Academic literature on the topic 'Mikrotubuli'

Zarówno wolna tubulina, jak i tubulina wbudowana w mikrotubule może być modyfikowana potranslacyjnie poprzez przyłączenie różnorodnych grup funkcyjnych. Wśród kilkunastu zidentyfikowanych modyfikacji α- i β-tubuliny, przynajmniej niektóre zmiany potranslacyjne, jak acetylacja, detyrozynacja czy glutamylacja są zachowane w toku ewolucji od pierwotniaków do człowieka. Modyfikacje potranslacyjne tworzą specyficzny wzór na powierzchni mikrotubul, nazwany kodem tubulinowym, który jest rozpoznawany i „interpretowany” przez białka oddziałujące z mikrotubulami. W efekcie modyfikacje potranslacyjne tubuliny wpływają zarówno bezpośrednio na właściwości mikrotubul, jak i pośrednio, przez białka towarzyszące mikrotubulom. Poziom modyfikacji potranslacyjnych tubuliny na poszczególnych mikrotubulach jest zróżnicowany i zależy od rodzaju tworzonych struktur mikrotubularnych oraz typu komórek. Dodatkowo, poziom modyfikacji potranslacyjnych tubuliny może zmieniać się zależnie od stadium cyklu komórkowego lub stopnia zróżnicowania komórki. Intensywne badania prowadzone w ciągu ostatnich lat zaowocowały odkryciem kluczowych enzymów modyfikujących α- i β-tubulinę oraz częściowo, mechanizmu ich działania. Nadal jednak jesteśmy dalecy od pełnego zrozumienia roli modyfikacji potranslacyjnych mikrotubul w regulacji procesów komórkowych.

ZusammenfassungGegenwärtig sind Anthelminthika-Resistenzen bei Pferdeund Wiederkäuerhelminthen bereits weit verbreitet. Es handelt sich dabei in erster Linie um Resistenzen gegen Wirkstoffe aus den Gruppen der Benzimidazole (BZ) und bei kleinen Wiederkäuern auch der makrozyklischen Laktone (ML). Das Angriffsziel der BZ ist das Beta-Tubulin. Gemeinsam mit dem Alpha-Tubulin bildet dieses Protein die röhrenartigen Mikrotubulin-Strukturen in den Zellen der Parasiten und Wirte. Die BZ binden an das Beta-Tubulin und blockieren dadurch den Aufbau von Mikrotubuli. Ohne Mikrotubuli können wichtige Zellstoffwechselvorgänge, wie z. B. der intrazelluläre Transport von Stoffen oder die Zellteilung, nicht mehr stattfinden, sodass der betroffene Organismus abstirbt. Durch molekularbiologische Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass bei BZ-resistenten Trichostrongyliden des Schafes im Vergleich zu BZ-empfindlichen Würmern Unterschiede in der Gensequenz des Beta-Tubulins auftreten. Dabei wird durch die Expression von Tyrosin anstelle von Phenylalanin, vor allem an der Position 200 des Proteins, die Bindungsintensität zwischen BZ und dem Zielprotein erheblich reduziert. Beim Pferd sind in erster Linie Populationen der auch als Palisadenwürmer bezeichneten kleinen Strongyliden (Cyathostominae) von BZ-Resistenz betroffen. Ähnlich wie bei den Trichostrongyliden wurden auch hier Veränderungen der Beta-Tubulin- Gensequenz im Zusammenhang mit der Resistenz beobachtet. Allerdings scheint hier die Veränderung in der Position 200 nur eine untergeordnete Bedeutung zu haben. Die molekularen Zusammenhänge der Resistenz gegen ML sind bisher nur vergleichsweise wenig untersucht. Neueste Daten zum Resistenzmechanismus bei Cooperia oncophora des Rindes weisen auf Veränderungen im glutamatgesteuerten Chloridionenkanal, dem Zielprotein dieser Wirkstoffklasse, hin.

The ultrastructural morphometric quantification of cytoplasmic microtubular distribution densities requires electron micro­graph magnifications whereby only small cytoplasmic areas are included per negative. Consecutive electron micrographs can be composed in montages to attain complete profiles of high magnification cell sections. Conventional morphometric methods are not suitable for application on areas that may be as great or even greater than 1 m² in size. Modifications of conventional morphometric technology to facilitate investigations of this nature are described. Statistical comparison of results obtained with this method and a standard method reflect the soundness of the modifications.

