To see the other types of publications on this topic, follow the link: Mikrotubuli.
Dissertations / Theses on the topic 'Mikrotubuli'
Create a spot-on reference in APA, MLA, Chicago, Harvard, and other styles
Consult the top 50 dissertations / theses for your research on the topic 'Mikrotubuli.'
Next to every source in the list of references, there is an 'Add to bibliography' button. Press on it, and we will generate automatically the bibliographic reference to the chosen work in the citation style you need: APA, MLA, Harvard, Chicago, Vancouver, etc.
You can also download the full text of the academic publication as pdf and read online its abstract whenever available in the metadata.
Browse dissertations / theses on a wide variety of disciplines and organise your bibliography correctly.
1
Manns, Isabel. "Die Rolle der Mikrotubuli und der mikrotubuli-abhängigen Transportprozesse im polaren Wachstum von Ustilago maydis." [S.l.] : [s.n.], 2005. http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2005/0129/.
Full text
2
Kopp, Petra. "Regulation von Podosomen in Makrophagen durch Mikrotubuli und Motorproteine." Diss., lmu, 2006. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:19-49060.
Full text
3
Kopp, Petra. "Regulation von Podosomen in Makrophagen durch Mikrotubuli und Motorproteine." [S.l.] : [s.n.], 2005. http://edoc.ub.uni-muenchen.de/archive/00004906.
Full text
4
Zapke, Janet [Verfasser]. "Untersuchungen zur Wechselwirkung von Mikrotubuli mit Kinesinen und Colchicin-Derivaten / Janet Zapke." Berlin : Freie Universität Berlin, 2011. http://d-nb.info/1025939689/34.
Full text
5
Vietmeier-Decker, Corina. "Die Funktion des Mikrotubuli-assoziierten S. pombe Proteins Mal3p in der Mitose." [S.l. : s.n.], 2004. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=971864985.
Full text
6
Hinrichs, Maike [Verfasser]. "Diffusion von Tau auf Mikrotubuli und Auswirkung auf die Kinesin-Funktion / Maike Hinrichs." Hannover : Technische Informationsbibliothek und Universitätsbibliothek Hannover (TIB), 2012. http://d-nb.info/1021438618/34.
Full text
7
Peth, Andreas. "Funktionelle Charakterisierung der Interaktion des COP9-Signalosoms mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1." Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I, 2007. http://dx.doi.org/10.18452/15686.
Full textAbstract:
Das COP9-Signalosom (CSN) ist ein evolutionär konservierter Proteinkomplex. Er besteht aus acht Untereinheiten und wird als Paralog des Lid-Subkomplexes des 26S Proteasoms angesehen. Das CSN verfügt über diverse enzymatische Aktivitäten, die es zu einem regulatorischen Faktor des Ubiquitin-Proteasom-Systems (UPS) machen. Das UPS ist für den Abbau von einem Großteil der zellulären Proteine notwendig. Für die Proteolyse bestimmter Proteine werden diese mit einer Polyubiquitinkette markiert. Dies geschieht über eine Enzymkaskade von E1, E2s und E3-Ligasen, wobei die E3s die Substratspezifität bestimmen. Die Interaktion von E3s mit dem CSN ist für deren Assemblierung und Aktivität von entscheidender Bedeutung. Des Weiteren bindet das CSN eine Vielzahl von proteasomalen Substraten und scheint deren Abbau direkt zu kontrollieren. In dieser Arbeit konnte eine Interaktion des CSN mit dem Mikrotubuli-bindenden Protein EB1 nachgewiesen werden. EB1 wirkt präferentiell an den (+)-Enden von Mikrotubuli und fördert die Polymerisierung und Stabilität von Mikrotubulifilamenten. EB1 bindet über die Untereinheit CSN5 an das CSN. Die Interaktion von EB1 mit dem CSN findet im Centrosom statt und führt zur Phosphorylierung und Stabilisierung von EB1. Eine verminderte Bindung von EB1 an das CSN oder eine reduzierte Phosphorylierung von EB1 führt zu einem beschleunigten Abbau. Die Funktion der Interaktion zwischen EB1 und dem CSN wurde in CSN-siRNA-Zelllinien untersucht. Dazu wurden die Untereinheiten CSN1, 3 und 5 in HeLa-Zellen permanent herunterreguliert. Die siRNAs gegen CSN1 und 3 (siCSN1, siCSN3) führen zur Reduktion des gesamten CSN Komplexes, der Knockdown von CSN5 (siCSN5) nur zur Verminderung von CSN5. In allen drei Zelllinien ist der Abbau von EB1 beschleunigt, was auf eine verminderte Bindung an, bzw. Phosphorylierung durch das CSN zurückzuführen ist. Dies hat Konsequenzen für die Stabilität von Mikrotubulifilamenten in siCSN1- und siCSN3-Zellen. Diese zeigen eine erhöhte Sensibilität gegenüber Nocodazol, welches die Polymerisierung von Mikrotubuli inhibiert. Des Weiteren konnte ein durch Nocodazol ausgelöster Zellzyklusarrest durch die Überexpression von EB1 oder CSN1 in HeLa-Zellen überwunden werden.The COP9 signalosome (CSN) is an evolutionary conserved protein complex. It consists out of eight subunits and is a paralogue to the lid subcomplex of the 26S proteasome. The CSN posesses several activities, supporting its function as a regulator of the Ubiquitin Proteasome System (UPS). The UPS mediates the degradation of the majority of the cellular proteins. Prior to degradation, a poly-ubiquitin chain is attached to the proteins. This process is catalyzed by a cascade of E1, E2s and E3-ligases. The CSN is a regulator of the E3-ligases, which determine substrate selectivity of the ubiquitination. The CSN also directly binds and thereby controls degradation of several proteasomal substrates. In the present study a direct interaction between the CSN and the microtubule binding protein EB1 is shown, which is mediated by the subunit CSN5. EB1 binds preferentially to the (+)-ends of microtubules and thereby promotes polymerisation rates and enhances the stability of microtubule filaments. The interaction between the CSN and EB1 is localized to the centrosome and results in EB1 phosphorylation and stabilization. A compromised binding of EB1 to the CSN results in an accelerated degradation. For functional studies of the CSN-EB1 interaction in HeLa cells, siRNA mediated knockdowns of CSN subunits were used. The subunits CSN1, CSN3 and CSN5 were knocked down permanently resulting in a faster proteolysis of EB1. This was a result of decreased amounts of CSN complex in cells with downregulated CSN1 and CSN3. The knockdown of CSN5 affects only subunit CSN5 levels causing a compromised binding of EB1 to the CSN complex. An increased sensitivity to the microtubule disrupting agent nocodazole was observed in the CSN1 and CSN3 knockdown cells. A cell cycle arrest induced in HeLa cells by nocodazole treatment was rescued by overexpression of EB1 or CSN1. The data presented in this study suggest a functional relationship of EB1 and the CSN resulting in a stabilization of microtubule filaments.
8
Dinu, Cerasela Zoica. "Leveraging the motor protein Kinesin to manipulate DNA molecules in synthetic environment." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2006. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:swb:14-1149612769067-28113.
Full textAbstract:
Die vorliegende Doktorarbeit stammt aus (ist in) dem Bereich der NanoBioTechnologie. Ihr Ziel ist es, das Motorprotein Kinesin und Mikrotubuli einzusetzen, um DNS-Moleküle in einem synthetischen Umgebung zu manipulieren. Diese Doktorarbeit setzt sich aus fünf Kapiteln zusammen. In der Einführung wird die makromolekulare Struktur der Zelle beschrieben, z.B. das Zytoskelett und Kinesin, eins der Motorproteine, die auf Mikrotubuli entlang laufen können. Der Schwerpunkt dieses Kapitels liegt auf der Nützlichkeit biologischer Motoren für den Aufbau und die Organisation von Strukturen im technischen Umfeld. Das zweite Kapitel zeigt, wie Kinesin und Mikrotubulis in einem synthetischen Umfeld für den Transport verschiedener Frachten, z.B. Streptavidin, Quantum dots oder DNS-Molekülen, genutzt werden können. Hier liegt der Schwerpunkt auf der Manipulation der DNS-Moleküle durch motor-gesteuerte Mikrotubulis und wie dieser Fracht-Transport-Mechanismus prinzipiell als Basis für die Entwicklung neuer Konzepte im Bereich des Bioingenieurwesens dienen kann. Ein Beispiel für ein solches Konzept ist die auf DNS basierende Molekularelektronik, bei der die Bindung und Streckung von DNS-Molekülen zwischen leitfähigen Oberflächen notwendig ist. Das dritte Kapitel beschreibt den Einfluß der Oberflächeneigenschaften auf die DNS-Anbindung. Es bietet Antworten darauf, wie diese Eigenschaften erforscht, spezifisch gestaltet und vorbereitet werden können, so daß sie der wissenschaftlichen Zielsetzung angemessen sind. Auf die Betrachtung von komplexen Musteranordnungen, wie sie in der Nanoelektronik genutzt werden können, wird im vierten Kapitel eingegangen. Hier wird auf praktische Art und Weise deutlich gemacht, wie DNS-Moleküle an leitfähige Oberflächen gebunden und dort durch Motorproteine und Mikrotubulis manipuliert werden können. Die Vorteile der motor-basierten Manipulation gegenüber den konventionellen Methoden wie AFM oder der optischen Pinzette werden diskutiert. Das fünfte und letzte Kapitel zeigt, wie man das Kinesin-Mikrotubuli-System nutzen kann, um daraus Informationen über DNS-Moleküle abzuleiten. Dafür wurde das Verhalten der Mikrotubulis in Beziehung auf die von gebundenen DNS-Molekülen ausgeübten Kräfte untersucht. Zusammenfassend habe ich experimentelle Untersuchungen und Färbeprotokolle entwickelt, um den gesamten Manipulationsprozeß zu detektieren, visualisieren und kontrollieren. Weiterhin untersuchte ich seine Implikationen auf theoretische Analysen, sowie auf praktische Anwendungen im Nano-Ingenieurwesen. Meine Daten demonstrieren, das DNS-Moleküle im synthetischen Umfeld so manipuliert werden können, daß kontrollierte DNS-Bioschnittstellen entstehen; Schnittstellen, die sowohl für weitere nanoelektronische Anwendungen als auch für topologische DNS-Studien genutzt werden können. Es wird weiterhin erwartet, daß das Kinesin-Mikrotubuli-System für die 3D-Anordnung auf biomolekularer Ebene im technischen Umfeld eine ebenso wichtige Rolle spielen wird. Die Fähigkeit, Vorlagen von Biomolekülen und/oder Anordungen mit definierten Eigenschaften zu schaffen und gleichzeitig ihre biologische Aktivität zu erhalten, kann als Beweis dienen, daß biologische Motoren für die molekulare Fertigung genutzt werden können. - (Die Druckexemplare enthalten jeweils eine CD-ROM als Anlagenteil: QuickTimeMovies (ca. 86 MB)- Übersicht über Inhalte siehe Dissertation S. IX - XIII)The work described in this thesis is in the field of NanoBioTechnology. Its goal is to leverage the motor protein kinesin and its microtubule track to manipulate DNA molecules in synthetic environment. This thesis contains five chapters. The first chapter describes macromolecular structures of the cell: i. e. the cytoskeleton and one of the motor proteins that move along it, kinesin. Emphasized is how biological motors might prove useful for organizing structures in engineered environments. The second chapter demonstrates how kinesin and microtubules can be used in synthetic environments to transport different cargos: i.e. streptavidin, quantum dots and DNA molecules. Special emphasis is placed on the manipulation of DNA molecules by the motor-driven microtubules. This cargo transport mechanism serves as a proof-of-principle for new bioengineering concepts such as DNA-based molecular electronics. The third chapter describes the influences of the surface properties on the DNA attachment and offers answers as how surface characteristics can be investigated, specifically designed and prepared so that they can serve the desired scientific purpose. The fourth chapter describes the manner in which DNA molecules can be attached to conductive surfaces and manipulated with motor proteins and microtubules. The complex DNA pattern formation that can be used for nanoelectronics is demonstrated. The advantages of motor-based manipulation over the conventional "one-by-one" methods (AFM, optical tweezers etc.) are discussed. The fifth and last chapter shows how one can use the kinesin-microtubule system to derive information about DNA molecules. For this, the response of the microtubules to forces exerted by attached DNA molecules has been studied. In summary, I have generated experimental assays and staining procedures to detect, visualize and control the entire manipulation process and to investigate its implications for theoretical analysis as well as for practical nano-engineered applications. My data demonstrated that DNA molecules can be manipulated in synthetic environment by kinesin and microtubules in such a way that controlled DNA biointerfaces can be generated. These biointerfaces can then be used for nanoelectronical application as well as for DNA topological studies. The kinesin-microtubule system is also expected to be equally important for 3D biomolecular assembly in engineered environments. The ability to generate templates of biomolecules and/or bioassemblies with well-defined features while maintaining their bioactivity, serves as proof-of-principle that biological motors can be used for molecular manufacturing. - (The pressure copies contain in each case a CD-ROM as component: QuickTimeMovies (ca. 86 MB)- To overview of contents see thesis P. IX - XIII)
9
Rehberg, Markus. "DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1: drei neue, centrosomale und Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium discoideum." Diss., lmu, 2005. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:19-32903.
