Academic literature on the topic 'Monooxygénases du cytochrome P450'

Le cytochrome p450 CYP102A1, mieux connu sous le nom de BM3, provient de la bactérie Bacillus megaterium. Cette enzyme possède un groupement prosthétique hémique lui permettant de catalyser l’insertion d’oxygène dans un lien carbone-hydrogène menant généralement à une hydroxylation du substrat, ce qui en fait une monooxygénase. Ce genre de réaction demeure jusqu’à aujourd’hui difficile à effectuer par chimie traditionnelle ce qui confère un intérêt particulier à cette enzyme. Au contraire des autres cytochromes p450, BM3 est soluble (et non membranaire) et est naturellement fusionnée à son partenaire réductase formant ainsi une seule chaîne polypeptidique. Ainsi, au cours des dernières années, BM3 a attiré beaucoup d’attention de la part de l’industrie de la chimie fine et pharmaceutique due à son potentiel biocatalytique important. Cependant, son usage en industrie est restreint par son instabilité ainsi que par le coût prohibitif du cofacteur qui lui est nécessaire pour catalyser ses réactions, le NADPH. Cette thèse décrit le développement de différentes stratégies visant à libérer les réactions effectuées avec BM3 de leur dépendance au NADPH, tout en maximisant le rendement spécifique de la monooxygénase. En place du NADPH, deux autres cofacteurs de moindre coût furent utilisés comme alternative, soit le NADH et le N-benzyle-1,4- dihydronicotinamide (NBAH) en utilisant le mutant R966D/W1046S de BM3. Afin de maximiser le rendement spécifique de BM3, l’une des stratégies de cette thèse, l’optimisation du milieu réactionnel, repose sur deux éléments clés, soit favoriser la stabilité du cofacteur, car celui-ci est plus instable que l’enzyme elle-même, ainsi que d’abaisser au minimum la température de la réaction, car nous avons constaté que ceci avait pour effet d’augmenter le couplage entre les réactions réductase et monooxygénase et donc la stabilité de l’enzyme. L’effet net de la réaction ainsi optimisée fut d’augmenter le rendement spécifique du mutant R966D/W1046S par un facteur situé entre 2 et 2.6 en fonction du cofacteur utilisé. D’autre part, deux stratégies d’ingénierie enzymatique furent explorées afin de générer des mutations pouvant augmenter la performance de BM3. L’une d’entre elles, la mutagenèse par consensus guidé, généra une librairie de mutants de laquelle les mutants NTD5 et NTD6 furent identifiés, augmentant le rendement spécifique de l’enzyme comparativement à leur parent, R966D/W1046S, par un facteur de 5.2 et 2.3 pour le NBAH et le NADH, respectivement. L’autre stratégie explorée fut d’appliquer une pression sélective sur la bactérie Bacillus megaterium pour forcer, par évolution expérimentale, la performance de l’enzyme. De cette stratégie, un nouveau mutant de BM3 nommé DE, possédant 34 acides aminés substitués sur sa séquence, fut généré. Ce dernier a démontré une plus forte résistance aux solvants organiques ainsi qu’une augmentation de son rendement spécifique vis-à-vis le NADPH et le NADH d’un facteur de 1.23 et 1.76, comparativement à BM3 sauvage, respectivement. Les stratégies décrites dans cette thèse présentent une amélioration significative du rendement spécifique de BM3 ainsi que deux iii nouvelles méthodologies avec lesquelles une enzyme peut être optimisée et de nouvelles mutations bénéfiques identifiées.<br>The p450 cytochrome CYP102A1, better known as BM3, comes from the bacteria Bacillus megaterium. This enzyme possesses a prosthetic heme group enabling it to catalyze the insertion of oxygen into a carbon-hydrogen bond generally resulting in the hydroxylation of the substrate, the enzyme is therefore a monooxygenase. This type of reaction remains difficult to achieve by traditional chemistry. Unlike other p450 cytochromes, BM3 is soluble (is not membrane bound) and is naturally fused to its reductase partner forming a single polypeptide chain. As such, in recent years, BM3 has garnered much attention from the pharmaceutical and fine chemical industries, due to its high biocatalytic potential. However, its use in industry remains constrained by its instability as well as by the prohibitive cost of its cofactor, NADPH. This thesis describes the development of different strategies aiming at liberating reactions driven with BM3 from their dependence to NADPH whilst maximizing the specific yield of the monooxygenase. Instead of NADPH, two other inexpensive cofactors were used, namely NADH and N-benzyl-1,4-dihydronicotinamide (NBAH) by using the BM3 mutant R966D/W1046S. To maximize BM3 