Dissertations / Theses on the topic 'Mucoviscidose – Inflammation'

Chez les patients atteints de mucoviscidose (CF), l'inflammation et l'infection bronchique sont les premières causes de mortalité. L'inflammation bronchique est liée à un déséquilibre dans la production de cytokines pro-inflammatoires (TNF-a, IL-1b, IL-8, RANTES. . . ) et anti-inflammatoires (IL-10) des cellules épithéliales respiratoires humaines. Notre étude vise à montrer qu'il existe une dérégulation de la réponse inflammatoire à l'état basal, excessive en présence d'un stimulus infectieux dans les cellules épithéliales respiratoires CF, et qu'il est possible de moduler cette réponse inflammatoire grâce à des agents pharmacologiques. Notre étude a été réalisée in vitro sur des cellules glandulaires bronchiques CF et non-CF, et in vivo sur des xénogreffes bronchiques CF et non-CF. Les études in vitro ont mis en évidence, de façon constitutive, une absence du facteur inhibiteur IkB-a limitant l'activation du facteur NF-kB, associée à une sécrétion élevée d'IL-8 dans les cellules glandulaires bronchiques CF. Nous avons observé une augmentation de la sécrétion d'IL-8 après stimulation par du lipopolysaccharide (LPS) de P. Aeruginosa, et en réponse à l'augmentation de la concentration extracellulaire en NaCl (85, 130 et 170 mM) dans les cellules glandulaires bronchiques CF. Une étude approfondie des mécanismes moléculaires impliqués dans la sécrétion constitutive d'IL-8 par les cellules glandulaires bronchiques CF a montré que: 1) la sécrétion constitutive d'IL-8 est induite par l'activation du facteur NF-kB, 2) la génistéine et le propionate de fluticasone inhibent l'activation de NF-kB via une augmentation du facteur inhibiteur IkB-a et réduit la sécrétion d'IL-8. La seconde approche expérimentale choisie a consisté en la mise au point de modèles in vivo. . .

La mucoviscidose est une maladie génétique caractérisée par une inflammation pulmonairepersistante du poumon résultant d’un recrutement massif de polynucléaires neutrophiles quisécrètent trois protéases à sérine, l’élastase leucocytaire, la protéase 3 et la cathepsine G. Ledéséquilibre de la balance protéases/antiprotéases au site inflammatoire contribue à la protéolyse dutissu pulmonaire et provoque à terme l’insuffisance respiratoire des patients. Les stratégiesthérapeutiques utilisant des inhibiteurs endogènes n’ont pas abouti aux résultats espérés et n’ontciblé que l’élastase soluble. Nous avons étudié l’activité et la régulation des protéases duneutrophile dans les expectorations des patients atteints de mucoviscidose Nous avons démontrél’importance des pièges neutrophiliques extracellulaires (NETs) dans leur séquestration, ce quiexplique leur résistance à l’inhibition et en conséquence leur pouvoir de destruction du tissupulmonaire. Nous avons également démontré qu’un traitement par la DNase facilite l’action desinhibiteurs ce qui ouvre de nouvelles stratégies de thérapie anti-inflammatoire
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Les macrophages sont en première ligne de la défense innée et jouent un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire puisque régulant l’inflammation et permettant la clairance des pathogènes. Dans la mucoviscidose, ces phénomènes sont exacerbés et deviennent chronique sans pouvoir être résolus. Les objectifs de cette thèse ont été de déterminer des cibles potentielles responsables des altérations du macrophage dans la mucoviscidose. Dans le contexte inflammatoire, la forme soluble du CD14 (sCD14), dont la sécrétion est augmentée par les macrophages de patients atteints de la mucoviscidose, est caractérisé comme un DAMP puisqu’il contribue à l’entretien de l’inflammation au niveau tissulaire. Dans le contexte infectieux, l’activité de TRPV2, impliqué dans la phagocytose, est altérée. Dans la mucoviscidose, l’inflammation et l’infection sont aussi intimement liées par l’intermédiaire d’une altération des microstructures de la membrane plasmique impliquée dans la production du sCD14 et dans le processus de phagocytose. En conclusion, les modifications des fonctions du macrophage affaiblissent la défense innée des patients atteints de mucoviscidose et peuvent être impliqués dans la progression de la maladie. Par conséquent, les interventions visant à réduire l’inflammation et l’infection pourraient être bénéfiques afin de préserver la fonction pulmonaire des patients. Ainsi, les approches thérapeutiques visant à corriger les dysfonctions du macrophage de patients atteints de mucoviscidose pourrait fournir une meilleure résolution de l'infection et l'inflammation
Macrophages play a significant role in the initiating stages of immune responses regulating inflammation and clearance of the pathogens. In cystic fibrosis, inability of the macrophage to act as a suppressor cell leading to chronic inflammation/infection cannot be resolved. The aims of this work was to find new targets responsible for alterations in cystic fibrosis macrophages. Regarding inflammation, the soluble form of CD14 (sCD14), find overproduced by cystic fibrosis macrophages, is characterized to be a DAMP as it contributes for maintenance of inflammation in tissues. Regarding infection, the activity of TRPV2, involved in phagocytic capacity of macrophage, is impaired. In cystic fibrosis, inflammation and infection were closely linked to the alteration of the plasma membrane microstructures involved in the production of sCD14 and in the phagocytosis process. In conclusion, the alterations of macrophage weaken innate defense of cystic fibrosis patients and may be involved in cystic fibrosis disease progression and lung damage. Consequently, interventions aimed to reduce ongoing infection and destructive inflammatory response may be beneficial in order to preserve their lung function. In this way, therapeutic approaches aimed to correct cystic fibrosis macrophages dysfunctions might provide improved resolution of infection and inflammation

La mucoviscidose (CF pour Cystic Fibrosis) est la conséquence de mutations du gène codant pour le canal chlorure CFTR. L’absence de ce canal conduit à une hyper-inflammation, dont les mécanismes de régulation sont altérés, notamment la voie de signalisation NF-κB qui est hyper-activée. L’origine de cette dérégulation demeurant incertaine, l'objectif de ce travail était d’étudier le rôle des miR dans la physiopathologie pulmonaire chez les patients CF. Une analyse du miRNome sur des cellules épithéliales bronchiques cultivées en interface air-liquide issues de patients CF et non-CF a permis d’identifier le miR-199a-3p, sous-exprimé dans les cellules CF, qui régule directement IKKβ et donc la voie NF-κB et la sécrétion en IL-8. L’origine de la dérégulation de miR-199a-3p est due à des variations calciques intracellulaires qui modulent son expression via l’un des gènes le synthétisant. L’expression de miR-199a-3p peut être diminuée suite à une infection par P. aeruginosa, le pathogène le plus fréquemment retrouvé dans les voies aériennes des patients CF. Le miR-199a-3p peut interagir avec d’autres miR dérégulés chez les patients CF, les miR-636 et miR-9. Le miR-636 montré comme sur-exprimé dans des cellules CF par le miRNome, régule directement IL1R1 et IKKβ négativement et RANK positivement mais pas FAM13A. La surexpression de miR-636 permet de diminuer la voie NF-κB et la sécrétion en IL-8 et IL-6. Nous avons montré que le miR-199a-3p était un potentiel biomarqueur sanguin et les miR-636 et miR-9 de potentiels biomarqueurs neutrophiles chez les patients CF par rapport aux non-CF. L’ensemble de ces résultats illustrent le rôle pivot des miR dans l'inflammation pulmonaire
In patients with cystic fibrosis (CF), at the pulmonary level, the ionic imbalance caused by CFTR chloride channel dysfunction promoting hyper-inflammation, whose regulatory mechanisms are altered. In this context, the NF-κB pathway is hyper-activated, but the origin of its deregulation remains uncertain. The aim of this work was to study the role of miRNA in pulmonary pathophysiology in CF patients. A small RNAseq analyse on bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface from CF patients and non-CF healthy subjects, allowed to identify miR-199a-3p, which is underexpressed in CF cells and regulates IKKβ directly and consequently the NF κB pathway activation and IL-8 secretion. In CF cells, miR-199a-3p origin is not due to pro-inflammatory context, nor CFTR intrinsic dysfunction but due to intracellular calcium concentration variation whose modulate the miR-199a-3p expression through one of the genes that synthesize it. Moreover, miR-199a-3p expression could be decreased following an infection by Pseudomonas aeruginosa, the most frequently found pathogen in CF airways. MiR-199a-3p can interact with others dysregulated miRNA in CF, the miR-636 and miR-9. MiR-636, an another miR identified by the small RNAseq, is overexpressed in CF cells and regulates negatively IL1R1 and IKKβ and positively RANK. Overexpression of miR-636 allows decreasing NF-κB pathway activation and IL-8, IL-6 secretions. MiR-199a-3p was a potential biomarker of plasma and miR-636 and miR-9 potential neutrophil biomarkers in CF patients vs non-CF. All these results illustrate the pivotal role of miRNA in lung inflammation in cystic fibrosis patients