Full text
10
Thiemann, Meinolf. "Untersuchungen zur In-vitro-Interaktion von Peroxisomen mit Mikrotubuli und der daran beteiligten Bindungsproteine." [S.l. : s.n.], 2001. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=962781649.
Full text
11
Rehberg, Markus. "DdEB1, DdMoe1 und DdLIS1: drei neue, centrosomale und Mikrotubuli-assoziierte Proteine bei Dictyostelium discoideum." [S.l. : s.n.], 2004. http://edoc.ub.uni-muenchen.de/archive/00003290/.
Full text
12
Muhs, Stefanie [Verfasser]. "Mechanismus der Mikrotubuli-modulierenden Aktivität von Centrosomal Protein 55 bei chromosomaler Instabilität / Stefanie Muhs." Hamburg : Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky, 2021. http://d-nb.info/123981481X/34.
Full text
13
Friedrich, Michael. "Antiangiogenetische Therapie beim humanen Pankreaskarzinom nach orthotoper Implantation in die Nacktmaus durch einen Mikrotubuli-Inhibitor." Diss., lmu, 2006. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bvb:19-49659.
Full text
14
Straube, Anne. "Struktur und zelluläre Funktionen von cytoplasmatischem Dynein und Organisation des Mikrotubuli-Cytoskeletts in Ustilago maydis." [S.l.] : [s.n.], 2003. http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2003/0175.
Full text
15
Beuter, Christoph. "Funktionelle Charakterisierung des Mal3-Proteins bei der Organisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe." [S.l.] : [s.n.], 2006. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=980301270.
Full text
16
Cavus, Ersin [Verfasser], and Eckart [Akademischer Betreuer] Förster. "Zur Wirkung von Reelin auf die Mikrotubuli-Dynamik in Neuronen / Ersin Cavus ; Betreuer: Eckart Förster." Hamburg : Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg, 2017. http://d-nb.info/1126116076/34.
Full text
17
Cavus, Ersin Verfasser], and Eckart [Akademischer Betreuer] [Förster. "Zur Wirkung von Reelin auf die Mikrotubuli-Dynamik in Neuronen / Ersin Cavus ; Betreuer: Eckart Förster." Hamburg : Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg, 2017. http://d-nb.info/1126116076/34.
Full text
18
Hascher, Antje. "Rolle der Phosphorylierung des humanen Tau-Proteins Einfluss auf die pathologische Aggregation und Wechselwirkung mit Mikrotubuli /." [S.l.] : [s.n.], 2005. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=977022412.
Full text
19
Grüb, Saskia Sybille [Verfasser], and Sabine [Akademischer Betreuer] Windhorst. "Funktion der Mikrotubuli-modulierenden Aktivität von DIAPH2 beim Chromosomen-Alignment / Saskia Sybille Grüb ; Betreuer: Sabine Windhorst." Hamburg : Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg, 2019. http://d-nb.info/1183262396/34.
Full text
20
Grün, Nathalie [Verfasser], and R. [Akademischer Betreuer] Fischer. "Untersuchung des Mikrotubuli-abhängigen Vesikeltransports und der Tubulin- Detyrosinierung in Aspergillus nidulans / Nathalie Grün. Betreuer: R. Fischer." Karlsruhe : KIT-Bibliothek, 2015. http://d-nb.info/1099432308/34.
Full text
21
Gögel, Stefanie. "Analyse der Funktion des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Futsch während der Entwicklung des neuronalen Cytoskeletts bei Drosophila melanogaster." [S.l. : s.n.], 2004. http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn=971930848.
Full text
22
Grell, Jan [Verfasser]. "Eine aberrante Expression des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau ist ein unabhängiger prognostischer Marker bei Prostatakrebs / Jan Grell." Hamburg : Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg Carl von Ossietzky, 2020. http://d-nb.info/1236695283/34.
Full text
23
Konzack, Sven. "Funktion des Kinesin-Motorproteins KipA bei der Organisation des Mikrotubuli-Cytoskeletts und beim polaren Wachstum von Aspergillus nidulans." [S.l. : s.n.], 2004. http://archiv.ub.uni-marburg.de/diss/z2004/0151/.
Full text
24
Arens, Julia [Verfasser], Philippe I. [Akademischer Betreuer] Bastiaens, and Frank [Akademischer Betreuer] Wehner. "Die Rolle von Mikrotubuli-regulierenden Proteinen während der neuronalen Differenzierung / Julia Arens. Betreuer: Philippe I. Bastiaens. Gutachter: Frank Wehner." Dortmund : Universitätsbibliothek Dortmund, 2012. http://d-nb.info/1099327628/34.
Full text
25
Labonté, Dorthe Verfasser], and Matthias [Akademischer Betreuer] [Kneussel. "Untersuchung der Funktion von TRIM3 in Mikrotubuli-assoziierten Transportprozessen im Nervensystem von Mus musculus (Linnaeus, 1758) / Dorthe Labonté. Betreuer: Matthias Kneussel." Hamburg : Staats- und Universitätsbibliothek Hamburg, 2012. http://d-nb.info/1025931521/34.
Full text
26
Eckert, Thomas [Verfasser], Günther Akademischer Betreuer] Woehlke, and Thorsten [Akademischer Betreuer] [Hugel. "Kinetische und strukturelle Untersuchung der Mikrotubuli-schneidenden Enzyme Spastin und Katanin / Thomas Eckert. Gutachter: Thorsten Hugel ; Günther Woehlke. Betreuer: Günther Woehlke." München : Universitätsbibliothek der TU München, 2012. http://d-nb.info/1031515488/34.
Full text
27
Samereier, Matthias. "Functional analyses of microtubule and centrosome-associated proteins in Dictyostelium discoideum." Phd thesis, Universität Potsdam, 2011. http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2011/5283/.
Full textAbstract:
Understanding the role of microtubule-associated proteins is the key to understand the complex mechanisms regulating microtubule dynamics. This study employs the model system Dictyostelium discoideum to elucidate the role of the microtubule-associated protein TACC (Transforming acidic coiled-coil) in promoting microtubule growth and stability.
Dictyostelium TACC was localized at the centrosome throughout the entire cell cycle. The protein was also detected at microtubule plus ends, however, unexpectedly only during interphase but not during mitosis. The same cell cycle-dependent localization pattern was observed for CP224, the Dictyostelium XMAP215 homologue. These ubiquitous MAPs have been found to interact with TACC proteins directly and are known to act as microtubule polymerases and nucleators. This work shows for the first time in vivo that both a TACC and XMAP215 family protein can differentially localize to microtubule plus ends during interphase and mitosis. RNAi knockdown mutants revealed that TACC promotes microtubule growth during interphase and is essential for proper formation of astral microtubules in mitosis. In many organisms, impaired microtubule stability upon TACC depletion was explained by the failure to efficiently recruit the TACC-binding XMAP215 protein to centrosomes or spindle poles. By contrast, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) analyses conducted in this study demonstrate that in Dictyostelium recruitment of CP224 to centrosomes or spindle poles is not perturbed in the absence of TACC. Instead, CP224 could no longer be detected at the tips of microtubules in TACC mutant cells. This finding demonstrates for the first time in vivo that a TACC protein is essential for the association of an XMAP215 protein with microtubule plus ends. The GFP-TACC strains generated in this work also turned out to be a valuable tool to study the unusual microtubule dynamics in Dictyostelium. Here, microtubules exhibit a high degree of lateral bending movements but, in contrast most other organisms, they do not obviously undergo any growth or shrinkage events during interphase. Despite of that they are affected by microtubuledepolymerizing drugs such as thiabendazole or nocodazol which are thought to act solely on dynamic microtubules. Employing 5D-fluorescence live cell microscopy and FRAP analyses this study suggests Dictyostelium microtubules to be dynamic only in the periphery, while they are stable at the centrosome.
In the recent years, the identification of yet unknown components of the Dictyostelium centrosome has made tremendous progress. A proteomic approach previously conducted by our group disclosed several uncharacterized candidate proteins, which remained to be verified as genuine centrosomal components. The second part of this study focuses on the investigation of three such candidate proteins, Cenp68, CP103 and the putative spindle assembly checkpoint protein Mad1. While a GFP-CP103 fusion protein could clearly be localized to isolated centrosomes that are free of microtubules, Cenp68 and Mad1 were found to associate with the centromeres and kinetochores, respectively. The investigation of Cenp68 included the generation of a polyclonal anti-Cenp68 antibody, the screening for interacting proteins and the generation of knockout mutants which, however, did not display any obvious phenotype. Yet, Cenp68 has turned out as a very useful marker to study centromere dynamics during the entire cell cycle. During mitosis, GFP-Mad1 localization strongly resembled the behavior of other Mad1 proteins, suggesting the existence of a yet uncharacterized spindle assembly checkpoint in Dictyostelium.Die Kenntnis der Funktion von Mikrotubuli-assoziierenden Proteinen (MAPs) ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik und deren Regulation. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des Mikrotubuli-assoziierenden Proteins TACC (Transforming acidic coiled-coil), welches in vielen Organismen an der Stabilisierung und dem Wachstum von Mikrotubuli beteiligt ist, im Modellorganismus Dictyostelium discoideum untersucht. Das Dictyostelium TACC Protein konnte während des gesamten Zellzyklus am Centrosom nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde es an den Mikrotubuli-Plus-Enden vorgefunden, überraschenderweise jedoch ausschließlich während der Interphase. Die gleiche Zellzyklusabhängige Lokalisation wurde für CP224 beobachtet, einem Homologen der XMAP215 Proteine in Dictyostelium. Diese ubiquitären MAPs sind konservierte, direkte Interaktionspartner der TACC Proteine und spielen eine zentrale Rolle bei der Nukleation und der Polymerisation von Mikrotubuli. Durch diese Arbeit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass TACC und XMAP215 Proteine während der Interphase und Mitose unterschiedlich stark mit Mikrotubuli-Plus-Enden assoziiert sein können. Durch Untersuchungen an Knockdown-Mutanten wurde ersichtlich, dass Dictyostelium TACC eine Rolle beim Mikrotubuli-Wachstum während der Interphase spielt und über weite Strecken der Mitose essentiell für die Ausbildung von astralen Mikrotubuli ist. In anderen Organismen konnte als Ursache instabiler Mikrotubuli in TACC Mutanten häufig unzureichendes Rekrutieren des jeweiligen XMAP215 Proteins an das Centrosom ausgemacht werden. Um entsprechende Auswirkungen auf die Lokalisation von CP224 durch den Knockdown von TACC in Dictyostelium zu untersuchen, wurden Fluorescence Recovery after Photobleaching (FRAP) Experimente durchgeführt. Diese ergaben, dass CP224 auch in Abwesenheit von TACC in vollem Umfang an die Centrosomen und Spindelpole rekrutiert wird. Anders als im Wildtyp, konnte in TACC Mutanten allerdings kein CP224 an den Mikrotubuli-Plus-Enden nachgewiesen werden. Somit konnte erstmals in vivo gezeigt werden, dass ein TACC Protein essentiell für die Assoziation eines XMAP215 Proteins mit den Mikrotubuli-Plus-Enden ist. Im Laufe der genannten Experimente stellte sich heraus, dass sich die GFP-TACC Stämme aufgrund ihrer markierten Plus-Enden sehr gut für Untersuchungen zur ungewöhnlichen Mikrotubuli-Dynamik in Dictyostelium eignen. Zwar weisen Mikrotubuli hier über die gesamte Länge ausgeprägte Krümmungs- und Seitwärtsbewegungen auf, es können jedoch im Vergleich zu anderen Organismen während der Interphase kaum Wachstums- oder Verkürzungsvorgänge beobachtet werden. Dennoch können Dictyostelium Mikrotubuli unter Verwendung von Agenzien wie Thiabendazol oder Nocodazol, welche ausschließlich auf dynamische Mikrotubuli wirken, signifikant verkürzt werden. Durch FRAP Experimente und Einsatz von 5D Fluoreszenz-Mikroskopie an lebenden Zellen konnte in dieser Arbeit erstmalig nachgewiesen werden, dass Dictyostelium Mikrotubuli nur in der Zellperipherie, nicht aber im pericentrosomalen Bereich dynamisch sind. Die Identifikation bislang unbekannter Bestandteile des Dictyostelium Centrosoms erfuhr in den vergangenen Jahren große Fortschritte. Ein von unserer Gruppe durchgeführter Proteomics-Ansatz brachte eine Vielzahl potentiell centrosomaler Proteine zu Tage, von welchen bereits viele am Centrosom nachgewiesen werden konnten. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung dreier noch unbekannter Proteine aus dem Proteomics-Ansatz, Cenp68, CP103 und dem Dictyostelium Homologen des Spindle Assembly Checkpunkt Proteins Mad1. Hierbei zeigte sich, dass lediglich CP103 Bestandteil isolierter, Mikrotubuli-freier Centrosomen ist, während Cenp68 an die Centromere und Mad1 an die Kinetochoren lokalisieren. Die Charakterisierung von Cenp68 umfasste außerdem die Herstellung eines polyklonalen anti-Cenp68 Antikörpers, das Suchen nach Interaktionspartnern und die Erzeugung eines Cenp68 Knockout-Stammes. Letzterer wies jedoch keinen offensichtlichen Phänotyp auf. Das Verhalten des Dictyostelium Mad1 Proteins während der Mitose stimmte in großen Teilen mit dem anderer Mad1 Proteine überein, was auf die Existenz eines bislang unerforschten Spindle Assembly Chekpunkts in Dictyostelium hinweisen könnte.
