Dissertations / Theses on the topic 'Mitogen-activated protéine kinase'

La schistosomiase est une parasitose causée par un ver plat trématode du genre Schistosoma. Cette pathologie, responsable de près de 300 000 décès par an, est essentiellement due à la forte fécondité des vers et à l’accumulation des œufs dans les tissus de l’hôte. Pour lutter contre la pathologie, un seul traitement efficace, le Praziquantel, est utilisé en masse dans les régions endémiques. Afin de parer à l’apparition de résistances au Praziquantel, le développement de molécules régulant la ponte du parasite fait partie des solutions alternatives envisagées.Les récepteurs Venus Kinase (VKRs) forment une famille de récepteurs tyrosine kinase (RTKs) spécifique des invertébrés découverte au laboratoire chez le parasite Schistosoma mansoni. Les VKRs possèdent une structure atypique associant un domaine extracellulaire de fixation au ligand de type Venus Flytrap (VFT) associé à un domaine Tyrosine Kinase (TK) intracellulaire. Deux VKRs sont exprimés chez S. mansoni : SmVKR1 et SmVKR2. Ces deux récepteurs activent les voies de signalisation ERK, Akt et JNK et jouent un rôle dans la reproduction du parasite.Du fait de leur absence dans le génome de l’Homme, et de leur rôle potentiel dans la modulation de la reproduction et du développement des parasites, les SmVKRs constituent des cibles intéressantes pour lutter contre la schistosomiase.La première partie de mon travail de thèse expose les données acquises quant au rôle des RTKs dans la régulation de la reproduction des schistosomes. Nous avons pu montrer que la conservation des domaines catalytiques des différents RTKs ouvre la voie à l’élaboration de molécules pouvant inhiber simultanément plusieurs RTKs de schistosomes afin de lutter contre la schistosomiase en agissant sur la ponte du parasite.La seconde partie de mon travail met en évidence qu’en plus d’agir directement sur l’activité des RTKs, il est possible d’inhiber les voies qu’ils activent. En effet, un criblage d’inhibiteurs de protéines kinases a permis d’identifier les composants de la voie Akt comme cibles potentielles pour lutter contre la schistosomiase : des doses très faibles (de l’ordre du nM) de certains inhibiteurs d’Akt sont capables d’inhiber l’appariement des schistosomes et la ponte.Dans la dernière partie, nous montrons que la protéine adaptatrice SmShb interagit spécifiquement avec SmVKR1 phosphorylé. Cette interaction se fait par la liaison du domaine SH2 de SmShb sur une Tyrosine phosphorylée spécifique, située dans la région juxtamembranaire du récepteur (pY979). La formation de ce complexe induit la phosphorylation de SmShb et dirige le signal de SmVKR1 spécifiquement vers la voie JNK. Des expériences d’hybridation in situ ont mis en évidence une colocalisation des transcrits de SmShb avec ceux de Smvkr1 au niveau des organes reproducteurs des vers adultes, notamment au niveau des ovocytes matures et des testicules. Le knock-down de SmShb par ARN interférence conduit à une accumulation de spermatozoïdes dans les testicules des vers mâles. Parallèlement, un criblage par la technique du triple hybride, en utilisant SmShb phosphorylé par SmVKR1 comme appât, a permis l’identification de diverses protéines partenaires de SmShb. En raison des résultats précédents, notre attention s’est portée sur deux protéines partenaires pour lesquelles l’interaction avec SmShb a été confirmée. 1) La GTPase RhoU, qui possède des fonctions potentielles dans la signalisation JNK et sur la dynamique du cytosquelette. 2) Une chaine légère de la dynéine TcTex-1 possédant un rôle potentiel dans la motilité des spermatozoïdes. L’ensemble de ces résultats suggère un rôle de SmShb dans la régulation de l’activité de SmVKR1 en permettant la formation d’un complexe multi-protéique incluant des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette
Schistosomiasis is a parasitic disease caused by trematode flatworm species belonging to the genus Schistosoma. Responsible for about 300,000 deaths per year, the disease is mainly due to the high fertility of the worms and to encystment of eggs in host tissues. In order to fight against schistosomiasis, a single drug (Praziquantel) is efficient and massively distributed in endemic areas. To deal with the emergence of resistance to Praziquantel, one alternative is to consider the design of molecules that target parasite reproduction.Venus Kinase Receptors (VKRs) constitute an invertebrate Receptor Tyrosine Kinase (RTK) family initially discovered in the parasite Schistosoma mansoni. VKRs are atypical RTKs formed by an extracellular Venus Fly Trap (VFT) ligand binding domain associated via a transmembrane domain with an intracellular tyrosine kinase (TK) domain. Two VKRs are expressed in S. mansoni: SmVKR1 and SmVKR2. They both activate Erk, Akt and JNK signaling pathways and act on the parasite reproduction.As they are absent from the human genome and as they have potential roles in the modulation of reproductive processes and development of parasites, SmVKRs appear as attractive targets to fight schistosomiasis.The first part of my thesis work sets known data concerning the role of RTKs in schistosome reproduction. Here, we show that the catalytic domains are conserved across various RTKs and we open the perspective to design drugs which could inhibit several RTKs at the same time to control egg laying by schistosomes.The second part of my work describes the importance of using an alternative strategy of inhibiting downstream partners of RTKs. By screening a kinase inhibitor library, we defined the Akt pathway components as potential targets to fight schistosomiasis. Nanomolar doses of Akt inhibitors can inhibit schistosome pairing and egg laying.In the last part, we present the specific interaction of the adaptor protein SmShb with the phosphorylated form of SmVKR1. This binding occurs between the SH2 domain of SmShb and a phosphotyrosine residue (pY979) located in the juxtamembrane region of the receptor. That interaction leads to the phosphorylation of SmShb and promotes the signal of SmVKR1 towards a JNK pathway. In situ hybridization experiments highlighted that SmShb and Smvkr1 transcripts were both located in mature oocytes and testes of adult worms. RNA interference experiments using double-stranded RNA targeting SmShb led to an accumulation of mature sperm in testes of male worms. Finally, a yeast three hybrid screening, using SmShb phosphorylated by SmVKR1 as prey, allowed us to identify various protein partners. Taking advantage of previous results, we focused on two partners and confirmed their interaction with SmShb. 1) RhoU GTPase which has potential functions in JNK signalling and cytoskeleton dynamic. 2) The dynein light chain TcTex-1, with potential role in sperm motility. Altogether, this results argue for a potential role of SmShb in the regulation of the SmVKR1 activity by forming a multiprotein complex including proteins with various roles in cytoskeleton reorganization

Des études récentes ont souligné l'importance des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine. En permettant l'assemblage de complexes protéiques nucléaires, les ARN non codants agissent comme des échafaudages et favorisent ainsi les interactions protéine-protéine afin de réguler l'état de la chromatine. Les ARN sont également capables d’interagir avec des protéines pour en moduler leurs activités, leurs interactions ou encore leurs localisations. Cependant, le rôle potentiel des ARN dans la régulation des interactions protéine-protéine dans les principales voies de transduction du signal cytoplasmique reste largement inconnu. L’objectif de la thèse a consisté à rechercher et à mettre en évidence une activité de liaison directe à l’ARN de protéines impliquées dans les voies de transduction du signal cytoplasmique et d’évaluer le rôle des interactions ARN-protéines de transduction sur la signalisation intra-cellulaire. En utilisant des approches de CLIP (CrossLink et ImmunoPrécipitation) et de 2C (Complexe Capture : purification d’ARN basée sur leur affinité pour une matrice de silice), qui peuvent mettre en évidence des interactions directes entre les protéines et les ARN in vivo, nous avons démontré une interaction directe avec l’ARN de certaines protéines clés de la voie de signalisation MAPK. Des approches de microscopie telles que le PLA (Proximity Ligation Assay) nous ont permis de démontrer une modulation des interactions protéine-protéine dépendant de l'ARN dans la voie MAPK, suggérant qu'une composante ARN est impliquée dans la stabilisation de ces interactions protéine-protéine. Nous avons spécifiquement identifié un mutant de délétion BRAF, une protéine oncogène centrale et une cible thérapeutique dans le mélanome, qui montre une déficience dans son activité de liaison à l'ARN, ainsi qu’une activité de signalisation réduite. En mettant en évidence l'existence d'une modulation des interactions protéine-protéine médiée par l'ARN, cette étude démontre l'importance sans précédent de l'activité de liaison à l'ARN des principales protéines de transduction du signal qui devrait être prise en compte dans la compréhension et le ciblage des cellules tumorales
Recent studies have underscored the importance of RNAs in the regulation of protein-protein interactions. By allowing the assembly of protein complexes, non-coding RNAs act as scaffolds and thus promote protein-protein interactions in order to regulate the chromatin state. RNAs are also able to interact with proteins in order to modulate their activities, interactions or localisation. In the cytoplasm, signalling pathways are regulated through a cascade of protein-protein interactions. In the MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) signalling pathway, the binding of a ligand to a membrane receptor triggers a cascade of phosphorylation and protein-protein interactions that allow the transduction of the signal. Abnormal activity of this pathway through increased ligand binding or activating mutations lead to cellular dysfunction associated with tumor initiation and progression.The potential role of RNAs in the direct regulation of protein-protein interactions of key cytoplasmic signal transduction pathways remains largely unknown. The aim of the thesis was to investigate and demonstrate the direct RNA binding activity of proteins involved in the MAPK pathway and to evaluate the role of RNA-protein interactions on intracellular signalling.Using a combination of CLIP (crosslinking and immunoprecipitation) and silica matrix-based affinity capture (2C complex capture) approaches that can uncover direct interactions between proteins and RNAs in vivo, we demonstrated a direct interaction between key MAPK signalling proteins and RNA in melanoma cells. Subsequent microscopy studies using proximity ligation assay (PLA) led us to demonstrate an RNA-dependent modulation of protein-protein interactions in the MAPK pathway, suggesting that an RNA component is involved in the stabilization of these protein-protein interactions. We specifically identified a deletion mutant in BRAF, a central oncogenic protein and therapeutic target in melanoma, that lacks RNA binding activity and harbors decreased signalling activity.By highlighting the existence of an RNA-mediated modulation of protein-protein interactions, this study shows the unprecedented importance of the RNA binding activity of key signal transduction proteins that should be considered in the understanding and targeting of tumor cells

L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L'objectif principal de mon travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l'activation des MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l'étirement. Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D'une part, nous nous sommes intéressés aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l'activation des MAPK. D'autre part, nous avons cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de signalisation activées par l'étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes protéiques nécessaires à l'activation des différents partenaires. Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à l'activation de ERK et de JNK lors de l'étirement. Ces cascades de transduction peuvent être dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l'activation de ERK par l'étirement. Enfin, nous avons montré la formation d'un complexe Protein Kinase C (PKC)/Calcineurine nécessaire à l'activation et à la translocation de la PKC lors de l'étirement. Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire

