Dissertations / Theses on the topic 'Mucor circinelloides'

O glicerol (também conhecido como glicerina) é um subproduto importante no processo de fabricação de biodiesel, representando cerca de 10% do subproduto formado na reação de transesterificação deste biocombustível. O custo de purificação deste subproduto é alto para que o mesmo seja inserido nas indústrias de alimentos, farmacêutica, e cosméticos. Dessa forma, vários métodos de eliminação e utilização deste glicerol residual têm sido tentados, incluindo combustão, compostagem, digestão anaeróbica, ração animal, bem como sua conversão biológica em produtos de valor agregado. Além disso, o estabelecimento de uma dinâmica de inovação tecnológica e desenvolvimento cientifico-tecnológico relacionadas à glicerina como uma possível matéria-prima para os processos biotecnológicos microbianos é de grande relevância. Nesse estudo foram avaliados os efeitos da glicerina residual do biodiesel sobre o crescimento, a morfologia, expressão de enzimas oxidativas; peroxidase, superóxido dismutase e glutation-S-transferase, peroxidação de lipídeos, produção de lipídeos e perfil de ácidos graxos do fungo Mucor circinelloides. Os resultados revelam alterações em todos os parâmetros testados. A presença de glicerina o meio de cultura induz a um aumento de biomassa celular comparado ao crescimento em glicose e glicerol puro. O reaproveitamento do resíduo revela-se uma alternativa viável minimizar o excesso de glicerina produzido para a produção de biomassa, lipídeos e enzimas antioxidantes, apontando o potencial industrial e biotecnológico do isolado. Além disso, da habilidade de utilização do subproduto, o fungo poderia ser utilizado como substrato para a produção de biodiesel.
Glycerol (also known as glycerin) is an important by-product in the process of manufacture of biodiesel, corresponding to 10% of the by-product formed in the reaction of transesterificação of this biofuel. The purification costs of raw glycerol is high and disables its use in the industries of foods, druggs, and cosmetics. Thus, several methods of reuse of residual glycerol have been attemped, including combustion, anaerobic digestion, animal food, as well as its biological conversion in products of aggregate value. Moreover, the establishment of a dynamics of related technological innovation and scientific development to the glycerin as a possible raw material for the microbial biotechnological processes are of great importance. In this study the effects of the residual glycerin of biodiesel were evaluated on the growth, biomass production, morphology, oxidative enzymes: superoxide dismutase; gluthation-S-Transferase and catalase, lipid peroxidation, production of lipids and fatty acid of Mucor circinelloides. The results revealed alterations in all parameters tested. The glycerin presence in culture medium induced increase in cellular growth and biomass compared to growth in glucose and pure glycerol. The residue metabolization is a viable alternative for exceeding glycerin produced for production of biomass, lipids and antioxidant enzymes, pointing the industrial and biotechnological potential application of the isolate. Moreover, the ability of use of the by-product also can be applied as substrate for biodiesel production.

1. The profile and biochemistry of growth and lipid accumulation in M. circinelloides and Mt. alpina were investigated. 2. A nitrogen-limited condition was vital in triggering lipid accumulation in both fungi, which was in agreement with previous work reported in oleaginous yeasts (Botham and Ratledge, 1979; Boulton and Ratledge, 1984). Good growth and lipid production by M. circinelloides were obtained only when it was grown in fermenters. Growth in stirred bottles (whirlipots) did not result in high lipid yields. This was caused by the anaerobic nature of cultivation in the whirlipots which affected the utilization of ammonium by the cells. As a result the cultures became carbon-limited instead of nitrogen-limited. Conversely, in a fermenter culture which had an efficient aeration, the culture reached a nitrogen-limited condition at an early stage of the incubation which led to a higher lipid production of the cells. 3. The lipid production in both fungi increased in parallel with the increase in the C:N ratio of the medium but the fatty acid compositions were not affected. 4. Ten enzymes potentially linked to the regulation of lipid biosynthesis (fatty acid synthase, acetyl-CoA carboxylase, ATP:Citrate lyase, AMP:deaminase, carnitine acetyl transferase, malic enzyme, glucose-6- phosphate dehydrogenase, 6-phosphogluconate dehydrogenase, NADP:isocitrate dehydrogenase and NAD:isocitrate dehydrogenase) were detected in both fungi. In both fungi, the profile of all enzymes stated above was similar with the activities increased coincidentally with the depletion of ammonia in the medium. 5. The only differences in the enzymatic profiles of the two fungi was the early depletion of ME activity in M. circinelloides where it disappeared after approximately 40 h of incubation, coincident with the cessation of lipid accumulation, although other key enzymes of lipid biosynthesis (FAS, ACC and ACL) together with the activities of other NADPHgenerating enzymes were still active and the glucose was still present. Conversely, ME in Mt. alpina culture was present until the late stage of fermentation and the cell lipid continued to increase until the end of the fermentation. This suggests ME is a major provider of NADPH for lipid biosynthesis which was in agreement with previous observations in Aspergillus nidu/ans (Wynn and Ratledge, 1997) and M. circinelloides (Wynn et al., 1997). 6. The depletion of ME activity in M. circinelloides after approximately 40 h of incubation was as a result of the cessation of the protein from being synthesized, triggered by the depletion of ammonium in the culture. This - was evident as malic enzyme activity returned after its initial depletion when ammonium tartrate was added into the culture. Also, the restitution of malic enzyme activity was prevented when cycloheximide, a protein synthesis inhibitor, was added simultanously with the addition of ammonium tartrate. 7. The NAD:isocitrate dehydrogenase from both fungi showed an increased affinity for its substrate, isocitrate, in, the presence of AMP. However, the enzyme did not show an absolute requirement for AMP for its activity as it could still be activated in the absence of AMP at a saturating concentration of isocitrate. 8. ME was purified some 20-fold purification from both fungi. Both showed a similar Km values for NADP (approximately 0.04 mM) but a slightly higher Km value for malate was obtained in Mt. alpina compared to M. circinelloides (1 mM and 0.4 mM, respectively). 9. ME from both fungi showed various degrees of inhibition by tartronic acid, oxaloacetate, palmitoyl-CoA and oleoyl-CoA. At 10 mM, tartronic acid caused approximately 40 % inhibition in the activity of ME from both fungi while OAA inhibited ME from M. circinelloides more strongly (70 %) than that from Mt. alpina ( 45 % ). At a final concentration of 1 mM, palmitoyl-CoA and oleoyl-CoA caused a 100 % inhibition on ME from M. circinelloides and approximately 90 % on ME from Mt. alpina. 10. FAS purified from both fungi showed a similar Km values for malonyl-CoA and acetyl-CoA (approximately 0.013 and 0.016 mM, - respectively) while a higher Km value for NAOPH was observed in Mt. alpina compared to M. circinelloides (0.038 and 0.01 mM, respectively). 11. Despite a range of experiment using different approaches, no direct evidence of a physical association between FAS and ME was obtained when experiments were performed to observe the formation of complexes between the two enzymes in vitro.

Introducción: El conocimiento cada vez mayor sobre la relevancia funcional de los pequeños RNAs endógenos (esRNAs) como riboreguladores ha estimulado la identificación y caracterización de estas moléculas en numerosos eucariotas. En el hongo basal Mucor circinelloides, un patógeno oportunista humano, se han descrito esRNAs que regulan la expresión de muchos genes que codifican proteínas. En la biogénesis de estos esRNAs participan una RNasa III denominada Dicer, una proteína Argonauta y dos RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRP). Además de participar en esta ruta canónica de silenciamiento mediado por RNA, los genes rdrp de M. circinelloides están implicados en la producción de una nueva clase de esRNA, que son independientes de Dicer. Estos esRNAs muestran un sesgo muy fuerte en la polaridad de las cadenas y una distribución aleatoria de tamaños, lo que sugiere que son productos de degradación de RNAm endógenos. El objetivo global de esta tesis es caracterizar esta posible ruta de degradación de RNAm, identificar la RNasa implicada y utilizar los mecanismos de silenciamiento de Mucor para realizar un análisis funcional a escala genómica. Estos objetivos globales se concretan en los siguientes: Objetivos: i) Análisis de la función de la ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRp en la regulación de la expresión génica. ii) Identificación in silico de RNasas de M. circinelloides candidatas a participar en la ruta de degradación independiente de Dicer. iii) Análisis del papel de los genes candidatos en la producción de esRNAs independientes de Dicer y dependientes de RdRP. iv) Construcción de genotecas genómicas para el análisis funcional de genes mediante RNA de interferencia (RNAi), utilizando vectores de silenciamiento para identificar secuencias de M. circinelloides con un posible papel en patogénesis. v) Generación de mutantes nulos de los genes candidatos para confirmar el fenotipo e investigar su papel en la patogénesis de Mucor. Métodos: El análisis de la función génica se llevó a cabo mediante manipulaciones genéticas in vitro e in vivo. Estas incluyen métodos para aislar, amplificar y analizar la expresión de genes específicos y para la transformación genética de células vivas. Se construyeron genotecas de DNA genómico en vectores de silenciamiento con promotores duales para el análisis funcional del genoma y la identificación de genes candidatos con un posible papel en la patogénesis de Mucor. Se utilizaron análisis fenotípicos para evaluar las funciones de los genes candidatos en el crecimiento, la morfogénesis y la virulencia de este hongo. Resultados: Los análisis de expresión demostraron que la nueva ruta independiente de Dicer y dependiente de RdRP regula la expresión génica mediante la degradación específica de RNAm por una RNasa previamente desconocida. Esta ruta regula principalmente genes conservados implicados en metabolismo y procesos de señalización celular, tales como los requeridos para la biosíntesis del grupo hemo, y controla las respuestas a señales ambientales específicas. La búsqueda en el genoma de Mucor identificó varias RNasas candidatas, y el análisis funcional de los mutantes nulos correspondientes permitió identificar una nueva proteína, R3B2, que es específica de hongos basales. Esta RNasa III participa tanto en la ruta no canónica de degradación independiente de Dicer, como en la ruta canónica de silenciamiento dependiente de Dicer, lo que pone de manifiesto su papel crucial en la biogénesis y función de los esRNAs reguladores. Se ha utilizado el mecanismo canónico de silenciamiento para llevar a cabo el análisis funcional a escala genómica en Mucor, para lo cual se construyeron dos genotecas genómicas basadas en RNAi. La introducción de estas genotecas en M. circinelloides permitió identificar varios transformantes con fenotipos anormales. Los análisis moleculares y de silenciamiento demostraron que dos genes específicos fueron los responsables de las alteraciones fenotípicas estudiadas. El análisis fenotípico de los mutantes nulos correspondientes confirmó el papel de dichos genes en la morfogénesis y patogénesis de M. circinelloides. Conclusiones: Se ha identificado y caracterizado una nueva ruta no canónica de silenciamiento, independiente de Dicer y dependiente de RdRP, que regula la expresión génica mediante la degradación de RNAm específicos. La RNasa implicada en esta ruta, denominada R3B2, presenta una arquitectura de dominios única, es específica de hongos basales y también está implicada en el mecanismo canónico de RNAi. Estos resultados asignan un nuevo papel para las proteínas RdRP en un proceso de degradación de RNA que podría representar el primer paso en la evolución del RNAi. Se ha desarrollado con éxito un procedimiento para realizar análisis funcional a gran escala utilizando RNAi, lo que ha permitido identificar dos genes que participan en la morfogénesis de Mucor. El gen mcmyo5 codifica una miosina de clase V que juega un papel esencial en la morfogénesis y la patogénesis de Mucor. El gen mcclasp codifica una proteína CLASP, que también participa en la morfogénesis, pero no juega ningún papel importante en la patogénesis de Mucor.