Dix ans après la découverte du gène CFTR responsable de la mucoviscidose, l'infection pulmonaire persistante des malades par Pseudomonas aeruginosa reste mal comprise. Cette bactérie se fixe majoritairement sur les chaînes glycanniques des mucines bronchiques, dont la glycosylation et la sulfatation sont modifiées dans la mucoviscidose. Nous avons tout d'abord caractérisé une GlcNAc-6-O-sulfotransférase de muqueuse bronchique humaine, qui pourrait être responsable de l'hypersulfatation des mucines bronchiques des patients atteints de mucoviscidose (CF). Puis nous avons défini la séquence de biosynthèse, par les transférases de muqueuse bronchique humaine, des dérivés sulfatés et/ou sialylés de l'épitope Lewis x qui sont présents en périphérie des mucines bronchiques de patients CF. Certains de ces épitopes, en particulier le 6-sulfo sialyl Lewis x qui est le meilleur ligand de la L-sélectine, pourraient interagir avec les leucocytes et moduler la réponse inflammatoire
Nous avons ensuite caractérisé, en périphérie des mucines bronchiques de patients CF ou atteints de bronchite chronique, une hypersialylation et une surexpression de l'épitope sialyl Lewis x liées à l'inflammation (et à l'infection), alors que l'hypersulfatation des mucines bronchiques serait une anomalie primaire, liée aux mutations du gène CFTR. L'influence de l'inflammation sur les phénomènes de glycosylation et de sulfatation a été confirmée en caractérisant une certaine augmentation des activités (Alpha)1-3-fucosyltransférasiques, (Alpha)2-3-sialyltransférasiques et GlcNac-6-O-sulfotransférasique induite par le facteur de nécrose tumorale dans la lignée MM-39 d'origine glandulaire bronchique humaine, et dans des explants bronchiques. Enfin, nous avons démontré que P. Aeruginosa reconnaissait préférentiellement l'épitope sialyl Lewis x présent en périphérie des mucines bronchiques humaines et surexprimé chez les patients très infectés, ce qui pourrait expliquer la persistance de cette bactérie dans la mucoviscidose

La mucoviscidose est une maladie génétique dont l’atteinte respiratoire est responsable de 90 % de la morbidité et de la mortalité et est caractérisée par une infection chronique et une inflammation persistante. Cette inflammation non contrôlée participe de manière importante à la dégradation du tissu pulmonaire. Malgré les progrès récents, les thérapies actuelles ne permettent pas un traitement efficace de l’atteinte respiratoire. Il est donc indispensable d’identifier de nouveaux mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans l’inflammation pulmonaire. Dans ce but, nous nous sommes intéressés au canal calcique "Transient Receptor Potential Vanilloid 4" (TRPV4) exprimé au niveau de l’épithélium respiratoire. A l’aide d’approches in vitro et in vivo, nous avons démontré que l’activation du TRPV4 déclenche la sécrétion de médiateurs inflammatoires cytokiniques et lipidiques et un recrutement leucocytaire dans les poumons. Nous avons également observé une altération de la signalisation dépendante du TRPV4 dans le contexte de la mucoviscidose, suggérant que le TRPV4 pourrait constituer une cible prometteuse pour le développement de nouvelles thérapies anti-inflammatoires applicables en santé respiratoire
Cystic fibrosis (CF) is due to mutations in the gene encoding the Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR). The pulmonary consequence of the disease accunts for over 90 % of the morbidity and mortality and is characterized by chronic infection and persistent inflammation. This uncontrolled inflammation participates significantly to the degradation of the lung tissue. Despite recent progress, current therapies do not allow effecgive treatment of CF lung disease. It is therefore necessary to characterize nex cellular and molecular mechanisms that could contribute to lung inflammation. In that purpose, we focused on the calcium channel "Transient Receptor Potential Vanilloid 4" (TRPV4) expressed by respiratory epithelium. Using in vitro and in vivo approaches, we found that TRP4 activation triggers the secretion of inflammatory mediators (including cytokines and lipids) and leukocytes recruitment into the lungs. We also observed a significant alteration of TRPV4-dependent signalling in the CF context, suggesting that TRPV4 could constitue a promising target for the development of new anti-inflammatory therapies in lung diseases such as CF

La mucoviscidose est la maladie génétique récessive la plus fréquente dans les populations caucasiennes. Elle est dûe à des mutations dans le gène CFTR qui code pour une protéine qui a une fonction canal chlorure et qui est exprimée au pôle apical des épithéliums sécrétoires. La mutation la plus fréquente F508del altère le repliement de la protéine, induisant sa dégradation précoce par le protéasome et son absence à la membrane plasmique. La recherche fondamentale se focalise sur la protéine mutée et cherche à découvrir des molécules capables d’adresser celle-ci au pôle apical des cellules épithéliales où elle pourra remplir sa fonction de canal chlorure. Au sein du laboratoire, nous nous intéressons aux interactions de la protéine CFTR/ F508del-CFTR avec d’autres protéines. Nous avons déjà montré l’existence d’une interaction non voulue entre F508del-CFTR et un filament intermédiaire, la cytokératine 8. En combinant une approche in-silico et du criblage haut débit, nous avons identifié des molécules capables d’interrompre ces interactions. Des tests fonctionnels sur des lignées cellulaires ainsi que sur des modèles murins ont montré une restauration de la fonction canal chlorure après traitements avec ces molécules. Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à l’une d’entre elles qui est la molécule « c407 ». L’objectif de ma thèse était de comprendre les mécanismes d’action de cette molécule. J’ai également évalué l’efficacité des traitements actuels dans le contexte des allèles complexes de F508del-CFTR. Dans une seconde partie de ma thèse, j’ai étudié l’effet d’une cytokine (TNFα) sur la protéine mutée F508del-CFTR. De façon inattendue, j’ai observé que le TNFα, à des concentrations physiologiques, corrige le défaut de routage de la protéine F508del-CFTR. Cette observation pourrait expliquer une fonction résiduelle de la F508del-CFTR chez certains patients atteints de mucoviscidose. En conclusion, mes travaux ont permis de préciser les mécanismes d’action d’un correcteur et de découvrir un effet inattendu d’une cytokine pro-inflammatoire. Ces travaux permettent de relier la correction d’un défaut de routage au processus inflammatoire ouvrant ainsi un nouveau champ d’investigation
Cystic fibrosis is due to the loss of epithelial chloride transport caused by mutations in the CFTR gene, the most frequent mutation being F508del. One of the strategies developed to find new treatment for Cystic fibrosis (CF) is to discover compounds that correct the trafficking of F508del-CFTR to the plasma membrane. Using hypothesis-driven approach and combining modeling of NBD1, molecular docking and functional assays, we identified 4 compounds that correct F508del-CFTR function in cells (including human primary bronchial cells in culture) and F508del mice. New correctors probably act by interrupting the interaction between F508del-CFTR with keratin 8 (Odolczyk et al EMBO Mol Med 2013). During my PhD, I focused on one of those molecules, the "c407" molecule. The aim of my thesis was to investigate the mechanisms of action of this molecule. I have also evaluated the effectiveness of current treatments in the context of complex alleles F508del-CFTR. In the second part of my thesis, I studied the effect of a cytokine (TNFα) on the protein F508del-CFTR. Unexpectedly, I observed that the TNFα at physiological concentrations, corrects the trafficking of F508del-CFTR protein. This observation could explain a residual function of F508del-CFTR in some CF patients. In conclusion, my thesis helped to clarify the mechanisms of action of new correctors of F508del-CFTR

