by BCR-ABL1 could participate in the antileukemic response triggered by tyrosine kinase inhibitors. In the second part of this manuscript, we was interested in the immature stem cells population that cannot be eliminated by TKI. The underlying mechanisms of this resistance are not fully understood. The TKI-resistant CML stem cells reside in the CD34+/CD38low subpopulation, that can be sorted from the mononuclear cells fraction using FACS. In this project, we propose to describe the microRNA repertoire of the CML CD34+/CD38low cells to highlight the potential role of microRNA in the resistance mechanisms by identifying some of their targets, using bioinformatic and experimental approaches. This combination of miRNome and functional analysis would allow to increase the knowledge of the biology of the TKI-resistant CML stem cells. Our results have shown that the cellular fraction enriched in stem cells (CD34+CD38low) expressed specifically four microRNA: miR-10a, miR-146, miR-150 and miR-155. It is also interested to notice that only two of them, miR-150 and miR-155, are highly expressed in CML-patient CD34+CD38low cells compared to normal cells

Les carcinomes spinocellulaires cutanés (cSCCs) sont le deuxième type de cancer par ordre de fréquence et sont responsables de 25% des décès dus aux cancers de la peau. Il est donc essentiel de caractériser les mécanismes responsables de la cancérisation de l'épiderme afin de développer de nouveaux traitements. Dans ce contexte, les miRNAs apparaissent comme des cibles de choix pour le développement de futures thérapies anti-tumorales. Toutefois, leur implication dans la physiopathologie des cSCCs est encore peu documentée. Au cours de cette étude, j’ai identifié, par séquençage à haut débit, 112 miRNAs dont l’expression est altérée au cours du développement tumoral dans un modèle murin de carcinogénèse chimique cutanée. J’ai ensuite focalisé mon attention sur le cluster miR-193b/365a et sur miR-708 dont les niveaux diminuent au cours de la progression tumorale, suggérant des fonctions de suppresseurs de tumeur. En accord avec cette hypothèse, l’expression ectopique de ces miRNAs inhibe la prolifération, la survie et la migration de cellules tumorales, alors que le blocage de leur action par des anti-sens stimule ces fonctions cellulaires dans des kératinocytes normaux. L’association d’approches in silico et d’analyses du transcriptome de cellules de cSCC sur-exprimant ces miRNAs m’a permis d’identifier leurs gènes cibles potentiels. J’ai validé KRAS et MAX comme cibles communes de miR-193b et miR-365a, et montré par l’utilisation de siRNAs que la répression de ces cibles mime les effets de ces miRNAs. Ces résultats suggérent que le ciblage de ces gènes pourrait médier en partie les effets suppresseurs de tumeur de miR-193b et de miR-365a dans les cSCCs
Cutaneous squamous cell carcinomas (cSCCs) are the second most common cancer and are responsible for up to 25% of all skin cancer deaths. It is therefore essential to characterize the mechanisms responsible for epidermis carcinogenesis to develop new treatments. In this context, miRNAs appear to be prime targets for the development of future anti-tumor therapies. However, their involvement in the pathophysiology of cSCCs is still poorly documented. In this study, I identified using Small RNA sequencing, 112 miRNAs whose expression is altered during tumor development in a mouse model of cutaneous two-stage chemical carcinogenesis. Then, I focused my attention on the miR-193b/365a cluster and on miR-708, that are down-regulated during tumorigenesis, suggesting tumor suppressor functions. Consistent with this hypothesis, the ectopic expression of these miRNAs inhibit the proliferation, survival and migration of tumor cells, while blocking their action with antisense oligonucleotides stimulates these cellular functions in normal keratinocytes. Combining in silico target-prediction approaches and transcriptome analyzes of cSCC cells over-expressing these miRNAs, I identified their potential target genes. I validated KRAS and MAX as direct targets of miR-193b and miR-365a, and I showed that repression of these genes using siRNAs mimics the effects of these miRNAs. These results suggest that targeting these genes might mediate, at least in part, the tumor suppressor action of miR-193b and miR-365a in cSCCs