The increasing knowledge on the functional relevance of endogenous small RNAs (esRNAs) as riboregulators has stimulated the identification and characterization of these molecules in numerous eukaryotes. In the basal fungus Mucor circinelloides, an emerging opportunistic human pathogen, esRNAs that regulate the expression of many protein coding genes have been described. These esRNAs share common machinery for their biogenesis consisting of an RNase III endonuclease Dicer, a single Argonaute protein and two RNA-dependent RNA polymerases. Besides participating in this canonical dicer-dependent RNA interference (RNAi) pathway, the M. circinelloides rdrp genes are involved in the production of a novel dicer-independent esRNA class, which showed a very strong strand bias, being exclusively sense to the mRNAs, and a random spread of size distribution, suggesting that they are degradation products of endogenous mRNAs. The overall objective of this thesis is to characterize this putative mRNA degradation pathway, identify the RNase involved and use the Mucor silencing mechanisms for whole-genome functional analysis. These global objectives are specified in the following: Objectives: i) Functional analysis of the rdrp-dependent dicer-independent pathway in the regulation of gene expression. ii) In silico identification of M. circinelloides candidate RNases to be involved in the dicer-independent degradation pathway. iii) Functional studies of the candidate genes in the production of rdrp-dependent dicer-independent esRNAs. iv) Construction of genomic libraries for functional analysis by knocking-down genes using silencing vectors to identify M. circinelloides sequences with putative roles in pathogenesis. v) Generation of null mutants for each candidate gene to confirm the phenotype and investigate their roles in Mucor pathogenesis. Methods: in vivo and in vitro genetic manipulations were used to analyze gene functions. These include methods to isolate, amplify and analyze the expression of specific genes and genetic transformation of living cells. Genomic DNA libraries were constructed in silencing vectors containing dual promoters for whole-genome functional analysis and identification of candidate genes with a possible role in Mucor pathogenesis. Phenotypic analyses were used to evaluate the functions of candidate genes in growth, morphogenesis and virulence of this fungus. Results: Expression analysis demonstrated that the new rdrp-dependent dicer-independent pathway regulates gene expression by promoting the specific degradation of mRNAs by a previously unknown RNase. This pathway mainly regulates conserved genes involved in metabolism and cellular processes and signaling, such as those required for heme biosynthesis, and controls responses to specific environmental signals. Searching the Mucor genome for candidate RNases to participate in this pathway, and functional analysis of the corresponding knockout mutants identified a new protein, R3B2, which is only found in basal fungi. This RNase III-like protein participates in both the rdrp-dependent dicer-independent non-canonical pathway and the canonical dicer-dependent RNAi pathway, highlighting its crucial role in the biogenesis and function of regulatory esRNAs. RNAi was applied to carry out whole-genome functional analysis in Mucor. Two RNAi-based genomic libraries were constructed. Introduction of these libraries into M. circinelloides identified several transformants with abnormal phenotypes. Silencing and molecular analyses demonstrated that two specific genes were responsible for the phenotypic alterations. Phenotypic analyses of the corresponding disruption mutants revealed the role of those genes in M. circinelloides morphogenesis and pathogenesis. Conclusions: A novel non-canonical RNA silencing mechanism promoting mRNA degradation in M. circinelloides has been identified and characterized. This pathway is rdrp-dependent dicer-independent and regulates gene expression by degrading specific mRNAs. The RNase involved in this pathway, R3B2, presents unique domain architecture and it is also involved in the canonical dicer-dependent RNAi pathway. Our results expand the role of RdRPs in gene silencing and reveal the involvement of these proteins in a new RNA degradation process that could represent the first step in the evolution of RNAi. A new approach for large-scale functional genomics using RNAi has been successful developed in M. circinelloides. Two genes that participate in Mucor morphogenesis have been identified. Gene mcmyo5 encodes a Myosin class V protein that plays an essential role in Mucor morphogenesis and pathogenesis. Gene mcclasp encodes a CLASP protein, which is also involved in morphogenesis, but does not play any significant role in Mucor pathogenesis.

Introducción La luz regula gran cantidad de procesos fisiológicos y del desarrollo en muchos organismos. La mayoría de respuestas a la luz caracterizadas en hongos dependen de fotorreceptores de luz azul similares a la proteína Wc-1 de Neurospora crassa. La respuesta a la luz mejor conocida en el hongo Mucor circinelloides es la síntesis de β-caroteno. En este organismo, CrgA, una proteína que muestra características de ligasas de ubiquitina, reprime la carotenogénesis en la oscuridad, afectando también a otros procesos celulares como la esporulación y el crecimiento vegetativo. Objetivos El objetivo principal de la tesis era investigar las vías de transducción de la señal luminosa en hongos, concretamente en las respuestas fototrópica y fotocarotenogénica, utilizando M. circinelloides como modelo. Este objetivo general se estructuró en los siguientes objetivos específicos: 1. Identificación y aislamiento de los genes wc-1 de M. circinelloides. 2. Caracterización de las respuestas fototrópica y fotocarotenogénica. 3. Generación de mutantes nulos para cada gen wc-1 de M. circinelloides y análisis de sus fenotipos. 4. Generación de mutantes dobles para el gen crgA y cada uno de los genes wc-1 y análisis de sus fenotipos. Metodología M. circinelloides presenta el mayor repertorio de herramientas moleculares dentro de los cigomicetos y una respuesta fotocarotenogénica medianamente caracterizada, con mutantes disponibles en genes estructurales y reguladores de la síntesis de carotenos. Los genes mcwc-1 se identificaron y clonaron utilizando una genoteca de M. circinelloides en el fago λ y mediante hibridaciones tipo Southern. Para la caracterización de los genes mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c y el estudio de su relación con el gen crgA se generaron mutantes simples y dobles (crgAΔ) nulos para cada uno de los genes mcwc-1. Se analizó el contenido en β-caroteno de sus micelios y el fototropismo de los esporangióforos. También se estudiaron los cambios en los niveles de mRNAs en respuesta a la luz de los genes carotenogénicos y de los genes mcwc-1 utilizando hibridaciones tipo Northern. Además, en el caso de la proteína Mcwc-1b, se analizó su abundancia, sus modificaciones post-traduccionales y su posible interacción con CrgA por medio de hibridaciones tipo Western y co-inmunoprecipitación. Resultados y Conclusiones En primer lugar, utilizando diferentes longitudes de onda del espectro visible, se demostró que los esporangióforos de M. circinelloides poseen fototropismo positivo inducido por luz azul y verde, mientras que la carotenogénesis se induce sólo por luz azul. Además, se identificaron tres genes white-collar-1 en M. circinelloides (mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c) que codifican proteínas similares a Wc-1 de Neurospora crassa. Las tres contienen un dominio LOV (luz, oxígeno y voltaje) parecido al presente en receptores de luz azul de plantas y hongos. Los resultados obtenidos en el análisis de los mutantes simples mcwc-1Δ implicaron al gen mcwc-1a en el control del fototropismo y al gen mcwc-1c en la fotocarotenogénesis. Los resultados indican que mcwc-1a y mcwc-1c controlan diferentes rutas de transducción de la luz, aunque es posible que existan interacciones entre ambas rutas, ya que mcwc-1a está implicado en el regulación por luz de la expresión de mcwc-1c. Análisis de los dobles mutantes crgAΔ mcwc-1Δ demostraron que el efecto de crgA en la carotenogénesis depende de mcwc-1b, que actúa como un activador de la carotenogénesis. Por último, se demostró que CrgA está implicado en la mono- y diubiquitilación no degradativa de Mcwc-1b, resultando en su inactivación. La existencia de tres genes mcwc-1 y los fenotipos observados de sus mutantes apoyan la sucesiva duplicación de los genes tipo wc-1 postulada en cigomicetos, seguida de una especialización de sus funciones permitida por la aparición de las nuevas copias.
Introduction Light regulates many developmental and physiological processes in a large number of organisms. Most light responses studied in fungi require blue-light photoreceptors similar to Wc-1 of Neurospora crassa. The best-known light response in the fungus Mucor circinelloides is the biosynthesis of β-carotene. In this organism, CrgA, a protein that shows characteristics of ubiquitin ligases, represses carotenogenesis in the dark and affects also other cellular processes, like sporulation or vegetative growth. Objectives The main goal of this thesis was to study light transduction pathways in fungi, specifically photocarotenogenesis and phototropism responses, using M. circinelloides as a model. The main objective was divided in the following specific objectives: 1. Identification and isolation of wc-1 genes in M. circinelloides. 2. Characterization of photocarotenogenesis and phototropic responses. 3. Generation of knockout mutants of each wc-1 gene in M. circinelloides and analysis of their phenotypes. 4. Generation of double knockout mutants of crgA and each wc-1 gene and analysis of their phenotypes. Methods The most complete molecular toolset in zygomycetes is available in M. circinelloides. The photocarotenogenesis response has been studied in this organism and there are several mutants available in structural and regulatory genes of the biosynthesis of carotenes. A bacteriophage λ genomic library of M. circinelloides and Southern blots were used to identify and clone the three wc-1 genes of M. circinelloides (mcwc-1). To characterize mcwc-1a, mcwc-1b and mcwc-1c and to study their relationships with crgA, simple and double (crgAΔ) knockout mutants for each mcwc-1 gene were generated. Phototropism of sporangiophores and β-carotene content in the mycelium were analysed. Changes in the level of mRNAs in response to light of carotenogenic genes and of mcwc-1 genes were also studied by Northern blots. In addition, the expression levels of Mcwc-1b, its post-translational modifications and it possible interaction with CrgA were analysed using Western blots and co-immunoprecipitation. Conclusions Here, we show that M. circinelloides sporangiophores exhibit a positive phototropism. Analysis of light responses to different light wavelengths within the visible spectrum demonstrated that phototropism is induced by green and blue light, whereas carotenogenesis is only induced by blue light. Three white-collar-1 genes (mcwc-1a, mcwc-1b and mcwc-1c), coding for proteins showing similarity with the Wc-1, were identified in this thesis. All three contain a LOV (light, oxygen or voltage) domain, similar to the one present in fungal and plant blue-light receptors. The study of the knockout mutants for each mcwc-1 gene, showed that mcwc-1c is involved in the light transduction pathway that controls carotenogenesis and that positive phototropism is controlled by mcwc-1a gene. It seems therefore that mcwc-1a and mcwc-1c genes control different light transduction pathways, although cross-talk between both pathways probably exists, because mcwc-1a is involved in the light regulation of mcwc-1c expression. Analysis of double knockout mutants crgAΔ mcwc-1Δ showed that the effect of crgA on carotenogenesis is mediated by mcwc-1b, which acts as a carotenogenesis activator. Finally, it was demonstrated that CrgA is involved in the proteolysis-independent mono- and di-ubiquitylation of Mcwc-1b, which results in its inactivation. The existence and characteristics of the three mcwc-1 genes and the phenotypes of their knockout mutants support the successive duplication of the wc-1 like genes hypothesized in zygomycetes, followed by the functional specialization allowed by the presence of several copies.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Biossurfactantes são metabólitos secundários de origem microbiana com propriedades tensoativas capazes de atuar como solubilizantes, dispersantes, formadores de espuma e agentes molhantes. Surfactantes de origem biológica são mais vantajosos do que os sintéticos, visto que exibem pouca toxicidade, biodegradabilidade e alta eficiência. Os surfactantes de origem biológica podem ser classificadas de acordo com alguns critérios como, por exemplo, seu peso molecular, carga iônica e tipo de secreção. Contudo, o princípio fundamental de classificação continua a ser a sua estrutura química, o que lhes permite ser divididos nas seguintes classes: glicolipídicos, lipopeptídicos, surfactantes particulares, ácidos graxos, fosfolipídios, lipídios neutros e biossurfactantes poliméricos. Essas biomoléculas possuem uma vasta gama de aplicações na indústria de alimentos, na agricultura, em couro, em cosméticos, na área têxtil, recuperação avançada do petróleo e na biorremediação. A contaminação de solos e águas subterrâneas por hidrocarbonetos tornou-se um foco de grande preocupação, a principal fonte destes poluentes provém de operações rotineiras de lavagem de navios, vazamentos de óleo no mar e, especialmente acidentes relacionados a exploração e transporte de petróleo. O uso de biossurfactante tornou-se uma ferramenta essencial na biorremediação de áreas impactadas por petróleo e seus derivados, estes hidrocarbonetos tornam-se mais acessíveis para degradação microbiana local quando tratados com agentes tensoativos. O biossurfactante lipopeptídico produzido por M. circinelloides apresentou atividade superficial de 26 mN/m relativamente estável em condições ambientais adversas, com uma CMC de 1,5% e rendimento de 6 g/L. O tensioativo exibiu semelhança aos surfactantes químicos por apresentar uma área de deslocamento de óleo de 50 cm2 em dispersão de água-óleo, bem como reduzir a viscosidade do óleo de 843,6 cP para 14,7 cP. Além disso, o biossurfactante foi capaz de recuperar 95,9% de óleo de motor adsorvido em uma amostra de solo argiloso, apresentando considerável potencial para uso em processos de biorremediação, especialmente na indústria de petróleo.
Biosurfactants are secondary metabolites of microbial origin with tensoactive properties capable of acting as solubilizers, dispersants, foaming agents and wetting agents. Surfactants of biological origin are more advantageous than synthetic ones, since they exhibit little toxicity, biodegradability and high efficiency. Surfactants of biological origin can be classified according to some criteria such as, for example, their molecular weight, ionic charge and type of secretion. However, the fundamental principle of classification remains their chemical structure, which allows them to be divided into the following classes: glycolipids, lipopeptides, particular surfactants, fatty acids, phospholipids, neutral lipids and polymeric biosurfactants. These biomolecules have a wide range of applications in the food industry, agriculture, leather, cosmetics, textiles, advanced oil recovery and bioremediation. Contamination of soils and groundwater by hydrocarbons has become a focus of major concern, most in developing countries, because of their wide environmental distribution, which can reach the ground, groundwater and air. Consequently, these toxic compounds are the leading causes of death from toxicity. However, the main source of hydrocarbons in the environment comes from routine shipwreck operations, oil leaks in the seabed and especially accidents related to the exploration and transportation of oil. The use of biosurfactant has become an essential tool in the bioremediation of areas impacted by oil and its derivatives, these hydrocarbons become more compatible for microbial degradation when treated with surfactants. The lipopeptide biosurfactant produced by M. circinelloides showed a relatively stable surface activity of 26 mN / m in adverse environmental conditions, with a CMC of 1.5% and yield of 6 g / L. The surfactant exhibited similarity to chemical surfactants by having a 50 cm2 oil displacement area in water-oil dispersion, as well as reducing the oil viscosity from 843.6 cP to 14.7 cP. The biosurfactant was able to recover 95.9% of adsorbed motor oil in a clayey soil sample, presenting considerable potential for use in bioremediation processes, especially in the petroleum industry.

