Dissertations / Theses: 'Mitosom'

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Cortez, Beatriz de Araujo. "Interação da crisotila com células de carcinoma de pulmão humano em cultura: interferência com a mitose utilizando genes repórteres e microscopia em tempo real e estudo do potencial genotóxico." Universidade de São Paulo, 2010. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-05042010-134617/.

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Abstract:

Asbesto é um nome geral dado a seis tipos de fibras minerais encontradas naturalmente na crosta terrestre. Estas fibras vêm sendo exploradas industrialmente desde 1970, porém diversos trabalhadores expostos às fibras apresentaram patologias no trato respiratório, como fibroses e carcinomas. Alguns tipos de fibra foram banidos do mercado, porém o tipo de asbesto crisotila ainda pode ser comercializado na maioria dos países. Estudos in vivo e in vitro tentam elucidar as alterações causadas pela exposição à asbesto nos tecidos e nas células que possam estar relacionadas ao aparecimento de doenças, e foi verificado que a exposição às fibras leva a quebras na dupla fita de DNA, estresse oxidativo, formação de células micronucleadas e células aneuploides. O presente estudo teve como objetivo verificar a presença de alterações causadas em células em cultura expostas à crisotila por 48 h e recuperadas em meio livre de fibras por 48 h, 4 dias e 8 dias, além de observar por microscopia em tempo real divisões aberrantes após a exposição as fibras por 24 e 48h. Foram verificadas alterações que permaneceram na cultura mesmo após 8 dias de recuperação, quando não foram mais observadas fibras na cultura, como formação de células aneuploides, diminuição de frequência de células em G0/G1, aumento de células em G2/M e aumento relativo de células em metáfase quanto à porcentagem de células em fases mais tardias da fase M do ciclo. Já aumento da frequência de células micronucleadas ocorreu apenas nos períodos quando foram observadas fibras na cultura. Para análise da formação de mitoses multipolares e destinos destas células foram construídos vetores para expressão de tubulinas fusionadas a proteínas fluorescentes RFP e GFP, padronizadas as condições de transfecção e de aquisição de imagens para que as células tratadas com crisotila fossem observadas por time-lapse. Alguns destinos de mitoses multipolares causadas pelo tratamento com crisotila foram observados, como morte em metáfase, divisão gerando duas ou três células filhas, fusão de células durante a telófase e retenção em metáfase. Os dados sugerem também a indução da amplificação centrossômica, que parece ocorrer inicialmente em células interfásicas, e também devido à fusão de células.
Asbestos is a general name given to six different fibrous silicate minerals found naturally in the earth\'s crust. These fibers are being exploited industrially since 1970, but several workers exposed to the fibers developed diseases in the respiratory tract, such as fibrosis and carcinomas. Some types of fiber were banished from the market, but the type of asbestos chrysotile can still be marketed in most countries. Studies in vivo and in vitro are trying to elucidate the asbestos effects in tissues and cells that could be related to the development of diseases, and these studies verified that asbestos exposure lead to DNA double strand breaks, oxidative stress, multinucleated and aneuploid cell formation. The present work aimed to verify the alterations in culture cells exposed to chrysotile for 48 h and recovered in fiber-free medium for 48 h, 4 days and 8 days, and also observe aberrant mitosis using time-lapse microscopy after 24 h and 48 h of chrysotile exposure. Some alterations were observed and remained in cell culture even after 8 days of recovery when chrysotile fibers were no longer observed - such as aneuploid cell formation, increased frequencies of G2/M cell, decreased frequencies of G1 cells, and increased frequencies of cells in early M phases as metaphase. The induction of micronuclei occurred only during the periods that fibers were observed in cell culture. For the analysis of multipolar mitosis formation and destinies of these cells after chrysotile treatment, DNA vectors for the expression of tubulins fused to fluorescent proteins (GFP and RFP) were constructed, and the conditions for cells transfection and image acquisition for time-lapse microscopy were established. The fate of some multipolar metaphases was observed: cell retention on metaphase, cell cycle progression generating two or three daughter cells, cell fusion during cytokinesis or during telophase after a multipolar anaphase, and cell death. The centrosome amplification was not observed during the M phase of cell cycle, and may occur in interphase, and also despite cell fusion.

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Cannet, Aude. "Rôle du Rho-GEF Trio dans la division cellulaire." Thesis, Montpellier 2, 2014. http://www.theses.fr/2014MON20124.

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Abstract:

Durant la division cellulaire, la cellule subit des changements importants dans sa forme et son adhésion qui dépendent de l'efficacité du remodelage du cytosquelette d'actine. Ce processus est localement et temporellement régulé pour assurer le bon déroulement de la cytokinèse, l'étape finale de la division cellulaire. Il est contrôlé par les GTPases de la famille Rho via le remodelage du cytosquelette d'actine. Les Rho-GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, passant d'une forme au repos (liée au GDP) à une forme active (liée au GTP). La forme au repos interagit avec des facteurs d'échange, les GEFs (Guanine nucleotide Exchange Factors) qui déplacent le GDP et permet la fixation du GTP. Le retour à la forme inactive se fait par hydrolyse du GTP en GDP, stimulée par les protéines GAPs (GTPase Activating Proteins). RhoA est un régulateur positif de la cytokinèse, activée spécifiquement à l'équateur de la cellule, et qui promeut l'assemblage et la constriction de l'anneau d'actomyosine. En contraste, Rac1 a été proposée pour réguler négativement ce processus et doit être inactivée spécifiquement à l'équateur de la cellule pour le bon déroulement de la cytokinèse. Ainsi, une GAP de Rac1, MgcRacGAP, qui est localisé sur le fuseau central de microtubules, inactive Rac1 à l'équateur de la cellule. La déplétion de MgcRacGAP induit des défauts de cytokinèse qui peuvent être sauvés en co-déplétant Rac1. Cependant, le Rho-GEF activant Rac1 durant la division cellulaire n'a pas encore été identifié. Pour identifier un GEF régulant l'activité de Rac1 dans les cellules en division, nous avons réalisé une approche de « screening » par siRNA dans les cellules HeLa. Les Rac-GEFs sont déplétés par siRNA seul ou en combinaison avec un siRNA ciblant MgcRacGAP, dans le but d'identifier lesquels sont capables de sauver le nombre de cellules multinuclées induit par la déplétion de MgcRacGAP. De façon intéressante, la co-déplétion de MgcRacGAP et du Rho-GEF Trio, un GEF caractérisé principalement pour son rôle dans la croissance et le guidage axonal, entraîne une forte diminution du nombre de cellules multinuclées. Par la suite, nous démontrons que ce sauvetage du phénotype passe par la voie Trio-Rac1 en utilisant des mutants GEFs inactifs de Trio et un inhibiteur spécifique de l'activation de Rac1 par Trio. Ces résultats et le rôle de MgcRacGAP dans l'inactivation de Rac1 en cytokinèse, suggèrent que la déplétion de Trio pourrait sauver les défauts de cytokinèse induits par la déplétion de MgcRacGAP en diminuant l'activité de Rac1. Cela suggère aussi que Trio pourrait être un GEF de Rac1 dans les cellules en division. Pour directement tester si Trio pouvait fonctionner comme un GEF de Rac1 dans les cellules en division, la quantité de Rac1 a été mesurée par « pull-down assay » dans des cellules synchronisées en mitose. Comparé aux cellules traitées avec un siRNA contrôle, la déplétion de Trio réduit de moitié la quantité de Rac1 activée dans les cellules en mitose, démontrant que Trio active Rac1 en mitose. De plus, la déplétion de Trio induit des défauts de remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules en anaphase. De façon intéressante, la déplétion de Trio phénocopie la déplétion de Rac1 et de son effecteur Arp2/3, en accord avec un rôle de la voie Trio-Rac1 dans le contrôle du remodelage du cytosquelette d'actine dans les cellules en division. L'ensemble de ce travail a permis d'identifier pour la première fois un GEF contrôlant l'activité de Rac1 dans les cellules en division dont l'activité s'oppose à la fonction de MgcRacGAP en cytokinèse. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel Trio contrôle l'activation de Rac1 et le remodelage du cytosquelette d'actine au cortex cellulaire dans les cellules en division. Dans notre modèle, MgcRacGAP s'oppose à l'action de Trio en inhibant localement et temporellement l'activation de Rac1 au plan de division, assurant ainsi le bon déroulement de la cytokinèse
During cell division, cells undergo dramatic changes in shape and adhesion that depend on efficient actin cytoskeleton remodeling. This process has to be locally and temporally regulated to accurately ensure cytokinesis, the final stage of cell division. The small GTPases Rac1 and RhoA play an essential role in this process by controlling F-actin cytoskeleton remodeling. GTPases oscillate between an inactive, GDP-bound state and an active, GTP-bound state. They are activated by Guanine-nucleotide Exchange Factors (GEFs), which stimulate the GDP-to-GTP exchange, while they are turned off by GTPase-Activating Proteins (GAPs) which catalyse the hydrolysis of GTP. RhoA is a positive regulator of cytokinesis specifically activated at the division plane, which promotes the assembly and constriction of the actomyosin network. In contrast, Rac1 has been proposed to negatively regulate this process and has to be inactivated at the division plane for cytokinesis to occur properly. A central spindle localized GAP, MgcRacGAP, component of the centralspindlin complex, controls Rac1 inactivation at the cleavage plane. Depletion of Rac1 can suppress the cytokinesis failure induced by MgcRacGAP depletion. However, the Rho-GEF that activates Rac1 during cell division has not been identified yet. To identify a GEF regulating Rac1 activity in dividing cells, we performed a siRNA screening approach in HeLa cells. Rac-GEFs were depleted by siRNA alone or in combination with MgcRacGAP siRNAs, in order to identify the ones able to rescue the multinucleated cells induced by MgcRacGAP depletion. Importantly, co-depletion of MgcRacGAP and Rho-GEF Trio, a GEF characterized primarily for its role in axon outgrowth and guidance resulted in a strong decrease in the number of multinucleated cells. Then, we demonstrate that this rescue is mediated by the Trio-Rac1 pathway, using GEF dead mutants of Trio and a specific inhibitor of Rac1 activation by Trio. These data and the fact that MgcRacGAP was recently described to be essential for Rac1 inactivation in cytokinesis, suggest that Trio depletion could rescue the cytokinesis failure induced by MgcRacGAP depletion by decreasing Rac1 activity. It therefore suggests that Trio could be a GEF of Rac1 in dividing cells. To directly test if Trio could function as a GEF of Rac1 in dividing cells, the amount of activated Rac1 was monitored by pull down assay in synchronized mitotic cells. Compared to control siRNA-treated cells, Trio depletion reduced by half the amount of activated Rac1 in mitotic cells, showing that Trio activates Rac1 in mitosis. Strikingly, Trio depletion led to defects in F-actin cytoskeleton remodeling in anaphase cells. Indeed, the F-actin staining at the cortex was significantly reduced in Trio-depleted cells compared to control cells. Interestingly, Trio depletion phenocopied the depletion of Rac1, consistent with a role for the Trio-Rac1 pathway in controlling F-actin remodeling in dividing cells.Overall, this work identifies for the first time a GEF controlling Rac1 activation in dividing cells that counteracts MgcRacGAP function in cytokinesis. Based on these observations, we propose a model in which Trio functions as a GEF of Rac1 during cell division. Trio, which is expressed throughout the cell cycle, activates Rac1 to control F-actin cytoskeleton remodeling at the cell cortex of dividing cells. MgcRacGAP therefore counteracts the action of Trio by locally and temporally inhibiting Rac1 activation at the division plane, subsequently ensuring accurate cytokinesis

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Ma, Sheng. "Caractérisation du rôle des protéines phosphatases impliquées dans la déphosphorylation de la protéine kinase Greatwall lors de la sortie de mitose." Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTS007/document.

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Abstract:

Chez la drolosophile, des mutants de Greatwall présentent des défauts de condensation des chromosomes lors de la mitose. Plus tard, la même équipe a montré que chez le Xénope, Greatwall est nécessaire pour entrer en mitose. L'idée consistant à penser que puisque Greatwall ne permet plus l'entrée en mitose, il joue un rôle dans la boucle qui conduit à l'auto-amplification de MPF. En 2009, notre équipe a montré que Greatwall est réellement impliquée dans l'entrée en mitose, mais de façon indirecte par rapport à la boucle d'amplification de MPF, et cela en contrôlant l'activité de la phosphatase PP2A. Notre équipe a montré que lorsque l'on enlève PP2A, on peut sauver le phénotype de l'absence de Greatwall. Plus tard, il a été montré que la phosphorylation de Greatwall est nécessaire pour l'entrée en mitose. La phosphorylation de Greatwall sur la partie C-terminale est nécessaire pour activer Greatwall. Par conséquent, Greatwall doit être phosphorylé pour être actif. Une fois activé, Greatwall est capable de phosphoryler Arpp19 qui lie la phosphatase PP2AB55, et qui l'inhibe permettant ainsi de maintenir les phosphorylations des substrats mitotiques. Si cette voie de signalisation n'est pas fonctionnelle, la phosphatase PP2A va déphosphoryler tous les substrats mitotiques et la cellule n'entrera jamais en mitose. Greatwall doit être phosphorylé pour s'activer et pour entrer en mitose, mais on observe aussi qu'au moment de la sortie de mitose, il est déphosphorylé, et il doit être déphosphorylé pour s'inactiver. (On ne sait pas s'il est requisse pour sortir). Mon projet consiste à chercher la/les phosphatase(s) qui pourrait contrôler l'activité ou l'inactivation de Greatwall. Les questions que l'on se pose : Comment et par quelle(s) phosphatase(s) Greatwall est déphosphorylé, comment ces phosphoatases sont activées, quel est l'ordre d'activation de ces phosphatases ? Pour étudier comment Greatwall est déphosphorylé, il y a 2 sites majors : T194 et S875. Ces 2 sites sont nécessaires pour l'activité de Greatwall. Nous avons réalisé les 2 mutants T194A et S875A, et les traduit dans l'extrait interphasique d'œufs de Xénope, pour mesurer l'activité de kinase Greatwall. Pour déphosphoryler ces 2 sites, il y a 4 phosphatases principales comme candidats : Calcineurine, Fcp1, PP1, PP2A
The establishment of mitosis requires phosphorylaton of several substrates induced by kinases. Cdk1-cyclin B and Greatwall kinases are both necessary for the entry into mitosis. Cdk1-cyclin B complex phosphorylates many substrates and at the same time Greatwall phosphorylates Arpp19 which binds PP2AB55 phosphatase and inhibits it. PP2AB55 has an important role in the dephosphorylation of Cdk1-cyclin B mitotic substrates.In my laboratory, we found that after Greatwall depletion, either in Xenopus egg extracts or in human cells, PP2A is no longer inhibited and cells exit mitosis. Since activation of Greatwall requires its phosphorylation in the c-terminal part and in the T-loop site, we suppose that mitosis exit require dephosphorylation of Greatwall. So these dephosphorylations could be involved for Greatwall inactivation. Several phosphatases are candidates for this process: Fcp1, PP1, PP2A and Calcineurin. My project proposes to determine the involvement of these four phosphatases in Xenopus egg extracts after depletion and overexpression of these four proteins

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Bouguenina, Mohammed El Habib. "La protéine SMYLE (Short MYomegalin Like EB1 binding protein) dans l'organisation d'un complexe centrosomal, la régulation de la nucléation et la stabilisation des microtubules : conséquences sur la migration et la division des cellules cancéreuses." Thesis, Aix-Marseille, 2016. http://www.theses.fr/2016AIXM5060.

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Abstract:

Les microtubules (MT) sont des polymères dynamiques ancrés par leurs extrémités moins aux centres de nucléation alors que leurs extrémités plus, explorent le cytoplasme, jusqu’à être stabilisées. Cette capture des extrémités permet l’organisation du réseau des MT. Les +TIP sont un groupe de protéines qui s’associent aux bouts plus des MT. EB1 est une protéine centrale dans le réseau des +TIP qui régule la dynamique des MT et leur interaction avec les structures d’ancrage des extrémités plus. Par protéomique ciblée, nous avons caractérisé l’interactome d’EB1, et mis en évidence un groupe de protéines, précédemment associées aux centres de nucléation incluant AKAP9, une protéine échafaudage pour les protéines kinases A (PKA), la protéine de la matrice péricentriolaire CDK5RAP2, et une isoforme courte de la myomégaline que nous avons appelé SMYLE (Short MYomegalin Like EB1 binding protein). La cartographie moléculaire a permis de montrer que ces protéines formaient un complexe organisé de manière hiérarchique. Nous avons observé que l’association transitoire deLa protéine SMYLE (Short MYomegalin Like EB1 binding protein )dans l'organisation d'un complexe centrosomal, la régulation de la nucléation et la stabilisation des microtubules : conséquences sur la migration et la division des cellules cancéreuses avec les MT néo-nucléés au centrosome favorisait la nucléation et l’acétylation des MT. De manière notable, la déplétion de SMYLE aboutissait à un défaut de nucléation, mais aussi de la capture corticale des MT. Ces défauts dans l’organisation des MT étaient associés à une baisse notable de la migration des cellules de carcinome mammaire et à des anomalies mitotiques. Nos résultats nous permettent de proposer que SMYLE fait partie d’un complexe centrosomale, qui favorise l’assemblage ou la stabilité des microtubules néo-nucléés, contribuant ainsi à des processus majeurs pour le développement tumoral
Microtubules (MT) are dynamic polymers anchored by their minus ends at the MT organizing centers while their highly dynamic plus end explores the cytoplasm until it get stabilized. This plus end capture allows the organization of the MT network. +TIPs are a group of proteins that share the commonality to associate either directly or indirectly to MT plus ends. EB1 is a central protein of the +TIP network that regulates MT dynamics and their interactions with plus end anchoring structures. Using targeted proteomics, we have characterized the EB1 interactome and revealed a set of protein previously shown to associate with the nucleating centers that included AKAP9 an anchoring protein for protein kinase A (PKA), the pericentriolar matrix protein CDK5RAP2 and a short Myomegalin isoform that we named SMYLE (Short MYomegalin Like EB1 binding protein). Molecular mapping revealed that the proteins formed a hierarchically organized complex. We have observed that the transient association of SMYLE to the newly nucleated MTs at the centrosome favored the nucleation and acetylation. Interestingly, SMYLE depletion led to MT nucleation defects, but also a disruption of cortical MT capture. These defects in the MT network were associated with a steep fall in the migratory potential of breast cancer cells and mitotic abnormalities. Our results allow proposing that SMYLE belongs to centrosomal supramolecular complex that favors the assembly and stability of newly nucleated MTs, thus contributing to major processes in tumor development

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Feizbakhsh, Omid. "La protéine Kinase Haspine comme nouvelle cible thérapeutique : analyse de ses fonctions et caractérisation d'inhibiteurs spécifiques." Thesis, Rennes 1, 2017. http://www.theses.fr/2017REN1B053.

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Abstract:

Depuis sa découverte en 1994, la protéine kinase Haspine fait l’objet d’un intérêt scientifique croissant en raison de son rôle clé dans la mitose. Elle est impliquée dans localisation et l’activation spatio-temporel d’Aurora B en créant un site d’ancrage (phosphorylation de l’Histone H3 sur la Thr3) sur les chromosomes et notamment aux centromères en première partie de mitose. Une perte d’activité de l’Haspine s’accompagne irrémédiablement d’erreurs dans l'alignement des chromosomes, la cohésion centromérique et l'intégrité des fuseaux mitotiques. Ces fonctions en fait une cible thérapeutique potentielle contre le cancer. Les objectifs de cette thèse ont été de mieux comprendre les fonctions de cette protéine dans la cellule en mitose, et parallèlement, de caractériser de nouveaux inhibiteurs spécifiques de cette kinase. Nous avons montré que l'intégrité des centrosomes et du fuseau mitotique dépend de l'activité kinase de l’Haspine de façon indépendante de l’activité d’Aurora B. De plus, nous montrons que l’Haspine agit comme un régulateur négatif de la nucléation des microtubules aux centrosomes ainsi que sur les chromosomes. Pour mieux comprendre le rôle de Haspine dans la nucléation des microtubules, nous avons cherché de nouveaux substrats à l'aide d'une puce protéique. Nous avons identifié plusieurs candidats parmi lesquels l’effecteur de nucléation, la kinase Nima Nek9. Nous avons confirmé que Nek9 est un substrat de l’Haspine in vitro. De plus, nos résultats ont montré que la déplétion de Nek9 sauve en partie le phénotype de déplétion de l’Haspine, ce qui suggère que l’Haspine a un rôle antagoniste de la fonction centrosomale de Nek9. L’ensemble de nos résultats démontre une nouvelle fonction de l’Haspine de son implication dans la régulation des voies de signalisation de la nucléation des microtubules. En parallèle, nous avons caractérisé une nouvelle série de petites molécules inhibitrices de Haspine, des imidazopyridines dérivées du CHR-6494. Nos composés hits montrent une bonne activité inhibitrice de l’Haspine et une sélectivité accrue. Ils ont l’avantage de ne pas provoquer un arrêt du cycle cellulaire en G2/M comme le CHR-6494 et n’inhibent pas la CDK1. Ils s’avèrent être de précieux outils d’études des fonctions de l’Haspine et une base structurale pour la synthèse d’outils thérapeutiques potentiels
Since its discovery in 1994, Haspin protein kinase has been of growing scientific interest due to its key role in mitosis. It is involved in spatio-temporal localization and activation of Aurora B kinase by creating a specific anchoring site (phosphorylation of Histone H3 on Thr3) on chromosomes and specifically at centromers during early mitosis. Loss of Haspin activity is irremediably accompanied by chromosome alignment errors, centromeric cohesion and mitotic spindle defects. Its essential mitotic functions make it a potential therapeutic target for cancer. The objectives of this thesis were to better understand the functions of Haspin in mitosis, and at the same time, to characterize new specific inhibitors. We have shown that centrosome and mitotic spindle integrity depends on Haspin kinase activity independently of Aurora B activity. In addition, we show that Haspin acts as a negative regulator microtubule nucleation both at centrosomes and on chromosomes. To better understand Haspin's role in microtubule nucleation we looked for new substrates using protein chips. We have identified several candidates including the Nima kinase nucleation effector, Nek9. We confirmed that Nek9 is an in vitro Haspin substrate. In addition, our results showed that Nek9 depletion partly saves the Haspin depletion phenotype, suggesting that Haspin antagonizes Nek9 nucleation function. All of our results demonstrate a new Haspin function in the regulation of microtubule nucleation signaling pathway. At the same time, we have characterized a new series of small inhibitory molecules of Haspin, imidazopyridines derived from CHR-6494. Our hit compounds showed good Haspin inhibitory activity and increased selectivity. Unlike CHR-6494, they have the advantages of not causing cell cycle arrest in G2/M through CDK1 inhibition. They prove to be valuable tools for Haspin function studies and form a strong structural basis for the development of potential therapeutic drugs

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Lerner, Jonathan. "Caractérisation de l’effet de mutations MODY sur la fonction de bookmarking de HNF1beta." Thesis, Paris 5, 2014. http://www.theses.fr/2014PA05T064/document.