La mucoviscidose (Cystic Fibrosis, CF) est caractérisée par une symptomatologie variée, dominée par la gravité de l'atteinte pulmonaire et une réponse inflammatoire inadaptée. Elle est due à des mutations du gène CFTR codant un canal chlorure AMPc-dépendant à la surface des cellules épithéliales. L'inflammation des voies aériennes de type neutrophilique est caractérisée au niveau cellulaire par une surproduction de cytokines pro-inflammatoires telles que l'interleukine-8 (IL-8) et une activation anormale des facteurs de transcription impliqués dans les voies de signalisation de l'inflammation comme NF-κB, AP-1 et PPARγ.Notre projet est d'identifier des agents à effet anti-inflammatoire dans le contexte de la mucoviscidose et d'en décrypter les mécanismes d'action. Nous avons pour cela étudié l'effet de molécules anti-inflammatoires avec une autorisation de mise sur le marché mais jamais testées pour la mucoviscidose et l'effet de COMMD1 une protéine pléïotropique impliquée dans l'inhibition de l'inflammation et identifiée au laboratoire pour interagir avec CFTR.Dans un premier temps nous avons montré l'activité anti-inflammatoire de COMMD1 dans le contexte de la mucoviscidose via son action anti-NF-κB. Dans un second temps nous avons montré que le sulindac et l'amlexanox permettent de moduler des facteurs dérégulés dans des cellules CF. Ces molécules inhibent l'activité de NF-κB et activent PPARγ. Le sulindac permet de diminuer la sécrétion d'IL-8 in vitro sur des cellules épithéliales bronchiques et in vivo sur modèles d'inflammation pulmonaire murin. De plus nous avons montré que le sulindac augmente le transport des ions chlorures via CFTR sur des cellules épithéliales nasales humaines non CF suggérant que le sulindac a un double effet anti-inflammatoire et potentiateur.Ce projet de recherche nous a permis de proposer de nouveaux candidats pour les thérapies anti-inflammatoires dans la mucoviscidose et d'initier l'étude de leur mécanisme d'action
Cystic fibrosis (CF) is characterized by a varied symptomatology dominated by the lung injury severity and inappropriate inflammatory response. It is caused by mutations in the CFTR gene that encodes a cAMP-dependent chloride channel on the surface of epithelial cells. Airway inflammation with neutrphilic profil is characterised by increased Interleukine-8 (IL-8) secretion with dysregulation of transcription factors implicated in the inflammatory pathway such as NF-κB, AP-1 and PPARγ.Our aim is to evaluate agents with anti-inflammatory effect in CF context and to decrypt their mechanisms of action. We have study the effect of anti-inflammatory FDA approved drugs having a yet undefined effect in CF airway epithelial cells and the effect of COMMD1 a pleiotropic protein involved in the inhibition of inflammation and identified in the laboratory to interact with CFTR.In a first time we have shown the anti-inflammatory activity of COMMD1 mediated by its anti-NF-kB activity in the CF context. In a second time we have shown that sulindac and amlexanox can modulate factors dysgulated in CF cells. Both inhibit NF-κB and activate PPARγ. Sulindac reduces IL-8 secretion in vitro on airway epithelial cells and in vivo in mouse model of lung inflammation. Additionally, sulindac increases CFTR-dependent chloride currents in non-CF primary human nasal epithelial cells suggesting that sulindac has a dual anti-inflammatory and potentiator effect.This research has allowed us to propose good anti-inflammatory agents for CF context and to initiate the study of their molecular targets

L’objectif de ma thèse a été d’étudier les réponses transcriptionnelles suite à l’infection par Statphylococcus aureus (S. Aureus) et Helicobacter pylori (H. Pylori) grâce aux puces à ADN. Pour identifier les mécanismes sous-jacents à une plus forte sensibilité de l’épithélium respiratoire à S. Aureus lors de la mucoviscidose, j’ai étudié les réponses transcriptionnelles des cellules épithéliales respiratoires MM-39 (CFTR non muté) après contact avec S. Aureus ou avec le surnageant bactérien qui contient les produits de sécrétion. Les facteurs de transcription comme HIF ou NF-kB sont surexprimés et activés, expliquant la surexpression de molécules inflammatoires. Une comparaison entre les cellules MM-39 et les cellules CF-KM4 (mutation delta F508 du CFTR) après contact avec le surnageant de S. Aureus a révélé une surexpression d’IL-1 et de prostaglandines dans les MM-39 alors que l’IL-6, les leucotriènes, et les calgranulines sont surexprimées dans les CF-KM4. J’ai ensuite analysé le transcriptome de biopsies stomacales infectées par H. Pylori, caractérisée par une activation du complément, et une réponse induite par le CMH-2. Alors que les biopsies ont été extraites au stade gastrite, deux gènes trouvés, surexprimés dans certains cancers, sont surexprimés, résultant probablement d’une réponse non appropriée de type CD4+ Th1, associée à la production d’interféron. Après avoir développé une puce double brin à ADNc, utilisable pour l’étude de nombreuses espèces mammifères, j’ai participé à la création et a la validation d’une collection d’oligonucléotides correspondant à 95% des transcrits humains. J’ai également validé plusieurs méthodes d’analyse
The aim of my thesis was to study the host transcriptional responses to infection by Staphylococcus aureus (S. Aureus) and Helicobacter pylori (H. Pylori) with DNA microarray. To identify the mechanisms underlying the stronger sensibility to S. Aureus of the cystic fibrosis respiratory epithelium, I first studied the transcriptional response to epithelial respiratory MM-39 cells (WT) after a contact with S. Aureus or to bacterial supernatant containing bacterial secreted products. Transcription factors such as HIF and NF-kB, were over-expressed and activated, explaining the up-regulation of inflammatory molecules. A comparison between MM-39 cells and CF-KM4 cells (DF 508 mutated form of CFTR) after a contact with S. Aureus supernatant revealed that IL-1 and prostaglandins were up-regulated mainly in MM-39 cells, whereas IL-6, leukotrienes, and calgranulins were up-regulated mainly in CF-KM4 cells. I then analysed the transcriptome of stomach biopsies infected by H. Pylori, characterized by an activation of the complement cascade, along with a MHC-II elicited response. Whereas biopsies were extracted at gastritis stage, two genes previously found over-expressed in cancers were up-regulated, probably resulting from a non appropriate Th1 type CD4+ response associated with interferon gamma production. The microarray technology requires numerous interacting steps. After having developed a double strand cDNA microarray that can be used for most mammal species studies, I participated to the creation and validation of a human oligonucleotide collection corresponding to 95 % of all known human transcripts. I also set up and validated many analysis methods