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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Os ácidos graxos insaturados, presentes naturalmente em óleos vegetais e peixes de áua fria, possuem potentes atividades biológicas como precursores antiinflamatórios e hormonais. A busca por novas fontes de organismos ricos em ácidos graxos insaturados da família ômega 6 tem-se intensificado. Os fungos filamentosos do solo da ordem Mucorales são conhecidos por possuírem naturalmente altas concentrações destes ácidos graxos. Neste estudo foram inicialmente utilizadas duas linhagens de Mucor circinelloides isoladas de solo de área de caatinga (M1) e cerrado (M2), com as quais foram realizados teste preliminares para selecionar a melhor linhagem produtora de ácido gama-linolênico (AGL). A partir dos resultados obtidos nos cultivos em sistema automatizado foram selecionadas as melhores fontes de carbono, glicose e maltose, para produção de biomassa e também o melhor pH 5,8 para o cultivo submerso. Nos cultivos submerso objetivando-se melhor produção de AGL, selecionouse a linhagem M1 sob as condições de cultivo com pH 5,8, temperatura 25° C, rotação de 150 rpm e inóculo com de 1.107 esporos.mL-1. Os cultivos em substrato sólido foram realizados com farinha de soja, farelo de trigo, polpa cítrica, bagaço de cana-de-açúcar e casca de mandioca, acrescidos com extrato de levedura 1% e mantidos a 25° C, por 168 horas. Foram observados decréscimos no teor de lipídios totais (LT) em todos os cultivos realizados. A farinha de soja foi o melhor substrato para produção de AGL. Este substrato suplementado com diferentes suplementos carbônicos demonstrou que a mistura de óleo de canola: óleo de gergelim 2% (1:1 p/p) foi o maior indutor de AGL (6,2 g.Kg-1 Bioproduto; 26,0 g.g-1 LT). A adição de casca de arroz ao substrato melhorou a aera o do substrato e o aproveitamento deste pelo fungo, acentuando a forma o de AGL (8,4 g.Kg-1 Bioproduto; 36,3 g.g-1 LT). Os testes de temperatura
Unsaturated fatty acid naturally occur in vegetable oils and cold-water fishes. They have powerful biological activities being anti-inflammatory and hormone precursor. The search for new organisms which are rich in omega 6 unsaturated fatty acid family has been intensified. Soil filamentous fungi from Mucorales order are known by having high fatty acids concentrations. Firstly, two Mucor circinelloides strains isolated from caatinga soil area, M1, and from cerrado, M2, have been used. The preliminary tests have been carried out to select the best strain for production of gamma-linolenic acid (GLA). From the automatized incubator system results, either the best carbon sources, glucose and maltose or the best pH, 5.8, have been selected for biomass production in submerged culture. In that cultures focused on better GLA production, M1 strain has been selected under pH 5.8, temperature of 25 C, 150 rpm rotation and with a 1.107 mL-1 spore inocula. The cultures in solid substrate have been carried out with soy flour, wheat bran, citric pulp, sugar cane bagasse and cassava rind, added with 1% yeast extract, at 25 C, for 168 hour. The increase of total lipids (TL) values of all cultures has been observed. The soy flour was the best substrate for GLA production. The substrate added with different carbonic supplements, demonstrated that canola:sesame 2% (1:1 w/w) oil mixture was the best inducer of GLA production (6.2 g.Kg-1 Bioproduct; 26.0 mg.g-1 TL). The rice rind addition in the substrate improved the aeration and the exploitation of it, for the fungi strain, increasing the GLA synthesis (8.4 g.Kg-1 Bioproduct; 36.3 mg.g-1 TL). Temperature tests have shown that 20 C during 144 hours followed by 12 C during 24 hours has leaded to a greater GLA production (12.9 g.Kg-1 Bioproduct; 43.4 mg.g-1 TL) When the spore concentration as increased to 1.108 spores.mL-1 there was an increase in the GLA production (14.2 g.Kg-1; 58.1 mg.g- 1 TL). The culture ...

Orientador: Sâmia Maria Tauk-Tornisielo
Banca: Eleonora Cano Carmona
Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini
Resumo: Os ácidos graxos insaturados, presentes naturalmente em óleos vegetais e peixes de áua fria, possuem potentes atividades biológicas como precursores antiinflamatórios e hormonais. A busca por novas fontes de organismos ricos em ácidos graxos insaturados da família ômega 6 tem-se intensificado. Os fungos filamentosos do solo da ordem Mucorales são conhecidos por possuírem naturalmente altas concentrações destes ácidos graxos. Neste estudo foram inicialmente utilizadas duas linhagens de Mucor circinelloides isoladas de solo de área de caatinga (M1) e cerrado (M2), com as quais foram realizados teste preliminares para selecionar a melhor linhagem produtora de ácido gama-linolênico (AGL). A partir dos resultados obtidos nos cultivos em sistema automatizado foram selecionadas as melhores fontes de carbono, glicose e maltose, para produção de biomassa e também o melhor pH 5,8 para o cultivo submerso. Nos cultivos submerso objetivando-se melhor produção de AGL, selecionouse a linhagem M1 sob as condições de cultivo com pH 5,8, temperatura 25° C, rotação de 150 rpm e inóculo com de 1.107 esporos.mL-1. Os cultivos em substrato sólido foram realizados com farinha de soja, farelo de trigo, polpa cítrica, bagaço de cana-de-açúcar e casca de mandioca, acrescidos com extrato de levedura 1% e mantidos a 25° C, por 168 horas. Foram observados decréscimos no teor de lipídios totais (LT) em todos os cultivos realizados. A farinha de soja foi o melhor substrato para produção de AGL. Este substrato suplementado com diferentes suplementos carbônicos demonstrou que a mistura de óleo de canola: óleo de gergelim 2% (1:1 p/p) foi o maior indutor de AGL (6,2 g.Kg-1 Bioproduto; 26,0 g.g-1 LT). A adição de casca de arroz ao substrato melhorou a aera o do substrato e o aproveitamento deste pelo fungo, acentuando a forma o de AGL (8,4 g.Kg-1 Bioproduto; 36,3 g.g-1 LT). Os testes de temperatura
Abstract: Unsaturated fatty acid naturally occur in vegetable oils and cold-water fishes. They have powerful biological activities being anti-inflammatory and hormone precursor. The search for new organisms which are rich in omega 6 unsaturated fatty acid family has been intensified. Soil filamentous fungi from Mucorales order are known by having high fatty acids concentrations. Firstly, two Mucor circinelloides strains isolated from caatinga soil area, M1, and from cerrado, M2, have been used. The preliminary tests have been carried out to select the best strain for production of gamma-linolenic acid (GLA). From the automatized incubator system results, either the best carbon sources, glucose and maltose or the best pH, 5.8, have been selected for biomass production in submerged culture. In that cultures focused on better GLA production, M1 strain has been selected under pH 5.8, temperature of 25 C, 150 rpm rotation and with a 1.107 mL-1 spore inocula. The cultures in solid substrate have been carried out with soy flour, wheat bran, citric pulp, sugar cane bagasse and cassava rind, added with 1% yeast extract, at 25 C, for 168 hour. The increase of total lipids (TL) values of all cultures has been observed. The soy flour was the best substrate for GLA production. The substrate added with different carbonic supplements, demonstrated that canola:sesame 2% (1:1 w/w) oil mixture was the best inducer of GLA production (6.2 g.Kg-1 Bioproduct; 26.0 mg.g-1 TL). The rice rind addition in the substrate improved the aeration and the exploitation of it, for the fungi strain, increasing the GLA synthesis (8.4 g.Kg-1 Bioproduct; 36.3 mg.g-1 TL). Temperature tests have shown that 20 C during 144 hours followed by 12 C during 24 hours has leaded to a greater GLA production (12.9 g.Kg-1 Bioproduct; 43.4 mg.g-1 TL) When the spore concentration as increased to 1.108 spores.mL-1 there was an increase in the GLA production (14.2 g.Kg-1; 58.1 mg.g- 1 TL). The culture ...
Mestre

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-17T11:58:46Z No. of bitstreams: 2 Dissertação Mayara Nunes Anjos.pdf: 706530 bytes, checksum: fd790fb778cff175e2c741fe323d8c38 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5)
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CNPq
Os carotenóides são substâncias naturais que podem ser sintetizados por plantas e microorganismos. Recentemente houve um aumento do interesse da produção de corantes naturais por processos biotecnológicos de fontes biológicas devido à preocupação com o uso de aditivos químicos nos alimentos. A astaxantina é um dos principais carotenóides amplamente utilizado na indústria e na aquicultura, além disso, possui um importante papel na diminuição do risco de várias doenças degenerativas devido ao seu alto poder antioxidante. Neste trabalho foi estudada a produção de astaxantina por Mucor circinelloides utilizando o meio definido Hesseltine e Anderson e o resíduo agroindustrial melaço de cana-de-açúcar, nas concentrações de 4%, 7% e 10% na presença e ausência de LED´s azul. O inóculo foi obtido a partir do M. circinelloides após 5 dias de crescimento no meio BDA (Batata-Dextrose-Ágar), a 28ºC, 96 horas, 120 rpm. Após a seleção da melhor concentração os frascos contendo melaço de cana-de-açúcar foram incubados em shaker orbital sob diferentes temperaturas (25, 30 e 35ºC), pH (6,0, 7,0 e 8,0) e agitação (120, 135 e 150 rpm) por 96h sob iluminação com LED´S de cor azul e no escuro, segundo um planejamento fatorial 23 com quatro repetições no ponto central. Após o processo fermentativo, a astaxantina foi extraída da biomassa, utilizando uma solução de dimetilsulfóxido/acetona. Em seguida foi pré-purificada em éter de petróleo e analisada por espectrofotometria UV-visível (474 nm). A partir do ponto maximizado do planejamento fatorial foi realizada a determinação do peso seco, pH, proteínas totais, assim como teste de toxicidade e de atividade antioxidante da astaxantina obtida. A produção de astaxantina utilizando o meio Hesseltine e Anderson apresentou rendimento de 142,0 μg/g sem influência de LED´s azul e 340,1 μg/g quando se utilizou LED´s azul, com um aumento da produção de aproximadamente 42%. A melhor condição para a produção de astaxantina com melaço de cana-de-açúcar deu-se na concentração de 4% na ausência (32,7 μg/g) e presença de LED´s azul (134,4 μg/g) durante 96h, 120 rpm a 25°C. De acordo com o planejamento fatorial 23 o ponto máximo de produção foi obtido a 30°C, pH 7,5 e 100 rpm com cerca de 469,0 μg/g na ausência de LED´s azul e 667,6 μg/g na presença de LED´s azul, aumentando em aproximadamente 89% a produção. A astaxantina obtida por M. circinelloides apresentou baixa toxicidade frente à Artemia salina na concentração de 25% e potencial de inibição dos radicais livres de cerca de 92% nos índices testados. O resíduo agroindustrial melaço de cana-de-açúcar possui potencial para a produção de astaxantina por M. circinelloides principalmente na concentração de 4%. Os resultados apresentados demonstram que a utilização de LED´S azul pode aumentar significativamente o teor de astaxantina produzida pelo M. circinelloides.