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Abstract:

HNF1beta est un facteur de transcription homeobox, dont les mutations sont fréquemment rencontrées chez des patients atteints d’anomalies congénitales du rein et du tractus urinaire (Congenital Abnomalities of the Kidney and the Urogenital Tract, CAKUT). HNF1beta est également impliqué dans le diabète de type Maturity Onset Diabetes of the Young 5 (MODY5). Le laboratoire d’accueil a démontré que HNF1beta était impliqué dans un mécanisme épigénétique, le Bookmarking, nécessaire à la réexpression post-mitotique de ses gènes cibles. En particulier, des expériences de vidéo-microscopie ont montré que la partie N-terminale de HNF1beta, contenant le domaine de liaison à l’ADN, en fusion avec la GFP (HNF1beta -GFP) est liée à la chromatine pendant la mitose. L’objectif de ma thèse était de caractériser les modalités biochimiques d’interaction de HNF1beta avec la chromatine mitotique. Nous avons mis en évidence le fait que la capacité de liaison à l’ADN est indispensable à la localisation mitotique de HNF1beta. En effet, la délétion de la troisième hélice alpha de l’homéo-domaine, responsable de l’interaction avec le grand sillon de l’ADN, entraîne la dissociation de la chromatine de HNF1beta pendant la mitose. Nous avons ensuite étudié l’effet de plusieurs mutations identifiées chez des patients MODY sur la localisation mitotique de HNF1beta. Nos résultats ont montré que certaines mutations faux-sens sont capables d’empêcher la fixation de la chromatine mitotique. Parmi ces mutations, certaines manifestent un phénotype dépendant de la température. Par exemple, à une température permissive, inférieure à 30°C, les mutations P256S et C273Y présentent une localisation mitotique normale. En revanche, à 37°C pour P256S et à 39°C pour le mutant C273Y, les protéines sont complètement dissociées, alors que dans toutes ces conditions de température, l’association de la protéine sauvage avec la chromatine mitotique n’est pas affectée. A température permissive (4°C), nous avons montré par retard sur gel (Electophoresis Mobility Shift Assay EMSA) que les mutants lient l’ADN avec un Kd apparent similaire à celui de la protéine sauvage. Par contre, à température restrictive, les mutants présentent des comportements différents. En effet, P256S perd sa capacité de liaison à l’ADN (de façon réversible), tandis que C273Y continue à lier l’ADN avec une affinité similaire à celui de la protéine sauvage. Le caractère thermosensible des mutants de HNF1beta nous a permis d’étudier les modalités de son recrutement sur la chromatine mitotique. Nos résultats ont montré que l’association des protéines à la chromatine mitotique présente une nature très dynamique. En effet, nous avons observé qu’une diminution rapide de température détermine la relocalisation mitotique réversible de la protéine, dans un délai de quelques secondes. Nous avons pu montrer que la relocalisation mitotique de HNF1beta induit par la température était affectée par une déplétion d’énergie, ainsi que par l’action d’un inhibiteur spécifique de l’importine-β (importazole). Nous avons enfin mis en évidence par immuno-précipitation de chromatine (ChIP) que la liaison de HNF1beta à la chromatine mitotique est séquence-spécifique. Nos résultats suggèrent que le recrutement de HNF1beta à la chromatine mitotique est énergie-dépendante, et nécessite le bon fonctionnement du système de transport lié à l’importine-beta. Mes résultats suggèrent que des mutations trouvées chez des patients MODY3 et MODY5 inactivent ou affaiblissent la capacité de HNF1beta de remplir son activité de Bookmarking
HNF1beta is a POU transcription factor that is frequently mutated in patients that suffer from diabetes and renal cystic dysplasia. This protein has the peculiar ability to bind mitotic chromosomes and behave as a gene bookmarking. Here we show that the capacity of HNF1beta to bind to DNA plays an essential role for mitotic binding. A close homologue, HNF1alpha, shares the ability of HNF1beta to bind to mitotic chromosomes, and several MODY mutations (e.g P256S, V265L and C273Y) affect the ability of the protein to localize to mitotic chromatin. Interestingly, the phenotype induced by these mutations is very rapidly rescued by sudden temperature shifts. Temperature-sensitivity is probably linked to a conformational change that prevents DNA binding ability of P256S and V265L mutants at 37°C. Interestingly, the mitotic relocalization of these mutants induced by temperature shift was sensitive to energy depletion and importazole, suggesting an active mechanism involving the importin-beta system. Interestingly, C273Y mutant exhibited a significantly mitotic dispersion that is not correlated with any DNA or interphase chromatin binding defect, indicating that DNA binding function is necessary but not sufficient to accomplish bookmarking

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Reynaud, Florie. "Rôle de la Sémaphorine 3B dans l’orientation des divisions des progéniteurs au cours de la neurogenèse chez les vertébrés." Thesis, Lyon, 2016. http://www.theses.fr/2016LYSE1320/document.

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Abstract:

Au cours de la mitose, la ségrégation des chromatides, la partition du matériel cytoplasmique entre cellules filles et leur position relative se fait selon un plan qui est préfiguré par la plaque métaphasique. Ainsi, l'orientation de ce plan est un processus crucial pour le contrôle du destin des cellules, pour la morphogenèse durant l'embryogenèse et pour l'homéostasie tissulaire. Jusqu'à aujourd'hui, les mécanismes intrinsèques impliqués dans le positionnement du plan de division ont reçu beaucoup d'attention. En revanche, peu d'études ont exploré l'implication de signaux extracellulaires dans l'orientation du plan de division. Pourtant, l'axe des divisions cellulaires dont la position est souvent stéréotypée est largement associé aux axes de polarités du tissu. Au cours de ma thèse, je me suis demandé si des signaux extracellulaires capables de délivrer des informations de position spatiale aux cellules dans le cadre de leur migration, de leur différenciation morphologique, ou de leur polarisation, pouvaient influencer l'orientation des divisions cellulaires. En particulier, je me suis intéressée aux facteurs impliqués dans le guidage axonal à travers l'étude des mitoses des progéniteurs neuraux chez l'embryon de souris. Dans la moelle épinière en développement, les progéniteurs neuraux effectuent leur division au contact du canal central, lequel renferme le liquide céphalo-rachidien (LCR), une source de nombreux facteurs extracellulaires comme les morphogènes. Nous avons montré que la présence de molécules du LCR était nécessaire pour une orientation appropriée du plan de divisions des progéniteurs neuraux localisés au contact du canal central. Priver les progéniteurs neuraux de LCR par l'ouverture du tube neural ou provoquer génétiquement l'obstruction du canal central affecte les proportions de divisions planaires et obliques. Nous avons identifié la protéine Sémaphorine 3B, secrétée par les cellules de la plaque du plancher et les plexus choroïdes, comme un signal extrinsèque contrôlant l'orientation des divisions des progéniteurs neuraux dans la moelle épinière. L'invalidation génétique de Sema3B chez la souris phénocopie la perte d'accès au LCR des progéniteurs. Une application exogène de Sema3B sur des embryons dont le tube neural a été ouvert compense la déficience de LCR. Nous avons pu montrer que Sema3B se lie à ses récepteurs Neuropilines à la surface apicale des progéniteurs mitotiques et agit sur l'architecture des microtubules via l'activation de la voie GSK3/CRMP2, voie initialement mise en évidence dans le contexte du guidage axonal. Afin d'identifier de nouveaux facteurs influençant le positionnement du fuseau mitotique en réponse à ce facteur de guidage, une analyse transcriptomique des progéniteurs neuraux des mutants Sema3B-/- a été réalisée et des gènes candidats dérégulés en contexte d'invalidation de Sema3B ont été considérés. Durant la seconde partie de ma thèse, j'ai exploré l'implication du gène Norbin/Neurochondrin. De manière intéressante, le knock- down de Norbin dans les cellules HeLa altère l'orientation du fuseau mitotique. L'ensemble de ces travaux révèle donc la contribution d'une large famille de signaux topographiques jusqu'à présent inexplorée, dans l'orientation des divisions cellulaires et ouvre un large champ d'investigation passionnant concernant leur action moléculaire et cellulaire dans la neurogenèse et la morphogenèse
During development, the orientation of cell division is crucial to correctly organize andshape tissues and organs and also to generate cellular diversity. As cell mitosis proceeds, thesegregation of chromatids and cytoplasmic material occurs along a division axis. Itsorientation largely determines the relative position of daughter cells and the partition ofmother cell subcellular domain between them. The orientation of the cell division isprefigured by the position of a complex microtubule-based scaffold, the mitotic spindle.Until now, the intrinsic molecular machinery positioning the mitotic spindle and its couplingto cell polarities have been study in details. In contrast, the contribution of extracellularsignals to cell division orientation is less characterised. My research shows that these signalsin the CSF contribute to the orientation of cell division in neural progenitors. Removal theCSF cues by opening the neural tube or by genetic engineering affects the proportion ofplanar and oblique divisions. We identified Semaphorin 3B (Sema3B), released from thefloor plate and the nascent choroid plexus, as an important actor in this extrinsic control ofprogenitor division. Knockout of Sema3B phenocopies the loss of progenitor access to CSF.Delivery of exogenous Sema3B to progenitors in living embryos compensates this deficiency.We showed that Sema3B binds to Neuropilin receptors at the apical surface of mitoticprogenitors and exerts its effect through GSK3b activation and subsequent inhibition of themicrotubule stabilizer CRMP2. Thus extrinsic signaling mediated by Semaphorins directs theorientation of progenitor division in neurogenic zones.In order to identify new factors implicated in Sema3B-dependant mitotic spindleposition, we performed a transcriptomic analysis of Sema3B -/- neural progenitors. Severalderegulated candidate genes were considered. In the second part of my thesis, I focus onone of this, Norbin/Neurochondrin. Interestingly, the invalidation of Norbin/Neurochondrinalters the orientation of the mitotic spindle in HeLa cells.My PhD work reveals the contribution of a large family of topographic cues known tofunction in axon guidance has a novel role in the orientation of cell division

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Gharbi, Ayachi Aicha. "Identification et caractérisation des premiers substrats de la protéine kinase Greatwall et étude de leur implication au cours du cycle cellulaire." Thesis, Montpellier 2, 2013. http://www.theses.fr/2013MON20133.

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Abstract:

Au cours de la division cellulaire, l'information génétique doit être transmise de façon précise et identique de la cellule mère aux cellules filles. Le génome est répliqué au cours de la phase S tandis que la distribution des deux copies entre les cellules filles se fait au cours de la mitose. L'initiation et le maintien de la mitose nécessite un équilibre contrôlé entre les activités des kinases et des phosphatases. La protéine kinase Greatwall est requise pour l'entrée et le maintien de la mitose à travers l'inhibition de la PP2A, la principale phosphatase qui déphosphoryle les substrats du complexe Cdk1-cycline B. Au cours de ce travail, nous avons entrepris l'étude structure/fonction de la protéine kinase Greatwall qui nous a permis de caractériser ses mécanismes d'activation. Nos résultats montrent que Greatwall appartient à la famille des AGC kinases mais qu'elle présente la particularité d'être contrôlée par des mécanismes qui lui sont propres: l'activation de la protéine, qui se fait en deux étapes, est différente de celle décrite pour les autres membres de cette famille de kinases. Par la suite, nous avons identifié deux substrats de la protéine kinase Greatwall, Arpp19 (cAMP-Regulated Phosphoprotein 19) et l'alpha-Endosulfine (ENSA). Nous avons montré qu'une fois phosphorylées par Greatwall, ces deux protéines s'associent à la PP2A et inhibent cette phosphatase. Malgré le fait que ces deux substrats soient capables d'inhiber la PP2A, seul Arpp19 endogène est responsable de l'inhibition de la phosphatase pour promouvoir l'entrée en mitose dans le modèle des extraits d'ovocytes de xénope. Nous nous intéressons à présent à l'étude du rôle d'ENSA
During cell division, genetic information must be transmitted from the mother cell to the daughter cell in an accurate and identical way. During the S phase the genome is replicated while an equal distribution of two copies of DNA between the daughter cells is made during mitosis. Initiation and maintenance of mitosis require a controlled balance between kinase and phosphatase activities. Greatwall kinase is essential for mitotic entry and maintenance through the inhibition of PP2A, the main phosphatase that dephosphorylates Cdk1/cycline B mitotic substrates. Here we investigate the mechanisms regulating Greatwall. Our results show that Greatwall is a member of the AGC family of kinases that appears to be regulated by a unique two-step mechanism that differs from the other members of this family. Furthermore we identified Arpp19 (cAMP-Regulated Phosphoprotein 19) and alpha-Endosulfine (ENSA) as two substrates of Greatwall that, when phosphorylated by this kinase, associate with and inhibit PP2A. Despite the fact that these two substrates are able to inhibit PP2A, only endogenous Arpp19 is responsible for the phosphatase inhibition at mitotic entry in xenopus egg extratcs. Roles of ENSA are currently under investigation

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Ducháček, Ladislav. "Mitosis." Master's thesis, Vysoké učení technické v Brně. Fakulta výtvarných umění, 2016. http://www.nusl.cz/ntk/nusl-240615.

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Abstract:

Mitosis diploma work is figurative sculpture created by duplication statues. These duplicates to form pairs at each mitotic bind. Couples are composed into complex system, and thus form a spherical object. Against the background of this work is to introduce perspective on the human population and its culture as an independent organic whole.

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Goutte-Gattat, Damien. "Etude des fonctions mitotiques du domaine amino-terminal de CENP-A." Thesis, Grenoble, 2011. http://www.theses.fr/2011GRENV079/document.

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Abstract:

Le variant d'histone CENP-A est le facteur responsable de la détermination épigéné- tique du centromère. Il permet le recrutement de nombreuses protéines centromériques, et constitue ainsi la brique fondatrice du kinétochore. Il possède un domaine amino-terminal non structuré dont la fonction précise reste encore à élucider, bien qu'il soit déjà établi chez certaines espèces que ce domaine est requis pour le bon fonctionnement du cen- tromère et conséquemment le bon déroulement de la mitose. Nous avons construit des lignées cellulaires humaines exprimant stablement diverses formes mutantes de CENP-A, qui nous ont permis de réaliser des expériences de pseudogénétique en supprimant l'ex- pression de la protéine CENP-A endogène. Nous observons une augmentation drastique du taux de défauts de ségrégation des chromosomes et de cellules plurinucléées dans des cellules exprimant uniquement le domaine globulaire de CENP-A, ce qui est en accord avec les données de la littérature et confirme l'importance du domaine amino-terminal. Un phénotype similaire est observé dans des cellules exprimant une protéine CENP-A entière mais dont le domaine amino-terminal n'est pas phosphorylable. Nos résultats montrent l'implication de la phosphorylation de la sérine de CENP-A dans le bon déroulement de la mitose, et suggèrent que la fonction mitotique du domaine amino-terminal est centrée sur cette seule phosphorylation
The histone variant CENP-A is the epigenetic factor responsible for centromere deter- mination. It allows the recruitment of a handful of centromeric proteins, and thus acts as the primary foundation for the kinetochore. It comprises an unstructured amino-terminal domain to which no precise function has yet been assigned, although it is established in some species that the mere presence of that domain is required for proper centromere func- tion and thus successful completion of mitosis. We have established several human cell lines stably expressing GFP-tagged CENP-A constructs, allowing us to perform pseudoge- netic experiments by siRNA-mediated silencing of the endogenous CENP-A. Our results show a dramatic increase of mitotic defects and plurinuclear cells when cells express only the globular domain of CENP-A; this is in accordance with the litterature and confirms the importance of the amino-terminal tail. More importantly, a similar increase of mitotic defects is observed when cells express a full-length, but non-phosphatable, CENP-A. Our results show the involvement of the phosphatable serine 7 of CENP-A in the successful completion of mitosis, and may suggest that the role of the whole amino-terminal tail of CENP-A could be reduced to this single phosphorylation event

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Derive, Nicolas. "Etude du rôle et de la régulation de BubR1 dans la ségrégation des chromosomes acentriques." Thesis, Bordeaux, 2014. http://www.theses.fr/2014BORD0256/document.

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Abstract:

La transmission correcte du matériel génétique au cours de la mitose requiert l’attachement correct des chromosomes aux microtubules du fuseau mitotique. Les centromères au niveau des chromosomes servent de site d’assemblage aux kinétochores, interfaces multiprotéiques permettant la liaison des microtubules. Cependant, nous avons récemment mis en évidence chez la drosophile un mécanisme par lequel les fragments acentriques ségrégent normalement. Celui-‐ci fonctionne grâce à un « tether », un filament d’ADN, qui relie les fragments acentriques à leurs partenaires centriques. L’intégrité du tether dépend de la fonction de BubR1, qui s’accumule au tether pendant de la mitose. BubR1 est une protéine clé dans le point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique, ou SAC (Spindle Assembly Checkpoint), qui contrôle l’attachement correct des kinétochores aux microtubules et inhibe l’entrée en anaphase. Nous avons voulu déterminer comment BubR1 est recrutée au tether, et nous avons montré que ce recrutement est dépendant du Bub3 Binding Domain de BubR1 et plus précisément de l’acide aminé E481 dans ce domaine. L’interaction Bub3-‐BubR1 par l’intermédiaire de ce domaine est nécessaire à la localisation du complexe au tether. Nous avons également montré que BubR1 recrute à son tour Fzy par l’intermédiaire de son domaine KEN.Nous proposons un modèle dans lequel le recrutement successif de Bub3-‐BubR1 et Fzy au niveau des chromosomes endommagés est nécessaire à leur bonne ségrégation en mitose
Accurate transmission of genome during mitosis requires proper chromosomes attachment to microtubules of the mitotic spindle. Centromeres of chromosomes are assembly sites for kinetochores, multiproteic interfaces for microtubule binding. However, we recently discovered in Drosophila a mechanism that permits proper acentric chromosomes segregation. This mechanism works through a DNA « tether » that binds together acentric chromosomes to their centric counterparts. Tether integrity depends on BubR1 function, which accumulates on the tether during mitosis. BubR1 is a key protein in the Spindle Assembly Checkpoint (SAC), which monitors proper kinetochore-‐microtubule attachment, and inhibits anaphase onset until all kinetochores are properly bound to microtubules. We wanted to determine how BubR1 is recruted to the tether, and we showed that this recruitment is dependant on the Bub3-‐Binding Domain of BubR1, and more precisely the E481 amino acid. Bub3-‐BubR1 interaction mediated by this domain is necessary for complex localisation on the tether. We also discovered that BubR1 then recruits Fzy via its KEN domain. We propose a model where successive recruiting of Bub3-‐BubR1 and Fzy at the broken chromosome level is mandatory to their proper segregation in mitosis

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Loncar, Ana. "Comparaison de la dynamique du fuseau mitotique et méiotique chez la levure à fission." Thesis, Université Paris sciences et lettres, 2020. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-03174872.

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Abstract:

La division cellulaire est un processus universel chez tous les êtres vivants où les chromosomes dupliqués sont séparés aux pôles cellulaires opposés. La mitose est un type de division cellulaire qui sert à la prolifération des cellules, tandis que la méiose produit des cellules sexuelles, qui sont utilisées dans la reproduction sexuelle d'un organisme. Dans les deux cas, une machine à base de microtubules appelée le fuseau sépare parfaitement les chromosomes. Une séparation précise des chromosomes est primordiale, car les erreurs de ségrégation des chromosomes dans peuvent entraîner une aneuploïdie qui pourrait provoquer des malformations congénitales, le cancer ou la mort cellulaire.La mitose et la méiose font l'objet de recherches depuis de nombreuses décennies, et une pléthore d'acteurs clés a été identifiée et étudiée. Cependant, aucune étude n'a été réalisée sur la comparaison de la dynamique des fuseaux mitotiques et méiotiques dans le même organisme. Dans cette étude, la dynamique du fuseau mitotique et méiotique a été caractérisée et comparée simultanément dans la levure à fission. La comparaison de la dynamique des fuseaux a permis de déterminer qu'il existe trois types de fuseaux distincts - le fuseau mitotique, méiotique I et méiotique II, avec des caractéristiques distinctives. Un mutant de levure à fission déficient en kinésine-5 Cut7 et en kinésine-14 Pkl1 a été utilisé comme outil pour identifier la source des différences dans la dynamique du fuseau mitotique et méiotique. Bien que les fuseaux mitotiques cut7Δpkl1Δ soient bipolaires et capables de séparer les chromosomes, nous montrons que les fuseaux de la méiose I ne parviennent pas à établir la bipolarité et à séparer les chromosomes, ce qui entraîne la formation de zygotes formant moins de quatre spores typiques. Ensuite, nous révélons que la concentration de Pkl1 est réduite en fuseaux méiotiques I par rapport aux fuseaux mitotiques, et identifions la kinésine-14 Klp2 comme la molécule qui coopère avec Pkl1 en antagonisant Cut7 dans la méiose I. De plus, nous avons constaté que la suppression de la dynamique des microtubules dans cut7Δpkl1Δ zygotes restaure bipolarité du fuseau, faisant valoir que les microtubules sont plus dynamiques dans les fuseaux de la méiose I que dans les fuseaux mitotiques.En résumé, ce travail montre que les fuseaux mitotiques et méiotiques sont intrinsèquement différents, et leurs différences proviennent de la kinésine-14 et de la régulation de la dynamique des microtubules
Cell division is a universal process in all living beings where duplicated chromosomes are separated to the opposite cell poles. Mitosis is a cell division type that serves for proliferation of cells, while meiosis produces sex cells, which are used in the sexual reproduction of an organism. In both cases, a microtubule-based machine called a spindle flawlessly separates the chromosomes. Precise chromosome separation is paramount, as any errors in chromosome segregation can result in aneuploidy that may cause congenital defects, cancer or cell death.Mitosis and meiosis have been the focus of research for many decades, and a plethora of key players has been identified and studied. However, no study has been done on comparison of mitotic and meiotic spindle dynamics in the same organism. In this study, mitotic and meiotic spindle dynamics have been characterized and compared simultaneously in fission yeast. Spindle dynamics comparison ascertained that there are three distinct spindle types – mitotic, meiotic I and meiotic II spindles, with distinguishing features. A fission yeast mutant deficient for kinesin-5 Cut7 and kinesin-14 Pkl1 was used as a tool to identify the source of the differences in mitotic and meiotic spindle dynamics. Although cut7Δpkl1Δ mitotic spindles are bipolar and capable of segregating the chromosomes, we show that meiosis I spindles fail to establish bipolarity and separate the chromosomes, resulting in zygotes forming less than typical four spores. Next, we reveal Pkl1 concentration is reduced in meiotic I compared to mitotic spindles, and identify kinesin-14 Klp2 as the molecule that co-operates with Pkl1 in antagonizing Cut7 in meiosis I. Furthermore, we found that suppressing microtubule dynamics in cut7Δpkl1Δ zygotes restores spindle bipolarity, arguing that microtubules are more dynamic in meiosis I spindles than in mitotic spindles.In summary, this work shows mitotic and meiotic spindles are inherently different, and their differences stem from kinesin-14s and microtubule dynamics regulation

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Boehler, Christian. "Rôles de la poly (ADP-ribose) polymérase-3 (PARP-3) dans la réponse cellulaire aux dommages dans l'ADN et la progression mitotique." Thesis, Strasbourg, 2012. http://www.theses.fr/2012STRAJ113/document.

