Dissertations / Theses on the topic 'Museo di anatomia patologica'

This thesis wants to call the attention to the long route made by the collections of pathological anatomy from the second half of the 1700’s until the beginnings of the 1900’s and today. Padua has always been the world-wide centre of medicine. The necessity to preserve the anatomical preparations has kept pace with the prestige of the “Medical School. “His Anatomical Majesty” Giovanni Battista Morgagni (1682-1771) had planned an anatomical museum inside Palazzo del Bo, next to the anatomical theatre of Girolamo Fabrici D’Acquapendente, but this work was never finished. The after Morgagni sees illustrious doctors like Caldani (1725-1813), Comparetti (1745-1801) and Fanzago (1764-1836). Only with this last one we have the first news about a pathological cabinet (1810), even if completely rudimental. However, we must wait for Lodovico Brunetti (1813-1899) to have a real Museum of Pathological Anatomy (1870). He was the first professor of pathological anatomy in Padua, as well as the first director of the same Institute. During his direction major changes take place: the anatomical schools “in force of my persevering firmness had been transported from the hospital to Saint Mattia”, the anatomical theatre became, more and more, the essential moment of the anatomo-pathological research, the Museum is conceived like a formative and popular instrument. Another great innovation introduced by Brunetti was the realization of many preparations with his personal method: the “tannizzazione”. This extraordinary technique is a process of conservation of the animals tissues that required the use of water to bleed the preparation (passing through the blood vessels), sulfuric ether to de-grease, tannic acid to “tannizzare” and compressed air to dry the whole preparation. Unfortunately, the tannizzazione did not have a continuation and remained unused, despite the prizes obtained in all Europe by Brunetti, who used to complain: “nobody of you follows me in my work”. The teaching of Morgagni, Rokitansky, Virchow has evolved in the one of Koch and the research mostly concerns “the invisible”. The history of the Museum of Pathological Anatomy is close to the one of the Institute of Pathological Anatomy of the University of Padua and in particular to the history of the Directors. Beginning exactly from Brunetti, carrying on with Augusto Bonome, Giovanni Cagnetto, up to professor Gaetano Thiene, their works and the interventions for the development of the Museum have been highlighted. The Museum is a place getting more and more modern where the collection and the preservation of the anatomo-pathological material is guaranteed, but in particular it represents a biological archives in which we can draw upon for study and scientific research. To allow and develop that, it is opportune to think of “a widespread” museum in the territory.
Questo lavoro vuole richiamare il lungo percorso compiuto dalle collezioni di anatomia patologica a partire dalla seconda metà del Settecento fino agli inizi del Novecento e ai giorni nostri. Padova è stata da sempre centro mondiale della medicina. Di pari passo col prestigio della “Scuola Medica” si è vista accrescere negli anni la necessità di poter conservare i preparati anatomici. Già “Sua Maestà Anatomica” Giovanni Battista Morgagni (1682-1771) aveva fatto progettare proprio un museo anatomico al Palazzo del Bo, di fianco al teatro anatomico di Girolamo Fabrici D’Acquapendente, ma tale opera non fu mai portata a termine. Il dopo Morgagni vede illustri medici come Caldani (1725-1813), Comparetti (1745-1801) e Fanzago (1764-1836), però solo con quest’ultimo si hanno le prime notizie riguardanti un gabinetto patologico (1810), anche se del tutto rudimentale. Bisogna aspettare però l’arrivo di Lodovico Brunetti (1813-1899) per avere un vero e proprio Museo anatomo-patologico (1870). Egli fu il primo cattedratico di anatomia patologica a Padova, nonché il primo direttore del medesimo Istituto. Durante la sua direzione ci furono i più significativi cambiamenti: le scuole anatomiche “in forza della mia perseverante fermezza vennero trasportate dall’ospitale in San Mattia”, il teatro anatomico divenne, sempre più, il momento essenziale della ricerca anatomo-patologica, il Museo concepito come strumento formativo e divulgativo. Altra grande novità introdotta dal Brunetti fu la realizzazione di moltissimi preparati con una sua personalissima metodica: la tannizzazione. Questa straordinaria tecnica è un processo di conservazione dei tessuti animali che prevedeva l’utilizzo, passando attraverso i vasi sanguigni, di acqua per dissanguare il preparato, etere solforico per digrassarlo, acido tannico per tannizzarlo ed infine aria compressa per essiccare il tutto. La tannizzazione non ebbe più un seguito, rimanendo purtroppo inutilizzata, nonostante i premi ricevuti in tutta Europa dal Brunetti, che si lamentava: “nessuno di voi mi segue coll’opera. L’insegnamento del Morgagni, del Rokitansky, del Virchow si è trasformato in quello del Koch e le indagini si aggirano, pressoché esclusivamente, intorno agli invisibili”. La storia del museo di anatomia patologica si colloca al fianco di quella dell’Istituto di Anatomia Patologica dell’Università di Padova ed in specifico con quella dei Direttori. Partendo appunto dal Brunetti, per continuare con Augusto Bonome, Giovanni Cagnetto, fino ad arrivare al prof. Gaetano Thiene, sono stati evidenziati i loro lavori e gli interventi fatti per lo sviluppo del Museo; luogo sempre più moderno dove vengono garantite la raccolta e la salvaguardia di materiale anatomo-patologico, ma in particolare rappresenta un archivio biologico in cui attingere per lo studio e la ricerca scientifica. Per permettere e sviluppare ciò, è opportuno pensare ad un museo “diffuso” nel territorio.

