Dissertations / Theses: 'Microbiologia e microbiologia clinica'

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Martins, Angela Guimarães. "Avaliação clinica e microbiologica do uso de pontas sonicas diamantadas na descontaminação radicular (estudo longitudinal)." [s.n.], 2005. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/290413.

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Abstract:

Orientador: Antonio Wilson Sallum
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba
Made available in DSpace on 2018-08-05T21:20:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins_AngelaGuimaraes_D.pdf: 694133 bytes, checksum: 433f44b9064bb37a64b1dd3af169f058 (MD5) Previous issue date: 2005
Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar longitudinalmente a efetividade de pontas sônicas diamantadas (RootplanerTM), na descontaminação de superfícies radiculares de dentes unirradiculares sob parâmetros clínicos (índice de placa, sangramento à sondagem, profundidade de sondagem, nível de inserção clínica relativo, e retração gengival) e microbiológicos (cultura microbiana e PCR), comparados a instrumentação com curetas. Esta pesquisa trata-se de um teste clínico controlado randomizado com um delineamento em parcela subdividida, envolvendo 12 pacientes com moderada a avançada periodontite crônica apresentando profundidade de sondagem ³ 5 mm. Os pacientes foram submetidos a tratamento inicial com sessões de remoção de placa e cálculo supragengival e instruções de higiene bucal. Posteriormente, retalho cirúrgico foi realizado e a superfície dos dentes instrumentada. Os parâmetros clínicos e microbiológicos foram avaliados no tempo inicial (T0), e em 30 dias, 6, 12 e 24 meses após a cirurgia. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística através de Análise de variância (ANOVA), teste de Tukey, realizados para todos os períodos (a=0.05), Friedman e Wilcoxon foram usados na avaliação não paramétrica das unidades formadoras de colônias. Os resultados mostraram que quando as pontas sônicas diamantadas foram comparadas a instrumentos manuais nenhuma diferença estatística foi encontrada em redução de profundidade de sondagem, índice de placa, sangramento a sondagem, ganho de inserção, recessão gengival. Bem como, nas reduções das contagens microbiológicas das UFCs e diminuição de A.a., P.g. e T.f.. Os resultados não mostraram diferença significativa entre os tratamentos, apenas entre os períodos de avaliação. Concluiu-se, dentro das limitações do estudo que as pontas sônicas diamantadas podem ser uma boa alternativa terapêutica para instrumentação radicular, mantendo a estabilidade da saúde dos tecidos periodontais em longo prazo
Abstract: The aim of this study was to evaluate the long term the effectiveness of diamond-coated sonic scaler insert (RootplanerTM), in the root surface debridement in single-rooted teeth on clinical (plaque index, bleeding on probing, probing depth, relative attachment level clinical, and gingival recession) and microbiological parameters (culture and PCR), compared to hand instruments. The investigation was a test-controlled randomized clinical trial with a splith-mouth design involving 12 patients with moderate to advanced chronic periodontites with pocket depth ³ 5 mm. The patients were submitted to initial treatment sessions of supragingival plaque and cauculus removal and were also instructed in oral hygiene techniques. After, flap surgery was carried out and the tooth surface instrumented. Clinical and microbiological parameters, were evaluated at baseline (0), in the 30 days, 6, 12 and 24 months after surgery. Analysis of variance and Tukey test was done goes all periods (a=0.05) and the results showed that when diamond-coated sonic scaler insert was compared to manual scalers, showed no statistical differences in probing depth reduction, plaque index, bleeding on probing, relative attachment level gain, gingival recession. As well as, reductions of the microbial counts and colony-forming units using Friedman and Wilcoxon test, and decrease of A.a, P.g. and T.f.. There were no significant differences between regard with treatments for all parameters at each re-examination. Within the limits of this study, it can be concluded that the use the of diamond-coated sonic scaler insert can be a good alternative for root debridement, maintaining the stability of the periodontal tissues in long term
Doutorado
Periodontia
Doutor em Clínica Odontológica

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Vitone, Francesca <1973&gt. "Tecniche di biologia molecolare per la determinazione quantitativa di HIV-DNA (integrato ed episomale) in soggetti HIV-1 infetti." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/76/1/tesi_dottorato%2CVitone_2003-2007.pdf.

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Vitone, Francesca <1973&gt. "Tecniche di biologia molecolare per la determinazione quantitativa di HIV-DNA (integrato ed episomale) in soggetti HIV-1 infetti." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/76/.

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Filippone, Claudia <1978&gt. "Analisi funzionale di cloni genomici e subgenomici di parvovirus B19." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/79/1/Tesi_Claudia_Filippone.pdf.

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Filippone, Claudia <1978&gt. "Analisi funzionale di cloni genomici e subgenomici di parvovirus B19." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2007. http://amsdottorato.unibo.it/79/.

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Leo, Elisa <1981&gt. "Marker molecolari relativi all'infezione da Papillomavirus umani: significato diagnostico e prognostico in lesioni virus-correlate." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2297/1/leo_elisa_tesi.pdf.

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Abstract:

Introduzione: Il cervico-carcinoma è la seconda neoplasia maligna per incidenza e mortalità nelle donne in tutto il mondo dopo il cancro al seno. L’infezione persistente da Papillomavirus Umani (HPV) è causa necessaria dell’insorgenza del cervico-carcinoma e delle sue lesioni pre-cancerose. L’infezione da HPV si associa anche ad altri carcinomi del distretto ano-genitale (a livello anale, vulvare, vaginale e del pene) e a circa il 25% dei carcinomi squamosi dell’orofaringe. I circa 40 genotipi di HPV che infettano la mucosa genitale vengono suddivisi in alto rischio (HR-HPV) e basso rischio (LR-HPV) oncogeno a seconda della alta e bassa associazione con la neoplasia cervicale. I 13 genotipi a più alto rischio oncogeno sono 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68. Di questi, otto (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 e 58) sono associati alla maggior parte dei carcinomi cervicali (circa 89%) e i genotipi 16 e 18 da soli sono riscontrati nel 70% circa delle neoplasie. L’insorgenza e progressione delle lesioni preneoplastiche cervicali è, però, associata non solo alla presenza di HPV ad alto rischio, ma, soprattutto, alla persistenza virale (> 18 mesi), alla capacità di integrazione degli HPV ad alto rischio e alla conseguente sovraespressione delle oncoproteine E6/E7. Inoltre, l’integrazione è spesso favorita da un’alta carica virale soprattutto per quanto riguarda alcuni genotipi (HPV16 e 18). L’infezione da HPV non interessa solo la cervice uterina ma tutto il distretto ano-genitale e quello testa-collo. L’HPV, in particolare il genotipo 16, è implicato, infatti, nell’insorgenza delle lesioni preneoplastiche della vulva (VIN) classificate come VIN classiche e nei carcinomi ad esse associati. L’incidenza del carcinoma vulvare in Europa è di 1.5/100.000 di cui circa il 45% è dovuto a HR-HPV (80% ad HPV16). Nonostante l’associazione tra HPV16 e carcinoma vulvare sia alta, ancora poco si conosce sul ruolo della carica virale e dell’integrazione in tali lesioni. Le lesioni che possono presentarsi nella regione testa-collo possono essere sia di natura benigna che maligna. I genotipi più frequentemente riscontrati in associazione a lesioni benigne (papillomi) sono HPV 6 e 11, quelli associati a forme tumorali (HNSCC) sono il genotipo 18 ma soprattutto il 16. Molti aspetti del coinvolgimento di HPV in queste patologie non sono ancora perfettamente conosciuti e spesso studi su tale argomento hanno mostrato risultati contraddittori, soprattutto perché vengono utilizzate metodiche con gradi diversi di sensibilità e specificità. Recenti dati di letteratura hanno tuttavia messo in evidenza che i pazienti affetti da HNSCC positivi ad HPV hanno una elevata risposta al trattamento chemioradioterapico rispetto ai pazienti HPV-negativi con un notevole impatto sul controllo locale e sulla sopravvivenza ma soprattutto sulla qualità di vita di tali pazienti, evitando di sottoporli a chirurgia sicuramente demolitiva. Scopo del lavoro: Sulla base di queste premesse, scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’importanza di marker quali la presenza/persistenza di HPV, la carica virale, la valutazione dello stato fisico del genoma virale e l’espressione degli mRNA oncogeni nella gestione di pazienti con lesioni preneoplastiche e neoplastiche di diverso grado, associate a papillomavirus mucosi. Per la valutazione dei markers virologici di progressione neoplastica abbiamo sviluppato dei saggi di real time PCR qualitativi e quantitativi studiati in modo da poter fornire, contemporaneamente e a seconda delle esigenze, risposte specifiche non solo sulla presenza e persistenza dei diversi genotipi di HPV, ma anche sul rischio di insorgenza, progressione e recidiva delle lesioni mediante lo studio di markers virologici quali carica virale, integrazione ed espressione degli mRNA. Abbiamo pertanto indirizzato la nostra attenzione verso tre popolazioni specifiche di pazienti: - donne con lesioni vulvari preneoplastiche (VIN) e neoplastiche, allo scopo di comprendere i complessi meccanismi patogenetici di tali patologie non sempre associate ad infezione da HPV; - pazienti con lesioni maligne a livello della regione testa-collo allo scopo di fornire informazioni utili all’elaborazione di un percorso terapeutico mirato (radiochemioterapico o chirurgico) a seconda o meno della presenza di infezione virale; - donne con lesioni cervicali di alto grado, trattate chirurgicamente per la rimozione delle lesioni e seguite nel follow-up, per stabilire l’importanza di tali marker nella valutazione della persistenza virale al fine di prevenire recidive di malattia.

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Leo, Elisa <1981&gt. "Marker molecolari relativi all'infezione da Papillomavirus umani: significato diagnostico e prognostico in lesioni virus-correlate." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2297/.

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Abstract:

Introduzione: Il cervico-carcinoma è la seconda neoplasia maligna per incidenza e mortalità nelle donne in tutto il mondo dopo il cancro al seno. L’infezione persistente da Papillomavirus Umani (HPV) è causa necessaria dell’insorgenza del cervico-carcinoma e delle sue lesioni pre-cancerose. L’infezione da HPV si associa anche ad altri carcinomi del distretto ano-genitale (a livello anale, vulvare, vaginale e del pene) e a circa il 25% dei carcinomi squamosi dell’orofaringe. I circa 40 genotipi di HPV che infettano la mucosa genitale vengono suddivisi in alto rischio (HR-HPV) e basso rischio (LR-HPV) oncogeno a seconda della alta e bassa associazione con la neoplasia cervicale. I 13 genotipi a più alto rischio oncogeno sono 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68. Di questi, otto (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 e 58) sono associati alla maggior parte dei carcinomi cervicali (circa 89%) e i genotipi 16 e 18 da soli sono riscontrati nel 70% circa delle neoplasie. L’insorgenza e progressione delle lesioni preneoplastiche cervicali è, però, associata non solo alla presenza di HPV ad alto rischio, ma, soprattutto, alla persistenza virale (> 18 mesi), alla capacità di integrazione degli HPV ad alto rischio e alla conseguente sovraespressione delle oncoproteine E6/E7. Inoltre, l’integrazione è spesso favorita da un’alta carica virale soprattutto per quanto riguarda alcuni genotipi (HPV16 e 18). L’infezione da HPV non interessa solo la cervice uterina ma tutto il distretto ano-genitale e quello testa-collo. L’HPV, in particolare il genotipo 16, è implicato, infatti, nell’insorgenza delle lesioni preneoplastiche della vulva (VIN) classificate come VIN classiche e nei carcinomi ad esse associati. L’incidenza del carcinoma vulvare in Europa è di 1.5/100.000 di cui circa il 45% è dovuto a HR-HPV (80% ad HPV16). Nonostante l’associazione tra HPV16 e carcinoma vulvare sia alta, ancora poco si conosce sul ruolo della carica virale e dell’integrazione in tali lesioni. Le lesioni che possono presentarsi nella regione testa-collo possono essere sia di natura benigna che maligna. I genotipi più frequentemente riscontrati in associazione a lesioni benigne (papillomi) sono HPV 6 e 11, quelli associati a forme tumorali (HNSCC) sono il genotipo 18 ma soprattutto il 16. Molti aspetti del coinvolgimento di HPV in queste patologie non sono ancora perfettamente conosciuti e spesso studi su tale argomento hanno mostrato risultati contraddittori, soprattutto perché vengono utilizzate metodiche con gradi diversi di sensibilità e specificità. Recenti dati di letteratura hanno tuttavia messo in evidenza che i pazienti affetti da HNSCC positivi ad HPV hanno una elevata risposta al trattamento chemioradioterapico rispetto ai pazienti HPV-negativi con un notevole impatto sul controllo locale e sulla sopravvivenza ma soprattutto sulla qualità di vita di tali pazienti, evitando di sottoporli a chirurgia sicuramente demolitiva. Scopo del lavoro: Sulla base di queste premesse, scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’importanza di marker quali la presenza/persistenza di HPV, la carica virale, la valutazione dello stato fisico del genoma virale e l’espressione degli mRNA oncogeni nella gestione di pazienti con lesioni preneoplastiche e neoplastiche di diverso grado, associate a papillomavirus mucosi. Per la valutazione dei markers virologici di progressione neoplastica abbiamo sviluppato dei saggi di real time PCR qualitativi e quantitativi studiati in modo da poter fornire, contemporaneamente e a seconda delle esigenze, risposte specifiche non solo sulla presenza e persistenza dei diversi genotipi di HPV, ma anche sul rischio di insorgenza, progressione e recidiva delle lesioni mediante lo studio di markers virologici quali carica virale, integrazione ed espressione degli mRNA. Abbiamo pertanto indirizzato la nostra attenzione verso tre popolazioni specifiche di pazienti: - donne con lesioni vulvari preneoplastiche (VIN) e neoplastiche, allo scopo di comprendere i complessi meccanismi patogenetici di tali patologie non sempre associate ad infezione da HPV; - pazienti con lesioni maligne a livello della regione testa-collo allo scopo di fornire informazioni utili all’elaborazione di un percorso terapeutico mirato (radiochemioterapico o chirurgico) a seconda o meno della presenza di infezione virale; - donne con lesioni cervicali di alto grado, trattate chirurgicamente per la rimozione delle lesioni e seguite nel follow-up, per stabilire l’importanza di tali marker nella valutazione della persistenza virale al fine di prevenire recidive di malattia.

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De, Crignis Elisa <1982&gt. "Potenzialità antiretrovirali di proteine immunomodulatrici di origine animale." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2796/2/Elisa.pdf.

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De, Crignis Elisa <1982&gt. "Potenzialità antiretrovirali di proteine immunomodulatrici di origine animale." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2796/.

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Accardo, Silvia <1976&gt. "Il gene plasmidico orf5 e il gene pmpD di Chlamydia trachomatis." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2911/1/ACCARDO_SILVIA_TESI.pdf.

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Accardo, Silvia <1976&gt. "Il gene plasmidico orf5 e il gene pmpD di Chlamydia trachomatis." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2010. http://amsdottorato.unibo.it/2911/.

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Schiavone, Pasqua <1971&gt. "Metodi biomolecolari per il follow up dei pazienti HIV positivi." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2011. http://amsdottorato.unibo.it/3449/1/Schiavone_Pasqua_tesi.pdf.