La luz induce una amplia variedad de respuestas relacionadas con la fisiología celular y el comportamiento de muchos organismos. El conocimiento de los mecanismos moleculares implicados en la regulación de esas respuestas es, sin duda, uno de los grandes retos de la biología molecular. Hongos filamentosos, como Neurospora crassa, han contribuido al conocimiento de algunos de los mecanismos moleculares implicados en las respuestas a la luz. La caracterización de los genes white collar-1 y white collar-2 (wc-1 y wc-2), dos genes claves en todas las respuestas a la luz de este hongo, ha sido crucial en el desarrollo de esos conocimientos. Por otra parte, la biosíntesis de carotenos en hongos, como el propio N. crassa o el cigomiceto Phycomyces blakesleeanus, es una de las respuestas a la luz que más atención ha merecido por parte de un número importante de investigadores. El hongo Mucor circinelloides, otro cigomiceto, responde a la luz azul incrementando notablemente la síntesis de carotenos. La carotenogénesis en M. circinelloides está controlada por crgA, un gen que cifra una proteína RING-finger represora de la carotenogenesis. Este gen está evolutivamente conservado desde hongos hasta humanos y, por tanto, no es un gen exclusivo de la carotenogénesis. De hecho, en el propio M. circinelloides regula también procesos de desarrollo, como la formación de hifas aéreas y producción de esporas asexuales. Este gen está presente en prácticamente todos los eucariotas, pero sólo se ha estudiado en los hongos fundamentalmente en M. circinelloides. El gen crgA regula la carotenogénesis a través del control de la expresión del gen mcwc-1b. En concreto, la proteína CrgA está implicada directa o indirectamente en la adición de una o dos ubiquitinas a la proteína Mcwc-1b, lo que supone su inactivación, pero no su degradación. Esta tesis ha caracterizado en detalle las bases moleculares de dicho mecanismo, que ha includo objetivos específicos como la caracterización de la oligoubiquitilación de Mcwc-1b, la identificación y caracterización de genes regulados por crgA de forma dependiente e independiente de mcwc-1b así como genes exclusivamente regulados por mcwc-1b. Mediante mutagénesis dirigida se ha identificado la lisina de Mcwc-1b que es diana de la ubiquitilación mediada por CrgA. Mediante análisis transcriptómico se ha determinado que la expresión de al menos 350 genes, que representan cerca del 3% de los genes identificados en M. circinelloides, depende de crgA, revelando el importante papel de crgA en la regulación de la expresión génica. La regulación ejercida por crgA es principalmente a través de mcwc-1b, sin embargo, ambos son capaces de regular la expresión de algunos genes de forma independiente. Se ha encontrado un enriquecimiento de genes implicados en el metabolismo de aminoácidos y de metabolitos secundarios regulados por crgA. La regulación de un aspecto tan básico como la síntesis de aminoácidos podría significar que este gen también pueda ejercer esta función en eucariotas superiores. Esta tesis también ha caracterizado a nivel transcriptómico la respuesta a la luz en M. circinelloides. M. circinelloides presenta tres genes homólogos al gen wc-1 (mcwc-1a, mcwc-1b y mcwc-1c). En esta tesis se han planteado el objetivo de caracterizar a nivel molecular las respuestas a la luz de M. circinelloides y la implicación de los tres genes wc-1. El análisis transcriptómico realizado en esta tesis ha identificado 146 genes (1,24 % del genoma) regulados por luz, muchos de ellos a través de mcwc-1a, indicando que es elemento principal de control de las respuestas a la luz. La existencia de genes que se inducen en los mutantes en los tres genes mcwc-1 de M. circinelloides, sugiere que existen otros fotorreceptores que podrán ser caracterizados en futuras investigaciones.
Light induces a wide variety of responses related to cell physiology and behavior of many organisms. Knowledge of the molecular mechanisms involved in the regulation of these responses is undoubtedly one of the great challenges of molecular biology. Filamentous fungi, such as Neurospora crassa, have contributed to the knowledge of some of the molecular mechanisms involved in responses to light. The characterization of the white collar-1 and white collar-2 (wc-1 and wc-2), two key genes in all responses in the light of this fungus, has been crucial in the development of such knowledge. Moreover, the carotenoid biosynthesis in fungi such as itself N. crassa or cigomiceto Phycomyces blakesleeanus, is one of the responsess to light that more attention has been received by a large number of researchers. The fungus Mucor circinelloides, another cigomiceto, responds to blue light significantly increasing the synthesis of carotenoids. In M. circinelloides carotenogenesis is controlled by a crgA, gene that codes a RING-finger repressor protein of the carotenogenesis. This gene is evolutionarily conserved from yeast to humans and, therefore, it is not an exclusive gene carotenogenesis. In fact, itself M. circinelloides also regulates development processes such as the formation of aerial hyphae and production of asexual spores. This gene is present in almost all eukaryotes, but has only been studied in fungi mainly in M. circinelloides. The gene crgA regulates carotenogenesis through expression control of mcwc-1b gene. Specifically, CrgA protein is directly or indirectly involved in the addition of one or two ubiquitin to mcwc-1b protein, resulting in its inactivation, but not degradation. This thesis has been characterized in detail the molecular basis of this mechanism, which has included when specific goals as characterization of oligoubiquitilación of mcwc-1b, identification and characterization genes regulated by crgA dependent or independent of mcwc-1b and genes exclusively regulated by mcwc-1b. By mutagenesis has been identified lysine is the target crgA mediated ubiquitylation. By transcriptomic analysis has determined that the expression of at least 350 genes, representing about 3% of the genes identified in M. circinelloides, it depends crgA, revealing the important role of crgA in regulation of gene expression. The regulation is mainly exerted by crgA through mcwc-1b, however, both are capable of regulating the expression of some genes independently. It found an enrichment of genes involved in amino acid metabolism and secondary metabolites regulated by crgA. The regulation of such a basic amino acid synthesis as aspect could mean that this gene can also perform this function in higher eukaryotes. This thesis has characterized response to light of M. circinelloides at the transcriptome level. M. circinelloides presents three genes homologous to gene wc-1 (mcwc-1a, mcwc-b and mcwc-1c). In This thesis has been raised the characterization at the molecular level responses to light in M. circinelloides and the involvement of three genes wc-1. Transcriptome analysis in this thesis has identified 146 genes (1.24% of the genome) regulated by light, many of them through mcwc-1a, indicating that it is the main control element of responses to light. The existence of genes induced by light in mutants mcwc-1aΔ, suggests that other photoreceptors that may be characterized in future research.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4413.pdf: 14486486 bytes, checksum: b1db822e0c1f598c763487b5331706a6 (MD5) Previous issue date: 2012-03-28
Financiadora de Estudos e Projetos
Identification and study of the fungus Mucor circinelloides isolated from the trunk of Pinus taeda, with emphasis on the carvone biotransformation. Fungi associated with plants have been studied ripping seeking the discovery of new substances and the understanding of the ecological interactions between plants and microorganisms. This study aimed to identify a fungus associated with the trunk of Pinus taeda using morphological analysis with images obtained by optical microscopy and scanning electron microscopy (SEM), genetic sequencing of the 18S ribosomal region, and proteome analysis by MALDI-TOF. The fungus was identified as Mucor circinelloides and its metabolism was studied. A mixture of 3-epiergosterol and ergosterol, glucosilceramidas mixture, and 3-glucopyranosyl-sitosterol were identified. The emphasis of this work was on the biotransformation of carvone, which is one of the main monoterpenes found in nature and one of the most commercialized. From the biotransformation experiment it was possible to isolate two trihydroxylated products and also dihydrocarvona, dihydrocarveol and neo-dihydrocarveol identified by GC-MS. The biotransformation products were identified by GC-MS and were proposed a pathway biotransformation. After that was performed also an estimative of production for some products and consumption estimated of (4R) - and (4S)-carvone, which is consumed in less than four hours of the experiment, showing a very rapid metabolism as reported in several genera of Mucor.
Identificação e estudo do fungo Mucor circinelloides isolado do tronco de Pinus taeda, com ênfase em biotransformação da carvona. Fungos associados a plantas tem sido intensamente estudados buscando a descoberta de novas substancias e o entendimento das interacoes ecologicas entre plantas e microorganismos. Este trabalho visou a identificacao de um fungo associado ao tronco do Pinus taeda utilizando para isso a identificacao morfologica com imagens de microscopia optica e microscopia eletronica de varredura (MEV), identificacao por sequenciamento genetico da regiao 18S ribossomal, e identificacao por perfil proteomico usando MALDI-TOF. O fungo foi identificado como Mucor circinelloides e seu metabolismo foi estudado, sendo identificadas uma mistura de ergosterol e 3-epiergosterol, mistura de glucosilceramidas, e o 3-glucopiranosil sitosterol. A enfase do trabalho foi a biotransformacao da carvona, que e um dos principais monoterpenos encontrados na natureza e um dos mais comercializados. Com o experimento de biotransformacao foi possivel isolar dois produtos trihidroxilados como tambem identificar alguns outros como dihidrocarvona, dihidrocarveol e neo-dihidrocarveol por GC-MS. A partir dos produtos identificados foi proposto um caminho de biotransformacao como tambem uma estimativa de producao para alguns produtos e estimativa de consumo da (4R)- e (4S)-carvona, que e consumida em menos de 4 horas de experimento, mostrando um metabolismo muito acelerado conforme e relatado em diversos generos de Mucor.

Mucor circinelloides es un hongo filamentoso utilizado como modelo para el estudio del mecanismo de silenciamiento génico mediado por RNA. Una vez caracterizado dicho mecanismo y los principales genes implicados, se pretende determinar el papel de la ruta de silenciamiento en la regulación de genes endógenos, así como identificar otros posibles elementos genéticos que participen en dicha ruta. Para ello, se plantean los siguientes objetivos concretos: 1. Identificación del gen implicado en la eliminación de la cadena pasajera de los siRNAs y estudio de la existencia de interacciones entre las proteínas de la maquinaria de silenciamiento. 2. Estudio de la participación de Ago-1 en la biogénesis de los distintos tipos de ex-siRNAs de M. circinelloides. 3. Identificación de los genes regulados por el mecanismo de silenciamiento mediante el análisis de los perfiles transcriptómicos de la estirpe silvestre y de mutantes en genes de silenciamiento. 4. Caracterización fenotípica detallada de los mutantes afectados en la ruta de silenciamiento, para identificar los procesos celulares regulados mediante dicho mecanismo. Para desarrollar estos objetivos se ha utilizado la siguiente metodología: 1. La identificación de otros genes implicados en el mecanismo de silenciamiento se llevó a cabo mediante la disrupción de los genes candidatos por recombinación homóloga y su posterior análisis fenotípico. Para ello, se utilizaron técnicas de amplificación de DNA mediante PCR, clonación, transformación de protoplastos e hibridaciones tipo Southern y Northern. Las interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento se analizaron mediante el sistema de doble híbrido de levaduras. 2. La participación de Ago-1 en la biogénesis de los ex-siRNAs se analizó mediante la secuenciación de librerías de sRNAs. Ago-1 fue purificada mediante FLPC para el aislamiento y secuenciación de los sRNAs unidos a ella. Los datos obtenidos fueron validados experimentalmente mediante hibridaciones tipo Northern. 3. El análisis transcriptómico de las distintas estirpes se realizó mediante hibridaciones con micromatrices y secuenciación de RNA (RNA-seq). 4. El análisis fenotípico de los mutantes en genes de silenciamiento incluyó la cuantificación de la producción de esporas vegetativas y zigosporas, el estudio de la respuesta frente a diferentes situaciones de estrés, la cuantificación del proceso de autolisis y el análisis de la virulencia en Galleria mellonella. Los resultados obtenidos permitieron alcanzar las siguientes conclusiones: 1. El gen qip es esencial para el eficaz funcionamiento del mecanismo de silenciamiento génico inducido por transgenes, sugiriendo un papel en la activación del complejo RISC. No se detectaron interacciones entre proteínas de la maquinaria de silenciamiento de M. circinelloides, lo que podría deberse a la necesidad de modificaciones post-traduccionales específicas de las proteínas de silenciamiento o a la formación de complejos multiproteicos. 2. El gen ago-1 está implicado en el mecanismo de silenciamiento endógeno de M. circinelloides, siendo necesario para la biogénesis y/o estabilidad de las cuatro clases de ex-siRNAs. Las clases I y II de ex-siRNAs se unen específicamente a Ago-1 para llevar a cabo la identificación y degradación de sus mensajeros diana. Las clases III y IV son generadas por una ruta de silenciamiento no canónica, en la que se requiere la participación de Ago-1, pero no la unión específica de estos ex-siRNAs a dicha proteína. 3. Los análisis transcriptómicos ponen de manifiesto que el mecanismo de silenciamiento posee un papel modulador de la expresión de un gran número de genes endógenos a lo largo del crecimiento vegetativo. Las funciones de las proteínas cifradas por estos genes están relacionadas con la biogénesis y modificación de la pared celular, el control de la división celular y el crecimiento, metabolismo de carbohidratos, envejecimiento celular o respuesta a estrés. 4. La ruta canónica de silenciamiento está implicada en la regulación del proceso de esporulación vegetativa y en la activación del programa de autolisis inducido por estrés nutricional. La regulación del desarrollo sexual debe ser llevada a cabo por una ruta no canónica independiente de Dicer. Los experimentos de patogénesis no revelan una clara participación del mecanismo de silenciamiento en el proceso de virulencia, aunque no se descarta una respuesta diferencial en otros organismos modelo, como el ratón.
