Academic literature on the topic 'Mitogen-activated protéine kinase'

La schistosomiase est une parasitose causée par un ver plat trématode du genre Schistosoma. Cette pathologie, responsable de près de 300 000 décès par an, est essentiellement due à la forte fécondité des vers et à l’accumulation des œufs dans les tissus de l’hôte. Pour lutter contre la pathologie, un seul traitement efficace, le Praziquantel, est utilisé en masse dans les régions endémiques. Afin de parer à l’apparition de résistances au Praziquantel, le développement de molécules régulant la ponte du parasite fait partie des solutions alternatives envisagées.Les récepteurs Venus Kinase (VKRs) forment une famille de récepteurs tyrosine kinase (RTKs) spécifique des invertébrés découverte au laboratoire chez le parasite Schistosoma mansoni. Les VKRs possèdent une structure atypique associant un domaine extracellulaire de fixation au ligand de type Venus Flytrap (VFT) associé à un domaine Tyrosine Kinase (TK) intracellulaire. Deux VKRs sont exprimés chez S. mansoni : SmVKR1 et SmVKR2. Ces deux récepteurs activent les voies de signalisation ERK, Akt et JNK et jouent un rôle dans la reproduction du parasite.Du fait de leur absence dans le génome de l’Homme, et de leur rôle potentiel dans la modulation de la reproduction et du développement des parasites, les SmVKRs constituent des cibles intéressantes pour lutter contre la schistosomiase.La première partie de mon travail de thèse expose les données acquises quant au rôle des RTKs dans la régulation de la reproduction des schistosomes. Nous avons pu montrer que la conservation des domaines catalytiques des différents RTKs ouvre la voie à l’élaboration de molécules pouvant inhiber simultanément plusieurs RTKs de schistosomes afin de lutter contre la schistosomiase en agissant sur la ponte du parasite.La seconde partie de mon travail met en évidence qu’en plus d’agir directement sur l’activité des RTKs, il est possible d’inhiber les voies qu’ils activent. En effet, un criblage d’inhibiteurs de protéines kinases a permis d’identifier les composants de la voie Akt comme cibles potentielles pour lutter contre la schistosomiase : des doses très faibles (de l’ordre du nM) de certains inhibiteurs d’Akt sont capables d’inhiber l’appariement des schistosomes et la ponte.Dans la dernière partie, nous montrons que la protéine adaptatrice SmShb interagit spécifiquement avec SmVKR1 phosphorylé. Cette interaction se fait par la liaison du domaine SH2 de SmShb sur une Tyrosine phosphorylée spécifique, située dans la région juxtamembranaire du récepteur (pY979). La formation de ce complexe induit la phosphorylation de SmShb et dirige le signal de SmVKR1 spécifiquement vers la voie JNK. Des expériences d’hybridation in situ ont mis en évidence une colocalisation des transcrits de SmShb avec ceux de Smvkr1 au niveau des organes reproducteurs des vers adultes, notamment au niveau des ovocytes matures et des testicules. Le knock-down de SmShb par ARN interférence conduit à une accumulation de spermatozoïdes dans les testicules des vers mâles. Parallèlement, un criblage par la technique du triple hybride, en utilisant SmShb phosphorylé par SmVKR1 comme appât, a permis l’identification de diverses protéines partenaires de SmShb. En raison des résultats précédents, notre attention s’est portée sur deux protéines partenaires pour lesquelles l’interaction avec SmShb a été confirmée. 1) La GTPase RhoU, qui possède des fonctions potentielles dans la signalisation JNK et sur la dynamique du cytosquelette. 2) Une chaine légère de la dynéine TcTex-1 possédant un rôle potentiel dans la motilité des spermatozoïdes. L’ensemble de ces résultats suggère un rôle de SmShb dans la régulation de l’activité de SmVKR1 en permettant la formation d’un complexe multi-protéique incluant des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette
Schistosomiasis is a parasitic disease caused by trematode flatworm species belonging to the genus Schistosoma. Responsible for about 300,000 deaths per year, the disease is mainly due to the high fertility of the worms and to encystment of eggs in host tissues. In order to fight against schistosomiasis, a single drug (Praziquantel) is efficient and massively distributed in endemic areas. To deal with the emergence of resistance to Praziquantel, one alternative is to consider the design of molecules that target parasite reproduction.Venus Kinase Receptors (VKRs) constitute an invertebrate Receptor Tyrosine Kinase (RTK) family initially discovered in the parasite Schistosoma mansoni. VKRs are atypical