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Abstract:

As proviral human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) DNA can replenish and revive viral infection upon attivation, its analysis, in addition to RNA viral load, could be considered a useful marker during the follow-up of infected individuals, to evaluate reservoir status, especially in HAART-treated patients when RNA viral load is undetectable by current techniques and the antiretroviral efficacy of new, more potent therapeutic regimens. Standardized methods for the measurement of the two most significant forms of proviral DNA, total and non-integrated, are currently lacking, despite the widespread of molecular biology techniques. In this study, total and 2-LTR HIV-1 DNA proviral load, in addition to RNA viral load, CD4 cell count and serological parameters, were determined by quantitative analysis in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in naïve or subsequently HAART-treated patients with acute HIV-1 infection in order to establish the role of these two DNA proviral forms in the course of HIV infection. The study demonstrated that HAART-treated individuals show a significant decrease in both total and 2-LTR circular HIV-1 DNA proviral load compared with naïve patients: these findings confirm that HIV-1 reservoir decay correlates with therapeutic effectiveness. The persistence of small amounts of 2-LTR HIV-1 DNA form, which is considered to be a molecular determinant of infectivity, in PBMC from some patients demonstrates that a small rate of replication is retained even when HAART is substantially effective: HAART could not eradicate completely the infection because HIV is able to replicate at low levels. Plasma-based viral RNA assays may fail to demonstrate the full extent of viral activity. In conclusion, the availability of a new standardized assay to determine DNA proviral load will be important in assessing the true extent of virological suppression suggesting that its quantification may be an important parameter in monitoring HIV infection.

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Schiavone, Pasqua <1971&gt. "Metodi biomolecolari per il follow up dei pazienti HIV positivi." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2011. http://amsdottorato.unibo.it/3449/.

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Abstract:

As proviral human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) DNA can replenish and revive viral infection upon attivation, its analysis, in addition to RNA viral load, could be considered a useful marker during the follow-up of infected individuals, to evaluate reservoir status, especially in HAART-treated patients when RNA viral load is undetectable by current techniques and the antiretroviral efficacy of new, more potent therapeutic regimens. Standardized methods for the measurement of the two most significant forms of proviral DNA, total and non-integrated, are currently lacking, despite the widespread of molecular biology techniques. In this study, total and 2-LTR HIV-1 DNA proviral load, in addition to RNA viral load, CD4 cell count and serological parameters, were determined by quantitative analysis in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in naïve or subsequently HAART-treated patients with acute HIV-1 infection in order to establish the role of these two DNA proviral forms in the course of HIV infection. The study demonstrated that HAART-treated individuals show a significant decrease in both total and 2-LTR circular HIV-1 DNA proviral load compared with naïve patients: these findings confirm that HIV-1 reservoir decay correlates with therapeutic effectiveness. The persistence of small amounts of 2-LTR HIV-1 DNA form, which is considered to be a molecular determinant of infectivity, in PBMC from some patients demonstrates that a small rate of replication is retained even when HAART is substantially effective: HAART could not eradicate completely the infection because HIV is able to replicate at low levels. Plasma-based viral RNA assays may fail to demonstrate the full extent of viral activity. In conclusion, the availability of a new standardized assay to determine DNA proviral load will be important in assessing the true extent of virological suppression suggesting that its quantification may be an important parameter in monitoring HIV infection.

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Barbieri, Daniela <1985&gt. "Human papillomavirus (HPV) and associated diseases: between applied diagnostic and basic research." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5314/1/Barbieri_Daniela_tesi.pdf.

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Abstract:

Human Papillomavirus (HPV) is the cause of cervical cancers (among these, adenocarcinoma, AdCa) and is associated to a subgroup of oropharyngeal carcinomas (OPSCCs). Even if the risk for cancer development is linked to the infection by some viral genotypes, mainly HPV16 and 18, viral DNA alone seems not to be sufficient for diagnosis. Moreover, the role of the virus in OPSCCs has not been totally clarified yet. In the first part of the thesis, the performances concerning viral genotyping in clinical cervical samples of a new pyrosequencing-based test and a well-known hybridization-based assay have been compared. Similar results between the methods have been obtained. However, the former showed advantages in detecting intratype variants, higher specificity and a broader spectrum of detectable HPV types. The second part deals with the evaluation of virological markers (genotyping, viral oncoproteins expression, viral load, physical state and CpG methylation of HPV16 genome) in the diagnosis/prognosis of cervical AdCa and HPV-associated OPSCCs. HPV16 has been confirmed the most prevalent genotype in both the populations. Interestingly, the mean methylation frequency of viral DNA at the early promoter showed the tendency to be associated to invasion for cervical AdCa and to a worse prognosis for OPSCCs, suggesting a promising role as diagnostic/prognostic biomarker. The experiments of the third part were performed at the DKFZ in Heidelberg (Germany) and dealt with the analysis of the response to IFN-k transfection in HPV16-positive cervical cancer and head&neck carcinoma cell lines to evaluate its potential role as new treatment. After 24h, we observed increased IFN-b expression which lead to the up-regulation of genes involved in the antigens presentation pathway (MHC class I and immunoproteasome) and antiviral response as well, in particular in cervical cancer cell lines. This fact suggested also the presence of different HPV-mediated carcinogenic pathways between the two anatomical districts.
Il Papillomavirus umano (HPV) è causa dei carcinomi della cervice uterina (tra cui adenocarcinomi, AdCa) ed è associato ad un sottogruppo di tumori dell’orofaringe (OPSCCs). Nonostante il rischio di sviluppo di tumore sia associato all’infezione da parte di alcuni genotipi virali, principalmente HPV16 e 18, il DNA virale da solo sembra non essere sufficiente in campo diagnosico. Inoltre, per tumori orofaringei il ruolo del virus non è ancora del tutto chiaro. Nella prima parte della tesi, sono state confrontate le performance riguardo la genotipizzazione di HPV su campioni clinici cervicali di una tecnica innovativa, basata su amplificazione e pirosequenziamento, e una di routine, basata su amplificazione e ibridazione inversa. Lo studio ha evidenziato performance simili tra le due metodiche, sottolineando per il sequenziamento una maggiore specificità e capacità di rilevare varianti intratipo. Nella seconda parte sono stati analizzati marker virologici (genotipizzazione, espressione delle oncoproteine virali, carica virale, stato fisico e metilazione del genoma di HPV16) in funzione dei dati clinici disponibili, per un possibile impiego nella diagnosi/prognosi di AdCa cervicali e OPSCCs HPV-associati. HPV16 si è confermato il genotipo prevalente in entrambe le popolazioni. La frequenza di metilazione nel promotore precoce virale ha mostrato una tendenza ad essere associata ad invasione negli AdCa, e ad una prognosi peggiore negli OPSCCs, emergendo come il più promettente marker diagnostico/prognostico. La terza parte, svolta presso il DKFZ di Heidelberg (Germania), ha visto l’analisi della risposta alla transfezione di IFN-k in linee cellulari tumorali HPV16-positive della cervice uterina e della regione testa-collo, per valutarne l’impiego terapeutico. Dopo 24h, è stato osservato un incremento dell’espressione di IFN-b e, di conseguenza, una up-regolazione dei geni coinvolti nella presentazione antigenica (MHC classe I ed immunoproteasoma) e nella risposta antivirale, specialmente nelle cellule cervicali, suggerendo la presenza di diversi meccanismi patogenetici tra tumori HPV-positivi dei due distretti anatomici.

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Barbieri, Daniela <1985&gt. "Human papillomavirus (HPV) and associated diseases: between applied diagnostic and basic research." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5314/.

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Abstract:

Human Papillomavirus (HPV) is the cause of cervical cancers (among these, adenocarcinoma, AdCa) and is associated to a subgroup of oropharyngeal carcinomas (OPSCCs). Even if the risk for cancer development is linked to the infection by some viral genotypes, mainly HPV16 and 18, viral DNA alone seems not to be sufficient for diagnosis. Moreover, the role of the virus in OPSCCs has not been totally clarified yet. In the first part of the thesis, the performances concerning viral genotyping in clinical cervical samples of a new pyrosequencing-based test and a well-known hybridization-based assay have been compared. Similar results between the methods have been obtained. However, the former showed advantages in detecting intratype variants, higher specificity and a broader spectrum of detectable HPV types. The second part deals with the evaluation of virological markers (genotyping, viral oncoproteins expression, viral load, physical state and CpG methylation of HPV16 genome) in the diagnosis/prognosis of cervical AdCa and HPV-associated OPSCCs. HPV16 has been confirmed the most prevalent genotype in both the populations. Interestingly, the mean methylation frequency of viral DNA at the early promoter showed the tendency to be associated to invasion for cervical AdCa and to a worse prognosis for OPSCCs, suggesting a promising role as diagnostic/prognostic biomarker. The experiments of the third part were performed at the DKFZ in Heidelberg (Germany) and dealt with the analysis of the response to IFN-k transfection in HPV16-positive cervical cancer and head&neck carcinoma cell lines to evaluate its potential role as new treatment. After 24h, we observed increased IFN-b expression which lead to the up-regulation of genes involved in the antigens presentation pathway (MHC class I and immunoproteasome) and antiviral response as well, in particular in cervical cancer cell lines. This fact suggested also the presence of different HPV-mediated carcinogenic pathways between the two anatomical districts.
Il Papillomavirus umano (HPV) è causa dei carcinomi della cervice uterina (tra cui adenocarcinomi, AdCa) ed è associato ad un sottogruppo di tumori dell’orofaringe (OPSCCs). Nonostante il rischio di sviluppo di tumore sia associato all’infezione da parte di alcuni genotipi virali, principalmente HPV16 e 18, il DNA virale da solo sembra non essere sufficiente in campo diagnosico. Inoltre, per tumori orofaringei il ruolo del virus non è ancora del tutto chiaro. Nella prima parte della tesi, sono state confrontate le performance riguardo la genotipizzazione di HPV su campioni clinici cervicali di una tecnica innovativa, basata su amplificazione e pirosequenziamento, e una di routine, basata su amplificazione e ibridazione inversa. Lo studio ha evidenziato performance simili tra le due metodiche, sottolineando per il sequenziamento una maggiore specificità e capacità di rilevare varianti intratipo. Nella seconda parte sono stati analizzati marker virologici (genotipizzazione, espressione delle oncoproteine virali, carica virale, stato fisico e metilazione del genoma di HPV16) in funzione dei dati clinici disponibili, per un possibile impiego nella diagnosi/prognosi di AdCa cervicali e OPSCCs HPV-associati. HPV16 si è confermato il genotipo prevalente in entrambe le popolazioni. La frequenza di metilazione nel promotore precoce virale ha mostrato una tendenza ad essere associata ad invasione negli AdCa, e ad una prognosi peggiore negli OPSCCs, emergendo come il più promettente marker diagnostico/prognostico. La terza parte, svolta presso il DKFZ di Heidelberg (Germania), ha visto l’analisi della risposta alla transfezione di IFN-k in linee cellulari tumorali HPV16-positive della cervice uterina e della regione testa-collo, per valutarne l’impiego terapeutico. Dopo 24h, è stato osservato un incremento dell’espressione di IFN-b e, di conseguenza, una up-regolazione dei geni coinvolti nella presentazione antigenica (MHC classe I ed immunoproteasoma) e nella risposta antivirale, specialmente nelle cellule cervicali, suggerendo la presenza di diversi meccanismi patogenetici tra tumori HPV-positivi dei due distretti anatomici.

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Alessandrini, Federica <1976&gt. "Virus oncogeni a dna in tumori umani: studio delle infezioni da papillomavirus e poliomavirus in neoplasie di diversa origine." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5608/1/alessandrini_federica_tesi.pdf.

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Abstract:

I virus tumorali inducono oncogenesi nel loro ospite naturale o in sistemi animali sperimentali, manipolando diverse vie cellulari. Ad oggi, sono stati identificati sette virus capaci di causare specifici tumori umani. Inoltre HPV, JCV ed SV40, sono stati associati con un grande numero di tumori umani in sedi corporee non convenzionali, ma, nonostante molti anni di ricerca, nessuna eziologia virale è stata ancora confermata. Lo scopo di questo studio è stato di valutare la presenza ed il significato sia di JCV ed SV40 in tumori ossei umani, e di HPV nel carcinoma della mammella (BC), galattoforectomie (GF), secrezioni mammarie patologiche (ND) e glioblastoma multiforme (GBM). Tecniche di biologia molecolare sono state impiegate per esaminare campioni di tessuto tumorale di 70 tumori ossei (20 osteosarcomi [OS], 20 tumori a cellule giganti [TCG], 30 condrosarcomi [CS]), 168 BCs , 30 GFs, 59 GBM e 30 campioni di ND. Il genoma di SV40 e JCV è stato trovato nel 70% dei CS + 20% degli OS, e nel 13% dei CS +10% dei TCG, rispettivamente. Il DNA di HPV è stato rilevato nel 30% dei pazienti con BC, nel 27% dei campioni GF e nel 13% dei NDs. HPV16 è stato il genotipo maggiormente osservato in tutti questi campioni, seguito da HPV18 e HPV35. Inoltre, il DNA di HPV è stato trovato nel 22% dei pazienti con GBM, in questo tumore HPV6 era il tipo più frequentemente rilevato, seguito da HPV16. L’ ISH ha mostrato che il DNA di HPV è situato all’interno di cellule tumorali mammarie e di GBM. I nostri risultati suggeriscono un possibile ruolo di JCV, SV40 e HPV in questi tumori, se non come induttori come promotori del processo neoplastico, tuttavia diversi criteri devono ancora essere soddisfatti prima di chiarirne il ruolo.
Tumor viruses induce oncogenesis in their natural host or in experimental animal systems by manipulating an array of different cellular pathways. To date, seven human viruses have been identified to cause or contribute to specific human cancers. Furthermore some viruses such as HPV, JCV and SV40, have been associated with a large number of human cancers in non conventional body sites; but, in spite of many years of research, no viral etiology have been confirmed for these tumors. The aim of this study was to evaluate the presence and significance of both JCV and SV40 in human bone tumors, and HPV in breast carcinoma (BC), galactophorectomy (GF), pathological nipple discharge (ND) and glioblastoma multiforme (GBM). Molecular biology techniques (PCR) and chromogenic in situ hybridization (ISH) were employed to examine specimens of tumor tissue from 70 bone tumors (20 Osteosarcomas[OS], 20 Giant Cell Tumors [TCG], 30 Condrosarcomas [CS]), 168 BCs, 30 GFs, 59 GBMs and 30 specimens of ND. SV40 and JCV genomes were found in70% of CS + 20% of OS, and in 13% of CS +10% of TCG, respectively. HPV DNA was detected in 30% of BC patients, in 27% of GF specimens and in 13% of NDs. HPV16 was the most common type observed in all these samples, attended by HPV18 and HPV35. In addition, HPV DNA was found in 22% of patients with GBM; in this tumor HPV6 was the most frequent type detected, followed by HPV16. ISH data showed that HPV DNA was located in breast and GBM tumor cells. Our results suggest a possible role of JCV, SV40 and HPV in the induction of these different tumors. However, detection of viruses in human tumors does not prove that they cause those malignancies. Several different criteria need to be met before viral etiology could be established.

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Alessandrini, Federica <1976&gt. "Virus oncogeni a dna in tumori umani: studio delle infezioni da papillomavirus e poliomavirus in neoplasie di diversa origine." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5608/.