specific yield, one of the strategies used in this thesis work, the optimization of the reaction medium, rested on two key elements. Firstly, favouring the stabilization of the cofactor, as it was found to be more unstable than the enzyme itself and secondly lowering the reaction temperature as this effectively augmented oxidase/reductase reactions coupling and as such the stability of the enzyme. The net effect of the optimized reaction was to enhance the specific yield of the BM3 mutant R966D/W1046S by a factor of 2 and 2,6 depending on which cofactor was used. Two other enzymatic engineering strategies were explored to generate mutations which could enhance the performance of BM3. One of these, consensus guided mutagenesis, generated a library of mutants from which mutants NTD5 and NTD6 were identified enhancing the specific yield of the enzyme comparatively to their parent, R966D/W1046S, by a factor of 5,24 and 2,3 for NBAH and NADH respectively. The other strategy explored was to apply a selective pressure on Bacillus megaterium to force, by experimental evolution, the performance of the enzyme. From this strategy, a new mutant of BM3 called DE, possessing 34 new amino acid substitutions, was generated. This new mutant displayed a greater resistance to organic solvents as well as an augmentation of specific yields when used alongside NADPH and NADH comparatively to wild type BM3 by a factor of 1,23 and 1,76 respectively. The strategies described in this thesis allowed a significative enhancement of BM3 specific yield as well as represent two new methodologies by which new beneficial mutations can be identified.

L’aptitude des microorganismes à dégrader les molécules synthétisées par l’industrie peut être mise à profit pour décontaminer des sites pollués. La morpholine (C4H9ON), la pyrrolidine (C4h9N) et la pipéridine (C5H11N) sont des amines secondaires très utilisées par l’industrie chimique. Ces amines peuvent subir diverses réactions chimiques et être transformées en N-nitosocomposés par action du NO2. Ces N-nitrosocomposés, même présents en faible concentration, ont un effet mutagène et cancérigène. En conséquence, la présence de ces polluants dans l’environnement présente un danger pour la santé publique. Ces amines sont biodégradables par des bactéries à Gram positif appartenant au genre Mycobacterium comme Mycobacterium sp. Rp1 qui est capable de les utiliser comme seule source de carbone, d’azote et d’énergie. L’utilisation de la métyrapone et des mesures spectrophotométriques ont permis de confirmer l’implication d’un cytochrome P450 dans la dégradation de ces amines cycliques. Nous avons associé des techniques de biologie moléculaire à des mesures de chromatographie d’affinité pour la purification de la protéine. Nous avons réalisé une construction génétique, permettant l’expression d’un cytochrome P450 recombinant et portant un motif His Tag en N-terminal pour une purification en une seule étape de la protéine (CYP151A2). Cette hémoprotéine présente un poids moléculaire de 46 kDa et montre un spectre d’absorption avec un maximum à 448 nm en présence de monoxyde de carbone. D’autre part, les paramètres montrent que cette monoxygénase présente une faible affinité pour les amines cycliques, et une vitesse de transformation de même ordre pour la pyrolidine et la morpholine mais moins importante pour la pipéridine. Une seconde partie de ce travail s’est focalisée sur l’étude de la dégradation des amines secondaires par Pseudomonas putida O1G3, bactérie à Gram négatif. Cette souche est capable de pousser sur milieu riche en pyrrodine et pipéridine mais pas en morpholine. Une caractérisation microbiologique et la détermination des différents paramètres cinétiques de dégradation de ces amines cycliques ont permis d’évaluer les capacités dégradatives de la souche O1G3. Différentes expériences comprenant la recherche des substrats de croissance, ont montré que la première étape de dégradation de ces amines est l’ouverture du cycle suite à la coupure de liaison C-N. Au vu de l’ensemble de ces résultats, nous avons proposé un modèle métabolique de la voie de dégradation de la pyrrolidine. Les analyses spectroscopiques et la recherche de l’enzyme impliquée dans l’ouverture des cycles des ces amines, ont montré l’implication d’une monooxygénase NADH dépendante. Cette monooxygénase présente une analogie avec la diméthylamine monooxygénase. La biodégradation des amines cycliques est possible par des bactéries Gram-positif via des monooxygénases de type amine monooxygénase P540 respectivement.