Il presente lavoro nasce dall’obiettivo di individuare strumenti statistici per indagare, sotto diversi aspetti, il flusso di lavoro di un Laboratorio di Anatomia Patologica. Il punto di partenza dello studio è l’ambiente di lavoro di ATHENA, software gestionale utilizzato nell’Anatomia Patologica, sviluppato dalla NoemaLife S.p.A., azienda specializzata nell’informatica per la sanità. A partire da tale applicativo è stato innanzitutto formalizzato il workflow del laboratorio (Capitolo 2), nelle sue caratteristiche e nelle sue possibili varianti, identificando le operazioni principali attraverso una serie di “fasi”. Proprio le fasi, unitamente alle informazioni addizionali ad esse associate, saranno per tutta la trattazione e sotto diversi punti di vista al centro dello studio. L’analisi che presentiamo è stata per completezza sviluppata in due scenari che tengono conto di diversi aspetti delle informazioni in possesso. Il primo scenario tiene conto delle sequenze di fasi, che si presentano nel loro ordine cronologico, comprensive di eventuali ripetizioni o cicli di fasi precedenti alla conclusione. Attraverso l’elaborazione dei dati secondo specifici formati è stata svolta un’iniziale indagine grafica di Workflow Mining (Capitolo 3) grazie all’ausilio di EMiT, un software che attraverso un set di log di processo restituisce graficamente il flusso di lavoro che li rappresenta. Questa indagine consente già di valutare la completezza dell’utilizzo di un applicativo rispetto alle sue potenzialità. Successivamente, le stesse fasi sono state elaborate attraverso uno specifico adattamento di un comune algoritmo di allineamento globale, l’algoritmo Needleman-Wunsch (Capitolo 4). L’utilizzo delle tecniche di allineamento applicate a sequenze di processo è in grado di individuare, nell’ambito di una specifica codifica delle fasi, le similarità tra casi clinici. L’algoritmo di Needleman-Wunsch individua le identità e le discordanze tra due stringhe di caratteri, assegnando relativi punteggi che portano a valutarne la similarità. Tale algoritmo è stato opportunamente modificato affinché possa riconoscere e penalizzare differentemente cicli e ripetizioni, piuttosto che fasi mancanti. Sempre in ottica di allineamento sarà utilizzato l’algoritmo euristico Clustal, che a partire da un confronto pairwise tra sequenze costruisce un dendrogramma rappresentante graficamente l’aggregazione dei casi in funzione della loro similarità. Proprio il dendrogramma, per la sua struttura grafica ad albero, è in grado di mostrare intuitivamente l’andamento evolutivo della similarità di un pattern di casi. Il secondo scenario (Capitolo 5) aggiunge alle sequenze l’informazione temporale in termini di istante di esecuzione di ogni fase. Da un dominio basato su sequenze di fasi, si passa dunque ad uno scenario di serie temporali. I tempi rappresentano infatti un dato essenziale per valutare la performance di un laboratorio e per individuare la conformità agli standard richiesti. Il confronto tra i casi è stato effettuato con diverse modalità, in modo da stabilire la distanza tra tutte le coppie sotto diversi aspetti: le sequenze, rappresentate in uno specifico sistema di riferimento, sono state confrontate in base alla Distanza Euclidea ed alla Dynamic Time Warping, in grado di esprimerne le discordanze rispettivamente temporali, di forma e, dunque, di processo. Alla luce dei risultati e del loro confronto, saranno presentate già in questa fase le prime valutazioni sulla pertinenza delle distanze e sulle informazioni deducibili da esse. Il Capitolo 6 rappresenta la ricerca delle correlazioni tra elementi caratteristici del processo e la performance dello stesso. Svariati fattori come le procedure utilizzate, gli utenti coinvolti ed ulteriori specificità determinano direttamente o indirettamente la qualità del servizio erogato. Le distanze precedentemente calcolate vengono dunque sottoposte a clustering, una tecnica che a partire da un insieme eterogeneo di elementi individua famiglie o gruppi simili. L’algoritmo utilizzato sarà l’UPGMA, comunemente applicato nel clustering in quanto, utilizzando, una logica di medie pesate, porta a clusterizzazioni pertinenti anche in ambiti diversi, dal campo biologico a quello industriale. L’ottenimento dei cluster potrà dunque essere finalmente sottoposto ad un’attività di ricerca di correlazioni utili, che saranno individuate ed interpretate relativamente all’attività gestionale del laboratorio. La presente trattazione propone quindi modelli sperimentali adattati al caso in esame ma idealmente estendibili, interamente o in parte, a tutti i processi che presentano caratteristiche analoghe.

Recent reports showed that early-interim PET-scan is the only tool predicting treatment outcome in advanced-stage classical Hodgkin lymphoma (asCHL). We evaluated the prognostic impact of a series of immunohistochemical markers, mentioned in literature as prognostic factors, on tissue microarrays assembled from biopsies of 220 patients: STAT1, SAP, TOP2A, PCNA and CD20, both in neoplastic (HRSC) and microenvironment cells (MC); RRM2, MAD2, CDC2, BCL2, P53, BCL11A and EBER in HRSC; ALDH1A1, TIA-1, granzyme B, perforin, FOXP3, and PD-1 in MC. All patients had been treated with standard ABVD ± Rx therapy. Interim-PET after 2 ABVD courses was evaluated according to the criteria indicated by Gallamini in his study (Journal of Clinical Oncology, 2007). The survival analysis has been performed in a subset of 138 patients whose complete clinical information were available: the mean age was 33.3 years (14-79), the stage III-IVB in 98 and IIB in 40, and the mean follow-up 38.1 months (7.6-71.9). Histopathology review showed: NS-I 75, NS-II 22, MC 20, DL 3, and CHL/nos 18 cases. Interim-PET was positive in 30 patients, while treatment failure was recorded in 32. In univariate analysis the factors related to treatment outcome were BCL2 on HRSC (cut-off value 50%), STAT1/SAP on MC, and PET (Log-rank 6.9, 7.9 and 93.9 respectively). The combined expression of STAT1 and SAP was scored in three levels depending on the architectural pattern: score 0 for expression of both with a diffuse/rosetting pattern; score 1 for discordant combination of diffuse/rosetting and scattered patterns; score 2 for both markers with a scattered pattern; the 3y-PFS were 87.4%, 69.9% and 61.9% respectively. In multivariate analysis PET, BCL2 and STAT1/SAP remained significant (HR: 24.8, 4.6, 7.5 and 5.6, respectively; p<.01). The proposed model is able to predict treatment response in AsCHL, even if with a lower efficacy than PET. However, unlike PET, it can be applied upfront therapy.