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Abstract:

I virus tumorali inducono oncogenesi nel loro ospite naturale o in sistemi animali sperimentali, manipolando diverse vie cellulari. Ad oggi, sono stati identificati sette virus capaci di causare specifici tumori umani. Inoltre HPV, JCV ed SV40, sono stati associati con un grande numero di tumori umani in sedi corporee non convenzionali, ma, nonostante molti anni di ricerca, nessuna eziologia virale è stata ancora confermata. Lo scopo di questo studio è stato di valutare la presenza ed il significato sia di JCV ed SV40 in tumori ossei umani, e di HPV nel carcinoma della mammella (BC), galattoforectomie (GF), secrezioni mammarie patologiche (ND) e glioblastoma multiforme (GBM). Tecniche di biologia molecolare sono state impiegate per esaminare campioni di tessuto tumorale di 70 tumori ossei (20 osteosarcomi [OS], 20 tumori a cellule giganti [TCG], 30 condrosarcomi [CS]), 168 BCs , 30 GFs, 59 GBM e 30 campioni di ND. Il genoma di SV40 e JCV è stato trovato nel 70% dei CS + 20% degli OS, e nel 13% dei CS +10% dei TCG, rispettivamente. Il DNA di HPV è stato rilevato nel 30% dei pazienti con BC, nel 27% dei campioni GF e nel 13% dei NDs. HPV16 è stato il genotipo maggiormente osservato in tutti questi campioni, seguito da HPV18 e HPV35. Inoltre, il DNA di HPV è stato trovato nel 22% dei pazienti con GBM, in questo tumore HPV6 era il tipo più frequentemente rilevato, seguito da HPV16. L’ ISH ha mostrato che il DNA di HPV è situato all’interno di cellule tumorali mammarie e di GBM. I nostri risultati suggeriscono un possibile ruolo di JCV, SV40 e HPV in questi tumori, se non come induttori come promotori del processo neoplastico, tuttavia diversi criteri devono ancora essere soddisfatti prima di chiarirne il ruolo.
Tumor viruses induce oncogenesis in their natural host or in experimental animal systems by manipulating an array of different cellular pathways. To date, seven human viruses have been identified to cause or contribute to specific human cancers. Furthermore some viruses such as HPV, JCV and SV40, have been associated with a large number of human cancers in non conventional body sites; but, in spite of many years of research, no viral etiology have been confirmed for these tumors. The aim of this study was to evaluate the presence and significance of both JCV and SV40 in human bone tumors, and HPV in breast carcinoma (BC), galactophorectomy (GF), pathological nipple discharge (ND) and glioblastoma multiforme (GBM). Molecular biology techniques (PCR) and chromogenic in situ hybridization (ISH) were employed to examine specimens of tumor tissue from 70 bone tumors (20 Osteosarcomas[OS], 20 Giant Cell Tumors [TCG], 30 Condrosarcomas [CS]), 168 BCs, 30 GFs, 59 GBMs and 30 specimens of ND. SV40 and JCV genomes were found in70% of CS + 20% of OS, and in 13% of CS +10% of TCG, respectively. HPV DNA was detected in 30% of BC patients, in 27% of GF specimens and in 13% of NDs. HPV16 was the most common type observed in all these samples, attended by HPV18 and HPV35. In addition, HPV DNA was found in 22% of patients with GBM; in this tumor HPV6 was the most frequent type detected, followed by HPV16. ISH data showed that HPV DNA was located in breast and GBM tumor cells. Our results suggest a possible role of JCV, SV40 and HPV in the induction of these different tumors. However, detection of viruses in human tumors does not prove that they cause those malignancies. Several different criteria need to be met before viral etiology could be established.

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Di, Furio Francesca <1984&gt. "Meccanismi replicativi e di regolazione dell'espressione genica di Parvovirus B19." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5694/1/difurio_francesca_tesi.pdf.

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Abstract:

Il Parvovirus B19, virus patogeno umano della famiglia Parvoviridae, mostra uno specifico tropismo per i precursori eritroidi e una limitata replicazione in alcune linee cellulari megacarioblastoidi. Allo scopo di sviluppare sistemi utili allo studio delle caratteristiche biologiche del virus, diversi laboratori si sono occupati della costruzione di cloni genomici di B19 dotati di competenza funzionale e capaci di generare virus infettante. Parte del presente lavoro ha riguardato l’analisi funzionale di diversi cloni genomici di B19 e ha permesso di caratterizzare le regioni terminali del virus e di identificare requisiti essenziali per la loro funzionalità. Nel contesto intracellulare, esistono differenti livelli di restrizione in relazione alla capacità della cellula di supportare la replicazione virale, non ancora del tutto caratterizzati. Inoltre si sono accumulate evidenze circa la capacità del B19 di instaurare persistenza in numerosi tessuti. Non sono ancora note le caratteristiche funzionali del genoma virale in questo stato, è possibile che il virus persista in forma silente e meccanismi epigenetici possano regolare tale silenziamento. In questo studio è stato analizzato lo stato di metilazione del genoma di B19 e il suo possibile effetto sul ciclo replicativo virale ed è stata investigata la possibile associazione del DNA virale agli istoni cellulari nel corso di infezione in vitro. I risultati ottenuti confermano la presenza di questi meccanismi epigenetici, potendo ipotizzare che giochino un importante ruolo nella regolazione della funzionalità virale e nell’interazione B19-cellula e siano un elemento critico per l’adattamento del virus nell’ambiente in cui si trova. Inoltre l’ipotesi che anche i microRNA possano assumere un importante significato nell’interazione B19-cellula è stata proposta da diversi lavori e nel presente studio è stata valutata la produzione di queste piccole molecole durante l'infezione in vitro, ricercando microRNA (cellulari e/o virali) con omologia di sequenza per il genoma di B19 e quindi specifici per il virus.
Parvovirus B19, human pathogenic virus of the Parvoviridae family, shows a specific tropism for erythroid precursors and a limited replication in some megakaryoblastic cell lines. In order to develop an in vitro system and study the biological features of this virus, several groups have constructed genomic clones of B19 with functional competence and able to generate infectious particles. Part of this work has focused on the functional analysis of several genomic clones of B19 to characterize the terminal regions of the virus and to identify essential requirements for their functionality. Once the virus is inside the cell, there are different levels of restriction depending on the cell's ability to support viral replication, which are not yet fully characterized. Furthermore there is increasing evidence that B19 is able to establish persistence in several tissues. The functional characteristics of the persistent viral genome are not yet known; the virus probably persists in a silent state and epigenetic mechanisms may regulate such silencing. In this study we analyzed the methylation status of the genome of B19 and its possible effect on the viral replication cycle and we investigated the potential association of viral DNA with histones during in vitro infection. The results confirm that these epigenetic events take place, supporting the hypothesis that they play an important role in the regulation of viral functionality and B19-cell interaction and are critical for the adaptation of the virus to the cellular environment. Moreover several works have proposed the hypothesis that microRNAs may also have an important value in B19-cell interaction, so in this study we evaluated the production of these small molecules during in vitro infection, searching for microRNAs (cellular and/or viral) showing sequence homology with the B19 genome and being thus specific for the virus.

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Di, Furio Francesca <1984&gt. "Meccanismi replicativi e di regolazione dell'espressione genica di Parvovirus B19." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5694/.

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Abstract:

Il Parvovirus B19, virus patogeno umano della famiglia Parvoviridae, mostra uno specifico tropismo per i precursori eritroidi e una limitata replicazione in alcune linee cellulari megacarioblastoidi. Allo scopo di sviluppare sistemi utili allo studio delle caratteristiche biologiche del virus, diversi laboratori si sono occupati della costruzione di cloni genomici di B19 dotati di competenza funzionale e capaci di generare virus infettante. Parte del presente lavoro ha riguardato l’analisi funzionale di diversi cloni genomici di B19 e ha permesso di caratterizzare le regioni terminali del virus e di identificare requisiti essenziali per la loro funzionalità. Nel contesto intracellulare, esistono differenti livelli di restrizione in relazione alla capacità della cellula di supportare la replicazione virale, non ancora del tutto caratterizzati. Inoltre si sono accumulate evidenze circa la capacità del B19 di instaurare persistenza in numerosi tessuti. Non sono ancora note le caratteristiche funzionali del genoma virale in questo stato, è possibile che il virus persista in forma silente e meccanismi epigenetici possano regolare tale silenziamento. In questo studio è stato analizzato lo stato di metilazione del genoma di B19 e il suo possibile effetto sul ciclo replicativo virale ed è stata investigata la possibile associazione del DNA virale agli istoni cellulari nel corso di infezione in vitro. I risultati ottenuti confermano la presenza di questi meccanismi epigenetici, potendo ipotizzare che giochino un importante ruolo nella regolazione della funzionalità virale e nell’interazione B19-cellula e siano un elemento critico per l’adattamento del virus nell’ambiente in cui si trova. Inoltre l’ipotesi che anche i microRNA possano assumere un importante significato nell’interazione B19-cellula è stata proposta da diversi lavori e nel presente studio è stata valutata la produzione di queste piccole molecole durante l'infezione in vitro, ricercando microRNA (cellulari e/o virali) con omologia di sequenza per il genoma di B19 e quindi specifici per il virus.
Parvovirus B19, human pathogenic virus of the Parvoviridae family, shows a specific tropism for erythroid precursors and a limited replication in some megakaryoblastic cell lines. In order to develop an in vitro system and study the biological features of this virus, several groups have constructed genomic clones of B19 with functional competence and able to generate infectious particles. Part of this work has focused on the functional analysis of several genomic clones of B19 to characterize the terminal regions of the virus and to identify essential requirements for their functionality. Once the virus is inside the cell, there are different levels of restriction depending on the cell's ability to support viral replication, which are not yet fully characterized. Furthermore there is increasing evidence that B19 is able to establish persistence in several tissues. The functional characteristics of the persistent viral genome are not yet known; the virus probably persists in a silent state and epigenetic mechanisms may regulate such silencing. In this study we analyzed the methylation status of the genome of B19 and its possible effect on the viral replication cycle and we investigated the potential association of viral DNA with histones during in vitro infection. The results confirm that these epigenetic events take place, supporting the hypothesis that they play an important role in the regulation of viral functionality and B19-cell interaction and are critical for the adaptation of the virus to the cellular environment. Moreover several works have proposed the hypothesis that microRNAs may also have an important value in B19-cell interaction, so in this study we evaluated the production of these small molecules during in vitro infection, searching for microRNAs (cellular and/or viral) showing sequence homology with the B19 genome and being thus specific for the virus.

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Avanzi, Simone <1982&gt. "Cell Host-Microbe Interactions: Turning Pathogen Mechanisms Into Cell's Advantages." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5759/1/avanzi_simone_tesi.pdf.

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Abstract:

Host-Pathogen Interaction is a very vast field of biological sciences, indeed every year many un- known pathogens are uncovered leading to an exponential growth of this field. The present work lyes between its boundaries, touching different aspects of host-pathogen interaction: We have evaluate the permissiveness of Mesenchimal Stem cell (FM-MSC from now on) to all known human affecting herpesvirus. Our study demonstrate that FM-MSC are full permissive to HSV1, HSV2, HCMV and VZV. On the other hand HHV6, HHV7, EBV and HHV8 are susceptible, but failed to activate a lytic infection program. FM-MSC are pluripotent stem cell and have been studied intensely in last decade. FM-MSC are employed in some clinical applications. For this reason it is important to known the degree of susceptibility to transmittable pathogens. Our atten- tion has then moved to bacterial pathogens: we have performed a proteome-wide in silico analy- sis of Chlamydiaceae family, searching for putative Nuclear localization Signal (NLS). Chlamy- diaceae are a family of obligate intracellular parasites. It’s reasonably to think that its members could delivered to nucleus effector proteins via NLS sequences: if that were the case the identifi- cation of NLS carrying proteins could open the way to therapeutic approaches. Our results strengthen this hypothesis: we have identified 72 protein bearing NLS, and verified their func- tionality with in vivo assays. Finally we have conceived a molecular scissor, creating a fusion protein between HIV-1 IN protein and FokI catalytic domain (a deoxyexonuclease domain). Our aim is to obtain chimeric enzyme (trojIN) which selectively identify IN naturally occurring target (HIV LTR sites) and cleaves subsequently LTR carrying DNA (for example integrated HIV1 DNA). Our preliminary results are promising since we have identified trojIN mutated version capable to selectively recognize LTR carrying DNA in an in vitro experiments.

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Avanzi, Simone <1982&gt. "Cell Host-Microbe Interactions: Turning Pathogen Mechanisms Into Cell's Advantages." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2013. http://amsdottorato.unibo.it/5759/.

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Abstract:

Host-Pathogen Interaction is a very vast field of biological sciences, indeed every year many un- known pathogens are uncovered leading to an exponential growth of this field. The present work lyes between its boundaries, touching different aspects of host-pathogen interaction: We have evaluate the permissiveness of Mesenchimal Stem cell (FM-MSC from now on) to all known human affecting herpesvirus. Our study demonstrate that FM-MSC are full permissive to HSV1, HSV2, HCMV and VZV. On the other hand HHV6, HHV7, EBV and HHV8 are susceptible, but failed to activate a lytic infection program. FM-MSC are pluripotent stem cell and have been studied intensely in last decade. FM-MSC are employed in some clinical applications. For this reason it is important to known the degree of susceptibility to transmittable pathogens. Our atten- tion has then moved to bacterial pathogens: we have performed a proteome-wide in silico analy- sis of Chlamydiaceae family, searching for putative Nuclear localization Signal (NLS). Chlamy- diaceae are a family of obligate intracellular parasites. It’s reasonably to think that its members could delivered to nucleus effector proteins via NLS sequences: if that were the case the identifi- cation of NLS carrying proteins could open the way to therapeutic approaches. Our results strengthen this hypothesis: we have identified 72 protein bearing NLS, and verified their func- tionality with in vivo assays. Finally we have conceived a molecular scissor, creating a fusion protein between HIV-1 IN protein and FokI catalytic domain (a deoxyexonuclease domain). Our aim is to obtain chimeric enzyme (trojIN) which selectively identify IN naturally occurring target (HIV LTR sites) and cleaves subsequently LTR carrying DNA (for example integrated HIV1 DNA). Our preliminary results are promising since we have identified trojIN mutated version capable to selectively recognize LTR carrying DNA in an in vitro experiments.

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Clò, Alberto <1984&gt. "Studio della patogenesi di HIV-1 nel compartimento osseo: effetti della terapia antiretrovirale convenzionale e nuovi approcci all'eradicazione." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6206/1/Cl%C3%B2_Alberto_tesi.pdf.