Les cancers ovariens, se développant de façon silencieuse, diagnostiqués à des stades tardifs et de mauvais pronostiques, requièrent urgemment la mise au point de nouvelles options thérapeutiques. Ma thèse s'est attachée à caractériser les propriétés physiques et biologiques des cancers ovariens Séreux de Haut Grade (HGSOC), représentant 75% des tumeurs ovariennes.En premier lieu, nous avons démontré la valeur pronostique de la protéine MAP3K8 s'accumulant dans les HGSOC. Nous avons montré que MAP3K8 contrôle la prolifération et la migration des cellules cancéreuses via la transition G 1/S et les mécanismes d'adhésion dynamique. Aussi, nous avons mis en évidence que MAP3K8 active majoritairement la voie MEK, présentant ainsi un potentiel prédictif des inhibiteurs de MEK, les positionnant comme une stratégie thérapeutique prometteuse, en combinaison des thérapies conventionnelles, chez les HGSOC.Dans un second axe de ma thèse, nous avons montré que la rigidité augmente avec la taille tumorale, chez les HGSOC présentant une signature moléculaire « Fibrose ». Cette rigidification tumorale s'associe à une accumulation de stroma et un remodelage du réseau de collagène, mais aussi à une activation spécifique de la voie MEK. De façon intéressante, la rigidification tumorale accompagne un « switch » métabolique glycolytique, restreint au centre de la tumeur, la périphérie demeurant plus molle, et différant par une production élevée de collagène et un métabolisme OXPHOS. La rigidité pourrait donc être au carrefour de 3 processus majeurs, tels un remodelage de la matrice, l'activation de MEK et un switch métabolique stromal, expliquant, au moins en partie, la progression des HGSOC
Ovarian cancers, which develop in a silent manner in the peritoneal cavity, resulting in a late diagnosis and a poor prognosis, urgently require new therapeutic strategies. In this context, my thesis aimed at better characterize the physical and biological properties of the High Grade Serous ovarian cancers (HGSOCs), accounting for 75% of the tumours.First, we found that the protein MAP3K8 accumulates in HGSOC and is a potential prognostic marker for these tumours. We demonstrated that MAP3K8 controls cancer cell proliferation and migration by regulating key players in Gl/S transition and adhesion dynamics. Importantly, we highlighted that MAP3K8 function is mainly mediated by the MEK pathway, and exhibits a predictive potential for MEK inhibitors, defining them as a promising therapeutic option, in combination with conventional therapy, for HGSOC patients.In a second part of my thesis, we showed that tumor stiffness is increased during tumor growth in HGSOC presenting a "Fibrosis" molecular signature. Moreover, tumor stiffening is associated with high stromal content and remodeling of the collagen network. Interestingly, the MEK kinase was specifically activated upon tumor stiffening. Furthermore, tumor stiffness accompanies a glycolytic metabolic switch, restricted to the central part of stiff tumors. Indeed, the periphery of stiff tumors remains softer than the central part with stromal cells secreting high levels of collagens and showing an OXPHOS metabolism. Thus, tumor stiffness could be at the crossroad of three major processes, i.e. matrix remodeling, MEK activation and stromal metabolic switch, that might explain, at least in part, the progression of HGSOC

Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (RVFV) est un arbovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae et au genre Phlebovirus. Il est transmis par les moustiques et infecte l'homme et les ruminants. De graves épidémies/épizooties ont eu lieu en Afrique et le virus circule maintenant en Arabie Saoudite ainsi qu'au Yémen. Le génome viral est composé de trois segments d'ARN simple brin: les segments L. M sont de polarité négative et le segment S utilise une stratégie ambisens. Bien que le cycle viral ait heu dans le cytoplasme, la protéine NSs (256 acides aminés, 31 kDa), codée par le segment S, a une localisation nucléaire où elle forme des filaments. NSs est un facteur de pathogenèse du virus qui inhibe la synthèse des ARNm du gène codant pour l'IFN bêta sans perturber pour autant l'enhanceosome (NF-KB, IRF3 et ATF2/cjun). Pour comprendre les mécanismes par lesquels NSs inhibe la réponse anti-virale, nous avons recherché ses partenaires cellulaires. Nous avons montré que l'infection par le VFVR a pour conséquences : i) une rapide diminution de la synthèse des ARN cellulaires parallèle à la décroissance de la concentration du facteur de transcription TFIIH, ii) l'inhibition du recrutement de CBP et de l'acétylation des histones au niveau du promoteur IFNp et iii) la protéolyse de STAT1. Par les techniques du double hybride, d'immunoprécipitations de protéines ou de la chromatine et en microscopie confocale, nous avons démontré que chacun des événements est lié aux interactions de la protéine NSs avec respectivement - la sous unité p44 du TFIIH, la sous unité SAP30 de certains co-répresseurs dont Sin3 et N-coR et la protéine Socs 1 présente dans une E3 ligase : ces différents partenaires de NSs sont présents dans les filaments nucléaires. NSs en interagissant avec p44 empêche la néo-formation du TFIIH. NSs, via SAP30 et son association avec le facteur de transcription YY1, stabilise des co-répresseurs responsables de la déacétylation des histones et empêche l'interaction entre CBP et YY1 au niveau du promoteur IFNp. Enfin NSs provoque l'accumulation de Socs 1 qui recrute un complexe E3 ligase CBCSo' responsable de la dégradation de STAT1 inhibant l'induction par l'IFNy. Ainsi la protéine multifonctionnelle NSs inhibe par trois mécanismes indépendants la réponse anti-virale de l'hôte
The Rift Valley fever virus is a phlebovirus of the Bunyaviridae family transmitted by mosquitoes and affecting cattle, sheep, goats and humans. It causes many dramatic epidémies and epizootics in Africa and recently it was introduced in Yemen and in Saudi Arabia with a high mortality rate. The viral genome is composed of three segments of RNA: the L and M segments are of negative polarity and encode respectively for the RNA polymerase RNA dependent and the precursor of envelope glycoproteins. The S segment utilises an ambisense strategy and codes for the nucleoprotein N and the non structural protein NSs. Although the viral cycle is cytoplasmic, the NSs protein (256 amino acids, 31 kDa) is nuclear and forms filament. Moreover, it was shown that NSs is the major pathogenicity factor, inhibiting IFN beta messenger RNA synthesis but do not disturb the formation of the enhanceosome (NF-KB, IRF3 and ATF2/cjun). We found that infection by RVFV leads to i) a rapid and drastic suppression of host cellular RNA synthesis that parallels a decrease of the TFIIH transcription factor concentration, ii) an inhibition of CBP recruitment and histones acetylation on IFNp promoter and iii) STAT1 proteolysis. Using yeast two hybrid System, immunoprecipitations, Chips and confocal microscopy, we further demonstrated that each event is linked to the association of the nonstructural viral NSs protein with respectively the TFIIH subunit p44, co-repressors subunit SAP30 and Socs 1 in the nuclear filaments. NSs prevents the assembly of newly synthesized TFIIH subunits. NSs, through the interaction between SAP30 and YY1 transcription factor, stabilizes co-repressors like N-coR or Sin3 responsible of histones deacetylation on IFNp promoter and preventing the association between CBP and YY1. Finally NSs provokes Socs 1 accumulation and, through a Socs 1 containing-E3 ligase complex, it degrades STAT1 and inhibes induction by IFNy. These observations shed light on the mechanisms utilized by RVFV to evade the host response

La phosphorylation des protéines joue un rôle important dans de nombreux processus fondamentaux chez le parasite Leishmania, et les mitogen-activated protein kinases (MAPKs) sont susceptibles d'intervenir dans les cascades de signalisation impliquées notamment dans le développement des différents stades du parasite et dans ses propriétés de virulence. Mon travail de thèse a consisté principalement à étudier les mécanismes de signalisation impliqués dans la virulence de Leishmania et ceci dans le cadre de trois projets principaux. Dans le 1er projet j'ai étudié le rôle de la MPK4 de L major en utilisant un nouveau système de knock-out (KO) basé sur la transfection avec l'épisome pXNG qui rend les parasites transgéniques sensibles au ganciclovir. Nos résultats ont démontré un rôle essentiel de l'expression de la MPK4 pour la viabilité du parasite et de l'activité phospho-transférase de la MPK4 impliquée dans la détection des signaux environnementaux et l'infectiosité. Dans le 2eme projet, nous avons étudié la chaperone 'Heat shock protein' HspVOr, substrat potentiel de la LmaMPKT, et nos résultats ont renforcé le lien entre Hsp70r et LmaMPK7 en révélant un nouveau mécanisme de résistance aux drogues dépendant de modifications post-traductionnelles. Enfin, dans le 3eme projet réalisé en collaboration, j'ai d'identifié deux sites de phosphorylation essentiels pour la survie du parasite sur la 'Stress-inducible protein 1' ST11. Les approches génétiques présentées dans ce mémoire apportent un nouvel éclairage sur la fonction de signalisation de Leishmania et des protéines de stress qui échappent normalement à l'analyse classique de KO en raison des phénotypes létaux
Protein phosphorylation is an important process in Leishmania proliferation and differentiation, and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) are likely to play a crucial regulatory role. The aim of my work was to elucidate Leishmania signalling mechanisms relevant for parasite virulence. My thesis work comprises three main projects. I first studied the role of LmaMPK4 using a novel knock-out System based on the episome pXNG that renders transgenic parasites sensitive to the drug ganciclovir. Our data demonstrate an essential role for MPK4 expression in parasite viability and for MPK4 phospho-transferase activity in environmental sensing and infectivity. The second project is focalized on the study of a chaperone Heat shock protein 70-related (Hsp70r) and LmaMPK7 by defining a novel drug résistance mechanism dependent on post-translational mechanisms. Finally, during a collaborative project I identified two phosphorylation sites that were essential for parasite survival for a chaperone Stress-inducible protein 1 (STI1). The genetic approaches presented here allow new insight into the fonction of essential Leishmania signaling and stress protein, which escape classical KO analyses due to lethal null mutant phenotypes