Recent reports showed that early-interim PET-scan is the only tool predicting treatment outcome in advanced-stage classical Hodgkin lymphoma (asCHL). We evaluated the prognostic impact of a series of immunohistochemical markers, mentioned in literature as prognostic factors, on tissue microarrays assembled from biopsies of 220 patients: STAT1, SAP, TOP2A, PCNA and CD20, both in neoplastic (HRSC) and microenvironment cells (MC); RRM2, MAD2, CDC2, BCL2, P53, BCL11A and EBER in HRSC; ALDH1A1, TIA-1, granzyme B, perforin, FOXP3, and PD-1 in MC. All patients had been treated with standard ABVD ± Rx therapy. Interim-PET after 2 ABVD courses was evaluated according to the criteria indicated by Gallamini in his study (Journal of Clinical Oncology, 2007). The survival analysis has been performed in a subset of 138 patients whose complete clinical information were available: the mean age was 33.3 years (14-79), the stage III-IVB in 98 and IIB in 40, and the mean follow-up 38.1 months (7.6-71.9). Histopathology review showed: NS-I 75, NS-II 22, MC 20, DL 3, and CHL/nos 18 cases. Interim-PET was positive in 30 patients, while treatment failure was recorded in 32. In univariate analysis the factors related to treatment outcome were BCL2 on HRSC (cut-off value 50%), STAT1/SAP on MC, and PET (Log-rank 6.9, 7.9 and 93.9 respectively). The combined expression of STAT1 and SAP was scored in three levels depending on the architectural pattern: score 0 for expression of both with a diffuse/rosetting pattern; score 1 for discordant combination of diffuse/rosetting and scattered patterns; score 2 for both markers with a scattered pattern; the 3y-PFS were 87.4%, 69.9% and 61.9% respectively. In multivariate analysis PET, BCL2 and STAT1/SAP remained significant (HR: 24.8, 4.6, 7.5 and 5.6, respectively; p<.01). The proposed model is able to predict treatment response in AsCHL, even if with a lower efficacy than PET. However, unlike PET, it can be applied upfront therapy.

Gliomas are the most common primary brain tumours. Despite advances in surgical techniques, postoperative supportive care, radiation and adjuvant systemic therapy, the life expectancy of patients with high grade glioma has remained essentially poor. Furthermore differential diagnosis among astrocytomas, oligodendrogliomas and oligoastrocytomas is very challenging and subject to inter-observer variability. The purpose of the research was: 1) to investigate a series of high grade and low grade gliomas at gene and protein (immunohistochemistry) levels to disclose possible genetic portraits of malignancy; 2) to verify the utility of Nogo-A, Olig-2 and synaptophysin in providing a correct histological diagnosis of oligodendroglioma and to investigate a possible complementary role in selecting the best areas suitable for detecting 1p/19q codeletion using FISH analysis; 3) to study the role of microRNA in high grade gliomas. In order to obtain these goals large series of brain tumors were studied with DNA microarrays, immunohistochemistry and RT-PCR The results demonstrated that: - Overexpression of IGFBP-2 and CDC20 is highly related to glioblastomas and their immunopositivity can be useful for the identification of glioblastoma in small biopsies. - Nogo-A is the most useful and specific marker in differentiating oigodendrogliomas from other gliomas. Furthermore, using a Nogo-A driven FISH analysis, it is possible to identify a larger number of 1p19q codeletions in gliomas. - microRNAs can be studied in paraffin embedded tissues better than in fresh tissues. A series of six microRNA, significatively deregulated in glioblastomas, may represent a genetic signature with prognostic and predictive value and could constitute candidates for novel anti-cancer therapeutics.

Gliomas are the most common primary brain tumours. Despite advances in surgical techniques, postoperative supportive care, radiation and adjuvant systemic therapy, the life expectancy of patients with high grade glioma has remained essentially poor. Furthermore differential diagnosis among astrocytomas, oligodendrogliomas and oligoastrocytomas is very challenging and subject to inter-observer variability. The purpose of the research was: 1) to investigate a series of high grade and low grade gliomas at gene and protein (immunohistochemistry) levels to disclose possible genetic portraits of malignancy; 2) to verify the utility of Nogo-A, Olig-2 and synaptophysin in providing a correct histological diagnosis of oligodendroglioma and to investigate a possible complementary role in selecting the best areas suitable for detecting 1p/19q codeletion using FISH analysis; 3) to study the role of microRNA in high grade gliomas. In order to obtain these goals large series of brain tumors were studied with DNA microarrays, immunohistochemistry and RT-PCR The results demonstrated that: - Overexpression of IGFBP-2 and CDC20 is highly related to glioblastomas and their immunopositivity can be useful for the identification of glioblastoma in small biopsies. - Nogo-A is the most useful and specific marker in differentiating oigodendrogliomas from other gliomas. Furthermore, using a Nogo-A driven FISH analysis, it is possible to identify a larger number of 1p19q codeletions in gliomas. - microRNAs can be studied in paraffin embedded tissues better than in fresh tissues. A series of six microRNA, significatively deregulated in glioblastomas, may represent a genetic signature with prognostic and predictive value and could constitute candidates for novel anti-cancer therapeutics.