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Abstract:

L’obiettivo della tesi è studiare il virus HIV-1 in relazione alle alterazioni sistemiche, riscontrate nel paziente HIV-infetto, in particolare alterazioni a carico del sistema scheletrico, indotte dal virus o dall’azione dei farmaci utilizzati nella terapia antiretrovirale (HAART). L’incidenza dell’osteoporosi nei pazienti HIV-positivi è drammaticamente elevata rispetto alla popolazione sana. Studi clinici hanno evidenziato come alcuni farmaci, ad esempio inibitori della proteasi virale, portino alla compromissione dell’omeostasi ossea, con aumento del rischio fratturativo. Il nostro studio prevede un follow-up di 12 mesi dall’inizio della HAART in una coorte di pazienti naïve, monitorando diversi markers ossei. I risultati ottenuti mostrano un incremento dei markers metabolici del turnover osseo, confermando l’impatto della HAART sull’omeostasi ossea. Successivamente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli osteoblasti, il citotipo che regola la sintesi di nuova matrice ossea. Gli esperimenti condotti sulla linea HOBIT mettono in evidenza come il trattamento, in particolare con inibitori della proteasi, porti ad apoptosi nel caso in cui vi sia una concentrazione di farmaco maggiore di quella fisiologica. Tuttavia, anche concentrazioni fisiologiche di farmaci possono regolare negativamente alcuni marker ossei, come ALP e osteocalcina. Infine esiste la problematica dell’eradicazione di HIV-1 dai reservoirs virali. La HAART riesce a controllare i livelli viremici, ciononostante diversi studi propongono alcuni citotipi come potenziali reservoir di infezione, vanificando l’effetto della terapia. Abbiamo, perciò, sviluppato un nuovo approccio molecolare all’eradicazione: sfruttare l’enzima virale integrasi per riconoscere in modo selettivo le sequenze LTR virali per colpire il virus integrato. Fondendo integrasi e l’endonucleasi FokI, abbiamo generato diversi cloni. Questi sono stati transfettati stabilmente in cellule Jurkat, suscettibili all’infezione. Una volta infettate, abbiamo ottenuto una significativa riduzione dei markers di infezione. Successivamente la transfezione nella linea linfoblastica 8E5/LAV, che porta integrata nel genoma una copia di HIV, ha dato risultati molto incoraggianti, come la forte riduzione del DNA virale integrato.
The aim of this thesis is to study HIV-1 virus and its relation with systemic alterations observed in HIV-positive patients, in particular alterations of the skeletal system, induced by the virus or drugs, used in antiretroviral therapy (HAART). The osteoporosis frequency in HIV-positive patients is dramatically higher in respect to healthy people. Clinical studies showed how some drugs (e.g. viral protease’s inhibitors) lead to bone homeostasis impairment, increasing bone fractures’ risk. In our study, we followed up a cohort of naïve patients for 12 months, starting from the beginning of HAART, monitoring several bone markers. Our results evidenced an increase in bone turnover’s metabolic markers, confirming the impact of HAART on bone homeostasis. Later, we focused on osteoblasts, the cell type responsible of new bone matrix’s synthesis. The experiments directed on HOBIT cells revealed how the antiretroviral treatment, particularly protease inhibitors, causes apoptosis in case and higher than physiological drug concentration an had been used. However, even physiological drugs’ concentrations may downregulate bone markers, such as ALP and osteocalcin. Eventually, we have the question of HIV-1’s eradication from viral reservoirs. HAART can successfully control HIV’s viremia. Nevertheless, diverse cell types are thought to be potential reservoirs of infection, thwarting the effects of therapy. That is why we set up a new molecular approach to eradication: taking advantage of the integrase enzyme to specifically recognize the viral LTR sequences, toward hit the integrated provirus. Blending integrase and FokI endonuclease, we obtained various clones. These clones had been stably transfected into Jurkat cells, susceptible to infection. Once infected, we obtained a significant reduction in markers of infection. Thereafter the transfection of the lymphoblastoid cell line 8E5/LAV (which harbours an integrated copy of HIV into cell genome) returned very encouraging results, such as the strong reduction of integrated viral DNA.

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Clò, Alberto <1984&gt. "Studio della patogenesi di HIV-1 nel compartimento osseo: effetti della terapia antiretrovirale convenzionale e nuovi approcci all'eradicazione." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6206/.

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Abstract:

L’obiettivo della tesi è studiare il virus HIV-1 in relazione alle alterazioni sistemiche, riscontrate nel paziente HIV-infetto, in particolare alterazioni a carico del sistema scheletrico, indotte dal virus o dall’azione dei farmaci utilizzati nella terapia antiretrovirale (HAART). L’incidenza dell’osteoporosi nei pazienti HIV-positivi è drammaticamente elevata rispetto alla popolazione sana. Studi clinici hanno evidenziato come alcuni farmaci, ad esempio inibitori della proteasi virale, portino alla compromissione dell’omeostasi ossea, con aumento del rischio fratturativo. Il nostro studio prevede un follow-up di 12 mesi dall’inizio della HAART in una coorte di pazienti naïve, monitorando diversi markers ossei. I risultati ottenuti mostrano un incremento dei markers metabolici del turnover osseo, confermando l’impatto della HAART sull’omeostasi ossea. Successivamente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli osteoblasti, il citotipo che regola la sintesi di nuova matrice ossea. Gli esperimenti condotti sulla linea HOBIT mettono in evidenza come il trattamento, in particolare con inibitori della proteasi, porti ad apoptosi nel caso in cui vi sia una concentrazione di farmaco maggiore di quella fisiologica. Tuttavia, anche concentrazioni fisiologiche di farmaci possono regolare negativamente alcuni marker ossei, come ALP e osteocalcina. Infine esiste la problematica dell’eradicazione di HIV-1 dai reservoirs virali. La HAART riesce a controllare i livelli viremici, ciononostante diversi studi propongono alcuni citotipi come potenziali reservoir di infezione, vanificando l’effetto della terapia. Abbiamo, perciò, sviluppato un nuovo approccio molecolare all’eradicazione: sfruttare l’enzima virale integrasi per riconoscere in modo selettivo le sequenze LTR virali per colpire il virus integrato. Fondendo integrasi e l’endonucleasi FokI, abbiamo generato diversi cloni. Questi sono stati transfettati stabilmente in cellule Jurkat, suscettibili all’infezione. Una volta infettate, abbiamo ottenuto una significativa riduzione dei markers di infezione. Successivamente la transfezione nella linea linfoblastica 8E5/LAV, che porta integrata nel genoma una copia di HIV, ha dato risultati molto incoraggianti, come la forte riduzione del DNA virale integrato.
The aim of this thesis is to study HIV-1 virus and its relation with systemic alterations observed in HIV-positive patients, in particular alterations of the skeletal system, induced by the virus or drugs, used in antiretroviral therapy (HAART). The osteoporosis frequency in HIV-positive patients is dramatically higher in respect to healthy people. Clinical studies showed how some drugs (e.g. viral protease’s inhibitors) lead to bone homeostasis impairment, increasing bone fractures’ risk. In our study, we followed up a cohort of naïve patients for 12 months, starting from the beginning of HAART, monitoring several bone markers. Our results evidenced an increase in bone turnover’s metabolic markers, confirming the impact of HAART on bone homeostasis. Later, we focused on osteoblasts, the cell type responsible of new bone matrix’s synthesis. The experiments directed on HOBIT cells revealed how the antiretroviral treatment, particularly protease inhibitors, causes apoptosis in case and higher than physiological drug concentration an had been used. However, even physiological drugs’ concentrations may downregulate bone markers, such as ALP and osteocalcin. Eventually, we have the question of HIV-1’s eradication from viral reservoirs. HAART can successfully control HIV’s viremia. Nevertheless, diverse cell types are thought to be potential reservoirs of infection, thwarting the effects of therapy. That is why we set up a new molecular approach to eradication: taking advantage of the integrase enzyme to specifically recognize the viral LTR sequences, toward hit the integrated provirus. Blending integrase and FokI endonuclease, we obtained various clones. These clones had been stably transfected into Jurkat cells, susceptible to infection. Once infected, we obtained a significant reduction in markers of infection. Thereafter the transfection of the lymphoblastoid cell line 8E5/LAV (which harbours an integrated copy of HIV into cell genome) returned very encouraging results, such as the strong reduction of integrated viral DNA.

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Miserocchi, Anna <1983&gt. "Analisi dei meccanismi patogenetici alla base del danno vascolare Hiv-indotto." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6207/1/Miserocchi_Anna_Tesi.pdf.

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Abstract:

L'infezione da HIV-1 resta ancora oggi una delle principali problematiche nell'ambito della sanità mondiale, con circa 35 milioni di individui infetti in tutto il mondo. L'introduzione della terapia antiretrovirale combinata (cART) ha drasticamente modificato l’evoluzione di questa infezione, che da patologia a sviluppo terminale dopo alcuni anni dalla trasmissione, è diventata una patologia cronica con una lunga aspettativa di vita per i pazienti. Tuttavia, la cART non è in grado di eradicare l’infezione e nei pazienti HIV-infetti trattati è possibile notare un aumento della comparsa di comorbidità, tra le quali le più frequentemente riscontrate sono lesioni al sistema nervoso centrale, ai reni, al tessuto osseo, al fegato e al sistema cardiovascolare. I danni al sistema cardiocircolatorio derivano da una serie di concause virologiche, comportamentali, ambientali e farmacologiche che alterano la parete vascolare, il metabolismo dei lipidi e la regolazione della coagulazione, inducendo la formazione di lesioni strutturali di tipo aterosclerotico che sono alla base dell’aumentata incidenza di infarti, ictus e alterazioni del circolo osservabili nei pazienti HIV-positivi. Dalla recente letteratura è emerso come l’omeostasi del tessuto endoteliale sia regolata anche a livello delle cellule staminali mesenchimali (MSC) presenti nella parete vascolare. Per questo abbiamo voluto analizzare possibili effetti dell’infezione di HIV, delle sue proteine e di alcune molecole antiretrovirali sulla vitalità e sul differenziamento delle MSC purificate dalla parete arteriosa umana. I risultati ottenuti indicano come l’infezione da HIV e l’azione delle proteine gp120 e Tat attivino il meccanismo di apoptosi nelle MSC e una profonda alterazione nel differenziamento verso la filiera adipocitaria e verso quella endoteliale. Inoltre, alcune molecole ad azione antiretrovirale (in particolare specifici inibitori della proteasi virale) sono in grado bloccare il differenziamento delle MSC verso le cellule endoteliali. Dall’insieme di queste osservazioni emergono nuovi meccanismi patogenetici correlati al danno cardiovascolare riscontrato nei pazienti HIV-positivi.
HIV-1 infection remains nowadays a major problem of health worldwide. The introduction of a combined antiretroviral therapy (cART) has greatly improved life expectancy of HIV-infected patients. However, cART cannot eradicate the infection and HIV-infected patients show different comorbidities, like central nervous system lesions, osteoporosis, renal and liver dysfunction and cardiovascular pathologies. Cardiovascular damages come from viral mechanisms and pharmacological interactions and their frequency is enhanced in HIV-positive patients. Mesenchymal stem cells (MSC) are very important for endothelial homeostasis, therefore we decided to analyze the effects of HIV and cART in these cells. Our results show that HIV-1 and its proteins gp120 and Tat increase MSC apoptosis and alter MSC differentiation towards endothelial and adipogenic lineages. Moreover, also antiretroviral molecules, in particular protease inhibitors, disrupt MSC differentiation regulation.

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Miserocchi, Anna <1983&gt. "Analisi dei meccanismi patogenetici alla base del danno vascolare Hiv-indotto." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6207/.

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Abstract:

L'infezione da HIV-1 resta ancora oggi una delle principali problematiche nell'ambito della sanità mondiale, con circa 35 milioni di individui infetti in tutto il mondo. L'introduzione della terapia antiretrovirale combinata (cART) ha drasticamente modificato l’evoluzione di questa infezione, che da patologia a sviluppo terminale dopo alcuni anni dalla trasmissione, è diventata una patologia cronica con una lunga aspettativa di vita per i pazienti. Tuttavia, la cART non è in grado di eradicare l’infezione e nei pazienti HIV-infetti trattati è possibile notare un aumento della comparsa di comorbidità, tra le quali le più frequentemente riscontrate sono lesioni al sistema nervoso centrale, ai reni, al tessuto osseo, al fegato e al sistema cardiovascolare. I danni al sistema cardiocircolatorio derivano da una serie di concause virologiche, comportamentali, ambientali e farmacologiche che alterano la parete vascolare, il metabolismo dei lipidi e la regolazione della coagulazione, inducendo la formazione di lesioni strutturali di tipo aterosclerotico che sono alla base dell’aumentata incidenza di infarti, ictus e alterazioni del circolo osservabili nei pazienti HIV-positivi. Dalla recente letteratura è emerso come l’omeostasi del tessuto endoteliale sia regolata anche a livello delle cellule staminali mesenchimali (MSC) presenti nella parete vascolare. Per questo abbiamo voluto analizzare possibili effetti dell’infezione di HIV, delle sue proteine e di alcune molecole antiretrovirali sulla vitalità e sul differenziamento delle MSC purificate dalla parete arteriosa umana. I risultati ottenuti indicano come l’infezione da HIV e l’azione delle proteine gp120 e Tat attivino il meccanismo di apoptosi nelle MSC e una profonda alterazione nel differenziamento verso la filiera adipocitaria e verso quella endoteliale. Inoltre, alcune molecole ad azione antiretrovirale (in particolare specifici inibitori della proteasi virale) sono in grado bloccare il differenziamento delle MSC verso le cellule endoteliali. Dall’insieme di queste osservazioni emergono nuovi meccanismi patogenetici correlati al danno cardiovascolare riscontrato nei pazienti HIV-positivi.
HIV-1 infection remains nowadays a major problem of health worldwide. The introduction of a combined antiretroviral therapy (cART) has greatly improved life expectancy of HIV-infected patients. However, cART cannot eradicate the infection and HIV-infected patients show different comorbidities, like central nervous system lesions, osteoporosis, renal and liver dysfunction and cardiovascular pathologies. Cardiovascular damages come from viral mechanisms and pharmacological interactions and their frequency is enhanced in HIV-positive patients. Mesenchymal stem cells (MSC) are very important for endothelial homeostasis, therefore we decided to analyze the effects of HIV and cART in these cells. Our results show that HIV-1 and its proteins gp120 and Tat increase MSC apoptosis and alter MSC differentiation towards endothelial and adipogenic lineages. Moreover, also antiretroviral molecules, in particular protease inhibitors, disrupt MSC differentiation regulation.

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Morini, Silvia <1986&gt. "Studio dell'interazione di HIV-1 sulle cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ (HPCs)." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6212/1/Morini_Silvia_tesi.pdf.

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Abstract:

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l’anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non è in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza è stata messa in luce la mancata suscettibilità all’infezione e l’aumento dell’ apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-β1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L’aspetto innovativo di questo studio però si evidenzia esaminando l’effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il “priming” negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata già dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, è presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch’essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-β1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L’insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessità della genesi dell’anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, già sottoposti a cART.
Beside the CD4 T cells progressive loss, HIV-infected subjects exhibit some peripheral cytopenias. In particular, anemia is found in 10% of asymptomatic and in 92% of AIDS patients and cART therapy is not able to solve this problem. The pathogenic mechanisms underlying this cytopenia are related to cytokine dysregulation, damage of HPCs, impairment of stromal cells and inhibition of the differentiation of HPCs. The CD34+ hematopoietic progenitor cells were separated from cord blood, differentiated towards the erythroid lineage and treated with active HIV-1, heat-inactivated virus and gp120. First of all we demonstrate that HPCs are not susceptible to infection and the gp120-CD4/CXCR4 binding cause a TGF-β1 mediated apoptosis. The innovative aspect of this study, however, is evident examining the effect of gp120 during differentiation towards the erythrocyte. Two experimental protocols are used: in the first cells are initially treated for 24 hours with gp120 ( HIV-1 or with heat-inactivated ) and then induced into differentiation, in the second cells are firstly differentiated and then treated with gp120. The negative "priming" induces a gp120-mediated apoptosis 48 hours after treatment and a differentiation reduction. If these cells are instead primarily differentiated for 24 hours and then treated with gp120, in the first 5 days after treatment, there is an increase of proliferation and differentiation, which is followed by a very marked apoptosis (also TGF-β1 mediated and due to gp120-CD4/CXCR4 binding) and a drastic reduction of differentiation. These results allowed us to define the complexity of the genesis of anemia in these patients and suggest new therapeutic targets for these subjects already receiving cART .

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Morini, Silvia <1986&gt. "Studio dell'interazione di HIV-1 sulle cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ (HPCs)." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2014. http://amsdottorato.unibo.it/6212/.