Cette étude concerne les réseaux de signalisation impliqués dans la régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses utérines (cellules myomètriales), celle-ci jouant un rôle essentiel dans le contrôle des activités de l'utérus. Nous avons démontré, dans des cellules de myomètre de rate en culture primaire, l'implication des MAP kinases de type ERK dans l'effet mitogène de différents agents: le PDGF, un facteur de croissance qui interagit avec un récepteur à activité tyrosine kinase, l'endothéline-1 (ET-1), un peptide mitogénique qui interagit avec un récepteur couplé aux protéines Gi et Gq dans le myomètre, et le pervanadate (PV), un inhibiteur de protéines tyrosine phosphatases. Nos résultats ont démontré que le PDGF et le PV stimulent les voies PLCγ1/InsP3 et ERK qui conduisent à la libération d'acide arachidonique et à la biosynthèse de prostaglandines impliquées dans la production d'AMPc. L'effet inhibiteur de l'AMPc sur l'activation de ERK et la synthèse d'ADN induites par les PDGF et le PV souligne l'existence d'une boucle de rétroinhibition au niveau des réponses médiées par ces deux agents. Nous avons également montré la présence et l'activation par le PV des protéines tyrosine kinases de la famille Src dans les cellules de myomètre. Ces protéines sont impliquées dans l'activation de la PLCγ1 et la production d'InsP3 dues au PV, et dans l'activation de ERK par ET-1. En effet, l'activation de ERK par ET-1 met en jeu la stimulation séquentielle de PKC, Src et Ras. Par ailleurs, deux voies de transduction contribuent à l'activation PKC-dépendante de ERK par ET-l: une voie Gq/PLCβ/InsP3/PKC conventionnelles et nouvelles, et une voie Gi/PI3-kinase/PKC atypiques. L'ensemble de cette étude contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de la prolifération des cellules de myomètre, qui intervient dans des conditions physiologiques (gestation) mais aussi pathologiques (fibromes) et physiopathologiques (préterme)
In this study, we aimed to analyse the signalling pathways involved in the regulation of myometrial cells proliferation which plays an essential role in uterine functions. We demonstrated, in rat myometrial cells in primary culture, the involvement of MAP kinases of the ERK type in the mitogenic effect of various agents: PDGF, a growth factor acting through a receptor tyrosine kinase, endothelin-1 (ET -1), a mitogenic peptide which interacts in the myometrium with receptors coupled to Gi and Gq proteins, and pervanadate (PV), a potent protein tyrosine phosphatase inhibitor. Our results showed that PDGF and PV induced PLC-γ1/Ins3 stimulation and ERK activation that both contribute to cAMP production by increasing the release of arachidonic acid and the biosynthesis of prostaglandin. The inhibition of ERK activation and DNA synthesis by cAMP constitutes a potentially important negative feedback loop for PDGF and PV- mediated responses. The presence and the activation by PV of tyrosine kinases of the Src family was also demonstrated in rat myometrial cells. These kinases contributed to the activation of PLCγ1 and the production of InsP3 triggered by PV, and to the activation of ERK induced by ET-1. Indeed, we demonstrated that ET-1-mediated ERK activation involves the sequential activation of PKC, Src and Ras. We also showed that two signalling pathways contribute to the PKC-dependant ERK activation induced by ET-1: a Gq-PLCβ-InsP3-conventional/novel PKC and a Gi-PI3kinase-atypical PKC pathway. Altogether, the results demonstrate the presence of signalling networks required for the regulation of myometrial cells proliferation which play an essential role in physiological conditions (gestation) as well as pathological (fibroma) and physiopathological (preterm) conditions

Le laboratoire s'intéresse à la voie de signalisation ERK, particulièrement aux protéines Raf (ARaf, BRaf et I CRaf). Nous avons montré que le gène BRAF codait de multiples isofbrmes présentant une expression tissu-j spécifique. La présence des séquences codées par les exons 8b/9b module les propriétés biochimiques et I oncogéniques de BRaf Mon projet de recherche a consisté à analyser le phénotype de souris knockout dans | lesquelles chacun des exons a été invalidé. Les résultats ont montré que l'épissage alternatif n'est pas essentiel pour I le développement ni pour la myélination du cerveau. Des analyses comportementales ont mis en évidence que l'expression des isoformes contenant l'exon 9b, et pas celles contenant l'exon 8b, était requise pour les mécanismes de mémoire et d'apprentissage dépendants de l'hippocampe. Le gène BRAF est muté dans 50% des mélanomes cutanés. Mon deuxième projet de thèse a consisté à générer et analyser le phénotype de souris mutées pour BRaf et CRaf dans les mélanocytes. Les souris ne présentent pas de défaut de pigmentation à la naissance, BRaf et CRaf ne sont donc pas requis pour l'homéostasie des mélanoblastes (MB). Cependant, les souris développent un phénotype de blanchiment du poil causé par une perte des cellules souches mélanocytaires (MSC). Les protéines Raf sont donc impliquées dans l'autorenouvellement des MSC, indépendantes de la signalisation en aval de Kit, tandis que les MB sont dépendants de cette signalisation et ne présentent pas de défaut particulier dans nos souris. Ces observations révèlent un découplage imprévu entre les signalisations Kit et ERK dans les cellules mélanocytaires
Our team works on the ERK pathway and we mainly focus on the Raf proteins family. We have demonstrated that the BRAF gene encoded several isoforms resulting from alternative splicing of exons 8b and 9b. The presence of these sequences modulates the biochemical and oncogenic properties of the protein. The aim of my project was to analyse the phenotype of knockout mice for each £/to/alternatively spliced exons. Constitutive ablation revealed no obvious defects during embryogenesis and adulthood. However, behavioural analyses revealed a specific role for exon 9b-containing BRaf isoforms in certain types of hippocampal-dependent learning and memory. BRaf and CRaf protein kinases have recently emerged as critical players in cutaneous melanoma but little is known about their putative role in the melanocyte lineage in vivo. The aim of my second project was to analyse the phenotype of mice deleted for both BRaf and CRaf in this lineage. Surprisingly, the double knockouts displayed normal pigmentation at birth and did not show signifîcant defect in melanoblasts. However, fbllowing the first hair | molting, the double knockout animals unveiled a progressive hair graying phenotype resulting from depletion of j melanocyte stem cells (MSC). In vitro cultures of melanocytic cells derived from knockout animals could not sustain growth in the presence of TPA but proliferated in the presence of the Kit ligand, SCF. Taken together, our results show that Raf signalling is required for proper MSC maintenance, but dispensable for early melanocyte lineage development. Our observations reveal an unexpected uncoupling between Kit and Raf signalling in the melanocyte lineage

Les voies de transduction du signal cellulaire permettent aux cellules de répondre aux signaux de l'environnement et de les traiter. Les voies de transduction de kinases MAP (MAPK) sont bien conservées dans toutes les cellules eucaryotes et sont impliquées dans la régulation de nombreux processus cellulaires importants. Les régions intrinsèquement désordonnées (RID), présentes dans de nombreuses MAPK, n'étaient pas encore structurellement caractérisées. Les RID de MAPK sont particulièrement importantes car elles contiennent des motifs de liaison qui contrôlent les interactions entre les protéines MAPK elles-mêmes et aussi entre les protéines MAPK et d'autres protéines contenant les mêmes motifs. La résonance magnétique nucléaire (RMN) en combinaison avec d'autres techniques biophysiques a été utilisée pour étudier les RID de kinase des voies de transduction du signal MAPK. La spectroscopie RMN est bien adaptée pour l'étude des protéines intrinsèquement désordonnées à l'échelle atomique. Les déplacements chimiques et couplages dipolaires résiduels peuvent être utilisés conjointement avec des méthodes de sélection d'ensemble pour étudier la structure résiduelle dans les RID. La relaxation de spin nucléaire nous renseigne sur les mouvements rapides. Des titrations par RMN et des techniques de spectroscopie d'échange peuvent être utilisées pour surveiller la cinétique d'interactions protéine-protéine. Cette étude contribuera à la compréhension du rôle des RID dans les voies de transduction du signal cellulaire
Protein signal transduction pathways allow cells respond to and process signals from the environment. A group of such pathways, called mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathways, is well conserved in all eukaryotic cells and is involved in regulating many important cell processes. Long intrinsically disordered region (IDRs), present in many MAPKs, have remained structurally uncharacterised. The IDRs of MAPKs are especially important as they contain docking-site motifs which control the interactions between MAPK proteins themselves and also between MAPKs and other interacting proteins containing the same motifs. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy in combination with other biophysical techniques was used to study IDRs of MAPKs. NMR spectroscopy is well suited for studying intrinsically disordered proteins (IDPs) at atomic-level resolution. NMR observables, such as for example chemical shifts and residual dipolar couplings, can be used together with ensemble selection methods to study residual structure in IDRs. Nuclear spin relaxation informs us about fast pico-nanosecond motions. NMR titrations and exchange spectroscopy techniques can be used to monitor kinetics of protein-protein interactions. The mechanistic insight into function of IDRs and motifs will contribute to understanding of how signal transduction pathways work

La nécroptose est une mort programmée caspase indépendante, induite par le Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) et fait intervenir une voie de signalisation impliquant deux kinases, les Receptor-Interacting Protein Kinases 1 et 3 (RIPK1 et RIPK3) et la pseudo-kinase Mixed Lineage Kinase domain-Like protein (MLKL). L’activation des kinases Extracellular signal-Regulated Kinase 1 et 2 (ERK1/2) a été rapportée dans plusieurs morts cellulaires programmées. Par ailleurs, la régulation de l’activité de ERK1/2 en termes d’amplitude, de durée et de localisation via des régulateurs spatio-temporels spécifiques est nécessaire pour l’orientation du destin cellulaire. L’inhibition de ERK1/2 retarde la nécroptose induite par le TNFα dans les L929 de manière dose-dépendante, sans pour autant la bloquer, suggérant un rôle pro-nécrotique de ERK1/2. Dans ces conditions expérimentales, une activité biphasique et compartimentée de ERK1/2 a été observée. De plus, nos résultats indiquent que la phosphorylation ERK1/2 est RIPK1 dépendante. Nous avons développé un nouveau rapporteur de localisation de ERK2, appelé ERK2-LOC. Une translocation transitoire suivi d’une accumulation nucléaire de ERK2 suite à la stimulation des L929 par le TNFα a été observée. Les mesures d’activité de ERK1/2 au cours de la nécroptose ont été réalisées avec un biosenseur FRET d’activité kinase (ERK1/2-ACT). Son utilisation a révélé une signature spatio-temporelle spécifique d’activité au cours de la nécroptose. Afin de corréler les signatures d’activité de ERK1/2 avec celles des kinases RIPK1 et RIPK3, nous avons développé une première génération de biosenseurs FRET pour ces kinases initiatrices de la nécroptose
Necroptosis is defined as a caspase-independent programmed cell death and relies on a signaling pathway involving two serine-threonine kinases: Receptor-Interacting Protein Kinase 1 and 3 (RIPK1 and RIPK3) and the pseudo-kinase Mixed-Lineage Kinase Like (MLKL). Activation of Extracellular signal-Regulated Kinases 1 and 2 (ERK1/2) was reported to be involved in different modes of programmed cell death. It is now accepted that the regulation of the duration, magnitude and subcellular compartmentalization of ERK1/2 activity by specific spatio-temporal regulators is interpreted by the cell towards cell fate determination. ERK1/2 inhibition delays TNFα-induced necroptosis in L929 cells in a dose dependent manner but did not block it, providing arguments for a pro-necrotic function of ERK1/2. In this context, a compartmentalized biphasic phosphorylation of ERK1/2 was observed. Our results indicate a RIPK1-dependent phosphorylation of ERK1/2. Owing to the importance of ERK1/2 spatio-temporal dynamics in determining cellular responses, we developed a new reporter of ERK2 localization named ERK2-LOC. We observed a transient translocation of ERK2 when necroptosis was triggered in L929 upon TNFα stimulation, followed by progressive ERK2 accumulation in the nucleus. ERK1/2 activities were monitored during necroptosis using a FRET-based kinase biosensor for ERK1/2 (ERK1/2-ACT). Using ERK1/2-ACT, a dedicated spatio-temporal signature of ERK1/2 activity was recorded during necroptosis. Finally, to correlate ERK1/2 activity code with necroptosis occurrence, we also engineered a first generation of FRET biosensors to report on both RIPK1 and RIPK3 activities during necroptosis