Regulation of endogenous gene expression by the RNA silencing mechanism in Mucor circinelloides. Mucor circinelloides is a filamentous fungus used as a model for studying the RNA silencing mechanism. Once the mechanism and main genes involved were characterized, the next goal is to determine the role of the RNA silencing pathway in the regulation of endogenous genes, and to identify other possible genetic elements that participate in the pathway. To do this, the following specific objectives were proposed: 1. Identification of the gene involved in the removal of the passenger strand of siRNAs duplex, and analysis of the interactions between silencing proteins. 2. Study of the participation of Ago-1 in the biogenesis of different classes of ex-siRNAs in M. circinelloides. 3. Identification the genes regulated by the RNA silencing mechanism by analyzing the transcriptome of the wild type and silencing mutants. 4. Phenotypic characterization of mutants affected in the silencing pathway to identify the cellular processes regulated by this mechanism. To develop these objectives the following methodology has been used: 1. Identification of other genes involved in the silencing pathway was addressed by disrupting candidate genes by homologous recombination and subsequent phenotypic analysis. To this end, PCR amplification of DNA fragments, cloning, transformation of protoplasts and Southern and Northern blot hybridizations were carry out. The study of interaction between RNA silencing proteins was performed using the yeast two-hybrid system. 2. cDNA libraries of sRNAs were generated and sequenced to analyze the participation of Ago-1 in the biogenesis of ex-siRNAs. Ago-1 was purified by FPLC for the isolation and sequencing of Ago-1 bound sRNAs. The sequencing data were validated by Northern-blot experiments. 3. Transcriptomic analysis of the different strains was carried out by hybridization methods using microarrays and RNA sequencing (RNA-seq). 4. Phenotypic analysis of silencing mutants included quantification of vegetative spore and zygospores, study of the response to different stresses, quantification of the autolysis process and virulence analysis of the different silencing mutants in Galleria mellonella. The results allowed reaching the following conclusions: 1. The qip gene is essential for transgene-induced gene silencing, suggesting a role in the activation of the RISC complex. No interactions were detected between proteins involved in the RNA silencing pathway of M. circinelloides. This could be due to the need for specific post-translational modifications of silencing proteins or the formation of multiprotein complexes. 2. Ago-1 is involved in endogenous RNA silencing in M. circinelloides, and it is necessary for the biogenesis and / or stability of all ex–siRNAs classes. Classes I and II of ex-siRNAs specifically bind to Ago-1 for the identification and degradation of their mRNA targets. Classes III and IV are generated by a non-canonical silencing mechanism that requires the participation of Ago-1, but there is not specific binding of these ex-siRNAs to Ago-1 protein. 3. Transcriptomic analysis showed that the silencing mechanism has a modulatory role in the expression of a large number of endogenous genes during vegetative growth. The functions of the proteins coded by these genes are linked to the biogenesis and modification of the cell wall, the control of cell division and growth, carbohydrate metabolism, cell aging or stress response. 4. The canonical RNA silencing pathway is involved in regulation of vegetative sporulation and autolysis induced by nutritional stress. Sexual development should be regulated by a non-canonical Dicer-independent RNA pathway. Pathogenesis experiments did not reveal a role of RNA silencing in the virulence process, but a differential response can’t be ruled out when using other model organisms, such as mouse.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior
O bagaÃo de cana-de-aÃÃcar à um resÃduo lignocelulÃsico obtido a partir do esmagamento e moagem da cana-de-aÃÃcar para extraÃÃo do seu caldo. Esta biomassa à abundante no Brasil pois, o paÃs à o maior produtor mundial de aÃÃcar e etanol. O emprego deste resÃduo como substrato, em processos fermentativos, para a produÃÃo de enzimas microbianas, como as celulases à uma opÃÃo viÃvel e interessante, uma vez que o custo destas enzimas ainda à alto, o que tem limitado sua utilizaÃÃo industrial. O potencial produtor de celulases de diversos micro-organismos tem sido extensivamente estudado, a fim de desenvolver novos bioprocessos menos onerosos na produÃÃo de enzimas celulolÃticas. No presente trabalho foram avaliadas a capacidade de produÃÃo de celulases, pelos micro-organismos Mucor circinelloides e Melanoporia sp., a partir da fermentaÃÃo em estado sÃlido do bagaÃo de cana-de-aÃÃcar e a influÃncia de alguns parÃmetros na produÃÃo da enzima. Foram investigados os seguintes parÃmetros fÃsico-quÃmicos, relacionados com o crescimento do micro-organismo e produÃÃo da enzima: pH inicial do meio de crescimento, tempo e temperatura de produÃÃo da enzima. Quanto aos parÃmetros nutricionais, o efeito do Tween 80 e de diferentes fontes de sais minerais e nitrogÃnio orgÃnico foram estudados. AlÃm disto, foram realizados ensaios no intuito de definir a melhor combinaÃÃo de pH e temperatura para a determinaÃÃo da atividade enzimÃtica. Para M. circinelloides, a atividade enzimÃtica mÃxima (15,87 FPU/g) foi obtida utilizando-se 3 g de bagaÃo, com adiÃÃo de 2,0 mL de uma soluÃÃo contendo 0,1 g/L de CuSO4, 9,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,0 g/L de KH2PO4 e Tween 80 a 0,8% (v/v) em pH 5,48. A temperatura e o tempo que resultaram na maior produÃÃo da enzima foram 34,4 ÂC e 48 horas, respectivamente. A maior atividade enzimÃtica foi quantificada em pH 6,5 e 60 ÂC. Em relaÃÃo ao Melanoporia sp., a atividade enzimÃtica mÃxima alcanÃada foi 14,21 FPU/g como resultado da produÃÃo utilizando 3 g de bagaÃo, com adiÃÃo de 2,0 mL de uma soluÃÃo contendo 9,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,0 g/L de KH2PO4 e Tween 80 a 0,2% (v/v) em pH 6,28. A produÃÃo mÃxima da enzima foi observada apÃs 48 horas de fermentaÃÃo a 30 ÂC. A maior atividade enzimÃtica foi quantificada em pH 7,0 e 60 ÂC. Os resultados demonstraram o elevado potencial produtor de celulases pelas duas cepas fÃngicas num curto perÃodo de tempo, apresentando maior atividade enzimÃtica em pH prÃximo da neutralidade, consistindo num diferencial atrativo do ponto de vista industrial.
Sugarcane bagasse is a lignocellulosic residue obtained from sugarcane mechanical pressing for juice extraction. This biomass is abundant in Brazil because the country is the worldâs largest manufacturer of sugar and ethanol. The use of sugarcane waste as substrate for enzymes production, such as cellulases, is an interesting and viable option since the production costs of these enzymes are high, which limits its industrial use. In this context, potential cellulase-producing strains have been extensively studied in order to develop less costly cellulolytic enzymes complexes. In this study, the production of cellulases by Mucor circinelloides. and Melanoporia sp through solid state fermentation of sugarcane bagasse and the effects of selected parameters for enzyme production were evaluated. The investigated physicochemical parameters associated with the growth of the microorganisms and enzyme production were: initial pH of the growth medium, temperature and time of enzyme production. Regarding nutritional parameters, the effect of Tween 80 and different sources of mineral salts and organic nitrogen and were studied. In addition, tests were performed in order to define the best combination of pH and temperature for the determination of enzyme activity. For M. circinelloides, the maximal enzyme activity (15.87 FPU / g) was achieved with a fermentation medium composed of 3g of sugarcane bagasse, 2mL of saline solution containing 0.1 g/L of CuSO4, 9.0 g/L of (NH4)2SO4 e 1.0 g/ L of KH2PO4 and 0.8% Tween 80 (v/v) at pH 5.48 incubated at 34.4 ÂC for 48 hours. The optimum combination of pH and temperature was at pH 6.5 and 60 ÂC. For Melanoporia sp. the higher enzymatic activity obtained was 14.21 FPU / g as a result of using 3g of sugarcane bagasse with the addition of 2mL of saline solution containing 9.0 g/L of (NH4)2SO4, 1.0 g/ L of KH2PO4 and 0.2% Tween 80 (v/v) at pH 6.28 and incubated at 30ÂC for 48 hours. The optimized conditions of pH and temperature for enzymatic activity determination were pH 7.0 and 60ÂC. The results demonstrated the high potential of the two strains under investigation, which presented the higher enzyme activity at pH in the neutral range. This result represents a technical advantage from the industrial viewpoint.

O desenvolvimento sustentável é atualmente um dos maiores focos das pesquisas no mundo em virtude dos impactos ambientais, tais como aquecimento global, geração de resíduos e emissão de gases poluentes causados pelo uso de combustíveis fósseis. Deste modo, pesquisas têm sido concentradas em tecnologias que permitam a substituição de refinarias à base de petróleo por biorrefinarias que utilizam matérias-primas renováveis. Neste contexto, os fungos filamentosos surgem como um recurso promissor no desenvolvimento de novos produtos sustentáveis, entre os quais os fungos pertencentes ao filo Zigomiceto, contribuem significativamente para esse desenvolvimento e estão sendo extensivamente estudados para a aplicação em biorrefinarias, com destaque especial para os fungos do gênero Mucor. Esse gênero, particularmente da espécie Mucor circinelloides, é um potencial produtor da enzima lipase e de biomassa com quantidades significativas de lipídios (single cell oil) o que permite sua exploração no processo de produção de biodiesel. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi explorar importantes aplicações biotecnológicas da linhagem de Mucor circinelloides URM 4182, tanto para produção de lipases quanto de lipídios. O trabalho experimental realizado consolidou dados da potencialidade do fungo para produção de lipase ligada ao micélio e sua utilização como biocatalisador para obtenção de biodiesel partir de óleos vegetais alternativos, como andiroba, coco, macaúba, palma e pinhão manso. Nas condições estudadas, foram obtidos rendimentos de transesterificação entre 88% a 97% e as conversões mais elevadas foram alcançadas para os óleos láuricos sugerindo seletividade da lipase para ácidos de cadeia curta. A potencialidade da linhagem Mucor circinelloides URM 4182 foi comprovada na obtenção de lipídios em cultivos efetuados em biorreator utilizando glicose e milhocina, respectivamente, como fontes de carbono e de nutrientes alternativos aos suplementos sintéticos. Nessas condições, valores médios de produtividade biomassa (3,10 ± 0,01 g/L/dia) contendo (31 ±0,01 % m/m) de lipídios, correspondendo produtividade lipídica de (0,97 ± 0,01 g/L.dia) foram alcançados. A composição do óleo microbiano revelou elevados teores dos ácidos graxos saturados palmítico (C16:0) e esteárico (C18:0) e dos insaturados oleico (C18:1) e linoleico (C18:2), que são os ácidos graxos semelhantes aos dos óleos vegetais convencionais utilizados para a produção de biodiesel. Além disso, foram verificados teores consideráveis do ácido gama-linolênico (GLA - C18:3), que tem relevante importância nas indústrias farmacêutica e de alimentos. A esterificação e transesterificação simultâneas do óleo microbiano ou diretamente da biomassa celular com etanol mediada por catalisadores heterogêneos bioquímicos e químicos forneceram amostras de biodiesel com elevados teores de ésteres de etila (> 97%) que atendem as normas de qualidade para uso como biocombustível.
Sustainable development is now the major research focus in the world because of the environmental impacts, such as global warming, waste generation and greenhouse gas emissions caused by the use of fossil fuels. Thus, research has been focused on technologies that enables the replacement of petroleum based refineries by biorefinery based on renewable raw materials. In this context, filamentous fungi emerge as a promising resource in the development of new sustainable products, including the fungi belonging to the phylum Zigomicete which contribute significantly to this development and are being extensively studied for using in biorefineries, with particular emphasis on the Mucor sp. fungus genus. This genus, particularly from the species of Mucor circinelloides, is a potential producer of the enzyme lipase and biomass having significant amounts of lipids (single cell oil) which allows its exploitation in the biodiesel production. Thus, the aim of this study was to explore important biotechnological applications of a Brazilian strain of Mucor circinelloides URM 4182 for both production of lipases and lipids. The experimental work consolidated this fungus capability to produce mycelium bound lipase and its use as biocatalysts for biodiesel production from alternative vegetable oils such as andiroba, coconut, macaw palm, palm and jatropha. The attained transesterification yields were in the range from 88 to 97%, and the highest conversions were achieved for lauric oils suggesting that M. circinelloides lipase has high selectivity for short chain fatty acids. The capability of this strain was also proven to produce lipids at cultivation conditions established in this work using glucose and corn steep liquor, respectively, as carbon sources and alternative nutrients to the mineral supplements. Under these conditions, average values for biomass productivity (3.10 ± 0.01 g/L/day) containing high lipis levels (31.2 ± 0.01% m/m) and lipid productivity of 0.97 ± 0.01 g/L.dia were achieved. The composition of microbial oil revealed high levels of saturated fatty acids such as palmitic acid (C16:0) and stearic (C18:0) and unsaturated oleic (C18:1) and linoleic (C18:2), which are fatty acids similar to conventional vegetable oils used for the production of biodiesel. In addition, considerable levels of gamma-linolenic acid (GLA-C18:3) were also verified which has relevant importance in the pharmaceutical and food industries. The simultaneous esterification and transesterification from microbial oil or direct fungal biomass with ethanol mediated by heterogeneous catalysts (biochemical and chemical) provided samples with high levels of ethyl esters (> 97%) that meet the quality standards for using as biofuel.

MACIEL, T. C. Produção de celulases por fermentação em estado sólido a partir de Melanoporia sp. e Mucor circinelloides utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato. 2013. 91 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro de Tecnologia, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013.