28
Kuhnert, Oliver. "Charakterisierung der neuen centrosomalen Proteine CP148 und CP55 in Dictyostelium discoideum." Phd thesis, Universität Potsdam, 2012. http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2012/5994/.
Full textAbstract:
Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es über eine spezifische Verbindung eng an den Kern geknüpft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M Übergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabhängige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer
Neubildung in der Telophase korreliert. Während der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 Überexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi führte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe während der Interphase und Mitose über verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren
bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine veränderte Sun1
Lokalisation in der Kernhülle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein für die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum für die Centrosom/Centromer Verbindung benötigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt während des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Moleküle in der Interphase keine Mobilität zeigten. Die GFP-CP55 Überexpression führte zur Bildung von überzähligen Centrosomen mit der üblichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erhöhte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergrößerte Corona sowie
zusätzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der frühen Metaphase anstatt, wie üblich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Darüber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeinträchtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden.The Dictyostelium centrosome consists of a layered core structure surrounded by a microtubule-nucleating corona. A tight linkage through the nuclear envelope connects the cytosolic centrosome with the clustered centromeres within the nuclear matrix. At G2/M the corona dissociates, and the core structure duplicates yielding two spindle poles. The two proteins CP148 and CP55 were discovered in a proteomic analysis of Dictyostelium centrosomes. CP148 is a novel coiled-coil protein of the centrosomal corona. GFP-CP148 exhibited cell cycle dependent presence and absence at the centrosome, which correlates with dissociation of the corona in prophase and its reformation in late telophase. During telophase, GFP-CP148 formed cytosolic foci, which coalesced and joined the centrosome. This explains the hypertrophic appearance of the corona upon strong overexpression of GFP-CP148. Depletion of CP148 by RNAi caused virtual loss of the corona and disorganization of interphase microtubules. Surprisingly, formation of the mitotic spindle and astral microtubules was unaffected. Thus, microtubule nucleation complexes associate with centrosomal core components through different means during interphase and mitosis. Furthermore, CP148 RNAi caused dispersal of centromeres and altered Sun1 distribution at the nuclear envelope, suggesting a role of CP148 in the linkage between centrosomes and centromeres. Taken together, CP148 is an essential factor for the formation of the centrosomal corona, which in turn is required for centrosome/centromere linkage. As CP148, CP55 was also identified in a centrosomal proteome analysis. It is a component of the centrosomal core structure, and persists at the centrosome throughout the entire cell cycle. FRAP experiments revealed the majority of centrosomal GFP-CP55 is immobile indicating a structural task of CP55 at the centrosome. GFP-CP55 overexpression elicits supernumerary centrosomes containing the usual set of corona and core marker proteins. The CP55 null mutant is characterized by increased ploidy, a less structured, slightly enlarged corona, and by supernumerary, cytosolic MTOCs, containing only corona proteins and lacking a core structure. Live cell imaging showed that supernumerary MTOCs arise in telophase. Lack of CP55 also caused premature recruitment of the corona organizer CP148 to mitotic spindle poles, already in metaphase instead of telophase. Forces transmitted through astral microtubules may expel prematurely acquired or loosely attached corona fragments into the cytosol, where they act as independent MTOCs. CP55null cells were also impaired in growth, most probably due to difficulties in centrosome splitting during prophase. Furthermore, although they were still capable of phagocytosis, they appeared unable to utilize phagocytosed nutrients. This inability may be attributed to their disorganized Golgi apparatus.
29
Evdokimov, Dimitar Ivanov [Verfasser]. "Der Carboxyterminus des spannungsgesteuerten Ca 2+ -Kanals Ca v 2.3 interagiert mit den Mikrotubuli-assoziierten Proteinen MAP1A und MAP1S / Dimitar Ivanov Evdokimov." Köln : Deutsche Zentralbibliothek für Medizin, 2015. http://d-nb.info/1073165175/34.
Full text
30
Nickel, Angela [Verfasser], and Kerstin PD [Akademischer Betreuer] Feistel. "Entstehung und Morphogenese des Vorderhirns - Die Rolle des mit Mikrotubuli assoziierten Proteins Hmmr in Xenopus laevis / Angela Nickel ; Betreuer: Kerstin PD Feistel." Hohenheim : Kommunikations-, Informations- und Medienzentrum der Universität Hohenheim, 2020. http://d-nb.info/1215178476/34.
Full text
31
Theiß, Martin [Verfasser], and G. Elisabeth [Akademischer Betreuer] Pollerberg. "Die Rolle des Mikrotubuli-assoziierten Proteins 1B (MAP1B) bei der axonalen Navigation in der embryonalen Retina / Martin Theiß ; Betreuer: G. Elisabeth Pollerberg." Heidelberg : Universitätsbibliothek Heidelberg, 2017. http://d-nb.info/117768828X/34.
Full text
32
Taute, Katja. "Microtubule mechanics and the implications for their assembly." Doctoral thesis, Universitätsbibliothek Leipzig, 2012. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa-86861.
Full textAbstract:
Microtubules are cytoskeletal protein polymers relevant to a wide range of cell functions. In order to polymerize, the constituent tubulin subunits need to bind the nucleotide GTP, but its subsequent hydrolysis to GDP in the microtubule lattice induces depolymerization. The resulting behaviour of stochastic switching between growth and shrinkage is called dynamic instability. Both dynamic instability and microtubule mechanical properties are integral to many cell functions, yet are poorly understood.
The present study uses thermal fluctuation measurements of grafted microtubules
with different nucleotide contents to extract stiffnesses, relaxation times, and drag coefficients with an unprecedented precision. Both the stiffness and the relaxation time data indicate that stiffness is a function of length for GDP microtubules stabilized with the chemotherapy drug taxol. By contrast, measurements on microtubules polymerized with the non-hydrolizable GTP-analogue GMPCPP show a significantly higher, but constant, stiffness. The addition of taxol is shown to not significantly affect the properties of these microtubules, but a lowering of the GMPCPP content restores the length-dependent stiffness seen for taxol microtubules.
The data are interpreted on the basis of a recent biopolymer model that takes into account the anisotropic architecture of microtubules which consist of loosely coupled protofilaments arranged in a tube. Using taxol microtubules and GMPCPP microtubules as the respective analogues of the GDP and GTP state of microtubules, evidence is presented that shear coupling between neighbouring protofilaments is at least two orders of magnitude stiffer in the GTP state than in the GDP state. Previous studies of nucleotide effects on tubulin have focussed on protofilament bending, and the present study is the first to be able to show a dramatic effect on interprotofilament bonds. The finding’s profound implications for dynamic instability are discussed.
In addition, internal friction is found to dominate over hydrodynamic drag for microtubules shorter than ∼ 4 μm and, like stiffness, to be affected by the bound nucleotide, but not by taxol.
Furthermore, the thermal shape fluctuations of free microtubules are imaged, and the intrinsic curvatures of microtubules are shown for the first time to follow a spectrum reminiscent of thermal bending. Regarding the extraction of mechanical data, this assay, though previously described in the literature, is shown to suffer from systematic flaws.
33
Reuther, Cordula. "Patterning planar surfaces with motor proteins: Towards spatial control over motile microtubules." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2009. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-20916.
Full textAbstract:
A major challenge in nanotechnology is the spatially controlled transport of cargo on the nanometer scale. The use of a nanoscale transport system based on molecular motors and filaments of the cytoskeleton proved as a promising approach to this problem. Therefore, the objective of this work was to pattern planar surfaces with motor proteins in a way that allows controlled and guided movement of microtubule-shuttles. The first part of the work was in particular focused on generating nanometer–sized tracks of motor proteins on unstructured surfaces. Specifically, microtubules themselves were used as biological templates for the stamping and alignment of motor proteins. Compared to other soft lithography techniques like microcontact printing this approach circumvented protein denaturation due to drying and conformational changes caused by mechanical stress. Given the large persistence length of microtubules their encounters with the boundaries of the nanotracks are limited to shallow approach angles. This way, the generated structures proved very efficient for the guiding of microtubules without topographical barriers. Topography-free guiding, as demonstrated in this work, is expected to significantly ease the design and fabrication of microtubule-transport systems and opens up the possibility to transport cargo of unlimited size, i.e. without any constraints by the dimensions of topographic guiding channels. Moreover, the biotemplated patterning is a promising tool for in vitro studies on the individual and cooperative action of motor proteins. In particular it might be helpful for the reconstitution of complex subcellular machineries in synthetic environments. As an example, microtubule-microtubule sliding by the biomolecular motor ncd has been shown to induce directional sliding between antiparallel microtubules and static cross-linking between parallel ones. The second part of the work explored an in-situ patterning technique for motor proteins to enable user-defined pattern designs, and investigated the achievable resolution. Photothermal patterning, based on localized light-to-heat conversion combined with a thermoresponsive polymer layer, was presented as a novel method. Specifically, the conformation of poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) molecules in aqueous solution was switched between the swollen state at T < 30°C (protein-repelling conformation) to the collapsed state at T > 33°C (protein-binding conformation) by optical signals of visible light to generate heat in a highly-localized manner. Upon heating of a light-absorbing layer on the substrate, the surface-grafted PNIPAM molecules collapsed locally and allowed motor proteins in solution to bind in the illuminated areas. To confirm the successful patterning of kinesin-1 molecules and their functionality microtubule-based gliding motility assays were performed. It was shown that the microtubules bind to the patterned kinesin-1 molecules and are transported exclusively in the patterned areas. While the achieved pattern sizes were currently in the range of ten micrometers, finite element modeling (implemented in COMSOL) showed that increased optical intensities possibly combined with cooling of the sample allow to significantly scale down the pattern dimensions. The produced patterns can be reversibly activated and deactivated at high and low temperature, respectively. Moreover, sequential patterning of multiple kinds of proteins on the same surface will be possible in a similar way without the need for specific linker molecules or elaborate surface preparation. Another advantage of the method is the use of visible light, which is versatile as any wavelength can be applied. In addition visible light is in comparison to other UV-based photopatterning techniques non-damaging to proteinsDer räumlich kontrollierte Transport von nanoskaligen Objekten ist eine große Herausforderung auf dem Gebiet der Nanotechnologie. Ein auf molekularen Motoren und Filamenten des Zellskeletts basierendes Nanotransportsystem hat sich dabei als ein viel versprechender Ansatz erwiesen. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war es daher, ebene Oberflächen so mit Motorproteinen zu strukturieren, dass eine kontrollierte und geführte Bewegung von Mikrotubuli-Transportern ermöglicht wird. Der erste Teil der Arbeit war insbesondere darauf fokussiert, Motorprotein-Spuren im Nanometerbereich zu erzeugen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Strukturierungsmethode zur Realisierung von benutzerdefinierten Musterdesigns untersucht und die erreichbare Auflösung bestimmt. Für die Nanometerstrukturierung von Oberflächen mit funktionalen Motorproteinen wurde ein neuer Ansatz demonstriert. Mit der Anwendung von Biotemplaten, wie hier der Mikrotubuli, konnte ein hoch-lokalisiertes und orientiertes Anbinden von Proteinen an Oberflächen sowie gleichzeitig geringer Proteindenaturierung erreicht werden. Durch spezifisches Stempeln beziehungsweise Binden von Motoren wurden Muster aus funktionellen Proteinen mit hoher Oberflächendichte hergestellt. Die erzeugten Motor-Spuren haben gezeigt, dass Nanometerstrukturierungen möglich sind und ohne topographische Barrieren zu zuverlässiger Führung von Mikrotubuli führen können. Bisher konnte die nicht-topographische Strukturierung von Oberflächen mit Kinesin-1-Motoren nur im Mikrometerbereich demonstriert werden. Wegen der hohen Steifigkeit der Mikrotubuli war die thermische Energie des Systems in diesen Fällen nicht ausreichend, um die führende Spitze der Mikrotubuli zurück auf das Gebiet mit den strukturierten Motoren zu biegen. Dieses Problem wird durch die kleine Breite der hier demonstrierten Motor-Nanospuren verhindert, da das Auftreffen der Mikrotubuli mit den Grenzlinien auf extrem flache Winkel begrenzt ist. Interessanterweise haben sich Spuren des nicht-prozessiven Motors Kinesin-14 für das Führen und den Transport im Nanometerbereich als noch zuverlässiger herausgestellt als Kinesin-1-Spuren. Es ist zu erwarten, dass nicht-topographisches Führen, wie es in dieser Arbeit gezeigt wurde, das Design und die Herstellung von Mikrotubuli-Transportsystemen deutlich vereinfacht und die Möglichkeit eröffnet, Cargo mit unlimitierter Größe, d.h. ohne Einschränkungen durch die Abmessungen der topographischen Führungskanäle, zu transportieren. Zusätzlich ist die biotemplierte Strukturierung ein viel versprechendes Werkzeug um das individuelle und das kooperative Arbeiten von Motorproteinen in vitro untersuchen und komplexe subzelluläre Maschinerien in synthetischer Umgebung rekonstituieren zu können. Dies wurde am Beispiel des gerichteten Gleitens des biomolekularen Motors Kinesin-14 gezeigt, der ein gerichtetes Gleiten zwischen antiparallelen Mikrotubuli und statisches Vernetzen zwischen parallelen Mikrotubuli hervorruft. Mit dem Ansatz des biotemplierten Strukturierens ist es jedoch nicht einfach möglich, benutzerdefinierte Spuren zu erzeugen. Daher wurde die photothermische Proteinstrukturierung als eine neue Methode für die frei programmierbare, hochauflösende und schnelle Herstellung von strukturierten Proteinoberflächen eingeführt. Auf diese Weise wurden Kinesin-1-Muster durch licht-induziertes Heizen einer licht-absorbierenden Substratschicht erzeugt. Die thermisch schaltbaren poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM) Moleküle auf der Oberfläche kollabierten lokal und erlaubten es den Motorproteinen, in den beleuchteten Gebieten aus der Lösung an die Oberfläche zu binden. Die Bewegung gleitender Mikrotubuli bestätigte anschließend die erfolgreiche Strukturierung der Kinesin-1-Motoren und deren Funktionalität, da die Mikrotubuli an die strukturierten Motoren banden und ausschließlich in den strukturierten Gebieten transportiert wurden. Neben der Proteinstrukturierung wurde die lokalisierte Licht-zu-Wärme-Umwandlung kombiniert mit einer thermisch schaltbaren Polymerschicht auch für die lokale Aktivierung von Kinesin-1-Motoren auf der Oberfläche genutzt. Ein Vorteil der photothermischen Proteinstrukturierung ist die Möglichkeit, sichtbares Licht zu verwenden, da jede beliebige Wellenlänge angewendet werden kann und sichtbares Licht, im Vergleich zu anderen UV-basierten Photostrukturierungsmethoden, Proteine nicht schädigt. Modellierungen mit Hilfe der Finite-Elemente-Methode (implementiert in der Software COMSOL) haben gezeigt, dass die Lichtintensität und die Oberflächentemperatur speziell eingestellt werden müssen, um definierte Strukturgrößen zu erzielen. Während die derzeitig erzeugten Muster Größen im Bereich von zehn Mikrometern hatten, könnten durch höhere optische Intensitäten kombiniert mit Kühlung der Probe die Größenordnungen signifikant reduziert werden. Die reale experimentelle Auflösung wird jedoch auch von der Schaltcharakteristik des Polymers und der Proteinbindungsdynamik abhängen. Die hergestellten Muster können reversibel bei hohen beziehungsweise niedrigen Temperaturen aktiviert und deaktiviert werden. Zusätzlich können auf die gleiche Weise verschiedene Proteinsorten sequentiell auf einer Oberfläche strukturiert werden, ohne dass spezifische Bindungsmoleküle oder aufwändige Oberflächenpräparationen notwendig wären. Die Möglichkeit, Proteine reversibel an die Oberfläche zu binden, um geschriebene Muster wieder löschen zu können, wäre eine Weiterentwicklung und würde die Anwendungsmöglichkeiten der photothermischen Strukturierungsmethode erweitern. Außerdem würden optisch schaltbare Polymere das direkte Strukturieren von Motoren mit Licht ermöglichen und daher die Methode vereinfachen
34
Rauch, Philipp. "Neuronal Growth Cone Dynamics." Doctoral thesis, Universitätsbibliothek Leipzig, 2013. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa-119885.
Full textAbstract:
Sensory-motile cells fulfill various biological functions ranging from immune activity or wound healing to the formation of the highly complex nervous systems of vertebrates. In the case of neurons, a dynamic structure at the tip of outgrowing processes navigates towards target cells or areas during the generation of neural networks. These fan shaped growth cones are equipped with a highly complex molecular machinery able to detect various external stimuli and to translate them into directed motion. Receptor and adhesion molecules trigger signaling cascades that regulate the dynamics of an internal polymeric scaffold, the cytoskeleton. It plays a crucial role in morphology maintenance as well as in the generation and distribution of growth cone forces. The two major components, actin and microtubules (MTs) connect on multiple levels through interwoven biochemical and mechanical interactions. Actin monomers assemble into semiflexible filaments (F-actin) which in turn are either arranged in entangled networks in the flat outer region of the growth cone (lamellipodium) or in radial bundles termed filopodia. The dynamic network of actin filaments extends through polymerization at the front edge of the lamellipodium and is simultaneously moving towards the center (C-domain) of the growth cone. This retrograde flow (RF) of the actin network is driven by the polymerizing filaments themselves pushing against the cell membrane and the contractile activity of motor proteins (myosins), mainly in the more central transition zone (T-zone). Through transmembrane adhesion molecules, a fraction of the retrograde flow forces is mechanically transmitted to the cellular substrate in a clutch-like mechanism generating traction and moving the GC forward. MTs are tubular polymeric structures assembled from two types of tubulin protein subunits. They are densely bundled in the neurite and at the growth cone “neck” (where the neurite opens out into the growth cone) they splay apart entering the C-domain and more peripheral regions (P-domain). Their advancement is driven by polymerization and dynein motor protein activity. The two subsystems, an extending array of MTs and the centripetal moving actin network are antagonistic players regulating GC morphology and motility. Numerous experimental findings suggest that MTs pushing from the rear interact with actin structures and contribute to GC advancement. Nevertheless, the amount of force generated or transmitted through these rigid structures has not been investigated yet. In the present dissertation, the deformation of MTs under the influence of intracellular load is analyzed with fluorescence microscopy techniques to estimate these forces. RF mechanically couples to MTs in the GC periphery through friction and molecular cross-linkers. This leads to MT buckling which in turn allows the calculation of the underlying force. It turns out that forces of at least act on individual MT filaments in the GC periphery. Compared to the relatively low overall protrusion force of neuronal GCs, this is a substantial contribution. Interestingly, two populations of MTs buckle under different loads suggesting different buckling conditions. These could be ascribed to either the length-dependent flexural rigidity of MTs or local variations in the mechanical properties of the lamellipodial actin network. Furthermore, the relation between MT deformation levels and GC morphology and advancement was investigated. A clear trend evolves that links higher MT deformation in certain areas to their advancement. Interactions between RF and MTs also influence flow velocity and MT deformation. It is shown that transient RF bursts are related to higher MT deformation in the same region. An internal molecular clutch mechanism is proposed that links MT deformation to GC advancement.
When focusing on GC dynamics it is often neglected that the retraction of neurites and the controlled collapse of GCs are as important for proper neural network formation as oriented outgrowth. Since erroneous connections can cause equally severe malfunctions as missing ones, the pruning of aberrant processes or the transient stalling of outgrowth at pivotal locations are common events in neuronal growth. To date, mainly short term pausing with minor cytoskeletal rearrangements or the full detachment and retraction of neurite segments were described. It is likely that these two variants do not cover the full range of possible events during neuronal pathfinding and that pausing on intermediate time scales is an appropriate means to avoid the misdetection of faint or ambiguous external signals. In the NG108-15 neuroblastoma cells investigated here, a novel type of collapse was observed. It is characterized by the degradation of actin network structures in the periphery while radial filopodia and the C-domain persist. Actin bundles in filopodia are segmented at one or multiple breaking points and subsequently fold onto the edge of the C-domain where they form an actin-rich barrier blocking MT extension. Due to this characteristic, this type of collapse was termed fold collapse. Possible molecular players responsible for this remarkable process are discussed. Throughout fold collapse, GC C-domain area and position remain stable and only the turnover of peripheral actin structures is abolished. At the same time, MT driven neurite elongation is hindered, causing the GC to stall on a time scale of several to tens of minutes. In many cases, new lamellipodial structures emerge after some time, indicating the transient nature of this collapse variant. From the detailed description of the cytoskeletal dynamics during collapse a working model including substrate contacts and contractile actin-myosin activity is derived. Within this model, the known and newly found types of GC collapse and retraction can be reduced to variations in local adhesion and motor protein activity.
Altogether the results of this work indicate a more prominent role of forward directed MT-based forces in neuronal growth than previously assumed. Their regulation and distribution during outgrowth has significant impact on neurite orientation and advancement. The deformation of MT filaments is closely related to retrograde actin flow which in turn is a regulator of edge protrusion. For the stalling of GCs it is not only required that actin dynamics are decoupled from the environment but also that MT pushing is suppressed. In the case of fold collapse, this is achieved through a robust barrier assembled from filopodial actin bundles.
35
Müller-Reichert, Thomas. "Spindle organization in three dimensions." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2006. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:swb:14-1166107130476-22269.
Full textAbstract:
During cell division, chromosome segregation takes place on bipolar, microtubulebased spindles. Here, C. elegans is used to analyze spindle organization under both mitotic and meiotic conditions. First, the role of SAS-4 in organizing centrosome structure was analyzed. Partial depletion of SAS-4 in early embryos results in structurally defective centrioles. The study of this protein sheds light on the poorly understood role of the centrioles in dictating centrosome size. Second, the ultrastructure of wild-type mitotic spindle components was analyzed by electron tomography. This 3-D analysis reveals morphologically distinct microtubule end morphologies in the mitotic spindle pole. These results have structural implications for models of microtubule interactions with centrosomes Third, spindle assembly was studied in female meiosis. Specifically, the role of the microtubule severing complex katanin in spindle organization was analyzed. Electron tomography reveals fragmentation of spindle microtubules and suggests a novel katanin-dependent mechanism of meiotic spindle assembly. In this model, relatively long microtubules seen near the meiotic chromatin are converted into numerous short fragments, thus increasing the total number of polymers in an acentrosomal environment. Taken together, these results provide novel insights into the three-dimensional organization of microtubules during spindle assemblyDie Segregation der Chromosomen während der Zellteilung wird duch bipolare, von Microtubuli-aufgebauten Spindlen gewährleistet. In der vorliegenden Arbeit wird C. elegans zur Analyse der Spindelorganisation unter mitotischen und meiotischen Bedingungen herangezogen. Erstens wird die Rolle von SAS-4 in der Organisation von Zentrosomen untersucht. Die partielle Depletierung von SAS-4 in frühen Embryonen führt zu strukturell defekten Zentriolen und wirft somit Licht auf die wenig verstandene Rolle der Zentriolen in der Bestimmung der Zentrosomengröße. Zweitens wird die Ultrastruktur der mitotischen Spindelkomponenten im Wildtyp durch Elektronentomographie untersucht. Diese 3-D-Analyse zeigt, dass im mitotischen Spindlepol unterschiedliche Morphologien der Mikrotubulienden zu finden sind. Diese Ergebnisse haben strukturelle Implikationen für Modelle der Mikrotubuli-Zentrosomen-Interaktionen. Drittens wird der Aufbau der Spindel in der weiblichen Meiose, speziell die Rolle des Mikrotubuli-schneidenden Kataninkomplexes in der Spindelorganisation, untersucht. Die Elektronentomographie zeigt hier eine Fragmentierung der Spindelmikrotubuli. Basierend auf diesem Ergebnis wird ein neues Katanin-abhängiges Modell der Formierung der Meiosespindel entwickelt, in dem relativ lange Microtubuli in Nähe des meiotischen Chromatins in zahlreiche kurze Mikrotubuli “zerschnitten” werden. Dies erhöht die Anzahl der verfügbaren Polymere in dieser azentrosomalen Situation. Zusammenfassend bringen diese Ergebnisse neue Einsichten in die räumliche Organisation der Mikrotubuli während des Spindelaufbaus
36
Hirst, William Graham. "Tubulin biochemistry confers intrinsic differences in microtubule dynamics and drug sensitivity between species." Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, 2021. http://dx.doi.org/10.18452/22956.