Le récepteur activé par les proliférateurs de péroxysomes alpha (PPARa) appartient à la famille des récepteurs nucléaires et joue un rôle majeur dans la régulation du métabolisme des lipides, de l'homéostasie glucidique et des processus inflammatoires. En plus de son activation par un ligand, PPARa est également contrôlé par des processus post-traductionnels comme la phosphorylation. Dans le foie, PPARa est phosphorylé par des kinases comme les MAPKs, la PKA et la PKC. Le but de ce travail était d'étudier l'effet de la p38-MAPK sur l'activité transcriptionnelle de PPARa. Nous avons tout d'abord montré que, dans des cellules COS-7, un activateur de la p38-MAPK, l'anisomycine, phosphorylait PPARa de manière dose dépendante et inhibait de 50% son activité transcriptionnelle. Deuxièmement, dans des hépatomes, la phosphorylation de la p38-MAPK induite par l'anisomycine entraîne une diminution de l'expression endogène de la L-CPT I (liver-carnitine palmitoyltransferase), un gène cible de PPARa. Troisièmement, nous avons démontré que l'interaction PPARa/p38-MAPK nécessite un adaptateur, la protéine ZIP (zêta PKC-interacting protein). En effet, des expériences de co-immunoprécipitation nous ont permis de mettre en évidence une interaction trimèrique entre PPARa, la p38-MAPK et ZIP. Enfin, en diminuant l'expression de ZIP à l'aide d'un siRNA, nous avons observé une réduction de l'effet inhibiteur de l'anisomycine sur l'expression du gène codant la L-CPT I. En conclusion, nous avons montré que l'activation de la p38-MAPK induisait une phosphorylation de PPARa et une inhibition de son activité transcriptionnelle secondairement à la formation d'un trimère PPARa/ZIP/p38-MAPK
The peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARa) belongs to the nuclear receptor family and plays a central role in the regulation of lipid metabolism, glucose homeostasis an inflammatory processes. In addition to its ligand-induced transcriptional activity, PPARa is also regulated by phosphorylation. In the liver, PPARa is phosphorylated by kinases such as ERK mitogen-activated protein kinases (MAPK), cAMP-dependent protein kinase (PKA) and calcium dependent protein kinase (PKC). The aim of this work was to examine the effect of p38-MAPK on PPARa transcriptional activity. Firstly, we showed that in COS-7 cells, the p38-MAPK activator anisomycin, phosphorylated PPARa in a dose dépendent manner and inhibited by 50% its transcriptional activity. Secondly, in H4IIE hepatoma cells, anisomycin-induced p38-MAPK phosphorylation decreased the endogenous mRNA and protein expression levels of liver carnitine palmitoyltransferase I (L-CPTI), a PPARa target gene. Thirdly, we demonstrated that PPARa/p38 MAPK interaction required a molecular adapter, the zeta PKC-interacting protein (ZIP). Indeed using co-immunoprecipitation assays, we found a trimeric interaction between PPARa, p38-MAPJ and ZIP. Finally, reducing ZIP expression by siRNA, impaired L-CPTI gene expression in response to anisomycin. In conclusion, we showed that p38-MAPK activation induced PPARa phosphorylatio and inhibition of its transcriptional activity through a trimeric interaction between thé p38-MAPK, ZlP and PPARa

Le compartiment microvasculaire est une cible importante du stress oxydant qui est un facteur majeur de la dysfonction endothéliale, notamment au cours d'exposition aux rayonnements ionisants. L'altération de l'endothélium induite par le stress oxydant est impliquée dans la toxicité radio-induite des tissus sains. Limiter les dysfonctions endothéliales est donc un enjeu important des traitements radiothérapeutiques actuels. Cet objectif nécessite une meilleure caractérisation de la signalisation du stress oxydant dans les cellules endothéliales. La voie p38 MAPK est incontournable dans la réponse au stress oxydant mais reste encore insuffisamment caractérisée. Par une approche protéomique, nous avons identifié la nucléophosmine (NPM) comme nouveau partenaire de p38 dans le cytoplasme des cellules endothéliales. La phosphatase PP2a est aussi associée à ce complexe NPM/p38. Nos travaux montrent que le stress oxydant (H2O2, 500μM) régule la déphosphorylation de NPM via PP2a, entraine sa dissociation rapide du complexe et favorise sa translocation vers le noyau. De plus, nous montrons que la présence de NPM déphosphorylée au noyau altère la réponse des cellules aux dommages à l'ADN induits par le stress oxydant. Le céramide sphingolipide membranaire est également un facteur important des voies de stress, particulièrement dans les cellules endothéliales. Notre étude aborde donc l'implication de ce sphingolipide dans la régulation de la voie NPM/p38. Une meilleure caractérisation de la voie p38 et de ses acteurs permettra d'identifier de potentielles cibles afin de limiter les dysfonctions endothéliales et leurs conséquences délétères sur les tissus environnants
The microvascular compartment is a significant target of oxidative stress that is a major factor in endothelial dysfunction, especially during exposure to ionizing radiation. The alteration of endothelium induced by oxidative stress is involved in radiation-induced toxicity of normal tissues. Limiting endothelial dysfunction is therefore an important issue of current radiotherapeutic treatments. This objective requires a better characterization of oxidative stress signaling in endothelial cells. P38 MAPK pathway is essential in oxidative stress response but still insufficiently characterized. By using a proteomic approach, we identified nucleophosmin (NPM) as a new partner of p38 in the cytoplasm of endothelial cells. PP2a phosphatase is also associated with the NPM/p38 complex. Our work shows that oxidative stress (H2O2, 500μM) regulates the NPM dephosphorylation via PP2a, causes rapid dissociation of the complex, and promotes its translocation to the nucleus. In addition, we show that the presence of NPM dephosphorylated at T199 in the nucleus alters the cellular response to DNA damage induced by oxidative stress. The membrane sphingolipid ceramide is also an important factor in stress pathways, particularly in endothelial cells. Our study describes the involvement of this sphingolipid in the regulation of NPM/p38 pathway. A better characterization of the p38 pathway and its actors provided by our study will identify potential targets in order to limit endothelial dysfunction and its deleterious effect on surrounding tissues

La voie ERK joue un rôle important dans les fonctions de la TPO. L'équipe avait isolé le gène précoce IEX-1 en tant que substrat de ERK en réponse à la TPO et démontré une régulation réciproque des activités de ces deux protéines : IEX-1 phosphorylée par ERK acquiert une fonction anti-apoptotique ; IEX-1 en liant ERK, maintien son activation. Ce denier effet est du à la capacité de IEX-1 d'inhiber de façon spécifique la famille des phosphatases PP2A contenant les sous-unités régulatrices B56 (PP2A-B56). IEX-1 inhibe PP2A-B56 en permettant la phosphorylation de la sous-unité B56 par ERK ce qui conduit à la dissociation de la sous-unité catalytique de l'enzyme. Ces résultats suggéraient que IEX-1 pourrait séquestrer les sous-unités B56 de PP2A, les empêchant d'agir sur d'autres substrats. En effet, nous avons observé que IEX-1 bloque la déphosphorylation d'Akt sur Ser473 et Thr308 et augmente son activité kinase. Akt est une cible des PP2A-B56. En effet, la surexpression de sous-unités B56 entraîne une diminution de la phosphorylation d'Akt sur Ser4723 et Thr308. L'effet inverse est retrouvé en utilisant les siRNA dirigés contre B56β et γ. Les PP2A-B56 reversent l'effet de IEX-1 sur Akt. En utilisant des mutants dominant-négatifs de ERK et des mutants de phosphorylation de B56, nous avons montré que l'effet de IEX-1 sur Akt est dépendant de la phosphorylation de B56 par ERK. IEX-1 maintien donc l'activation d'Akt et de ERK par le même mécanisme. Ces résultats montrent que IEX-1 agit comme un inhibiteur cellulaire général des PP2A-B56et identifient un nouveau substrat des PP2A-B56 ainsi qu'une nouvelle coopération entre les voies ERK et Akt. Dans les cellules UT7-Mpl, IEX-1 est induit spécifiquement par la TPO, mais pas par l'EPO ou le GM-CSF, et participe au maintien de l'activation de ERK et Akt en réponse à cette cytokine. IEX-1 est aussi exprimée dans les CSH CD34+CD38- puis au cours de la différenciation des mégacaryocytes. Le nombre et la taille des CFC ainsi que la fréquence des LTC-IC sont augmentés lorsque IEX-1 est surexprimée par infection lentivirale dans les cellules CD34+ de sang de cordon ombilical. Des résultats préliminaires montrent que la surexpression de IEX-1 pourrait compenser de façon spécifique l'absence de TPO pour la prolifération des cellules CD34+. Par contre, la surexpression de IEX-1 n'a pas d'effet sur la différenciation mégacaryocytaire. Ces résultats suggèrent que IEX-1 et la famille des PP2A-B56 pourraient jouer un rôle unique dans les capacités de la TPO à maintenir le compartiment des CSH
IEX-1 is an early-response gene involved in survival and proliferation, which is rapidly induced by growth factors, viral infections or chemical carcinogens. IEX-1 was previously isolated as a substrate of the kinase ERK and having a dual role in ERK signaling : IEX-1 acquires anti-apoptotic functions upon phosphorylation by ERK and by binding to active ERK, IEX-1 behaves as a positive regulator of ERK activation, prolonging ERK signal in response to various growth factors. We have elucidated the mechanism by which IEX-1 prolong ERK signal. The major Ser/Thr phosphatase involve in ERK activation is the protein phosphatase 2A (PP2A). It is made of three subunits: the structural (A), the regulatory (B) and the catalytic (C) subunit. IEX-1 binds specifically to the B56 regulatory subunits of PP2A. This association enhances B56 phosphorylation by ERK and trigger dissociation from the catalytic subunit leading to the inactivation of the PP2A. We examine whether IEX-1 could control only the dephosphorylation of associated ERK or have a more general effect on other kinase activities controlled by PP2A. By using IEX-1 surexpression and shRNA targetting IEX-1, we found that IEX-1 had no effect on the phosphorylation of MEK, p38 or JNK, but that it encreased and sustained the activation of the kinase Akt by preventing its dephosphorylation both on in residues the308 and ser473. These similar regulations of Akt and ERK activities by IEX-1 prompted us to examine whether the same mechanism operates on the two pathways. Overexpression of IEX-1 and B regulatory subunit together shows that specifically B56 subunit strongly reduced the capacity of IEX-1 to prolong Akt phosphorylation. This indicates that Akt phosphorylation is controlled by PP2A holoenzyme containing B56 subunits. Next we have explored the mechanism by which IEX-1 prevents the activity of B56 on pAkt. To test that, we use an IEX-1 protein mutated in its ERK binding site, loosing its ability to both bind pERK and to inhibit B56-PP2A activity. This mutant was enable to extained the duration of pAKT signal showing that IEX-1 mediated Akt activation is dependent on its capacity to bind ERK. To confirm this result, we expressed IEX-1 together with ERK1 and ERK2 kinase dead mutant, devoided of catalytic activity. Expression of this mutant reduces the capacity to protect Akt from inactivation. This result indicate that the ability of IEX-1 to encreased ERK mediated phosphorylation of B56 subunit provides a general mechanism leading to inhibition of B56 regulatory subunits containing PP2A enzymes function. IEX-1-mediated ERK-dependent inhibition of B56 containing is responsible for its ability to control both ERK and Akt activation