BACKGROUND: Uterine serous carcinoma (USC) is an aggressive tumor, responsible for approximately half of endometrial carcinoma-related mortality. A subset of USC shows HER2 overexpression due to ERBB2 amplification, and a recent phase 2 trial demonstrated that these patients benefit from treatment with trastuzumab. Therefore, accurate assessment of HER2 status is critical to properly select patients for targeted therapy. However, previous work has shown a significant intratumoral heterogeneity of ERBB2 amplification in USC and Next Generation Sequencing (NGS) is (and will be) increasingly used in the identification of targetable or clinically relevant (such as POLE point mutations) molecular alterations in endometrial carcinoma. AIMS: To investigate the potential clinical impact of HER2 heterogeneity by examining HER2 status in paired endometrial biopsies, hysterectomy specimens, and metastatic lesions from patients with USC. To investigate the ability of a targeted NGS panel to detect ERBB2 amplification. MATERIALS AND METHODS: Cases of USC were retrospectively identified, for which FFPE tumoral tissue was available (biopsy, hysterectomy, and/or metastasis specimen from the same patient). HER2 expression was assessed by immunohistochemistry (IHC) on all samples and scored using the updated 2018 ASCO/CAP guidelines for testing in breast cancer as negative (0, 1+), equivocal (2+), or positive (3+). All cases which were scored as 2+, those with a discordant status (negative versus positive) between paired samples, and some more were tested by fluorescence in situ hybridization (FISH) for ERBB2 amplification status. A group of cases was also tested by NGS, comparing ERBB2 amplification as measured by NGS, IHC, and ISH. RESULTS: 70 patients resulted eligible for the heterogeneity-part of the project: 45 biopsies, 68 hysterectomies, and 71 metastases (multiple metastatic lesions from the same patient were available in 24 of 42 cases). Using combined IHC/FISH, HER2 positive status was observed in 9 of 68 primary USC (13%). By IHC, paired biopsy and hysterectomy were discordant in 1/43 (2%). Hysterectomy or biopsy and metastasis pairs showed discordance in 8/42 (19%) cases, while multiple metastatic lesions from a same patient in 3/24 (7%). Heterogeneity in HER2 amplification (as defined by Buza) within a single stained slide was present in 4/45 biopsies (9%), 21/68 hysterectomies (31%) and 2/71 metastasis (3%). 93 patients resulted eligible for the second part of the project (NGS). Using combined IHC/FISH, ERBB2 amplification was observed in 8 of 93 cases (9%). NGS identified the same 8 cases with copy number ≥6; all 85 others had copy number <6. CONCLUSIONS: Despite significant HER2 overexpression heterogeneity in over 30% of slides from hysterectomy specimens, there was excellent overall agreement (98%) in HER2 scores between paired biopsy and hysterectomy specimens. However, HER2 overexpression was discordant in 19% of hysterectomy-metastases pairs, suggesting that testing should be performed on a site of metastatic disease prior to the initiation of targeted therapy. In our series, NGS had 100% concordance with combined IHC/FISH in identifying ERBB2 amplification. NGS is highly accurate in detecting ERBB2 amplification in USC and provides an alternative to measurement by IHC and FISH.
BACKGROUND: Uterine serous carcinoma (USC) is an aggressive tumor, responsible for approximately half of endometrial carcinoma-related mortality. A subset of USC shows HER2 overexpression due to ERBB2 amplification, and a recent phase 2 trial demonstrated that these patients benefit from treatment with trastuzumab. Therefore, accurate assessment of HER2 status is critical to properly select patients for targeted therapy. However, previous work has shown a significant intratumoral heterogeneity of ERBB2 amplification in USC and Next Generation Sequencing (NGS) is (and will be) increasingly used in the identification of targetable or clinically relevant (such as POLE point mutations) molecular alterations in endometrial carcinoma. AIMS: To investigate the potential clinical impact of HER2 heterogeneity by examining HER2 status in paired endometrial biopsies, hysterectomy specimens, and metastatic lesions from patients with USC. To investigate the ability of a targeted NGS panel to detect ERBB2 amplification. MATERIALS AND METHODS: Cases of USC were retrospectively identified, for which FFPE tumoral tissue was available (biopsy, hysterectomy, and/or metastasis specimen from the same patient). HER2 expression was assessed by immunohistochemistry (IHC) on all samples and scored using the updated 2018 ASCO/CAP guidelines for testing in breast cancer as negative (0, 1+), equivocal (2+), or positive (3+). All cases which were scored as 2+, those with a discordant status (negative versus positive) between paired samples, and some more were tested by fluorescence in situ hybridization (FISH) for ERBB2 amplification status. A group of cases was also tested by NGS, comparing ERBB2 amplification as measured by NGS, IHC, and ISH. RESULTS: 70 patients resulted eligible for the heterogeneity-part of the project: 45 biopsies, 68 hysterectomies, and 71 metastases (multiple metastatic lesions from the same patient were available in 24 of 42 cases). Using combined IHC/FISH, HER2 positive status was observed in 9 of 68 primary USC (13%). By IHC, paired biopsy and hysterectomy were discordant in 1/43 (2%). Hysterectomy or biopsy and metastasis pairs showed discordance in 8/42 (19%) cases, while multiple metastatic lesions from a same patient in 3/24 (7%). Heterogeneity in HER2 amplification (as defined by Buza) within a single stained slide was present in 4/45 biopsies (9%), 21/68 hysterectomies (31%) and 2/71 metastasis (3%). 93 patients resulted eligible for the second part of the project (NGS). Using combined IHC/FISH, ERBB2 amplification was observed in 8 of 93 cases (9%). NGS identified the same 8 cases with copy number ≥6; all 85 others had copy number <6. CONCLUSIONS: Despite significant HER2 overexpression heterogeneity in over 30% of slides from hysterectomy specimens, there was excellent overall agreement (98%) in HER2 scores between paired biopsy and hysterectomy specimens. However, HER2 overexpression was discordant in 19% of hysterectomy-metastases pairs, suggesting that testing should be performed on a site of metastatic disease prior to the initiation of targeted therapy. In our series, NGS had 100% concordance with combined IHC/FISH in identifying ERBB2 amplification. NGS is highly accurate in detecting ERBB2 amplification in USC and provides an alternative to measurement by IHC and FISH.