Full textAbstract:
Mikrotubuli sind filamentöse intrazelluläre Polymere, die als grundlegende Bestandteile subzellulärer Strukturen in Eukaryoten dienen. Diese Studie verwendet einen vergleichenden Ansatz, um zu untersuchen, wie sich die intrinsischen dynamischen und biochemischen Eigenschaften von Tubulin zwischen verschiedenen Spezies unterscheiden, und zeigt ihre Konsequenzen in zwei verschiedenen physiologischen Kontexten: 1) Bestimmung der Spindelgröße bei Fröschen der Gattung Xenopus und 2) Spezifität von Mikrotubuli-Inhibitoren für Plasmodium falciparum-Mikrotubuli über denen ihres menschlichen Wirts.
In den Eiern der Froschgattung Xenopus wird die Länge der meiotischen Spindel biochemisch festgelegt und erreicht unabhängig von räumlichen Einschränkungen eine Obergrenze. Messungen der Dynamik von Xenopus-Mikrotubuli zeigen, dass X. laevis-Mikrotubuli sowohl schneller wachsen als auch länger leben als die von X. tropicalis. Darüber hinaus spielt die Quantifizierung der Länge und Massenverteilung der Xenopus-Mikrotubuli zusammen mit den Reaktionen der Eiextrakt-Spindelanordnung eine Rolle für die intrinsische Dynamik der Mikrotubuli bei der Modulation der Spindellänge.
Mikrotubuli sind auch Wirkstofftargets bei Pilz- und parasitären Helmintheninfektionen und haben in den letzten Jahrzehnten die Aufmerksamkeit als potenzielles Wirkstoffziel beim Malariaparasiten Plasmodium falciparum auf sich gezogen. Um die Dynamik und Medikamentspezifität von Mikrotubuli von P. falciparum zu charakterisieren, haben wir Tubulin direkt von den Parasiten gereinigt. Zum ersten Mal wurden hier dynamische P. falciparum-Mikrotubuli in vitro rekonstituiert und eine parasitenspezifische Unterdrückung der Dynamik von Mikrotubuli durch Oryzalin und Amiprofos-Methyl direkt nachgewiesen. Diese Studie legt einen experimentellen Rahmen fest, um direkt auf parasitenspezifische Hemmung von Mikrotubuli zu testen, die bisher unter Verwendung bestehender in-vitro-Ansätze nicht beobachtet wurden.Microtubules are filamentous intracellular polymers that are fundamental components of subcellular structures including the spindle, the cytoskeleton, and flagella in eukaryotes. This study uses a comparative approach to investigate how the intrinsic dynamic and biochemical characteristics of tubulin vary between species and demonstrates their consequences in two different physiological contexts: 1) Spindle size control in Xenopus frogs, and 2) The specificity of microtubule inhibitors for Plasmodium falciparum microtubules over those of their human host. In Xenopus frog eggs, the length of the spindle is biochemically controlled and reaches an upper limit independent of spatial constraints. In this study, in vitro measurements of Xenopus microtubule dynamics show that X. laevis microtubules are both faster-growing and longer-lived X. tropicalis, independent of the influence of microtubule-associated proteins. Furthermore, quantification of Xenopus microtubule length and mass distributions, combined with egg extract spindle assembly reactions, establishes a role for intrinsic microtubule dynamics in modulating spindle length. Microtubules are also established drug targets in fungal and parasitic helminth infections and have in the past decades drawn attention as a potential drug target in the malaria parasite Plasmodium falciparum. In order to characterize P. falciparum microtubule dynamics, structure, and drug specificity, we have used an affinity chromatography-based approach to purify tubulin directly from blood-stage parasites. For the first time, dynamic P. falciparum microtubules have been reconstituted in vitro and parasite-specific suppression of microtubule dynamics by oryzalin and amiprofos methyl has been directly demonstrated. This study establishes an experimental framework to directly test for parasite-specific microtubule inhibition, microtubule structure, and interactions with MAPs that previously have not observed using existing in vitro approaches.
37
Bringmann, Martin. "Identification of novel components that connect cellulose synthases to the cytoskeleton." Phd thesis, Universität Potsdam, 2012. http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2012/6147/.
Full textAbstract:
Cellulose is the most abundant biopolymer on earth and the main load-bearing structure in plant cell walls. Cellulose microfibrils are laid down in a tight parallel array, surrounding plant cells like a corset. Orientation of microfibrils determines the direction of growth by directing turgor pressure to points of expansion (Somerville et al., 2004). Hence, cellulose deficient mutants usually show cell and organ swelling due to disturbed anisotropic cell expansion (reviewed in Endler and Persson, 2011).
How do cellulose microfibrils gain their parallel orientation? First experiments in the 1960s suggested, that cortical microtubules aid the cellulose synthases on their way around the cell (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). This was proofed in 2006 through life cell imaging (Paredez et al., 2006). However, how this guidance was facilitated, remained unknown.
Through a combinatory approach, including forward and reverse genetics together with advanced co-expression analysis, we identified pom2 as a cellulose deficient mutant. Map- based cloning revealed that the gene locus of POM2 corresponded to CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1). Intriguingly, we previously found the CSI1 protein to interact with the putative cytosolic part of the primary cellulose synthases in a yeast-two-hybrid screen (Gu et al., 2010).
Exhaustive cell biological analysis of the POM2/CSI1 protein allowed to determine its cellular function. Using spinning disc confocal microscopy, we could show that in the absence of POM2/CSI1, cellulose synthase complexes lose their microtubule-dependent trajectories in the plasma membrane. The loss of POM2/CSI1, however does not influence microtubule- dependent delivery of cellulose synthases (Bringmann et al., 2012). Consequently, POM2/CSI1 acts as a bridging protein between active cellulose synthases and cortical microtubules.
This thesis summarizes three publications of the author, regarding the identification of proteins that connect cellulose synthases to the cytoskeleton. This involves the development of bioinformatics tools allowing candidate gene prediction through co-expression studies (Mutwil et al., 2009), identification of candidate genes through interaction studies (Gu et al., 2010), and determination of the cellular function of the candidate gene (Bringmann et al., 2012).Zellulose ist das abundanteste Biopolymer der Erde und verleiht pflanzlichen Zellwänden ihre enorme Tragkraft. Mit der Reißfestigkeit von Stahl umwickeln Zellulosefibrillen pflanzliche Zellwände wie ein Korsett. Die Orientierung der Zellulosefibrillen bestimmt zugleich die Wachstumsrichtung, indem sie den Zellinnendruck (Turgor) in die entsprechende Ausdehnungsrichtung dirigiert (Somerville et al.,2004).Folglich zeigen Mutanten mit gestörter Zellulosesynthese oft geschwollene Organe und Zellen, die sich nicht mehr gerichtet ausdehnen können (zusammengefasst von Endler und Persson,2011). Wie aber erhalten die Zellulosefibrillen ihre parallele Orientierung? Erste Experimente aus den1960ern führten zur Vermutung, kortikale Mikrotubuli leiten die Zellulosesynthasen auf ringförmigen Bahnen um die Zellen herum (Green, 1962; Ledbetter and Porter, 1963). Diese Theorie wurde 2006 mit Hilfe moderner mikroskopischer Methoden bestätigt (Paredez et al., 2006). Wie jedoch dieser Leitmechanismus funktioniert, blieb bisher unentdeckt. Durch die Kombination verschiedener genetischer und bioinformatischer Methoden, konnten wir pom2 als Zellulose defiziente Mutante identifizieren. Die Ermittlung des Genlocus durch Map-based cloning zeigte, dass es sich bei POM2 um CELLULOSE SYNTHASE INTERACTING 1 (CSI1) handelt, ein Gen, dessen korrespondierendes Protein, wie vorher von uns gezeigt, mit dem zytosolischen Teil der primären Zellulosesynthasen interagiert (Gu et al., 2010). Durch ausführliche zellbiologische Charakterisierung von POM2/CSI1 konnten wir seine zelluläre Funktion entschlüsseln. Mit Hilfe konfokaler Spinning- Disc-Mikroskopie konnten wir zeigen, dass in Abwesenheit von POM2/CSI1, Zellulosesynthasen von den Mikrotubuli- Bahnen abweichen. Der ebenfalls von den Mikrotubuli abhängige Transport der Zellulosesynthasen zur Zellmembran hingegen, war nicht beeinflusst (Bringmann et al., 2012). Demzufolge ist POM2/CSI1 das gesuchte Bindeglied zwischen aktiven Zellulosesynthasen und Mikrotubuli. In dieser Dissertationsschrift werden drei Publikationen des Autors zusammengefasst, die wa ̈hrend der Arbeit an der Dissertiation entstanden sind. Sie beinhalten die Entwicklung bioinformatischer Methoden zur Ko- Expressionsanalyse, um Kandidatengene zu ermitteln (Mutwil et al., 2009), die Identifikaton des Kandidatengens POM2/CSI1 in einer Interaktionsstudie (Gu et al., 2010), sowie die Bestimmung der zellula ̈ren Funktion des korrespondieren- den Proteins POM2/CSI1 (Bringmann et al., 2012).
38
Korten, Till. "How Kinesin-1 Deals With Roadblocks: Biophysical Description and Nanotechnological Application." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2010. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-26443.
Full textAbstract:
Proteins have been optimized by evolution for billions of years to work on a nanometer scale. Therefore, they are extremely promising for nanotechnological applications. Cytoskeletal filaments propelled by surface-attached motor proteins have been recently established as versatile transport platforms for nano-sized cargo in molecular sorting and nano-assembly devices. However, in this gliding motility setup, cargo and motors share the filament lattice as a common substrate for their activity. Therefore, it is important to understand the influence of cargo-loading on transport properties.
By performing single molecule stepping assays on biotinylated microtubules, it was shown that kinesin-1 motors first stop and then detach when they encounter a streptavidin obstacle on their path along the microtubule. Consequently, the deceleration of streptavidin coated microtubules in gliding assays could be attributed to an obstruction of kinesin-1's path on the microtubule rather than to "frictional" streptavidin-surface interactions.
The insights gained by studying kinesin-1's behavior at obstacles were then used to demonstrate a novel sensing application: Using a mixture of two distinct microtubule populations that each bind a different kind of protein, the presence of these proteins was detected via speed changes in the respective microtubule populations. In future applications, this detection scheme could be combined with other recent advancements in the field, creating highly integrated lab-on-a-chip devices that use microtubule based transport to detect, sort and concentrate analytes.
It has been envisioned that the kinesin-1-microtubule system could be used for even more complex appliances like nano-assembly lines. However, currently available control mechanisms for kinesin-1 based transport are not precise enough. Therefore, improved temporal control mechanisms for kinesin-1 were investigated: Using a polymer that changes its size in solution with temperature, starting and stopping of gliding microtubules was demonstrated. In combination with local heating by light, this effect could be used to control the gliding of single microtubules. Finally, a strategy to create photo-switchable kinesin-1 was developed and tested for feasibility using molecular modeling.
39
Jannasch, Anita. "High performance photonic probes and applications of optical tweezers to molecular motors." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2017. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-103696.
Full textAbstract:
Optical tweezers are a sensitive position and force transducer widely employed in physics and biology. In a focussed laser, forces due to radiation pressure enable to trap and manipulate small dielectric particles used as probes for various experiments. For sensitive biophysical measurements, microspheres are often used as a handle for the molecule of interest. The force range of optical traps well covers the piconewton forces generated by individual biomolecules such as kinesin molecular motors. However, cellular processes are often driven by ensembles of molecular machines generating forces exceeding a nanonewton and thus the capabilities of optical tweezers. In this thesis I focused, fifirst, on extending the force range of optical tweezers by improving the trapping e fficiency of the probes and, second, on applying the optical tweezers technology to understand the mechanics of molecular motors. I designed and fabricated photonically-structured probes: Anti-reflection-coated, high-refractive-index, core-shell particles composed of titania. With these probes, I significantly increased the maximum optical force beyond a nanonewton. These particles open up new research possibilities in both biology and physics, for example, to measure hydrodynamic resonances associated with the colored nature of the noise of Brownian motion. With respect to biophysical applications, I used the optical tweezers to study the mechanics of single kinesin-8. Kinesin-8 has been shown to be a very processive, plus-end directed microtubule depolymerase. The underlying mechanism for the high processivity and how stepping is affected by force is unclear. Therefore, I tracked the motion of yeast (Kip3) and human (Kif18A) kinesin-8s with high precision under varying loads. We found that kinesin-8 is a low-force motor protein, which stalled at loads of only 1 pN. In addition, we discovered a force-induced stick-slip motion, which may be an adaptation for the high processivity. Further improvement in optical tweezers probes and the instrument will broaden the scope of feasible optical trapping experiments in the future.
40
Trushko, Anastasiya. "Interaction of XMAP215 with a Microtubule Plus-end Studied with Optical Tweezers." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2012. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-90014.