Les cyanobactéries drainent une attention grandissante en tant que photo-biocatalyseurs répondant aux critères de la Chimie Verte. Elles sont capables de croître en utilisant uniquement la lumière et le CO2 comme sources d’énergie et de carbone. L’ajout de donneurs d’électrons sacrificiels (ie glucose) pour le recyclage du cofacteur NADPH d’oxydoréductases n’est pas nécessaire car celui-ci est régénéré par des électrons issus de l'oxydation photosynthétique de l'eau tandis que les oxygenases peuvent utiliser le dioxygène produit in-situ lors de la photosynthèse. Une souche de Synechocystis sp. PCC 6803, modifiée pour exprimer CYP153A6, un cytochrome P450, hydroxyle sélectivement le limonène, substrat bon marché et largement disponible, en l'alcool périllylique, utilisable comme arôme ou médicament. Une autre souche, exprimant le seul CYP110D1 et non les protéines porteuses d'électrons de ce cytochrome P450, catalyse l'hydroxylation regiosélective de la testostérone en 15β-hydroxytestostérone, davantage biodisponible et adapté aux formulations orales. L’activité (1 U gCDW-1) est deux fois plus grande que celle des réactions biocatalysées par la bactérie Escherichia coli. Une protéine de fusion CYP110D1- Fed1, une des ferrédoxines natives de Synechocystis, a également été conçue, visant à canaliser plus efficacement les électrons du photosystème I vers la monooxygénase.Ce travail a démontré l'efficacité des cyanobactéries modifiées exprimant des cytochromes P450 lorsqu’elles sont utilisés en tant que biocatalyseurs dans des procédés à cellules entières. Elles permettent la production durable de produits de grande valeur, tels que les produits pharmaceutiques<br>Cyanobacteria are attracting growing attention as photo-biocatalysts meeting the criteria of Green Chemistry. They are able to grow using only light and CO2 as energy and carbon sources. The addition of sacrificial electron donors (i.e. glucose) for the recycling of the NADPH cofactor of oxidoreductases is not necessary because it is regenerated by electrons from the photosynthetic oxidation of water, while the oxygenases can use the oxygen produced in-situ during photosynthesis. A strain of Synechocystis sp. PCC 6803, modified to express CYP153A6, a cytochrome P450, selectively hydroxylates limonene, a cheap and widely available substrate, to perillyl alcohol, usable as a flavor or drug. Another strain, expressing only CYP110D1 without any electron-carrier proteins of this cytochrome P450, catalyzes the regioselective hydroxylation of testosterone to 15β-hydroxytestosterone, which is more bioavailable and suitable for oral formulations. The activity (1 U gCDW-1) is twice as high as that of the reactions biocatalyzed by the bacterium Escherichia coli. A CYP110D1-Fed1 fusion protein, one of the native Synechocystis ferredoxins, was also designed, aiming to channel photosystem I electrons more efficiently to monooxygenase. This work demonstrated the efficacy of modified cyanobacteria expressing cytochromes P450 when used as biocatalysts in whole-cell processes. They enable the sustainable production of high-value products, such as pharmaceuticals