Das COP9-Signalosom (CSN) ist ein evolutionär konservierter Proteinkomplex. Er besteht aus acht Untereinheiten und wird als Paralog des Lid-Subkomplexes des 26S Proteasoms angesehen. Das CSN verfügt über diverse enzymatische Aktivitäten, die es zu einem regulatorischen Faktor des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) machen. Das UPS ist für den Abbau von einem Großteil der zellulären Proteine notwendig. Für die Proteolyse bestimmter Proteine werden diese mit einer Polyubiquitinkette markiert. Dies geschieht über eine Enzymkaskade von E1, E2s und E3-Ligasen, wobei die E3s die Substratspezifität bestimmen. Die Interaktion von E3s mit dem CSN ist für deren Assemblierung und Aktivität von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren bindet das CSN eine Vielzahl von proteasomalen Substraten und scheint deren Abbau direkt zu kontrollieren. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion des CSN mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1 nachgewiesen werden. EB1 wirkt präferentiell an den (+)-Enden von Mikrotubuli und fördert die Polymerisierung und Stabilität von Mikrotubulifilamenten. EB1 bindet über die Untereinheit CSN5 an das CSN. Die Interaktion von EB1 mit dem CSN findet im Centrosom statt und führt zur Phosphorylierung und Stabilisierung von EB1. Eine verminderte Bindung von EB1 an das CSN oder eine reduzierte Phosphorylierung von EB1 führt zu einem beschleunigten Abbau. Die Funktion der Interaktion zwischen EB1 und dem CSN wurde in CSN-siRNA-Zelllinien untersucht. Dazu wurden die Untereinheiten CSN1, 3 und 5 in HeLa-Zellen permanent herunterreguliert. Die siRNAs gegen CSN1 und 3 (siCSN1, siCSN3) führen zur Reduktion des gesamten CSN Komplexes, der Knockdown von CSN5 (siCSN5) nur zur Verminderung von CSN5. In allen drei Zelllinien ist der Abbau von EB1 beschleunigt, was auf eine verminderte Bindung an, bzw. Phosphorylierung durch das CSN zurückzuführen ist. Dies hat Konsequenzen für die Stabilität von Mikrotubulifilamenten in siCSN1- und siCSN3-Zellen. Diese zeigen eine erhöhte Sensibilität gegenüber Nocodazol, welches die Polymerisierung von Mikrotubuli inhibiert. Des Weiteren konnte ein durch Nocodazol ausgelöster Zellzyklusarrest durch die Überexpression von EB1 oder CSN1 in HeLa-Zellen überwunden werden.
The COP9 signalosome (CSN) is an evolutionary conserved protein complex. It consists out of eight subunits and is a paralogue to the lid subcomplex of the 26S proteasome. The CSN posesses several activities, supporting its function as a regulator of the Ubiquitin Proteasome System (UPS). The UPS mediates the degradation of the majority of the cellular proteins. Prior to degradation, a poly-ubiquitin chain is attached to the proteins. This process is catalyzed by a cascade of E1, E2s and E3-ligases. The CSN is a regulator of the E3-ligases, which determine substrate selectivity of the ubiquitination. The CSN also directly binds and thereby controls degradation of several proteasomal substrates. In the present study a direct interaction between the CSN and the microtubule binding protein EB1 is shown, which is mediated by the subunit CSN5. EB1 binds preferentially to the (+)-ends of microtubules and thereby promotes polymerisation rates and enhances the stability of microtubule filaments. The interaction between the CSN and EB1 is localized to the centrosome and results in EB1 phosphorylation and stabilization. A compromised binding of EB1 to the CSN results in an accelerated degradation. For functional studies of the CSN-EB1 interaction in HeLa cells, siRNA mediated knockdowns of CSN subunits were used. The subunits CSN1, CSN3 and CSN5 were knocked down permanently resulting in a faster proteolysis of EB1. This was a result of decreased amounts of CSN complex in cells with downregulated CSN1 and CSN3. The knockdown of CSN5 affects only subunit CSN5 levels causing a compromised binding of EB1 to the CSN complex. An increased sensitivity to the microtubule disrupting agent nocodazole was observed in the CSN1 and CSN3 knockdown cells. A cell cycle arrest induced in HeLa cells by nocodazole treatment was rescued by overexpression of EB1 or CSN1. The data presented in this study suggest a functional relationship of EB1 and the CSN resulting in a stabilization of microtubule filaments.