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Abstract:

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l’anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non è in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza è stata messa in luce la mancata suscettibilità all’infezione e l’aumento dell’ apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-β1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L’aspetto innovativo di questo studio però si evidenzia esaminando l’effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il “priming” negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata già dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, è presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch’essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-β1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L’insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessità della genesi dell’anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, già sottoposti a cART.
Beside the CD4 T cells progressive loss, HIV-infected subjects exhibit some peripheral cytopenias. In particular, anemia is found in 10% of asymptomatic and in 92% of AIDS patients and cART therapy is not able to solve this problem. The pathogenic mechanisms underlying this cytopenia are related to cytokine dysregulation, damage of HPCs, impairment of stromal cells and inhibition of the differentiation of HPCs. The CD34+ hematopoietic progenitor cells were separated from cord blood, differentiated towards the erythroid lineage and treated with active HIV-1, heat-inactivated virus and gp120. First of all we demonstrate that HPCs are not susceptible to infection and the gp120-CD4/CXCR4 binding cause a TGF-β1 mediated apoptosis. The innovative aspect of this study, however, is evident examining the effect of gp120 during differentiation towards the erythrocyte. Two experimental protocols are used: in the first cells are initially treated for 24 hours with gp120 ( HIV-1 or with heat-inactivated ) and then induced into differentiation, in the second cells are firstly differentiated and then treated with gp120. The negative "priming" induces a gp120-mediated apoptosis 48 hours after treatment and a differentiation reduction. If these cells are instead primarily differentiated for 24 hours and then treated with gp120, in the first 5 days after treatment, there is an increase of proliferation and differentiation, which is followed by a very marked apoptosis (also TGF-β1 mediated and due to gp120-CD4/CXCR4 binding) and a drastic reduction of differentiation. These results allowed us to define the complexity of the genesis of anemia in these patients and suggest new therapeutic targets for these subjects already receiving cART .

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Silenzi, Silvia <1984&gt. "Characterization of West Nile virus strains isolated in Italy." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2015. http://amsdottorato.unibo.it/6759/1/Silenzi_Silvia_tesi.pdf.

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Abstract:

West Nile virus (WNV) is a neurotropic flavivirus that is maintained in an enzootic cycle between mosquitoes and birds, but can also infect and cause disease in humans and other vertebrate species. Most of WNV infections in humans are asymptomatic, but approximately 20% of infected people develop clinical symptoms, although severe neurological diseases are observed in less than 1% of them. WNV is the most widely distributed arbovirus in the world and has been recently associated with outbreaks of meningo-encephalitis in Europe, including Italy, caused by different viral strains belonging to distinct lineages 1 and 2. The hypothesis is that genetic divergence among viral strains currently circulating in Italy might reflect on their pathogenic potential and that the rapid spread of WNV with increased pathogenicity within naïve population suggest that epidemic forms of the virus may encode mechanisms to evade host immunity. Infection with WNV triggers a delayed host response that includes a delay in the production of interferon-α (IFN-α). IFNs are a family of immuno-modulatory cytokines that are produced in response to virus infection and serve as integral signal initiators of host intracellular defenses. The increased number of human cases and the lack of data about virulence of European WNV isolates highlight the importance to achieve a better knowledge on this emerging viral infection. In the present study, we investigate the phenotypic and IFN-α-regulatory properties of different WNV lineage 1 and 2 strains that are circulating in Europe/Italy in two cell lines: Vero and 1321N1. We demonstrate that: Vero and 1321N1 cells are capable of supporting WNV replication where different WNV strains show similar growth kinetics; WNV lineage 2 strain replicated in Vero and 1321N1 cells as efficiently as WNV lineage 1 strains; and both lineages 1 and 2 were highly susceptible to the antiviral actions of IFN-α.

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Silenzi, Silvia <1984&gt. "Characterization of West Nile virus strains isolated in Italy." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2015. http://amsdottorato.unibo.it/6759/.

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Abstract:

West Nile virus (WNV) is a neurotropic flavivirus that is maintained in an enzootic cycle between mosquitoes and birds, but can also infect and cause disease in humans and other vertebrate species. Most of WNV infections in humans are asymptomatic, but approximately 20% of infected people develop clinical symptoms, although severe neurological diseases are observed in less than 1% of them. WNV is the most widely distributed arbovirus in the world and has been recently associated with outbreaks of meningo-encephalitis in Europe, including Italy, caused by different viral strains belonging to distinct lineages 1 and 2. The hypothesis is that genetic divergence among viral strains currently circulating in Italy might reflect on their pathogenic potential and that the rapid spread of WNV with increased pathogenicity within naïve population suggest that epidemic forms of the virus may encode mechanisms to evade host immunity. Infection with WNV triggers a delayed host response that includes a delay in the production of interferon-α (IFN-α). IFNs are a family of immuno-modulatory cytokines that are produced in response to virus infection and serve as integral signal initiators of host intracellular defenses. The increased number of human cases and the lack of data about virulence of European WNV isolates highlight the importance to achieve a better knowledge on this emerging viral infection. In the present study, we investigate the phenotypic and IFN-α-regulatory properties of different WNV lineage 1 and 2 strains that are circulating in Europe/Italy in two cell lines: Vero and 1321N1. We demonstrate that: Vero and 1321N1 cells are capable of supporting WNV replication where different WNV strains show similar growth kinetics; WNV lineage 2 strain replicated in Vero and 1321N1 cells as efficiently as WNV lineage 1 strains; and both lineages 1 and 2 were highly susceptible to the antiviral actions of IFN-α.

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Savini, Claudia <1987&gt. "Transfer of Viral and Mitochondrial Nucleic Acids through Microvesicles: a Possible Mechanism of Genetic Intra-Tumor Heterogeneity in Breast Cancer." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7475/1/Savini_Claudia_Tesi.pdf.

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Abstract:

Microvesicles (MVs) are small extracellular vesicles divided in exosomes (40-100nm), shedding microvesicles (100nm–1µm), and apoptotic bodies (1-5µm). MVs contain bioactive molecules, nucleic acids and proteins and are physiologically secreted by cells in order to guarantee cell-to-cell communication. The presence of viral miRNA in exosomes and viral DNA in apoptotic bodies was demonstrated. Viral DNA sequences like EBV and HPV have been identified in numerous cancers tissues, like in breast cancer, in the absence of a primary infection. Two meta-analyses studies analyzed the presence of HPV and EBV sequences in breast cancer tissues worldwide, and identified the viral nucleic acids in the 23% and 29% of the samples, respectively. However, the mechanisms of viral DNA acquisition in this cancer have not been investigated. This paper demonstrates the presence of viral nucleic acids in MVs coming from cell line models of onco-viral dependent transformation, including cervical carcinoma (HPV) and lymphoma (EBV), and their transfer through MVs to viral negative epithelial cells and fibroblasts. The presence and transfer of murine mitochondrial DNA in MVs coming from murine cancer-associated fibroblasts is also demonstrated, as well as its transfer to human recipient cells. This study also shows the presence of viral HPV16/18/31 DNA in the circulating MVs from two different cohorts: one of newly diagnosed breast cancer patients, collected in Bologna, Italy, and the other one of patients affected by hormonal therapy-resistant breast cancer, collected in New York, USA. The presence of DNaseI-resistant DNA in the RNA fraction prompted us to study the physical-chemical status of the viral DNA sequences packaged in the MVs coming from viral positive cell lines; the DNA is found in the form of DNA:RNA hybrids (R-loops), which are known to be more stable structures, mostly synthesized in hypoxic conditions.

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Savini, Claudia <1987&gt. "Transfer of Viral and Mitochondrial Nucleic Acids through Microvesicles: a Possible Mechanism of Genetic Intra-Tumor Heterogeneity in Breast Cancer." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7475/.

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Abstract:

Microvesicles (MVs) are small extracellular vesicles divided in exosomes (40-100nm), shedding microvesicles (100nm–1µm), and apoptotic bodies (1-5µm). MVs contain bioactive molecules, nucleic acids and proteins and are physiologically secreted by cells in order to guarantee cell-to-cell communication. The presence of viral miRNA in exosomes and viral DNA in apoptotic bodies was demonstrated. Viral DNA sequences like EBV and HPV have been identified in numerous cancers tissues, like in breast cancer, in the absence of a primary infection. Two meta-analyses studies analyzed the presence of HPV and EBV sequences in breast cancer tissues worldwide, and identified the viral nucleic acids in the 23% and 29% of the samples, respectively. However, the mechanisms of viral DNA acquisition in this cancer have not been investigated. This paper demonstrates the presence of viral nucleic acids in MVs coming from cell line models of onco-viral dependent transformation, including cervical carcinoma (HPV) and lymphoma (EBV), and their transfer through MVs to viral negative epithelial cells and fibroblasts. The presence and transfer of murine mitochondrial DNA in MVs coming from murine cancer-associated fibroblasts is also demonstrated, as well as its transfer to human recipient cells. This study also shows the presence of viral HPV16/18/31 DNA in the circulating MVs from two different cohorts: one of newly diagnosed breast cancer patients, collected in Bologna, Italy, and the other one of patients affected by hormonal therapy-resistant breast cancer, collected in New York, USA. The presence of DNaseI-resistant DNA in the RNA fraction prompted us to study the physical-chemical status of the viral DNA sequences packaged in the MVs coming from viral positive cell lines; the DNA is found in the form of DNA:RNA hybrids (R-loops), which are known to be more stable structures, mostly synthesized in hypoxic conditions.

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Musumeci, Giuseppina <1985&gt. "HIV e terapia antiretrovirale: effetti sulla densita di massa ossea in soggetti sieropositivi e strategie preventive innovative." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7571/1/Musumeci-Giuseppina.pdf.

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Abstract:

L’avvento della terapia antiretrovirale ha trasformato l’infezione da HIV in una patologia di tipo cronico, rendendo possibile la manifestazione di comorbidità HIV-relate. Particolare importanza rivestono le lesioni a carico del compartimento osseo, infatti i soggetti sieropositivi hanno un rischio maggiore di sviluppare osteopenia e osteoporosi, rispetto alla popolazione sana. Numerosi lavori hanno dimostrato come sia il virus HIV che la terapia antivirale siano in grado di determinare l’alterazione di questo bilancia, attraverso un’azione negativa diretta sulle cellule della linea osteoblastica. Per quanto riguarda il compartimento osteoclastico, invece, le indicazioni presenti in letteratura sono poche e spesso contrastanti. La prima parte di questo elaborato si è quindi focalizzata sullo studio dell’effetto indotto dal virus e dalla terapia antiretrovirale sulle cellule della linea osteoclastica in un modello sperimentale in vitro. I risultati ottenuti mostrano che in presenza del virus e della terapia si osserva un’intensificazione dell’attività osteoclastica, con conseguente riduzione della densità di massa ossea. Tuttavia, nonostante gli indubbi successi della cART la terapia non si è dimostrata in grado di eradicare l’infezione. Questo scenario ha aperto la strada allo sviluppo di nuove molecole ad azione antiretrovirale in grado di bloccare l’ingresso del virus attraverso il contatto sessuale: in particolare, alcuni studi si sono focalizzati sull’utilizzo di composti da impiegare a livello delle mucose genitali, con lo scopo di contrastare, o almeno ridurre, la trasmissione di HIV-1. In tal senso si è indirizzata la seconda parte della tesi, volta a valutare l’efficacia di una molecola di nuova concezione, un mini CD4 chiamato M48U1, da solo o in combinazione con farmaci tradizionali, nel ridurre o prevenire l’infezione di HIV-1. Dai dati emersi è possibile osservare una consistente riduzione della trasmissione dell’infezione sia su un modello in vitro che su un modello ex vivo.
Several studies have shown that HIV infection and treatment with antiretroviral drugs can induce a significant increase in cases of osteopenia / osteoporosis in HIV-infected patients. The loss of bone mass density (BMD) is related to the functional loss of balance of bone forming unit (BFU) that is characterized by fine adjustment that normally elapses between the trophic action of osteoblasts and bone resorption action of osteoclasts. In the first part of this work we evaluate the effect of HIV, specific viral proteins and some conditioned medium on the differentiation of osteoclasts. The achieved results show the contribute of the therapy and the viral protein on the osteoclast differentiation, with a consequent higher bone resorption and a decrease of Bone Mass Density. In the second part of this work, we analysed the antiviral activity of mini CD4 M48U1 peptide formulated in HEC on activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) infected by R5 and X4–tropic HIV strains. The results demonstrated that M48U1 prevented the HIV-1BaL and HIV-1IIIB infection in activated PBMCs with the half maximal effective concentration (EC50) determined at 30 and 20.3 nM, respectively. In addition, M48U1 was tested in association with Tenofovir in HEC and these two antiretroviral drugs synergized for the HIV inhibition. It is noteworthy that M48U1 alone or in combination with Tenofovir in HEC hydrogel strongly inhibited HIV replication in an organ-like structure of human cervico-vaginal tissue without any induction of significant tissue toxicity.

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Musumeci, Giuseppina <1985&gt. "HIV e terapia antiretrovirale: effetti sulla densita di massa ossea in soggetti sieropositivi e strategie preventive innovative." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7571/.

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Abstract:

L’avvento della terapia antiretrovirale ha trasformato l’infezione da HIV in una patologia di tipo cronico, rendendo possibile la manifestazione di comorbidità HIV-relate. Particolare importanza rivestono le lesioni a carico del compartimento osseo, infatti i soggetti sieropositivi hanno un rischio maggiore di sviluppare osteopenia e osteoporosi, rispetto alla popolazione sana. Numerosi lavori hanno dimostrato come sia il virus HIV che la terapia antivirale siano in grado di determinare l’alterazione di questo bilancia, attraverso un’azione negativa diretta sulle cellule della linea osteoblastica. Per quanto riguarda il compartimento osteoclastico, invece, le indicazioni presenti in letteratura sono poche e spesso contrastanti. La prima parte di questo elaborato si è quindi focalizzata sullo studio dell’effetto indotto dal virus e dalla terapia antiretrovirale sulle cellule della linea osteoclastica in un modello sperimentale in vitro. I risultati ottenuti mostrano che in presenza del virus e della terapia si osserva un’intensificazione dell’attività osteoclastica, con conseguente riduzione della densità di massa ossea. Tuttavia, nonostante gli indubbi successi della cART la terapia non si è dimostrata in grado di eradicare l’infezione. Questo scenario ha aperto la strada allo sviluppo di nuove molecole ad azione antiretrovirale in grado di bloccare l’ingresso del virus attraverso il contatto sessuale: in particolare, alcuni studi si sono focalizzati sull’utilizzo di composti da impiegare a livello delle mucose genitali, con lo scopo di contrastare, o almeno ridurre, la trasmissione di HIV-1. In tal senso si è indirizzata la seconda parte della tesi, volta a valutare l’efficacia di una molecola di nuova concezione, un mini CD4 chiamato M48U1, da solo o in combinazione con farmaci tradizionali, nel ridurre o prevenire l’infezione di HIV-1. Dai dati emersi è possibile osservare una consistente riduzione della trasmissione dell’infezione sia su un modello in vitro che su un modello ex vivo.
Several studies have shown that HIV infection and treatment with antiretroviral drugs can induce a significant increase in cases of osteopenia / osteoporosis in HIV-infected patients. The loss of bone mass density (BMD) is related to the functional loss of balance of bone forming unit (BFU) that is characterized by fine adjustment that normally elapses between the trophic action of osteoblasts and bone resorption action of osteoclasts. In the first part of this work we evaluate the effect of HIV, specific viral proteins and some conditioned medium on the differentiation of osteoclasts. The achieved results show the contribute of the therapy and the viral protein on the osteoclast differentiation, with a consequent higher bone resorption and a decrease of Bone Mass Density. In the second part of this work, we analysed the antiviral activity of mini CD4 M48U1 peptide formulated in HEC on activated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) infected by R5 and X4–tropic HIV strains. The results demonstrated that M48U1 prevented the HIV-1BaL and HIV-1IIIB infection in activated PBMCs with the half maximal effective concentration (EC50) determined at 30 and 20.3 nM, respectively. In addition, M48U1 was tested in association with Tenofovir in HEC and these two antiretroviral drugs synergized for the HIV inhibition. It is noteworthy that M48U1 alone or in combination with Tenofovir in HEC hydrogel strongly inhibited HIV replication in an organ-like structure of human cervico-vaginal tissue without any induction of significant tissue toxicity.