RTKs formed by an extracellular Venus Fly Trap (VFT) ligand binding domain associated via a transmembrane domain with an intracellular tyrosine kinase (TK) domain. Two VKRs are expressed in S. mansoni: SmVKR1 and SmVKR2. They both activate Erk, Akt and JNK signaling pathways and act on the parasite reproduction.As they are absent from the human genome and as they have potential roles in the modulation of reproductive processes and development of parasites, SmVKRs appear as attractive targets to fight schistosomiasis.The first part of my thesis work sets known data concerning the role of RTKs in schistosome reproduction. Here, we show that the catalytic domains are conserved across various RTKs and we open the perspective to design drugs which could inhibit several RTKs at the same time to control egg laying by schistosomes.The second part of my work describes the importance of using an alternative strategy of inhibiting downstream partners of RTKs. By screening a kinase inhibitor library, we defined the Akt pathway components as potential targets to fight schistosomiasis. Nanomolar doses of Akt inhibitors can inhibit schistosome pairing and egg laying.In the last part, we present the specific interaction of the adaptor protein SmShb with the phosphorylated form of SmVKR1. This binding occurs between the SH2 domain of SmShb and a phosphotyrosine residue (pY979) located in the juxtamembrane region of the receptor. That interaction leads to the phosphorylation of SmShb and promotes the signal of SmVKR1 towards a JNK pathway. In situ hybridization experiments highlighted that SmShb and Smvkr1 transcripts were both located in mature oocytes and testes of adult worms. RNA interference experiments using double-stranded RNA targeting SmShb led to an accumulation of mature sperm in testes of male worms. Finally, a yeast three hybrid screening, using SmShb phosphorylated by SmVKR1 as prey, allowed us to identify various protein partners. Taking advantage of previous results, we focused on two partners and confirmed their interaction with SmShb. 1) RhoU GTPase which has potential functions in JNK signalling and cytoskeleton dynamic. 2) The dynein light chain TcTex-1, with potential role in sperm motility. Altogether, this results argue for a potential role of SmShb in the regulation of the SmVKR1 activity by forming a multiprotein complex including proteins with various roles in cytoskeleton reorganization

Des études récentes ont souligné l'importance des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine. En permettant l'assemblage de complexes protéiques nucléaires, les ARN non codants agissent comme des échafaudages et favorisent ainsi les interactions protéine-protéine afin de réguler l'état de la chromatine. Les ARN sont également capables d’interagir avec des protéines pour en moduler leurs activités, leurs interactions ou encore leurs localisations. Cependant, le rôle potentiel des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine dans les principales voies de transduction du signal cytoplasmique reste largement inconnu. L’objectif de la thèse a consisté à rechercher et à mettre en évidence une activité de liaison directe à l’ARN de protéines impliquées dans les voies de transduction du signal cytoplasmique et d’évaluer le rôle des interactions ARN-protéines de transduction sur la signalisation intra-cellulaire. En utilisant des approches de CLIP (CrossLink et ImmunoPrécipitation) et de 2C (Complexe Capture : purification d’ARN basée sur leur affinité pour une matrice de silice), qui peuvent mettre en évidence des interactions directes entre les protéines et les ARN in vivo, nous avons démontré une interaction directe avec l’ARN de certaines protéines clés de la voie de signalisation MAPK. Des approches de microscopie telles que le PLA (Proximity Ligation Assay) nous ont permis de démontrer une modulation des interactions protéine-protéine dépendant de l'ARN dans la voie MAPK, suggérant qu'une composante ARN est impliquée dans la stabilisation de ces interactions protéine-protéine. Nous avons spécifiquement identifié un mutant de délétion BRAF, une protéine oncogène centrale et une cible thérapeutique dans le mélanome, qui montre une déficience dans son activité de liaison à l'ARN, ainsi qu’une activité de signalisation réduite. En mettant en évidence l'existence d'une modulation des interactions protéine-protéine médiée par l'ARN, cette étude démontre l'importance sans précédent de l'activité de liaison à l'ARN des principales protéines de transduction du signal qui devrait être prise en compte dans la compréhension et le ciblage des cellules tumorales