Les systemes enzymatiques responsables du metabolisme oxydatif d'un herbicide, le chlortoluron, ont ete etudies dans des microsomes isoles de cultures cellulaires de ble, qui renferment egalement de bons niveaux d'activites cinnamate 4-hydroxylase et laurate hydroxylase. Le chlortoluron est oxyde en un derive hydroxyle sur le methyle du cycle aromatique et en un derive n-monodemethyle. Les deux activites enzymatiques possedent les proprietes caracteristiques des monoxygenases a cytochromes p-450 (localisation cellulaire, besoins en co-facteurs, sensibilite a des inhibiteurs connus de monooxygenases a cytochrome p-450). Les quatre activites mesurees (cinnamate 4-hydroxylase, laurate hydroxylase, hydroxylase n-demethylase du chlortoluron) et les teneurs en cytochrome p-450 sont augmentees apres des traitements des cellules par des composes varies (herbicides, fongicides et antidotes d'herbicides). Des etudes qsar ont montre que des analogues structuraux du chlortoluron modifient le metabolisme de celui-ci. Prises dans leur ensemble, ces donnees suggerent que des monooxygenases a cytochrome p-450 sont impliquees dans les reactions d'hydroxylation et de n-demethylation de l'herbicide. Les caracteristiques des deux activites laissent penser que des enzymes distinctes catalysent chacune des deux reactions

Les produits de plus de 25 genes cytochrome p450 (cyp) et 5 genes flavine monooxygenase (fmo) sont exprimes chez l'homme, et sont responsables du metabolisme de phase i de la plupart des medicaments et xenobiotiques. L'expression par genie genetique d'enzymes humaines clonees repond specifiquement aux problemes d'obtention de materiel enzymatique pur, abondant, et actif necessaire a l'etude du metabolisme des xenobiotiques. Des baculovirus recombinants contenant les cdnas des enzymes cyp3a4, cyp2a6, cyp27, cyp3a6, fmo1, fmo3, fmo4, cytochrome p450 reductase (ncpr) et une cytochrome p450 reductase soluble ont ete construits et les enzymes produites ont ete caracterisees quant a leur taille, leur localisation sub-cellulaire, leur spectre d'absorption et leurs activites enzymatiques en systeme reconstitue. Une optimisation du systeme est decrite qui permet l'incorporation d'heme par l'apoenzyme cyp. Les mesures d'activite cyp2a6 demontrent la labilite de la reductase endogene des cellules hotes sf9 et la necessite de complementer les microsomes sf9 par la ncpr. L'activite des enzymes fmo est etudiee sur plusieurs substrats, ainsi que la stereoselectivite des fmo1 et fmo3 vis-a-vis d'un substrat prochiral. Le systeme baculovirus/sf9 est convenable pour la production d'enzymes fmo et ncpr, et, moyennant quelques adaptations specifiques, pour la production d'enzymes cyp

La géosmine est un terpénoïde, provoquant un goût moisi-terreux associée à des flaveurs atypiques dans l'eau et le vin. Chez les bactéries, la voie de biosynthèse de la géosmine est bien caractérisée, mais peu de connaissance sont disponibles au sujet de sa biosynthèse chez les eucaryotes, en particulier dans les champignons filamenteux. L'origine de la géosmine dans la vigne est en grande partie attribuable à la présence de Penicillium expansum sur les raisins. Dans cette thèse, afin de mieux comprendre la voie de biosynthèse de la géosmine chez Penicillium expansum, nous avons décrit la caractérisation et l'analyse de "gpe1", un gène codant pour une cytochrome P450 monooxygénase impliquée dans la biosynthèse de la géosmine. Nous avons démontré que les deux fragments d'ADN: p450-1 et p450-2 appartiennent à un seul gène du cytochrome p450 (gpe1). La séquence d'acides aminés déduite de gpe1 a une identité moyenne de 40 % avec les enzymes PbP450-2 et P450-4 qui ont été trouvées impliquées respectivement dans la synthèse d'indole diterpène et dans la synthèse des gibbérellines. Les amplifications par PCR effectuée sur quatorze espèces de Penicillium ont montré que seules les espèces producteurices de la géosmine ont donné le même fragment de ~1,2 kb que gpe1. L'analyse du gène gpe1 nous a permis d'identifier la présence de certains domaines conservés de cytochromes P450 monooxygénases. Ensuite, la caractérisation fonctionnelle du gène gpe1 chez P. expansum M2230 