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Chiereghin, Angela <1982&gt. "Epstein-Barr Virus-Related B Cell Lymphoproliferative Disorder After Hematopoietic Stem Cell Transplantation." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7611/1/Chiereghin_Angela_Tesi.pdf.

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Abstract:

In 51 (33 adult-18 paediatric) allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients we aimed to evaluate: i) the incidence of EBV infection and potential risk factors; ii) the suitability of whole blood (WB) as clinical specimen to monitor the risk of patients to develop EBV-related post-transplant lymphoproliferative disorder (EBV-PTLD); iii) the clinical utility of combined virological-immunological monitoring; iv) the management of infection and the incidence of EBV-PTLD. Quantitative real-time PCR assay was performed on WB samples for all patients. EBV-DNA quantification also in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) samples was adopted for actively EBV infected patients. Immunological monitoring of infection was performed by Enzyme-linked ImmunoSPOT assay evaluating the EBV-specific cell-mediated immunity (CMI). The incidence of EBV infection was 51% and the frequency of EBV-PTLD was 3.9%. Reduced-intensity conditioning (RIC) in combination with in vivo T-cell depletion was associated with higher frequencies of infection (P=0.036). A significant correlation (P<0.001) between EBV-DNA levels in WB and PBMC samples was obtained in adult (r=0.787) and paediatric (r=0.976) patients. A similar kinetics of EBV-DNA in blood compartments was observed. Clinically, both specimen types appeared to be equally informative. The lack of EBV-specific CMI during/after active infection was associated with a higher median peak level of EBV-DNA in WB (P=0.013) and a greater severity of infection. The 54.5% of the patients without EBV-specific CMI needed anti-CD20 therapy and the 27.2% developed EBV-related complications, including a lethal PTLD. All patients with EBV-specific CMI controlled EBV replication and were asymptomatic. WB proved to be a suitable clinical specimen to monitor the risk of patients to develop EBV-related complications. RIC combined with in vivo T-cell depletion is a risk factor for the development of infection. EBV-specific CMI is a critical determinant in controlling the infection and consequently the EBV-related complications. Combined virological-immunological monitoring could improve the management of infection.

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Chiereghin, Angela <1982&gt. "Epstein-Barr Virus-Related B Cell Lymphoproliferative Disorder After Hematopoietic Stem Cell Transplantation." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7611/.

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Abstract:

In 51 (33 adult-18 paediatric) allogeneic hematopoietic stem cell transplant recipients we aimed to evaluate: i) the incidence of EBV infection and potential risk factors; ii) the suitability of whole blood (WB) as clinical specimen to monitor the risk of patients to develop EBV-related post-transplant lymphoproliferative disorder (EBV-PTLD); iii) the clinical utility of combined virological-immunological monitoring; iv) the management of infection and the incidence of EBV-PTLD. Quantitative real-time PCR assay was performed on WB samples for all patients. EBV-DNA quantification also in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) samples was adopted for actively EBV infected patients. Immunological monitoring of infection was performed by Enzyme-linked ImmunoSPOT assay evaluating the EBV-specific cell-mediated immunity (CMI). The incidence of EBV infection was 51% and the frequency of EBV-PTLD was 3.9%. Reduced-intensity conditioning (RIC) in combination with in vivo T-cell depletion was associated with higher frequencies of infection (P=0.036). A significant correlation (P<0.001) between EBV-DNA levels in WB and PBMC samples was obtained in adult (r=0.787) and paediatric (r=0.976) patients. A similar kinetics of EBV-DNA in blood compartments was observed. Clinically, both specimen types appeared to be equally informative. The lack of EBV-specific CMI during/after active infection was associated with a higher median peak level of EBV-DNA in WB (P=0.013) and a greater severity of infection. The 54.5% of the patients without EBV-specific CMI needed anti-CD20 therapy and the 27.2% developed EBV-related complications, including a lethal PTLD. All patients with EBV-specific CMI controlled EBV replication and were asymptomatic. WB proved to be a suitable clinical specimen to monitor the risk of patients to develop EBV-related complications. RIC combined with in vivo T-cell depletion is a risk factor for the development of infection. EBV-specific CMI is a critical determinant in controlling the infection and consequently the EBV-related complications. Combined virological-immunological monitoring could improve the management of infection.

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Bua, Gloria <1987&gt. "Parvovirus B19: Virus-Cell Interactions, Pathogenetic Mechanisms and Development of Compounds with Antiviral Activity." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2016. http://amsdottorato.unibo.it/7624/1/PhDthesis_BUA.pdf.

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Abstract:

The pathogenic Parvovirus B19 is characterized by a strict adaptation to erythroid progenitor cells (EPCs), a heterogeneous population of differentiating cells. The aim of the work was the characterization of B19V infection dynamics in EPCs in dependence on the cell differentiation stage, in terms of distribution of infected cells, synthesis of viral nucleic acids and production of infectious virus. EPCs at early differentiation stage led to an abortive infection, without viral replication. EPCs at later stages were permissive, with highest levels of viral replicative activity at day 9 and lower levels at day 18. Quantitation of total RNA indicated a close association of genome replication and transcription with viral RNA accumulation within infected cells related to viral DNA increase during the course of infection. Analysis of the different classes of mRNAs revealed two distinct pattern of genome expression profile with a fine regulation in the frequency utilization of RNA processing signals: an early phase, when cleavage at the proximal site leading to a higher relative production of mRNA for NS protein, and a late phase, when cleavage at the distal site was more frequent leading to higher relative abundance of mRNA for VP and 11 kDA proteins. Infectious virus was released from cells at day 6–15, but not at day 18. Results providing a detailed description of B19V replication and expression profile in differentiating EPCs, highlight the very tight adaptation of B19V to a specific cellular target defined both by its erythroid lineage and its differentiation stage. This cell system provide also a reference framework to identify potential antiviral drugs active against B19V. The inhibitory activity of Cidofovir was evaluated in differentiated EPCs and UT7/EpoS1 cells and results are the first evidence of an inhibitory activity of a drug against B19V.

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Ortalli, Margherita <1986&gt. "Epidemiological, Diagnostic and Drug Discovery Studies of an Emerging Infection: Human Leishmaniasis." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2017. http://amsdottorato.unibo.it/8057/1/Ortalli_Margherita_tesi.pdf.

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Abstract:

Human leishmaniasis is a vector-borne diseases, caused by the Leishmania parasite and endemic in 100 countries, including southern Europe. The clinical spectrum of Leishmania infection ranges from asymptomatic to visceral leishmaniasis (VL), the latter being fatal if not treated. The real prevalence of asymptomatic infections is unknown, the diagnosis of VL is challenging and lacks standardized methods, and also antileishmanial treatment has critical limitations. In this scenario, this study aimed (1) to determine the prevalence of asymptomatic infections in blood donors of the Bologna province, where increase of VL cases has been recently reported, (2) to compare the performance of nine different serological tests in the diagnosis of VL in northern Italy, (3) to assess the antileishmanial activity of a library of newly synthesized natural like compounds, ie chalcones. (1) The screening on samples of blood donors living in the Bologna province, shows a total prevalence of asymptomatic Leishmania infection of 11.5%, suggesting a high circulation of the parasite in this area. (2) Our findings on serodiagnosis indicate that rK39 immunochromatographic tests are insufficiently sensitive as screening tests for VL, ELISA exhibited suboptimal results in terms of sensitivity, IFAT and WB exhibited excellent sensitivity, but their cost and complexity in execution would not allow their employment as screening tests for VL. These results confirm the complexity of VL serodiagnosis and reveal the variability of diagnostic performance of serological tests. (3) Screening of 33 newly synthesized chalcones on proliferation of Leishmania promastigote and amastigote revealed that 2 compounds showed a remarkable antileishmanial potency against the parasite, a low citotoxicity against mammalian cells and they also were able to efficiently bind trypanothione reductase - a specific parasite enzyme - suggesting that these compounds should be further evaluated as antileishmanial agents.

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De, Carolis Sabrina <1984&gt. "Role of Exosomes in the Transfer of Viral Nucleic Acids to Recipients Cells: in Vitro Studies with Cell Line Supernatant and Patient-Derived Exosomes." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2017. http://amsdottorato.unibo.it/8096/1/Frontespizio%2BTesiDottoratoFINALE.pdf.

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Abstract:

Human PapillomaVirus (HPV) is a main cause of cervical cancer in which HPV DNA is frequently found integrated into human genome at fragile sites. Meta analytic studies reported association between HPV and Breast Cancer (Bae JM, 2016). We found 30% of HPV DNA in breast cancer tissues, confirmed by ISH assay. HPV DNA is also found in other extra-genital tissues, including oro-pharingeal, anal, colon and skin (Kim SM, 2016; Pérez LO, 2010). Owing to the lack of viremia, HPV DNA presence in other districts, is still a conundrum. We hypothesized that the presence of HPV DNA in extra-genital tissues could be in relation with exosomes. Exosomes are extracellular vesicles, involved in cellular communication, tumor progression and biological molecules carriers. We isolated exosomes from 59 serum specimens from breast cancer patients by differential ultracentrifugation and we identified 5 HPV DNA positive samples. Subsequently we isolated exosomes, from HeLa and Caski supernatants (HPV18 and HPV16 positive, respectively) and from HPV DNA positive serum, urine and liquor patient by CD9-immunobeads isolation kit. Exosomes obtained were used to perform viral transfer in different cell lines. Finally, the literature reports association between SV40 and certain types of cancer, including bone tumors (Vilchez RA, 2003). In line with literature, we found 7/70 SV40 DNA in bone tumors (unpublished). We isolated exosomes, from COS7 supernatant (SV40 positive cell line) and we tested acid nucleic viral transfer to osteosarcoma cell lines. Exposed cells were analyzed by PCR, Real-time PCR and Digital PCR, demonstrating the viral nucleic acids transfer in receiving cells. The viral nucleic acids discovery in receiving cells, confirm the role of exosomes as biological molecules carriers. The mechanism through which the viral content is released, is yet to be clarified, as well as if it is sufficient to trigger infection.

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Longo, Serena <1988&gt. "Il ruolo del virus dell'immunodeficienza umana nelle alterazioni linfocitarie e nella coinfezione da Leishmania." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2018. http://amsdottorato.unibo.it/8603/1/longo_serena_tesi.pdf.

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Abstract:

Tra le proteine codificate da HIV-1, Tat sembrerebbe essere responsabile della regolazione dei linfociti B del centro germinativo mediante l’attivazione costitutiva del fattore NF-kB, coinvolto nella linfomagenesi. Per cercare di definire questa interazione, nella prima parte del progetto è stata ricercata la presenza di un’eventuale correlazione tra Tat e NF-kB in colture di cellule germinal center (GCs), isolate da organi linfoidi. L’espressione di NF-kB è stata valutata mediante Western blot a partire da colture di GCs attivate e trattate con Tat. I dati ottenuti indicano che l'espressione di NF-kB nelle cellule GCs è finemente regolata nel tempo e la sua modulazione è connessa alla presenza di Tat. In futuro, l’analisi micro-array dei profili di espressione genica in presenza/assenza di Tat è necessaria per determinare i pathways di trasduzione del segnale e i fattori di trascrizione coinvolti. Dal momento che durante l’infezione da HIV si verificano numerose infezioni, nella seconda parte dello studio, è stata analizzata la coinfezione Leishmania/HIV. La diagnosi precoce di infezione da Leishmania è indispensabile per poter introdurre una terapia mirata, ma viene raramente considerata negli algoritmi diagnostici con conseguente sotto-diagnosi. Recentemente, in Emilia Romagna è stato registrato un aumento di casi di leishmaniosi, pertanto, è stato condotto uno studio su donatori sani in Valsamoggia (BO) per dimostrare la reale prevalenza delle infezioni asintomatiche. Gli anticorpi anti-Leishmania sono stati rilevati in 27/260 campioni analizzati mediante Western blot (10,4%), mentre il DNA di Leishmania è stato ritrovato in 4/260 campioni sottoposti a real-time PCR (prevalenza totale=11.5%). Da questo studio è emerso che la Valsamoggia è una zona ad alta prevalenza di infezioni asintomatiche, dato rilevante soprattutto perché la leishmaniosi è solo la punta di un iceberg in cui bisogna considerare il rischio di riattivazione in soggetti immunocompromessi, come i pazienti HIV positivi, che necessitano di una diagnosi precoce.
Among proteins encoded by HIV-1, Tat appears to be responsible for the regulation of B cells of the germinal center by constitutive activation of the NF-kB factor involved in lymphomagenesis. To try to define this interaction, in the first part of the project the presence of a possible correlation between Tat and NF-kB in cultures of germinal center cells (GCs), isolated from lymphoid organs, was sought. The expression of NF-kB was evaluated by Western blot from cultures of activated GCs and treated with Tat. The data obtained indicate that the expression of NF-kB in GCs cells is finely regulated over time and its modulation is related to the presence of Tat. In the future, the micro-array analysis of gene expression profiles in Tat presence/absence is necessary to determine the signal transduction pathways and the transcription factors involved. Since many infections occur during HIV infection, the Leishmania/HIV coinfection was analyzed in the second part of the study. The early diagnosis of Leishmania infection is essential to introduce targeted therapy, but is rarely considered in diagnostic algorithms with consequent under-diagnosis. Recently, in Emilia Romagna there has been an increase in cases of leishmaniasis, therefore, a study was conducted on healthy donors in Valsamoggia (BO) to demonstrate the real prevalence of asymptomatic infections. Anti-Leishmania antibodies were detected in 27/260 samples analyzed by Western blot (10.4%), while Leishmania DNA was found in 4/260 samples by real-time PCR (total prevalence = 11.5%) . From this study it has emerged that Valsamoggia is an area with a high prevalence of asymptomatic infections, especially since it is only the tip of an iceberg in which the risk of reactivation must be considered in immunocompromised subjects, such as HIV-positive patients, who need an early diagnosis.

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Conti, Ilaria <1990&gt. "Human Parvovirus B19: from the development of a reverse genetics system to antiviral strategies." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2019. http://amsdottorato.unibo.it/8773/1/Conti_Ilaria_tesi.pdf.

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Abstract:

Human Parvovirus B19 (B19V) is a human pathogenic virus and responsible for various clinical manifestations, although neither an antiviral therapy nor a vaccine are available. Difficulties for B19V propagation and characterization are caused by its narrow tropism for the erythroid progenitor cells of human bone marrow and the very few cell lines that can support the viral replication. In this research, a reverse genetic approach was first developed to allow the generation of mature and infectious viral particles from a designed viral consensus sequence. Synthetic clones that differ for their terminal regions (ITRs) were constructed, transfected in UT7/EpoS1 cells and the obtained viral particles were used to infect EPCs (erythroid progenitor cells) in serial passages. Mature and functional viral particles were obtained by clones containing the almost full length ITRs and by clones codifying shorter ITRs, extended till the internal symmetry sites but with different sequence isomerisms. Cellular factors and machinery change along the eryhroid differentiation probably influencing and delimiting the cellular susceptibility and permissiveness to the virus. In face of the limited fraction of B19V productively infected cells, the expression of the globoside receptor, the coreceptor, the endocytosis and the EpoR pathway was commonly detected among both EPCs and UT7/EpoS1 cells during this research, suggesting the involvement of other cellular factors. Characterization of both the virus and cells allows investigation of new strategies for the development of specific antiviral compounds. In this research, the retargeted drug Hydroxyurea and especially the broad range analogue Brincidofovir showed a B19V antiviral activity. Small-scale screening of newly synthesized molecules led to identification of few compounds with suboptimal activity. The computational predictions of G-quadruplex structures within the B19V ITRs was not corroborated by chemical and biological studies excluding any their relevant role in the viral lifecyle.