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Abstract:

La Poly(ADP-ribosyl)ation est une modification post-traductionnelle des protéines catalysée par les poly(ADP-ribose) polymérases (PARPs), une famille de 17 membres. Nous avons débuté la caractérisation fonctionnelle d’un nouveau membre de cette famille : la Poly(ADP-Ribose) Polymérase-3 (PARP-3). Cette protéine était très peu étudiée. Le gène humain Parp3 permet l’expression de deux isoformes. Tandis que l’isoforme longue a été identifiée comme un composant centrosomal, l’isoforme courte est accumulée dans le noyau. En outre, seule l’isoforme courte est exprimée chez la souris. Pour étudier les conséquences fonctionnelles de l’absence de PARP-3 dans les cellules humaines, nous avons généré un modèle cellulaire de fibroblastes de poumons humains (MRC5) déplété en PARP-3 par la méthode de l’interférence ARN. Nos travaux ont permis d’identifier PARP-3 comme un nouvel acteur spécifique de la réponse cellulaire aux cassures double brin de l’ADN (DSB). Nous avons également entrepris une recherche de partenaires de PARP-3 par spectrométrie de masse. Nous avons identifié une interaction de PARP-3 avec la protéine NuMA, un régulateur essentiel de la division mitotique. Nos travaux ont mis en évidence l’existence d’un complexe protéique composé de PARP-3, NuMA et Tankyrase 1 (PARP-5a), impliquée dans les mécanismes mitotiques. PARP-3 a un rôle charnière dans la régulation de ce complexe qui joue un rôle fondamental dans la progression mitotique au travers de la maintenance du fuseau mitotique et de la résolution des télomères. Les rôles de PARP-3 dans les mécanismes de réparation des DSB ainsi que dans la progression mitotique en font une cible prometteuse en thérapie du cancer
Poly(ADP-ribosyl)ation is a post-translational modification of proteins mediated by poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs), a family of 17 members. We started the functional characterization of a new member of this family : the Poly(ADP-Ribose) Polymerase-3 (PARP-3). This protein was poorly studied. The human Parp3 gene displays two splicing variants giving rise to two proteins. Whereas the full length hPARP-3 has been identified as a core component of the centrosome throughout the cell cycle, the shorter splice variant accumulates within the nucleus. Of note, only the shorter nuclear variant is found in mice. We generated PARP-3 depletion in human lung cell line (MRC5) using RNA interference to analyse functional consequences of PARP-3 absence. We identified PARP-3 as a new specific actor of Double-Strand Breaks (DSB) repair mechanism. We also identified a new protein partner of PARP-3, NuMA, which is an essential regulator of mitotic division. These cells also showed problems in mitosis entry, in mitotic spindle formation, an increased mitosis duration and chromosomes aberrations. Performing protein interaction studies and using biochemical approaches, we highlighted a protein complex composed of PARP-3, NuMA and Tankyrase 1 (PARP-5a), involved in mitotic mechanisms. PARP-3 has a key role in the regulation of this complex. It plays essential role in mitotic progression and in mitotic spindle integrity maintenance and in telomere stability. The roles of PARP-3 in both DSB repair mechanisms and in mitotic progression indicate PARP-3 as a possible promising therapeutic target in cancer therapy

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Bouhlel, Bougdhira Imen. "The centrin-binding protein Sfi1 : functions in fission yeast and human." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017SACLS465/document.

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Abstract:

Le centrosome est le centre organisateur des microtubules dans les cellules animales, il nucléé les microtubules interphasiques ainsi que le fuseau mitotique. Les centrosomes sont produits par duplication, mécanisme rigoureusement régulé au cours du cycle cellulaire. En effet, un centrosome comporte deux centrioles qui se dupliquent une fois par cycle cellulaire. Des erreurs de duplication conduisant à plus de deux centrosomes induisent la formation de fuseaux multipolaires et provoquent des défauts de ségrégation des chromosomes. Chez la levure Schizosaccharomyces pombe, un organisme modèle pour l’étude de la division cellulaire, les homologues des centrosomes sont les SPBs (pour Spindle Pole Body). Une structure annexe spécifique liée aux SPBs est appelée demi-pont (quand les SPBs ne sont pas dupliqués) puis pont (quand elle relie les deux SPBs dupliqués). Les deux principaux composants du pont chez la levure S. pombe sont Cdc31 et Sfi1. Sfi1 est une protéine linéaire formée de répétitions en hélice α formant des sites de liaison pour la Centrine/Cdc31. Sfi1 s’assemble en réseau de molécules parallèles interagissant avec le SPB via leur domaine N-terminal. Lors de la première partie de ma thèse, j’ai démontré que Sfi1 est requis pour la duplication et la séparation des deux SPBs. Dans la première partie de ma thèse, je me suis intéressée aux fonctions de Sfi1 chez la levure. Cette étude a permis de démontrer que Sfi1 est un composant du demi-pont et qu’il est essentiel pour la duplication des SPBs et l’assemblage d’un fuseau bipolaire. De plus, nous avons déterminé que le pont est dupliqué en fin de mitose. Enfin, nous avons aussi montré que la déstabilisation du pont menant à sa rupture en mitose, dépend de la phosphorylation de Cdc31 par la kinase mitotique Cdk1. Lors de la seconde partie de ma thèse, je me suis intéressée au complexe Sfi1/Centrine dans les cellules humaines. J’ai confirmé que Sfi1 est localisée aux centrioles. De plus, j’ai montré que la déplétion de Sfi1 dans les cellules RPE1, conduit à une perte de localisation de la Centrine, suggérant soit un défaut de recrutement, soit une déstabilisation. De plus, en absence de Sfi1, les cellules RPE1 ne sont plus capables de former de cil primaire. Ce résultat suggère que Sfi1 et la Centrine sont requis pour la ciliogénèse. Enfin, j’ai aussi démontré que la déplétion deSfi1 induit un arrêt de cycle cellulaire dans les cellules non tumorales RPE1. Dans les cellules cancéreuses, HeLa, le cycle n’est pas arrêté mais j’ai pu observer une prolongation du temps de mitose. En conclusion mes travaux montrent que bien que la fonction de Sfi1/Centrin ne soit pas conservée, le complexe reste essentiel pour l’intégrité structurale et fonctionnelle du centrosome
The centrosome is the main microtubule organizing center. It nucleates and organizes interphase microtubule and contributes to the assembly of the bipolar mitotic spindle. To do so, the centrosome, present in one copy at the beginning of the cell cycle, duplicates to produce a second copy. The duplication process is tightly controlled and regulated since centrosome over-duplication can lead to multipolar mitotic spindles and promote genome instability and tumorigenesis. The duplication of the yeast centrosome, the SPB (Spindle pole body), begins with the duplication of the half bridge. This appendage is composed of Sfi1/Cdc31 complex organized in a parallel array attached to the core SPB. SPB duplication relies on the assembly of a second array of Sfi1/Cdc31, anti-parallel to the first one, creating thereby an assembly site for the new SPB. Therefore Sfi1 is essential for SPB duplication and our work defined the timing of half-bridge duplication and some of the regulatory mechanisms that favor bridge splitting to release duplicated centrosomes and allow spindle assembly at mitotic onset. Sfi1 and Cdc31/Centrins are conserved in human cells where the centrosome is composed of two centrioles surrounded by the pericentriolar material. Centrins are concentrated in the distal end of centrioles. Sfi1 has also been localized to centrioles, but its function remained unknown. Thus, we started investigating Sfi1 function in human cells. We found that Sfi1 depletion leads to a decrease in Centrin recruitment to the centrioles. It also leads to a cell cycle arrest in G1 in RPE1 cells, an event previously observed in presence of defects in centriole biogenesis. In HeLa cells where the cell cycle is not affected, Sfi1 depletion leads to a mitotic delay. Moreover, Sfi1 depletion leads to cilium assembly. To conclude, these results altogether point towards a role of human Sfi1 in centriole biogenesis

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Yung, Yuk Kwong. "Histone H3 Serine 28 is essential for efficient Polycomb-mediated gene repression in Drosophila." Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTT001/document.

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Abstract:

Dans le noyau de nos cellules l’ADN est enroulé autour de petites protéines que l’on appelle les histones et forme ainsi ce que l’on nomme la chromatine. L’activation des gènes permet la production de protéines qui sont nécessaires au bon fonctionnement des différentes cellules de notre organisme. Notre corps est composé de différentes cellules dont l’identité est définie par un patron de gènes actifs et inactifs bien spécifique. Au cours de la mitose (division des cellules) il est crucial que les cellules conservent leur identité, faute de quoi des structures non adaptées peuvent apparaître et dans certains cas conduire à l’apparition de cancers. Les protéines du groupe Polycomb (PcG) constituent un important système de mémoire cellulaire qui permet de maintenir un gène inactif au cours du développement d’un organisme. Ces protéines sont ciblées sur des gènes spécifiques où elles modifient la nature chimique des histones, rendant la chromatine compacte, difficile d’accès et donc empêchant l’activation de ces gènes. Lors de la mitose, la chromatine va se compacter drastiquement pour faciliter la ségrégation des chromosomes. Les mécanismes par lesquels les protéines du PcG s’adaptent à cette restructuration massive du génome ne sont pas connus. Mon projet est d’étudier le comportement des protéines du PcG au niveau de la chromatine à travers la mitose et ainsi de comprendre comment est préservée l’identité des cellules. Historiquement, les protéines du PcG ont été découvertes chez la drosophile et leurs mutations entrainent des anomalies au niveau du plan corporel. Ces protéines existent également chez l’homme et jouent un rôle essentiel dans le contrôle du développement. Ainsi mes travaux effectués chez la drosophile pourront être repris pour l’étude de ces protéines chez l’homme. Par l’utilisation de techniques de microscopie à fluorescence, il est possible de détecter la fixation des protéines du PcG au niveau de la chromatine au cours de la mitose. Il a été observé que durant la mitose l’une des protéines du PcG est dissociée de la chromatine alors que deux autres protéines de ce groupe sont quant à elles maintenues. L’ancrage des protéines du PcG à la chromatine se fait par le dépôt d’une modification chimique spécifique sur une histone, la triméthylation de la lysine 27 de l’histone 3 (H3K27me3). Pendant la mitose le résidu adjacent, la serine 28, va être phosphorylé (H3S28ph), et cette seconde modification perturbe la fixation des protéines du PcG. Pour mieux comprendre comment ces deux modifications (H3K27me3 et H3S28ph) définissent la fixation des protéines du PcG le long du chromosome lors de la mitose, j’analyserai la distribution de ces protéines le long du génome dans des cellules en mitose. D’autre part, j’étudierai les défauts développementaux provoques par l’absence de ces deux modifications chimiques à partir de drosophiles mutantes. La dérégulation des protéines du PcG entraine des défauts développementaux et est à l’origine de nombreux cancers chez l’homme. Des avancées dans le domaine pharmacologique ont permis d’élaborer des inhibiteurs de certaines des protéines du PcG qui pourraient constituer de nouvelles thérapies anti-cancer. Il est donc important de comprendre parfaitement les mécanismes d’actions de ces protéines, tout particulièrement au cours de processus biologiques cruciaux tel que la mitose
Polycomb group (PcG) proteins maintain repression on key developmental genes to preserve cell fates. It is unknown on how PcG-mediated repressive chromatin is inherited across cell cycles. This project aims to study the chromatin-binding profile of PcG proteins and their cognate histone mark (H3K27me3) in mitosis. We observed that Polycomb (Pc) were dissociated from chromosomes during mitosis and reassociation begins from late anaphase onwards. In contrary, Ph, PSC and high level of H3K27me3 were detected on mitotic chromosomes. Importantly, drug-inhibition of Aurora B and hence depletion of H3S28ph retained Pc on mitotic chromosomes. To further understand how mitotic H3S28ph affects PcG proteins binding profile, a FACS-sorting protocol was optimized to isolate mitotic cells for ChIP-seq analyses. In parallel, Drosophila model of histone mutants (H3K27R and H3S28A) were established to assess the importance of these modifications on PcG-mediated epigenetics inheritance across mitoses

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Rakkaa, Tarik. "Rôle de la kinase CDK11p58 dans la protection de la cohésion des chromatides sœurs au centromère." Thesis, Rennes 1, 2013. http://www.theses.fr/2013REN1S191.

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Abstract:

Pour assurer une ségrégation correcte des chromosomes, la cohésion entre les deux chromatides sœurs doit être protégée au centromère contre la vague de phosphorylation du "prophase pathway", depuis la prophase jusqu'à la transition métaphase-anaphase. Cette protection est sous contrôle de la shugoshine (Sgo1), une protéine recrutée au centromère par la thréonine 120 de l'histone H2A phosphorylée par la kinase Bub1. Mon équipe d'accueil a montré que la déplétion de la désacétylase HDAC3 conduit à l'acétylation et la perte de la di-méthylation de la lysine 4 de l'histone 3 au centromère. Cette acétylation forcée de H3K4 est corrélée avec un défaut de la protection de la cohésion et une perte de la localisation des acteurs majeurs de cette protection. L'objectif général de ma thèse est de déterminer le rôle de la protéine kinase CDK11p58 dans la protection de la cohésion. Nous avons pu confirmer que CDK11p58 est nécessaire à la protection de la cohésion centromérique. Des analyses de déplétion de CDK11 montrent une séparation précoce des chromatides sœurs. Cette séparation est corrélée à une perte de la localisation de Bub1, de la phosphorylation de H2A-T120 et de Sgo1 au centromère, mais la diméthylation de H3K4 reste intacte. Grâce à des expériences de FISH en utilisant des sondes qui ciblent la région centromérique du chromosome 11, nous avons démontré que CDK11 protège la cohésion des chromatides sœurs à partir de la mitose mais pas en interphase. En utilisant des lignées exprimant la forme sauvage ou mutée sur le domaine kinase de CDK11p58, nous avons démontré que l'activité kinase de cette protéine est nécessaire pour ce processus de protection. Les résultats de ma thèse documentent le rôle de l'activité kinase de CDK11p58 dans la protection de la cohésion des chromatides sœurs. Ces résultats montrent l'existence d'un substrat de CDK11p58 impliqué dans le recrutement au centromère des facteurs de cohésion qui assurent la protection des cohésines centromériques contre le "prophase pathway"
Sister chromatid cohesion during the early stages of mitosis is essential to ensure faithful chromosome segregation. Sister chromatid cohesion is established in S phase and is maintained at centromeres until the metaphase to anaphase transition. Protection of cohesion at centromeres is under the control of the Bub1 kinase which phosphorylates histone H2A on threonine 120. Phosphorylated H2AT120 recruits the cohesion protection factor shugoshin (Sgo1) at centromeres. We had previously reported that depletion of the HDAC3 deacetylase induces acetylation of histone H3 lysine 4 at the centromere and loss of dimethylation at the same position. Forced acetylation of H3K4 at centromeres correlates with impaired Sgo1 recruitment and loss of sister chromatid separation. Cdk11p58, a member of the p34cdc2 related protein kinase family, is a G2/M specific protein, involved in different cell cycle events such as centrosome maturation, spindle formation or centriole duplication. It has also been reported as being involved in sister chromatid cohesion. Here we report that, upon cdk11p58 depletion, sister chromatids do not prematurely separate until the early stages of mitosis. We confirm that Cdk11p58 depletion induces a loss of Bub1 and Sgo1 from the centromeres and we show that H3K4 dimethylation is not affected by Cdk11p58 depletion. We report that depletion of endogenous Cdk11p58 in a cell line expressing a kinase-dead version of Cdk11p58 do not rescue the premature sister chromatid separation phenotype. Thus, phosphorylation of an unknown susbtrate by Cdk11p58 is necessary to maintain Bub1 at centromeres and our efforts are now directed towards its identification

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Kuhnert, Oliver. "Charakterisierung der neuen centrosomalen Proteine CP148 und CP55 in Dictyostelium discoideum." Phd thesis, Universität Potsdam, 2012. http://opus.kobv.de/ubp/volltexte/2012/5994/.

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Abstract:

Das im Cytosol liegende Dictyostelium Centrosom ist aus einer geschichteten Core-Region aufgebaut, die von einer Mikrotubuli-nukleierenden Corona umgeben ist. Zudem ist es über eine spezifische Verbindung eng an den Kern geknüpft und durch die Kernmembran hindurch mit den geclusterten Centromeren verbunden. Beim G2/M Übergang dissoziiert die Corona vom Centrosom und der Core verdoppelt sich so dass zwei Spindelpole entstehen. CP55 und CP148 wurden in einer Proteom-Analyse des Centrosoms identifiziert. CP148 ist ein neues coiled-coil Protein der centrosomalen Corona. Es zeigt eine zellzyklusabhängige An- und Abwesenheit am Centrosom, die mit der Dissoziation der Corona in der Prophase und ihrer Neubildung in der Telophase korreliert. Während der Telophase erschienen in GFP-CP148 exprimierenden Zellen viele, kleine GFP-CP148-Foci im Cytoplasma, die zum Teil miteinander fusionierten und zum Centrosom wanderten. Daraus resultierte eine hypertrophe Corona in Zellen mit starker GFP-CP148 Überexpression. Ein Knockdown von CP148 durch RNAi führte zu einem Verlust der Corona und einem ungeordneten Interphase Mikrotubuli-Cytoskelett. Die Bildung der mitotischen Spindel und der astralen Mikrotubuli blieb davon unbeeinflusst. Das bedeutet, dass die Mikrotubuli-Nukleationskomplexe während der Interphase und Mitose über verschiedene Wege mit dem Core assoziiert sind. Des Weiteren bewirkte der Knockdown eine Dispersion der Centromere sowie eine veränderte Sun1 Lokalisation in der Kernhülle. Somit spielt CP148 ebenso eine Rolle in der Centrosomen-Centromer-Verbindung. Zusammengefasst ist CP148 ein essentielles Protein für die Bildung und Organisation der Corona, welche wiederum für die Centrosom/Centromer Verbindung benötigt wird. CP55 wurde als Protein der Core-Region identifiziert und verbleibt während des Zellzyklus am Centrosom. Dort besitzt es strukturelle Aufgaben, da die Mehrheit der GFP-CP55 Moleküle in der Interphase keine Mobilität zeigten. Die GFP-CP55 Überexpression führte zur Bildung von überzähligen Centrosomen mit der üblichen Ausstattung an Markerproteinen der Corona und des Cores. CP55 Knockout-Zellen waren durch eine erhöhte Ploidie, eine weniger strukturierte und leicht vergrößerte Corona sowie zusätzliche cytosolische Mikrotubuli-organisierende Zentren charakterisiert. Letztere entstanden in der Telophase und enthielten nur Corona- aber keine Core-Proteine. In CP55 k/o Zellen erfolgte die Rekrutierung des Corona-Organisators CP148 an den Spindelpol bereits in der frühen Metaphase anstatt, wie üblich, erst in der Telophase. Außerdem zeigten die Knockout-Zellen Wachstumsdefekte, deren Grund vermutlich Schwierigkeiten bei der Centrosomenverdopplung in der Prophase durch das Fehlen von CP55 waren. Darüber hinaus konnten die Knockout-Zellen phagozytiertes Material nicht verwerten, obwohl der Vorgang der Phagozytose nicht beeinträchtigt war. Dieser Defekt kann dem im CP55 k/o auftretenden dispergierten Golgi-Apparat zugeschrieben werden.
The Dictyostelium centrosome consists of a layered core structure surrounded by a microtubule-nucleating corona. A tight linkage through the nuclear envelope connects the cytosolic centrosome with the clustered centromeres within the nuclear matrix. At G2/M the corona dissociates, and the core structure duplicates yielding two spindle poles. The two proteins CP148 and CP55 were discovered in a proteomic analysis of Dictyostelium centrosomes. CP148 is a novel coiled-coil protein of the centrosomal corona. GFP-CP148 exhibited cell cycle dependent presence and absence at the centrosome, which correlates with dissociation of the corona in prophase and its reformation in late telophase. During telophase, GFP-CP148 formed cytosolic foci, which coalesced and joined the centrosome. This explains the hypertrophic appearance of the corona upon strong overexpression of GFP-CP148. Depletion of CP148 by RNAi caused virtual loss of the corona and disorganization of interphase microtubules. Surprisingly, formation of the mitotic spindle and astral microtubules was unaffected. Thus, microtubule nucleation complexes associate with centrosomal core components through different means during interphase and mitosis. Furthermore, CP148 RNAi caused dispersal of centromeres and altered Sun1 distribution at the nuclear envelope, suggesting a role of CP148 in the linkage between centrosomes and centromeres. Taken together, CP148 is an essential factor for the formation of the centrosomal corona, which in turn is required for centrosome/centromere linkage. As CP148, CP55 was also identified in a centrosomal proteome analysis. It is a component of the centrosomal core structure, and persists at the centrosome throughout the entire cell cycle. FRAP experiments revealed the majority of centrosomal GFP-CP55 is immobile indicating a structural task of CP55 at the centrosome. GFP-CP55 overexpression elicits supernumerary centrosomes containing the usual set of corona and core marker proteins. The CP55 null mutant is characterized by increased ploidy, a less structured, slightly enlarged corona, and by supernumerary, cytosolic MTOCs, containing only corona proteins and lacking a core structure. Live cell imaging showed that supernumerary MTOCs arise in telophase. Lack of CP55 also caused premature recruitment of the corona organizer CP148 to mitotic spindle poles, already in metaphase instead of telophase. Forces transmitted through astral microtubules may expel prematurely acquired or loosely attached corona fragments into the cytosol, where they act as independent MTOCs. CP55null cells were also impaired in growth, most probably due to difficulties in centrosome splitting during prophase. Furthermore, although they were still capable of phagocytosis, they appeared unable to utilize phagocytosed nutrients. This inability may be attributed to their disorganized Golgi apparatus.

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Tsaousis, Anastasios. "Evolution and function of the microsporidian mitosome." Thesis, University of Newcastle Upon Tyne, 2007. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.533700.

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Paganelli, Laëtitia. "Étude de partenaires protéiques d’une protéine associée aux microtubules, MAP65-3, indispensable à la formation des cellules géantes induites par le nématode à galles Meloidogyne incognita : caractérisation du complexe de surveillance de la mitose chez Arabidopsis." Thesis, Nice, 2013. http://www.theses.fr/2013NICE4028/document.

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Abstract:

Les nématodes à galles du genre Meloidogyne sont des parasites obligatoires des plantes. Lors de l’interaction compatible, ils induisent la formation de cellules nourricières hypertrophiées et plurinucléées leur permettant d’assurer croissance et reproduction. L'étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la formation de ces cellules géantes a permis d’identifier une protéine associée aux microtubules, MAP65-3, essentielle à la formation de ces cellules géantes et au développement du nématode. Un des partenaires protéiques de MAP65-3 est un homologue de BUB3, membre du « Mitotic Checkpoint Complex » (MCC). Le MCC est un point de contrôle de la mitose assurant la fidélité de la ségrégation des chromosomes. Au cours de ma thèse, j'ai caractérisé chez la plante modèle Arabidopsis thaliana les homologues du MCC: BUB3.1, MAD2 et la famille multigénique composée de BUBR1, BRK1 et BUB1.2. J’ai démontré les interactions in planta entre les membres du complexe, certaines interactions ayant lieu au niveau des noyaux, voire au niveau des centromères. J’ai réalisé l’analyse fonctionnelle de ces gènes et montré qu’ils étaient exprimés dans les tissus enrichis en cellules en division comme MAP65-3. L’étude de la localisation subcellulaire des protéines a révélé une localisation cytoplasmique pour BUB3.1, BUB1.2 et MAD2, nucléaire pour BUBR1 et centromérique pour BRK1. Nous avons pu également montrer que lorsque des défauts d’attachement des microtubules du fuseau mitotique sont provoqués, BUB3.1, BUBR1 et MAD2 se relocalisent au niveau des kinétochores. L’étude de la famille BUB1/BUBR1 a révélé que l’inactivation des gènes correspondants induisait une sensibilité accrue à un traitement chimique déstabilisant les réseaux de microtubules. L’étude de la mitose chez ces mutants a révélé que BUBR1 est essentielle à la réalisation d’une mitose sans erreur chez Arabidopsis. Ce travail a ainsi permis de caractériser pour la première fois le MCC chez A. thaliana
Root-knot nematodes from the genus Meloidogyne are obligate biotrophic plant parasites. During a compatible interaction, they induce the redifferentiation of root cells into multinucleated and hypertrophied feeding cells to ensure their growth and reproduction. The study of molecular and cellular mechanisms underlying giant cell ontogenesis has led to the identification of a Microtubule-Associated Protein, MAP65-3, essential for giant cell ontogenesis and nematode development. One of the MAP65-3 interacting partners is a BUB3 homologue, member of the Mitotic Checkpoint Complex (MCC). The MCC is a surveillance mechanism ensuring that chromosomes undergoing mitosis do not segregate until they are properly attached to the microtubules of the mitotic spindle. During my thesis, I have characterized the Arabidopsis thaliana orthologs of the MCC, BUB3.1, MAD2 and the multigenic family composed of BUBR1, BRK1 et BUB1.2. I have demonstrated that MAP65-3 and all the MCC members interact together in planta, some interactions taking place within the nuclei or at the centromeres. As MAP65-3, all these genes are expressed in dividing cells. The study of the subcellular localization of the protein showed a cytoplasmic localization for BUB3.1, BUB1.2 and MAD2, nuclear for BUBR1 and centromeric for BRK1. Thus, the MCC proteins did not relocalize to the kinetochore during a normal mitosis in planta. BUB3.1, BUBR1 and MAD2 localize to the unattached kinetochores following defects in spindle assembly as observed in cells treated with microtubule poisons. The functional analysis of BUB1/BUBR1 multigenic family showed that the knock-out mutants were more sensitive to microtubule-destabilizing drugs. Furthermore, analysis of mitosis revealed that BUBR1 is essential for an error-free mitosis in Arabidopsis. This work represents the first characterization of the MCC in A. thaliana

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Loukil, Abdelhalim. "Etude de la cycline A2 : interactions, dégradation et mise en évidence du rôle de l'autophagie." Thesis, Montpellier 2, 2012. http://www.theses.fr/2012MON20115.