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Sugarcane bagasse is a lignocellulosic residue obtained from sugarcane mechanical pressing for juice extraction. This biomass is abundant in Brazil because the country is the world’s largest manufacturer of sugar and ethanol. The use of sugarcane waste as substrate for enzymes production, such as cellulases, is an interesting and viable option since the production costs of these enzymes are high, which limits its industrial use. In this context, potential cellulase-producing strains have been extensively studied in order to develop less costly cellulolytic enzymes complexes. In this study, the production of cellulases by Mucor circinelloides. and Melanoporia sp through solid state fermentation of sugarcane bagasse and the effects of selected parameters for enzyme production were evaluated. The investigated physicochemical parameters associated with the growth of the microorganisms and enzyme production were: initial pH of the growth medium, temperature and time of enzyme production. Regarding nutritional parameters, the effect of Tween 80 and different sources of mineral salts and organic nitrogen and were studied. In addition, tests were performed in order to define the best combination of pH and temperature for the determination of enzyme activity. For M. circinelloides, the maximal enzyme activity (15.87 FPU / g) was achieved with a fermentation medium composed of 3g of sugarcane bagasse, 2mL of saline solution containing 0.1 g/L of CuSO4, 9.0 g/L of (NH4)2SO4 e 1.0 g/ L of KH2PO4 and 0.8% Tween 80 (v/v) at pH 5.48 incubated at 34.4 °C for 48 hours. The optimum combination of pH and temperature was at pH 6.5 and 60 °C. For Melanoporia sp. the higher enzymatic activity obtained was 14.21 FPU / g as a result of using 3g of sugarcane bagasse with the addition of 2mL of saline solution containing 9.0 g/L of (NH4)2SO4, 1.0 g/ L of KH2PO4 and 0.2% Tween 80 (v/v) at pH 6.28 and incubated at 30°C for 48 hours. The optimized conditions of pH and temperature for enzymatic activity determination were pH 7.0 and 60°C. The results demonstrated the high potential of the two strains under investigation, which presented the higher enzyme activity at pH in the neutral range. This result represents a technical advantage from the industrial viewpoint.
O bagaço de cana-de-açúcar é um resíduo lignocelulósico obtido a partir do esmagamento e moagem da cana-de-açúcar para extração do seu caldo. Esta biomassa é abundante no Brasil pois, o país é o maior produtor mundial de açúcar e etanol. O emprego deste resíduo como substrato, em processos fermentativos, para a produção de enzimas microbianas, como as celulases é uma opção viável e interessante, uma vez que o custo destas enzimas ainda é alto, o que tem limitado sua utilização industrial. O potencial produtor de celulases de diversos micro-organismos tem sido extensivamente estudado, a fim de desenvolver novos bioprocessos menos onerosos na produção de enzimas celulolíticas. No presente trabalho foram avaliadas a capacidade de produção de celulases, pelos micro-organismos Mucor circinelloides e Melanoporia sp., a partir da fermentação em estado sólido do bagaço de cana-de-açúcar e a influência de alguns parâmetros na produção da enzima. Foram investigados os seguintes parâmetros físico-químicos, relacionados com o crescimento do micro-organismo e produção da enzima: pH inicial do meio de crescimento, tempo e temperatura de produção da enzima. Quanto aos parâmetros nutricionais, o efeito do Tween 80 e de diferentes fontes de sais minerais e nitrogênio orgânico foram estudados. Além disto, foram realizados ensaios no intuito de definir a melhor combinação de pH e temperatura para a determinação da atividade enzimática. Para M. circinelloides, a atividade enzimática máxima (15,87 FPU/g) foi obtida utilizando-se 3 g de bagaço, com adição de 2,0 mL de uma solução contendo 0,1 g/L de CuSO4, 9,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,0 g/L de KH2PO4 e Tween 80 a 0,8% (v/v) em pH 5,48. A temperatura e o tempo que resultaram na maior produção da enzima foram 34,4 °C e 48 horas, respectivamente. A maior atividade enzimática foi quantificada em pH 6,5 e 60 °C. Em relação ao Melanoporia sp., a atividade enzimática máxima alcançada foi 14,21 FPU/g como resultado da produção utilizando 3 g de bagaço, com adição de 2,0 mL de uma solução contendo 9,0 g/L de (NH4)2SO4, 1,0 g/L de KH2PO4 e Tween 80 a 0,2% (v/v) em pH 6,28. A produção máxima da enzima foi observada após 48 horas de fermentação a 30 °C. A maior atividade enzimática foi quantificada em pH 7,0 e 60 °C. Os resultados demonstraram o elevado potencial produtor de celulases pelas duas cepas fúngicas num curto período de tempo, apresentando maior atividade enzimática em pH próximo da neutralidade, consistindo num diferencial atrativo do ponto de vista industrial.

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:02:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8615_1.pdf: 6293444 bytes, checksum: ef55c32ba2fb6d933976fd76fc675119 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Recentemente, a quitosana vem despertando bastante interesse em relação às suas aplicações em produtos alimentícios e farmacêuticos. Entre outras, a atividade antimicrobiana deste biopolímero tem sido apontada como uma das suas mais interessantes propriedades. O objetivo deste estudo foi extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP 050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos. Quitosana proveniente de caranguejo foi utilizada para comparação. A fim de determinar as concentrações mínimas bacteriostáticas e bactericidas das quitosanas foi realizado o teste de Heilman. Foi utilizada fermentação submersa para produção de quitosana por Mucor circinelloides (UCP 050) utilizando como substrato meio de cultura alternativo a partir de Jacatupé (Pachyrhizus erosus, (L) URBAN). Avaliou-se, ainda, o crescimento de M. circinelloiodes em diferentes tempos (24, 48, 72 e 96 horas), incubado a 28ºC e 150 rpm. Quitina e quitosana foram extraídas por tratamento álcali-ácido e a quitosana caracterizada por espectroscopia ao raio de Infravermelho, viscosidade, análise térmica e difração de raio X. M. circinelloides crescido em meio de cultura jacatupé apresentou rendimento de biomassa máximo (20.7 g.L-1) em 96 horas, enquanto a maior produção de quitosana (64 mg.g-1) e quitina (500 mg.g-1) foram observadas em 48 e 72 horas de crescimento, respectivamente. A quitosana caracterizada apresentou grau de deacetilação de 83% e massa molecular de 2,6 x 104 g/mol. A difração de raio X apresentou um pico de maior intensidade próximo ao angulo de 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) e a análise termogravimétrica demonstrou um processo de desidratação, seguido da decomposição do polímero, com geração de material carbonizado. As curvas de calorimetria apresentaram um pico largo endotérmico e um segundo pico endotérmico. A quitosana microbiológica e de crustáceo demonstraram concentração mínima inibitória idênticas para todas as bactérias ensaiadas, de 1,50 mg.mL-1 para Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli e Yersinia enterocolitica e 0,625 mg.mL-1 para Pseudomonas aeruginosa. Nenhuma concentração de ambas quitosanas demonstrou ação bactericida para a cepa de S. entérica. A quitosana microbiológica apresentou menor concentração mínima bactericida frente P. aeruginosa quando comparada com a quitosana de crustáceo, sendo de 2,5mg.mL-1 e 5,0 mg.mL-1, respectivamente. Os resultados obtidos destacam a quitosana como um promissor agente de conservação de alimentos de origem natural

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Os nematodes gastrointestinais (NGI) são um grande problema nos mamíferos selvagens em cativeiro, pelo que é importante que os Parques Zoológicos disponham de técnicas de diagnóstico eficientes e medidas de controlo alternativas. O Mini-FLOTAC é a mais recente técnica de contagem de ovos por grama de fezes (OPG), que devido à sua maior sensibilidade, exatidão e precisão pode vir a substituir o McMaster no diagnóstico de parasitoses. Os fungos nematófagos constituem um grupo com grandes perspetivas de ser utilizado como método complementar de controlo biológico das helmintoses, já que permitem a redução da utilização de anti-helmínticos, o que por sua vez diminui a probabilidade do aparecimento de resistências. Deste modo, o presente estudo teve como objetivos, caracterizar os parasitas presentes nos mamíferos selvagens de um Parque Zoológico e verificar a eficácia dos fungos Mucor circinelloides e Duddingtonia flagrans na diminuição de ovos e larvas de NGI destes mesmos animais, comparando as técnicas coprológicas quantitativas de McMaster e do Mini-FLOTAC. Nos meses de dezembro 2017 e abril 2018 foram colhidas amostras fecais de 30 espécies de mamíferos selvagens e analisadas através das técnicas de McMaster e Mini-FLOTAC. No total, 47% das espécies encontravam-se parasitadas com NGI, sendo estes estrongilídeos gastrointestinais (EGI) (26,7%), encontrados nos ungulados, Trichuris sp. (13,3%), encontrado nos primatas e Parascaris sp. (3,3%), encontrado nas zebras. As colheitas de fezes realizadas no mês de abril apresentaram contagens de OPG mais elevadas. Em maio 2018 foi realizado um ensaio com as fezes de macacos-de-tarrafe, zebras e lamas durante 4 semanas, com dois grupos: caixas de plástico contendo fezes de mamíferos selvagens e esporos de Mucor circinelloides (grupo Fungos) e caixas contendo apenas fezes (grupo Controlo), colocadas numa zona exterior com vegetação. Ao fim de cada semana foram retiradas e analisadas duas caixas Fungos e duas Controlo. Nas fezes de macacos-de-tarrafe, verificou-se a existência de uma diferença significativa entre o grupo Controlo e o grupo Fungos ao longo das quatro semanas, para os resultados obtidos através da técnica de McMaster (p = 0.04586) e Mini-FLOTAC (p = 0.03689). No ensaio utilizando fezes de zebra, apenas se obteve uma diferença biologicamente significativa entre o grupo Controlo e o grupo Fungos (p = 0.07814). Os resultados obtidos no ensaio com fezes de lama foram considerados inconclusivos. Não obstante, nas três espécies de mamíferos em estudo foi possível observar microscopicamente a ação nematófaga do fungo sobre os ovos de Trichuris sp, Parascaris sp. e EGI. Às caixas do grupo Fungos utilizadas para análise na quarta semana (zebras e lamas) foram também adicionados esporos de D. flagrans. Através da utilização da técnica de Baermann foi possível identificar larvas de Cyathostomum spp. nas fezes de zebra e de Trichostrongylus axei nas fezes de lama e verificar uma taxa de redução de 100% nestas últimas. Para todas as amostras recolhidas ao longo deste trabalho foram sempre realizadas em paralelo as técnicas de McMaster e Mini-FLOTAC. Quando comparadas todas as contagens obtidas através do teste de Bland Altman verificou-se que não existe uma forte concordância entre as duas técnicas, principalmente quando as contagens de OPG são baixas. Os resultados deste trabalho demonstram o grande potencial dos fungos nematófagos no controlo de diferentes nematodes gastrointestinais e da técnica do Mini-FLOTAC na deteção de ovos, principalmente quando existem cargas parasitárias baixas.
ABSTRACT - Diagnose and Biological Control of Gastrointestinal Nematodes in Wild Mammals Kept in Captivity at “Monte Selvagem – Reserva Animal” - Gastrointestinal nematodes (GIN) are a major problem in wild mammals kept in captivity, so it is important that Zoos resort to efficient diagnostic techniques and alternative control measures. The Mini-FLOTAC is the latest egg counting technique, which may replace the McMaster in the diagnosis of parasitosis, due to its greater sensitivity, accuracy and precision. Nematophagous fungi are a group with great prospects of being used as a complementary method of biological control of helminths, thus reducing the use of anthelmintics and, consequently, decreasing the probability of resistance. In this way, the objective of this study was to characterize the parasites present in the wild mammals of a Zoological Park and to verify the efficacy of the fungi Mucor circinelloides and Duddingtonia flagrans in the reduction of eggs and larvae of GIN from these same animals, while comparing the coprological quantitative techniques of McMaster and Mini-FLOTAC. In the months of December 2017 and April 2018, fecal samples were collected from 30 wild mammal species and analyzed using McMaster and Mini-FLOTAC. In total, 47% of species were infected with NGI, being these gastrointestinal strongyles (26.7%), found in ungulates, Trichuris sp. (13.3%), found in primates, and Parascaris sp. (3.3%) found in zebras. Fecal samples collected in April showed higher egg counts. In May 2018, a study with the faeces of grivet monkeys, zebras and llamas was carried out for 4 weeks, with two groups: plastic boxes containing feces of wild mammals with spores of Mucor circinelloides (Fungi group) and boxes containing only feces (Control group), placed outside in an area with a lot of vegetation. At the end of each week, two Fungi and two Control boxes were collected and analyzed. In the faeces of the monkeys, there was a significant difference between the Control group and the Fungi group over the four weeks, for the results obtained by the McMaster technique (p = 0.04586) and Mini-FLOTAC (p = 0.03689). In the test using zebra faeces, only a biologically significant difference was obtained between the Control group and the Fungi group (p = 0.07814). The results obtained in the llama faeces test were considered inconclusive. Nevertheless, it was possible to microscopically observe the action of M. circinelloides on the eggs of Trichuris sp, Parascaris sp. and EGI, in the three species of mammals under study. To the Fungi group boxes used for analysis in the fourth week (zebras and llamas) it was also added spores of D. flagrans. Using Baermann technique it was possible to identify Cyathostomum spp. larvae in the zebra faeces and Trichostrongylus axei larvae in the llama feces and to verify a 100% reduction rate in the latter. For all samples collected, McMaster and Mini-FLOTAC techniques were always performed in parallel. When all egg counts obtained were compared using the Bland Altman test, there was no strong agreement between the two techniques, especially when EPG counts were low. The results of this research demonstrate the great potential of nematophagous fungi in the control of different gastrointestinal nematodes and of the Mini-FLOTAC technique in the detection of eggs, especially when there are low parasite loads.