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Bertoldi, Alessia <1990&gt. "HIV e reservoir." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2019. http://amsdottorato.unibo.it/8875/1/bertoldi_alessia_tesi.pdf.

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Abstract:

Il maggiore ostacolo all’eradicazione di HIV è la presenza del reservoir virale trascrizionalmente silente ma in grado di replicare e difficilmente accessibile alla terapia. Reservoir di piccole dimensioni correlano con una prognosi migliore e una minor probabilità di rebound virologico in caso di semplificazione di terapia. La quantificazione del reservoir risulta pertanto essenziale per valutare la reale efficacia della terapia. La quantificazione dell’HIV-DNA totale (circolare e integrato) rappresenta una metodica semplice e ampiamente utilizzata per analizzare il reservoir, nonostante ne sovrastimi le reali dimensioni includendo genomi defettivi. Pertanto, inizialmente abbiamo ottimizzato una metodica per la quantificazione delle forme circolari di HIV-DNA. La forma circolare 2-LTR è stata misurata con successo; ciò non è stato possibile per la forma 1-LTR a causa di omologie di sequenza con il DNA genomico. Come parte di uno studio attualmente in corso, sette pazienti sono stati arruolati alla diagnosi (T0) e seguiti con prelievi a 6(T1), 12(T2), 18(T3) e 24(T4) mesi dopo l’inizio della terapia. Dati preliminari ottenuti nel primo anno (T0,T1,T2) mostrano un andamento dell’HIV-DNA totale stabile nel tempo (P>0,1); analogamente, la forma 2-LTR non mostra aumenti significativi tra T0 e T1 (P>0,5). Tuttavia, a T0 è stata osservata una differenza statisticamente significativa tra l’HIV-DNA totale e la forma 2-LTR (P<0,05). La seconda parte dello studio si è focalizzata sul saggio TILDA, un metodo in grado di misurare esclusivamente virus competenti la replicazione. Abbiamo adattato questa metodica alle nostre condizioni sperimentali eseguendola su 3 pazienti HIV-positivi. Infine, considerando il costante aumento dei casi di infezione con sottotipi non-B e che il saggio TILDA è stato sviluppato principalmente per il sottotipo B, il protocollo è stato modificato in modo da rilevare il sottotipo C, il più diffuso a livello mondiale. In particolare, è stato eseguito con successo su 3 pazienti infetti con il sottotipo C.
Persistence of transcriptionally silent but replication-competent HIV reservoir in resting CD4+T cells constitutes the major barrier to viral eradication. Small latent reservoirs are associated to a better prognosis and predictive of less likelihood to undergo virological rebound during simplified therapy. Therefore, the amount of HIV-DNA in latently infected cells is critical to evaluate the efficacy of available regimens and avoid the potential “re-seeding” in aviremic patients. Although the quantification of total HIV-DNA (circular and integrated) overestimates reservoir size because it includes not replication-competent genomes, it represents a simple and widely used biomarker reflecting global viral reservoir. Therefore, first we optimized PCR methods for detection of circular forms of HIV-DNA in HIV-positive patients. We successfully measured the 2-LTR form, but not the 1-LTR form due to homologies with genomic DNA sequence. As part of an ongoing project on HIV-DNA, we tested our in house assay on seven PBMCs samples of treatment-naïve patients collected at 0(T0), 6(T1), 12(T2), 18(T3) and 24(T4) months after starting ART. Preliminary data on T0,T1, and T2 time points showed that total HIV-DNA is stable during time (P>0,1); likewise, the amount of 2-LTR forms did not show significant differences between T0 and T1 time points (P>0,5). However, we observed a statistically significant difference between 2-LTR form and total HIV-DNA amounts at T0 (P<0,05). The second part of this study focused on TILDA, a method that detects only transcriptionally-competent proviruses. Hence, we adapted TILDA to our experimental conditions performing the modified assay in three long-term treated patients. Moreover, considering that the frequency of non-B subtype infections is constantly increasing and TILDA has been developed based on subtype B virus sequence, we modified the protocol to detect subtype C virus, the most prevalent subtype worldwide. We successfully perform the new version of TILDA in three patients harboring subtype C viruses.

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Piccirilli, Giulia <1983&gt. "Human congenital cytomegalovirus infection: characteristics and pathogenesis of fetal brain damage." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2019. http://amsdottorato.unibo.it/9138/1/Piccirilli_Giulia_tesi.pdf.

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Abstract:

Human cytomegalovirus (HCMV) causes congenital neurological lifelong disabilities. The study analyzed 10 HCMV-infected human fetuses at 21 weeks of gestation to evaluate the characteristics and pathogenesis of brain injury related to congenital human CMV (cCMV) infection. Specifically, tissues from cortical and white matter areas, subventricular zone, thalamus, hypothalamus, hippocampus, basal ganglia and cerebellum were analysed by: i) immunohistochemistry (IHC) to detect HCMV-infected cell distribution, ii) hematoxylin-eosin staining to evaluate histological damage and iii) real-time PCR to quantify tissue viral load (HCMV-DNA). Viral tropism was assessed by double IHC to detect HCMV-antigens and neural/neuronal markers: nestin (expressed in early differentiation stage), doublecortin (DCX, identifying neuronal precursor cells) and neuronal nuclei (NeuN, identifying mature neurons). HCMV-positive cells and viral DNA were found in the brain of 8/10 (80%) fetuses. For these cases, brain damage was classified in mild (n=4, 50%), moderate (n=3, 37.5%) and severe (n=1, 12.5%) based on presence of i) diffuse astrocytosis, microglial activation and vascular changes; ii) occasional (in mild) or multiple (in moderate/severe) microglial nodules and iii) necrosis (in severe). The highest median HCMV-DNA level was found in the hippocampus (212 copies/5ng of humanDNA [hDNA], range: 10-7,505) as well as the highest mean HCMV-infected cell value (2.9 cells, range: 0-23), followed by that detected in subventricular zone (1.8 cells, range: 0-19). This suggests a preferential HCMV tropism for immature neuronal cells, residing in these regions, confirmed by the detection of DCX and nestin in 94% and 63.3% of HCMV-positive cells, respectively. NeuN was not found among HCMV-positive cells and was nearly absent in the brain with severe damage, suggesting HCMV does not infect mature neurons and immature HCMV-infected neuronal cells do not differentiate into neurons. HCMV preferential tropism in immature neural/neuronal cells delays/inhibits their differentiation interfering with brain development processes that lead to structural and functional brain defects.

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D'Urbano, Vanessa <1991&gt. "HIV-1 infection: back and forth between virus and host." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2020. http://amsdottorato.unibo.it/9531/1/TesiDottorato_VanessaD%27URBANO.pdf.

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Abstract:

The main obstacles to HIV-1 eradication are linked to the viral ability to evade immune system and establish a reservoir where virus is transcriptionally latent but able to replicate. IFN action and Restriction Factors (RFs) expression, dominant proteins that target multiple steps of the HIV-1 lifecycle, represent an early line of defence Because of their interplay with viral replication, we would like to study the relationship between RFs and the viral amount in latently infected cells.The first part of this project investigates the expression levels variations of a selected group of RFs (APOBEC3G, BST2, TRIM5α, MX2, SAMHD1, SERINC3/5, IFI16 and STING) in HIV-1 patients during the course of infection before and after ART administration by using Real Time qPCR. The second part of this study deals with the role of IFNα and IFNγ, and their role in the immune system disfunction that has been described during chronic inflammation associated to cancer, viral infection such as HIV-1, and autoimmune-disease. Immune Check Point proteins (ICPs) are a group of inhibitory receptors expressed on the cellular surface of immune cells and trigger immunosuppressive signaling pathways leading to T-cell exhaustion and the expression of immune checkpoint molecules (PD-1, PD-L1, TIGIT, LILRB2). The major aim of this project is to assess the clinical meaning of ICPs expression in HIV-1 chronically infected patients to better characterized their involvement in immune system disfunction.

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De, Pascali Alessandra Mistral <1993&gt. "Leishmaniasis in the immunocompromised population: evaluation of strategies for screening and monitoring." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2021. http://amsdottorato.unibo.it/10004/1/Thesis%20PhDfinal.pdf.

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Abstract:

Leishmaniasis is a vector-borne disease caused by an intracellular parasite of the genus Leishmania. The clinical features of leishmaniasis include a wide range of manifestation from asymptomatic infections to different levels of disease severity. In most cases individuals do not develop clinical symptoms, but Leishmania parasites can persist lifelong in the host after an acute infection and easily reactivate under immunosuppressive conditions, causing severe disease with high mortality rate. The aim of this study was to identify Leishmania infection in selected groups of immunocompromised (IC) patients, including newly diagnosed HIV infected individuals, patients receiving kidney transplant (KT) and patients undergoing immunosuppressive therapies for immune-mediated diseases (IMD). Our study focused on the validation of a combination of methods to be used for the screening of asymptomatic Leishmania infection. The selected methods included high sensitive Real-Time PCR for detection of parasitic kinetoplast (k)DNA in peripheral blood, Western Blot (WB) for detection of specific IgG and Whole Blood Assay (WBA) to evaluate the anti-leishmanial T-cell response by quantifying the production of IFN-γ, IL-2 and IP-10 after stimulation of patients’ blood with Leishmania specific antigens. The methods have been validated on a cohort of immunocompetent individuals living in an endemic area of the Bologna province. Among 145 individuals recruited and screened with WB, Real-Time PCR and WBA, 24 subjects tested positive (17%) to one or more methods, thus confirming the high circulation of the parasite in the selected area. Given the high prevalence of asymptomatic infection in immunocompromised patients in endemic regions such as Italy, it seems essential to develop a plan for screening and follow-up of Leishmania infection. The screening algorithm that we tested in this study appears to be effective to identify accurately quiescent parasitic infection.

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Reggiani, Alessandro <1993&gt. "A genome editing approach to the study of Parvovirus B19." Doctoral thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2022. http://amsdottorato.unibo.it/10210/1/Reggiani%20PhD%20Thesis%20revised.pdf.

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Abstract:

Parvovirus B19 (B19V) is a ssDNA virus, with a 5596 nt long genome encapsidated within an icosahedral capsid with a diameter of 22 nm. Viral proteins are subdivided into structural and non-structural: the main non-structural one is the NS1, while the 2 structural proteins VP1 and VP2 assemble originating the capsid shell. B19V tropism is mainly limited to erythroid progenitor cells (EPCs), however, virus can be detected in several districts persisting in tissues possibly lifelong. The virus can induce anemia and erythroid aplasia. Therapeutic strategies are only symptomatic, so the search for antivirals is strongly active, with screenings showing the activity in vitro of different compounds like hydroxyurea, cidofovir and brincidofovir. In the first project, a functional minigenome of B19V was developed, able to express only the NS1 protein. This minigenome proved able to replicate and express the NS1 at levels comparable to unmodified clones. Furthermore, the ability of this minigenome to complement the function of NS1-deficient genomes was demonstrated, thus providing a proof-of-concept of B19V genome editing possibility and, at the same time, a useful tool to study the NS1 protein also as an antiviral target. In the second project I addressed the interplay between B19V and the cellular restriction factor APOBEC3B (A3B), a cytidine deaminase acting on ssDNA, whose footprint on B19V genome was proved by a bioinformatic sequence analysis performed by the hosting lab. To understand whether A3B still exerts activity and a potential antiviral effect on B19V, the UT7/EpoS1 cells were transduced with lentiviral vectors to silence A3B expression, then used as a model to study viral behavior. No significant role of A3B on B19V was demonstrated, in agreement with the hypothesis of viral adaptation to this cellular restriction factor; anyway, virus ability to alter A3B expression would deserve further investigations.

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Toscani, Silvia <1993&gt. "Abbattimento di As(V) per riduzione ad As(III) e complessazione con nanoparticelle di ferro idrossido biogenerate da Klebsiella oxytoca DSM 29614." Master's Degree Thesis, Università Ca' Foscari Venezia, 2018. http://hdl.handle.net/10579/12627.

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Abstract:

Spesso si parla dell’arsenico riferendosi ai problemi di inquinamento di falda ad esso correlati. Al giorno d’oggi esistono diverse tecnologie mirate al sequestro di arsenico dalle acque. Una tecnica che sta assumendo importanza in questi ultimi decenni è quella del cosiddetto ‘biorisanamento’, che si basa sul metabolismo microbico di specifici microrganismi in grado di trasformare metalli pesanti tossici in forme meno nocive. Il presente lavoro di tesi, portato avanti in collaborazione con l’Università degli studi di Milano, è incentrato sullo studio dell’abbattimento dell’arsenato in soluzione acquosa in presenza di Klebsiella oxytoca DSM 29614. La K. oxytoca è un microrganismo anaerobico facoltativo che in presenza di citrato ferrico (terreno FEC) come unica fonte di carbonio ed energia in condizioni anaerobiche, è in grado di produrre un ferro gel costituito da nanoparticelle di Fe(III) idrossido inglobate in una matrice polisaccaridica (EPS). Inoltre studi recenti sul genoma di K. oxyoca DSM 29614 hanno messo in evidenza la presenza dell’operone ars, che conferisce l’arsenico-resistenza al ceppo. L’affinità chimica dell’arsenato per gli idrossidi ferrici e la resistenza del ceppo all’arsenato, ci ha indotto a provare le capacità potenziali del batterio nel ridurre la tossicità dell’arsenico in soluzione acquose. Abbiamo quindi coltivato il ceppo sia in terreno FEC che in terreno NAC (con citrato di sodio al posto del citrato ferrico) aggiungendo 50 mg/l di arsenato. Nello specifico, sono state misurate le concentrazioni di arsenico totale nell’esopolisaccaride, nel pellet cellulare e nel surnatante di entrambi i terreni di coltura. Dai risultati ottenuti è emerso che il ferro idrossido è estremamente efficace nel complessare l’arsenico presente nella coltura. Nel terreno FEC si è infatti assistito a un abbattimento completo dell’arsenato addizionato alla coltura, in quanto la concentrazione di arsenico nel surnatante centrifugato e filtrato dopo 48 ore non era più determinabile. I dati relativi alla speciazione dell’arsenico hanno inoltre evidenziato che nel terreno NAC il ceppo DSM 29216 riduceva dell’83% As(V) ad As(III), la forma chimica dell’arsenico meno tossica. Questa trasformazione è probabilmante dovuta alla respirazione anaerobica dell’arsenato. Nella prima fase di crescita anaerobica il ceppo DSM 29614 fermenta il citrato a CO2 e acido acetico, e il pH della coltura si abbassa da 7.8 a 6.5-6.6. Quando viene aggiunto dell’arsenato alla coltura, il ceppo passa dalla fase fermentativa alla respirazione anaerobica consumando acido acetico e trasformandolo in CO2 e di conseguenza il pH aumenta da 6.6 a 7.1 in 24 ore. Pertanto l’arsenato in condizioni di anaerobiosi diventa l’accettore finale di elettroni e il microrganismo è in questo modo capace di resistere ad alte concentrazioni di arsenato e contemporaneamente di produrre un ferro gel polisaccaridico che sequestra alte concentrazioni di arsenico.