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Abstract:

Le cycle cellulaire est finement régulé dans le temps et l'espace. Nous avons abordé les aspects dynamiques des interactions que la cycline A2 entretient avec ses partenaires Cdk1, Cdk2 et l'ubiquitine au cours du cycle cellulaire, dans des lignées cellulaires humaines. A cette fin, nous avons eu recours aux approches de FRET (Förster/fluorescence resonance energy transfer) et de FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy). Ceci nous a permis de montrer que les formes ubiquitinylées de la cycline A2 apparaissent principalement sous forme de foyers en prométaphase et se propagent ensuite à l'ensemble de la cellule. En outre, nous avons découvert que l'autophagie participe à la dégradation de cette cycline en mitose. Nous discutons les implications de ces observations quant à un rôle éventuel de la cycline A2 au moment de la formation de l'anneau de constriction, ainsi que de la participation de l'autophagie via cette cycline, dans la réponse aux dommages à l'ADN en mitose
The cell cycle is finely regulated in time and space. We have studied the dynamical aspect of the interactions between cyclin A2 and its partners Cdk1, Cdk2 and ubiquitin during the cell cycle, in human cell lines. To this aim, we have used FRET (Förster/fluorescence resonance energy transfer) and FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy) techniques. We have thus shown that ubiquitylated forms of cyclin A2 are detected predominantly in foci in prometaphase, before spreading throughout the cell. Moreover, we have shown that autophagy contributes to cyclin A2 degradation in mitosis. We discuss the implications of these observations regarding a possible role of cyclin A2 when the cleavage furrow forms, and the participation of autophagy in DNA damage response in mitosis

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Breeden, Lauren N. "Mitosis : a collection." Honors in the Major Thesis, University of Central Florida, 2003. http://digital.library.ucf.edu/cdm/ref/collection/ETH/id/409.

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Abstract:

This item is only available in print in the UCF Libraries. If this is your Honors Thesis, you can help us make it available online for use by researchers around the world by following the instructions on the distribution consent form at http://library.ucf.edu/Systems/DigitalInitiatives/DigitalCollections/InternetDistributionConsentAgreementForm.pdf You may also contact the project coordinator, Kerri Bottorff, at kerri.bottorff@ucf.edu for more information.
Bachelors
Arts and Sciences
English

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Landmann, Cedric. "Rôles et régulations de Polo et BubR1 sur les cassures double-‐brin de l'ADN en mitose." Thesis, Bordeaux, 2017. http://www.theses.fr/2017BORD0852/document.

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Abstract:

La présence de cassures double-brin de l'ADN en mitose est problématique pour les cellules, car cette situation produit des fragments de chromosome ne possédant pas de centromères. En l'absence d'un mécanisme permettant leur prise en charge, ces fragments acentriques n'étant pas attachés au fuseau mitotique, pourraient être ségrégés aléatoirement dans les cellules filles, causant de l'instabilité génomique. Nous avons découvert un mécanisme permettant la transmission correcte des fragments acentriques dans les cellules filles via une structure faisant le lien entre les deux fragments cassés. Plusieurs protéines sont recrutées sur les cassures, comme les kinases mitotiques BubR1 et Polo, et favorisent la ségrégation correcte de ces chromosomes cassés. Cependant, les mécanismes permettant le recrutement de BubR1 et Polo sur les cassures d'ADN en mitose sont inconnus. De plus, les mécanismes moléculaires par lesquels BubR1 et Polo favorisent la ségrégation correcte des fragments acentriques restent à être identifiés. La première partie de mon projet a été d'étudier le rôle et la régulation de BubR1 sur les cassures d'ADN pendant la mitose. Nous avons montré que BubR1 requiert Bub3 pour se localiser sur les chromosomes cassés afin de favoriser leur ségrégation correcte. Nous avons également détecté l'accumulation de FizzyCDC20, un cofacteur de l'E3 ubiquitine ligase APC/C (Anaphase-Promoting- Complex/Cyclosome), sur les cassures d'ADN, et son recrutement dépend de son interaction avec la KEN Box de BubR1. De plus, l'utilisation d'un substrat synthétique de l'APC/C nous a permis de démontrer que la dégradation par l'APC/C est inhibée localement autour du chromosome cassé, de manière dépendante de BubR1. Ces résultats suggèrent fortement que le complexe BubR1/Bub3 recrut é sur les cassures d'ADN inhibe localement l'APC/C en séquestrant FizzyCDC20 et empêche ainsi la dégradation de substrats clefs impliqués dans la ségrégation correcte des chromosomes cassés. La seconde partie de mon projet a été d'étudier les relations d'interdépendance entre Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. Nous avons utilisé un laser UV pulsé pour induire des cassures dans un chromosome à un instant précis pendant la mitose, puis nous avons suivi le recrutement de protéines tagguées GFP sur les cassures de chromosome. Cette étude révèle que Polo est rapidement recrutée sur les cassures d'ADN et précède BubR1, Bub3 et Fizzy. De plus, la disparition de BubR1, Bub3 et Fizzy des cassures d'ADN coïncide avec la télophase alors que Polo disparait des cassures pendant l'interphase. Nous avons également montré que le recrutement de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN est retardé dans les mutants polo, indiquant que Polo est requis pour un recrutement efficace de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN. Pour finir, nous avons montré que l'accumulation de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN dépend de deux composants de la réponse aux dommages à l'ADN, le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) et ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Ce travail a permis d'avoir une meilleure compréhension sur la dynamique de recrutement de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. De plus, le mécanisme moléculaire par lequel le complexe BubR1/Bub3 agit pour faciliter la ségrégation des chromosomes cassés a pu être en partie élucidé
The presence of DNA double strand breaks (DSB) during mitosis is challenging for the cell, as it produces fragments of chromosome lacking a centromere. If not processed, this situation can cause genomic instability resulting in improper segregation of the broken fragments into daughter cells. We uncovered a mechanism by which broken chromosomes are faithfully transmitted to daughter cells via the tethering of the two broken chromosome ends. Several proteins including the mitotic kinase BubR1 and Polo are recruited to the breaks and mediate the proper segregation of the broken fragments. However, the mechanism underlying Polo and BubR1 recruitment to DNA breaks is unknown. Moreover, the molecular mechanisms by which Polo and BubR1 mediate the proper segregation of the broken fragments remain to be elucidated. We first investigated the role and regulation of BubR1 on DNA breaks during mitosis. We show that BubR1 requires Bub3 to localize on the broken chromosome fragment and to mediate its proper segregation. We also find that FizzyCdc20, a co--‐factor of the E3 ubiquitin ligase Anaphase--‐Promoting--‐Complex/Cyclosome (APC/C), accumulates on DNA breaks in a BubR1 KEN box--‐dependent manner. A biosensor for APC/C activity demonstrates a BubR1--‐dependent local inhibition of APC/C around the segregating broken chromosome. These results are consistent with a model where Bub3/BubR1 complex on DNA breaks functions to inhibit the APC/C locally via the sequestration of FizzyCdc20, thus preserving key substrates from degradation, which promotes proper transmission of broken chromosomes. In a second study, we investigated the dependency relationship between Polo and BubR1/Bub3/Fizzy on DNA breaks in mitosis. We used a pulsed UV laser to break one chromosome at a define time during mitosis. We immediately follow the recruitment of GFP--‐tagged proteins to laser--‐induced DNA breaks. My study reveals that Polo is promptly recruited to DNA breaks and precedes BubR1, Bub3 and Fizzy. In addition, while BubR1, Bub3 and Fizzy dissociation from the breaks coincide with telophase and the nuclear envelope reformation, Polo remains on the breaks well into interphase. We further show that the appearance of BubR1, Bub3 and Fizzy on DNA breaks is delayed in polo mutant, indicating that Polo is required for the robust and efficient recruitment of BubR1, Bub3 and Fizzy to DNA breaks. Finally, the timely accumulation of Polo, BubR1 and Bub3 to DNA breaks depends on two components of the DNA Damage Response, the MRN complex (Mre11--‐Rad50--‐Nbs1) and ATM (ataxia--‐telangiectasia mutated). This work gives us a better understanding on how Polo and BubR1, Bub3 and FizzyCdc20 are recruited to DNA breaks in mitosis and how they promote broken chromosomes segregation

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Ramírez, Cota Rosa María. "Dissecting the function of γTuRC subunits in microtubule nucleation and organization." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2016. http://hdl.handle.net/10803/398851.

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Abstract:

The depletion of MZT1 in human cells causes severe mitotic spindle defects. Depleted cells lack centrosomal γ-tubulin and arrest in mitosis with a monopolar spindle configuration. Similarly, double deletion mutants of the plant MZT1 orthologs GIP1a and GIP1b are embryonic lethal due to abnormal spindle microtubule distribution and chromosome mis-segregation. Moreover GIP1a and GIP1b were shown to localize to active nucleation sites in the interphase cortical microtubule array. MZT1 function is conserved in fission yeast, where it interacts with GCP3, and is an essential component for the recruitment of the γ-tubulin complex to the spindle pole body, the centrosome equivalent, but not for assembly of the γ-tubulin complex. However, the molecular mechanisms underlying these effects remain unknown. The main goal of this project is to study how MZT1 regulates γTuRC to control MT nucleation and organization. In this work I confirm that in human cells MZT1 is a subunit of the γTuRC and is required for the targeting of the γTuRC to centrosomes and for proper spindle formation. By sucrose gradient fractionation I found that in mammalian cells, MZT1 is not required to assemble the γTuRC. Interestingly, I found that MZT1 is necessary for the interaction of the γTuRC with the targeting factor NEDD1/GCPWD. While in plants and in fission yeast MZT1 interacts with the N-terminal region of GCP3, I found that in mammalian cells MZT1 interacts with a conserve motif at the N-terminal extension of GCP2, GCP3, GCP5 and GCP6. Furthermore, by immunoprecipitation of FLAG-tagged GCPs MZT1 binding motif mutants, I found that the mutants can be integrated into the γTuRC but lost the interaction with GCP-WD and fail to be targeted to the centrosomes To study the role of MZT1 in MT nucleation I performed a MT regrowth experiment with U2OS cells over expressing the CDK5RAP2 nucleation-activating fragment (CDK5RAP2 CM1) and depleted of MZT1. The MT nucleation induced by CDK5RAP2 was lost upon the depletion of MZT1, suggesting that MZT1 in required for the MT nucleation activation mediated by CDK5RAP2. In summary MZT1 is required for all γTuRC-dependent functions including centriole duplication. MZT1 binds to a conserved motif present in the extended N-termini of GCP2, GCP3, GCP5 and GCP6, allowing specific recognition of fully assembled γTuRC. Binding of MZT1 primes γTuRC for interaction with the adapter NEDD1/GCP-WD for targeting γTuRC to centrosomes. In addition, MZT1-dependent priming is required for the CDK5RAP2 CM1 domain to activate γTuRC nucleation activity. Thus, by enabling specific recognition of γTuRC by targeting and activation factors, MZT1 spatially controls microtubule nucleation
En las células humanas la depleción de MZT1 provoca graves defectos del huso mitótico. Las células deplecionadas carecen de γ-tubulina centrosomal y presentan una detención de la mitosis con una configuración monopolar del huso mitótico. Del mismo modo, mutantes de deleción dobles de planta MZT1 con sus ortólogos GIP1a y GIP1b son letales para los embriones debido a la anormal distribución de los microtúbulos del huso mitótico y la mala segregación del cromosoma. Además, GIP1a y GIP1b localizan en sitios de nucleación activos de los microtúbulos corticales. La función de MZT1 se conserva en la levadura de fisión, donde interactúa con GCP3, y es un componente esencial para el reclutamiento del complejo de γ-tubulina en el huso polar del cuerpo apical, el equivalente al centrosoma, pero no para el montaje de la γ-tubulina compleja. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a estos efectos siguen siendo desconocidos. El objetivo principal de este proyecto es estudiar cómo MZT1 regula la actividad del γTuRC en la nucleación y organización de los microtúbulos. En este trabajo encontré que MZT1 es necesaria para todas las funciones γTuRC-dependientes, como la duplicación de centríolos. MZT1 se une a un motivo conservado presente en la N-terminales extendida de GCP2, GCP3, GCP5 y GCP6, lo que permite el reconocimiento específico de γTuRC totalmente ensamblado. La unión de MZT1 al γTuRC “prepara” al complejo para la interacción con el adaptador NEDD1/GCP-WD para la orientación γTuRC a los centrosomas. Además, se requieren esta “preparación” para activar la actividad nucleadora del γTuRC mediada por CDK5RAP2 CM1. Por lo tanto, al permitir el reconocimiento específico de γTuRC por los factores de reclutamiento y los factores de activación, se observa que la MZT1 controla espacialmente la nucleación de microtúbulos.

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Eibes, González Susana. "Functional study of the NIMA protein kinases Nek9, Nek6 and Nek7 at the onset of mitosis. Control of the kinesin Eg5 and prophase centrosome separation." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2016. http://hdl.handle.net/10803/399449.

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Abstract:

Mitosis is a tightly regulated process that aims to ensure the correct distribution of the chromosomes between the two newly generated cells. Many protein kinases have been defined as essential for this process: cyclin- dependent kinases, Aurora family and Polo family kinases are some of the most relevant players. The objective of this thesis is to characterize one of the less studied kinase pathways involved in this process, which is constituted by the NIMA-related kinases Nek9, Nek6 and Nek7. Nek9 is activated at the onset of mitosis by a double step mechanism mediated by CDK1 and Plk1. Once Nek9 is activated it can bind to Nek6 and Nek7 and phosphorylate them, promoting their activation. Finally, Nek6 and Nek7 are responsible for the phosphorylation of the kinesin Eg5, promoting Eg5 accumulation at centrosome, and consequently, centrosome separation. The kinesin eg5 motor protein is considered as one of the major players for centrosome separation and formation of the bipolar spindle. The tetramer configuration allows Eg5 to bind antiparallel microtubules and slide them apart, exerting a force that promotes centrosome separation and the maintenance of the bipolar spindle. Centrosome separation, however, is a highly intricate process that involves several pathways, including Eg5 activity. Dynein presents a directed activity towards the minus ends of microtubules, which has a redundant role to Eg5 in centrosome separation. Dynein accumulation at the cell cortex and the nuclear membrane, through its adaptor BicD2, is also involved in centrosome tethering at the nuclear envelope, a necessary step prior to separation. Furthermore, dynein can control the position of Eg5 at the spindle via TPX2, an event that could also happen before nuclear envelope breakdown (NEB). Here we describe the conditions required for Eg5 accumulation at the centrosmes after Ser1033 phosphorylation. During the development of this project we have explored the essential circumstances for correct Eg5 localization in cells. By using protein-protein interaction techniques and shRNA depletion of protein candidates we have determined that another motor protein, dynein, together with the adaptor BicD2 and the protein TPX2 are responsible for Eg5 accumulation around centrosomes. Additionally, we proposed TPX2 as a novel Nek9 substrate and we have investigated the role of this phosphorylation, which affects TPX2 localization during prophase, before NEB. We present with this thesis a model for Eg5 accumulation at microtubule minus ends and centrosome separation during prophase summarized in the following points: 1) Dynein complex transports Eg5 towards the centrosome. Dynein interacts with Eg5 independently of the Ser1033 phosphorylation. The adaptor BicD2, which interacts directly with Eg5 tail domain, mediates the interaction. Dynein motility towards microtubule minus ends and the presence of BicD2 on the complex are required for Eg5 localization at centrosomes. Thus, the dynein complex is required for Eg5 transport to the centrosomes during G2-M transition. 2) TPX2 inhibits Eg5 motility in response to Ser1033 phosphorylation. TPX2 is necessary for the correct localization of Eg5 at centrosomes during prophase. TPX2 mislocalization at centrosomes without altering its overall levels leads to failed Eg5 localization, therefore the presence of TPX2 at centrosomes during prophase is required for Eg5 localization. TPX2 interacts with Eg5 during mitosis and the interaction is abolished when the Ser1033 can’t be phosphorylated. Thus, TPX2 is able to respond to Eg5 Ser1033 phosphorylation, which we propose is promoting the interaction between these two proteins, and consequently inhibiting Eg5 motility at centrosomal levels. 3) TPX2 phosphorylation by Nek9 promotes its centrosomal localization. Nek9 phosphorylation of TPX2 is responsible for TPX2 localization at the spindle poles during prophase. Nek9 phosphorylates TPX2 at residues that are proximal to a NLS, making TPX2 localization more cytoplasmic and promoting its accumulation to the area where Nek9 is more active, the centrosome.
La mitosis es un proceso altamente regulado cuyo objetivo es asegurar la correcta distribución de los cromosomas entre las dos células nuevamente generadas. Diferentes proteínas quinasas han sido definidas como esenciales en este proceso pero el objetivo de esta tesis es caracterizar una de las rutas de señalización menos estudiada, la cual la componen las NIMA quinasas Nek9, Nek6 y Nek7. Nek9 es activada al inicio de mitosis por un doble mecanismo mediado por CDK1 y Plk1. Una vez activada, se puede unir a Nek6 y Nek7 y fosforilarlas, promoviendo su activación. Finalmente, Nek6 y Nek7 son responsables de la fosforilación de la quinesina Eg5, promoviendo la acumulación de Eg5 en los centrosomas, y en consecuencia, la separación de los mismos en profase. Aquí describimos las condiciones necesarias para la acumulación de Eg5 en los centrosomas después de la fosforilación en la Ser1033. Durante el desarrollo de este trabajo hemos explorado las circunstancias esenciales para una correcta localización de Eg5 en las células. Usando técnicas de interacción proteína-proteína y técnicas de silenciamiento proteico de candidatos con shRNA hemos determinado que otra proteína motora, dineína, junto con el adaptador BicD2 y la proteína TPX2, son responsables de la acumulación de Eg5 alrededor de los centrosomas. Además, hemos propuesto a TPX2 como un nuevo substrato regulado por Nek9 y hemos investigado el papel de esta fosforilación, la cual afecta la localización de TPX2 durante profase, antes de la rotura de la membrana nuclear. Con esta tesis presentamos un modelo para la acumulación de Eg5 y la separación de los centrosomas en profase que puede ser resumido en los siguientes puntos: - El complejo de dineína transporta Eg5 hacia el centrosoma independientemente de la fosforilación en la Ser1033. El adaptador BicD2 media esta interacción uniéndose directamente al dominio C terminal de Eg5. -TPX2 inhibe movilidad de Eg5 en respuesta a la fosforilación en la Ser1033. - La presencia de TPX2 en los centrosomas es necesaria para la localización de Eg5. La fosforilación de TPX2 por Nek9 promueve la localización de TPX2 en los centrosomas durante la profase.

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Martínez, Delgado Paula. "Identification of novel NEK9 substrates and functions through the use of genetically engineered mice. Novel roles in the control of the centrosome cycle." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2018. http://hdl.handle.net/10803/663722.

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Abstract:

Mitosis is a process that ensure the correct distribution of the chromosomes between the two newly generated cells, is tightly regulated by two main processes, protein degradation controlled by the APC and protein phosphorylation by different mitotic kinases. CDK1 is the master regulator of mitosis but in the last decades proteins from the Aurora or Polo or the NIMA family have been shown to play key roles in mitosis. The objective of this thesis is to identify new roles during the cell cycle and more specifically the late phases of mitosis of Nek9, a NIMA-related kinase. We aim to characterize new substrates and functions of the kinase by using different cell lines and genetically modified mice and interfering with Nek9 expression. The centrosome acts as the major microtubule-organizing center (MTOC) of the cell to maintain cytoskeleton in interphase and to organize the bipolar spindle in mitosis, and its duplication cycle is coupled with the cell cycle. When the cell enters mitosis, the duplicated centrosomes separate to the spindle poles and assemble the bipolar mitotic spindle for accurate chromosome separation and to maintain genomic stability. However, centrosome aberrations occur frequently and often lead to abnormal mitotic spindle formation, which can result in abnormal chromosome segregation and as a consequence tumorigenesis, microcephaly or ciliopathies. Nek9 is inactive during interphase and activated at centrosomes and spindle poles during mitosis by a two-step mechanism mediated by Plk1 and CDK1. Once active, Nek9 is able to bind Nek6 and Nek7 and directly phosphorylate these kinases inducing in turn their activation. Our group has shown that Nek6/7 phosphorylates the kinesin Eg5 at Ser1033 in the C-terminal domain, modulating the accumulation of Eg5 at or around centrosomes and their separation during prophase. Nek9 also phosphorylates the adapter NEDD1/GCP-WD, independently of Nek6/7, contributing to its recruitment to the centrosome and in consequence, to the recruitment of the microtubule nucleating complex formed by y-tubulin to the same organelle. Thus, Nek9, Nek7 and Nek6 regulate different aspects of the centrosome machinery during the entry in mitosis and have a role in spindle organization and correct mitotic progression. Here we show that animals with a single Nek9 KO allele are healthy and fertile but intercrosses between them have not resulted in any homozygous null animals among born offspring indicating that the deletion of Nek9 is embryonic lethal. Also embryos obtained from these intercrosses had a higher frequency of mitotic abnormalities that result in death during the first days of development. As Nek9 is important for the proper development of mitosis we checked whether the expression in heterozygosity of Nek9 results in tumors affecting the viability of the animals. Some differences in tumor-free lifespan between heterozygous and wild type animals have been observed, with the appearance of tumors and aneuploidy. In addition, elimination of Nek9 expression lead to the apparition of abnormal mitosis, aneuploidy and multiple centrosomes both in genetically engineered MEFs and human cells, resulting in accumulation of centrobin, a protein mostly associated with the daughter centrioles, in the amplified centrioles. In the present thesis we describe possible new functions and substrates of Nek9 in the centrosome cycle, closely linked to the cell division cycle, after interfering with its expression using different strategies.
La mitosis es un proceso que asegura la distribución correcta de los cromosomas entre dos células recién generadas, está regulada por dos procesos principales, la degradación y la fosforilación de proteínas por diferentes quinasas mitóticas. CDK1 es el principal regulador de la mitosis, pero en las últimas décadas se ha demostrado que las proteínas de la familia Aurora o Polo o NIMA desempeñan un papel clave en la mitosis. El objetivo de esta tesis es identificar nuevas funciones de Nek9, una quinasa de la familia NIMA, durante el ciclo celular y más específicamente durante las fases tardías de la mitosis. Nuestro objetivo es caracterizar nuevos sustratos y funciones de la quinasa mediante el uso de diferentes líneas celulares y ratones genéticamente modificados que nos permiten interferir con la expresión de Nek9. El centrosoma actúa como el principal centro organizador de microtúbulos de la célula para mantener el citoesqueleto en interfase y para organizar el huso bipolar en la mitosis, su ciclo de duplicación va en sintonía con el ciclo celular. Cuando la célula entra en mitosis, los centrosomas duplicados se separan ensamblando el huso mitótico para segregar los cromosomas y para mantener la estabilidad genómica. Sin embargo, diferentes aberraciones ocurren con frecuencia en el centrosoma y a menudo conducen a la formación anormal del huso mitótico, que puede dar como resultado una segregación cromosómica anormal y, como consecuencia, tumorogénesis, microcefalia o ciliopatias. Nek9 está inactiva en interfase y se activa en los centrosomas durante la mitosis mediante un mecanismo de dos pasos mediado por Plk1 y CDK1. Una vez activo, Nek9 se puede unir a Nek6 y Nek7 y fosforilarlas induciendo a su vez su activación. Nuestro grupo ha demostrado que Nek6/7 fosforilan la quinesina Eg5, modulando la acumulación de Eg5 en los centrosomas y su separación durante la profase. Nek9 también fosforila el adaptador NEDD1 / GCP-WD, independientemente de Nek6/7, lo que contribuye a su reclutamiento en el centrosoma y, en consecuencia, al reclutamiento del complejo de nucleación de microtúbulos formado por y-tubulina. Aquí mostramos que los animales con un único alelo Nek9 KO están sanos y son fértiles. Sin embargo, los cruces entre ellos no dan lugar a ningún animal KO homocigoto, lo que indica que la eliminación de Nek9 es letal durante el desarrollo embrionario. Además, los embriones procedentes de estos cruces tienen una mayor frecuencia de defectos mitóticos que provocan la muerte durante los primeros días de desarrollo. Como Nek9 es importante para el correcto desarrollo de la mitosis, queríamos ver si la expresión en heterocigosis daba como resultado tumores que afectan la viabilidad de los animales. Se han observado algunas diferencias en la esperanza de vida libre de tumores entre los heterocigotos con cierta incidencia de cáncer y aneuploidía. Por otro lado, la eliminación de la expresión de Nek9 en células conduce a la aparición de mitosis anormales, aneuploidía y múltiples centrosomas, tanto en fibroblastos embrionarios de ratón genéticamente modificados como en células humanas teniendo como consecuencia la acumulación de centrobina, una proteína presente en los procentriolos. En la presente tesis describimos posibles nuevas funciones y sustratos de Nek9 en el ciclo del centrosoma, íntimamente ligado al ciclo de división celular, tras interferir con su expresión de diferentes formas.