a été décrite. Nous avons montré que les mutants de gpe1 ont perdus leur pouvoir de produire la géosmine alors que les révertants de gpe1 ont rétablis leur pouvoir de production. Enfin, nous avons démontré qu'une polykétide synthase putative et une putative NRPS sont présentes sur le côté droit du gène gpe1 proposant que le gène gpe1 pourrait être une partie d'un «Cluster» codant pour la biosynthèse de métabolites secondaires<br>Geosmin is a terpenoid, an earthy-musty compound associated with off-flavors in water and wine. In bacteria, the biosynthesis pathway of geosmin is well characterized, but little is known about its biosynthesis in eukaryotes, especially in filamentous fungi. The origin of geosmin in grapevine is largely attributable to the presence of Penicillium expansum on grapes. In this thesis, we have described the characterization and analysis of "gpe1", a gene encoding a cytochrome P450 monooxygenase probably involved in the biosynthesis of geosmin in P. expansum M2230, in order to better understand of the biosynthesis pathway of geosmin in this species. We demonstrated that the two DNA fragments i.e. p450-1 and p450-2 belong to a single cytochrome p450 gene (gpe1). We showed that the deduced amino acid sequence of gpe1 has an average identity of 40 % with PbP450-2 and P450-4 enzymes which have been found involved in indole diterpene synthesis and in gibberellin synthesis respectively. Then, the results of PCRs performed on the fourteen Penicillium species showed that only Penicillium species which were producers of geosmin gave the same fragment of ~1.2 kb like gpe1. Analysis of the gpe1 gene enabled us to identify the presence of some conserved domains of cytochromes P450 monoxygenases in the amino acid sequence of gpe1. Then, the functional characterization of the gpe1 gene in P. expansum M2230 was described. We illustrated that the mutants of gpe1 lost their potential to produce geosmin whereas the reverse complements of gpe1 restored their potential to produce geosmin. Finally, we demonstrated that a putative polyketide synthase and a putative NRPS-like enzyme are present on the right side of the gpe1 gene suggesting that gpe1 gene might be the part of a gene cluster encoding the biosynthesis of secondary metabolites

Ce manuscrit présente une étude fonctionnelle et structurale du cytochrome P450 2J2 humain (CYP2J2), enzyme exprimée dans les tissus cardiovasculaires, dont les rôles biologiques sont mal connus. En utilisant la terfénadone comme base structurale, qui est un composé oxydé régiosélectivement par le CYP2J2, plusieurs composés ont été synthétisés se sont révélés être des inhibiteurs affins et sélectifs du CYP2J2. En particulier, un inhibiteur très affin et compétitif (Ki = 160 nM) et deux substrats suicides efficaces du CYP2J2 (kinact/Ki 3000 L/mol/s) ont été mis en évidence. L'étude de l'oxydation de ces composés par le CYP2J2 a révélé une régiosélectivité surprenante, en faveur d'une position chimiquement moins réactive vis-à-vis des oxydations. La caractérisation du site actif du CYP2J2 et l'identification de résidus importants pour la reconnaissance des dérivés de terfénadone a pu être réalisée en construisant un modèle par homologie 3D de cette enzyme et par le docking de certains dérivés dans le site actif du CYP2J2. Enfin, une étude préliminaire des rôles biologiques possibles du CYP2J2 a été réalisée en étudiant les effets inhibiteur de ce P450. En conclusion, ce travail a permis de caractériser les premiers outils biochimiques d'étude des rôles biologiques du CYP2J2, de proposer une première topologie du site actif du CYP2J2, et d'affiner les rôles biologiques du CYP2J2.