Full textAbstract:
Microtubules are a part of the cell cytoskeleton that performs different functions, such as providing the mechanical support for the shape of a cell, acting as tracks along which the motor protein move organelles from one part of the cell to another, or the forming mitotic spindle during the cell division. The microtubules are dynamic structures, namely they can grow and shrink. The phase of microtubule growth alternates with the phase of shrinkage that results in the dynamic microtubule network in the cell. However, to form stable and spatially well-defined structures, such as a mitotic spindle, the cell needs to control this stochastic process. This is done by microtubule-associated proteins (MAPs). One class of MAPs is the proteins of XMAP216/Dis1 family, which are microtubule polymerases. The founding member of this family is X. laevis XMAP215.
XMAP215 is a processive polymerase acting on the microtubule plus end. XMAP215 binds either directly or reaches the microtubule plus end by the diffusion along the microtubule lattice. Being at the microtubule plus-end XMAP215 stays there transiently and helps to incorporate up to 25 tubulin dimers into microtubule lattice before it dissociates and, therefore, it processively tracks the growing microtubule end during polymerization. There are two hypothesis of microtubule assembly promotion: (i) XMAP215 repeatedly releases an associated tubulin dimer into the microtubule growing plus end or (ii) structurally stabilizes a polymerized tubulin intermediate at the growing plus end and, therefore, preventing depolymerization events. The first way results into the increase of on-rate of tubulin dimers at the microtubule end, whereas the second way results into the decrease of off-rate of tubulin dimers at the microtubule end.
Here, I show the study of the mechanism of microtubule growth acceleration by XMAP215 and the dependence of XMAP215 polymerization activity on the applied force. To answer these questions, I investigated the addition of tubulin dimers to the plus end of the microtubule by XMAP215 and how this addition depends on the applied force. XMAP215 remains at the microtubule end for several rounds of tubulin addition surfing both growing and shrinking microtubule ends. Therefore, if one could track the position of the XMAP215 molecules at the very tip of a microtubule with sufficient resolution, it would provide the information about the dynamics of the microtubule end. The technique, which can detect the position of the object of interest with high spatial and temporal resolution in addition to being able to exert a force, is an optical trap. A calibrated optical trap not only provides a good measure of displacement but also enables force measurements. To monitor the position of the molecules of interest, the molecules of interest are usually attached to a microsphere. Hence, I tethered XMAP215 to a microsphere held by an optical trap, and used XMAP215 as a handle to interact with the microtubule tip. When the microtubule grows, the XMAP215 coated microsphere will move in the optical trap and this movement can be detected with high temporal and spatial resolution.
My work demonstrates that cooperatively working XMAP215 molecules can not only polymerize microtubule but also harness the energy of microtubule polymerization or depolymerization to transport some cargo. There is an evidence that orthologues of XMAP215 in budding yeasts, fission yeasts and Drosophila localize on the kinetochores. Therefore, the ability of the bearing some load during microtubule polymerization could be potentially important for the XMAP215 functioning during cell division.
I also showed the influence of external force applied to the XMAP215 molecules. Pointing toward microtubule growth, a force of 0.5 pN applied to the microtubule tip-coupled XMAP215-coated microsphere increases XMAP215 polymerization activity. However, the force of the same magnitude but applied against microtubule growth does not affect XMAP215 polymerization activity. This result can be explained by the fact, that the force acting in the direction of microtubule growth constrains XMAP215 to be at the very microtubule tip. Hence, XMAP215 can not diffuse away from plus-end and there is higher chance to incorporate tubulin dimers into the microtubule plus-end. The on- and off-rate of tubulin dimers at the microtubule end are both decreased when the external force applied either in direction of microtubule growth or opposite to it. The external force affects the off-rate slightly stronger than on-rate of tubulin dimer. Taking together, my study gives new insights into the mechanism of microtubule polymerization by XMAP215 and shows some novel properties of this protein.
41
Nitzsche, Bert. "Optical 3D-Nanometry to Study the Function of Biomolecular Motors in Nanotransport." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2009. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-24802.
Full textAbstract:
A major challenge in nanotechnology is the controlled transport of cargo on the nanometer scale. A promising approach to this problem is the use of molecular motors of the cellular cytoskeleton. The aim of this work was to develop a method to characterize the behavior of filamentous nanoshuttles – specifically of motor protein-driven microtubules – in three dimensions (3-D). The main requirements to meet were low impact on the nanotransport system, high spatial and temporal resolution, and versatility. Furthermore, this method was intended to be used to address open questions in the field of nanotransport. In particular, it was firstly attempted to characterize cargo transport in a system currently favored by most studies in the field, where nanoshuttles are powered by the microtubule motor best understood so far – the plus-end-directed kinesin-1. Secondly, the goal was to further the understanding of potential counter-players of kinesin-1 in nanotransport applications - the much less well understood microtubule minus-end-directed motor proteins 22S dynein and the kinesin-14 non-claret disjunctional (ncd). A novel method to study the linear forward motion as well as the axial motion of filamentous nanoshuttles, which are driven by motors of the cell cytoskeleton, has been introduced. The method uses fluorescence interference-based 3-D nanometer tracking of quantum dots as optical probes that are attached to the nanoshuttles. While other recently reported 3-D tracking techniques based on dual-focus imaging offer similar sensitivity, the method here can be easily performed on any standard epi-fluorescence microscope, even with arc lamp illumination, and additionally holds the potential to retrieve absolute height values. It is strongly suggested that the ease of use might help to spread this valuable and versatile tool for a variety of applications, including studies of interactions between single molecules or even intramolecular changes. Specifically, 3-D tracking has been used to visualize and analyze the rotation of microtubules around their longitudinal axis when they are propelled on a motor protein-coated surface. This geometry called gliding assay is currently favored for most proof-of-principle studies that investigate the use of biomolecular motors for transport of nanoscale cargo with the goal to assemble and manipulate nanostructures. The suitability of the method has been proven for kinesin-1 gliding assays, where knowledge of properties of both, microtubules and kinesin-1, allowed a very precise prediction of microtubule rotation, which was matching the actual measured values very well. The microtubule rotation in kinesin-1 gliding assays has turned out to be robust against the attachment of small cargo in the shape of quantum dots (diameter ∼20 nm), but also against the reduction of electrostatic interactions between microtubules and kinesin-1 by cleavage of the tubulin E-hook. The situation was dramatically different when large cargo (beads with diameter of ∼3 µm) was attached to microtubules. In this case, filament rotation was stopped, but otherwise the impact on motility was surprisingly low. In particular, the velocity of the gliding microtubules only decreased to a negligible degree. This shows that in principle microtubules driven by processive motors like kinesin-1 can make flexible, responsive and effective molecular shuttles for nanotransport applications. In addition, the results might indicate that in vivo kinesin-1 molecules, which transport cargo along microtubules, can likewise flexibly respond to an axial force by deviating from their path parallel to the protofilament axes. Two microtubule minus-end-directed motors that might be employed to counteract kinesin-1 in engineered nanotransport systems are dynein and ncd. Both motors have been found to be capable of generating torque causing short-pitched microtubule rotation in gliding motility assays. The results for 22S dynein helped to resolve controversial findings of earlier reports about the ability of 22S dynein to generate torque. However, it turned out difficult to establish conditions where the movement of the dynein-driven nanoshuttles was homogeneous and reproducible. In contrast, motility in ncd gliding assays looks much more promising. The obtained results supported previous reports of torque generation by ncd. Moreover, a strong dependence of rotational pitches of gliding microtubules on ATP concentration was found. The reason could be that ncd motors in the nucleotide-free microtubule-bound state impede the forward movement of gliding microtubules stronger than the axial motion. To fully understand the nature of this effect, further research is required. Most likely, this will substantially contribute to the understanding of ncd function in vivo. Furthermore, the possibility of tuning the rotation of microtubules acting as nanoshuttles might provide a means to increase control of processes like cargo-loading and unloadingEine große Herausforderung auf dem Gebiet der Nanotechnologie ist der kontrollierte und präzise Transport von nanoskaligen Objekten. Der Einsatz von molekularen Motoren des zellulären Zytoskeletts hat sich dabei als vielversprechender Ansatz erwiesen. Ziel der hier vorgelegten Arbeit war die Entwicklung einer Methode, um das Verhalten von filamentartigen Nanotransportern - speziell von Mikrotubuli, die durch Motorproteine über Oberflächen bewegt werden - in drei Dimensionen (3-D) zu charakterisieren. Die Hauptkriterien waren dabei eine geringe Störung des zu untersuchenden Systems, hohe räumliche und zeitliche Auflösungen sowie die generelle Anwendbarkeit für Einzelmolekülstudien. Ein weiteres Ziel war es, die entwickelte Methode zur Beantwortung offener Fragen bezüglich des Nanotransports mittels Zytoskelett-basierter Motoren einzusetzen. Insbesondere sollte das System aus Mikrotubuli und dem Motorprotein Kinesin-1, welches für die meisten aktuellen Studien zum Thema Nanotransport herangezogen wird, untersucht werden. Schließlich sollten neue Erkenntnisse über weniger gut erforschte Motorproteine, speziell über 22S Dynein und das Kinesin-14 „Non-claret disjunctional“ (Ncd), gewonnen werden. Beide Motoren könnten in Nanotransportsystemen als Gegenspieler von Kinesin-1 agieren. In der vorliegenden Arbeit wird eine neuartige, auf Fluoreszenz-Interferenz basierende 3-D Nanometertrackingmethode beschrieben. Auf deren Grundlage wird es möglich, die Bewegung von einzelnen fluoreszenten Partikeln nahe einer reflektierenden Oberfläche mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich zu verfolgen. Im Vergleich zu anderen kürzlich vorgestellten 3-D Techniken, welche auf bifokaler optischer Mikroskopie basieren und ähnliche Genauigkeiten zulassen, ist die hier vorgestellte Methode mit deutlich geringerem Aufwand auf der Basis eines herkömmlichen Epi-Fluoreszenzmikroskops umsetzbar. Dabei kann die Fluoreszenzanregung wahlweise mit einer Bogenlampe oder einem Laser erfolgen. Weiterhin besteht die Möglichkeit, nicht nur Differenzwerte (wie bei bifokaler Mikroskopie), sondern absolute Werte in der Höhendimension zu messen. Im Ergebnis wurde ein mit geringem Aufwand umsetzbares, gleichwohl hochgradig genaues und vielseitig einsetzbares Werkzeug geschaffen, welches ideal für Studien der Interaktionen von Einzelmolekülen oder auch intramolekularer Dynamik geeignet ist. Mit Hilfe der hier vorgestellten 3-D Trackingmethode wurden die Rotationen von Mikrotubuli um ihre Längsachse während des Gleitens auf mit Motorproteinen besetzten Oberflächen analysiert. Diese Geometrie wird derzeit bevorzugt in Studien eingesetzt, welche den Einsatz von biomolekularen Motoren für den Transport von nanoskaligen Objekten untersuchen und das Ziel verfolgen, Nanostrukturen zu erzeugen und zu manipulieren. Die Ergebnisse zu Rotationen von Mikrotubuli, welche über mit Kinesin-1 besetzte Oberflächen bewegt werden, sind konsistent mit (i) der Eigenschaft von Kinesin-1 sich entlang der Protofilamente von Mikrotubuli zu bewegen und (ii) der Superhelixstruktur von in vitro rekonstituierten Mikrotubuli. Dies belegt die Eignung der Methode für die Charakterisierung von Nanotransportsystemen. Die Rotation von Mikrotubuli, welche durch Kinesin-1 angetrieben werden, hat sich sowohl beim Transport von kleinen Objekten in Form von Quantum Dots (Durchmesser ca. 20 nm) als auch bei der Reduktion elektrostatischer Wechselwirkungen zwischen Kinesin-1 und Mikrotubuli durch Verdau der Tubulin-C-Termini als stabil erwiesen. Ein vollkommen anderes Bild ergab sich für den Transport von großen Objekten (Durchmesser ca. 3 µm). In diesem Fall wurde die Rotation der Filamente angehalten. Unerwarteterweise war jedoch die Vorwärtsbewegung der Mikrotubuli und insbesondere deren Geschwindigkeit kaum betroffen. Dies zeigt, daß Mikrotubuli, welche von prozessiven Motoren wie Kinesin-1 angetrieben werden, das Potential zu responsiven, flexiblen und effektiven molekularen Shuttles besitzen. Außerdem weisen die Ergebnisse darauf hin, daß Kinesin-1-Moleküle, welche in vivo Frachten entlang von Mikrotubuli transportieren, auf seitwärts gerichtete Kräfte reagieren können, indem sie von ihrem intrinsisch vorgegebenen Pfad parallel zur Protofilamentachse des Mikrotubulus abweichen. Zwei Motoren, die sich im Gegensatz zu Kinesin-1 in Richtung des Minus-Endes von Mikrotubuli bewegen, sind 22S Dynein und Ncd. Sie sind somit als Gegenspieler von Kinesin-1 in Nanotransportsystemen prädestiniert. Beide Motoren können, ebenso wie Kinesin-1, die Translokation von Mikrotubuli über Oberflächen sowie damit verbundene Rotationen von Mikrotubuli verursachen. Im Gegensatz zu Kinesin-1 tritt die Rotation unabhängig von einer Superhelixstruktur der Mikrotubuli auf. Die Ergebnisse für 22S Dynein lösen Widersprüche zwischen früheren Studien auf, indem sie belegen, daß dieser Motor Rotationen von Mikrotubuli erzeugen kann. Jedoch scheint es unter Verwendung von 22S Dynein nicht möglich zu sein, Bedingungen zu schaffen, unter welchen sich Mikrotubuli in geeigneter Weise als Nanoshuttles homogen und reproduzierbar bewegen. Der Einsatz von Ncd ist hier deutlich erfolgversprechender. Die in diesem Falle erlangten Erkenntnisse bezüglich der Erzeugung von Rotationen von Mikrotubuli decken sich mit früheren Studien. Ein bislang unbekannter, bemerkenswerter Effekt ist dabei ein Rückgang in der Länge der Rotationsperioden mit sinkender ATP-Konzentration. Die mit dem heutigen Wissensstand über den mechanochemischen Zyklus von Ncd konsistente Erklärung ist, daß Ncd-Motoren im nukleotidfrei an Mikrotubuli gebundenen Zustand die Vorwärtskomponente der Bewegung von gleitenden Mikrotubuli stärker hemmen als die Rotationskomponente. Möglicherweise kann die sich hieraus ergebende Möglichkeit der Regulierung der Rotation von Mikrotubuli dazu eingesetzt werden, das Be- und Entladen von Nanoshuttles zu steuern
42
Mühle, Hans-Werner. "Das Zytoskelett der Endothelzelle." Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, Medizinische Fakultät - Universitätsklinikum Charité, 2004. http://dx.doi.org/10.18452/14986.