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Dalkara, Defne. "Etude des fonctions du domaine amino-terminal de CENP-A pendant la mitose." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017GREAV001.

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Abstract:

Le variant d’histone CENP-A marque épigénétiquement le centromère. La présence de CENP-A au centromère permet le recrutement de protéines centromériques qui constituent la plateforme pour l’assemblage de kinétochores fonctionnels.Dans les cellules humaines, l'extrémité amino-terminale de CENP-A ainsi que la phosphorylation de la sérine 7, ont été signalées comme étant cruciales pour la progression de la mitose. Cependant, aucune phosphorylation de CENP-A dans d'autres espèces de métazoaires n'a été décrite. Ici, nous montrons que le domaine NH2-terminal CENP-A, mais pas sa séquence primaire, est nécessaire pour la mitose dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs). Nos données montrent que les défauts mitotiques résultant de la déplétion de CENP-A endogène peuvent être restaurés lorsque les MEFs expriment un mutant GFP-CENP-A dont l'extrémité NH2-terminal de CENP-A a été échangée par la queue phosphorylable de l'histone canonique H3. Inversement, dans ce même mutant, lorsque l’on remplace les deux serines phosphorylables par des résidus alanines, les défauts mitotiques persistent. En outre, le mutant de fusion non- phosphorylable de CENP-A, où les sept serines du domaine NH2-terminal ont été remplacées par des résidus alanines, a été également incapable de restaurer le phénotype mitotique des cellules déplétées en CENP-A endogène.Nous avons également identifié les trois premières sérines de la queue de CENP-A comme sites potentiels de phosphorylation. De plus, nos résultats montrent que l’absence de phosphorylation du domaine amino-terminal conduit à la délocalisation de la protéine centromérique CENP-C. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation mitotique de CENP-A est un événement potentiellement fréquent chez les métazoaires et essentiel à la progression mitotique.Dans la seconde partie de ce travail, nous avons voulu lier sans ambiguïté la fonction du domaine NH2-terminal du CENP-A à la mitose. Nous avons conçu une nouvelle méthode, appelée approche Hara-kiri, pour pouvoir éliminer le domaine NH2- terminal seulement pendant la mitose. Ceci afin de répondre à la question ci-dessus dans les cellules humaines. L'élimination du domaine NH2-terminal du CENP-A en utilisant l'approche Hara-kiri en début de mitose a conduit à une augmentation des défauts mitotiques dans les cellules. Prises collectivement, ces données montrent que le domaine NH2-terminal CENP-A est nécessaire pendant la mitose afin d’assurer le bon déroulement de la division cellulaire
The histone variant CENP-A epigenetically marks the centromere. The presence of CENP-A at the centromeres allows the recruitment of centromeric proteins that constitute the platform for functional kinetochores.In human cells, the NH2-terminus of CENP-A and its phosphorylation at serine 7 in mitosis has been reported to be crucial for the progression of mitosis. However, no phosphorylation of CENP-A in other metazoan species has been described. Here, we show that the NH2-terminus of CENP-A, but not its primary sequence, is required for mitosis in mouse embryonic cells (MEFs). Our data show that the mitotic defects resulting from the depletion of the endogenous CENP-A can be rescued when MEFs expressing a GFP- CENP-A mutant where the NH2-terminus of CENP-A was swapped with the phosphorylatable tail of conventional histone H3. Conversely, no rescue was observed when the two phosphorylatable serines in the H3 tail mutant were replaced with alanines. Furthermore, a non-phosphorylatable fusion mutant of CENP-A where all seven serines in the amino-tail were replaced with alanines, was also unable to rescue the mitotic phenotype of CENP-A depleted cells.We also identified that the first three serines of the tail of CENP-A as potential sites for phosphorylation. Additionally, we were able to link the phosphorylation of CENP-A amino-tail to the proper localization of the key centromeric protein CENP-C. These results suggest that mitotic CENP-A phosphorylation is a potentially common event in metazoans essential for mitotic progression.In the second par of this work we wanted to unambiguously tie the NH2-terminus function of CENP-A to mitosis. To achieve this, we wanted to remove the CENP-A amino-tail only during mitosis and we devised a new method called the Hara-kiri approach in order to answer the above question in human cells. The removal of the NH2-terminal domain of CENP-A using the Hara-kiri approach at the onset of mitosis led to increased mitotic defects in cells. Taken collectively these data show that the CENP-A NH2- terminus is required during mitosis to assure proper cell division

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Sendra, Kacper M. "Metabolic functions and inheritance of the microsporidian mitosome." Thesis, University of Newcastle upon Tyne, 2016. http://hdl.handle.net/10443/3324.

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Abstract:

Microsporidia are a group of obligate intracellular parasites of economic and medical importance. Many aspects of microsporidian genomes and cell biology are a result of an extensive reductive evolution during adaptation to their intracellular parasitic lifestyle. Microsporidian mitochondrial homologues called mitosomes have only a single known conserved metabolic function in biosynthesis of the essential iron-sulfur clusters. Based on genomic data an additional function of the mitosome in the alternative respiratory pathway (ARP) was proposed for some microsporidians including human pathogenic Trachipleistophora hominis. This thesis provides the first direct experimental evidence for a mitosomal localization of the two components of the ARP in T. hominis. Quantitative analyses of the immunofluorescence data together with western blotting experiments provided results consistent with the life cycle-stage specific function of the organelle. In the proliferative stages of the T. hominis life cycle, capable of stealing ATP from the host, mitosomes seem to function mostly in the biosynthesis of the essential iron sulfur clusters. The ARP proteins are enriched in the T. hominis spores, which is consistent with the hypothetical functions of the mitosome in energy metabolism of the spore that is unable to rely on its host for ATP production. This thesis also provides the first bioinformatics characterization of the molecular machineries involved in the processes required for inheritance of the microsporidian mitosomes: organelle fission and segregation during the cell division. Specific antibodies were generated and used to detect the microsporidian spindle pole body (SPB), an organelle hypothesized to play a role in inheritance of the microsporidian mitosomes. Double labelling experiments using the specific antibodies against the SPB and mitosomal markers provide evidence for a stable connection between the two organelles throughout the life cycle of the parasite.

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Azzag, Karim. "Origine de la stabilité morphogénétique dans les épithéliums de métazoaires." Thesis, Montpellier 2, 2011. http://www.theses.fr/2011MON20112/document.

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Abstract:

La structure polygonale des épithéliums mono-stratifiés exerce une certaine fascination sur les biologistes depuis les observations originales par Robert Hooke en 1665. Cependant, il est difficile d‘expliquer comment la stabilité de la morphogenèse est atteinte, i.e. comment les structures polygonales maintiennent la régularité au sein d'un individu, entre les individus et au sein des phylums. Dans ces travaux, nous introduisons une nouvelle mesure quantitative de la stabilité de la morphogenèse entre individus appelée l'homéostasie topologique. Nous démontrons que les épithéliums non-prolifératifs, formés par un processus d'accrétion, sont plus stables que les épithéliums prolifératifs. Dans le contexte de prolifération, l'homéostasie topologique dépend du rapport apoptose/mitose comme en témoigne le modèle Drosophila où l'homéostasie épithéliale diminue drastiquement quand l'apoptose est inhibée dans les disques imaginaux. Ainsi, l'apoptose agit comme un régulateur positif dans la canalisation de la stabilité de la morphogenèse. En outre, des simulations numériques reproduisant la morphogenèse épithéliale, basées sur la physique des milieux divisés, décrivent comment les mécanismes d'accrétion dans les épithéliums non prolifératifs et l'apoptose dans les épithéliums prolifératifs sont des moyens efficaces pour parvenir à la stabilité morphogénétique
The polygonal structure of mono-stratified epithelia exerts a unique fascination among biologists since the original observations of Robert Hooke in 1665. However, it is always unclear how the stability of morphogenesis is achieved, i.e., how these polygonal structures maintain regularity among individual, between individuals and among all phyla, and among individuals for each tissue within each species. Here, we introduce a new and quantitative measure of the level of morphologic stability between individuals, referred to as topological homeostasis. We demonstrated that non-proliferative epithelia, formed by an accretion process, are significantly more regularly stabilized than proliferative ones. In proliferative context, topological homeostasis directly depends on the apoptosis/mitosis ratio, as evidenced in the Drosophila imaginal disc model, where topological homeostasis drastically drops down when apoptosis is inhibited. Apoptosis therefore acts as an unexpected positive regulator in the canalization of morphogenetic stability. In addition, numerical simulations of epithelial morphogenesis, based on the physics of devided media, described how accretion mechanisms in non-proliferative epithelia, and, apoptosis in proliferative ones, are efficient means to achieve morphogenetic stability

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Rouzeau, Sébastien. "Rôle de la protéine BLM dans le maintien de l’intégrité du centromère : implications dans le phénotype cellulaire associé au syndrome de Bloom." Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA11T110/document.

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Abstract:

Le syndrome de Bloom (BS) est une maladie génétique rare caractérisée par une forte augmentation du taux d’échanges entre chromatides soeurs, des anomalies de ségrégation des chromosomes et une prédisposition au développement de tous types de cancers. Ce syndrome est la conséquence de mutations dans les deux copies du gène BLM, codant pour une 3’-5’ ADN hélicase de type RecQ. La ou les fonctions de la protéine BLM sont encore mal définies mais les données de la littérature convergent vers un rôle de BLM dans des mécanismes de surveillance et/ou maintien de l’intégrité du génome. La protéine BLM serait impliquée dans le redémarrage de fourches de réplication bloquées pendant la phase S et serait nécessaire à la résolution de ponts anaphasiques en mitose, notamment de ponts particuliers appelées « UltraFine anaphase Bridges » (UFBs). Ces UFBs, qui relient les chromatides soeurs entre elles, ne sont pas détectables par les colorants classiques et leur présence ne peut-être révélée que par la détection des protéines PICH (Plk1-Interacting Checkpoint Helicase) ou BLM. A l’état basal, ces UFBs sont essentiellement d’origine centromérique (cUFBs).Tout l’enjeu de mon projet était de déterminer si BLM était également impliquée dans la prévention de la formation de ces cUFBs et donc si BLM jouait un rôle avant l’anaphase. Nous avons montré que BLM est recrutée aux centromères de la phase G2 jusqu’en mitose. BLM, en coopération avec la protéine PICH, est nécessaire (1) à l’organisation structurale de l’ADN centromérique, (2) à la disjonction complète des centromères, indépendamment de la voie des cohésines, suggérant une implication de ces protéines dans le processus de décaténation des centromères et (3) au recrutement de la topoisomérase IIa (Topo IIa) active aux centromères.Nos résultats révèlent ainsi une nouvelle localisation et une nouvelle fonction de la protéine BLM aux centromères et montrent pour la première fois l’implication des protéines BLM et PICH dans la décaténation centromérique avant l’anaphase. Nous proposons que BLM et PICH, par leurs activités respectives hélicase et de remodelage de la chromatine, modifient la structure des centromères pendant la pré-métaphase, rendant ainsi certaines caténations accessibles à la Topo IIa avant l’anaphase. La défaillance de ce mécanisme entraînerait la persistance de caténations centromériques non résolues avant l’anaphase. Ainsi, dans les cellules BS, la fréquence élevée de cUFBs aurait deux origines différentes : une partie correspondrait à des cUFBs formés du fait d’une décaténation défaillante des centromères avant l’anaphase, et l’autre partie correspondrait à des cUFBs « physiologiques » non résolus en anaphase. Afin de distinguer l’origine des cUFBs, nous avons appelé ceux issus de caténations non résolues avant l’anaphase les UFBs centromériques surnuméraires (SC-UFBs pour Supernumerary Centromeric UFBs)
Bloom syndrome (BS) is a rare genetic disease characterized by a sharp increase in the rate of sister chromatid exchanges, chromosome segregation abnormailities and a predisposition to the development of all types of cancers. This syndrome is caused by mutations in both copies of the BLM gene, which encodes BLM, a RecQ 3'-5 DNA helicase. The specific function(s) of BLM remain unclear, but the data from the literature converge towards a role for BLM in mechanisms monitoring and / or maintaining genome integrity. The BLM protein may be involved in restarting stalled replication forks during S phase and necessary to resolve anaphase bridges in mitosis, including particular bridges called "Ultrafine Anaphase Bridges" (UFBs). These UFBs, which link sister chromatids together, are not detectable by conventional stains and their presence can only be revealed by the detection of the proteins PICH (PLK1-interacting checkpoint helicase) or BLM. In untreated cells, UFBs originate mostly from centromeres (cUFBs).The challenge of my project was to determine whether BLM was also involved in preventing the formation of cUFBs and so, if it played a role before anaphase.We showed that BLM is recruited at centromeres from G2 phase to mitosis. BLM, in cooperation with PICH, is required for (1) structural organization of centromeric DNA, (2) completion of centromere disjunction, independently of the cohesin pathway, suggesting an involvement of these proteins in centromere decatenation process, and (3) recruitment of active topoisomerase IIα (Topo IIα) to centromeres. Thus, we report a new localization and a new function of BLM at centromeres, revealing for the first time a new role for BLM and PICH in a previously unknown centromeric decatenation mechanism, crucial for complete centromere disjunction.We propose that the combined action of BLM and PICH promotes, through their helicase and chromatin remodelling activities, respectively, the organization of centromeric chromatin, thereby rendering some centromeric catenates accessible to Topo IIa before the onset of anaphase. The failure of this mechanism may lead to the persistence of some centromeric catenations not resolved before anaphase. Thus, the increase in the frequency of centromeric UFBs in BLMdeficient cells has two different origins: cUFBs arising from catenations not resolved before anaphase and physiological cUFBs not processed at anaphase onset. Two distinguish the two cUFB origins, we defined the former as supernumerary centromeric UFBs (SC-UFBs)

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Al, Jord Adel. "Centriole amplification in brain multiciliated cells : high resolution spatiotemporal dynamics and identification of regulatory mechanisms." Thesis, Paris 6, 2016. http://www.theses.fr/2016PA066706/document.

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Abstract:

Les cellules multiciliées jouent un rôle essentiel dans la propulsion des fluides physiologiques. Leur dysfonctionnement provoque des maladies chroniques. Contrairement à la plupart des cellules de mammifères qui possèdent un centrosome composé de deux centrioles, les cellules multiciliées possèdent une centaine de centrioles qui servent de base à la nucléation des cils motiles. Les mécanismes d'amplification de centrioles ou de régulation du nombre de centrioles dans ce type cellulaire étaient jusque-là inconnus. Les centrioles nouvellement formés étaient considérés comme apparaissant " de novo ". Une approche de vidéomicroscopie et de microscopie de super-résolution corrélative nous a d'abord permis de déterminer que tous les procentrioles sont générés à partir du centrosome préexistant. Nous démontrons que le centriole fils du centrosome est le site principal de nucléation de 95% de centrioles nouvellement formés dans les cellules multiciliées. Ces résultats réfutent par conséquent l'origine " de novo " des centrioles dans ce type cellulaire. Puis, nous montrons que la machinerie mitotique orchestre la progression spatio-temporelle de la dynamique centriolaire dans ces cellules post-mitotiques et en phase terminale de différentiation. L'amortissement de l'activité de Cdk1 empêche la rentrée en mitose tout en permettant la coordination du nombre de centrioles, leur croissance, et leur désengagement par des transitions phasiques nécessaires à la nucléation de cils motiles. Cette thèse aide à mieux comprendre la différentiation des cellules multiciliées, les ciliopathies, ainsi que l'amplification centriolaire pathologique associée avec le cancer et la microcéphalie
Multiciliated mammalian cells play a crucial role in the propulsion of physiological fluids. Their dysfunction causes severe chronic diseases. In contrast to the strict centriole number control in cycling cells, multiciliated cell differentiation is marked by the production of up to several hundred centrioles, each nucleating a motile cilium. The mechanisms of centriole amplification or centriole number control in these cells were unknown and new centrioles were thought to appear de novo in the cytoplasm. First, videomicroscopy combined with correlative super-resolution and electron microscopy has enabled us to determine that all procentrioles are generated via runs of nucleation from the pre-existing progenitor cell centrosome. We show that the daughter centriole of the centrosome is the primary nucleation site for 95% of the new centrioles in multiciliated cells and thus refute the de novo hypothesis. Then, we provide evidence of an activation of the mitosis regulatory network during the centriole dynamic. With single cell live imaging and pharmacological modulation of mitosis regulators, we show that the mitosis machinery orchestrates the spatiotemporal progression of centriole amplification in terminally differentiating multiciliated cell progenitors. The fine-tuning of Cdk1 activity prevents mitosis while allowing the timely coordination of centriole number, growth, and disengagement through checkpoint-like phase transitions necessary for subsequent functional motile ciliation. This PhD provides a new paradigm for studying multiciliated cell differentiation, cilia-related diseases and pathological centriole amplification associated with cancer and microcephaly

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Robert, Perle. "Caractérisation fonctionnelle des modifications post traductionnelles de la protéine Arpp19, un inhibiteur de la phosphatase PP2A." Thesis, Montpellier, 2016. http://www.theses.fr/2016MONTT085/document.

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Abstract:

La phosphorylation/déphosphorylation des protéines est une modification clé dans les mécanismes qui contrôlent les évènements mitotiques.Classiquement, l’entrée en mitose requiert l’activation de Cdk1. Pour se faire, les phosphorylations inhibitrices sur Cdk1 par Myt1 et Wee1 doivent être éliminées par Cdc25. Le complexe Cdk1-Cycline B (MPF) est ainsi actif, les kinases inhibitrices inactivées.Dernièrement, une nouvelle protéine kinase clé pour l’entrée en mitose a été mise en évidence : Greatwall (Gwl). Les récents résultats publiés par notre équipe montrent que Gwl permet l’entrée et le maintien en mitose en inhibant l’activité de la phosphatase PP2A, la phosphatase responsable de la déphosphorylation des substrats de la protéine kinase Cdk1-Cycline B, via son substrat Arpp19. Gwl phosphoryle Arpp19 sur la sérine 71 lui conférant ainsi la capacité d’inhiber l’activité de la phosphatase PP2A.Une étude sur les modifications post traductionnelles d’Arpp19 a été initiée dans l’équipe et met en évidence plusieurs sites de phosphorylation : • La sérine 71, site de phosphorylation par Gwl • La sérine 28, dont la phosphorylation est attribuée à Cdk1 (vérifié in vitro) • La sérine 113, site de phosphorylation par pKA Ce projet de thèse s’inscrit dans la suite logique du travail déjà effectué dans l’équipe et a pour objectif de caractériser les modifications post traductionnelles d’Arpp19, leurs rôles dans la progression mitotique, leurs incidences sur la liaison et l’inhibition de la cible d’Arpp19, PP2A.Cette partie du projet repose sur la synthèse de mutants d’Arpp19Xe, mutants phosphomimétiques d’une part (sérine transformée en acide aspartique par mutagenèse dirigée) ou mutants dont la phosphorylation est impossible (sérine en alanine). Ces mutants nous ont permis de travailler sur l’impact de ces différentes phosphorylations dans l’extrait d’œufs de Xénope.Ce projet s’attache également à mettre en lumière l’ensemble de la voie de signalisation aboutissant aux différentes modifications post traductionnelles d’Arpp19, leurs chronologies au cours du cycle et ainsi identifier les protéines effectrices de ces phosphorylations sur Arpp19 qui sont autant de leviers potentiels sur lesquels les thérapies anti-tumorales pourraient s’appuyer
Proteins phosphorylation and dephosphorylation are key post translational modifications controlling mitotic events.Traditionally, mitotic entry requires Cdk1 activation. To allow this to occur, inhibitory phosphorylations on Cdk1 by Myt1 and Wee1 kinases must be removed by phosphatase Cdc25. Thus, the Cdk1-Cyclin B complex, also called MPF (Mitotic Promoting Factor), is active and inhibitory kinases inactivated.Along this canonic scheme, another key kinase has been shown to play a critical role: the Greatwall (Gwl) kinase also called MAST-L for MAST like. Results published by our team show that in Xenopus laevis, Gwl allows entry and maintains mitosis by inhibiting the activity of the phosphatase responsible for dephosphorylation of Cdk1/Cycline B substrates: PP2A. This activity is driven by Gwl target: Arpp19. Gwl phosphorylates Arpp19 on its 71st residue turning it into a potent inhibitor of PP2A.A study of Arpp19 post translational modifications of Arpp19 has been initiated in the team which will allow the further study of several phosphosites: • Serine 71, Gwl phosphosite, the best documented site. • Serine 28, shown in vitro to be a Cdk1-CycB phosphosite. • Serine 113, assigned to PKA. This thesis project joins logically after the work already made in the team and has for objective to characterize the post translational modifications of Arpp19, their roles in mitotic progress, their incidences on binding and inhibition of Arpp19’s target, PP2A.This part of the project relies on mutants' synthesis of Arpp19Xe, phosphomimetics’ mutants on one hand (serine transformed into aspartic acid by mutagenesis) or mutants unable to be phosphorylated (serine into alanine). These mutants allowed us to work on the impact of these various phosphorylations in Xenopus eggs extracts.This project also attempts to highlight the whole signalization pathway ending in the various post translational modifications of Arpp19, their timelines during the cycle and thus to identify effector proteins of these phosphorylations on Arpp19 which are as much as potential levers on which can serve as targets for cancer therapy

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Rouillon, Charlène. "Caractérisation des défauts cellulaires après transfert nucléaire chez le poisson rouge, et mise au point d'un nouveau modèle de cellules donneuses embryonnaires." Thesis, Rennes, Agrocampus Ouest, 2019. http://www.theses.fr/2019NSARB326.