La mucoviscidose est une maladie génétique, autosomale et récessive. Elle est caractérisée par une inflammation précoce des voies aériennes observée en absence de toute infection bactérienne, virale ou fongique. Aujourd’hui, l’origine de cette inflammation précoce reste très discutée. Plusieurs études mettent en avant la participation du stress oxydatif, une composante pathologique majeure de la mucoviscidose. Cependant, le lien entre le stress oxydatif et l’inflammation dans un contexte mucoviscidosique reste à démontrer.Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation du rôle du stress oxydatif dans le déclenchement de l'inflammation dans la mucoviscidose. Pour cela j’ai utilisé des cellules épithéliales bronchiques humaines saines (HBE) et mucoviscidosiques(CFBE). J'ai également utilisé deux modèles de cellules dérivées de la cellule CFBE; les cellules CFBE corrigées par la protéinenormale et celles surexprimant la protéine CFTR mutée ; CFTR-delF508 (CFBE-delF508). La caractérisation du profil inflammatoire dans les trois modèles cellulaires a confirmé la présence d'une inflammation intrinsèque dans les cellules CFBE. Cependant, ce profil serait indépendant de l'expression de la protéine CFTR, car il n’est pas modifié suite à l’utilisation de traitements avec des correcteurs de l’expression de la protéine CFTR mutée. Ces résultats suggèrent que le statut inflammatoire dans les cellules mucoviscidosiques serait dû à des protagonistes autres que CFTR. Des études récentes de notre groupe ont montré que les cellules de patients atteints de mucoviscidose présentent une diminution de la concentration en cuivre (Cu), une augmentation de la production de radicaux libres (ROS) et une diminution des activités enzymatiques anti-oxydantes, notamment celle de la Cu/Zn-SOD. La caractérisation du statut du métal cuivre dans nos modèles, nous a permis d'établir un lien entre les niveaux de Cu, le stress oxydatif et l'inflammation dans la mucoviscidose. La comparaison des niveaux d'expression de gènes codants pour des protéines impliquées dans l'homéostasie du Cu dans les cellules HBE et CFBE, nous a permis d’identifier la protéine prion cellulaire (PrPC) comme protéine surexprimée dans les cellules CFBE. PrPC est une glycoprotéine ancrée à la surface des cellules grâce à son ancre Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol(GPI). Plusieurs études menées in vitro et in vivo ont montré la capacité du PrPC à interagir avec différentes protéines, à lier le Cu avec une forte affinité, et à protéger les cellules contre le stress oxydatif. Néanmoins, ses fonctions restent à caractériserdans des tissus extra-neuronaux comme l'épithélium bronchique. Nous avons étudié le rôle de la protéine PrPC dans le contrôle de l'homéostasie du Cu et du stress oxydatif dans les cellules épithéliales bronchiques. Nous avons aussi étudié son implication dans le contrôle des jonctions cellulaires des cellules pulmonaires. Afin de mieux comprendre la fonction PrPC dans les processus inflammatoires associés à la mucoviscidose, nous avons développé une nouvelle lignée cellulaire invalidée pour la protéine PrPC, en utilisant la stratégie CRISPR / Cas9. Dans l'ensemble, notre projet a avancé nos connaissances sur la compréhension de l'implication de la protéine CFTR dans l’inflammation et le stress oxydatif associé aux cellules bronchiques mucoviscidosiques. Nous avons aussi mis en évidence l’implication du cuivre dans le stress et l’inflammation dans les cellules mucoviscidosiques. Finalement, nous avons montré que dans les cellules bronchiques humaine, la protéine PrPC est exprimée et localisée dans les jonctions cellulaires où elle participe à la protection contre le stress d’origine cuprique
In cystic fibrosis (CF), inflammation is detected early on in the airways, even before the onset of bacterial infection, suggesting that mechanisms other than infection are at the origin of the initial inflammatory processes. Among these processes, there is the oxidative stress. The latter is widely accepted as a critical component of several diseases. My PhD project was focused on the characterization of the role of the oxidative stress in triggering inflammation in the CF disease. I used normal (HBE) and cystic fibrosis (CFBE) human bronchial epithelial cells. I also used two cell models derived from CFBE upon either, a stable expression of the wild-type protein (CFBE-wt), or its mutant form; delF508 (CFBEdeltaF508). The characterization of the inflammatory profile in our cellular models confirmed the presence of an intrinsic inflammation inCFBE cells. This profile was independent of the expression of the CFTR protein and was not modified upon the treatments with different molecules known to correct the trafficking of the mutant CFTR (delF508) protein. This suggest that other parameters might be the cause of the CF intrinsic inflammation. Recent studies from our group showed that cells from bronchial CF patients displayed a decrease in copper (Cu) concentrations, and increase in the production of free radicals, and a decrease in antioxidant enzyme activities, such as Cu/Zn-SOD. These results allowed us to establish a link between Cu levels, oxidative stress and inflammation. While investigating the levels of expression of a number of genes encoding proteins that control Cu homeostasis in HBE and CFBE cells, we found that the expression of the cellular prion protein (PrPC) was altered in CFBE cells. PrPC is a glycosyl phosphatidyl inositol (GPI)-anchored glycoprotein involved in prion infection, propagation and aggregation in the central nervous system that leads to transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) diseases. Despite several in vitro and in vivo studies demonstrating the capacity of PrPC to interact with other proteins, to bind copper (Cu) with high affinity and to protect cells against oxidative stress, its physiological functions were still under investigations, particularly in extra-neuronal tissues, such as the bronchial epithelium. We have addressed the role of PrPC in the lung cellular architecture, by determining its impact on the integrity of the lung epithelial junctions. This was performed in relation to Cu homeostasis and oxidative stress in bronchial epithelial cells. To further understand PrPC function, we developed a new HBE PrPC knock-out cell line using the CRISPR/Cas9 strategy. Overall, my project brought new insights into the understanding copper involvement in inflammation, oxidative stress and jonctionnal barriers, and how PrPC protein protect bronchial epithelial cells form copper-associated oxidative stress

L’inflammation précoce et excessive des voies respiratoires joue un rôle prépondérant dans la progression de l’atteinte pulmonaire dans la mucoviscidose. Cette inflammation est caractérisée par la production exagérée de médiateurs inflammatoires par les cellules épithéliales des voies aériennes CF (pour Cystic Fibrosis signifiant Mucoviscidose, en terminologie anglo-saxonne). Afin de mieux évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans la réponse inflammatoire pulmonaire, nous avons étudié le rôle des voies de signalisation intracellulaire dans la régulation de l’expression de cytokines pro-inflammatoires, telles que l’interleukine-8 (IL-8), par des cellules épithéliales pulmonaires CF sous différentes conditions de stimulation. Nous avons ainsi montré que :la surexpression de l’IL-8 par les cellules épithéliales pulmonaires CF stimulées par l’IL-1 est liée à l’activation rapide et exagérée des voies ERK1/2 et p38 des MAP kinases, associées à l’activation du facteur NF-B, la présence de variants alléliques dans le promoteur du gène codant IB- influence son taux de transcription, des solutions salines issues de l’eau de mer réduisent in vitro l’expression de l’IL-8 comparé au sérum physiologique par les cellules épithéliales des voies aériennes, la nébulisation quotidienne de ces solutions salines, même si aucun effet anti-inflammatoire n’a pu être mis en évidence, est cliniquement tolérée par les patients atteints de mucoviscidose. Nos résultats confirment l’intérêt de l’étude des mécanismes moléculaires intracellulaires responsables de l’inflammatoire pulmonaire excessive dans la mucoviscidose, afin de mieux définir les cibles thérapeutiques qui permettraient de réduire l’inflammation pulmonaire des patients atteints de mucoviscidose.

L'infection persistante par pseudomonas aeruginosa (p a) et l'inflammation sont les deux problemes majeurs de la mucoviscidose (mv), maladie due a des mutations du gene cftr. Dans les bronches, cftr est fortement exprime par les cellules glandulaires tracheales humaines sereuses (gths). La physiologie de ces cellules et leur implication dans la mv sont peu connues. Pour comprendre les relations : infection-inflammation et cellules gths, nous avons etudie les effets du lps de p a sur les cellules gths et gths-mv. Nous avons montre que les cellules gths en presence de lps acquierent un phenotype mv : une absence de reponse aux agonistes adrenergiques et cholinergiques correlee a une chute de l'expression des arnm de la cftr. Nous avons aussi montre que les cellules gths secretent constitutivement de l'il6 et de l'il8 et que les cellules gths-mv produisent plus d'il6 et d'il8 que les cellules normales. Dans les cellules gths, le lps induit une augmentation de la secretion d'il6 et d'il8 et une production de tnf. Les glucocorticoides inhibent cette augmentation de secretion d'il6 et d'il8 mais pas la production de tnf. Dans les cellules gths-mv, le lps induit aussi une augmentation de la secretion d'il6 et d'il8 mais n'induit aucune production de tnf ces resultats suggerent une immunodeficience pulmonaire locale dans la mv due a un defaut de production de cytokine par les cellules gths-mv. Nous avons ensuite developpe des lignees transformees de cellules gths normales (mm39) et mv (cf-km4 f508/f508). Ces lignees ont des caracteristiques similaires aux cellules originelles. La transfection du gene cftr par adenovirus corrige les defauts secretoires typiques des cellules mv : absence de stimulation de secretion proteique par des agents adrenergiques et cholinergiques et absence d'activite canal chlorure. Les cellules cf-km4 pourront permettre d'etudier les mecanismes cellulaires et moleculaires generant les defauts secretoires dans la mv.