Full textAbstract:
F-Aktin spielt eine wichtige Rolle bei der Steuerung der endothelialen Barrierefunktion. In dieser Arbeit verwendeten wir Colchicin, Vinca-Alkaloide (Vinblastin, Vincristin) und Paclitaxel um Mikrotubulussysteme (MT) auszulenken und den Effekt auf die Permeabilität zu untersuchen. Endothelzellen wurden auf Polycarbonatfiltermembranen gepflanzt und einem kontinuierlichen hydrostatischen Druck von 10 cm H2O ausgesetzt. Die Exposition von Endothelzell-Monolayern gegenüber Colchicin und Vinca-Alkaloiden führte innerhalb von 60 100 Minuten zeit- und dosisabhängig zu einem fünf zehnfachen Anstieg der hydraulischen Konduktivität. Dagegen war nach MT-Stabilisation durch Paclitaxel keine Permeabilitätszunahme festzustellen. Doppelimmunfluoreszenz-Mikroskopie zeigte, dass die MT-Depolymerisation durch Colchicin und Vinca Alkaloide zu F-Aktin-Umverteilung, Stressfaserbildung und Zellretraktionen mit ausgeprägter parazellulärer Lücken-Bildung führt. Diese Phänomene wurden durch Kombinationen von Vinblastin und Paclitaxel deutlich abgeschwächt. Die fluorometrische Messung des intrazellulären F-Aktins nach MT-Depolymerisation durch Vinblastin resultierte in einer signifikanten Zunahme der Aktinfilamente. Auf der anderen Seite resultierte F-Aktin Abbau durch Cytochalasin D und Clostridium difficile (TcdB-10463) morphologisch nicht in einer Veränderung von MT-Strukturen. Dabei zeigten in Interzellularbrücken gelegene MT-Filamente Kolokalisation mit F-Aktin Fragmenten. Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass MT-Systeme an der Regulation der endothelialen Barriere beteiligt sind. Darüber hinaus verdeutlichen die Resultate eine enge Bindung von MT- und Aktin-Filamenten innerhalb endothelzellulärer Adhäsionskontakte.The endothelian cytosceleton plays an important role in the regulation of endothelial permeability via cellular actin filaments. We tested the effect of agents known to perturb cellular microtubules on the permeability of endothelial cell monolayers. The agents chosen were colchicine, the vinca alkaloids vinblastine and vincristine and paclitaxel. Cell monolayers were prepared on polycarbonate filter membranes and exposed to a continuous hydrostatic pressure of 10 cm H2O. Colchicine and the vinca alkaloids caused a five to tenfold increase in the hydraulic conductivity of the monolayers within 60 100 min. The effect was dose and time dependent. The microtubule stabilizer paclitaxel caused no increase in permeability. Double-immunofluorescence microscopy showed that microtubule depolymerisation was associated with certain morphological features such as inter-endothelial gaps, cell retraction, f-actin reorganisation and some stressfibre appearance. These phenomena were significantly reduced when vinblastine and paclitaxel were combined. Measurement of intracellular f-actin following microtubule inhibition with vinblastine showed a significant increase in endothelial actin filaments. No changes in microtubule structures were seen when actin filaments were perturbed with cytochalasin D and Clostridium difficile (TcdB-10463). However, in this case the intercellular bridges showed that microtubules were co-localised with fragments of actin filaments from neighbouring cells. Our data demonstrate that microtubules are important for the regulation of endothelial permeability. Moreover, our results support evidens of binding between microtubules and actin filaments within endothelial cell adhesion contacts.
43
Korten, Till. "How Kinesin-1 Deals With Roadblocks: Biophysical Description and Nanotechnological Application." Doctoral thesis, Max-Planck-Institut für Molekulare Zellbiologie und Genetik, 2009. https://tud.qucosa.de/id/qucosa%3A25213.
Full textAbstract:
Proteins have been optimized by evolution for billions of years to work on a nanometer scale. Therefore, they are extremely promising for nanotechnological applications. Cytoskeletal filaments propelled by surface-attached motor proteins have been recently established as versatile transport platforms for nano-sized cargo in molecular sorting and nano-assembly devices. However, in this gliding motility setup, cargo and motors share the filament lattice as a common substrate for their activity. Therefore, it is important to understand the influence of cargo-loading on transport properties.
By performing single molecule stepping assays on biotinylated microtubules, it was shown that kinesin-1 motors first stop and then detach when they encounter a streptavidin obstacle on their path along the microtubule. Consequently, the deceleration of streptavidin coated microtubules in gliding assays could be attributed to an obstruction of kinesin-1's path on the microtubule rather than to "frictional" streptavidin-surface interactions.
The insights gained by studying kinesin-1's behavior at obstacles were then used to demonstrate a novel sensing application: Using a mixture of two distinct microtubule populations that each bind a different kind of protein, the presence of these proteins was detected via speed changes in the respective microtubule populations. In future applications, this detection scheme could be combined with other recent advancements in the field, creating highly integrated lab-on-a-chip devices that use microtubule based transport to detect, sort and concentrate analytes.
It has been envisioned that the kinesin-1-microtubule system could be used for even more complex appliances like nano-assembly lines. However, currently available control mechanisms for kinesin-1 based transport are not precise enough. Therefore, improved temporal control mechanisms for kinesin-1 were investigated: Using a polymer that changes its size in solution with temperature, starting and stopping of gliding microtubules was demonstrated. In combination with local heating by light, this effect could be used to control the gliding of single microtubules. Finally, a strategy to create photo-switchable kinesin-1 was developed and tested for feasibility using molecular modeling.
44
Reuther, Cordula, Matthäus Mittasch, Sundar R. Naganathan, Stephan Grill, and Stefan Diez. "Highly-Efficient Guiding of Motile Microtubules on Non-Topographical Motor Patterns." ACS Publ, 2018. https://tud.qucosa.de/id/qucosa%3A30616.
Full textAbstract:
Molecular motors, highly-efficient biological nano-machines, hold the potential to be employed for a wide range of nanotechnological applications. Towards this end, kinesin, dynein or myosin motor proteins are commonly surface-immobilized within engineered environments in order to transport cargo attached to cytoskeletal filaments. Being able to flexibly control the direction of filament motion – in particular on planar, non-topographical surfaces – has, however, remained challenging. Here, we demonstrate the applicability of a UV-laser-based ablation technique to programmably generate highly-localized patterns of functional kinesin-1 motors with different shapes and sizes on PLL-g-PEG-coated polystyrene surfaces. Straight and curved motor tracks with widths of less than 500 nm could be generated in a highly-reproducible manner and proved to reliably guide gliding microtubules. Though dependent on track curvature, the characteristic travel lengths of the microtubules on the tracks significantly exceeded earlier predictions. Moreover, we experimentally verified the performance of complex kinesin-1 patterns, recently designed by evolutionary algorithms, for controlling the global directionality of microtubule motion on large-area substrates.
45
Hamati, Jida. "MuRF3 binds to the retromer subunit SNX5 inhibiting its MuRF2-mediated degradation and leading to its stabilization." Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, Lebenswissenschaftliche Fakultät, 2016. http://dx.doi.org/10.18452/17621.
Full textAbstract:
Die muskelspezifischen RING-Finger Ubiquitin E3 Ligasen MuRF1, MuRF2 und MuRF3 werden mit verschiedenen zellulären Prozessen in Verbindung gebracht. MuRF1 und MuRF3 beteiligen sich am Abbau mehrerer Muskelstrukturproteine über das Ubiquitin Proteasom System (UPS) und spielen somit eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Skelett- und Herzmuskelstruktur und -funktion. MuRF1 wurde als Atrophie-Marker identifiziert, da seine Expression während der Muskelatrophie ansteigt, und MuRF2 und MuRF3 wirken bei der Stabilisierung von Mikrotubuli und Differenzierung von Myozyten mit. Dennoch sind bisher viele Aspekte der Funktion von MuRF-Proteinen ungeklärt. Die Domänenstruktur der MuRF-Proteine zeigt mehrere hochkonservierte Domänen, die sich an Protein-Protein Interaktionen beteiligen. Die Identifizierung und Charakterisierung ihres Interaktoms ermöglicht ein besseres Verständnis ihrer Funktionen. Aus diesem Grund wurden quantitative massenspektrometrische Analysen durchgeführt, um neue Interaktionspartner und Substrate für MuRF1, 2 und 3 zu identifizieren. Sorting nexin 5 (SNX5), eine Untereinheit des Retromers in Säugetieren, wurde als Interaktionspartner von MuRF3 identifiziert. SNX5, das eine wichtige Rolle in subzellulären Transport-Signalwegen spielt, interagierte über seine BAR-Domäne mit MuRF3. SNX5 und MuRF3 co-lokalisierten und assoziierten mit vesikulären Strukturen des subzellulären Transport-Signalweges. SNX5 wurde außerdem als Substrat von MuRF2 identifiziert. MuRF2 band und ubiquitinierte SNX5 in vivo und vermittelte damit dessen Abbau über das UPS. MuRF3 stabilisierte SNX5 durch die Inhibierung dieses Abbaus. Somit konnten MuRF2 und MuRF3 mit einem in subzellulärem Transport aktiven Protein in Verbindung gebracht werden, das direkt mit Mikrotubuli assoziiert und funktionell von einem stabilen Mikrotubuli-Netzwerk abhängig ist. Dies legt eine mögliche regulatorische Rolle von MuRF2 und MuRF3 in Mikrotubuli-abhängigen subzellulären Transportwegen nahe.Muscle specific RING-Finger ubiquitin E3 ligases MuRF1, MuRF2 and MuRF3 have been implicated in several cellular functions. MuRF1 and MuRF3 have been shown to bind and degrade muscle contractile and structural proteins via the ubiquitin proteasome system (UPS), thus playing an important role in the maintenance of skeletal and cardiac muscle structure and function. MuRF1 is considered an atrophy marker since its expression increases during muscle atrophy. MuRF2 and MuRF3 are involved in myocyte differentiation and both bind to and stabilize microtubules. Nevertheless, many aspects of the functions of the MuRF-family are unknown. The domain structure of the MuRF family implicates several highly conserved domains involved in protein-protein interaction. Accordingly, one way to better understand the role of MuRF proteins in myocyte function and protein homeostasis is to identify and characterize their interactome. Therefore, quantitative mass spectrometric analysis was used to identify novel interaction partners and target proteins of MuRF1, 2 and 3. Sorting nexin 5 (SNX5), a mammalian retromer subunit which plays an important role in subcellular trafficking pathways, was identified as a novel interaction partner of MuRF3, with which it interacted via its Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR)-domain. SNX5 and MuRF3 co-localized and associated with early endosomes, connecting the microtubule-binding MuRF3 to structures of subcellular trafficking pathway. SNX5 was also identified as a substrate of MuRF2, which interacted with and ubiquitinated SNX5 in vivo, mediating its degradation in a UPS-dependent manner. This MuRF2-mediated degradation was inhibited by MuRF3, which stabilized SNX5. Thus, MuRF2 and MuRF3 were linked to a subcellular trafficking protein, SNX5, which is directly associated with microtubules and functionally dependent on a stable microtubule network, suggesting a possible regulatory role of MuRF2 and MuRF3 in microtubule-dependent subcellular trafficking pathways.