Recent studies have underscored the importance of RNAs in the regulation of protein-protein interactions. By allowing the assembly of protein complexes, non-coding RNAs act as scaffolds and thus promote protein-protein interactions in order to regulate the chromatin state. RNAs are also able to interact with proteins in order to modulate their activities, interactions or localisation. In the cytoplasm, signalling pathways are regulated through a cascade of protein-protein interactions. In the MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) signalling pathway, the binding of a ligand to a membrane receptor triggers a cascade of phosphorylation and protein-protein interactions that allow the transduction of the signal. Abnormal activity of this pathway through increased ligand binding or activating mutations lead to cellular dysfunction associated with tumor initiation and progression.The potential role of RNAs in the direct regulation of protein-protein interactions of key cytoplasmic signal transduction pathways remains largely unknown. The aim of the thesis was to investigate and demonstrate the direct RNA binding activity of proteins involved in the MAPK pathway and to evaluate the role of RNA-protein interactions on intracellular signalling.Using a combination of CLIP (crosslinking and immunoprecipitation) and silica matrix-based affinity capture (2C complex capture) approaches that can uncover direct interactions between proteins and RNAs in vivo, we demonstrated a direct interaction between key MAPK signalling proteins and RNA in melanoma cells. Subsequent microscopy studies using proximity ligation assay (PLA) led us to demonstrate an RNA-dependent modulation of protein-protein interactions in the MAPK pathway, suggesting that an RNA component is involved in the stabilization of these protein-protein interactions. We specifically identified a deletion mutant in BRAF, a central oncogenic protein and therapeutic target in melanoma, that lacks RNA binding activity and harbors decreased signalling activity.By highlighting the existence of an RNA-mediated modulation of protein-protein interactions, this study shows the unprecedented importance of the RNA binding activity of key signal transduction proteins that should be considered in the understanding and targeting of tumor cells

L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L'objectif principal de mon travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l'activation des MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l'étirement. Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D'une part, nous nous sommes intéressés aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l'activation des MAPK. D'autre part, nous avons cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de signalisation activées par l'étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes protéiques nécessaires à l'activation des différents partenaires. Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à l'activation de ERK et de JNK lors de l'étirement. Ces cascades de transduction peuvent être dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l'activation de ERK par l'étirement. Enfin, nous avons montré la formation d'un complexe Protein Kinase C (PKC)/Calcineurine nécessaire à l'activation et à la translocation de la PKC lors de l'étirement. Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire

Les cancers ovariens, se développant de façon silencieuse, diagnostiqués à des stades tardifs et de mauvais pronostiques, requièrent urgemment la mise au point de nouvelles options thérapeutiques. Ma thèse s'est attachée à caractériser les propriétés physiques et biologiques des cancers ovariens Séreux de Haut Grade (HGSOC), représentant 75% des tumeurs ovariennes.En premier lieu, nous avons démontré la valeur pronostique de la protéine MAP3K8 s'accumulant dans les HGSOC. Nous avons montré que MAP3K8 contrôle la prolifération et la migration des cellules cancéreuses via la transition G 1/S et les mécanismes d'adhésion dynamique. Aussi, nous avons mis en évidence que MAP3K8 active majoritairement la voie MEK, présentant ainsi un potentiel prédictif des inhibiteurs de MEK, les positionnant comme une stratégie thérapeutique prometteuse, en combinaison des thérapies conventionnelles, chez les HGSOC.Dans un second axe de ma thèse, nous avons montré que la rigidité augmente avec la taille tumorale, chez les HGSOC présentant une signature moléculaire « Fibrose ». Cette rigidification tumorale s'associe à une accumulation de stroma et un remodelage du réseau de collagène, mais aussi à une activation spécifique de la voie MEK. De façon intéressante, la rigidification tumorale accompagne un « switch » métabolique glycolytique, restreint au centre de la tumeur, la périphérie demeurant plus molle, et différant par une production élevée de collagène et un métabolisme OXPHOS. La rigidité pourrait donc être au carrefour de 3 processus majeurs, tels un remodelage de la matrice, l'activation de MEK et un switch métabolique stromal, expliquant, au moins en partie, la progression des HGSOC