Les coumarines et furocoumarines sont des phytoalexines synthétisées par certaines familles de plantes (ex : Rutacées dont font partie les agrumes), pour se défendre contre les bioagresseurs. Les furocoumarines peuvent être toxiques pour l’homme, lorsqu’elles sont combinées à certains médicaments : c’est l’effet pomelo. Aujourd’hui, la plupart des cytochromes P450 impliqués dans la synthèse des furocoumarines chez les Apiacées, ont déjà été caractérisés. En revanche, malgré l’importance économique des agrumes, nous en savons très peu sur la voie de biosynthèse des coumarines et furocoumarines chez ces plantes. Dans ce travail, nous avons créé, optimisé et validé une méthode d’analyse en chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à un spectromètre de masse (UPLC-MS), pour identifier et quantifier 28 coumarines et furocoumarines dans la peau et la pulpe d’agrumes. Cette méthode nous a permis de chémotyper 62 variétés d’agrumes, distinguées par leur faible ou forte capacité de production de ces composés. En parallèle, un travail de bioinformatique sur des banques publiques d’ADN génomique d’agrumes, a permis d’identifier sept gènes présentant de fortes homologies de séquences avec ceux intervenant dans la synthèse des furocoumarines chez Pastinaca sativa (CYP71) et chez Arabidopsis thaliana (CYP82). Une analyse quantitative de leur niveau d’expression chez des agrumes, a montré que quatre d’entre eux étaient plus fortement exprimés chez les fruits fortement producteurs de coumarines et furocoumarines. Le clonage de ces gènes et leur expression hétérologue chez la levure, a révélé la fonction de CYP82D64 de pomelo et de Combava, qui hydroxyle la xanthotoxine pour donner la 5-hydroxy-xanthotoxine. La synthèse des coumarines et furocoumarines chez les agrumes, ainsi mieux appréhendée, nous a permis de proposer un schéma de sélection variétale visant à abaisser les taux de ces composés chez les Citrus. Nous avons aussi montré l’évolution convergente des CYP71 et CYP82 dans leur synthèse chez les Apiacées et les Rutacées respectivement. La découverte du premier cytochrome P450 de Citrus intervenant dans la production de ces composés, ouvre de nouvelles perspectives quant à l’élucidation de leur voie de biosynthèse chez les agrumes<br>Coumarins and furanocoumarins are phytoalexines synthesized by some plant families (e.g. Rutaceæ that include citrus), to defend themselves against bioaggressors. Furanocoumarins can be toxic for humans, when combined with some drugs: this is the grapefruit juice effect. Nowadays, most of the cytochrome P450s involved in the furanocoumarin synthesis in Apiaceæ, have already been characterized. However, despite the economical importance of citrus, a little is known about the coumarins and furanocoumarins pathway in these plants. In this work, we created, optimized and validated an analytical method by ultra high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS), to identify and quantitate 28 coumarins and furanocoumarins in citrus peel and pulp. This method allowed us to chemotype 62 citrus varieties, distinguished by their low or high capacity to produce these compounds. In parallel, a bioinformatic work on public banks of genomic DNA from citrus, allowed to identify seven genes with high sequence homologies with those involved in the synthesis of furanocoumarins in Pastinaca sativa (CYP71) and in Arabidopsis thaliana (CYP82). A quantitative analysis of their expression level in citrus showed that four of them were more expressed in high coumarins and furanocoumarins producing fruits. The cloning of these genes and their heterologous expression in yeast, revealed the function of grapefruit and Combava CYP82D64, which catalyzes the hydroxylation of xanthotoxin in 5-hydroxy-xanthotoxin. The synthesis of coumarins and furanocoumarins in citrus, then better apprehended, allowed us to propose a breeding scheme aiming at decreasing the levels of these compounds in Citrus. We also showed the convergent evolution of CYP71 and CYP82 in their synthesis in Apiaceæ and in Rutaceæ respectively. The discovery of the first cytochrome P450 from Citrus involved in the production of these compounds, opens up new prospects for the elucidation of their biosynthetic pathway in citrus