La mucoviscidose (MV) est une maladie génétique associée aux mutations du gène CFTR et aux anomalies des épithéliums exocrines. Il existe de nombreux phénotypes MV ne pouvant pas être expliqués seulement par les mutations de CFTR suggérant l’influence d’autres facteurs. L’objectif de ce travail est d’identifier les protéines autres que CFTR influençant la physiopathologie MV. L’analyse protéomique différentielle des cryptes du côlon (siège du défaut de CFTR chez les souris invalidées pour cftr, cftr-/-) des souris normales et cftr-/- montre (i) une diminution d’expression de l’annexine-1 (protéine anti-inflammatoire) chez les souris cftr-/- et dans les cellules nasales de patients avec la mutation Y122X ; (ii) une sous-expression de mCLCA3 (canal Cl- activé par le Ca2+) associée à une diminution de la sécrétion des mucines par le côlon des souris cftr-/-. Ce travail indique que la protéomique permet de démasquer des protéines, qui contribuent à mieux comprendre la physiopathologie MV
Cystic Fibrosis (CF) is a lethal autosomal recessive genetic disease associated with mutations in the CFTR gene and abnormalities of exocrine epithelia. However, a number of clinical phenotypes can not be explained only by CFTR mutations suggesting the participation of other factors. The aim of this study was to identify the proteins involved in CF pathogenesis. The results of proteomic and cell biology analysis performed on colonic crypts from normal and cftr knock-out mice (cftr-/-, where crypts are the major site of CFTR defect) indicate that (i) annexin-1 (an anti-inflammatory protein) is down-regulated in cftr-/- mice and in epithelial nasal cells of CF patients homozygous for Y122X mutation, (ii) there is a diminished expression of mClCA3 (a potential Ca2+-dependent Cl- channel) associated with a decreased colonic mucin secretion in cftr-/- mice. Altogether, these results indicate that the proteomic approach is useful to unmask proteins that may be involved in CF pathogenesis

Heightened and sustained neutrophilic airway inflammation is central to the pathogenesis of CF lung disease. Studies evaluating corticosteroids and ibuprofen have demonstrated potential benefits associated with antiinflammatory therapy. The challenge lies in finding drugs that combine effective antiinflammatory activity in the CF lung with an acceptable risk for adverse effects. Drugs targeting single cytokines or receptors might prove less effective due to the redundancies of inflammatory processes involved. Drugs affecting multiple molecules or key inflammatory pathway intermediates could be more effective, but their use will need to be weighed against the risk of impairing innate immunity. Indirect approaches to manage inflammation, such as neutralizing cytotoxic substances in the lung, could be used in combination with other approaches. Development of an orally active, small-molecule antiproteinase drug would be highly desirable in this regard. Rescue/correction of the Cftr defect is a longterm goal with the potential to address multiple facets of CF pathology, including inflammation. Combining one or more of these strategies with the existing treatments of pulmonary toilet and antibiotics may lead to improved clinical outcome.

Contexte : Les maladies pulmonaires comme l'asthme ou la mucoviscidose représentent des problèmes majeurs de santé publique. Elles se manifestent par une inflammation chronique avec une production accrue de cytokines pro-inflammatoires et à terme une dégradation de la fonction respiratoire. Les efforts thérapeutiques tentent, d'un côté, de contrôler la réaction inflammatoire et aussi d'améliorer la biodisponibilité médicamenteuse. Objectif : Notre objectif est d'explorer l'implication des phospholipases dans l'inflammation et le rôle des transporteurs peptidiques dans le transport des antibiotiques dans la mucoviscidose. Nous avons aussi cherché à comprendre l'effet d'une supplémentation en cobalamine sur l'efficacité de la dexaméthasone dans un contexte inflammatoire. Méthodes : Des techniques immunologiques, électrophorétiques, de culture cellulaire, d'immunoprécipitation et d'expression génique sont utilisées sur des lignées bronchiques humaines normales ou mucoviscidosiques. Résultats : 1) La PC-PLC est constitutivement suractivée dans les cellules mucoviscidosiques et conduit à une surproduction d'arachidonate, à une surexpression de Cox-2, une surproduction de PGE2, une surexpression d'interleukine-8, et au défaut de régulation beta-adrénergique de la sécrétion. L'inhibition de cette enzyme par le D609 permet de corriger tous ces défauts. 2) L'activité du transporteur peptidique, impliquée dans le transport d'antibiotiques, PEPT2, a été caractérisée dans les cellules bronchiques normales (Vm = 115 pmol/106 cellules/min ; Km = 15µM). Ce transporteur n'est pas influencé par un contexte inflammatoire. Ce transporteur est inactif dans les cellules CF. 3) La cobalamine potentialise l'effet de la déxaméthasone sur la sécrétion et l'expression des cytokines pro-inflammatoires induite par le TNFa et l'histamine. Conclusions/perspectives : Cette étude devrait permettre 1) de mettre en lumière l'importance de la PC-PLC comme cible pharmacologique potentielle dans la mucoviscidose. 2) de comprendre la relative faible efficacité de l'antibiothérapie dans cette maladie et 3) de mettre en évidence une possible participation du cycle de la méthionine dans le processus inflammatoire
Background: Lung diseases such as asthma or cystic fibrosis are major public health problems. They are manifested by chronic inflammation with increased production of proinflammatory cytokines leading to respiratory failure. Current therapeutic is aimed at controling the inflammatory response and also at improving drug bioavailability. Objective: The objective is to explore the involvement of phospholipases in inflammation and the role of peptide transporters in the transport of antibiotics in cystic fibrosis. We also sought to understand the effect of cobalamin supplementation on the effectiveness of dexamethasone in an inflammatory context. Methods: immunological techniques, electrophoresis, cell culture, immunoprecipitation and gene expression are used on normal or cystic fibrosis human bronchial cell lines. Results : 1) PC-PLC is constitutively overactivated in cystic fibrosis cells and leads to overproduction of arachidonate, to overexpression of Cox-2 , an overproduction of PGE2 , an interleukin -8 overexpression , and to alteration of beta-adrenergic secretion. Inhibition of this enzyme by D609 corrects these defects. 2) The activity of the dipeptide carrier involved in the transport of antibiotics, PEPT2, was characterized in normal bronchial cells (Vm = 115 pmol/106 cells / min, Km = 15µM). This transporter is not affected by an inflammatory context. However, it was shown to be inactive in CF cells. 3) Cobalamin potentiates the effect of dexamethasone on the expression and secretion of pro-inflammatory cytokines induced by TNFa and histamine. Conclusions : This study should help 1) to highlight the importance of PC-PLC as a potential pharmacological target in cystic fibrosis. 2) to understand the relative ineffectiveness of antibiotics in this disease , and 3) to highlight a possible involvement of methionine cycle in the inflammatory process