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Abstract:

La cryoconservation des ressources génétiques est aujourd’hui un moyen de préserver la biodiversité et la durabilité des industries agronomiques. Chez les poissons, le transfert nucléaire est un moyen de régénérer des individus à partir de tissus somatiques cryoconservés, faciles à collecter. Pour autant, les faibles taux d’obtention de clones viables limitent aujourd’hui l’usage de cette biotechnologie. L’objectif de la thèse était donc de comprendre l’origine des défauts de développement des embryons après transfert nucléaire. Nous avons focalisé nos questionnements scientifiques sur l’identification des possibles perturbations induites par la présence de l’ADN maternel, ainsi que sur le devenir de l’ADN somatique lors des étapes critiques du développement précoce : la reprise de méiose et la première mitose embryonnaire. Un résultat majeur de la thèse a été de montrer que dans certains clones, l’ADN maternel se retrouve séquestré sous le sillon de la première mitose,où il est ainsi vraisemblablement écarté de toute contribution au génome du clone. Nous avons également identifié de nombreux désordres dans les fuseaux de division, que nous expliquons par l’observation de localisations et états de condensation variables du noyau injecté. Nous avons enfin développé un nouveau modèle d’étude pour le transfert nucléaire, les cellules de corps embryonnaires. Elles possèdent des caractéristiques cellulaires compatibles avec le transfert nucléaire : petite taille, cycle ralenti, peu différenciées selon les critères épigénétiques et transcriptionnels analysés. En conclusion, not
Cryopreservation of genetic resources is a mean to preserve biodiversity and sustainability of the agronomic industry. In fish, nuclear transfer is a method to regenerate breeders from cryopreserved somatic tissues that are easy to collect. However, the low rates of viable clone limit the application of this biotechnology. The objective of this thesis work was to understand the origin of embryo development defects after nuclear transfer. We have focused our scientific questions on identifying the possible disturbances induced by the presence of maternal DNA, as well as on the fate of somatic DNA during critical stages of early development: meiosis resumption and first embryonic mitosis. A major result of the thesis was to demonstrate that in some clones, maternal DNA is sequestered under the first mitosis furrow, where it is probably excludedfrom any contribution to the genome of the clone. We have also identified many disorders in the division spindle, for which we propose an explanation based on the observation of variable locations and condensation states of the injected nucleus. Finally, we have developed a new model for nuclear transfer, embryoid body cells. They have cellular characteristics compatible with nuclear transfer: small size, slow cell cycle, and limited differentiation according to the epigenetic and transcriptional criteria that were analysed. For the first time in fish, the early cellular events after nuclear transfer were described. Integrating the results allowed us to suggest hypothesis for the clone development disorders. This work also allowed us

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Daniels, M. J. "Mechanisms regulating eukaryotic mitosis." Thesis, University of Cambridge, 2005. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.598272.

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Abstract:

The fertilised egg gives rise to the entire organism through the coordination of high fidelity chromosome replication and then segregation. When this mechanism is corrupted cells acquire stable genetic mutations that absolve them from the normal proliferative impediments at work to keep the organism healthy. This is the basis of cancer. In order to understand and then rationally treat cancer we must understand the process of cell division. In this thesis I elucidate novel information pertaining to three mechanisms that guide a cell through the process of mitosis. Firstly as cells enter mitosis I have identified the requirement of the Promyelocytic Leukaemia (PML) tumour suppressor for the integrity of the antephase checkpoint. PML limits the intracellular distribution and mobility of the CHFR checkpoint protein previously known to be required for the antephase checkpoint. During mitotic progression the RanGTPase orchestrates several distinct events. By showing that the principle GTPase activating protein (RanGAP1) is the subject of multiple mitotic phosphorylations that regulate its activity I have identified part of the mechanism that allows the cell cycle to control the actions of the RanGTPase in mitosis. Finally I have provided evidence that the tumour suppressor BRCA2 is required during the process of cytokinesis, and that in its absence cells frequently become aneuploid. Thus I have identified a new route of genetic instability in a hereditary form of cancer.

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Bielska, Olga. "The role of PKD in mitochondrial fission during mitosis." Thesis, Strasbourg, 2018. http://www.theses.fr/2018STRAJ009.

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Abstract:

Plusieurs études ont découvert et renforcé l'implication de la dynamique mitochondriale dans le cancer. J'ai découvert un rôle inattendu des protéines kinases de la famille PKD dans la fission mitochondriale. La perte de l'activité PKD a conduit à un blocage de la fission et a entraîné une élongation significative des mitochondries par fusion continue. D'un point de vue mécanique, nous avons montré que les protéines PKD régulent la dynamique mitochondriale en activant le facteur de fission mitochondrial (MFF) par phosphorylation de plusieurs sites. MFF agit comme un récepteur principal de la GTPase DRP1, qui resserre les mitochondries, et il est essentiel à une bonne division mitochondriale. Les trois membres de la famille PKD peuvent phosphoryler MFF. La phosphorylation de MFF est médiée par PKD et la fragmentation mitochondriale se produit pendant la mitose. Comme démontré dans études sur les phosphoprotéomes, la phosphorylation du MFF est augmentée dans les cancers très mitotiques. Ainsi, l'axe de signalisation PKD-MFF régulant la dynamique mitochondriale en mitose pourrait devenir une voie thérapeutique attrayante pour le traitement du cancer
Over the last two decades, multiple studies have uncovered and strengthen the implication of mitochondrial dynamics in cancer. During my thesis, I discovered an unanticipated role for the PKD kinase family in mitochondrial fission. Loss of PKD activity led to blockade of mitochondrial fission and resulted in a significant elongation of mitochondria by unopposed fusion. Mechanistically, we showed that PKDs regulated mitochondrial dynamics by activating the mitochondrial fission factor (MFF) through phosphorylation of multiple sites. MFF acts as a main receptor for the large GTPase DRP1, which constricts mitochondria, and it is critical for proper mitochondrial division. All three PKD family members could phosphorylate MFF. PKD-mediated MFF phosphorylation and mitochondrial fragmentation occurred specifically during mitosis. As MFF phosphorylation was found to be significantly upregulated in highly mitotic cancers, which was evidenced in several global phosphoproteome studies, the discovered PKD-MFF signaling axis regulating mitochondrial dynamics in mitosis could become an attractive therapeutic avenue for cancer treatment

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Sundermann, Lena. "Identification and characterization of new Greatwall kinase substrates." Thesis, Montpellier, 2018. http://www.theses.fr/2018MONTT016.

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Abstract:

La Division mitotique est une phase essentielle du cycle cellulaire qui assure la répartition correcte du contenu génétique. La mitose implique une réorganisation cellulaire profonde qui est principalement induite par une phosphorylation massive de protéines. Cette phosphorylation a lieu grâce à un équilibre fin entre kinases et phosphatases. À l'entrée mitotique, la phosphorylation protéique est induite par l'activation de la kinase cycline B/CDK1 et par l'inhibition de la phosphatase PP2A-B55. Résultats de notre et d'autres laboratoires ont récemment découvert une nouvelle voie essentielle pour moduler la phosphatase PP2A-B55 pendant la transition G2-M. Cette voie inclut la kinase Greatwall (GW) et ses substrats Arpp19 et ENSA. À l'entrée mitotique GW est activé et phosphoryle Arpp19 et ENSA les convertissant en inhibiteurs puissants de PP2A-B55. Étonnamment, aucun autre substrat de GW n'a été identifié jusqu'ici. Cependant, plusieurs éléments suggèrent fortement de nouveaux rôles de GW indépendamment de Arpp19 et de ENSA. L'objectif principal de ce travail était l'identification de nouveaux substrats de GW. À cette fin, j'ai utilisé plusieurs approches, y compris: (1) fractionnement biochimique des lysats de cellules ou des extraits d'oeufs de Xenopus combiné suivi d’une phosphorylation in vitro avec une kinase GW recombinante, (2) SILAC/phosphoproteomique des lysats de cellules exprimant différents niveau de GW, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID, et (5) une approche dirigée candidat. Les résultats de la phosphorylation in vitro ont révélé la présence de deux bandes de phosphorylation intéressantes qui sont actuellement analysées. Les deux approches SILAC/phosphoprotéinique et interactome ont révélé l'enrichissement des protéines impliquées dans la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique et des processus liés à l'ARN, une fonction physiologique déjà décrite pour cette voie chez la levure. Enfin, nous avons directement étudié la phosphorylation présumée par GW de trois candidats connus pour être impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire. Bien que phosphorylées in vitro par GW, nous n’avons pu identifier le site de phosphorylation que dans l'une de ces trois protéines. Cette protéine, qui correspond à un inhibiteur de phosphatase, semble contrôler la sortie mitotique par la modulation de la déphosphorylation protéique. Un mutant non phosphorylable de cet inhibiteur induit une sortie mitotique perturbée avec une déphosphorylation ralentie des substrats mitotiques et une altération de la dégradation de la cycline B. J’ai pu attribuer ce défaut à une association perturbée de l'inhibiteur avec la phosphatase et, par conséquent, à un timing aberrant de l'inhibition de la phosphatase. Enfin, j'ai identifié le site de phosphorylation par GW comme le facteur clé contrôlant cette association. En résumé, j'ai identifié dans cette étude un nouveau substrat de GW contrôlant l'activité de la phosphatase essentielle pour une division mitotique correcte
Mitotic division is an essential phase of the cell cycle that ensures the correct repartition of the genetic content. Mitosis involves profound cellular reorganization that is mostly induced by massive protein phosphorylation. This phosphorylation is achieved thanks to the fine-tuning of the balance between kinases and phosphatases. At mitotic entry, protein phosphorylation is induced by the activation of the master kinase Cdk1-cyclin B and the inhibition of the phosphatase PP2A B55. Previous results from our and other laboratories recently discovered a new pathway essential to modulate PP2A-B55 during G2-M transition. This pathway includes the kinase Greatwall (GW) and its substrates Arpp19 and Ensa. At mitotic entry GW is activated and promotes the phosphorylation of Arpp19/Ensa converting them into potent inhibitors of PP2A B55. Surprisingly, no other substrates of GW have been identified so far. However, several pieces of data strongly suggest new roles of GW independently of Arpp19 and Ensa. The main aim of this work was the identification of new substrates of GW. To this end, I used several approaches including: (1) Biochemical fractionation of cell lysates or Xenopus egg extracts combined with in vitro phosphorylation with recombinant GW kinase, (2) SILAC/phosphoproteomics from cell lysates expressing different GW amounts, (3) Co-Immunoprecipitation, (4) BioID and (5) a candidate directed approach. Results from in vitro phosphorylation revealed the presence of two interesting phosphorylated bands that are currently being analysed. Both SILAC/phosphoproteomic and interactome approaches yielded the enrichment of proteins involved post-transcriptional regulation of gene expression and RNA related processes, a physiological function already described for this pathway in yeast. Finally, we directly investigated the putative phosphorylation by GW of three candidates known to be involved in the control of cell cycle. Although phosphorylated in vitro by GW, we could only identify the phosphorylation site in one of these three proteins. This protein, corresponding to a phosphatase inhibitor, appears to control mitotic exit through the modulation of mitotic protein dephosphorylation. A non-phosporylable mutant of this inhibitor promotes a perturbed mitotic exit with delayed dephosphorylation of mitotic substrates and impaired cyclin B degradation. I could attribute this defect to a perturbed association of the inhibitor with the phosphatase and consequently to an aberrant timing of phosphatase inhibition. Finally, I identified the GW phosphorylation site as a key factor controlling this association. In summary, I identified in this study a new substrate of GW controlling phosphatase activity essential for correct mitotic division

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Caous, Renaud. "Analyse de la prolifération cellulaire et de l'aneuploïdie dans les mutants sas-4 et aurA chez Drosophila melanogaster." Thesis, Rennes 1, 2016. http://www.theses.fr/2016REN1B011/document.

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Abstract:

Une surprolifération cellulaire associée à de l’aneuploïdie est un marqueur couramment retrouvé dans les cancers et une faible instabilité génétique peut-être un élément aggravant (sinon déclencheur) de la tumorigénèse. Récemment, il a été montré sur un modèle de cellules cancéreuses en culture qu’une forte aneuploïdie compromet la prolifération cellulaire en entraînant la mort de ces dernières. Au cours de ma thèse, nous avons souhaité tester si cette hypothèse se vérifiait in vivo en utilisant comme modèle, les tumeurs du système nerveux central de la larve de D. melanogaster. Nous avons fait le choix d’utiliser des mutants pour des gènes impliqués dans la formation du fuseau mitotique et la ségrégation des chromosomes (Sas-4 ou AurA) afin d’induire ces tumeurs. Pour générer l’aneuploïdie, nous avons choisi d’associer les mutations sas-4 ou aurA avec des mutations pour des gènes essentiels du SAC, Mad2 ou BubR1ken. Nous avons ensuite analysé par immunofluorescence et microscopie l’effet de la perte du SAC sur la prolifération des Nb. Pour sas-4, la perte du SAC cause l’apparition d’une forte aneuploïdie et une baisse du nombre de Nb associée à une forte réduction de taille des cerveaux. Cela compromet totalement la capacité des cerveaux mutants à induire des tumeurs lorsqu’on les injecte dans l’abdomen de mouches adultes saines. Dans le cas d’aurA, ni hausse de l’aneuploïdie dans le tissu ni baisse de la prolifération des Nbs n’ont été observés. Par ailleurs, la même forte proportion de mouches injectées avec des cerveaux aurA ou aurA mad2 développant une tumeur a été constaté. Afin de mieux comprendre pourquoi le mutant aurA ne réagit pas comme le mutant sas-4 à la déplétion du SAC, nous avons entrepris une analyse détaillée des mutants aurA et aurA mad2. Nous avons d’abord observé que, malgré la perte du SAC, 1) il existe toujours un délai en mitose dans aurA mad2 et 2) il existe un délai entre la satisfaction du SAC et l’entrée en anaphase dans aurA. Comme l’entrée en anaphase est dépendante de la dégradation de la CycB et de la Sécurine via l’APC/C, nous avons analysé le comportement de la CycB (couplé à une étiquette GFP) par vidéo-microscopie en temps réel et observé un défaut de la régulation de la dégradation de cette dernière dans le mutant aurA ainsi que dans le double mutant aurA mad2. Ces observations nous ont permis de proposer un nouveau rôle pour la kinase AurA dans la régulation de la dégradation de la CycB en fin de mitose
Cellular overproliferation associated with aneuploidy is a common hallmark of cancers. Low genetic instability may be a contributing factor of tumorigenesis. Recently, it was shown on a cellular cancer model in culture that strong aneuploidy compromises cell proliferation by causing cell death. During my thesis, we have test if this hypothesis was verified in vivo by using as a model, the tumours of the larval central nervous system of D. melanogaster. We decided to use mutants involved in mitotic spindle formation and chromosome segregation (Sas-4 or AurA) to induce these tumours. To generate aneuploidy, we chose to associate these mutations with mutations in genes essential for the SAC, Mad2 or BubR1ken. We then analysed the effect of the SAC depletion on the Nb proliferation. For sas-4, loss of the SAC leads to high aneuploidy and a decrease in Nb number associated with brain size reduction. It completely undermines the ability of mutant brain to induce tumors when injected into the abdomen of healthy adult flies. In the case of aurA, nor increase of aneuploidy in tissue or decrease in nb proliferation have been observed. Moreover, the same proportion of flies injected with aurA or aurA mad2 brains developed tumours. To better understand why the aurA mutant not react as the sas-4 mutant to the SAC depletion, we undertook a detailed analysis of aurA and aurA mad2 mutants. We first observed that despite the SAC depletion, 1) there is always a delay in mitosis in aurA mad2 and 2) there is a delay between SAC satisfaction and anaphase onset in aurA. Since anaphase onset is dependent of the CycB and Securine degradation via the APC / C, we analysed the behaviour of the CycB (coupled with a GFP tag) by real-time videomicroscopy and observed a defect in the regulation of CycB degradation in aurA and in the double aurA mad2 mutant. These observations lead us to propose a new role for AurA kinase in regulating the degradation of CycB at the end of mitosis

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Molina-Calavita, Maria. "Huntingtine et mitose." Phd thesis, Université Paris Sud - Paris XI, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00766423.

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Abstract:

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative héréditaire autosomique dominante. Elle résulte d'une expansion anormale de glutamines (polyQ) dans la partie N-terminale de la protéine huntingtine (HTT ; codé par HTT). La MH est caractérisée par la dysfonction et la mort de cellules neuronales dans le cerveau, entraînant l'apparition de symptômes cognitifs, psychiatriques et moteurs, dévastateurs chez les patients. De nombreuses études sur des modèles animaux et cellulaires montrent que l'expansion polyQ dans la protéine mutante conduit à un gain de nouvelles fonctions toxiques, ainsi qu'à la perte de fonctions neuroprotectives de la protéine sauvage. Pendant ma thèse, je me suis intéressée à la description et à la validation fonctionnelle d'un nouvel outil pour étudier la HTT : pARIS-htt. pARIS-htt est un gène synthétique construit pour faciliter le clonage et le marquage de la protéine HTT totale. En utilisant différentes approches cellulaires, nous avons montré que pARIS-htt peut remplacer le rôle de la HTT endogène dans le transport de vésicules du Golgi ainsi que du brain derived neurotrophic factor (BDNF). La version mutante de pARIS-htt ne peut pas restaurer cette fonction. Parallèlement, nous avons généré deux variants de pARIS-htt avec soit une délétion dans la région d'interaction de la HTT avec la dynéine, moteur moléculaire se dirigeant vers l'extrémité négative des microtubules, soit avec la huntingtin associated protein 1 (HAP1), l'un de ses interacteurs. Dans les expériences de remplacement du gène, aucun des deux mutants n'a restauré le transport vésiculaire.Un autre aspect de ma thèse a été d'étudier le rôle de la HTT au cours de la mitose. Nous avons mis en évidence l'importance de la HTT dans le contrôle de l'orientation du fuseau. Cette fonction est perdue lorque la HTT est mutée, mais restaurée lorsque celle-ci est phosphorylée par Akt à la sérine 421. Le contrôle de l'orientation du fuseau est particulièrement important durant la neurogénèse puisque cette orientation ainsi que le mode de division sont impliqués dans la détermination des devenirs cellulaires. Cette fonction de la HTT est conservée chez la D. melanogaster.Cette étude a donc permis de mieux comprendre les fonctions de la HTT, et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter la MH.

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Masiá, Fandos Nuria. "Targeting mitosis in hormone-refractory prostate cancer." Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2020. http://hdl.handle.net/10803/670655.

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Abstract:

El CaP és la segona neoplàsia maligna invasiva diagnosticada amb major freqüència i la taxa de supervivència a 5 anys dels homes amb malaltia metastàtica cau per sota del 30%. Els andrògens, a través del receptor d'andrògens, són crucials per a l'inici i la progressió del CaP i, per tant, la ADT ha estat el principal tractament del CaP localment avançat, metastàtic i recurrent. Les teràpies de deprivació androgènica són capaces d'aconseguir inicialment una resposta bioquímica en la majoria dels pacients; no obstant això, les remissions són temporals i la malaltia acaba progressant a un estat independent d'andrògens, també denominat CRPC. Després de la progressió a CRPC, la supervivència mitjana d'aquests pacients és de menys de 2 anys i la malaltia acaba sent pràcticament intractable. Els mecanismes moleculars que causen aquesta transició continuen sent en gran part desconeguts. La creixent evidència en els últims anys suggereix que les cèl·lules de CaP insensibles als andrògens han estat reprogramades genèticament per a regular de manera selectiva l'expressió de gens de la fase M del cicle cel·lular. Els taxans, dirigits als microtúbuls, ja s'estan utilitzant en la pràctica clínica per a pacients amb CaP avançat, però la supervivència continua sent modesta i els pacients acaben desenvolupant resistència a la teràpia. Pel fet que la progressió mitòtica és un procés altament regulat, la nostra hipòtesi és que les proteïnes de fase M expressades de manera aberrant poden conferir a les cèl·lules CaP un avantatge per al creixement en condicions de depleció d'andrògens i, en conseqüència, representen possibles dianes terapèutiques per a la intervenció molecular de pacients amb CRPC. Encara que diversos inhibidors del cicle cel·lular no han aconseguit demostrar benefici en l'entorn clínic del CRPC, continua havent-hi un gran interès en aquest enfocament i encara hi ha desafiaments importants per a intentar tractar a aquests pacients amb teràpies dirigides que siguin eficaces. En aquest context, l'objectiu principal d'aquesta tesi és obtenir nous coneixements moleculars sobre la progressió del CaP, amb especial èmfasi en la participació dels reguladors mitòtics en l'adquisició de la independència a andrògens dels tumors de pròstata.
El CaP es la segunda neoplasia maligna invasiva diagnosticada con mayor frecuencia y la tasa de supervivencia a 5 años de los hombres con enfermedad metastásica cae por debajo del 30%. Los andrógenos, a través del receptor de andrógenos, son cruciales para el inicio y la progresión del CaP y, por tanto, la ADT ha sido el principal tratamiento del CaP localmente avanzado, metastásico y recurrente. Las terapias de deprivación androgénica son capaces de conseguir inicialmente una respuesta bioquímica en la mayoría de los pacientes; sin embargo, las remisiones son temporales y la enfermedad acaba progresando a un estado independiente de andrógenos, también denominado CRPC. Tras la progresión a CRPC, la supervivencia media de estos pacientes es de menos de 2 años y la enfermedad acaba siendo prácticamente intratable. Los mecanismos moleculares que causan esta transición siguen siendo en gran parte desconocidos. La creciente evidencia en los últimos años sugiere que las células de CaP insensibles a andrógenos han sido reprogramadas genéticamente para regular de forma selectiva la expresión de genes de la fase M del ciclo celular. Los taxanos, dirigidos a los microtúbulos, ya se están utilizando en la práctica clínica para pacientes con CaP avanzado, pero la supervivencia sigue siendo modesta y los pacientes acaban desarrollando resistencia a la terapia. Debido a que la progresión mitótica es un proceso altamente regulado, nuestra hipótesis es que las proteínas de fase M expresadas de manera aberrante pueden conferir a las células CaP una ventaja para el crecimiento en condiciones de depleción de andrógenos y, en consecuencia, representan posibles dianas terapéuticas para la intervención molecular de pacientes con CRPC. Aunque varios inhibidores del ciclo celular no han logrado demostrar beneficio en el entorno clínico del CRPC, sigue habiendo un gran interés en este enfoque y todavía hay desafíos importantes para intentar tratar a estos pacientes con terapias dirigidas que sean eficaces. En este contexto, el objetivo principal de esta tesis es obtener nuevos conocimientos moleculares sobre la progresión del CaP, con especial énfasis en la participación de los reguladores mitóticos en la adquisición de la independencia a andrógenos de los tumores de próstata.
PCa is the second most frequently diagnosed invasive malignancy and the 5-year survival rate of men with metastatic disease drops below 30%. Androgens, through the AR, are crucial for the initiation and progression of PCa and thus, ADT has been the mainstay of treatment for locally advanced, metastatic and recurring PCa. Androgen-ablation therapies can initially achieve a biochemical response in the majority of patients; however, remissions are temporary and the disease invariably progresses to an androgen-independent state, also termed CRPC. Upon progression to CRPC, the median survival for those patients is less than 2 years, and the disease is essentially untreatable. The molecular mechanisms that cause this transition remain largely unknown. Increasing evidence in recent years suggest that androgen insensitive PCa cells have undergone a genetic reprogramming to selectively upregulate the expression of M-phase cell cycle genes. Microtubule-targeting taxanes are already being used in the clinical practice for patients with advanced PCa, but survival remains modest and resistance inevitably develops. Because mitotic progression is a highly regulated process, we hypothesized that aberrantly expressed M-phase proteins may confer PCa cells an advantage to growth in androgen-depleted conditions and consequently represent potential therapeutic targets for the molecular intervention of CRPC patients. Although several small molecule inhibitors of the cell cycle have failed to demonstrate benefit in the clinical setting of CRPC, there remains a keen interest in this approach and significant challenges persist to match patients with effective targeted therapies. In this context, the main goal of this thesis is to gain novel molecular insights into the progression of PCa, with special emphasis on the involvement of mitotic regulators in the acquisition of prostate tumors androgen independence.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina

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Demir, Özlem. "Functional Characterization of Microtubule Associated Proteins in ES Cell Division and Neuronal Differentiation." Doctoral thesis, Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2015. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-163103.