N/A

O biodiesel, que possui grande potencial para substituição do diesel tradicional na matriz energética, é amplamente estudado pela rota enzimática, cujo biocatalisador pode ser usado de duas formas principais: extra e intracelular. A forma intracelular é considerada mais vantajosa por evitar processos complexos de isolamento, purificação e imobilização, diminuindo o custo efetivo das enzimas. O custo enzimático também pode ser reduzido pela imobilização em suporte adequado. Com base neste contexto, este trabalho teve como objetivo sintetizar e caracterizar espumas de poliuretano utilizando diferentes formulações e verificar a influência das variáveis temperatura, pH, tempo de cultivo e quantidade mássica de suporte no crescimento de biomassa microbiana in situ de Mucor circinelloides URM 4182 nas espumas de poliuretano sintetizadas, visando a aplicação em processo não contínuo e contínuo de produção de biodiesel etílico a partir do óleo de babaçu. Definidas as melhores condições de cultivo, o trabalho teve como foco a otimização dos parâmetros de produção em sistema contínuo e reator de leito fixo: tempo espacial e razão molar óleo:álcool. Na primeira etapa de trabalho, a biomassa imobilizada em pH 5,5 a 35 ºC em 96 h e com 100 cubos de suporte EPU3 foi a que apresentou resultados de conversão mais elevados no sistema não contínuo (98%). Esta condição foi utilizada para definir os parâmetros da produção de biodiesel em reator de leito fixo e regime de fluxo contínuo. Inicialmente utilizou-se um reator com 44 mm de diâmetro e 56 mm de altura. Com este reator o melhor resultado em termos de rendimento foi da ordem de 64 ± 1,66 % obtido com um tempo espacial de 86 h e razão molar óleo:álcool de 1:6 com 120 cubos de biomassa imobilizada. Outras geometrias de suporte foram analisadas, mas o formato cúbico foi o mais estável, mantendo o rendimento durante o período analisado, apresentando uma perda de biomassa de 2% e produtividade de 5,68 ± 0,15 mg éster g-1 meio h-1. Visando aumentar o rendimento e a produtividade do sistema contínuo, utilizou-se uma segunda configuração de reator com 30 mm de diâmetro e 420 mm de altura. Utilizando os parâmetros já definidos e a nova configuração de reator, obteve-se um rendimento médio de 86 ± 3,53 % a partir do primeiro tempo espacial. A reação foi conduzida por um período máximo de 30 dias. O resultado apresentado em termos de produtividade foi de 7,57 ± 0,31 mg éster g-1 meio h-1 e a perda da biomassa de 44,55 ± 2,40 %. Os resultados de rendimento e produtividade apresentados pelo reator de razão diâmetro:altura de 1:14 foram superiores aos do primeiro reator utilizado que possuía essa razão de 1:1,3. Todavia, grande perda de biomassa foi observada. De forma geral, os resultados encontrados foram promissores para a utilização das células íntegras de Mucor circinelloides imobilizadas em espuma de poliuretano EPU3 para produção de biodiesel em reator de leito fixo operando em fluxo contínuo. Alguns ajustes ainda são necessários, como reduzir a vazão de alimentação inicial para estabilização do leito, visando uma menor perda de biomassa para obtenção de resultados ainda mais relevantes.
Biodiesel has a great potential to replace traditional diesel in the energy matrix and has been widely studied by enzymatic route, whose biocatalyst can be used in two main forms: extra and intracellular. The intracellular is considered more advantageous to avoid complex processes of isolation, purification and immobilization, reducing the effective cost of the enzymes which can also be reduced by immobilization of such biocatalysts on suitable matrix. This study aimed the synthesis and characterization of polyurethanes foams with different recipes and to verify the influence of the variables temperature, pH, cultivation time and mass amount of support in the growth in situ of Mucor circinelloides URM 4182 microbial biomass in the synthetized polyurethane foams, for application in noncontinuous and continuous production process of ethyl biodiesel from babassu oil. After the best growing conditions were defined, the focuses of this work changed to the optimization of the parameters of continuous production system in a fixed bed reactor: space time and molar ratio oil: alcohol. In the first stage of the work, the biomass immobilization in 100 cubes of support EPU3 at pH 5.5 and 35 °C in a period of 96h showed the highest conversion results in non-continuous system (98%). This condition was used to define the parameters of biodiesel production in a continuous flow fixed bed reactor. Initially, a 45 mm diameter and 55 mm height reactor was used. The best yield result with this reactor was approximately 64 ± 1.66% with a space-time of 86 h and the molar ratio oil: alcohol of 1:6 with 120 cubes of immobilized biomass. Different geometries of support were also analyzed, but the cuboid was the most stable, maintaining stable during the period analyzed, with a loss of 2% of biomass and productivity of 5.68 ± 0.15 mg ester. g-1 medium. h-1. In order to increase the yield and productivity in the continuous system, we used a second configuration of reactor: 30 mm in diameter and 420 mm height. It was obtained an average yield of 86 ± 3.53% from the first residence time using the parameters defined and the new configuration of the reactor. The reaction was carried for a period of 30 days. The productivity of was 7.57 ± 0.31 mg ester g-1 medium. h-1 and the biomass loss 44.55 ± 2.40%. The yield and productivity results presented with the second reactor, which diameter:height ratio was 1:14 was higher than that used in the first reactor which the diameter:height ratio was 1:1.3. However, great loss of biomass was observed. Overall, the results were promising for the use of whole cells of Mucor circinelloides immobilized in polyurethane foam EPU3 for biodiesel production in fixed bed reactor operating in continuous flow. Some adjustments are still needed, as the reduction the initial flow feed to stabilize the bed, in order to decrease biomass loss.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Nas últimas décadas, surgiram novos problemas tais como o agravamento de resistências a anti-helmínticos e os consequentes efeitos adversos que o seu uso abusivo pode trazer para o ambiente e para os produtos alimentares. Recorrer a um método de controlo biológico dos parasitas com a utilização de fungos telúricos nematófagos surge como uma alternativa muito promissora. Neste trabalho, foi investigada a eficácia do fungo predador Duddingtonia flagrans na redução de larvas L3 de Oesophagostomum spp. no javali da Tapada Nacional de Mafra, dos fungos ovicidas Mucor circinelloides e Pochonia spp. no combate aos ovos de Toxocara canis do cão da zona urbana de Lisboa e do fungo M. circinelloides na prevenção das infecções por helmintes (ação sobre ovos de Fasciola hepatica e de estrongilídeos gastrintestinais) e coccídias (ação sobre oocistos de Eimeria spp. e Cystoisospora suis) dos ungulados silvestres da Tapada Nacional de Mafra. Recorreu-se a três tipos de ensaios: coprocultura em copo (quantificação de larvas L3), ensaio em caixas (interação entre o fungo ovicida, os ovos de helmintes e oocistos de coccídias e o meio ambiente) e ensaio em placas (avaliação qualitativa da ação do fungo ovicida M. circinelloides em oocistos de coccídias do javali). Em todos os ensaios, o desenvolvimento base foi igual: criou-se um grupo Fungos, onde era acrescentada uma suspensão com esporos do fungo em estudo às formas parasitárias (ovos, larvas ou oocistos) nas amostras fecais e um grupo Controlo, onde apenas tínhamos parasitas em desenvolvimento nas fezes (também ovos, larvas ou oocistos). As técnicas laboratoriais qualitativas utilizadas foram a Flutuação de Willis e a Sedimentação Simples e as quantitativas consistiram no McMaster e McMaster Modificada. No ensaio com as L3 de Oesophagostomum spp. e o fungo D. flagrans, registou-se uma Taxa de Redução que variou entre 53% e 83%, comprovando-se a eficácia deste fungo sobre este nemátode do javali. Com o ensaio em caixas com os ovos de helmintes dos ungulados silvestres e o fungo M. circinelloides não se obtiveram resultados estatisticamente significativos, porém foi possível avaliar qualitativamente a eficácia do fungo. No ensaio em caixas com os ovos de T. canis, foi observada uma Taxa de Redução de 37% com o fungo M. circinelloides e de 61% com o fungo Pochonia spp. Concluiu-se que ambos os fungos ovicidas foram eficazes, porém Pochonia spp. mostrou uma atividade ovicida mais agressiva. Foram realizados ensaios em caixa com coccídias do javali e o fungo M. circinelloides, com a duração de seis semanas, em dois momentos distintos do ano: inverno e primavera-verão. No ensaio de primavera-verão, verificou-se que, até à 3ª semana, observaram-se Taxas de Redução num intervalo de 52-66% sendo que, à 4ª semana sofreu uma diminuição abrupta (20%) e depois tornou-se negativa. Em simultâneo, também foi observada um aumento da inviabilidade dos oocistos no grupo Controlo. Concluiu-se que as condições ambientais desfavoráveis de temperatura elevada e humidade relativa baixa justificam a morte progressiva dos oocistos no grupo Controlo e a diminuição do desenvolvimento e atividade ovicida do fungo no grupo Fungos sendo que, a partir da quarta semana, apenas se observou a degradação natural dos oocistos no solo. Não obstante, foi observado que o momento crítico de infeção de novos hospedeiros corresponde às primeiras três semanas e, durante esse período, obtiveram-se valores de redução muito significativos. No ensaio de inverno as Taxas de Redução não foram tão elevadas (28-35%) e a percentagem de inviabilidade máxima anotada foi de 64%. Verifica-se que, a temperaturas mais baixas e humidade relativa mais alta constituem melhores condições de sobrevivência dos oocistos e piores para o crescimento do fungo. O ensaio em placas veio apoiar os resultados verificados no ensaio em caixas. Os resultados globais deste trabalho mostram o grande potencial dos fungos nematófagos no controle de T. canis nos cães e F. hepatica, helmintes e protozoários gastrointestinais de ungulados silvestres em Portugal, sendo a primeira vez na literatura que este tipo de controlo biológico foi avaliado em coccídias.