L’hypophyse contrôle l’ensemble du système endocrinien en intégrant des informations diverses (centrales, périphériques et paracrines). Une bonne coordination des protéines du réseau de signalisation intracellulaire des cellules hypophysaires est le garant du bon fonctionnement de ce système. Au sein de ce réseau, la voie des MAPKinases ERK1/2 apparaît comme un point de convergence et d’intégration des signaux extracellulaires régulant la fonction hypophysaire somatotrope (expression génique, sécrétion hormonale). Les travaux précédents du groupe, réalisés dans la lignée cellulaire somatolactotrope GH4C1, ont permis de montrer (i) l’existence d’un dialogue entre la voie ERK et celle de l’AMPc induite par le récepteur VPAC2 (récepteur du VIP et du PACAP) et son implication dans la régulation du promoteur du gène PRL (ii) le rôle crucial joué par les protéines G monomériques Ras et Rap1 dans le contrôle de la fonction hypophysaire. A voie PI3K est également impliquée dans la régulation de la synthèse et de la libération des hormones hypophysaires. Dans un premier temps, nous nous sommes interessés aux interactions entre la voie ERK et celle de la PI3K. Nous avons mis en évidence dans la lignée cellulaire GH4C1 un dialogue entre ces deux voies impliquant spécifiquement les protéines Rap1 et Raf-1. Le module PI3K/Akt/Rap1/Raf-1 exerce un double effet sur l’activité des MAPK et sur la sécrétion de PRL. La voie PI3K/Akt joue un rôle répresseur en conditions basales non stimulées et activateur dans les cellules stimulées par l’IGF-1. Des anomalies detransduction du signal peuvent aboutir à une situation physiopathologique. Ainsi, des altérations de la voie de l’AMPc sont associées à la pathologie somatotrope. En particulier, l’oncogène gsp, mutant constitutivement actif de la protéine Gsα, est associé à 40% des adénomes somatotropes. Par ailleurs, une surexpression de la protéine Gsα sauvage est retrouvée dans des adénomes n’exprimant pas l’oncogène gsp. Nous avons développé des lignées cellulaires GH4C1 inductibles, afin d’appréhender le rôle des altérations de Gsα dans l’initiation et la progression de la tumorigénèse hypophysaire. L’expression de la protéine Gsα mutée et la surexpression de la protéine Gsα sauvage, qui activent la voie de l’AMPc à des niveaux différents, induisent une activation soutenue de la cascade ERK1/2 de même amplitude. De plus, nous montrons que l’hyperactivation des promoteurs humains de GH et PRL (hGH et hPRL), induite par la protéine Gsα mutée ou surexprimée, est en partie dépendante de l’activation chronique de la voie des MAPKinases ERK1/2 observée dans les deux lignées. Nous avons par la suite recherché en aval de l’oncogène gsp les mécanismes moléculaires responsables de l’hyperactivation des protéines ERK1/2. Nous montrons que l’activation soutenue de la cascade ERK et l’activation chronique du promoteur hPRL sont dépendantes de la voie PKA/AMPc et impliquent également les tyrosine kinases Src. De plus, nous avons observé qu’au cours de la cinétique d’induction de l’oncogène gsp, la sensibilité de réponse au VIP de la cascade ERK et du promoteur hPRL est fortement diminuée, contrairement à celle à l’EGF qui ne semble pas être perturbée. Nous avons également montré que l’expression de l’oncogène gsp induit une activation des protéines Ras et Rap1 et que ces deux GTPases participent conjointement à l’activation chronique de la cascade ERK et du promoteur hPRL. Contrairement à ce qui a été montré dans la physiologie, nous montrons que Ras devient une composante activatrice dans le contrôle de l’activité de ce promoteur dans un contexte physiopathologique, en présence de l’oncogène gsp. L’ensemble de ces travaux montre que la cascade ERK joue un rôle central dans la régulation de la physiologie hypophysaire, mais également dans la physiopathologie somatotrope impliquant des altérations de Gsα. L’un des enjeux de ce travail est d’identifier les partenaires de signalisation des protéines ERK1/2 afin de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques. Au vue de ces résultats, la GTPase Ras apparaît comme un candidat potentiel pour le développement de traitements pharmacologiques plus adaptés à chaque type de tumeur.

Lors de la transition G2/M des ovocytes de Xénope, la voie p39Mos-MEK1-MAPK présente des propriétés dynamiques et physiques particulières telles que l’ultrasensibilité, la bistabilité, l’irréversibilité et un caractère ‘tout-ou-rien’. Ces propriétés sont considérées dans le contexte de la boucle de rétroaction positive qui existe au sein de cette voie. L’objectif de cette thèse s’est focalisé sur le rôle de l’oncoprotéine p39Mos et le recrutement des motifs de régulation qui permettent l’apparition de ces propriétés. Des approches expérimentales et in silico ont été menées pour réaliser une modélisation physiquement et biologiquement réaliste de ce réseau. Le modèle développé tient compte de l’influence du MPF sur l’accumulation de p39Mos et ajuste le rôle de la boucle de rétrocontrôle positif. Par ailleurs, nous avons pu mettre en évidence que p90Rsk, cible des MAPK, est dégradée. La voie MAPK a été activée en absence de p39Mos. Nos résultats montrent que la 1,10 Phénanthroline monohydrate (1,10-PA) active les MAPK suivant une réponse graduelle et ultrasensible. L’action de la 1,10-PA s’exerce en absence de synthèse protéique et de toute boucle de rétrocontrôle, et nous avons émis l’hypothèse que la 1,10 PA agit via l’inactivation d’une MEK-phosphatase. Dans ce contexte, un modèle de pro-action est discuté et des inhibiteurs de phosphatases ont été utilisés pour activer les MAPK en absence de p39Mos. Nos résultats discutent du rôle de la boucle de rétroaction positive dans l’activation des MAPK et montrent que l’ultrasensibilité de réponse des MAPK peut être générée par des motifs de régulation de type pro-action
During G2/M transition in Xenopus oocyte, p39Mos-MEK1-MAPK cascacade harbors specific dynamic and physical properties, such as ultrasensitivity, bistability, irreversibility, and all-or-none responses. These properties are generally considered in the context of the positive feedback loop that embeds the p39Mos-MEK1-MAPK pathway architecture. The objective of this work was focused onto p39Mos oncoprotein and regulation motifs recruitment enabling together the generation of such properties. Both experimental and in silico approaches were undertaken in order to yield a realistic modelisation, physically and biologically relevant for this network. We developed a model that takes into account the influence of MPF onto p39Mos accumulation, and adjusts the role of the positive feedback loop. Also, we were able to show that p90Rsk, target of MAPK, was degraded. This signaling pathway was activated in the absence of p39Mos. Our results show that 1,10 Phénanthroline monohydrate (1,10-PA) is able to induce gradual and ultrasensitive MAPK activation. 1,10-PA action is then exerted in the absence of protein synthesis and positive feedback loop. In this context, a feed forward loop model can be considered, and phosphatase inhibitors were used for MAPK activation in the absence of p39Mos. Our results confront the role attributed to the positive feedback loop in MAPK activation, and show that this ultrasensitive response may be generated in vivo through feed forward regulation motifs

En modulant en permanence une production d’insuline adaptée au besoin de l’organisme, la cellule béta pancréatique joue un rôle crucial dans l’homéostasie glucidique. L’adaptation de cette production d’insuline est l’opération d’une machinerie cellulaire responsable de la production de l’insuline hautement adaptative et d’une augmentation de la masse des cellules bêta-pancréatiques. Cette plasticité des cellules béta est particulièrement critique dans des périodes de modifications de la physiologie de l’organisme, telles que la prise de poids, la grossesse ou le développement du nouveau-né jusqu’au sevrage. Une perte de la fonctionnalité et de la masse des cellules béta sont à l’origine du diabète, une des causes principales de mortalité dans le monde.Chez les vertébrés, les sérine-thréonine kinases (STKs) dirigent des voies de signalisation importantes permettant aux cellules de répondre à l’environnement. L’objectif de ma thèse a été d’identifier les voies de signalisation responsables du développement de la masse de cellules bêta à la naissance, au cours de la grossesse et de l’obésité, afin de mieux comprendre le dysfonctionnement et la perte de la masse des cellules béta induite par l’environnement diabétogène (ex : LDL-oxydées, hyperglycémie, hyperlipidémie,..) du patient diabétique. En étudiant la plasticité des cellules béta des rats nouveau-nés, nous avons découvert une élévation importante de l’expression de la protéine Dual Leucine Zipper Kinase (DLK) dans les îlots des rats nouveau-nés de 10 jours lorsqu’ils sont comparés aux îlots des rats adultes. Dans les îlots des ratons, l’augmentation de l’expression de DLK coïncide avec une très forte prolifération des cellules béta et l’activation de la signalisation «cJun-amino terminal Kinase 3» (JNK3), une STK de la famille des «mitogen activated protein kinase» (MAPKs). Comme observé pour DLK, dans les îlots des ratons, l’invalidation de JNK3, réduit considérablement le nombre de cellules sécrétrices de l’insuline. Nous avons aussi observé que les MAPKs sont directement impliquées dans la mort des cellules béta induite par des LDL-oxydées via un mécanisme cellulaire impliquant le stress du réticulum endoplasmique et le stress oxydant. Nos résultats montrent l’importance de la signalisation des MAPKs dans le contrôle de la survie et de la prolifération des cellules béta et de son implication dans le diabète
Pancreatic beta cell constantly tunes insulin production to meet the body needs. The insulin production adaptation is achieved thanks to highly adaptive beta cell metabolism, signaling, secretory machinery and mass. The beta-cell function and mass plasticity are particularly critical during nutritional, body growth and physiological changes such as obesity, pregnancy and postnatal development of newborn. Functional beta cell demise account for diabetes is one of the leading causes of death worldwide.In vertebrates, serine-threonine kinases (STKs) drive key signaling pathways for adaptive cells response to the environment. The overall goal of the thesis was to identify the signaling pathways responsible for the development of beta cell mass during postnatal development, pregnancy and obesity. Identification of these signaling pathways may help in understanding the functional beta cell mass demise induced by the diabetogenic environment (e.g oxidized LDL, hyperglycemia, hyperlipidemia, etc.) in diabetic patients. By investigating beta cell mass plasticity in 10 day old neonate rats, we found a significant increase in the expression of Dual Leucine Zipper Kinase (DLK) protein when compared to islets from adult rats. In islets of pups, the increase of DLK expression coincides with a very high proliferative rate of beta cells and activation of "cJun-amino terminal Kinase 3" (JNK3) signaling, an STK belonging to “mitogen activated protein kinase” (MAPKs) family. As observed for DLK, in islets of rat pups, the genetic disruption of JNK3 drastically reduces the number of beta cells leading to glucose intolerance. Finally, we also observed that MAPKs link oxidized LDL to beta cell death via mechanisms involving endoplasmic reticulum stress and oxidative stress. Our results show the critical importance of MAPK signaling in controlling beta cell survival and proliferation in response to physiological condition and diabetes