Malignant cells exhibit an exceptional ability to maintain homeostasis in an hostile environment, upregulation of proteins involved in the stress response with an increase in the apoptosis resistance, and in diminishing cell senescence or permanent arrest of cell division. SEL1L is a member of endoplasmic-reticulum (ER)-associated protein degradation (ERAD)-specific ubiquitin ligase complex that functions in the detection, targeting, and degradation of malfolded and normal endoplasmic reticulum (ER) resident proteins in fisiologic or pathologic conditions. Past studies have focused on the role of SEL1L in various aspects of malignant transformation and tumorigenic processes, providing significant in vitro and in vivo evidences to link its increased expression to a decrease in breast tumor aggressiveness. In this study it has been suggested that SEL1L protein could be also a tumor breast markers with a prognostic and/or predictive response and this may be important in determining the successive therapeutic approach. In patients of Black African ethnicity, breast cancer strongly differ from Western populations in ethnicity, lifestyle and environmental exposures and is reportedly to be characterized by aggressive, poorly differentiated phenotype(s). To highlight possible differences between breast cancer in indigenous sub-Saharan African and European patients, two breast cancer case series, from Central Sudan (Khartoum) and Northern Italy (Milan), were compared for clinicopathological characteristics, expression of oestrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), Her-2/neu, and breast cancer subtypes and for SEL1L expression. SEL1L protein expression was evaluated by immunohistochemistry using the mouse MAb MSel1 raised against the NH2 terminus of the recombinant human SEL1L protein. Compared with the Italian series, the Sudanese breast cancer series showed younger age and worse prognostic features, including larger tumour size, higher grade and LN+ status, consistent with more advanced stage at disease diagnosis. Results showed that no clear significant differences between the Sudanese and Italian series were found for SEL1L expression levels combined with clinicopathological characteristics, including nodal involvement, tumor size, grade, with hormone receptor status (ER and/or PR), Her-2/neu status and with breast cancer subtypes (Luminal A, Luminal B, Her-2/neu+ and basal-like). The clinicopathological differences between breast cancer in indigenous sub-Saharan African and European patients probably reflects the young demographic structure of the Sudanese population, the lack of breast cancer prevention, the extreme rarity of healthcare centres able to treat breast cancer and, possibly, the influence of socio-cultural and logistic factors which could limit travel and access to healthcare. In conclusion, SEL1L protein expression is not a tumor marker however the role of SEL1L during tumorigenesis and in breast cancer needs further investigation.

Introduzione L’aborto spontaneo è l’evento clinico che determina l’interruzione di una gravidanza, senza intervento esterno, prima delle 20 settimane di gestazione. La sua incidenza è stimata tra il 28 e il 33% di tutte le gravidanze riconosciute, con una maggiore distribuzione del tasso di aborto in relazione all’aumento dell’età delle donne. I fattori di rischio sono molteplici e comprendo fattori anamnestici ed ambientali, patologie legate alla madre ed alterazioni genetiche dell’embrione. In particolare, le alterazioni cromosomiche dell’embrione sono causa di interruzione spontanea di gravidanza nel 50% dei casi e tra queste la percentuale maggiore è rappresentata dalle anomalie numeriche in cui si verificano variazioni del numero di cromosomi. Lo scopo di questa tesi è stato quello di identificare alcune delle principali anomalie cromosomiche numeriche, quale causa di aborto precoce, mediante l’indagine molecolare FISH (Fluorescent in situ hybridization) su campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE). Questo lavoro si pone poi l’obiettivo di stabilire la presenza di correlazioni tra anomalie cromosomiche e aspetti isto-patologici osservati nei campioni al fine di definire determinate caratteristiche isto-morfologiche predittive della presenza di alterazioni cromosomiche. È stato inoltre importante il confronto dei risultati derivati dal nostro campione di studio con quanto riportato in letteratura. Materiali e metodi È stato effettuato uno studio osservazionale retrospettivo su campioni di materiale abortivo da interruzione spontanea di gravidanza del primo trimestre pervenuti da gennaio 2017 ad aprile 2021 alla UOSD Centro diagnostica ginecopatologica e patologia feto-perinatale dell’Istituto Giannina Gaslini di Genova sia da pazienti dell’Istituto stesso, sia da sedi regionali per la centralizzazione della malattia trofoblastica gestazionale. I campioni, costituiti principalmente da residui deciduali e coriali, sono stati inizialmente allestiti per l'esame isto-morfologico e successivamente selezionati e preparati per l'analisi mediante FISH. Il tessuto selezionato per eseguire la FISH deve contenere una porzione rappresentativa delle strutture coriali di origine embrionale. Per l’analisi del tessuto sono state eseguite, oltre alla colorazione di routine con ematossilina ed eosina, reazioni immunoistochimiche con marker per actina muscolare liscia, CD31, CD45, CD146, ck18, Ki67, p63, p57 e plap. Per l'analisi FISH è stato scelto un pannello per lo studio dei cromosomi sessuali e dei cromosomi autosomici 9, 13, 15, 16, 18, 21 e 22, principalmente coinvolti nell’eziologia della patologia abortiva. Risultati Da gennaio 2017 ad aprile 2021 sono stati studiati 471 casi di aborti spontanei del primo trimestre di cui 125 con sospetto di malattia trofoblastica. L'età media delle pazienti è di 36 anni. Mediante lo studio isto-morfologico dei tessuti corio-deciduali è stata confermata la diagnosi di aborto spontaneo del primo trimestre. In 194 campioni sono state osservate alterazioni morfologiche indicative della presenza di anomalie cromosomiche quali irregolarità della ramificazione dei villi e del rivestimento trofoblastico, forme villari bizzarre, presenza di inclusioni e/o invaginazioni del rivestimento trofoblastico, fenomeni degenerativi dello stroma (idrope e degenerazione cerea) e ridotta vascolarizzazione. In 260 campioni la causa di aborto spontaneo è stata attribuita ad altri fattori eziologici (flogosi, stati disglicemici materni, stati disendocrini, dismetabolici, stati disreattivi/autoimmuni) mentre 17 casi sono risultati non valutabili. L'analisi mediante FISH è stata eseguita su 447 campioni selezionati: in 24 casi non è stata richiesta per via dell'esiguità del tessuto coriale presente nel campione. A causa della scarsa visualizzazione dei segnali di fluorescenza non sono risultati valutabili 84 casi. Sono state individuate 166 anomalie cromosomiche (45,7%), causa