Ovarian cancers, which develop in a silent manner in the peritoneal cavity, resulting in a late diagnosis and a poor prognosis, urgently require new therapeutic strategies. In this context, my thesis aimed at better characterize the physical and biological properties of the High Grade Serous ovarian cancers (HGSOCs), accounting for 75% of the tumours.First, we found that the protein MAP3K8 accumulates in HGSOC and is a potential prognostic marker for these tumours. We demonstrated that MAP3K8 controls cancer cell proliferation and migration by regulating key players in Gl/S transition and adhesion dynamics. Importantly, we highlighted that MAP3K8 function is mainly mediated by the MEK pathway, and exhibits a predictive potential for MEK inhibitors, defining them as a promising therapeutic option, in combination with conventional therapy, for HGSOC patients.In a second part of my thesis, we showed that tumor stiffness is increased during tumor growth in HGSOC presenting a "Fibrosis" molecular signature. Moreover, tumor stiffening is associated with high stromal content and remodeling of the collagen network. Interestingly, the MEK kinase was specifically activated upon tumor stiffening. Furthermore, tumor stiffness accompanies a glycolytic metabolic switch, restricted to the central part of stiff tumors. Indeed, the periphery of stiff tumors remains softer than the central part with stromal cells secreting high levels of collagens and showing an OXPHOS metabolism. Thus, tumor stiffness could be at the crossroad of three major processes, i.e. matrix remodeling, MEK activation and stromal metabolic switch, that might explain, at least in part, the progression of HGSOC

Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (RVFV) est un arbovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae et au genre Phlebovirus. Il est transmis par les moustiques et infecte l'homme et les ruminants. De graves épidémies/épizooties ont eu lieu en Afrique et le virus circule maintenant en Arabie Saoudite ainsi qu'au Yémen. Le génome viral est composé de trois segments d'ARN simple brin: les segments L. M sont de polarité négative et le segment S utilise une stratégie ambisens. Bien que le cycle viral ait heu dans le cytoplasme, la protéine NSs (256 acides aminés, 31 kDa), codée par le segment S, a une localisation nucléaire où elle forme des filaments. NSs est un facteur de pathogenèse du virus qui inhibe la synthèse des ARNm du gène codant pour l'IFN bêta sans perturber pour autant l'enhanceosome (NF-KB, IRF3 et ATF2/cjun). Pour comprendre les mécanismes par lesquels NSs inhibe la réponse anti-virale, nous avons recherché ses partenaires cellulaires. Nous avons montré que l'infection par le VFVR a pour conséquences : i) une rapide diminution de la synthèse des ARN cellulaires parallèle à la décroissance de la concentration du facteur de transcription TFIIH, ii) l'inhibition du recrutement de CBP et de l'acétylation des histones au niveau du promoteur IFNp et iii) la protéolyse de STAT1. Par les techniques du double hybride, d'immunoprécipitations de protéines ou de la chromatine et en microscopie confocale, nous avons démontré que chacun des événements est lié aux interactions de la protéine NSs avec respectivement - la sous unité p44 du TFIIH, la sous unité SAP30 de certains co-répresseurs dont Sin3 et N-coR et la protéine Socs 1 présente dans une E3 ligase : ces différents partenaires de NSs sont présents dans les filaments nucléaires. NSs en interagissant avec p44 empêche la néo-formation du TFIIH. NSs, via SAP30 et son association avec le facteur de transcription YY1, stabilise des co-répresseurs responsables de la déacétylation des histones et empêche l'interaction entre CBP et YY1 au niveau du promoteur IFNp. Enfin NSs provoque l'accumulation de Socs 1 qui recrute un complexe E3 ligase CBCSo' responsable de la dégradation de STAT1 inhibant l'induction par l'IFNy. Ainsi la protéine multifonctionnelle NSs inhibe par trois mécanismes indépendants la réponse anti-virale de l'hôte