Le récepteur 2C de la sérotonine (récepteur 5-HT2C) est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) principalement exprimé dans le système nerveux central qui joue un rôle majeur dans les états anxio-dépressifs. Il est également la cible de nombreux composés thérapeutiques incluant la plupart des classes d'antidépresseurs. Le récepteur 5-HT2C interagit avec de nombreuses protéines intracellulaires différentes des protéines G. Celles-ci incluent les arrestines et la calmoduline (CaM). J'ai démontré que l'activation de la cascade des MAP kinases ERK1,2 par le récepteur 5-HT2C était indépendante des protéines G auxquelles il est couplé mais requérait les β-arrestines1,2 et la CaM. L'association physique de la CaM, au domaine C-terminal (motif 1-10 localisé à la région juxtamembranaire) du récepteur 5-HT2C est essentielle à cette signalisation dépendante de la β-arrestine. Mes travaux démontrent également que la CaM favorise le recrutement de la β-arrestine au récepteur 5-HT2C pour former un complexe protéique incluant probablement le récepteur 5-HT2C, un dimère de CaM et la β-arrestine. Le rôle de la CaM dans la signalisation indépendante des protéines G a été établi non seulement dans un système d'expression hétérologue (cellules HEK-293) mais également dans des contextes cellulaires authentiques (neurones corticaux, cellules épithéliales choroïdiennes). La régulation de cette cascade par l'activité constitutive du récepteur et différentes classes d'antidépresseurs (tricycliques, tétracycliques, ISRS, dérivés du mCPP) a enfin été étudiée.

Ces travaux de thèse ont montré que la protéine ERK5 joue un rôle clé dans deux processus importants de la tumorigenèse qui sont le changement de métabolisme et la diminution de l'expression du complexe MHC-I. En effet, un des moyens qu'utilisent les cellules tumorales pour échapper à la réponse immune est la diminution de l'expression du MHC-I. D'autre part, les cellules cancéreuses changent leur métabolisme cellulaire en produisant plus d'ATP par la fermentation au lieu de la respiration en condition de normoxie : c'est ce qu'on appelle l'effet Warburg. Nous avons montré que le métabolisme cellulaire régule l'expression d'ERK5, qui va réguler l'expression du MHC-I. L'expression d'ERK5 est induite, quand la respiration est imposée, et l'expression du MHC-I est augmentée. D'autre part, nous avons montré qu'ERK5 régule l'expression du MHC-I au niveau transcriptionnel en contrôlant ses deux chaînes : la chaîne lourde et sa chaîne légère, la β-2m. L'établissement d'une lignée stable exprimant un shRNA dirigé contre la protéine ERK5 (shERK5) nous a permis d'élaborer une stratégie thérapeutique pour traiter les leucémies. Les cellules leucémiques shERK5 ne forment pas de tumeurs in vivo et sont rapidement éliminées, après injection chez la souris, par le système immunitaire inné. En effet, la diminution de l'expression d'ERK5 induit la diminution d'expression du MHC-I, ce qui va rendre ces cellules très sensibles aux cellules Natural Killer. Nos résultats nous laissent penser qu'ERK5 est une bonne cible thérapeutique pour traiter les leucémies.

L'hypothèse selon laquelle il serait possible de supprimer le phénotype transformé de cellules tumorales, en induisant leur différenciation, a été validée dans un modèle ex vivo, développé au laboratoire. Nous avons montré que l'activation constitutive de la voie Notch, impliquée dans la différenciation de la rétine, supprimait la transformation des cellules de neurorétine de caille, induite par l'oncoprotéine v-Src (QNR/v-src). Cette réversion phénotypique est corrélée avec la perte du caractère indifférencié de ces cellules et leur engagement dans la différenciation gliale. Elle résulte de la modulation, par la signalisation Notch, des voies de signalisation JNK et Rho/Rac GTPAses, essentiellement impliquées dans le contrôle de la morphologie et l'organisation du cytosquelette. Cette réversion phénotypique est, au moins partiellement, due à un mécanisme auto/paracrine. En effet, les cellules, ayant réverté vers un phénotype normal, sécrètent un facteur capable d'inhiber la transformation des cellules QNR/v-src. La comparaison du transcriptome des cellules QNR/v-src et QNR/v-src/Notch a mis en évidence l'augmentation des messagers codant le ligand TGFβ3 dans les cellules QNR/v-src/Notch. Cette augmentation est associée à une activation de la signalisation TGF-β dans ces cellules. Des expériences d'activation de la signalisation TGF-p dans les cellules QNR/v-src par une protéine TGFβ3 recombinante ou d'inhibition chimique de cette voie dans les cellules QNR/v-src/Notch ont montré que la signalisation TGF-β est impliquée dans la restauration d'une morphologie normale et la réorganisation du cytosquelette mais aussi dans la mise en place des programmes de différenciation
Understanding how disruption of differentiation contributes to the cancer cell phenotype is required to identify alterations essential for malignant transformation and provide experimental basis for their correction. We have been using quail neuroretina cells transformed by v-Sr6 (QNR/v-src), as an ex vivo model to study this question. We report that stable activation of Notch signalling, which is involved in retina differentiation, suppresses v-Src-induced transformation of QNR cells. This phenotypic reversion coincides with a major switch in cell identity, since these undifferentiated cells acquire glial differentiation traits. Cells restored to a normal and differentiated phénotype hâve undergone changes in the functioning of JNK and Rho/Rac GTPases pathways, which essentially regulate cell morphology and cytoskeleton organization. This phenotypic reversion is partially mediated by an auto/paracrine mechanism, since revertant cells secrete a factor, which inhibits transformation properties of QNR/v-src cells. Transcriptome anlaysis revealed an increase of TGFβ3 RNA in QNR/v-src/Notch cells. This increase is associated with an activation of TGFβ signalling in these cells. Treatment of QNR/v-src cells with a TGFβ3 recombinant protein or chemical inhibition of TGFβ signaling in QNR/v-src/Notch showed that TGFβ signalling is involved in restoration of normal morphology and cytoskeleton organization but also, in part, in commitment to glial differentiation

Les deux aspects essentiels de la mémoire sont la formation de la trace et la rétention du souvenir à long terme. Afin de comprendre ces processus, nous avons étudié leur mise en place au cours de l'ontogenèse. Chez le raton, nous avons montré que : 1) ERK1/2 et la synthèse de nouvelles protéines sont nécessaires à la consolidation et reconsolidation dès 3 jours postnatals ; 2) les cinétiques de stabilisation de la mémoire raccourcissent au cours du développement post-natal ; 3) une mémoire précoce peut s'inverser avec l'âge ; 4) la capacité de rétention à très long terme apparaît pendant une période critique (une semaine avant le sevrage). Il semble donc que la mémoire précoce implique des mécanismes moléculaires similaires à ceux observés chez l'adulte, mais sa dynamique évolue au cours du développement post-natal.

La réussite de la thérapie cellulaire à l'aide des cellules souches embryonnaires, nécessite une bonne compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent leur différenciation. Une des voies de signalisation, impliquée dans le contrôle de la différenciation des cellules souches, est la voie p38MAPK. Dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la différenciation précoce des cellules ES, nous avons réalisé un criblage sur puces à ADN. Les résultats du criblage ont montré que certains gènes régulés différentiellement, comme le gène Bcl2, sont des cibles communes de p38MAPK et de p53. En plus de son rôle de répresseur de tumeur, p53 a été impliqué dans le développement embryonnaire et dans la biologie des cellules ES. Ainsi, il est connu que p53 agit comme un répresseur du gène de pluripotence, Nanog. Il est également connu que p53 interfère avec le processus de reprogrammation des cellules adultes ; et que son activité transcriptionnelle augmente avec l'entrée des cellules ES en différenciation. En revanche, son rôle dans la différenciation et dans la formation des différents lignages issus des cellules ES, reste inconnu. Nous avons trouvé que le traitement des cellules ES sauvages avec l'inhibiteur spécifique de p53, la pifithrine-α, durant le processus de différenciation, inhibe les lignages mésodermiques, et à l'inverse, stimule la neurogenèse. De plus, la transfection transitoire des cellules ES avec des siRNAs spécifiques, dirigés contre p53 ainsi que l'utilisation des cellules ES déficientes pour le gène p53, montrent que l'absence de p53, affecte les lignages cardiaques, du muscle lisse et du muscle squelettique
Embryonic stem cells (ESCs) differentiate in vitro into all cell lineages. We previously found that p38MAPK controls two independent successive steps during the early mesodermal commitment of ESCs. The first one is Brachyury dependent, a master gene of mesoderm formation whereas the second one is not. In order to understand the molecular mechanism implicated in the second step, we treated ESCs with the p38 specific Inhibitor PD169316 and performed microarray experiments on mRNAs extracted from treated versus untreated cells. Our results show that many regulated genes are common targets of p38MAPK and p53 transcription factor. In addition to its role as a tumor suppressor and cell cycle checkpoint control, p53 has been involved in embryonic development, but its role in ESC differentiation is still unknown. We found that treatment of wild type ESCs with the p53 specific inhibitor pifithrin α during the differentiation process inhibits mesodermal lineages and, by contrast, stimulates neurogenesis. Likewise, ESCs Transfected with p53 siRNAs and p53 KO ESCs show an inhibition of cardiac, endothelial, smooth muscle and skeletal muscle lineage formation. Furthermore, p38MAPK inhibition by PD169316 for 24h induces a strong decrease of p53 protein level. Our results suggest that p53 mediates the p38MAPK control of the commitment of ESCs towards mesodermal lineages. The involvement of the various p53 isoforms in this process will be discussed