di aborto spontaneo. In 108 campioni sono state osservate variazioni del numero di singoli cromosomi: trisomie e monosomie. In particolare, è stata osservata con maggiore frequenza la trisomia del cromosoma 16. Eventi di poliploidia sono stati evidenziati in 58 campioni, con la triploidia osservata con maggior frequenza. Due casi hanno mostrato la presenza di una doppia trisomia. In 117 casi l’assenza di particolari alterazioni morfologiche della componente coriale ha trovato corrispondenza con l’assenza di anomalie dei cromosomi indagati mediante la FISH. Allo stesso modo è stata osservata corrispondenza tra la presenza di alterazioni isto-architetturali dei villi e presenza di anomalie cromosomiche accertate dalla FISH in 85 campioni. In 80 casi la presenza di alterazioni a livello morfologico non è stata confermata dalla FISH mentre in 76 campioni risultati normali istologicamente è stata osservata la presenza di un’anomalia cromosomica. Nonostante queste discrepanze, l’associazione tra l’esame istologico di campioni di materiale abortivo e l’indagine mediante FISH è risultata statisticamente significativa (p<0,05). Conclusioni La patologia abortiva ha una elevata incidenza e un forte coinvolgimento psicologico per cui la diagnosi corretta ed esaustiva è di grande importanza. L'esame isto-morfologico dei campioni di materiale abortivo fissati in formalina e inclusi in paraffina è stato affiancato in questo studio all'esame mediante FISH per l'individuazione della presenza di determinate anomalie numeriche cromosomiche causa di aborto. La percentuale di anomalie cromosomiche osservate (45,7%) e il riscontro di una maggior frequenza della trisomia 16 tra le alterazioni del numero dei singoli cromosomi è in linea con quanto riportato dai dati in letteratura. Un dato importante che emerge da questo lavoro è l’associazione significativa tra le due metodiche utilizzate per la diagnosi, nonostante in diversi casi siano state osservate delle discordanze. La mancata conferma della presenza di anomalie mediante FISH nei casi in cui sono state osservate alterazioni isto-architetturali dei villi a livello istologico, può essere dovuta al limitato pannello utilizzato per lo studio dei cromosomi. Di più difficile interpretazione risulta la discordanza tra l’assenza di specifiche alterazioni a livello morfologico nei casi in cui la FISH mostra invece un’anomalia cromosomica numerica. In questi casi è possibile ipotizzare che l’alterazione non sia così grave da determinare una modificazione dell’architettura del tessuto. I risultati ottenuti da questa analisi mostrano che è opportuno affiancare all’esame istologico del tessuto abortivo l’analisi mediante FISH per fornire una diagnosi più completa che sia di supporto ai clinici e alle pazienti che vogliono pianificare future gravidanze. Ci spingono inoltre ad implementare la ricerca per ampliare ulteriormente la casistica e arricchire i pochi dati ad oggi presenti in letteratura riguardo la patologia abortiva spontanea. Un ulteriore spunto, avvalorato dall’esiguità dei dati in merito, consiste nell’approfondimento della ricerca sulle doppie trisomie che nella nostra casistica sono state evidenziate in 2 campioni.
Background and Objectives Spontaneous abortion, defined as loss of a pregnancy without outside intervention before 20 weeks gestation, has an incidence estimated between 28% and 33% of clinically recognized pregnancies. Many risk factors have been documented and approximately the 50% of spontaneous abortion is due to chromosomal anomalies, in particular numerical alterations, known as “aneuploidies”. The aim of this study was to assess the presence of numerical chromosomal abnormalities in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) abortive material by fluorescent in situ hybridization (FISH) and establish a possible correlation with spontaneous abortion events. Furthermore, another goal was to ascertain a correlation of chromosomal aneuploidies with histomorphology in order to identify those morphological features possibly predicting chromosomal abnormalities. Materials and Methods A retrospective observational study was performed on 471 samples collected from women who experienced a first trimester spontaneous abortion referring to the period between January 2017 and April 2021, at the Pathology Laboratory of Giannina Gaslini Institute. The mean age of patients was 36 years. Abortive specimens were routinely processed for histopathological diagnosis by hematoxylin/eosin staining and by a panel of immunohistochemistry markers: smooth muscle actin, CD31, CD45, CD146, ck 18, Ki67, p63, p57 and plap. Then, FISH analysis was performed thanks to a set of probes identifying both sex and autosomal chromosomes (9, 13, 15, 16, 18, 21 and 22) mainly involved in pathology of abortion. Results Histopathological examination of abortive material confirmed the spontaneous abortion diagnosis for all the 471 samples. In 194/471 (41.2%), we observed morphological alterations suggestive of chromosomal anomalies, including irregular chorionic villi branching, throphoblastic invagination and inclusion, stroma with edema and reduced vascularisation. For 260/471 (55.2%) abortive specimens, the cause of miscarriage was attributable to other factors, for example co-occurring pathological maternal conditions. For the remaining 17 abortive specimens the histomorphology could not explain the cause of abortion. FISH analysis was successfully performed on 363/471 (77.1%) samples and a total of 166 chromosomal aneuploidies were identified. Different chromosome alterations were found in 108/166 (65.1%) spontaneous abortion specimens and most of them were trisomy (mainly involving chromosome 16) and monosomy. Two cases showed a double trisomy. Poliploidy was observed in 58/166 (34.9%) samples. Comparison between histomorphology and FISH was possible in 358 samples: no histomorphology/FISH anomalies were found in 117 cases; on the contrary, for 85 samples was possible to appreciate both structural alterations of the villi and the presence of chromosomal abnormalities. Correlation between histomorphology of abortive material and analysis by FISH was statistically significant (p<0,05). However, we observed 156 discrepant samples: morphological alterations of chorionic villi were not confirmed by FISH in 80 cases, while a chromosomal aneuploidy was observed in 76 structurally normal samples. Conclusion In this study, histomorphology of abortive material in FFPE and FISH for detection of specific chromosomal aneuploidies, represented useful tools to establish the possible causes of miscarriage. The analysis of discordant cases further revealed that the combined use of both approaches was able to better clarify the mechanisms of abortion. Since few data are already existing in literature, the overall results provide a contribute to improve the knowledge about abortion diagnosis, really supportive to clinicians and patients management.