The Rift Valley fever virus is a phlebovirus of the Bunyaviridae family transmitted by mosquitoes and affecting cattle, sheep, goats and humans. It causes many dramatic epidémies and epizootics in Africa and recently it was introduced in Yemen and in Saudi Arabia with a high mortality rate. The viral genome is composed of three segments of RNA: the L and M segments are of negative polarity and encode respectively for the RNA polymerase RNA dependent and the precursor of envelope glycoproteins. The S segment utilises an ambisense strategy and codes for the nucleoprotein N and the non structural protein NSs. Although the viral cycle is cytoplasmic, the NSs protein (256 amino acids, 31 kDa) is nuclear and forms filament. Moreover, it was shown that NSs is the major pathogenicity factor, inhibiting IFN beta messenger RNA synthesis but do not disturb the formation of the enhanceosome (NF-KB, IRF3 and ATF2/cjun). We found that infection by RVFV leads to i) a rapid and drastic suppression of host cellular RNA synthesis that parallels a decrease of the TFIIH transcription factor concentration, ii) an inhibition of CBP recruitment and histones acetylation on IFNp promoter and iii) STAT1 proteolysis. Using yeast two hybrid System, immunoprecipitations, Chips and confocal microscopy, we further demonstrated that each event is linked to the association of the nonstructural viral NSs protein with respectively the TFIIH subunit p44, co-repressors subunit SAP30 and Socs 1 in the nuclear filaments. NSs prevents the assembly of newly synthesized TFIIH subunits. NSs, through the interaction between SAP30 and YY1 transcription factor, stabilizes co-repressors like N-coR or Sin3 responsible of histones deacetylation on IFNp promoter and preventing the association between CBP and YY1. Finally NSs provokes Socs 1 accumulation and, through a Socs 1 containing-E3 ligase complex, it degrades STAT1 and inhibes induction by IFNy. These observations shed light on the mechanisms utilized by RVFV to evade the host response

La phosphorylation des protéines joue un rôle important dans de nombreux processus fondamentaux chez le parasite Leishmania, et les mitogen-activated protein kinases (MAPKs) sont susceptibles d'intervenir dans les cascades de signalisation impliquées notamment dans le développement des différents stades du parasite et dans ses propriétés de virulence. Mon travail de thèse a consisté principalement à étudier les mécanismes de signalisation impliqués dans la virulence de Leishmania et ceci dans le cadre de trois projets principaux. Dans le 1er projet j'ai étudié le rôle de la MPK4 de L major en utilisant un nouveau système de knock-out (KO) basé sur la transfection avec l'épisome pXNG qui rend les parasites transgéniques sensibles au ganciclovir. Nos résultats ont démontré un rôle essentiel de l'expression de la MPK4 pour la viabilité du parasite et de l'activité phospho-transférase de la MPK4 impliquée dans la détection des signaux environnementaux et l'infectiosité. Dans le 2eme projet, nous avons étudié la chaperone 'Heat shock protein' HspVOr, substrat potentiel de la LmaMPKT, et nos résultats ont renforcé le lien entre Hsp70r et LmaMPK7 en révélant un nouveau mécanisme de résistance aux drogues dépendant de modifications post-traductionnelles. Enfin, dans le 3eme projet réalisé en collaboration, j'ai d'identifié deux sites de phosphorylation essentiels pour la survie du parasite sur la 'Stress-inducible protein 1' ST11. Les approches génétiques présentées dans ce mémoire apportent un nouvel éclairage sur la fonction de signalisation de Leishmania et des protéines de stress qui échappent normalement à l'analyse classique de KO en raison des phénotypes létaux
Protein phosphorylation is an important process in Leishmania proliferation and differentiation, and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are likely to play a crucial regulatory role. The aim of my work was to elucidate Leishmania signalling mechanisms relevant for parasite virulence. My thesis work comprises three main projects. I first studied the role of LmaMPK4 using a novel knock-out System based on the episome pXNG that renders transgenic parasites sensitive to the drug ganciclovir. Our data demonstrate an essential role for MPK4 expression in parasite viability and for MPK4 phospho-transferase activity in environmental sensing and infectivity. The second project is focalized on the study of a chaperone Heat shock protein 70-related (Hsp70r) and LmaMPK7 by defining a novel drug résistance mechanism dependent on post-translational mechanisms. Finally, during a collaborative project I identified two phosphorylation sites that were essential for parasite survival for a chaperone Stress-inducible protein 1 (STI1). The genetic approaches presented here allow new insight into the fonction of essential Leishmania signaling and stress protein, which escape classical KO analyses due to lethal null mutant phenotypes