A travers l'évolution, les agents pathogènes ont développé des stratégies leur permettant de survivre au sein de leur hôte en interférant avec la biogénèse des phagolysosomes. Comme C. burnetii vit dans un phagosome acide incapable de fusionner avec les lysosomes et que sa virulence est associée à l'expression de son LPS, nous avons étudié le rôle du LPS de C. burnetii dans le détournement de la conversion phagosomale. En effet, nous avons montré que C. burnetii virulent ainsi que son LPS se localisent dans des compartiments Lamp-1+ qui n'acquièrent pas la CathepsineD et Rab7 n'est pas recruté à leur surface. Contrairement au LPS du variant avirulent de C. burnetii, qui est localisé dans les lysosomes, le LPS de C. burnetii virulent (vLPS) n'induit pas l'activation de la MAPKinase p38, empêche le recrutement de Rab7 à la surface des compartiments en déstabilisant le complexe HOPS. Finalement, nous avons démontré que la bactérie virulente exprimant le vLPS détourne la conversion phagosomale pour survivre et pour se multiplier dans les macrophages en évitant l'activation de l'axe MAPK-p38/Vps41-HOPS. Nous avons également étudié les mécanismes permettant à Tropheryma whipplei, l'agent de la maladie de Whipple, de se répliquer dans les macrophages puisque les macrophages sont la cible in vivo de cette bactérie. Nous avons montré que T. whipplei bloque la conversion de son phagosome
Through evolution, pathogens have developed strategies to survive within their host by interfering with the biogenesis of phagolysosomes. As it is known that C. burnetii lives in acidic phagosome which is unable to fuse with the lysosomes and that its virulence is associated with the expression of LPS, we studied the role of C. burnetii LPS in hijacking of phagosomal conversion. Indeed, we showed that the virulent C. burnetii and its LPS are located in Lamp-1+ compartments which do not acquire CathepsineD and Rab7 is not recruited to their surface. Contrary to LPS of avirulent C. burnetii, which is located in the lysosomes, the LPS of virulent C. burnetii (vLPS) does not induce activation of the p38 MAPKinase and it prevents the recruitment of Rab7 to the surface of compartments by destabilizing the HOPS complex. Finally, we demonstrated that virulent bacteria expressing virulent LPS hijack phagosomal conversion to survive and multiply in macrophages by preventing activation of p38-MAPK/Vps41HOPS axis. We also studied the mechanisms by which Tropheryma whipplei, the agent of Whipple's disease, replicates in macrophages, which are its target in vivo. We have shown that T. whipplei blocks the conversion of its phagosome. Indeed, after purification of phagosomes containing-T. whipplei, we observed by Western blot and confocal microscopy that T. whipplei survives in an immature phagosome with characteristics of both early and late phagosomes (presence of Rab5 and Rab7) making it unable to fuse with lysosomes. As the IL-16 is known to induce replication of T. whipplei, we studied the effect of this cytokine on the phagosome biogenesis of T. whipplei

Pour survivre et se multiplier dans leurs cellules hôtes les bactéries intracellulaires ont élaboré divers mécanismes d'échappement à la réponse immunitaire. L’altération du trafic intracellulaire est une des stratégies utilisée par ces agents pathogènes. Ainsi Coxiella burnetii, bactérie intracellulaire stricte responsable chez l’homme de la fièvre Q, bloque la maturation du phagosome afin de résider et se multiplier dans un compartiment incapable de fusionner avec les lysosomes. Ce défaut de fusion est associé à la virulence bactérienne. Pour analyser le défaut de maturation du phagosome de C. burnetii, j’ai étudié le rôle du lipopolysaccharide (LPS) de C. burnetii dans le trafic intracellulaire de cette bactérie. J’ai montré que le LPS de C. burneti, unique par sa structure, ne permet pas l’activation de la MAPKinase p38α, entrainant un défaut dans le recrutement du complexe HOPS (homotypic fusion and vacuole protein sorting complex) nécessaire à la conversion phagosomale. J’ai en effet montré que le recrutement du complexe HOPS requiert la phosphorylation de la protéine Vps (vacuolar protein sorting) 41. La transfection de macrophages permettant la surexpression d’un activateur de p38 et l’utilisation de mutants phosphomimétiques de Vps41 ont montré une restauration de la conversion phagosomale. Il apparaît ainsi que la MAPK-p38α et son dialogue avec Vps41 jouent un rôle central dans la maturation du phagosome de C. burnetii en phagolysosome. L’utilisation de la structure atypique de son LPS permet ainsi à C. burnetii de se soustraire à la réponse protectrice de l'hôte
To survive and replicate in their host, microbes have evolved several strategies to hijack the microbicidal properties of the immune cells. C. burnetii, the q fever agent, survive and replicate in macrophages through the alteration of the phago-lysosome biogenesis. To further analyze the nature of the defect phagosome maturation of C. burnetii, I studied the role of lipopolysaccharide (LPS) of C. burnetii in the intracellular trafficking of the bacteria. The LPS is unable to activate the p38α MAPKinase, which explains that the virulent bacteria are not directed to a degradative compartment . The lack of activation of the p38α MAPKinase , which involves a commitment TLR4 antagonist by LPS, has the effect of preventing the recruitment of the HOPS complex ( homotypic fusion and vacuole protein sorting complex) , a complex require for the phagosomal conversion. I have shown that the recruitment of HOPS requires phosphorylation of protein Vps (vacuolar protein sorting) 41. Transfection of macrophages by an activator of p38 and using phosphomimétiques mutants VPS41 showed restoration of phagosome maturation. It thus appears that the p38α MAPK and his dialogue with VPS41 play a central role in phagosome maturation of C. burnetii in the phagolysosome. Use of the unique structure of the LPS allows C. burnetii to evade the protective response of the host

La thérapie cellulaire représente une alternative intéressante aux approchespharmacologiques dans le cadre de certaines pathologies comme les dystrophiesneuromusculaires ou l’ischémie du myocarde. La transplantation de précurseurs adultes deces tissus peut améliorer ces pathologies. Toutefois, le faible nombre de ces précurseursdans l’organisme et la difficulté de leur culture et expansion in vitro sont des facteurslimitants. Grâce à leurs propriétés spécifiques, les cellules souches embryonnaires (ES)constituent une source alternative pour la thérapie cellulaire. Cependant, leur efficacité dedifférenciation dans un lignage donné doit être finement contrôlée avant de pouvoir lesutiliser avec succès.Afin de mieux connaître le potentiel thérapeutique des cellules dérivées de cellulesES, il est essentiel de caractériser les mécanismes moléculaires qui engagent les cellules ESvers différents lignages. Nous nous sommes plus particulièrement intéressés à la voie designalisation p38MAPK, qui est largement impliquée dans la différenciation cellulaire et lasurvie cellulaire. Nous avons plus précisement étudié l’implication de p38MAPK au coursdes différenciations endothéliale, du muscle lisse et du muscle squelettique.Nous avons mis en évidence que les cellules ES p38!-/- ne se différencient plus encellules endothéliales, en cellules du muscle lisse et en cellules du muscle squelettique. Laré-expression de p38MAPK dans ces cellules restaure partiellement les différenciationsdérivées du mésoderme (les différenciations endothéliale, du muscle lisse,cardiomyocytaire et de muscle squelettique). Parallèlement grâce à une inhibitionspécifique de la voie p38MAPK au cours de la différenciation des cellules ES, nous avonsmontré que la voie p38MAPK agit via deux mécanismes moléculaires distincts successifspour réguler la différenciation mésodermique des cellules ES. Le premier mécanisme estcorrèlé à l’expression de Brachyury, un marqueur précoce du mésoderme, alors que lesecond mécanisme est indépendant de Brachyury.Nous avons ensuite poursuivi l’étude de l’implication de p38MAPK dans lamyogénèse des cellules ES et nous avons pu mettre en évidence que p38MAPK estnécessaire à la fois pour l’engagement précoce et la différenciation terminale des cellulesmusculaires.En combinant des approches biochimiques et génétiques, nous avons démontré que lavoie de signalisation p38MAPK est nécessaire très précocement à la différenciation deslignages issus du mésoderme.Ces résultats permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculairesimpliqués dans la différenciation des cellules ES, ce qui constitue une étape préalable ausuccés de futures thérapies cellulaires
Embryonic stem (ES) cells give rise, in vivo, to all of the three germ layers and, invitro, to differentiate into a broad variety of cell lineages which opens up largeperspectives in regenerative medicine. We previously found that the p38MAPKpathway controls the commitment of ES cells toward either cardiomyogenesis (p38on) or neurogenesis (p38 off ). In this study, we show that p38a knock-out ES cellsdo not differentiate into cardiac, endothelial, smooth muscle, and skeletal musclelineages. Reexpression of p38MAPK in these cells partially rescues theirmesodermal differentiation defects and corrects the high level of spontaneousneurogenesis of knock-out cells. Wild-type ES cells were treated with a p38MAPKspecificinhibitor during the differentiation process. These experiments allowed us toidentify 2 early independent successive p38MAPK functions in the formation ofmesodermal lineages. Further, the first one correlates with the regulation of theexpression of Brachyury, an essential mesodermal-specific transcription factor, byp38MAPK. Moreover, we also showed that p38MAPK is required for the late stageskeletal muscle differentiation. In conclusion, by genetic and biochemicalapproaches, we demonstrate that p38MAPK activity is essential for the commitmentof ES cell into cardiac, endothelial, smooth muscle, and skeletal muscle mesodermallineages