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Abstract:

Microtubules are tubular polymers that are involved in a variety of cellular processes such as cell movement, mitosis and intracellular transport. The dynamic behavior of microtubules makes this possible because all of these processes require quick responses. Embryonic stem (ES) cells were first isolated from mouse embryos and they have two unique characteristics; they can be kept undifferentiated for many passages with a stable karyotype and they can be differentiated into any type of cells under appropriate conditions. The pluripotency of ES cells, their ease of manipulation in culture, and their ability to contribute to the mouse germ-line provides us a model of differentiation both in vitro and in vivo. In my thesis I focused on the cell division and neuronal differentiation of ES cells and developed two methods to understand the effects of microtubule dynamics in spindle assembly and chromosome segregation and to reveal the roles of different Microtubule Associated Proteins (MAPs) in the neuronal morphology formation. In the first part, we developed a live-cell imaging method for ES cells to visualize, track and analyze the single cell behavior in a cell population over a time period. So far many techniques have been adapted and combined for imaging of cell lines, mainly for the cancer or immortalized ones. However, because ES cells are very prone to apoptosis, tend to form spheres and hard to stably label, it is quite tricky to image them in culture conditions. In our system, we combined the BAC-based gene expression with wide-field deconvolution microscopy for ES cells that are plated onto the laminin-511 coated surface and kept in CO2 independent culture conditions. This combined technique does not interfere with the growth of cells and keeps them healthy up to 24 hours on the microscope stage. In the second part, we analyzed the effects of MAPs chTOG, EB1, Kif18A and MCAK in the overall spindle morphology and mitotic progression in mES cells. For this purpose, we utilized our stable TUBB-GFP and H2A-GFP cell lines along with our live-cell imaging set-up to reveal the effects of the above-mentioned proteins and the interplay among each other. By using RNAi method we either single or co-depleted the genes by siRNAs and measured the spindle length and width in RNAi conditions. We further analyzed the mitotic progression in H2A-GFP cell line in terms of the metaphase timing and the percentage of chromosome segregation errors. Our results showed that, EB1 depletion did not cause any significant changes in the overall spindle morphology or in the metaphase timing. However, the co-depletion of EB1 with chTOG partially rescued the sichTOG specific mini-spindle phenotype. siKif18A produced longer spindles without any change in the spindle width. Surprisingly, the co-depletion of antagonistic chTOG and Kif18A proteins had additive effects on the spindle dynamics and on mitotic progression in a way that spindle assembly was severely disrupted by the absence of these two proteins and as a result of this, both metaphase timing and chromosome missegregation levels increased significantly. These results overall indicate that MAPs have important roles in the regulation of dynamic instability and these proteins have an interplay among each other to be able to control the morphology of the spindle as well as the correct segregation of chromosomes into daughter cells. In the last part, I will introduce you a new ES cell based differentiation and morphology model, which brings the advantages of high resolution imaging capacity, control over development and easy genetic manipulation and culturing. We have generated Tet-induced shRNA cell lines against chTOG, Kif18A and MCAK, which are also stably expressing TUBB-GFP. These labeled cells were mixed with unlabeled wild-type mES cells before differentiation at 1:1000 ratio and then they were differentiated into mouse cortical cells and spinal motor neurons. Our results showed that, all of the three genes could be successfully knocked-down by shRNA after 48 hours of Tet induction. After mixing the labeled and unlabeled cells, single neurons could be imaged at high resolution and their skeletons could be generated afterwards. The RNAi studies in shchTOG cell line showed that, the knock-down of this gene in early differentiation interferes with the neuronal differentiation.

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Chakraborty, Papia. "Regulation of Nucleoporins in Mitosis." Scholarly Repository, 2007. http://scholarlyrepository.miami.edu/oa_dissertations/54.

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Abstract:

Nucleoporins mediate nucleocytoplasmic trafficking in interphase. In mitosis, upon nuclear envelope breakdown, the role and regulation of Nups remain to be elucidated. An important subcomplex of nucleoporins is the Nup107-160 complex, which, in mitosis, is involved in spindle assembly and nuclear pore re-assembly. Here we show that the level of a key constituent of the Nup107-160 complex- Nup96 is cell cycle regulated. We found that the mechanism involved in regulating Nup96 levels in mitosis is proteolysis by the anaphase-promoting complex (APC). Nup96 interacts with the APC, and its proteolysis can be regulated by Cdc20 and Cdh1. Like the Nup107-160 complex, the APC is localized at kinetochores, centrosomes, and spindles. Disruption of Nup96 levels led to an acceleration of prophase to prometaphase transition and, most importantly, resulted in a delay of G1 progression. Thus, regulation of Nup96 proteolysis in mitosis sets the stage for proper G1 progression. Additionally, we have observed differential regulation of members of the Nup107-160 complex during mitosis and have identified interacting partners of Nup96 at the centrosome which reveal a novel role of nucleoporins in regulating microtubule nucleation.

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Madriles, Gimeno Carles. "Mitosis based speculative multithreaded architectures." Doctoral thesis, Universitat Politècnica de Catalunya, 2012. http://hdl.handle.net/10803/124709.

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Abstract:

In the last decade, industry made a right-hand turn and shifted towards multi-core processor designs, also known as Chip-Multi-Processors (CMPs), in order to provide further performance improvements under a reasonable power budget, design complexity, and validation cost. Over the years, several processor vendors have come out with multi-core chips in their product lines and they have become mainstream, with the number of cores increasing in each processor generation. Multi-core processors improve the performance of applications by exploiting Thread Level Parallelism (TLP) while the Instruction Level Parallelism (ILP) exploited by each individual core is limited. These architectures are very efficient when multiple threads are available for execution. However, single-thread sections of code (single-thread applications and serial sections of parallel applications) pose important constraints on the benefits achieved by parallel execution, as pointed out by Amdahl’s law. Parallel programming, even with the help of recently proposed techniques like transactional memory, has proven to be a very challenging task. On the other hand, automatically partitioning applications into threads may be a straightforward task in regular applications, but becomes much harder for irregular programs, where compilers usually fail to discover sufficient TLP. In this scenario, two main directions have been followed in the research community to take benefit of multi-core platforms: Speculative Multithreading (SpMT) and Non-Speculative Clustered architectures. The former splits a sequential application into speculative threads, while the later partitions the instructions among the cores based on data-dependences but avoid large degree of speculation. Despite the large amount of research on both these approaches, the proposed techniques so far have shown marginal performance improvements. In this thesis we propose novel schemes to speed-up sequential or lightly threaded applications in multi-core processors that effectively address the main unresolved challenges of previous approaches. In particular, we propose a SpMT architecture, called Mitosis, that leverages a powerful software value prediction technique to manage inter-thread dependences, based on pre-computation slices (p-slices). Thanks to the accuracy and low cost of this technique, Mitosis is able to effectively parallelize applications even in the presence of frequent dependences among threads. We also propose a novel architecture, called Anaphase, that combines the best of SpMT schemes and clustered architectures. Anaphase effectively exploits ILP, TLP and Memory Level Parallelism (MLP), thanks to its unique finegrain thread decomposition algorithm that adapts to the available parallelism in the application.

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Martin, Carol-Anne. "Role of microcephalin at mitosis." Thesis, University of Edinburgh, 2011. http://hdl.handle.net/1842/8734.

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Abstract:

A large brain is one of the most distinguishing features of humans compared to other members of the animal kingdom. During mammalian evolution there has been a disproportionate enlargement of the brain relative to body size and this expansion has been particularly prominent during the past 3 million years of human lineage. This must be the consequence of adaptive genetic alterations during mammalian evolution, but the genes and molecular processes altered are essentially unknown. One approach for identifying candidate genes for brain size regulation is through characterisation of Mendelian disorders of brain development. In particular, primary microcephaly has received considerable interest as a model disease for studying brain size regulators because patients present with a profoundly reduced brain size but have no other malformations. Genetic studies have identified mutations in seven genes that can cause primary microcephaly. All the primary microcephaly proteins localise to the centrosome at some stage during the cell cycle and have roles in a diverse range of functions including centrosome maturation, centriole formation and microtubule organisation at the spindle pole. The precise mechanism leading to primary microcephaly is not known but a prevalent hypothesis is that centrosome dysfunction disrupts mitosis of neural progenitor cells. Despite there being strong evidence in support of this hypothesis for most primary microcephaly genes, MCPH1 (the first primary microcephaly gene to be identified) always appeared to be functionally distinct from other primary microcephaly proteins. Most work on MCPH1 has focussed on its role in the DNA damage response and cell cycle timing rather than on its mitotic role. As a result, the aim of this thesis is to perform a detailed analysis of MCPH1 function during mitosis. In this thesis, three isoforms of MCPH1 were characterised and their localisation, expression and stability examined. It was established that MCPH1 is highly regulated during mitosis. MCPH1 transcript and protein levels vary significantly throughout the cell cycle and MCPH1 protein is targeted for degradation late in mitosis. In addition, MCPH1 is hyperphosphorylated during mitosis (in prometaphase-arrested cells) suggesting that phosphorylation could potentially regulate MCPH1 mitotic function. Twelve mitotic phosphorylation sites were identified by phosphopeptide mapping, many of which were CDK1 and PLK1 consensus sites. Both PLK1 and CDK1 also contribute to MCPH1 phosphorylation in vivo. Although MCPH1 non-phosphorylatable mutants localise normally during mitosis, binding to interaction partners may be affected which may have functional consequences. During mitosis MCPH1 localises to the centrosomes and kinetochores. Consistent with this localisation, RNAi-mediated knockdown of MCPH1 leads to metaphase arrest with multipolar spindles, major defects in chromosome alignment and loss of chromatid cohesion. In addition, MCPH1 deficient mouse embryonic fibroblast cells also demonstrate similar chromosome alignment defects, strengthening this finding in an independent system. Live-imaging of MCPH1 depleted cells demonstrate that a normal bipolar spindle and metaphase plate are initially formed, but subsequently chromosomes and chromatids drop off the metaphase plate and eventually the spindle collapses. This suggests that the primary function of MCPH1 is to allow timely progression through metaphase, possibly by mediating kinetochore-microtubule attachments to satisfy the spindle activated checkpoint. Therefore my work describes several roles for MCPH1 in mitosis (centrosome stability, chromosome alignment and metaphase progression) suggesting that its role in mitosis could result in primary microcephaly in a number of different ways.

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Petit, Dominique. "Caractérisation de ARHGAP19, une nouvelle GAP de Rho impliquée dans la mitose des Lymphocytes T." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS018/document.

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Abstract:

Dans le but de déterminer le rôle des Rho GTPases et de leurs régulateurs dans les cellules hématopoïétiques, une analyse des niveaux d’expressions de 300 gènes codant pour des protéines impliquées dans les voies de signalisation dépendantes de Rho a été faite à partir d’échantillons de patients atteints de leucémies de type T-ALL. Il a ainsi pu être mis en évidence qu’un groupe de gènes incluant notamment RacGAP1, Ect2, Citron et ARHGAP19 variaient parallèlement. A l’exception de ARHGAP19, ces gènes avaient une fonction connue au cours de la mitose. Il a donc été entrepris de caractériser ARHGAP19 qui, d’après les banques de données, est spécifique du système hématopoïétique, et pour laquelle aucune fonction n’avait encore été déterminée.Afin de déterminer la fonction biologique de GAP19, un anticorps a été généré. Cet outil nous a permis de montrer que l’expression de la protéine est régulée au cours du cycle cellulaire et que sa localisation varie au cours de la mitose. Par ailleurs, nous avons montré que GAP19, joue un rôle essentiel dans le changement de forme des lymphocytes en mitose, la ségrégation des chromatides sœurs et le recrutement membranaire des effecteurs de RhoA au cours de la mitose. Nous avons aussi mis en évidence le mécanisme par lequel GAP19 permet le changement de forme dans les lymphocytes.Nous avons aussi montré que GAP19 est phosphorylée par CDK1 sur deux résidus présents dans la partie C-Terminale. Afin de mettre en évidence le rôle de ces phosphorylations, nous avons généré des cellules Kit225 transfectées avec des plasmides pour les formes non-phosphorylables de la protéine. Ceci nous a permis de mettre en évidence que la phosphorylation des résidus T404 et T476 permet la localisation cytoplasmique de GAP19 en début de mitose. Nous avons aussi pu observer lors de l’anaphase la formation de ponts de chromatines, ainsi qu’une augmentation significative de cellules multinucléées. Par ailleurs, nous avons procédé à des expériences de cytogénétique et d’immunofluorescence afin de déterminer, si les ponts de chromatines avaient pour origine soit des défauts de condensation de la chromatine, soit un stress réplicatif.Enfin, un possible modèle de la protéine ARHGAP19 a été généré et des simulations de dynamiques moléculaires réalisées afin de comprendre le rôle des phosphorylations par CDK1 a un niveau structurel
In an attempt to understand the role of Rho GTPases and their regulators in hematopoietic cell lines, expression levels of 300 genes were analyzed for proteins involved in Rho dependent signaling pathways from patients with T-ALL leukemia.It was shown that a group of genes consisting of RacGAP1, Ect2 and Citron varied concomitantly. With the exception of ARHGAP19, all already had a known function during mitosis. Consequently, it was decided to characterize ARHGAP19, which according to databases is specific of hematopoietic cell lines, and whose function was unknown. In order to determine the biological function of ARHGAP19, a specific antibody has been generated. This allowed us to demonstrate that the level of expression of the protein vary during the cell cycle and its localization varies during mitosis. In addition, we have shown that ARHGAP19 plays a central role in regulating cell shapes changes, sister chromatids segregation and RhoA effectors membrane recruitment during mitosis. We have also shown that this occurs by a previously undescribed pathway involving RhoA-ROCK-Vimentin.Finally, we have demonstrated that ARHGAP19 is a substrate of CDK1. It is phosphorylated on two residues located in the C-Terminal region of the protein. For investigating the role of these phosphorylations, we have generated Kit225 cell lines transfected with plasmids coding for the non-phosphorylable forms of the protein. This allowed us to show that phosphorylation of residue T404 and T476 are involved preventing GAP19 recruitment at the equatorial cell cortex during mitosis.In addition, we have observed the formation of chromatin bridges, as well as an increase in multinucleated cells. Thus, we have performed cytogenetic experiments for determining if chromatin bridges are due to chromosome condensation defects, or replicative stress. Finally, a possible tertiary structure of ARHGAP19 has been created de novo, and molecular dynamics simulations were generated in order to understand the role of these phosphorylations by CDK1 at a structural level

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Gallaud, Emmanuel. "Caractérisation du rôle d'Ensconsine / MAP7 dans la dynamique des microtubules et des centrosomes." Thesis, Rennes 1, 2014. http://www.theses.fr/2014REN1S004/document.

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Abstract:

La mitose est une étape essentielle du cycle cellulaire à l’issue de laquelle le génome répliqué de la cellule mère est ségrégé de façon équitable entre les deux cellules filles. Pour cela, la cellule assemble une structure hautement dynamique et composée de microtubules, appelée le fuseau mitotique. En plus d’assurer la bonne ségrégation des chromosomes, le fuseau mitotique détermine l’axe de division, un phénomène particulièrement important pour la division asymétrique où des déterminants d’identité cellulaire doivent être distribués de façon inéquitable entre les deux cellules filles. L’assemblage et la dynamique de ce fuseau sont finement régulés par de nombreuses protéines qui sont associées aux microtubules. Au cour de ma thèse, nous avons identifié 855 protéines constituant l’interactome des microtubules de l’embryon de Drosophile par spectrométrie de masse puis criblé par ARNi 96 gènes peu caractérisés pour un rôle en mitose dans le système nerveux central larvaire. Par cette approche, nous avons identifié 18 candidats sur la base de leur interaction aux microtubules et de leur phénotype mitotique, dont Ensconsine/MAP7. Nous avons montré qu’Ensconsine est capable de s’associer aux microtubules du fuseau et favorise leur polymérisation. De plus, les neuroblastes des larves mutantes présentent des fuseaux raccourcis et une durée de mitose prolongée. Ce délai en mitose est dû à une activation prolongée du point de contrôle du fuseau mitotique qui est essentiel pour une ségrégation correcte des chromosomes en l’absence d’Ensconsine. D’autres part, en association avec la Kinésine-1, son partenaire fonctionnel en interphase, nous avons montré qu’Ensconsine est également impliquée dans la séparation des centrosomes au cours de l’interphase. Ceci entraine une distribution aléatoire des centrosomes pères et fils dans cellules filles. Grâce à cette étude, nous avons révélé deux nouvelles fonctions pour Ensconsine : elle favorise la polymérisation des microtubules et participe donc à l’assemblage du fuseau mitotique et est impliquée, avec la Kinésine-1 dans la dynamique des centrosomes
Mitosis is a key step of the cell cycle that allows the mother cell to segregate its replicated genome equally into the two daughter cells. To do so, the cell assembles a highly dynamic structure composed of microtubules called the mitotic spindle. Additionally to its role in the faithful segregation of chromosomes, the mitotic spindle defines the axis of cell division. This phenomenon is particularly important for the asymmetric cell division in which cell fate determinants have to be unequally distributed between the two daughter cells. Spindle assembly and dynamics are subtly regulated by numerous microtubules-associated proteins. During my PhD, we identified using mass spectrometry, 855 proteins establishing the Drosophila embryo microtubule interactome. An RNAi screen was performed in the larval central nervous system for 96 poorly described genes, in order to identify new mitotic regulators. Based on microtubule interaction and mitotic phenotype, among 18 candidates we focused on Ensconsin/MAP7. We have shown that Ensconsin is associated with spindle microtubules and promotes their polymerization. Neuroblasts from mutant larvae display shorter spindles and a longer mitosis duration. This mitotic delay is a consequence of an extended activation of the spindle assembly checkpoint, which is essential for the proper chromosome segregation in the absence of Ensconsin. This study also showed that, in association with its interphase partner Kinesin-1, Ensconsin is involved in centrosome separation during interphase. As a result, mother and daughter centrosomes are randomly distributed between the daughter cells. In conclusion, we highlighted two news functions of Ensconsin : first, this protein promotes microtubule polymerization and is involved in spindle assembly ; second, Ensconsin and its partner Kinesin-1 regulate centrosome dynamics

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Stonyte, Morin Violeta. "Phosphorégulation de l'activité de la kinase Mps1." Thesis, Montpellier 2, 2010. http://www.theses.fr/2010MON20099.

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Abstract:

Mps1 est une protéine kinase à double spécificité impliquée dans le point de contrôle du fuseau mitotique et l'alignement des chromosomes. L'augmentation de l'activité de Mps1 est corrélée avec une augmentation de son niveau de phosphorylation lors de l'entrée en mitose. Cependant, les mécanismes contrôlant cette activation sont inconnus. Nous avons donc cherché à identifier les sites de phosphorylation de Mps1 afin d'étudier leur contribution à la régulation de Mps1. Par spectrométrie de masse, nous avons identifié jusqu'à 27 sites, et nous avons choisi de mutagéniser 11 d'entre eux individuellement en acides aminés non-phosphorylables (alanine), sur la base de leur conservation entre la protéine humaine et de xenope. Nous montrons que trois de ces sites de phosphorylation (S283, T697 et T707) sont essentiels pour l'activité kinase de Mps1, et pour son rôle dans le checkpoint mitotique. Deux de ces sites (T697 et T707) sont localisés dans la boucle d'activation du domaine kinase de Mps1 et sont des sites d'autophosphorylation. La phosphorylation sur le troisième site (S283) requiert une autre kinase. S283 est localisée dans le domaine non-catalytique de Mps1 qui est peu caractérisé et est impliqué dans le recrutement de Mps1 au kinétochore. Nous montrons par immunofluorescence que l'absence de phosphate sur le site S283 ne perturbe pas significativement le recrutement de Mad2 au kinétochore. Enfin, en utilisant des inhibiteurs et l'anticorps spécifique de la phosphorylation du site S283 que nous avons développé, nous montrons que le site S283 est phosphorylé en mitose par CDK, suggérant que les fonctions de Mps1 qui sont spécifiques de la mitose soient régulées par une phosphorylation dépendante des CDKs
Mps1 is a dual-specificity protein kinase involved in the spindle assembly checkpoint and chromosome alignment. Mps1 phosphorylation state and activity increase in mitosis. However, the regulatory mechanisms underlying these observations are unknown. We therefore sought to identify Mps1 phosphorylation sites and to study their contribution to Mps1 regulation. By mass spectrometry we identified up to 27 phosphorylation sites on Mps1. We chose 11 sites that were conserved between Xenopus and human Mps1, and constructed 11 non-phosphorylatable single point mutants. We show that three phosphorylation sites (S283, T697 and T707) are essential for the kinase activity and the checkpoint signalling function of Mps1. Two of these sites (T697 and T707) are located in the activation loop of Mps1 kinase domain and are autophosphorylation sites. Phosphorylation on the third site (S283) results from the activity of an upstream kinase. S283 is located in the less characterized non-catalytic domain that is responsible for the kinetochore localization of Mps1. By immunofuorescence we show that the absence of the phosphate at S283 does not significantly perturb the kinetochore recruitment of the spindle assembly checkpoint component Mad2. Finally, using inhibitors and our developed phosphospecific antibody we demonstrate that Mps1 is phosphorylated at S283 in mitosis by cyclin-dependent kinase (Cdk), suggesting that mitosis specific functions of Mps1 kinase are regulated by Cdk-dependent phosphorylation

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Almacellas, i. Canals Eugènia. "Implication of lysosomes on glucose-dependent E2F1-driven cell growth control and their novel role in mitotic progression." Doctoral thesis, Universitat de Barcelona, 2018. http://hdl.handle.net/10803/664033.