Cette étude concerne les réseaux de signalisation impliqués dans la régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses utérines (cellules myomètriales), celle-ci jouant un rôle essentiel dans le contrôle des activités de l'utérus. Nous avons démontré, dans des cellules de myomètre de rate en culture primaire, l'implication des MAP kinases de type ERK dans l'effet mitogène de différents agents: le PDGF, un facteur de croissance qui interagit avec un récepteur à activité tyrosine kinase, l'endothéline-1 (ET-1), un peptide mitogénique qui interagit avec un récepteur couplé aux protéines Gi et Gq dans le myomètre, et le pervanadate (PV), un inhibiteur de protéines tyrosine phosphatases. Nos résultats ont démontré que le PDGF et le PV stimulent les voies PLCγ1/InsP3 et ERK qui conduisent à la libération d'acide arachidonique et à la biosynthèse de prostaglandines impliquées dans la production d'AMPc. L'effet inhibiteur de l'AMPc sur l'activation de ERK et la synthèse d'ADN induites par les PDGF et le PV souligne l'existence d'une boucle de rétroinhibition au niveau des réponses médiées par ces deux agents. Nous avons également montré la présence et l'activation par le PV des protéines tyrosine kinases de la famille Src dans les cellules de myomètre. Ces protéines sont impliquées dans l'activation de la PLCγ1 et la production d'InsP3 dues au PV, et dans l'activation de ERK par ET-1. En effet, l'activation de ERK par ET-1 met en jeu la stimulation séquentielle de PKC, Src et Ras. Par ailleurs, deux voies de transduction contribuent à l'activation PKC-dépendante de ERK par ET-l: une voie Gq/PLCβ/InsP3/PKC conventionnelles et nouvelles, et une voie Gi/PI3-kinase/PKC atypiques. L'ensemble de cette étude contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de la prolifération des cellules de myomètre, qui intervient dans des conditions physiologiques (gestation) mais aussi pathologiques (fibromes) et physiopathologiques (préterme)
In this study, we aimed to analyse the signalling pathways involved in the regulation of myometrial cells proliferation which plays an essential role in uterine functions. We demonstrated, in rat myometrial cells in primary culture, the involvement of MAP kinases of the ERK type in the mitogenic effect of various agents: PDGF, a growth factor acting through a receptor tyrosine kinase, endothelin-1 (ET -1), a mitogenic peptide which interacts in the myometrium with receptors coupled to Gi and Gq proteins, and pervanadate (PV), a potent protein tyrosine phosphatase inhibitor. Our results showed that PDGF and PV induced PLC-γ1/Ins3 stimulation and ERK activation that both contribute to cAMP production by increasing the release of arachidonic acid and the biosynthesis of prostaglandin. The inhibition of ERK activation and DNA synthesis by cAMP constitutes a potentially important negative feedback loop for PDGF and PV- mediated responses. The presence and the activation by PV of tyrosine kinases of the Src family was also demonstrated in rat myometrial cells. These kinases contributed to the activation of PLCγ1 and the production of InsP3 triggered by PV, and to the activation of ERK induced by ET-1. Indeed, we demonstrated that ET-1-mediated ERK activation involves the sequential activation of PKC, Src and Ras. We also showed that two signalling pathways contribute to the PKC-dependant ERK activation induced by ET-1: a Gq-PLCβ-InsP3-conventional/novel PKC and a Gi-PI3kinase-atypical PKC pathway. Altogether, the results demonstrate the presence of signalling networks required for the regulation of myometrial cells proliferation which play an essential role in physiological conditions (gestation) as well as pathological (fibroma) and physiopathological (preterm) conditions