46
Redemann, Stefanie, Jacques Pecreaux, Nathan W. Goehring, Khaled Khairy, Ernst H. K. Stelzer, Anthony A. Hyman, and Jonathon Howard. "Membrane Invaginations Reveal Cortical Sites that Pull on Mitotic Spindles in One-Cell C. elegans Embryos." Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2015. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-185631.
Full textAbstract:
Asymmetric positioning of the mitotic spindle in C. elegans embryos is mediated by force-generating complexes that are anchored at the plasma membrane and that pull on microtubules growing out from the spindle poles. Although asymmetric distribution of the force generators is thought to underlie asymmetric positioning of the spindle, the number and location of the force generators has not been well defined. In particular, it has not been possible to visualize individual force generating events at the cortex. We discovered that perturbation of the acto-myosin cortex leads to the formation of long membrane invaginations that are pulled from the plasma membrane toward the spindle poles. Several lines of evidence show that the invaginations, which also occur in unperturbed embryos though at lower frequency, are pulled by the same force generators responsible for spindle positioning. Thus, the invaginations serve as a tool to localize the sites of force generation at the cortex and allow us to estimate a lower limit on the number of cortical force generators within the cell.
47
Redemann, Stefanie, Jacques Pecreaux, Nathan W. Goehring, Khaled Khairy, Ernst H. K. Stelzer, Anthony A. Hyman, and Jonathon Howard. "Membrane Invaginations Reveal Cortical Sites that Pull on Mitotic Spindles in One-Cell C. elegans Embryos." PloS, 2010. https://tud.qucosa.de/id/qucosa%3A29013.
Full textAbstract:
Asymmetric positioning of the mitotic spindle in C. elegans embryos is mediated by force-generating complexes that are anchored at the plasma membrane and that pull on microtubules growing out from the spindle poles. Although asymmetric distribution of the force generators is thought to underlie asymmetric positioning of the spindle, the number and location of the force generators has not been well defined. In particular, it has not been possible to visualize individual force generating events at the cortex. We discovered that perturbation of the acto-myosin cortex leads to the formation of long membrane invaginations that are pulled from the plasma membrane toward the spindle poles. Several lines of evidence show that the invaginations, which also occur in unperturbed embryos though at lower frequency, are pulled by the same force generators responsible for spindle positioning. Thus, the invaginations serve as a tool to localize the sites of force generation at the cortex and allow us to estimate a lower limit on the number of cortical force generators within the cell.
48
Zumdieck, Alexander. "Dynamics of Active Filament Systems." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2006. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:swb:14-1139849910030-68242.
Full textAbstract:
Aktive Filament-Systeme, wie zum Beispiel das Zellskelett, sind Beispiele einer interessanten Klasse neuartiger Materialien, die eine wichtige Rolle in der belebten Natur spielen. Viele wichtige Prozesse in lebenden Zellen wie zum Beispiel die Zellbewegung oder Zellteilung basieren auf dem Zellskelett. Das Zellskelett besteht aus Protein-Filamenten, molekularen Motoren und einer großen Zahl weiterer Proteine, die an die Filamente binden und diese zu einem Netz verbinden können. Die Filamente selber sind semifexible Polymere, typischerweise einige Mikrometer lang und bestehen aus einigen hundert bis tausend Untereinheiten, typischerweise Mono- oder Dimeren. Die Filamente sind strukturell polar, d.h. sie haben eine definierte Richtung, ähnlich einer Ratsche. Diese Polarität begründet unterschiedliche Polymerisierungs- und Depolymerisierungs-Eigenschaften der beiden Filamentenden und legt außerdem die Bewegungsrichtung molekularer Motoren fest. Die Polymerisation von Filamenten sowie Krafterzeugung und Bewegung molekularer Motoren sind aktive Prozesse, die kontinuierlich chemische Energie benötigen. Das Zellskelett ist somit ein aktives Gel, das sich fern vom thermodynamischen Gleichgewicht befindet. In dieser Arbeit präsentieren wir Beschreibungen solcher aktiven Filament-Systeme und wenden sie auf Strukturen an, die eine ähnliche Geometrie wie zellulare Strukturen haben. Beispiele solcher zellularer Strukturen sind Spannungsfasern, kontraktile Ringe oder mitotische Spindeln. Spannungsfasern sind für die Zellbewegung essentiell; sie können kontrahieren und so die Zelle vorwärts bewegen. Die mitotische Spindel trennt Kopien der Erbsubstanz DNS vor der eigentlichen Zellteilung. Der kontraktile Ring schließlich trennt die Zelle am Ende der Zellteilung. In unserer Theorie konzentrieren wir uns auf den Einfluß der Polymerisierung und Depolymerisierung von Filamenten auf die Dynamik dieser Strukturen. Wir zeigen, dass der kontinuierliche Umschlag (d.h. fortwährende Polymerisierung und Depolymerisierung) von Filamenten unabdingbar ist für die kontraktion eines Rings mit konstanter Geschwindigkeit, so wie in Experimenten mit Hefezellen beobachtet. Mit Hilfe einer mikroskopisch motivierten Beschreibung zeigen wir, wie "filament treadmilling", also Filament Polymerisierung an einem Ende mit der gleichen Rate wie Depolymerisierung am anderen Ende, zur Spannung in Filament Bündeln und Ringen beitragen kann. Ein zentrales Ergebnis ist, dass die Depolymerisierung von Filamenten in Anwesenheit von filamentverbindenden Proteinen das Zusammenziehen dieser Bündel sogar in Abwesenheit molekulare Motoren herbeiführen kann. Ferner entwickeln wir eine generische Kontinuumsbeschreibung aktiver Filament-Systeme, die ausschließlich auf Symmetrien der Systeme beruht und von mikroskopischen Details unabhängig ist. Diese Theorie erlaubt uns eine komplementäre Sichtweise auf solche aktiven Filament-Systeme. Sie stellt ein wichtiges Werkzeug dar, um die physikalischen Mechanismen z.B. in Filamentbündeln aber auch bei der Bildung von Filamentringen im Zellkortex zu untersuchen. Schließlich entwickeln wir eine auf einem Kräftegleichgewicht basierende Beschreibung für bipolare Strukturen aktiver Filamente und wenden diese auf die mitotische Spindel an. Wir diskutieren Bedingungen für die Bildung und Stabilität von SpindelnActive filament systems such as the cell cytoskeleton represent an intriguing class of novel materials that play an important role in nature. The cytoskeleton for example provides the mechanical basis for many central processes in living cells, such as cell locomotion or cell division. It consists of protein filaments, molecular motors and a host of related proteins that can bind to and cross-link the filaments. The filaments themselves are semiflexible polymers that are typically several micrometers long and made of several hundreds to thousands of subunits. The filaments are structurally polar, i.e. they possess a directionality. This polarity causes the two distinct filament ends to exhibit different properties regarding polymerization and depolymerization and also defines the direction of movement of molecular motors. Filament polymerization as well as force generation and motion of molecular motors are active processes, that constantly use chemical energy. The cytoskeleton is thus an active gel, far from equilibrium. We present theories of such active filament systems and apply them to geometries reminiscent of structures in living cells such as stress fibers, contractile rings or mitotic spindles. Stress fibers are involved in cell locomotion and propel the cell forward, the mitotic spindle mechanically separates the duplicated sets of chromosomes prior to cell division and the contractile ring cleaves the cell during the final stages of cell division. In our theory, we focus in particular on the role of filament polymerization and depolymerization for the dynamics of these structures. Using a mean field description of active filament systems that is based on the microscopic processes of filaments and motors, we show how filament polymerization and depolymerization contribute to the tension in filament bundles and rings. We especially study filament treadmilling, an ubiquitous process in cells, in which one filament end grows at the same rate as the other one shrinks. A key result is that depolymerization of filaments in the presence of linking proteins can induce bundle contraction even in the absence of molecular motors. We extend this description and apply it to the mitotic spindle. Starting from force balance considerations we discuss conditions for spindle formation and stability. We find that motor binding to filament ends is essential for spindle formation. Furthermore we develop a generic continuum description that is based on symmetry considerations and independent of microscopic details. This theory allows us to present a complementary view on filament bundles, as well as to investigate physical mechanisms behind cell cortex dynamics and ring formation in the two dimensional geometry of a cylinder surface. Finally we present a phenomenological description for the dynamics of contractile rings that is based on the balance of forces generated by active processes in the ring with forces necessary to deform the cell. We find that filament turnover is essential for ring contraction with constant velocities such as observed in experiments with fission yeast
49
Krauß, Sybille Ellen. "Charakterisierung der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und ihrer Zielproteine." Doctoral thesis, Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät I, 2005. http://dx.doi.org/10.18452/15361.
Full textAbstract:
In der vorliegenden Arbeit sollten Ziel-Proteine der Mikrotubulus-assoziierten PP2A gefunden werden. Anhand phänotypischer Ähnlichkeiten zwischen OS- und Greig-, Acrocallosal- bzw. Pallister-Hall-Syndrom-Patienten wurde eine mögliche Interaktion zwischen dem MID1-alpha4-PP2A-Komplex und GLI3, einem zentralen Transkriptionsfaktor der SHH-Signaltransduktionskaskade, postuliert. In einer Reihe von zellbiologischen und proteinbiochemischen Experimenten konnte gezeigt werden, dass sowohl die intrazelluläre Lokalisation des GLI3 als auch der Phosphorylierungsstatus von Fu, einem Interaktionspartner von GLI3, über den MID1-alpha4-PP2A-Komplex und Mikrotubulus-assoziierter PP2A-Aktivität reguliert werden. Erhöhte Aktivität der Mikrotubulus-assoziierten PP2A führt hierbei zur Dephosphorylierung von Fu und zu einer Akkumulation des GLI3 im Cytosol, während verringerte PP2A-Aktivität zu einer Anreicherung der hyperphosphorylierten Form des Fu und zur Akkumulation des GLI3 im Nukleus führt. Darüber hinaus konnte GSK3beta als die der Mikrotubulus-assoziierten PP2A entgegenwirkende Kinase identifiziert werden. Eine verringerte Aktivität der GSK3beta führt zur Dephosphorylierung von Fu und zu einer Akkumulation des GLI3 im Cytosol. Außerdem wurde in der vorliegenden Arbeit eine Interaktion zwischen GLI3 und der hyperphosphorylierten Form des Fu beschrieben. Die Hyperphosphorylierung von Fu wird über die gegenläufigen Aktivitäten der Mikrotubulus-assoziierten PP2A und GSK3beta reguliert. Durch die Interaktion des hyperphosphorylierten Fu mit cytosolischem, nicht phosphorylierten GLI3 wird dessen Phosphorylierung gesteuert. Phosphoryliertes GLI3 reichert sich im Zellkern an und die Transkription von SHH-Zielgenen wird induziert. Die in dieser Arbeit identifizierten Mechanismen sind ein möglicher zellbiologischer Hintergrund der Übereinstimmung in den klinischen Erscheinungsbildern von OS und Syndromen, die mit Genen der SHH-Signaltransduktionskaskade assoziiert sind.Misregulation of microtubule-associated phosphatase 2A (PP2A) activity as a result of mutations in the ubiquitin ligase MID1 plays a central role in the pathogenesis of Opitz BBB/G syndrome (OS). Features typical for OS are shared by patients with mutations in GLI3 and PATCHED1 (PTC1), two members of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. These observations suggest that MID1 / PP2A may also be involved in the transduction of the SHH signal. Here we demonstrate that nuclear translocation of the transcription factor GLI3, a major effector of the SHH pathway, is regulated by the activity of the microtubule-associated pool of PP2A. This effect is reproduced pharmacologically by lithium chloride (LiCl), a potent inhibitor of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta), and correlates with the phosphorylation status of human Fused (hFu), a GLI3 interaction partner. Our data suggest an antagonistic relationship between PP2A and GSK3beta as regulators of SHH signaling and provide a molecular basis for the phenotypic overlap between patients with OS and SHH pathway mutations.
50
Schnauß, Jörg, Tina Händler, and Josef A. Käs. "Semiflexible biopolymers in bundled arrangements." Universitätsbibliothek Leipzig, 2016. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:15-qucosa-207973.
Full textAbstract:
Bundles and networks of semiflexible biopolymers are key elements in cells, lending them mechanical integrity while also enabling dynamic functions. Networks have been the subject of many studies, revealing a variety of fundamental characteristics often determined via bulk measurements. Although bundles are equally important in biological systems, they have garnered much less scientific attention since they have to be probed on the mesoscopic scale. Here, we review theoretical as well as experimental approaches, which mainly employ the naturally occurring biopolymer actin, to highlight the principles behind these structures on the single bundle level.