Il carcinoma squamoso orale (CSO) è spesso preceduto da lesioni definite potenzialmente maligne tra cui la leucoplachia e il lichen ma una diagnosi precoce avviene ancora oggi in meno della metà dei casi. Inoltre spesso un paziente trattato per CSO svilupperà secondi tumori. Scopo del lavoro di ricerca è stato: 1) Studiare, mediante metodica di next generation sequencing, lo stato di metilazione di un gruppo di geni a partire da prelievi brushing del cavo orale al fine di identificare CSO o lesioni ad alto rischio di trasformazione maligna. 2) Valurare la relazione esistente tra sovraespressione di p16INK4A e presenza di HPV in 35 pazienti affetti da lichen 3) Valutare la presenza di marker istopatologici predittivi di comparsa di seconde manifestazioni tumorali 4) valutare la relazione clonale tra tumore primitivo e metastasi linfonodale in 8 pazienti mediante 2 metodiche di clonalità differenti: l’analisi di mtDNA e delle mutazioni del gene TP53. I risultati hanno mostrato: 1) i geni ZAP70 e GP1BB hanno presentato un alterato stato di metilazione rispettivamente nel 100% e nel 90,9% di CSO e lesioni ad alto rischio, mentre non sono risultati metilati nei controlli sani; ipotizzando un ruolo come potenziali marcatori per la diagnosi precoce nel CSO. 2)Una sovraespressione di p16INK4A è risultata in 26/35 pazienti affetti da lichen ma HPV-DNA è stato identificato in soli 4 campioni. Nessuna relazione sembra essere tra sovraespressione di p16INK4A e virus HPV. 3)L’invasione perineurale è risultato un marker predittivo della comparsa di recidiva locale e metastasi linfonodale, mentre lo stato dei margini chirurgici si è rilevato un fattore predittivo per la comparsa di secondi tumori primitivi 4) Un totale accordo nei risultati c’è stato tra analisi di mtDNA e analisi di TP53 e le due metodiche hanno identificato la presenza di 4 metastasi linfonodali non clonalmente correlate al tumore primitivo.
Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is often preceded by Potentially Malignant Lesions, Leukoplakia and Lichen Planus (LP), but still today is usually diagnosed in advanced stage. Additionally patients treated for OSCC have a good chance to develop a second primary OSCC. The purpose of the research was: 1) to assess, by bisulfite Next Generation Sequencing, the methylation status of a list of candidate genes obtained from oral brushing specimens to early detect OSCC using non-invasive procedures. 2) to yield more insights into the relationship between p16INK4A over-expression and the presence of HPV-DNA in 35 LP samples. 3) to identify the clinicopathologic parameters significantly related to a second loco-regional event in a population of 180 patients treated for primary OSCC 4) to evaluate the relationship between primary OSCC and lymph node metastasis in 8 patients using two different 2 clonality tests: mt-DNA D-loop and TP53 sequence analysis. The results showed that: 1) ZAP70 and GP1BB showed an aberrant methylation status respectively in 100% and 90,9% of OSCC and High Risk lesions, while resulted unmethylated in normal healthy donors. DNA methylation analysis of GP1BB and ZAP70 seems to be a promising non invasive tool to early detect OSCC from oral brushing specimens. 2) p16INK4A over-expression was found in 26/35 LP samples, whereas HPV was found in 4/35 lesions: 3 low-risk HPV and 1 high-risk HPV. P16INK4A overexpression is not correlated with HPV in patients with LP. 3) Perineural invasion was significantly related to lymph-node metastasis (18% vs 8%) and Local Recurrence (15% vs 5%), while the status of the surgical margin resulted an independent factor influencing Second Primary Tumor. 4) The results from mtDNA analysis showed a good agreement with results of p53 mutation analysis and revealed the presence of 4/11 neck nodal metastases not phylogenetically related respect to primary tumor.

Il carcinoma squamoso orale (CSO) è spesso preceduto da lesioni definite potenzialmente maligne tra cui la leucoplachia e il lichen ma una diagnosi precoce avviene ancora oggi in meno della metà dei casi. Inoltre spesso un paziente trattato per CSO svilupperà secondi tumori. Scopo del lavoro di ricerca è stato: 1) Studiare, mediante metodica di next generation sequencing, lo stato di metilazione di un gruppo di geni a partire da prelievi brushing del cavo orale al fine di identificare CSO o lesioni ad alto rischio di trasformazione maligna. 2) Valurare la relazione esistente tra sovraespressione di p16INK4A e presenza di HPV in 35 pazienti affetti da lichen 3) Valutare la presenza di marker istopatologici predittivi di comparsa di seconde manifestazioni tumorali 4) valutare la relazione clonale tra tumore primitivo e metastasi linfonodale in 8 pazienti mediante 2 metodiche di clonalità differenti: l’analisi di mtDNA e delle mutazioni del gene TP53. I risultati hanno mostrato: 1) i geni ZAP70 e GP1BB hanno presentato un alterato stato di metilazione rispettivamente nel 100% e nel 90,9% di CSO e lesioni ad alto rischio, mentre non sono risultati metilati nei controlli sani; ipotizzando un ruolo come potenziali marcatori per la diagnosi precoce nel CSO. 2)Una sovraespressione di p16INK4A è risultata in 26/35 pazienti affetti da lichen ma HPV-DNA è stato identificato in soli 4 campioni. Nessuna relazione sembra essere tra sovraespressione di p16INK4A e virus HPV. 3)L’invasione perineurale è risultato un marker predittivo della comparsa di recidiva locale e metastasi linfonodale, mentre lo stato dei margini chirurgici si è rilevato un fattore predittivo per la comparsa di secondi tumori primitivi 4) Un totale accordo nei risultati c’è stato tra analisi di mtDNA e analisi di TP53 e le due metodiche hanno identificato la presenza di 4 metastasi linfonodali non clonalmente correlate al tumore primitivo.
Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) is often preceded by Potentially Malignant Lesions, Leukoplakia and Lichen Planus (LP), but still today is usually diagnosed in advanced stage. Additionally patients treated for OSCC have a good chance to develop a second primary OSCC. The purpose of the research was: 1) to assess, by bisulfite Next Generation Sequencing, the methylation status of a list of candidate genes obtained from oral brushing specimens to early detect OSCC using non-invasive procedures. 2) to yield more insights into the relationship between p16INK4A over-expression and the presence of HPV-DNA in 35 LP samples. 3) to identify the clinicopathologic parameters significantly related to a second loco-regional event in a population of 180 patients treated for primary OSCC 4) to evaluate the relationship between primary OSCC and lymph node metastasis in 8 patients using two different 2 clonality tests: mt-DNA D-loop and TP53 sequence analysis. The results showed that: 1) ZAP70 and GP1BB showed an aberrant methylation status respectively in 100% and 90,9% of OSCC and High Risk lesions, while resulted unmethylated in normal healthy donors. DNA methylation analysis of GP1BB and ZAP70 seems to be a promising non invasive tool to early detect OSCC from oral brushing specimens. 2) p16INK4A over-expression was found in 26/35 LP samples, whereas HPV was found in 4/35 lesions: 3 low-risk HPV and 1 high-risk HPV. P16INK4A overexpression is not correlated with HPV in patients with LP. 3) Perineural invasion was significantly related to lymph-node metastasis (18% vs 8%) and Local Recurrence (15% vs 5%), while the status of the surgical margin resulted an independent factor influencing Second Primary Tumor. 4) The results from mtDNA analysis showed a good agreement with results of p53 mutation analysis and revealed the presence of 4/11 neck nodal metastases not phylogenetically related respect to primary tumor.