Le laboratoire s'intéresse à la voie de signalisation ERK, particulièrement aux protéines Raf (ARaf, BRaf et I CRaf). Nous avons montré que le gène BRAF codait de multiples isofbrmes présentant une expression tissu-j spécifique. La présence des séquences codées par les exons 8b/9b module les propriétés biochimiques et I oncogéniques de BRaf Mon projet de recherche a consisté à analyser le phénotype de souris knockout dans | lesquelles chacun des exons a été invalidé. Les résultats ont montré que l'épissage alternatif n'est pas essentiel pour I le développement ni pour la myélination du cerveau. Des analyses comportementales ont mis en évidence que l'expression des isoformes contenant l'exon 9b, et pas celles contenant l'exon 8b, était requise pour les mécanismes de mémoire et d'apprentissage dépendants de l'hippocampe. Le gène BRAF est muté dans 50% des mélanomes cutanés. Mon deuxième projet de thèse a consisté à générer et analyser le phénotype de souris mutées pour BRaf et CRaf dans les mélanocytes. Les souris ne présentent pas de défaut de pigmentation à la naissance, BRaf et CRaf ne sont donc pas requis pour l'homéostasie des mélanoblastes (MB). Cependant, les souris développent un phénotype de blanchiment du poil causé par une perte des cellules souches mélanocytaires (MSC). Les protéines Raf sont donc impliquées dans l'autorenouvellement des MSC, indépendantes de la signalisation en aval de Kit, tandis que les MB sont dépendants de cette signalisation et ne présentent pas de défaut particulier dans nos souris. Ces observations révèlent un découplage imprévu entre les signalisations Kit et ERK dans les cellules mélanocytaires
Our team works on the ERK pathway and we mainly focus on the Raf proteins family. We have demonstrated that the BRAF gene encoded several isoforms resulting from alternative splicing of exons 8b and 9b. The presence of these sequences modulates the biochemical and oncogenic properties of the protein. The aim of my project was to analyse the phenotype of knockout mice for each £/to/alternatively spliced exons. Constitutive ablation revealed no obvious defects during embryogenesis and adulthood. However, behavioural analyses revealed a specific role for exon 9b-containing BRaf isoforms in certain types of hippocampal-dependent learning and memory. BRaf and CRaf protein kinases have recently emerged as critical players in cutaneous melanoma but little is known about their putative role in the melanocyte lineage in vivo. The aim of my second project was to analyse the phenotype of mice deleted for both BRaf and CRaf in this lineage. Surprisingly, the double knockouts displayed normal pigmentation at birth and did not show signifîcant defect in melanoblasts. However, fbllowing the first hair | molting, the double knockout animals unveiled a progressive hair graying phenotype resulting from depletion of j melanocyte stem cells (MSC). In vitro cultures of melanocytic cells derived from knockout animals could not sustain growth in the presence of TPA but proliferated in the presence of the Kit ligand, SCF. Taken together, our results show that Raf signalling is required for proper MSC maintenance, but dispensable for early melanocyte lineage development. Our observations reveal an unexpected uncoupling between Kit and Raf signalling in the melanocyte lineage

Les voies de transduction du signal cellulaire permettent aux cellules de répondre aux signaux de l'environnement et de les traiter. Les voies de transduction de kinases MAP (MAPK) sont bien conservées dans toutes les cellules eucaryotes et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires importants. Les régions intrinsèquement désordonnées (RID), présentes dans de nombreuses MAPK, n'étaient pas encore structurellement caractérisées. Les RID de MAPK sont particulièrement importantes car elles contiennent des motifs de liaison qui contrôlent les interactions entre les protéines MAPK elles-mêmes et aussi entre les protéines MAPK et d'autres protéines contenant les mêmes motifs. La résonance magnétique nucléaire (RMN) en combinaison avec d'autres techniques biophysiques a été utilisée pour étudier les RID de kinase des voies de transduction du signal MAPK. La spectroscopie RMN est bien adaptée pour l'étude des protéines intrinsèquement désordonnées à l'échelle atomique. Les déplacements chimiques et couplages dipolaires résiduels peuvent être utilisés conjointement avec des méthodes de sélection d'ensemble pour étudier la structure résiduelle dans les RID. La relaxation de spin nucléaire nous renseigne sur les mouvements rapides. Des titrations par RMN et des techniques de spectroscopie d'échange peuvent être utilisées pour surveiller la cinétique d'interactions protéine-protéine. Cette étude contribuera à la compréhension du rôle des RID dans les voies de transduction du signal cellulaire