La première partie de ce travail se centre sur la recherche de tests sanguins (reposant sur les granulocytes) de dépistage, de suivi et d’efficacité thérapeutique dans différentes maladies allergiques. Elle débute par un travail réalisé dans la maladie asthmatique. Elle se poursuit par l’étude du rôle des granulocytes (polynucléaires neutrophiles et/ou polynucléaires éosinophiles et/ou basophiles) dans deux maladies allergiques : l’oesophagite à éosinophiles et les allergies alimentaires. Chez des patients atteints d’oesophagite à éosinophiles, nous avons étudier le profil d’activation des éosinophiles sanguins et de l’œsophage. Nous nous sommes focalisés sur certains marqueurs d’activation de surface (CD66b) et sur certains phosphoépitopes d’intérêt (Ph-STAT1 et Ph-STAT6). Nous avons démontré que les éosinophiles sanguins avaient un profil spécifique dans cette maladie. Enfin, cette première partie s’achève par deux études portant sur les basophiles sanguins dans les allergies alimentaires, plus précisément, dans les allergies aux fruits à coques ; Nous avons développé de nouveaux potentiels tests de dépistage de patients atteints d’allergies alimentaires, d’identification des allergènes responsables ainsi que de potentiels marqueurs d’évaluation d’efficacité de nouvelles thérapeutiques dans les allergies alimentaires par l’utilisation des marqueurs d’activation de surface des basophiles.La deuxième partie se centre principalement sur le rôle des polynucléaires neutrophiles (PNN) du sang et des voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose. La mucoviscidose est la maladie génétique autosomique récessive la plus fréquente dans l’Europe du nord. Son pronostic est étroitement lié à l’atteinte pulmonaire, qui se caractérise par des infections à répétition, une obstruction et une inflammation à PNN. Notre équipe a tout d’abord démontré que les PNN sanguins de patients atteints de mucoviscidose présentaient un déficit en glutathion. Nous avons donc réaliser un essai clinique de phase IIa ou, N-acétyl-cystéine (précurseur du glutathion) était donné, à forte dose et par voie orale à des patients atteints de mucoviscidose. Ce traitement par N-acétyl-cystéine pendant douze semaines a permis une correction du déficit des PNN sanguins en glutathion. Cette correction de l’excès de stress oxydatif au sein des PNN a permis une diminution significative du nombre d’exacerbation chez les patients atteints de mucoviscidose. En revanche, possiblement en raison de la courte durée de ce traitement, aucune différence significative ne fut observée au niveau des paramètres de fonction respiratoire, tels que le VEMS. De plus, nous avons démontré que les PNN des voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose dysfonctionnaient. En effet, alors qu’il était rapporté dans la littérature que les PNN nécrotiques des voies aériennes larguaient de manière passive l’élastase et la myélopéroxidase, nous avons démontré que les PNN vivants larguaient de manière active ces deux enzymes, dont la présence est en étroite corrélation avec le déclin de la fonction pulmonaire.. Nous avons alors émis l’hypothèse que les PNN, lors de leur migration du sang vers les voies aériennes, s’activaient anormalement. Nous avons donc décider d’étudier leurs cascade d’activations intracellulaire. Nous avons ainsi démontré que les PNN des voies aériennes des patients atteints de mucoviscidose présentaient une régulation positive de la voie mTOR. mTOR étaient possiblement activé par la pléthore d’acides aminés présents dans le poumon mucoviscidosique. mTOR pourrait refléter une possible survie prolongée des PNN des voies aériennes du poumon mucoviscidosique. Ces PNN pourraient aussi secréter de nouvelles protéines, alors même qu’ils sont « conventionnellement » définis comme cellules terminallement différenciées. [...]
Summary of the first part. We hypothesized that granulocytes were not only playing an effector role in atopic diseases, but also a regulatory role. Furthermore, we proposed that granulocytes, due to their rapid activation response, could be used in rapid non-invasive whole blood assays for Allergic Asthma (AA), Food Allergy (FA) and Eosinophillic Esophagitis (EoE), three allergic diseases. We first studied asthma. Then, we explored the profil of activation of blood eosinophils in patients with EoE. We explored some activation surface markers (CD66b) and some intracellular phosphoepitopes of interest (Ph-STAT1 and Ph-STAT6). We then focused our attention on blood basophils in food allergy. We developped a potential blood basophil assay (based on two basophil activation surface markers, CD203c and CD63), which could discriminate a patient with food allergy, which could also identify the offending allergen and, which could monitor the effect of new therapy.Summary of the second part. We focused our attention on the role of the blood and sputum neutrophils in cystic fibrosis (CF). Cystic fibrosis is the most frequent disease in Caucasians. While CF affects all exocrine organs throughout the body, its lung manifestation represents the main cause of morbidity and mortality. We first discovered that blood neutrophils were deficient in glutathion. We therefore started a clinical phase IIa, where N-acetyl-cystein were given orally in high dose to patients with CF for twelve weeks. Thanks to this regimen, the deficit in glutathion in blood PNN disappeared. The number of exacerbations significantly decreased, however, no positive effect were observerd on the lung function. Furthermore, we demonstrated that profound functional and signaling changes readily occur within viable PNN recruited to CF airways, compared to their blood counterparts. For a long time, neutrophil dysfunction in CF airways has been equated with necrosis and passive release of elastase, DNA and, actin. However, we established recently by direct ex vivo analysis of airway neutrophils from CF patients that a large fraction of these cells are viable and appear to actively release these enzymes-containing granules. We also show that neutrophils that entered CF airways have increased phosphorylation of key effectors in the amino acid-regulated mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway. An upregulation of the mTOR pathway might reflect an increase of the survival of the neutrophils in the airways. Another common view of peripheral neutrophils is that of terminally differentiated population, with little if any ability to become anabolic. However, we outlined the ability of human neutrophils to modify their transcriptional profile upon migration to the lung in CF. The last part of these thesis is a combination of knowledge that we acquired on the blood basophils in food allergy and on the neutrophils from the airways of patients with CF. We are currently trying to develop an unmet need blood (basophil) test which could discrimate the CF patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis. We are also trying to understand the role of airways neutrophils and eosinophils in the pathogenese of these disease

Dans la mucoviscidose (CF), Pseudomonas aeruginosa colonise les voies respiratoires, conduisant à une inflammation chronique de l’épithélium bronchique. Une analyse transcriptomique antérieure nous a permis d’identifier CHAC1 comme un gène différentiellement exprimé entre les cellules épithéliales bronchiques primaires de patients CF et non-CF, au niveau basal et au cours de l’infection à P. aeruginosa. CHAC1 est une protéine dégradant le glutathion et associée au stress du réticulum endoplasmique et à l’apoptose. L’objectif principal de ce travail était de comprendre la contribution de CHAC1, en particulier dans la réponse inflammatoire et l’apoptose des cellules épithéliales pulmonaires. Nous avons donc, dans un premier temps, confirmé que CHAC1 est surexprimé au niveau ARNm dans les cellules épithéliales bronchiques primaires non-CF par rapport aux cellules CF. Nous avons observé que P. aeruginosa et deux de ses facteurs de virulence, le LPS et la flagelline, induisent l’expression de CHAC1 dans les cellules non-CF. L’expression de CHAC1 induite par le LPS est indépendante de PERK mais implique ATF4. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression de CHAC1 est associée, après stimulation par du LPS et de la flagelline, à une modulation des marqueurs inflammatoires notamment l’IL-8, l’IL-6, CCL2 et PGE2. Enfin, nous avons montré que P. aeruginosa n’est pas capable d’induire de l’apoptose dans la lignée de cellules épithéliales bronchiques NCI-H292. Ces résultats suggèrent que la régulation de l’expression de CHAC1 dans les cellules CF pourrait contribuer à la réponse inflammatoire excessive et chronique observée chez les patients atteints de mucoviscidose
In cystic fibrosis (CF), Pseudomonas aeruginosa colonizes the airways, leading to chronic inflammation of the bronchial epithelium. A previous transcriptomic analysis allowed us to identify CHAC1 as a gene differentially expressed between primary bronchial epithelial cells of CF and non-CF patients at the basal level and during P. aeruginosa infection. CHAC1 is a glutathione-degrading protein associated with endoplasmic reticulum stress and apoptosis. The main objective of this work was to understand the contribution of CHAC1, particularly in the inflammatory response and apoptosis of pulmonary epithelial cells. We therefore first confirmed that CHAC1 is overexpressed at the mRNA level in non-CF primary bronchial epithelial cells relative to CF cells. We observed that P. aeruginosa and two of its virulence factors, LPS and flagellin, induce CHAC1 expression in non-CF cells. The expression of CHAC1 induced by LPS is independent of PERK but involves ATF4. Moreover, we have observed that a reduction in the expression of CHAC1 is associated, after stimulation by LPS and flagellin, with a modulation of the inflammatory markers, in particular IL-8, IL-6, CCL2 and PGE2. Finally, we have shown that P. aeruginosa is not capable of inducing apoptosis in the NCI-H292 bronchial epithelial cell line. These results suggest that CHAC1 is involved in the regulation of bronchial cell inflammation during P. aeruginosa infection and the regulation of CHAC1 expression in CF cells may contribute to the observed excessive and chronic inflammatory response in patients with cystic fibrosis

Face au phénomène de multi-résistance aux antibiotiques des souches de Pseudomonas aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose, de nouvelles approches doivent être envisagées. L'utilisation des bactériophages pour cibler les bactéries semble être l'une des plus prometteuses. L'efficacité de la phagothérapie semble démontrée par son utilisation en Europe de l'Est depuis des décennies et par les récents résultats obtenus sur des modèles expérimentaux. Cependant, la possibilité de son utilisation chez des patients atteints de mucoviscidose n'a pas encore fait l'objet d'études approfondies. Nous avons démontré l'efficacité des bactériophages in vivo, lors d'une infection pulmonaire létale provoquée par une souche clinique de P. aeruginosa, mais aussi in vitro, pour réduire un biofilm formé par P. aeruginosa. Nous avons aussi étudié la réponse inflammatoire induite par les bactériophages, dans différents modèles in vitro et in vivo, qui s'est révélée quasiment négligeable. Nous avons également mis au point la technique de mesure de différence de potentiel nasale chez la souris pour étudier le transport ionique transépithélial, paramètre fondamental de la mucoviscidose. Les mesures obtenues en présence de bactériophages ne diffèrent pas significativement par rapport aux normes préalablement définies. Enfin, nous avons mis au point une méthode permettant d'évaluer la capacité des bactériophages à infecter des bactéries au sein d'expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Nous apportons ainsi des résultats scientifiques concrets qui permettront de mieux appréhender les conditions nécessaires au développement de futurs essais cliniques chez ces patients.