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DI, LUCA MARIA CHIARA. "Structural and Functional Studies on Group A Streptococcus." Doctoral thesis, Università degli Studi di Camerino, 2013. http://hdl.handle.net/11581/401692.

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Abstract:

The main aim of this project was to conduct a study of some functional and structural aspects characterizing group A Streptococcus. Part of this work addressed the important issue of horizontal gene transfer among GAS. The study sought to demonstrate the lysogenic transfer of genetically linked erythromycin and tetracycline resistance genes carried by the chimeric element Ï•m46.1 and to analyze the susceptibility of different strains to both lysogenic conversion and bacteriophage-mediated lysis. Conjugation and transduction have always been indicated as mechanisms of intraspecific horizontal gene transfer. Genomic data have also revealed that S. pyogenes genome is extremely polylysogenic, indicating that temperate bacteriophages play a fundamental role in the evolution and plasticity of the chromosome. Hence, lysogenic conversion has recently attracted interest in the bacteriophage research field. However, lately published works focused just on toxigenic conversion, while those regarding transduction itself date back to the 1960s and 1970s. This lack of information is mainly due to the well-known difficulty in handling the GAS bacteriophage-host system. The present work represents a novelty in the topic of antimicrobial resistance in S. pyogenes and, more specifically, in dissemination of genetic elements carrying and mobilizing antimicrobial resistance genes. The second part of the project focused on a set of clinical group A streptococci belonging to the emm type 89 (M serotype 89). Some strains had been isolated in Italy from sore throats of patients in the course of a single seasonal outbreak of pharyngitis. These isolates had been already characterized for their SmaI macrorestriction profile by pulsed field gel electrophoresis and for the content in phage-associated virulence and resistance genes [...]. They showed a very low content in antibiotic resistance and prophage-associated virulence genes with a mean value of about one per genome. A great fraction of these strains did not possess any phage at all. In this context, the ability of certain GAS phages to lysogenize isolates with different emm types had also been studied. Interestingly, in the experimental conditions used, the emm89 recipients were not lysogenized [...]. The availability of several emm89 strains coming from Italy and other different world locations presenting a variable content in known prophage-associated virulence and resistance genes represented a unique starting material and an opportunity to study functional and structural aspects in GAS genome.

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DE, ARPAN. "Streptococcus mutans X-prolyl dipeptidyl peptidase as a target against biofilm formation unravelled by antihuman DPP IV drugs: a new paradigm for the synthesis of innovative anti-caries agents." Doctoral thesis, Università degli Studi di Camerino, 2015. http://hdl.handle.net/11581/401720.

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Filippini, Federica. "VALUTAZIONE DELLA RISPOSTA UMORALE E CELLULO-MEDIATA CONTRO SARS-COV-2 EVOCATA DAL VACCINO PFIZER mRNA BNT162b2 IN PAZIENTI IMMUNOSOPPRESSI." Doctoral thesis, Università degli studi di Brescia, 2023. https://hdl.handle.net/11379/570888.

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Abstract:

In questo lavoro di tesi è stata valutata la risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata, in seguito alla somministrazione del vaccino a mRNA anti-COVID-19 (Pfizer mRNA BNT162b2), in pazienti trattati con farmaci immunosoppressi e con immunodeficienza comune variabile (CVID). Dall’Unità di Reumatologia e Immunologia Clinica, dell’A.O. Spedali Civili di Brescia sono stati reclutati 38 pazienti, di cui 34 affetti da malattie reumatiche croniche (RDs), 4 da CVID e 11 persone sane (HC), utilizzate come controlli. Tutti i pazienti con RDs erano sottoposti ad una terapia a base di corticosteroidi e/o trattamento immunosoppressivo e/o farmaci biologici; in particolare, 14 pazienti assumevano abatacept (ABA), 10 rituximab e 10 tocilizumab. In primo luogo, è stato valutato il titolo anticorpale sia contro la proteina del nucleocapside (N) che della proteina Spike (S) di SARS-CoV-2 mediante immunodosaggio ad elettro chemiluminescenza. È stata analizzata la risposta immunitaria cellulo-mediata dei linfociti T CD4+ e CD4+-CD8+ mediante il test di rilascio dell’interferone- (IFN-) e valutata la produzione di chemochine indotte dall’IFN- (CXCL9 e CXCL10) e dalle cellule dell’immunità innata (CCL2, CXCL8 e CCL5), mediante l’uso di cytometric bead array method (CBA) a seguito di stimolazione con due pool di peptidi differenti della proteina S di SARS-CoV-2. Infine, mediante citofluorimetria, è stata studiata l’espressione di marcatori di attivazione precoce, come CD40L, CD137 e di citochine intracellulari, come IL-2, IFN- e IL-17, a seguito di stimolazione dei linfociti T con due pool di peptidi differenti della proteina S. I principali risultati ottenuti sono stati: (i) una ridotta risposta anti-S nei pazienti trattati con ABA, ripristinata però dopo la terza dose vaccinale; (ii) una ridotta attivazione delle cellule T dovuta ad una riduzione di IFN- e chemochine (CXCL9 e CXCL10); (iii) una riduzione di cellule T CD8+ della memoria nei pazienti trattati con ABA; (iv) una significativa abilità dei pazienti trattati con ABA di sviluppare una risposta cellulo-mediata delle cellule T CD4+, se stimolate con antigeni derivati dalla proteina S di SARS-CoV-2. Nonostante questo lavoro sia stato limitato dal basso numero di pazienti reclutati, l’esecuzione di numerose valutazioni effettuate a livello cellulare, ha contribuito a dimostrare il tipo di risposta immunitaria che i pazienti sottoposti a diverse terapie immunosoppressive sono stati in grado di generare a seguito della vaccinazione anti-COVID-19. La capacità di generare cloni di linfociti T CD4+ SARS-CoV-2 specifici in seguito alla vaccinazione, ha garantito a questi pazienti un’efficace protezione contro il virus. Inoltre, dal momento che, i pazienti trattati con ABA, dopo la somministrazione della terza dose di vaccino a mRNA anti-COVID-19 hanno acquisito la capacità di aumentare la risposta anticorpale, si può affermare che dosi ripetute di vaccino potrebbero essere necessarie al fine di ottimizzare la risposta immunologica in pazienti altamente vulnerabili.
In this study, we analyzed T cell-mediated response after COVID-19 mRNA vaccine in immunosuppressed patients and patients with common variable immunodeficiency disease (CVID). We enrolled 38 patients, from the Unit of Rheumatology and Clinical Immunology, of the A.O. Spedali Civili of Brescia, Italy, and 11 healthy sex- and age- matched controls (HC). Four patients were affected by CVID and 34 by chronic rheumatic diseases (RDs). All patients with RDs were treated by corticosteroid therapy and/or immunosuppressive treatment and/or biological drugs: 14 patients were treated with abatacept, 10 with rituximab and 10 with tocilizumab. Total antibody titer to SARS-CoV-2 spike protein was assessed by electrochemiluminescence immunoassay, CD4+ and CD4+-CD8+ T cell-mediated immune response was analyzed by interferon- (IFN-) release assay, the production of IFN-γ-inducible (CXCL9 and CXCL10) and innate-immunity chemokines (CCL2, CXCL8 and CCL5) by cytometric bead array after stimulation with different spike peptides. The expression of CD40L, CD137, IL-2, IFN-γ and IL-17 on CD4 and CD8 T cells, evaluating their activation status, after SARS-CoV-2 spike peptides stimulation, was analyzed by intracellular flow cytometry staining. The main findings were (i) a reduced anti-S response in ABA-treated group, restored after the third dose of vaccine; (ii) an impaired T cell activation, represented by a reduction of IFN-γ and related chemokines; (iii) a reduction of effector memory CD8+ T cells in ABA-treated group; (iiii) a significant ability of ABA treated group to mount a CD4 T cell response, when stimulated with spike derived antigens. Our work was limited by the low number of patients enrolled but performing extended cellular assessments, contributed to explain which kind of immune response patients chronically exposed to different immunosuppressive regimen are able to generate in response to COVID-19 vaccination. The preserved ability to generate clones of CD4+ T lymphocytes specific for SARS-CoV-2 spike proteins represents the assurance of an effective protection of vaccination to SARS-CoV-2. Moreover, after the third dose of COVID-19 mRNA vaccine, ABA-treated patients acquired the capability to produce a strong antibody response, despite they maintained a significant reduction of CD8+ T response. All these data represent a critical message from laboratory research bench to clinical patients’ side, suggesting that repeated vaccine doses may be necessary to optimize the immunological response and to induce more robust serological responses in these high-risk vulnerable patients.

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Russo, Valentina. "Potenzialità immunomodulanti di Akkermansia muciniphila in modelli animali di inflammatory bowel disease (IBD)." Doctoral thesis, Università degli studi del Molise, 2016. http://hdl.handle.net/11695/66363.

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Abstract:

About 500 different species of bacteria colonize the gastro-intestinal tract, in an amount equal to 1000 billion lire / gram, giving life commensal microbial ecosystem, the dimensions of which make it a real organ metabolically active. The intestinal microflora, which resides primarily in the colon, performs very important functions for the health of our organism as the synthesis of vitamins, fatty acids (butyrate and proprionate) and amino acids, but is also able to interact with the mucosal barrier and the system Local immune. The normal intestinal mucosa is constantly exposed to an enormous antigen load in the lumen, where the resident bacterial flora contributes impressive. Indeed, inflammation is a normal phenomenon in the intestine, a so-called "physiological inflammation", as the commensal bacteria stimulate the immune system regularly. When the structure for maintaining immune homeostasis are not working properly we move to a situation of inflammation is not controlled and the onset of inflammatory bowel disease, although, due to the complexity of the microbiota, is not yet clear the role played by commensal bacteria, and those pathogens. IBD, such as Crohn's disease and ulcerative colitis, are immune-mediated disorders because they cause an abnormal immune response and cause chronic inflammation at the level of the gastro-intestinal tract, with symptoms such as abdominal pain, diarrhea and loss of blood. Recently it has been isolated from the intestinal tract, a new bacterium called Akkermansia muciniphila belongs to the genus Verrucomicrobia. Akkermansia muciniphila is a Gram-negative, strictly anaerobic, not mobile asporogenous shaped coconut or rod with an unusual structure, , with wart-like protrusions phones, able to grow singly or in pairs. My work has focused on depth phenotypic characteristics (sugar metabolism and enzyme activity) and antibiotic resistance of A. muciniphila, germ until now little known. The presence of A. muciniphila in humans is associated with a good balance of the intestinal microflora and thus able to perform a beneficial action in the host organism. In order to substantiate these claims, it was decided to study the role of A. muciniphila in animal models of intestinal inflammation induced by dextran sulfate sodium (DSS). The animals were divided into groups: the first group was administered the germ vivo, the second dead one, while the control group was administered only water. It was subsequently induced experimental colitis. To analyze the trend of the disease were taken into account three basic parameters: body weight, weight of the colon and DAI (disease activity index). The results of this monitoring show that A. muciniphila is able to protect the animals from the typical symptoms of the colitis, which affect, however, those not treated. The analysis of cytokines appears to confirm the protective function of the bacterium during demonstrations inflammatory bowel, because the expression of cytokines during colitis presents lower levels in animals pre-treated with Akkermansia muciniphila alive. In conclusion, it is clear that this new germ Akkermansia muciniphila is one of those responsible for the contribution beneficial intestinal bacteria and appears to have an important immunomodulatory role in inflammatory bowel models: the data show that the germ is present in the normal intestinal microflora of individuals adults, is able to play a beneficial role in the course of IBD. This promising result allows us to hope that A. muciniphila can be used in future as an excellent therapeutic target in the treatment of inflammatory bowel disease.
Circa 500 specie diverse di batteri colonizzano il tratto gastro-intestinale, in una quantità pari a 1000 miliardi/grammo, dando vita all’ecosistema microbico commensale, le cui dimensioni ne fanno un vero e proprio organo metabolicamente attivo. La microflora intestinale, che risiede principalmente nel colon, svolge funzioni molto importanti per la salute del nostro organismo come la sintesi di vitamine, acidi grassi (butirrato e proprionato) e amminoacidi, ma è anche in grado di interagire con la barriera mucosale ed il sistema immunitario locale. La mucosa intestinale normale è costantemente esposta ad un’enorme carica antigenica presente nel lume, cui la flora batterica residente contribuisce in modo imponente. Infatti, l’infiammazione rappresenta un fenomeno normale nell’intestino, una cosiddetta “infiammazione fisiologica”, in quanto i batteri commensali stimolano regolarmente il sistema immunitario. Quando le strutture preposte al mantenimento dell’omeostasi immunitaria non funzionano correttamente si passa ad una situazione di infiammazione non controllata e quindi all’instaurarsi delle patologie infiammatorie intestinali, anche se, a causa della complessità del microbiota, ancora non è chiara la funzione svolta dai batteri commensali e da quelli patogeni. Le IBD, come il morbo di Crohn e la colite ulcerosa, sono disordini immuno-mediati perché causano un’abnorme risposta immunitaria e provocano un’infiammazione cronica a livello del tratto gastro-intestinale, accompagnata da sintomi come dolori addominali, diarrea e perdita di sangue. Recentemente è stato isolato, nel tratto intestinale, un nuovo batterio chiamato Akkermansia muciniphila, appartenente al genere Verrucomicrobia. Akkermansia muciniphila è un batterio Gram-nagativo, anaerobio stretto, non mobile, asporigeno a forma di cocco o bastoncello con un’insolita struttura cellulare, con sporgenze simili a verruche cellulari, capace di crescere singolarmente o in coppia. Il mio lavoro si è concentrato sull’approfondimento delle caratteristiche fenotipiche (metabolismo degli zuccheri ed attività enzimatica) e di antibiotico resistenza di A. muciniphila, germe fino ad oggi ancora poco conosciuto. La presenza di A. muciniphila nell’uomo viene associata ad un buon equilibrio della microflora intestinale e quindi in grado di svolgere un’azione benefica nell’organismo ospite. Allo scopo di avvalorare queste affermazioni, si è deciso di studiare il ruolo di A. muciniphila in modelli animali di infiammazione intestinale indotta da sodio destrano solfato (DSS). Gli animali sono stati suddivisi in gruppi: al primo gruppo è stato somministrato il germe vivo, al secondo quello morto, mentre al gruppo di controllo è stata somministrata solo acqua. Successivamente è stata indotta la colite sperimentale. Per analizzare l’andamento della malattia sono stati presi in considerazione tre parametri fondamentali: peso corporeo, peso del colon e DAI (disease activity index). I risultati di questi monitoraggi dimostrano che A. muciniphila è in grado di proteggere gli animali dai sintomi tipici della colite, che colpiscono, invece, quelli non trattati. Anche l’analisi delle citochine sembra confermare la funzione protettiva del batterio durante le manifestazioni infiammatorie intestinali, perché l’espressione delle citochine durante la colite presenta livelli minori negli animali pre-trattati con Akkermansia muciniphila viva. In conclusione, è chiaro che questo nuovo germe Akkermansia muciniphila rappresenta uno di quei batteri responsabili dell’apporto benefico all’intestino e sembra avere un ruolo immunomodulante importante in modelli infiammatori intestinali: i dati dimostrano che il germe, presente nella normale microflora intestinale di individui adulti, è in grado di svolgere un ruolo benefico in corso di IBD. Questo promettente risultato ci permette di auspicare che A. muciniphila possa essere sfruttato, in futuro, come un ottimo target terapeutico nella cura delle patologie infiammatorie intestinali.

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Dissertations / Theses on the topic 'Microbiologia e microbiologia clinica'

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