ABSTRACT - In the last decades, new problems have arisen such as the worsening of resistance to anthelmintics and the consequent adverse effects that its abuse can bring to the environment and food products. Resorting to a method of biological control of parasites with the use of telluric nematophagous fungi emerges as a very promising alternative. This work focused on three main research topics: (i) the efficacy of the predator fungus Duddingtonia flagrans on the reduction of Oesophagostomum spp. L3 larvae of the wild boar from the Tapada Nacional de Mafra; (ii) the ovicidal effect of the fungus Mucor circinelloides and Pochonia spp. on Toxocara canis eggs from the dog‟s urban area of Lisbon; (iii) the use of the fungus M. circinelloides on the prevention of helminthic infection (action on Fasciola hepatica and gastrointestinal strongyle eggs) and coccidia (action on Eimeria sp. and Cystoisospora suis oocysts) of the wild ungulates from the Tapada Nacional de Mafra. Three types of experiments were developed: fecal cultures (quantification of L3 larvae), box tests (interaction between the ovicidal fungus, eggs of helminths and coccidia oocysts and the environment) and a Petri dish test (qualitative evaluation of ovicidal fungus M. circinelloides action on wild boar coccidian oocysts). In all tests, the same basic development was implemented, involving two groups of samples: a Fungi group where a suspension of fungus spores was added to the parasitic stages (eggs, larvae or oocysts) in fecal samples and a Control group, where there were only parasitic stages in the feces (also eggs, larvae or oocysts). The qualitative laboratory techniques used were Willis Flotation and Simple Sedimentation and the quantitative techniques consisted of McMaster and Modified McMaster. In the experiment with L3 larvae of Oesophagostomum spp. and D. flagrans fungus, there was a reduction rate ranging between 53% and 83%, which demonstrated the efficacy of this fungus on this nematode from wild boar. With the box test with helminths eggs of the wild ungulates and the fungus M. circinelloides it was not possible to observe statistically significant results, but it was possible to qualitatively verify the efficacy of the fungus. In the box test evolving T. canis eggs, a 37% reduction rate was observed with the fungus M. circinelloides and 61% with the fungus Pochonia spp. We concluded that both ovicides fungi were effective, but Pochonia spp. showed a more aggressive ovicidal activity. Box tests with six weeks duration were performed on the wild boar coccidia and the fungus M. circinelloides, in two different periods of the year: winter and spring-summer. In the spring-summer test, it was found that, until the 3rd week, the reduction rates observed were between 52% and 66%. At the 4th week these values suffered an abrupt decrease (20%) and, after that, negative reductions were verified. At the same time, an increase of the oocysts unviability in the Control group was also observed. It was concluded that the adverse environmental conditions of high temperature and low relative humidity justify the progressive death of oocysts on the Control group, and the decline of the development and ovicidal activity of the fungus in the Fungi group. Since the fourth week, only the natural degradation of oocysts in the soil is observed. However, it was noticed that the critical moment of the hosts‟ infection corresponds to the first three weeks and, during this period, we obtained very significant reduction values. In the winter test the reduction rates were not as high (28-35%) and the maximum percentage of egg‟s unviability was 64%. It is concluded that lower temperatures and higher relative humidity conditions provide better survival of oocysts and worst conditions for fungus growth. The Petri dishes test came to support the results obtained in the boxes tests. The overall results of this research show the great potential of nematophagous fungi in the control of T. canis in dogs and F. hepatica, gastrointestinal helminths and protozoa of wild ungulates in Portugal, being the first time in literature that this type of biological control was assessed on coccidian.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária
Anthelmintic resistance in horses has increased in recent years and the continuous search for alternative control methods has led to the development of complementary approaches such as biological control. This approach can make use of parasiticide fungi, such as Duddingtonia flagrans and Mucor circinelloides, in parasite population control and recent research has been focused on the development of new administration methods. Following this line of research, a new and alternative formula has been developed by using a lyophilized product that contained both D. flagrans and M. circinelloides spores for the control of gastrointestinal nematodes in horses. After the product manufacture and the normal spore morphology were assessed, these were tested for in vitro growth. A total of 20 Petri dishes were assembled with a mix of 0.1 g of product and 0.5 ml of water in solid media. The assembled plaques were kept at 25ºC in total darkness and all showed the development of new fungi spores after 10 days. Following the in vitro assessment, the product was administered per os to horses in order to observe their effect in the faecal egg count (FEC) of eggs per gram (EPG). Thus, one group of 5 horses in a pasture was chosen to receive 10 g of product (with M. circinelloides spores and a total of around 105 D. flagrans chlamydospores per horse), 3 days a week starting in September, and another group of 7 horses in an adjacent pasture remained as control. Following treatment with Ivermectin pour-on in September 2017, a faecal sample was collected from each horse on a monthly basis and FEC was assessed using a Modified McMaster technique. Only gastrointestinal nematode eggs, namely strongyle eggs, were observed with this technique. The EPG average from each group was compared for each individual month and overall to see the reduction effect achieved with the fungi treatment. Statistically significant differences were found between the two groups in February (72% reduction), March (64% reduction), and overall, 66% reduction. The horses in the test group only reached a cut-off value of 300 EPG two months after the horses in the control group. In November and January, faecal culture method was applied to all faecal samples, showing only the presence of cyathostomin larvae. This study allowed the successful development of a new formula for the administration of parasiticide fungi to horses, based on lyophilized product, which increases the possibilities for future product development and application. New and improved ways of biological control should be developed and implemented to increase parasite control and reduce anthelmintic resistance cases.
RESUMO - NOVA FÓRMULA DE ADMINISTRAÇÃO DE FUNGOS PARASITICIDAS PARA PREVENIR INFEÇÃO POR NEMÁTODES GASTROINTESTINAIS EM CAVALOS DE PASTOREIO (LUGO, ESPANHA) - A resistência a anti-helmínticos em cavalos tem vindo a aumentar recentemente e a procura por métodos de controlo alternativos levou ao desenvolvimento de abordagens complementares como o controlo biológico. Esta abordagem usa fungos parasiticidas, como Duddingtonia flagrans e Mucor circinelloides, no controlo da população parasitária e estudos recentes têm-se focado no desenvolvimento de novos métodos de administração. Seguindo esta tendência, uma fórmula nova e alternativa foi desenvolvida utilizando um produto liofilizado que contém esporos de D. flagrans e M. circinelloides para o controlo de nematodes gastrointestinais em cavalos. Após fabrico do produto e verificação da morfologia normal dos esporos, estes foram testados para crescimento in vitro. Um total de 20 placas de Petri foram semeadas com uma mistura de 0.1 g de produto e 0.5 ml de água em meio sólido. As placas foram mantidas a 25ºC em escuridão total e todas demonstraram desenvolvimento de novos esporos passados 10 dias. Após a verificação in vitro, o produto foi administrado per os a cavalos para observar o seu efeito nas contagens fecais de ovos (CFO) por grama (OPG). Assim, um grupo de 5 cavalos em pastoreio foi escolhido para receber 10 g de produto cada (com esporos de M. circinelloides e um total de cerca 105 clamidosporos de D. flagrans por cavalo) 3 vezes por semana, de setembro a março. Outro grupo de 7 cavalos numa pastagem adjacente foi utilizado como controlo. Após tratamento com unção contínua de Ivermectina em setembro de 2017, uma amostra fecal de cada cavalo foi colhida mensalmente e o CFO foi avaliado utilizando a técnica de McMaster modificado. Apenas ovos de nemátodes gastrointestinais, nomeadamente estrongilídeos, foram observados com esta técnica. A média de OPG de cada grupo foi comparada para cada mês e no total do estudo para observar o efeito de redução do tratamento fúngico. Diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos foram observadas em fevereiro, redução de 72%, março, redução de 64%, e no total, 66% de redução. Cavalos no grupo de teste só passaram o limiar de 300 OPG dois meses depois dos cavalos do grupo controlo. Em novembro e janeiro foram realizadas culturas fecais em todas as amostras, demonstrando apenas a existência de larvas de ciatostomíneos. Este estudo permitiu com sucesso o desenvolvimento de uma nova fórmula para administração oral de fungos parasiticidas para cavalos com base num produto liofilizado, aumentando as futuras possibilidades de desenvolvimento e aplicações de produtos. Novas e aperfeiçoadas formas de controlo biológico devem ser desenvolvidas e implementadas para aumentar o controlo de parasitas e diminuir os casos de resistência a anti-helmínticos.
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Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019
O presente trabalho procurou caracterizar o microbiota parasitário gastrointestinal de Frangos do Campo, na fase de engorda e ao longo das quatro estações do ano, bem como visou testar a utilização de fungos nematófagos para o controlo biológico dos principais parasitas gastrointestinais avícolas. Foram realizadas oito amostragens fecais ao longo de todas as estações, numa exploração agropecuária situada no distrito de Lisboa. As amostras foram analisadas por métodos coprológicos quantitativos (McMaster e Mini-FLOTAC) e qualitativos (Flutuação-Willis, Sedimentação Natural, Coproculturas de Oocistos e Larvas de Nemátodes). Os ensaios de Controlo Biológico foram realizados em meio agar-água (2 %), confrontando larvas de Nemátodes de Vida Livre (NVL) e oocistos de Eimeria spp. com suspensões de Mucor circinelloides e Duddingtonia flagrans, bem como em caixas de plástico no solo, onde se testou a atividade coccidicida de M. circinelloides sobre as coccídias, nas quatro estações do ano. No Verão foram identificados sobretudo parasitas do género Eimeria, registando-se um aumento significativo na carga parasitária fecal, entre as duas amostragens. Na coprocultura de oocistos da 2ª amostra identificaram-se praticamente todas as espécies de coccídias, fruto do seu estado avançado de desenvolvimento no solo. O Outono foi a estação com mais casos positivos de coccídias, sendo que na 1ª colheita os animais apresentavam quadros de coccidiose clínica. Aliado ao clima, a redução da área do parque aumentou a densidade animal e, por conseguinte, facilitou a disseminação de oocistos no bando. Após desparasitação com Amprólio, ocorreu uma redução significativa na carga parasitária fecal de coccídias. No Inverno, o efetivo encontrava-se subdividido em dois grupos etários, sendo que nos frangos com 64 dias, identificaram-se somente E. brunetti e E. tenella, com prevalências reduzidas, resultados estes que já eram esperados, dado que os animais estavam no 4º dia de desparasitação. Já o efetivo com 114 dias apresentava uma prevalência bastante elevada de Eimeria spp., tendo sido identificadas todas as espécies de coccídias. Na 2ª amostra, o grupo mais jovem exibiu uma prevalência global de coccídias igual a 92%. Fatores como um período pré-patente curto, densidade animal elevada e uma eventual resistência ao desparasitante, poderão ter influenciado estes resultados. Na Primavera foram identificadas praticamente todas as espécies de Eimeria sp. na 1ª amostra, embora na coprocultura de oocistos tenha somente esporulado E. mitis, permitindo inferir sobre o impacto do desparasitante aplicado sobre a atividade esporulatória das coccídias. Ao nível dos ensaios de Controlo Biológico, tanto laboratorialmente, como em caixas de plástico no solo, foi identificada com sucesso atividade coccidicida de M. circinelloides face às coccídias, tendo sido detetados oocistos com alterações morfológicas e paredes destruídas. Também se visualizou atividade larvicida de D. flagrans sobre larvas de NVL. Com a aplicação da técnica de Mini-FLOTAC em 40 amostras fecais obteve-se uma maior carga parasitária fecal (2669,3 OoPG), comparativamente com os resultados do método de McMaster (1220 OoPG). Embora a sua diferença não tenha sido estatisticamente significativa, estes resultados sugerem a aplicação do Mini-FLOTAC para quantificação de oocistos de Eimeria spp. em amostras fecais de aves. Os resultados obtidos com este estudo permitem concluir que efetivamente o clima é uma variável determinante na evolução do microbiota parasitário gastrointestinal em aves produzidas ao ar livre, bem como sugerem a aplicação de fungos nematófagos no Controlo Biológico dos principais parasitas gastrointestinais das aves, sendo necessários estudos futuros in vivo, através da realização de ensaios de alimentação animal.
The current study aimed to characterize the gastrointestinal parasitic microbiota of Free-Range Chickens, at the fattening stage and through the four seasons of the year, as well as, to test the use of nematophagous fungi to perform the biological control of the main avian gastroinestinal parasites. Eight faecal samplings were performed through all seasons, in an agricultural-livestock farm located in Lisbon district. Samples were analysed by quantitative (McMaster and Mini-FLOTAC) and qualitative (Willis-Flotation, Natural Sedimentation, Coprocultures of Oocysts and Nematode Larvae) coprological methods. The Biological Control trials were developed in water-agar (2 %) medium, by facing free-living nematodes larvae and oocysts of Eimeria spp. with suspensions of Mucor circinelloides and Duddingtonia flagrans, as well as, in plastic boxes on soil, in which was tested the coccidicidal activity of M. circinelloides against coccidia, during the four seasons of the year. On summer were identified mainly parasites from the genus Eimeria, having been pointed out a significant increase on the faecal parasitic load, between the two samplings. On the oocysts coproculture from the 2nd sample, practically every species of coccidia were identified, due to their advanced development on soil. Autumn was the season with the most positive cases of coccidia and the animals of the 1st harvest showed cases of clinical coccidiosis. Together with climate, the reduction of the outdoor area increased animal density, turning easier the dissemination of oocysts through the flock. After the administration of Amprolium, a significant decrease occurred on the faecal parasitc load of coccidia. On winter, the flock was split into two age groups and on chickens with 64 days, E. brunetti and E. tenella were the only identified species, with low prevalences, results already expected, since the animals were on the 4th day after treatment. However, the flock with 114 days showed a higher prevalence of Eimeria spp., being identified all the species of coccidia. On the 2nd sample, the younger group showed a global prevalence of coccidia equal to 92%. Factors such as a short pre-patent period, high animal density and a possible resistance to the antiparasitic compound may have influenced these results. On spring, practically all species of Eimeria were identified on the 1st sample, although only E. mitis sporulated on the coproculture of oocysts, allowing to conclude on the impact of the applied product over the sporulating activity of coccidia. At the level of the Biological Control trials, both on laboratory and on plastic boxes on soil, coccidicidal activity of M. circinelloides against coccidia was identified with success, having been detected oocysts with morphological changes and walls destroyed. Larvicidal activity from D. flagrans was also checked against free-living nematodes larvae. With the use of the Mini-FLOTAC technique on 40 faecal elements, a higher faecal parasitc load of oocysts per gram was obtained (2669.3 OoPG), compared to the results of the McMaster method (1220 OoPG). Although their diference was not statistically significant, these results suggest the potential interest on the increasead use of Mini-FLOTAC for quantifying Eimeria spp. oocysts in avian faecal samples. The results obtained with this study allowed concluding that climate is indeed a determinant factor on the evolution of the parasitic gastrointestinal microbiota in free-range aviculture, as well as suggesting the use of nematophagous fungi on the Biological Controlo of the main avian gastrointestinal parasites, being necessary future in vivo studies by performing animal feeding trials.