The present study focuses on adaptive metabolic steps adopted by neutrophils during inflammation, particularly during their recruitment into the cystic fibrosis (CF) airways. In CF, we previously described that airway neutrophils are alive and undergo reprogramming, featuring notably the activation of the anabolic mTOR pathway. The present work is based on specific properties of soluble ligands derived from the receptor-binding domains (RBD) of retroviral glycoprotein envelopes, which can be used for the detection of metabolite transporters at the cell surface. First, we validated the use of this new set of markers for the identification and characterization of the metabolic phenotype of CF leukocytes obtained from distinct compartments (blood and sputum). Second, by studying the metabolite transporter expression on blood neutrophils from CF or rheumatoid arthritis patients and control subjects, we distinguished metabolic phenotypes characteristic of specific inflammatory states. Then, we compared metabolite transporter expression between CF blood and airway neutrophils and showed that neutrophils undergo significant metabolic adaptation upon recruitment into the lungs. Finally, we demonstrated that CF airway neutrophils display significant transcriptional modulation and that despite their metabolic reprogramming, they remain functionally competent, thus adding an additional angle of approach to neutrophil studies with regard to inflammation, notably during CF airway disease.

Chez les patients mucoviscidosiques (CF), l'épithélium des voies aériennes est souvent lésé et remodelé. Que le remodelage soit lié à l'infection et/ou l'inflammation inhérentes à la pathologie ou à un processus de régénération dérégulée reste à déterminer. Le premier objectif de cette thèse a été de déterminer le rôle de l'inflammation dans le remodelage et la régénération de l'épithélium bronchique CF. Grâce à un modèle in vitro de culture en interface air-liquide, nous avons montré qu'en absence d'infection et d'inflammation exogènes, la régénération épithéliale CF est anormale et retardée, et que l'épithélium régénéré est remodelé, en comparaison d'un épithélium régénéré non-CF. En outre, en générant une inflammation chronique dans les cultures CF et non-CF, nous avons pu attribuer un rôle pour l'inflammation endogène (mémoire inflammatoire) des cellules CF dans l'augmentation de la hauteur épithéliale et dans le développement de l'hyperplasie des cellules basales, un rôle essentiel de l'inflammation exogène dans le développement de l'hyperplasie des cellules mucipares, et l'absence d'influence de l'inflammation dans le retard de différenciation des cellules ciliées épithéliales CF. Le second objectif de cette thèse a été d’identifier une molécule susceptible d’être anti-remodelage et/ou pro-régénératrice. Les résultats obtenus montrent qu’une molécule issue des agro-ressources régionales régule l'augmentation de la hauteur épithéliale et l'hyperplasie des cellules basales et sécrétoires, favorise la différenciation des cellules ciliées, et réduit l'inflammation et de synthèse de la mucine MUC-5AC, tant dans les cultures CF quand dans les cultures non-CF soumises à une inflammation chronique. Enfin, la molécule restaure la sécrétion des ions chlorure CFTR-dépendante dans les cultures CF. Cette molécule semble donc être un candidat médicament prometteur pour le traitement de la CF
The airway epithelium of cystic fibrosis (CF) patients is frequently injured and remodeled. Whether these alterations are related to infection and/or inflammation or to a dysregulated regeneration process remains to be elucidated. The first objective of this study was to determine the involvement of inflammation in remodeling and regeneration of the CF airway epithelium. Using an in vitro model of airway epithelial cell culture at the air-liquid interface, we demonstrated that, in absence of exogenous infection and inflammation, the CF airway epithelium regeneration was abnormal, delayed, and led to the reconstitution of a remodeled epithelium, in comparison to a non-CF regenerated airway epithelium. Moreover, by inducing a chronic inflammation in non-CF and CF cultures, we were able to attribute a role of the endogenous inflammation of CF cells (inflammatory memory) in the airway epithelium height increase as well as in the basal cell hyperplasia development, an essential involvement of exogenous inflammation in the development of goblet cell hyperplasia, and the absence of implication of inflammation in the ciliated cell differentiation delay. The second objective of this study was to identify an anti-remodeling and/or pro-regenerative molecule. The results we obtained showed that a molecule derived agro-resources regulated the increase in the airway epithelium height as well as the basal and goblet cell hyperplasia development, favored the ciliated cell differentiation, decreased the inflammation and the production of the MUC5-AC mucin, in the CF cultures an in the chronically inflamed non-CF cultures. Finally, this molecule restored chloride secretion through CFTR in CF cultures. In conclusion, the chosen molecule seems to be a promising therapeutics for cystic fibrosis

Ce travail scientifique a abordé la problématique de la communication cellulaire entre le pancréas exocrine et endocrine dans la mucoviscidose. La contribution des infections pulmonaires chroniques et des traitements immunosuppresseurs sur la dégénerescence pancréatique a été aussi étudiée. Les résultats obtenus ont montré que le LPS disséminé par des infections récurrentes peut cibler les cellules pancréatiques exocrines, en conduisant à la formation des microparticules membranaires qui sont nuisibles pour la survie et le fonctionnement des cellules endocrines. Dans cette communication intercellulaire, la protéine CFTR est un médiateur essentiel de la sévérité des signaux délivrés par les microparticules et de la réponse cellulaire à l'inflammation du pancréas, en participant à l'équilibre de la sécrétion d'insuline des cellules endocrines. En outre, les données ont mis en évidence que l'administration prolongée d’immunosuppresseurs chez les patients greffés pourrait différemment induire l'apoptose de manière dépendante de la mitochondrie, cela en favorisant l'entrée des cellules en sénescence prématurée, un état métabolique du dysfonctionnement cellulaire
This scientific work tackled the issue of the communication between exocrine and endocrine pancreas in cystic fibrosis. Also, the contribution of recurrent lung infections and immunosuppressive therapy to the pancreatic cell degenerescence was studied in vitro. Results obtained showed that disseminated LPS released by recurrent infections could target pancreatic exocrine cells, leading to the formation of membrane microparticles that are deleterious for endocrine cell survival and function. In this intercellular cross-talk, CFTR is a critical mediator for the severity of the MP-delivered signals and for the pancreatic cell response to inflammation, also participating to the balance of insulin secretion of endocrine cells. Furthermore, data evidenced that long-term administration of immunosuppressive drugs in grafted patients may differently induce apoptosis in a mitochondrial-dependent fashion, possibly favoring cells to enter premature senescence, which is a metabolic state of cellular dysfunction

L’augmentation de l’espérance de vie des patients atteints par la mucoviscidose (CF, Cystic Fibrosis) est associée à des complications extra-pulmonaires dont la prévalence augmente avec l’âge, comme c’est le cas pour la maladie osseuse ou le diabète, représentant une véritable problématique pour la qualité de vie des patients CF. Le déficit osseux lié à la mucoviscidose reste encore incomplètement caractérisé et la compréhension de l’impact du défaut de fonction du canal CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) sur la physiologie osseuse est indispensable pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques. La mutation la plus fréquente de CFTR (F508del) dans les ostéoblastes est associée à un ratio RANK-L/OPG élevé susceptible de stimuler l’ostéoclastogenèse. L’objectif de ce travail était d’étudier l’impact du défaut d’activité de CFTR sur les précurseurs ostéoclastiques et leur différenciation ainsi que l’activité fonctionnelle des ostéoclastes CF. Nous avons pu mettre en évidence qu’il existe une surexpression des récepteurs RANK et M-CSF à la surface des précurseurs ostéoclastiques issus de patients porteurs de la mutation G551D de CFTR. Par ailleurs, nous avons démontré que le phénotype ostéoclastique est fortement impacté par la mutation F508del, ainsi que la voie de la S1P, médiateur prépondérant dans la circulation des précurseurs ostéoclastiques entre les compartiments sanguins et osseux. L’ensemble de ces données et la mise en évidence d’un profil résorptif perturbé des ostéoclastes lorsque l’activité de CFTR est déficiente, suggèrent qu’il existe une dérégulation de la résorption, et plus largement du remodelage osseux chez les patients CF
The increasing life expectancy of patients with cystic fibrosis (CF) is associated with extra-pulmonary complications which prevalence increases with age, such as bone disease or diabetes, that impact the quality of life of CF patients. The bone deficit related to cystic fibrosis is still incompletely characterized and the understanding of the impact of CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) defect on bone physiology is essential to propose new therapeutic strategies. The most common mutation of CFTR, (F508del) in osteoblasts is associated with a high RANK-L/OPG ratio that may stimulate osteoclastogenesis. The aim of this work was to study the impact of CFTR defective activity on osteoclast precursors and their differentiation as well as the functional activity of CF osteoclasts. We have demonstrated that there is an overexpression of the RANK and M-CSF receptors on the surface of osteoclastic precursors derived from patients carrying the CFTR G551D mutation. Furthermore, we have revealed that the osteoclasts phenotype is strongly impacted by the F508del mutation as well as the S1P pathway, a prominent mediator for the circulation of osteoclastic precursors between blood and bone compartments. All of these data and the demonstration of a disturbed resorptive osteoclasts profile when CFTR activity is deficient suggest that there is a dysregulation of resorption and more widely of bone remodeling in CF patients