Les cascades de Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) sont présentes chez tous les eucaryotes et permettent la transduction des signaux de l’extérieur vers l’intérieur de la cellule. Chez les végétaux, elles sont très abondantes et actives dans une multitude de processus, autant lors de la réponse aux stress que lors du développement. Elles fonctionnent comme un système de phosphorelais, se transférant un groupement phosphate d’une protéine à l’autre, de la MAPKKK à la MAPKK (MKK), puis de la MKK à la MAPK (MPK) et finalement, de la MPK vers des facteurs de transcription ou toute autre protéine qui permettra un changement au niveau de la réponse cellulaire. Depuis quelques années, plusieurs membres de la grande famille des MAPKs ont été étudiés pour leur rôle dans la reproduction sexuée des végétaux. Des mutants ont été caractérisés, mais jusqu’à maintenant, peu de voies complètes ont été décelées. Des précédents travaux dans le laboratoire ont démontré que deux MAPKKKs, de la sous-famille des MEKKs, ScFRK1 et ScFRK2, sont importantes pour le développement normal de l’ovule et du pollen chez Solanum chacoense, une espèce de pomme de terre sauvage diploïde. Sachant que les mutants des gènes les plus orthologues chez Arabidopsis thaliana ne possèdent pas les mêmes phénotypes, nous avons émis l’hypothèse que les Solanacées, du moins S. chacoense, possèdent une famille de MAPKKKs différente, qui n’est pas présente chez A. thaliana. Nous avons donc analysé les génomes/transcriptomes/protéomes de 15 espèces issues de différents clades du règne végétal afin d’étudier les relations phylogénétiques à l’intérieur de la sous-famille des MEKKs. Cela nous a permis d’observer que ScFRK1 et ScFRK2 ne sont pas seuls, mais sont inclus dans un groupe monophylétique que nous avons nommé la classe des FRKs (FRK pour Fertilization-Related Kinase). De plus, nous avons observé une expansion considérable de cette classe chez les Solanacées, comparativement à d’autres dicotylédones comme le peuplier, la vigne ou le coton. La classe des FRKs est absente chez les monocotylédones étudiées (riz et maïs) et ne possède qu’un seul membre (une FRK primitive) chez l’angiosperme basal Amborella trichopoda. Cette analyse phylogénétique des MEKKs nous a poussés à nous poser des questions sur l’origine de la classe des FRKs ainsi que sur son rôle au sein des Solanacées. Dans un deuxième temps, nous avons fait la caractérisation fonctionnelle de ScFRK3, un troisième membre de la classe des FRKs chez S. chacoense, aussi impliqué dans le développement des gamétophytes mâle et femelle. Du patron d’expression jusqu’à l’établissement d’une voie de signalisation potentielle, en passant par la caractérisation phénotypique des mutants, plusieurs expériences ont été réalisées dans le but de comprendre le rôle de ScFRK3 au niveau de la reproduction chez S. chacoense. Dans un contexte plus global, il est important de se questionner sur les rôles semblables, mais forcément différents, des trois membres de la famille FRKs qui ont été caractérisés jusqu’à présent.
Mitogen-Activated Protein Kinases (MAPKs) signaling cascades are found in all Eucaryotes and allow signal transduction from the outside of the cell to the inside. In plants, they are particularly numerous and play roles in several signaling processes, including stress responses and response to developmental cues. Their system involves a phosphorelay: they interact with each other to transfer a phosphate group. It starts with an activated MAPKKK, which transfers the phosphate group to a MAPKK (MKK), then this MKK transfers the signal to a MAPK (MPK), which ends this relay by phosphorylating transcription factors or any other proteins that will, in a way or an other, change the cell response according to the signal. During the last few years, many MAPKs members have been studied for their role in plants sexual reproduction. Some mutants were characterized, but until now, our knowledge of complete signaling cascades is very limited. Previous studies in our lab have shown that two MAPKKKs from the MEKK subfamily, ScFRK1 and ScFRK2, are important for male and female gametophytes development in Solanum chacoense, a wild diploid potato species. Genes that are the most orthologous to ScFRK1 and ScFRK2 in Arabidopsis thaliana, AtMAPKKK19, 20 and 21, do not seem to play the same roles in reproduction, which led us to make the hypothesis that in solanaceous species, at least in S. chacoense, there is one MAPKKK family that is different and not present in A. thaliana. At first, we did analyze the genomes/transcriptomes/proteomes of 15 species from different clads of the plant kingdom to find all the members of the MEKK subfamily of MAPKKKs in order to study their phylogenetic relationship. We then observed that ScFRK1 and ScFRK2 are included in a large monophyletic group which was called the FRK class (Fertilization Related Kinase). Moreover, we also observed that this class has considerably expanded within the solanaceous species, compared to other species like A. thaliana, poplar, cotton or grape vine. The FRK class is totally absent in the monocot species studied (rice and maize) and only one member is found in the basal angiosperm Amborella trichopoda. This phylogenetic analysis led us to ask questions about the origins of the FRK class and its role inside the Solanaceae family. Secondly, we characterized ScFRK3, a third member of the FRK class in S. chacoense, which is also involved, as its two FRK sisters, in male and female gametophytes development. From its expression pattern to the establishment of a potential signaling cascade, analysis and phenotyping of ScFRK3 mutant lines, many experiments were realized in order to understand the role of ScFRK3 in S. chacoense sexual reproduction. Overall, the appearance of this new and expanded class of MEKKs questions its specific role in comparison to other species that have much lesser members, mainly when compared to the model plant A. thaliana, which harbor only a fifth of the FRKs found in solanaceous species.

La mycotoxine déoxynivalénol (DON) et son métabolite déépoxy-déoxynivalenol (DOM-1) ont des effets significatifs sur la modification de la fonction des cellules thècales de l’ovaire bovin. L'objectif de cette étude était d'identifier les différentes voies de signalisation impliquées dans le mécanisme d'action de DON et DOM-1 par la spectrométrie de masse. Méthodes: Les cellules thécales de l'ovaire bovin ont été récoltées à partir des vaches adultes, indépendamment du stade du cycle œstral, et ont été cultivées à une densité de 500000 cellules viables dans 1 ml de milieu de McCoy pendant 5 jours. Les cellules ont ensuite été traitées au jour 5 de la culture avec 1 ng/ml de DON ou DOM-1 pendant 30 minutes et des échantillons cellulaires de protéins totales ont été préparés pour spectrométrie de masse. Résultats: la spectrométrie de masse a montré que DON et DOM-1 induisent une surexpression simultanée de ERK1/2, MAPK14 (p38alpha) et MAPK13 (p38delta). La spectrométrie de masse a également indiqué que 94 peptides ont été surexprimés tels que GNGT1, EDN1 et YWHAB. Ils régulent la plupart des voies de prolifération des cellules et sont impliqués dans la biosynthèse des lipides et des glucides. Néanmoins, 255 peptides ont été régulés à la baisse, tels que CALR3, PTGES3, RAD21, ACVR2B et TGFBR1 dont leurs activités sont principalement l'activation ou la désactivation des processus apoptotiques, et le métabolisme du glucose et de la choline. Nos résultats montrent que DON et DOM-1, à une dose de 1 ng/ml, ont le potentiel de stimuler la surexpression de MAPK distinctes et réguler négativement les voies de signalisation spécifiques qui stimulent la prolifération les cellules de la thèque de l’ovaire de bovin.
The mycotoxin deoxynivalenol (DON) and its metabolite deepoxy-DOM-1 have significant effects on bovine ovarian theca cell function. The objective of this study was to identify different signaling pathways involved in the mechanism of action of DON and DOM-1 by mass spectrometry. Methods: bovine ovarian theca cells were harvested from adult cows independently of the stage of the estrous cycle, and were cultured at a density of 500000 viable cells in 1 ml McCoy’s medium for 5 days. The cells were then treated on day 5 of culture with 1 ng/mL DON or DOM-1 for 30 minutes and total cell protein was collected for mass spectrometry. Results from mass spectrometry showed that both DON and DOM-1 induce simultaneous upregulation of ERK1/2 , MAPK14 (p38alpha) and MAPK13 (p38delta). Mass spectrometry also indicated that 94 peptides such as GNGT1, EDN1 and YWHAB were upregulated. They mostly regulate cell proliferation pathways and are involved in biosynthesis of lipid and carbohydrates. Nevertheless, 255 peptides such as CALR3, PTGES3, RAD21, ACVR2B and TGFBR1 were downregulated whose activities are mainly activation or deactivation of apoptotic processes, and glucose and choline metabolism. Our findings show that both DON and DOM-1 at least at a low dose (1 ng/ml) have the potential to stimulate upregulation of distinct MAPKs and downregulate specific signaling pathways that stimulate bovine ovarian theca cell proliferation.

Les opioïdes sont les analgésiques les plus efficaces mais leur utilisation est limitée par la tolérance, un processus lié en partie à la désensibilisation des récepteurs. Le rôle de la présente étude était de mieux caractériser le processus de désensibilisation des récepteurs et plus particulièrement, d’étudier le rôle de la tyrosine kinase Src sur la régulation de la signalisation des récepteurs delta opioïdes. Nos résultats démontrent que l’inhibition pharmacologique avec PP2 (à faible concentration : 20- 40µM) ou encore l’inhibition moléculaire de la kinase avec de faibles concentrations d’ADN d’un mutant dominant inactif de Src (0,2µg/ml) potentialise l’amplitude et la durée de l’activation de la cascade ERK lorsqu’un agoniste, DPDPE (1µM; 5 min), se lie aux récepteurs. Nous avons également démontré que de fortes concentrations d’inhibiteurs de Src (80 et 100µM de PP2 ou 1µg/ml d’ADN du mutant dominant négatif) bloquent la cascade des MAPK suivant la stimulation de DOR par l’agoniste DPDPE. Ces observations indiquent que Src a un effet biphasique sur l’activité de ERK : l’inhibition complète de Src inhibe l’activité de la cascade MAPK alors qu’une inhibition modérée potentialise cette même cascade. Nous pensons aussi que de fortes concentrations des bloqueurs de Src interfèrent avec l’activation de ERK alors que de faibles concentrations interfèrent avec la désensibilisation des récepteurs. Cette possibilité a été testée à l’aide d’essais d’accumulation d’AMPc qui visaient à évaluer l’effet des bloqueurs de Src (PP2, 20 µM; 1h) sur la désensibilisation induite par un agoniste. L'activation de DOR par DPDPE inhibe la production d’AMPc, préalablement stimulée par du forskolin, de façon dose-dépendante. Le maximum d'inhibition observé est de 61%, mais lors d’un prétraitement au DPDPE (1 µM, 30 min) l’inhibition maximale est réduite à 72% de l’inhibition initiale observée. Cependant, un prétraitement des cellules au PP2 (20µM pendant 1 heure) avant d’effectuer la désensibilisation protège contre cette désensibilisation. L’effet protecteur des bloqueurs de Src n’entraîne pas de changement au niveau de l’internalisation des DOR mais l’altération de leur internalisation via un mutant tronqué du DOR ou via un milieu sucré hypertonique (0.4M de saccharose) réduit cette protection. Ces données suggèrent alors que l’internalisation optimale du récepteur est nécessaire pour que l’effet protecteur prenne place. Nous concluons donc que Src contribue à la désensibilisation de DOR après que l’internalisation du DOR soit survenue.
Opioids are the most effective analgesics available but their use is limited by tolerance. Tolerance is related, at least in part, to receptor desensitization. Hence, the role of the present study was to better characterize the desensitization process, in particular concerning the role of the tyrosine kinase Src on regulation of delta opioid receptor signalling. Our results show that pharmacological inhibition with PP2 (administered at low concentration: 20-40µM) or molecular inhibition of the kinase with low expression levels of a dominant negative mutant of Src (0,2µg of DNA) potentiate the magnitude and duration of agonist-dependent (DPDPE; 1µM; 5 min) activation of the ERK pathway. We also showed that higher concentrations of Src inhibitors (80 and 100µM of PP2 or 1µg/ml of dominant negative mutant DNA) block the MAPK cascade following DOR stimulation by DPDPE. These observations indicate that Src has a biphasic effect on ERK activity, respectively potentiating or inhibiting agonist stimulation of the MAPK cascade at low and high levels of Src inhibition. We reasoned that high levels of Src blockers were interfering with ERK activation mechanism while low levels of inhibition were interfering with receptor desensitization. This possibility was tested by using cAMP accumulation assays to evaluate the effect of Src blockers (PP2, 20 µM; 1h) on agonist-induced desensitization. DOR stimulation by DPDPE inhibited forskolin stimulated cAMP production in a dose dependent manner with a maximal reduction of 61%. This inhibitory response was reduced by 72% following pre-exposure to DPDPE (1 µM, 30 min), an effect that was blocked by pre-treating cells with PP2 (PP2, 20 µM; 1 h) before desensitization. The protective effect of Src blockers did not involve changes in DOR internalization but interfering with internalization by using an internalization-deficient DOR mutant or hypertonic medium (0.4M sucrose) reduced this protection, indicating the need for optimal internalization in order for the protective effect of Src blockers to take place. Based on the latter observation it was possible to conclude that Src contribution to DOR desensitization is post-endocytic.