Les microARNs sont de petits ARN non codants régulant négativement l'expression génique au niveau post-transcriptionnel. Ils interviennent dans de nombreux processus biologiques et leur rôle dans la régulation de l'homéostasie cutanée est clairement démontrée. Cependant, leur fonction durant le vieillissement épidermique n'a jamais été étudiée. Nous avons donc réalisé une analyse exhaustive du miRnome épidermique durant son vieillissement afin d'identifier les microARNs différentiellement exprimés avec l'âge dans ce tissu. Plusieurs microARNs significativement modulés dans des kératinocytes âgés, nous ont permis d'établir une signature du vieillissement épidermique. Parmi eux, les deux brins du microARN miR-30a sont induits dans les épidermes âgés. La construction d'un lentivirus permettant la surexpression stable et inductible de ce microARN a facilité son étude fonctionnelle dans un modèle organotypique d'épiderme reconstruit. Nous avons observé que la surexpression de ce microARN dans un modèle de culture tridimensionnelle induit un phénotype épidermique présentant des similitudes avec celui observé durant son vieillissement chronologique et caractérisé par une forte altération de la différenciation des kératinocytes, par une perturbation de sa fonction barrière et par une augmentation de l'abondance des cellules apoptotiques. Ce projet de thèse a permis l'identification de 3 cibles directes de miR-30a dans les kératinocytes. Il s'agit de LOX, codant pour la lysyl oxydase qui intervient dans la balance prolifération/différenciation des kératinocytes, d'AVEN, un inhibiteur de caspase et d'IDH1, codant pour l'isocitrate déshydrogénase, enzyme du métabolisme énergétique. Ainsi, ce projet de thèse a révélé un nouveau microARN acteur du vieillissement épidermique et a permis de de mettre à jour de nouveaux mécanismes moléculaires expliquant certaines altérations phénotypiques observées dans l'épiderme avec l'âge
MicroRNAs are small non-coding RNA that negatively regulate gene expression at the post-transcriptional level. There are involved in many biological processes and play a key role in the regulation of skin homeostasis. However, their function during epidermal aging has never been studied. We performed an exhaustive analysis of the epidermal miRnome during its aging in order to identify microRNAs differentially expressed with age in this tissue. Several microRNAs significantly modulated in elderly keratinocytes, allowed us to establish a signature of epidermal aging. Among them, the two strands of the microRNA miR-30a are induced in aged epidermis. The construction of a lentivirus allowing inducible and stable overexpression of this microRNA facilitated its functional study in an organotypic model of reconstructed epidermis. We observed that the overexpression of this microRNA in a three-dimensional culture model induces an epidermal phenotype similar of those observed during its chronological aging characterized by a strong alteration of keratinocyte differentiation, by a disturbance of its barrier function and by an increase in the abundance of apoptotic cells. This thesis project allowed the identification of three miR-30a targets in keratinocytes : LOX encoding lysyl oxidase, which plays a role in proliferation/differentiation balance of keratinocytes, AVEN encoding a caspase inhibitor and IDH1 encoding isocitrate deshydrogenase, a key enzyme of cellular metabolism.Our work revealed a new miRNA actor and deciphered new molecular mechanisms to explain some alterations observed in epidermis during aging, especially those concerning keratinocytes differentiation and apoptotic death

L’acide docosahexaénoïque (DHA) est un acide gras polyinsaturé oméga-3 avec des propriétés anti-inflammatoires et anti-tumorales. L’effet du DHA dans le cadre du cancer colorectal pourrait être la conséquence d'une action anti-proliférative directe sur les cellules cancéreuses et de sa capacité à réduire l’inflammation propice au développement de la tumeur. Le Tumor Necrosis Factor-alpha (TNFa) est une cytokine pro-inflammatoire et présente des effets paradoxaux. En fonction du contexte cellulaire, le TNFa activera une voie de signalisation dépendante de la kinase RIP1 engageant la cellule cancéreuse vers la prolifération ou la mort cellulaire. Notre objectif fut d'évaluer le rôle du TNFa dans l'effet anti-prolifératif du DHA sur des cellules cancéreuses coliques et de préciser les mécanismes moléculaires régulant l'expression de cette cytokine. Le DHA induit l'expression de TNFa et sa sécrétion par les cellules cancéreuses. Nous avons montré que des anticorps neutralisant l'action autocrine du TNFa sur les cellules cancéreuses prévenait l'effet pro-apoptotique du DHA et abolissait l'effet anti-cancéreux observé dans des souris nude avec tumeurs HCT-116 sous régime DHA. L’induction de l'expression de TNFa par le DHA prend son origine à un niveau post-transcriptionnel par la répression du microARN miR-21 perdant sa capacité à dégrader l'ARNm TNFa. Le DHA par l'activation des kinases AMPKa et RIP1 déclenche la translocation nucléaire du facteur de transcription FOXO3a se fixant sur le promoteur miR-21 et diminuant l’expression de ce microARN. Nos travaux mettent en évidence un nouveau mécanisme moléculaire soutenant l'action anti-tumorale du DHA
Docosahexaenoic acid (DHA) is an omega-3 polyunsaturated fatty acid with anti-inflammatory and anti-tumoral properties. The anti-tumor effect of DHA in colorectal cancer might be attributed to direct anti-proliferative action on cancer cells and to its ability to reduce inflammatory status involved in tumor growth. Tumor Necrosis Factor-alpha (TNFa) is an inflammatory cytokine with paradoxical effect in cancer biology. According to the cellular context, TNFa activates RIP1 kinase dependent signaling pathway leading to proliferation or cell death. Our aim was to evaluate the role of TNFa in anti-proliferative effect of DHA in colon cancer cells and to precise the molecular mechanisms regulating TNFa expression.DHA treatment increased TNFa expression and secretion by cancer cells. We have shown that neutralization of autocrine TNFa action prevented the pro-apoptotic effect of DHA colon cancer cells and abolished anti-cancer effect in tumor HCT-116 bearing nude mice fed a DHA-enriched diet. Induction of TNFa expression by DHA occured at post-transcriptional level through microRNA miR-21 repression reducing its ability to induce TNFa mRNA degradation. DHA activates AMPKa and RIP1 kinases triggering nuclear translocation of the transcription factor Foxo3a which bound to miR-21 promoter and repressed the microRNA expression. Our works highlight a new molecular mechanism supporting the anti-cancer action of DHA