Die vorliegende Doktorarbeit stammt aus (ist in) dem Bereich der NanoBioTechnologie. Ihr Ziel ist es, das Motorprotein Kinesin und Mikrotubuli einzusetzen, um DNS-Moleküle in einem synthetischen Umgebung zu manipulieren. Diese Doktorarbeit setzt sich aus fünf Kapiteln zusammen. In der Einführung wird die makromolekulare Struktur der Zelle beschrieben, z.B. das Zytoskelett und Kinesin, eins der Motorproteine, die auf Mikrotubuli entlang laufen können. Der Schwerpunkt dieses Kapitels liegt auf der Nützlichkeit biologischer Motoren für den Aufbau und die Organisation von Strukturen im technischen Umfeld. Das zweite Kapitel zeigt, wie Kinesin und Mikrotubulis in einem synthetischen Umfeld für den Transport verschiedener Frachten, z.B. Streptavidin, Quantum dots oder DNS-Molekülen, genutzt werden können. Hier liegt der Schwerpunkt auf der Manipulation der DNS-Moleküle durch motor-gesteuerte Mikrotubulis und wie dieser Fracht-Transport-Mechanismus prinzipiell als Basis für die Entwicklung neuer Konzepte im Bereich des Bioingenieurwesens dienen kann. Ein Beispiel für ein solches Konzept ist die auf DNS basierende Molekularelektronik, bei der die Bindung und Streckung von DNS-Molekülen zwischen leitfähigen Oberflächen notwendig ist. Das dritte Kapitel beschreibt den Einfluß der Oberflächeneigenschaften auf die DNS-Anbindung. Es bietet Antworten darauf, wie diese Eigenschaften erforscht, spezifisch gestaltet und vorbereitet werden können, so daß sie der wissenschaftlichen Zielsetzung angemessen sind. Auf die Betrachtung von komplexen Musteranordnungen, wie sie in der Nanoelektronik genutzt werden können, wird im vierten Kapitel eingegangen. Hier wird auf praktische Art und Weise deutlich gemacht, wie DNS-Moleküle an leitfähige Oberflächen gebunden und dort durch Motorproteine und Mikrotubulis manipuliert werden können. Die Vorteile der motor-basierten Manipulation gegenüber den konventionellen Methoden wie AFM oder der optischen Pinzette werden diskutiert. Das fünfte und letzte Kapitel zeigt, wie man das Kinesin-Mikrotubuli-System nutzen kann, um daraus Informationen über DNS-Moleküle abzuleiten. Dafür wurde das Verhalten der Mikrotubulis in Beziehung auf die von gebundenen DNS-Molekülen ausgeübten Kräfte untersucht. Zusammenfassend habe ich experimentelle Untersuchungen und Färbeprotokolle entwickelt, um den gesamten Manipulationsprozeß zu detektieren, visualisieren und kontrollieren. Weiterhin untersuchte ich seine Implikationen auf theoretische Analysen, sowie auf praktische Anwendungen im Nano-Ingenieurwesen. Meine Daten demonstrieren, das DNS-Moleküle im synthetischen Umfeld so manipuliert werden können, daß kontrollierte DNS-Bioschnittstellen entstehen; Schnittstellen, die sowohl für weitere nanoelektronische Anwendungen als auch für topologische DNS-Studien genutzt werden können. Es wird weiterhin erwartet, daß das Kinesin-Mikrotubuli-System für die 3D-Anordnung auf biomolekularer Ebene im technischen Umfeld eine ebenso wichtige Rolle spielen wird. Die Fähigkeit, Vorlagen von Biomolekülen und/oder Anordungen mit definierten Eigenschaften zu schaffen und gleichzeitig ihre biologische Aktivität zu erhalten, kann als Beweis dienen, daß biologische Motoren für die molekulare Fertigung genutzt werden können. - (Die Druckexemplare enthalten jeweils eine CD-ROM als Anlagenteil: QuickTimeMovies (ca. 86 MB)- Übersicht über Inhalte siehe Dissertation S. IX - XIII)
The work described in this thesis is in the field of NanoBioTechnology. Its goal is to leverage the motor protein kinesin and its microtubule track to manipulate DNA molecules in synthetic environment. This thesis contains five chapters. The first chapter describes macromolecular structures of the cell: i. e. the cytoskeleton and one of the motor proteins that move along it, kinesin. Emphasized is how biological motors might prove useful for organizing structures in engineered environments. The second chapter demonstrates how kinesin and microtubules can be used in synthetic environments to transport different cargos: i.e. streptavidin, quantum dots and DNA molecules. Special emphasis is placed on the manipulation of DNA molecules by the motor-driven microtubules. This cargo transport mechanism serves as a proof-of-principle for new bioengineering concepts such as DNA-based molecular electronics. The third chapter describes the influences of the surface properties on the DNA attachment and offers answers as how surface characteristics can be investigated, specifically designed and prepared so that they can serve the desired scientific purpose. The fourth chapter describes the manner in which DNA molecules can be attached to conductive surfaces and manipulated with motor proteins and microtubules. The complex DNA pattern formation that can be used for nanoelectronics is demonstrated. The advantages of motor-based manipulation over the conventional "one-by-one" methods (AFM, optical tweezers etc.) are discussed. The fifth and last chapter shows how one can use the kinesin-microtubule system to derive information about DNA molecules. For this, the response of the microtubules to forces exerted by attached DNA molecules has been studied. In summary, I have generated experimental assays and staining procedures to detect, visualize and control the entire manipulation process and to investigate its implications for theoretical analysis as well as for practical nano-engineered applications. My data demonstrated that DNA molecules can be manipulated in synthetic environment by kinesin and microtubules in such a way that controlled DNA biointerfaces can be generated. These biointerfaces can then be used for nanoelectronical application as well as for DNA topological studies. The kinesin-microtubule system is also expected to be equally important for 3D biomolecular assembly in engineered environments. The ability to generate templates of biomolecules and/or bioassemblies with well-defined features while maintaining their bioactivity, serves as proof-of-principle that biological motors can be used for molecular manufacturing. - (The pressure copies contain in each case a CD-ROM as component: QuickTimeMovies (ca. 86 MB)- To overview of contents see thesis P. IX - XIII)