La mucoviscidose est une pathologie pulmonaire causée par un dysfonctionnement du canal CFTR et caractérisée par un mucus visqueux, une susceptibilité accrue aux infections chroniques et une inflammation excessive. Une première partie de ma thèse a eu pour objectif d’étudier les mécanismes inflammatoires impliqués dans le développement de la pathologie. Nous avons plus particulièrement analysé le rôle de l’IL-1β et de l’IL-17 dans la réponse à l’infection par Pseudomonas aeruginosa, dans le modèle murin ΔF508 de mucoviscidose. La seconde partie de ma thèse a porté sur l’étude de la malaria pulmonaire et cérébrale, une complication létale de l’infection à P. falciparum. Nous avons mis en évidence l’importance de trois voies d’activation des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques dans le développement de la neuropathologie induite par Plasmodium berghei ANKA chez la souris : la protéine PKC-θ, la sous-unité β2 du récepteur à l’IL-12 et le récepteur des IFN de type I, mais qui ne semblent pas impliquées dans l’inflammation pulmonaire associée
Cystic fibrosis is a pulmonary pathology, caused by the CFTR channel dysfunction, and characterized by high mucus viscosity, increased sensitivity to chronic infections and excessive inflammation. The aim of my thesis was first to study the inflammatory mechanisms involved in this lung pathology. Indeed, we analyzed the role of IL-1β and IL-17 in response to Pseudomonas aeruginosa infection, in the ΔF508 mouse model of cystic fibrosis. In the second part of my thesis, I studied pulmonary and cerebral malaria, a lethal complication of P. falciparum infection. We showed the importance of three pathways implicated in cytotoxic CD8+ T lymphocytes activation during the Plasmodium berghei ANKA-induced neuropathology development in mice: PKC-θ protein, β2 subunit of IL-12 receptor and type I IFN receptor, which did not seem essential for the associated lung inflammation

Lors de pathologies pulmonaires inflammatoires chroniques comme la mucoviscidose ou la BPCO, le déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases aboutit à la dégradation du tissu pulmonaire et à l’inactivation des défenses antimicrobiennes. Les cathepsines à cystéine participent à l’inactivation protéolytique de peptides et protéines antimicrobiens (PAMs) pulmonaires comme le SLPI, la lactoferrine, et les β-défensines HBD-2 et -3 lors de l’emphysème ou de la mucoviscidose. Lors de cette thèse, nous avons étudié la capacité des cathepsines à cystéine B, K, L et S à hydrolyser le peptide LL-37, qui est un PAM important dans l’immunité innée pulmonaire. Seules les cathepsines K et S clivent le LL-37 et inactivent efficacement son activité antimicrobienne. A l’inverse, le LL-37 est un inhibiteur compétitif de la cathepsine L. D’autre part, l’expression pulmonaire de la cathepsine S est fortement augmentée chez les individus fumeurs atteints ou non de BPCO. La fumée de cigarette qui est une source importante de stress oxydatif induit une augmentation significative de l'expression et l'activité de la cathepsine S. Malgré un environnement oxydatif non favorable à l'activité des cathepsines, la cathepsine S parvient à hydrolyser le peptide LL-37 et pourrait ainsi augmenter le risque d’exacerbation lors de la BPCO
During chronic inflammatory lung diseases like cystic fibrosis or COPD, proteases/antiproteases imbalance leads to pulmonary tissue degradation and compromise antimicrobial barrier. Cysteine cathepsins are involved in the proteolytic inactivation of several lung antimicrobial peptides (AMPs) such as SLPI, lactoferrin and β- defensins -2 and -3 during emphysema or cystic fibrosis. During this thesis, we studied the ability of cathepsins B, K, L and S to degrade LL-37, which is an important AMP in lung immunity. Only cathepsins K and S degrade readily LL-37 and inactivate its antimicrobial property. Conversely, LL-37 is a competitive inhibitor of cathepsin L. Beside, lung expression of human cathepsin S is significantly increased in smokers with or without COPD compared to non-smokers. Cigarette smoke that is a major source of oxidative stress significantly increases the expression and activity of cathepsin S. Despite an unfavorable oxidative environment, cathepsin S retains its proteolytic activity toward LL-37 and thus could participate to COPD exacerbation

Les mucines bronchiques des patients atteints de mucoviscidose présentent des modifications de glycosylation qui se traduisent par la sur-expression de motifs sialyl-Lewisx (NeuAcα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc-R, sLex) et 6-sulfo-sLex (6-sulfo-sLex), qui sont des récepteurs préférentiels de la bactérie Pseudomonas aeruginosa, responsable de l’infection chronique des patients atteints de mucoviscidose. Nous avons montré que le traitement au TNF d’explants bronchiques humains induisait une surexpression de motifs sLex et 6-sulfo-sLex, et que celle-ci était accompagnée d’une surexpression du gène de l’α2,3-sialyltransférase ST3GAL4. Nous avons pu mettre en évidence un effet similaire du TNF dans la lignée A549, et démontrer l’importance du gène ST3GAL4 dans la synthèse de sLex et 6-sulfo-sLex par interférence ARN. Nous avons ensuite identifié un transcrit majeur, BX répondant au TNF dans les explants bronchiques humains et dans les cellules A549, et cloné la région génomique possiblement impliquée dans le contrôle de l’expression de ce transcrit. Cette région présente une activité promotrice de base et répond au TNF. L’étude de différentes constructions de cette région et d’inhibiteurs pharmacologiques de voies de signalisation ont ensuite été utilisé dans le but de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires conduisant à l’augmentation de l’expression de ST3GAL4 par le TNF. Enfin, nous avons étudié avec la lignée cellulaire NCI-H292 l’effet du TNF sur l’adhésion de différentes souches de Pseudomonas aeruginosa. Nos résultats préliminaires indiquent que le traitement par le TNF induit une surexpression de ST3GAL4, du sLex, et une augmentation de l’adhésion des souches PAO1 et PAK, dépendante de l’adhésine FliD, et de la présence d’acide sialique
Bronchial mucins from patients suffering from cystic fibrosis (CF) exhibit glycosylation alterations, especially increased amounts of sialyl-Lewisx (NeuAcα2-3Galβ1-4[Fuc[α1-3]GlcNAc-R, sLex) and 6-sulfo-sialyl-Lewisx (6-sulfo-sLex) structures. These epitopes are preferential receptors for Pseudomonas aeruginosa, the bacteria responsible for the chronicity of airway infection of CF patients. Several studies have shown that inflammation may affect glycosylation and sulfation of glycoproteins, including mucins. We previously proposed that the inflammatory context in the respiratory tract of CF patients was responsible for the overexpression of sLex and 6 sulfo-sLex structures. Indeed, we and others have shown that pro-inflammatory cytokines can modulate glycosylation in the bronchial mucosa and in bronchial cell lines. In particular, TNF, IL-6 and IL-8 increase the expression and activity of several members of the sialyl-, fucosyl- and sulfotransferases families in human bronchial explants. During my thesis, I showed that TNF regulates the expression of a specific transcript (BX) of the ST3GAL4 gene that encodes the main α2,3-sialyltransferase (ST3Gal IV) involved in the biosynthesis of sLex and 6-sulfo-sLex epitopes in both human bronchial explants and A549 lung cancer cells. A 2 kb genomic region was cloned and we have shown by reporter gene experiments that this region could be responsible for both basal BX transcript expression and response to TNF treatment in A549 cells. Different genetic constructions of this sequence and the use of pharmacological inhibitors allowed us to study the molecular and cellular mechanisms involved in ST3GAL4 up-regulation induced by TNF treatment. In parallel, we have studied the effect of TNF-induced sLex and 6- sulfo -sLex overexpression on P. aeruginosa adhesion, using the NCI-H292 pulmonary carcinoma cell model. Our preliminary results indicate that TNF treatment induces an enhance expression of sLex derivatives that correlates with an enhance adhesion of both PAO1 and PAK strain. This increased adhesion is dependant of the presence of a functional FliD protein, the bacterial lectin recognizing sLex and 6- sulfo -sLex, and is abolished by sialidase treatment. Identifying mechanisms by which sLex and 6-sulfo-sLex structures are overexpressed on bronchial mucins from CF patients may allow the identification of new targets to fight bronchial inflammation and infection by P. aeruginosa