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Abstract:

Lysosomes are the primary degradative organelles in mammalian cells. Indeed, lysosome enzymatic cocktail allows the degradation of a vast repertoire of cellular material through different converging pathways including macroautophagy. Lysosome function relies on both its acidification capacity, mediated by the vacuolar ATPase, and its cytosolic positioning, driven by the motor proteins kinesins and dyneins. Emerging evidences point out a relevant role of lysosomes in cancer progression denoting their important function in cellular homeostasis maintenance. Indeed, lysosomotropic drugs, such as chloroquine-derivatives, are already being used in clinical trials for cancer treatment. This PhD thesis aims to study lysosome functions in cancer cells to identify novel vulnerabilities related to this organelle. Two different questions are addressed herein: 1) The implication of lysosomes on glucose-mediated E2F1-driven mTORC1 activation and 2) The role of lysosomes in cell division. E2F1 is overexpressed in numerous human cancers, including lung, breast and hepatocellular carcinomas. Traditionally, the major role reported for E2F1 in cancer is the activation of cell cycle. Previously, our group reported that E2F1 regulates cell growth, through the activation of mTORC1, a major regulator of protein synthesis and autophagy and demonstrated that E2F1 induces the anterograde movement of lysosomes, which is associated with translocation of mTOR to lysosomes and v-ATPase activation. Here we demonstrate that E2F1-dependent mTORC1 activation relies on glucose availability. E2F1 transcriptionally regulates several glycolytic enzymes, thus increasing glycolytic flux. More specifically, we described that E2F1 up-regulates the PFKFB3 isoenzyme of the PFK-2, a potent activator of glycolysis, and that PFKFB3 activity determines mTORC1 activation. We hypothesize that E2F1 is able to activate glycolysis and therefore increase v-ATPase and mTORC1 activity. Besides, E2F1 induces lysosome-dependent exocytosis which correlates with a metastatic phenotype. These novel functions of E2F1 in v-ATPase regulation and lysosomal trafficking provide insight into regulatory mechanisms by which E2F1 drives malignancy and highlight the potential role of lysosomes as a metabolic hub in mammalian cells. Studies on lysosome function are mainly focused in cells in interphase. However, the implication of these organelles during cell division remains unclear. Mitosis is a key event during cell cycle, in which cells finally divide into two daughter cells. Mitotic progression comprises five active phases involving a dramatic rearrangement of cellular components in a short period of time. Until now, degradation of mitotic factors has been attributed only to ubiquitination and proteasome-dependent degradation. In the present study, we show that impairment of lysosomal trafficking and function delays mitotic progression and increases mitotic errors, phenomena accompanied by an increase in toroidal-shaped nuclei a reflection of impaired mitosis. Finally, we use a proteomic approach to discover novel lysosome protein substrates involved in mitotic progression. Interestingly, we identified regulatory proteins of the cohesin complex necessary for correct chromosomal segregation. By characterizing a novel function of lysosomes specifically in mitosis, our work establishes a novel model of regulation of cell division beyond the proteasome. In summary, this work provides new insights into the function of lysosomes down-stream of E2F1 oncogenic signaling, which modulates G1/S transition and cell proliferation but also into lysosomal function in the completion of cell cycle by regulating mitotic progression. Our work highlights the importance of targeting lysosomes for novel cancer therapies.
Els lisosomes són els principals orgànuls degradatius de la cèl·lula eucariota, capaços de degradar un ampli repertori de material cel·lular. La funció lisosomal depèn tant de la seva acidificació, sota el control de la v-ATPasa, com de la seva distribució citosòlica, regulada per kinesines i dineïnes. La funció lisosomal és essencial per preservar la homeòstasi cel·lular i la seva alteració està lligada al desenvolupament de malalties de diferent índole, des de trastorns neurodegeneratius fins al càncer. De fet, fàrmacs lisosomotròpics, tals com els derivats de la cloroquina, s’estudien actualment en assajos clínics com a tractament per un ampli ventall de tumors. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral és l’estudi de les funcions lisosomals en cèl·lules canceroses per tal de definir noves vulnerabilitats relacionades a aquest orgànul. S’adrecen així doncs, dues preguntes experimentals: 1) La implicació dels lisosomes en l’activació de mTORC1 degut a E2F1 a través de la glucosa i 2) El rol dels lisosomes en la divisió cel·lular. La funció oncogènica d’E2F1 s’ha atribuït tradicionalment al seu paper com a regulador del cicle cel·lular. Actualment, però, es coneix la seva implicació en diverses funcions relacionades amb la progressió tumoral, entre elles, el creixement cel·lular a través de l’activació de mTORC1. En aquest projecte, hem demostrat que l’activació d’mTORC1 és amplificada en presència de glucosa. E2F1 activa la transcripció d’enzims glucolítics, específicament l’isoenzim de la PFK-2 PFKFB3 i d’aquesta manera incrementa el flux glucolític. Hem descrit que l’activitat de PFKFB3 està directament relacionada amb l’activació d’mTORC1 suggerint la regulació del complex pel flux glucolític. En paral·lel, a través de la regulació del tràfic lisosomal, E2F1 incrementa la exocitosi lisosomal àmpliament correlacionada amb el fenotip metastàtic. Les funcions descrites aquí destaquen la importància del lisosoma en el mecanisme oncogènic d’E2F1 i recolzen la idea dels lisosomes com a plataformes d’integració del metabolisme cel·lular. L’estudi de la funció lisosomal s’ha limitat majoritàriament a cèl·lules en interfase i pocs estudis es centren en la seva implicació en la divisió cel·lular (mitosi). La mitosi és un procés crucial en el cicle cel·lular en què la cèl·lula finalment es divideix en dues cèl·lules filles genèticament idèntiques. La progressió mitòtica requereix un ampli canvi morfològic, estrictament coordinat en un període de temps extremadament curt. En aquest context, la degradació de factors mitòtics és un element limitant per garantir la correcta progressió mitòtica. Fins ara, la degradació de factors mitòtics s’ha atribuït exclusivament al proteasoma deixant la funció lisosomal fora de l’escenari. En aquest estudi, demostrem que la inhibició de la funció lisosomal tant a nivell de tràfic com d’acidificació retarda la progressió mitòtica i incrementa la freqüència d’errors mitòtics, fenòmens acompanyats de l’aparició del nucli toroïdal el qual reflexa una mitosi aberrant. Finalment, hem usat una aproximació proteòmica per descobrir noves dianes lisosomals implicades en la mitosi. Entre aquestes, hem identificat proteïnes reguladores del complex de coesines, essencial pel correcte desenvolupament de la segregació cromosòmica. La caracterització de la funció lisosomal específicament en mitosi desenvolupada en aquest estudi implica un nou model de regulació de la divisió cel·lular més enllà de la degradació proteasomal. Aquest estudi dóna llum a la funció lisosomal sota el senyal oncogènic d’E2F1, un regulador clau de la transició G1/S del cicle cel·lular així com demostra la implicació dels lisosomes per la culminació del cicle a través de la regulació de la mitosi. En conclusió, el nostre treball recolza la importància del lisosoma com a possible diana terapèutica en el càncer.

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Tatsch, Helene Mochetti. "ATIVIDADES DIDÁTICAS COMO FERRAMENTAS FACILITADORAS NA COMPREENSÃO DE IMAGENS DA DIVISÃO CELULAR." Universidade Federal de Santa Maria, 2016. http://repositorio.ufsm.br/handle/1/6709.

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Abstract:

Images are teaching resources widely used in education. Especially in biology, they are very useful to register form and structure of organisms and to represent the cellular processes. The overall aim of this dissertation was to investigate how the records and representations through images, also can be a source of misconceptions. The specific objectives of the study were to evaluate the recognition and interpretation of images of mitosis and propose educational activities that would help in the development of interpretation skills. The sample of this research was 50 students in the first year of high school. The activities were developed in two schools, one private school and one public school). The research was divided into three stages; the first one was the application of diagnostic activities using: i) a sequence of images of cell division, to investigate the recognition of phases of mitosis; ii) modeling clay to know how the students represent a chromosome. Difficulties in recognition of images and concepts about the structure of chromosomes were analyzed. After the diagnostic activities was applied a set of educational activities about the mitosis. Two ludic activities (card game and puzzle) and two practical classes (observation of mitosis in onion roots and tridimensional model of metaphase) were associated for presentation and discussion of the phases of the mitosis. At the end of the activities the students carried out the assessment of the set of educational proposals and answered questions about interpretation of images related to mitosis and chromosomes. At diagnostic activity was detected that students still have difficulty in recognizing the images produced by microscopy. The construction of chromosomes with modeling clay revealed that most students believe that the chromosomes have the shape of X. This concept was resistant and remained even after the presentation of the set of educational activities. The students were highly motivated and rated as very positive all the activities presented. The application of these activities had positive results for the understanding of the spatial distribution of chromosomes in mitosis and permited more effective association between microscopy and simplified representations of images. These results reinforce the ideas about the need to diversify the forms and methods of presentation of abstract content related to cellular processes and the importance of working with the images generated from microscopy to assist the development of interpretation skills.
As imagens são recursos didáticos muito utilizados no Ensino, especialmente na Biologia, onde podem registrar de modo direto organismos e estruturas macroscópicas ou representar processos e componentes microscópicos. O objetivo geral dessa dissertação foi investigar, como os registros e representações através imagens que são facilitadores do entendimento de conceitos, aproximando o aluno da teoria que está em estudo, também pode ser fonte de concepções inadequadas. O presente trabalho teve por objetivos específicos avaliar o reconhecimento e interpretação de imagens da mitose e propor atividades didáticas que auxiliassem no desenvolvimento de habilidades de interpretação. Participaram deste trabalho 50 alunos do primeiro ano do Ensino Médio, sendo 27 de escola da rede particular de ensino da cidade de Rosário do Sul e 23 de escola rede pública de ensino da cidade de Santa Maria. A pesquisa foi dividida em três etapas; no primeiro momento houve a aplicação de atividades diagnósticas, utilizando: i) uma sequência de imagens de divisão celular, para investigar o reconhecimento das fases da mitose; ii) massa de modelar para que os alunos modelassem um cromossomo de maneira livre, de acordo com suas concepções. As dificuldades de reconhecimento de imagens e o conceito dos alunos sobre a estrutura de cromossomos foram analisadas. Finalizada a atividade diagnóstica utilizou-se uma intervenção constituída por um conjunto de atividades didáticas tendo como tema imagens de mitose. Os alunos participaram de atividades lúdicas compostas por jogos de baralho e quebra- cabeça, e também de atividades com caráter mais formal, como aula prática de observação de lâminas de células de Allium cepa em divisão celular e montagem de um modelo didático tridimensional representando uma célula na fase de metáfase da mitose. Ao final das atividades os alunos realizaram a avaliação do conjunto de propostas didáticas e responderam questões relacionadas a interpretação de imagens sobre mitose e cromossomos. A atividade diagnóstica demonstrou que os alunos ainda possuem dificuldade no reconhecimento de imagens principalmente as de microscopia. A concepção de que o cromossomo é sempre correspondente a letra X foi observada na maioria dos alunos, conceito este que permaneceu após a intervenção. Os alunos se mostraram bastante motivados e participaram dede modo atento e ativo em todas as atividades, o que se refletiu nas avaliações. Em relação a compreensão de imagens da mitose foi possível detectar mudanças que revelam melhor interpretação. Os resultados positivos da aplicação das atividades foram melhor compreensão da distribuição espacial dos cromossomos na mitose e associação mais efetiva entre imagens de microscopia e representações simplificadas. Esses resultados reforçam as ideias sobre a necessidade de diversificar as formas e métodos de apresentação de conteúdos abstratos relacionados a processos celulares e a importância de trabalhar com as imagens geradas a partir da microscopia para auxiliar o desenvolvimento de habilidades de interpretação.

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Marceaux, Claire. "Régulation d'une nouvelle GAP de Rho, ARHGAP19, dans la division des lymphocytes T humains et rôle dans l'hématopoièse murine." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS046/document.

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Abstract:

L’équipe a identifié une nouvelle GAP de RhoA, ARHGAP19, majoritairement exprimée dans le système hématopoïétique. Le projet a consisté à étudier la régulation de cette protéine dans des lymphocytes T humains. Pour cela, les analyses se sont portées sur la phosphorylation d’ARHGAP19 et sur sa localisation au cours de la division des lymphocytes T. ARHGAP19 est phosphorylée par l’effecteur de RhoA, la protéine kinase ROCK, sur la Sérine 422 et par la protéine kinase mitotique CDK1 sur les Thréonines 404 et 476. La phosphorylation par ROCK permet à ARHGAP19 d’interagir avec la famille de protéines 14-3-3 qui la protège des déphosphorylations pouvant avoir lieu au cours de la division cellulaire. L'ensemble des phosphorylations est primordial pour la régulation de la localisation cellulaire d'ARHGAP19 et contribue à une division cellulaire correcte. En effet, en absence de phosphorylation, on observe des défauts lors de la cytodiérèse entrainant la formation de cellules multinucléées. De plus, des dérégulations de RhoGTPases comme l’absence de GAP, sont aujourd’hui mises en évidence dans les cancers. C’est pourquoi nous avons généré des souris arhgap19 KO pour étudier les conséquences de l’absence du gène codant pour ARHGAP19, dans le système hématopoïétique murin. L’ensemble des cellules progénitrices et matures intervenant dans l’hématopoïèse murine a été analysé. Par ce modèle d’invalidation conditionnelle d’arhgap19, aucun rôle majeur de la protéine n'a été mis en évidence mais les résultats suggèrent une implication aux différents stades de la différenciation hématopoïétique et un impact sur l'ensemble des populations de ce système
The team identified a new GAP of RhoA, ARHGAP19, mostly expressed in the hematopoietic system. The project consisted in studying the regulation of this protein in human T lymphocytes. For this, the analyzes focused on the phosphorylation of ARHGAP19 and on its localization during the division of the T lymphocytes. ARHGAP19 is phosphorylated by the effector of RhoA, the protein kinase ROCK, on the Serine 422 and by the protein CDK1 mitotic kinase on Threonines 404 and 476. ROCK phosphorylation allows ARHGAP19 to interact with the 14-3-3 family of proteins that protects it from dephosphorylation that occur during cell division. All phosphorylations are essential for regulating the cellular localization of ARHGAP19 and contribute to correct cell division. Indeed, in the absence of phosphorylation, defects are observed during cytodiérèse resulting in the formation of multinucleate cells. In addition, deregulation of RhoGTPases, such as the absence of GAP, are now highlighted in cancers. This is why we generated arhgap19 KO mice to study the consequences of the absence of the gene coding for ARHGAP19, in the murine hematopoietic system. All progenitor and mature cells involved in murine hematopoiesis were analyzed. By this model of conditional invalidation of arhgap19, no major role of the protein has been demonstrated but the results suggest an involvement at different stages of hematopoietic differentiation and an impact on all populations of this system

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Argenty, Jérémy. "Rôles dans les lymphocytes T de la protéine Lis1, un régulateur de la dynamique des microtubules dépendante de la dynéine." Thesis, Toulouse 3, 2018. http://www.theses.fr/2018TOU30123/document.

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Abstract:

Les récepteurs d'antigènes des lymphocytes T (TCR) sont assemblés au cours du développement précoce de ces cellules dans le thymus suite à des recombinaisons complexes de gènes. Le réarrangement d'une chaine beta des TCR fonctionnelle (pré-TCR) déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui entrainent la survie, l'expansion et la maturation des thymocytes. Par ailleurs, l'engagement des TCR à la surface des lymphocytes T (LT) matures par des antigènes conduit également à des cycles de prolifération qui permettent le développement de réponses immunitaires efficaces. Ces évènements cellulaires s'accompagnent de remaniements importants du réseau de microtubules et une redistribution des moteurs moléculaires, tels que la dynéine, qui véhiculent les structures cellulaires sur ces réseaux. Les mécanismes moléculaires et les conséquences physiologiques de ces remaniements sont peu connus dans les LT. Lis1 est un régulateur de la dynéine qui est mis à contribution dans la migration neuronale et la prolifération des cellules souches au cours du développement neural. Son rôle au sein du tissu lymphoïde est peu connu. Dans ce travail, nous avons utilisé des modèles de souris spécifiquement déficients en Lis1 dans les LT afin d'étudier les fonctions moléculaires, cellulaires et physiologiques de cette protéine dans ces cellules. Nous montrons que Lis1 joue un rôle essentiel dans le développement précoce des LT et dans l'homéostasie des LT matures. La déficience en Lis1 n'affecte pas le réarrangement de la chaine beta ou les évènements de signalisation déclenchés par le pré-TCR ou le TCR. Cependant, la prolifération des thymocytes ayant passé la beta-sélection ou des LT matures dont le TCR a été engagé, est fortement impactée. L'analyse fine de la mitose indique que la déficience en Lis1 ralentit fortement le processus mitotique, contrarie les remaniements intracellulaires conduisant à la métaphase et entraîne la répartition asymétrique du matériel génétique dans les cellules filles. L'analyse des réseaux de microtubules montre que l'absence de Lis1 entraîne l'amplification du nombre de centrosomes et l'augmentation des cellules multipolaires au cours de la mitose. Enfin, nous montrons que Lis1 favorise l'interaction de la dynéine avec la dynactine, indiquant que Lis1 joue un rôle important dans les LT pour relier la dynéine aux structures cellulaires qu'elle véhicule. En conclusion, nous avons montré que Lis1 est importante dans la distribution du matériel génétique au cours de la prolifération des thymocytes doubles négatifs et des lymphocytes T périphériques
The T cell receptor (TCR) is assembled during the early development of T lymphocytes in the thymus after complexe genetic recombinations. The rearrangement of a functional TCR beta-chain (pre-TCR) triggers intracellular signaling pathways that cause the survival, expansion and maturation of thymocytes. The commitment of the TCR to the surface of mature T cells after antigen recognition also leads to proliferation allowing the development of effective immune responses. These cellular events go along with significant reorganization of the microtubule networks and a redistribution of molecular motors, such as dynein, which transport the cellular structures via this network. The molecular mechanisms and physiological consequences of the reorganization are poorly understood in T cells. Lis1 is a dynein regulator involved in neuronal migration and stem cells proliferation during neural development. Its role in lymphoid tissue is still unknown. In this study, we used mouse models specifically Lis1-deficient in T cells to study the molecular, cellular and physiological functions of this protein in T cells. We identifiy that Lis1 plays an essential role in the early development of T cells and in the homeostasis of mature cells. Lis1 deficiency does not affect beta-chain rearrangement or signaling events triggered by pre-TCR or TCR, but leads to the blockage of thymocyte cell division that have undergone beta-selection or mature T cells stimulated. Fine analysis of mitosis indicates that the deficiency of Lis1 strongly slows down the mitotic process, counteracts the cell changes leading to the metaphase and leads to asymmetric distribution of the genetic material in the daughter cells. Microtubule networks analysis shows that the absence of Lis1 induces centrosomes amplification and increase of multipolar cells during mitosis. Finally, we show that Lis1 promotes the dynein-dynactin interaction, indicating that Lis1 plays an important role in T cells to bind dynein to the cell structures it carries. In conclusion, we here described that Lis1 is important for the distribution of genetic material during double negative thymocyte and peripheral lymphocyte proliferation

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Penin, Jessica. "Les foyers nucléaires de stress : conséquences structurales et fonctionnelles." Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016GREAV095/document.

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Abstract:

Une réponse rapide et adaptée est nécessaire à la survie des cellules soumises à un stress. La réponse cellulaire au stress (HSR pour Heat-Shock response) médié par le facteur de transcription HSF1 est induite par les contextes environnementaux (chaleur, hypoxie, …) et les processus biologiques normaux et pathologiques (vieillissement, inflammation, …) associés à une accumulation de protéines endommagées (Morimoto, 1998). Ces protéines endommagées forment des agrégats toxiques aux conséquences létales pour les cellules.Conservé chez tous les eucaryotes, HSF1 orchestre les actions nécessaires à la survie et à la croissance des cellules malgré le stress. Ses cibles les mieux connues sont les gènes codants pour les Heat Shock Protein (HSP) qui font office de chaperon moléculaire. Une caractéristique de la HSR chez l’Homme est l’accumulation massive du facteur HSF1 en foyers nucléaires nommés Nuclear Stress Bodies (nSBs). Curieusement, ces foyers ciblent l’hétérochromatine péricentrique composée de séquences répétées en tandem de type Satellite III (SATIII), particulièrement au niveau du locus 9q12. HSF1 induit une forte transcription en ARN SATIII Sens (Jolly et al., 2004). Le rôle des nSBs est une des problématiques majeures de notre équipe cependant jusqu’à présent aucune fonction n’a été confirmée pour ces structures.Les nSBs, spécifiques aux cellules humaines, n’ont été décrits que dans des cellules en culture. Mon projet de thèse a consisté dans un premier temps à montrer la présence des nSBs in vivo chez l’Homme. Cette étude, réalisée sur du tissu testiculaire nous a également permis d’identifier une nouvelle cible SATIII majeure pour HSF1, la région Yq12. Dans les testicules, les nSBs sont associés à des processus méiotiques et post-méiotiques, suggérant un rôle dans le remodelage de l’hétérochromatine. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à mieux comprendre le rôle des nSBs lors de la HSR. Nous avons pu montrer que l’étape de transcription des SATIII induit une déstabilisation de l’hétérochromatine péricentrique caractérisée par une dissociation des facteurs HP1 (Heterochromatin Protein 1) alpha et beta et une perte de la marque répressive H3K9me3. Au cours de la période de récupération qui accompagne la reformation de l’hétérochromatine, une transcription séquentielle d’ARN SATIII Sens puis Anti-sens précède la restructuration des loci 9q12. Nous avons également pu montrer que la transcription des SATIII est associée à un blocage de la mitose. Nous montrons que dans les cellules stressées, une altération de ce point de contrôle par un Knock down des ARN sat III par des approches LNA conduisent à une l’instabilité génomique des cellules tumorales avec apparition de cellules polynucléées
A rapid and well-adapted response is required for cell survival upon stress. The cellular stress response (HSR) is mediated by the transcription factor Heat Shock Factor 1 (HSF1) (Morimoto, 1998). It is activated by environmental stress (heat, hypoxia, ...) and by a series of patho-physiological contexts (aging, inflammation, ...) involving protein damages.The best-characterized targets of HSF1 are genes encoding for Heat Shock Protein (HSP) acting as molecular chaperone. A specific feature of the HSR in human cells is the presence of HSF1 nuclear foci named Nuclear Stress Bodies (NSBs). Surprisingly, nSBs target pericentric heterochromatin consisting in tandem repeats of type III Satellite (SATIII) sequences, primarily at the 9q12 locus. HSF1 triggers a strong transcriptional activation of this locus (Jolly et al., 2004). The role of nSBS is a major issue since no function related to these structures has been reported so far.So far, nSBs have been only identified in cells in culture. My thesis project has been to further explore whether these structures also existed in normal tissues. Indeed, we have been able to identify the presence of nSBs in testis where they were found to be associated to meiotic and post-meiotic stages, suggesting a role related to heterochromatin remodeling. Moreover, we have identified the Yq12 locus as a new target of nSBs in these tissues. Secondly, we have brought new evidence that sat III sequences triggers a transient dissociation of HP1 (heterochromatin Protein 1) α and β as well as a loss of the repressive epigenetic H3K9me3 histone mark at pericentric heterochromatin. Interestingly we have also found that, following stress, a sequential accumulation of SATIII RNA in a Sense and Antisense orientation occurs, suggesting that this specific pattern of expression plays an important role in heterochromatin reformation. Finally, we have found that the accumulation of SATIII RNA is associated with a slowdown of mitosis. Indeed we have found that in stressed cells, accumulation of sat III impcats the progression of mitosis and that a knock down of sat III RNA using LNA approaches releases this blockade, leading to genomic instability of tumor cells and to the appearance of poly nucleated cells

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Dissertations / Theses on the topic 'Mitosom'

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