Protein signal transduction pathways allow cells respond to and process signals from the environment. A group of such pathways, called mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathways, is well conserved in all eukaryotic cells and is involved in regulating many important cell processes. Long intrinsically disordered region (IDRs), present in many MAPKs, have remained structurally uncharacterised. The IDRs of MAPKs are especially important as they contain docking-site motifs which control the interactions between MAPK proteins themselves and also between MAPKs and other interacting proteins containing the same motifs. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in combination with other biophysical techniques was used to study IDRs of MAPKs. NMR spectroscopy is well suited for studying intrinsically disordered proteins (IDPs) at atomic-level resolution. NMR observables, such as for example chemical shifts and residual dipolar couplings, can be used together with ensemble selection methods to study residual structure in IDRs. Nuclear spin relaxation informs us about fast pico-nanosecond motions. NMR titrations and exchange spectroscopy techniques can be used to monitor kinetics of protein-protein interactions. The mechanistic insight into function of IDRs and motifs will contribute to understanding of how signal transduction pathways work

La nécroptose est une mort programmée caspase indépendante, induite par le Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) et fait intervenir une voie de signalisation impliquant deux kinases, les Receptor-Interacting Protein Kinases 1 et 3 (RIPK1 et RIPK3) et la pseudo-kinase Mixed Lineage Kinase domain-Like protein (MLKL). L’activation des kinases Extracellular signal-Regulated Kinase 1 et 2 (ERK1/2) a été rapportée dans plusieurs morts cellulaires programmées. Par ailleurs, la régulation de l’activité de ERK1/2 en termes d’amplitude, de durée et de localisation via des régulateurs spatio-temporels spécifiques est nécessaire pour l’orientation du destin cellulaire. L’inhibition de ERK1/2 retarde la nécroptose induite par le TNFα dans les L929 de manière dose-dépendante, sans pour autant la bloquer, suggérant un rôle pro-nécrotique de ERK1/2. Dans ces conditions expérimentales, une activité biphasique et compartimentée de ERK1/2 a été observée. De plus, nos résultats indiquent que la phosphorylation ERK1/2 est RIPK1 dépendante. Nous avons développé un nouveau rapporteur de localisation de ERK2, appelé ERK2-LOC. Une translocation transitoire suivi d’une accumulation nucléaire de ERK2 suite à la stimulation des L929 par le TNFα a été observée. Les mesures d’activité de ERK1/2 au cours de la nécroptose ont été réalisées avec un biosenseur FRET d’activité kinase (ERK1/2-ACT). Son utilisation a révélé une signature spatio-temporelle spécifique d’activité au cours de la nécroptose. Afin de corréler les signatures d’activité de ERK1/2 avec celles des kinases RIPK1 et RIPK3, nous avons développé une première génération de biosenseurs FRET pour ces kinases initiatrices de la nécroptose
Necroptosis is defined as a caspase-independent programmed cell death and relies on a signaling pathway involving two serine-threonine kinases: Receptor-Interacting Protein Kinase 1 and 3 (RIPK1 and RIPK3) and the pseudo-kinase Mixed-Lineage Kinase Like (MLKL). Activation of Extracellular signal-Regulated Kinases 1 and 2 (ERK1/2) was reported to be involved in different modes of programmed cell death. It is now accepted that the regulation of the duration, magnitude and subcellular compartmentalization of ERK1/2 activity by specific spatio-temporal regulators is interpreted by the cell towards cell fate determination. ERK1/2 inhibition delays TNFα-induced necroptosis in L929 cells in a dose dependent manner but did not block it, providing arguments for a pro-necrotic function of ERK1/2. In this context, a compartmentalized biphasic phosphorylation of ERK1/2 was observed. Our results indicate a RIPK1-dependent phosphorylation of ERK1/2. Owing to the importance of ERK1/2 spatio-temporal dynamics in determining cellular responses, we developed a new reporter of ERK2 localization named ERK2-LOC. We observed a transient translocation of ERK2 when necroptosis was triggered in L929 upon TNFα stimulation, followed by progressive ERK2 accumulation in the nucleus. ERK1/2 activities were monitored during necroptosis using a FRET-based kinase biosensor for ERK1/2 (ERK1/2-ACT). Using ERK1/2-ACT, a dedicated spatio-temporal signature of ERK1/2 activity was recorded during necroptosis. Finally, to correlate ERK1/2 activity code with necroptosis occurrence, we also engineered a first generation of FRET biosensors to report on both RIPK1 and RIPK3 activities during necroptosis