Nell’ambito della patologia gastroenterica del suino sono comprese alcune malattie sostenute da batteri spirillari gram negativi, di cui sono disponibili numerose trattazioni riguardanti, soprattutto, l'aspetto epidemiologico e patogenetico. Per alcuni di questi agenti microbici, e per le relative manifestazioni patologiche, poco si conosce nel cinghiale selvatico, animale correlato filogeneticamente al suino domestico, ma compreso in un’ecologia completamente differente. Da queste premesse è nato un approccio di ricerca e studio del comportamento di questi microrganismi in una metapopolazione di cinghiali, abbattuti durante il piano di controllo della popolazione densità-dipendente nel Parco dei Gessi e Calanchi dell’Abbadessa (BO), cercando di rapportare le conoscenze riportate in letteratura sul suino domestico con quanto è scaturito dalle indagini condotte sul cinghiale selvatico. In particolare è stata indagata con metodica immunoistochimica la presenza di Lawsonia intracellularis, patogeno del suino responsabile di Enterite Proliferativa (EP), in secondo luogo sono state condotte indagini batteriologiche e istologiche da stomaco e intestino, finalizzate all’isolamento di microrganismi spirillari dei generi Campylobacter e Helicobacter, da correlare all’eventuale presenza di lesioni infiammatorie e ulcerative gastriche o enteriche valutate secondo sistemi a punteggio ottenuti dalla bibliografia o realizzati in base alla tipologia di infiltrato cellulare e alla sua localizzazione. In ultimo, a fini comparativi con uno studio condotto nel 2002-2004 nello steso Parco Regionale, sono stati monitorati i livelli di antibioticoresistenza di indicatori fecali usando metodiche internazionali standardizzate (Escherichia coli e Enterococcus faecium.) nonché su un numero significativo di isolati di Campylobacter lanienae, per ottenere indicazioni preliminari sull’andamento nei 10 anni trascorsi dello stato di inquinamento da farmaco del Parco stesso. I risultati ottenuti permettono di ampliare le conoscenze sulla flora enterica del cinghiale selvatico e pongono questioni di sicurezza pubblica sulla gestione dei mammiferi selvatici.
In the field of swine pathology many studies are available about some gastrointestinal bacteria like Lawsonia intracellularis, Helicobacter spp. and Campylobacter spp.. Less studies have been performed for the same bacteria on wild boar, which is strongly phylogenetically related with domestic swine but lives in a different ecological habitat. The aim of this study is to define if, and how, these bacteria can be related with pathological findings on gastrointestinal tracts in wild boar, and to compare these findings with those reported for domestic swine. The wild boar samples have been collected during a culling project in the Regional Park of Gessi Bolognesi e Calanchi dell’Abbadessa (BO) in Italy during the year 2011. Infection with Lawsonia intracellularis has been investigated with immunohistochemistry, while the research of Helicobacter spp. and Campylobacter spp. has been performed with culturing. The identification of isolates has been performed with PCR, multiplex-PCR or RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR) and the phenotypic characters has been investigated for isolates of Helicobacter genus. Slides of gastric and intestinal tracts have been evaluated with different scoring methods taken from literature or built considering cellular inflammatory types and localization. Bacteriological and pathological findings have been correlated with statistical analysis. Finally, in order to compare data with a previous study on antimicrobial resistance performed in the same area in 2002-2004 (Rossi et al. 2007), antimicrobial disk diffusion assays, performed following international standardized methods, have been realized on fecal indicators (Escherichia coli and Enetrococcus faecium) isolated from the culled wild boars. The MIC (Minimal Inhibitory Concentration) of some isolates of Campylobacter lanienae has been evaluated too. Obtained results can implement the knowledge about the gastrointestinal flora of wild boars and can put question on public safety in wild mammals.

Nell’ambito della patologia gastroenterica del suino sono comprese alcune malattie sostenute da batteri spirillari gram negativi, di cui sono disponibili numerose trattazioni riguardanti, soprattutto, l'aspetto epidemiologico e patogenetico. Per alcuni di questi agenti microbici, e per le relative manifestazioni patologiche, poco si conosce nel cinghiale selvatico, animale correlato filogeneticamente al suino domestico, ma compreso in un’ecologia completamente differente. Da queste premesse è nato un approccio di ricerca e studio del comportamento di questi microrganismi in una metapopolazione di cinghiali, abbattuti durante il piano di controllo della popolazione densità-dipendente nel Parco dei Gessi e Calanchi dell’Abbadessa (BO), cercando di rapportare le conoscenze riportate in letteratura sul suino domestico con quanto è scaturito dalle indagini condotte sul cinghiale selvatico. In particolare è stata indagata con metodica immunoistochimica la presenza di Lawsonia intracellularis, patogeno del suino responsabile di Enterite Proliferativa (EP), in secondo luogo sono state condotte indagini batteriologiche e istologiche da stomaco e intestino, finalizzate all’isolamento di microrganismi spirillari dei generi Campylobacter e Helicobacter, da correlare all’eventuale presenza di lesioni infiammatorie e ulcerative gastriche o enteriche valutate secondo sistemi a punteggio ottenuti dalla bibliografia o realizzati in base alla tipologia di infiltrato cellulare e alla sua localizzazione. In ultimo, a fini comparativi con uno studio condotto nel 2002-2004 nello steso Parco Regionale, sono stati monitorati i livelli di antibioticoresistenza di indicatori fecali usando metodiche internazionali standardizzate (Escherichia coli e Enterococcus faecium.) nonché su un numero significativo di isolati di Campylobacter lanienae, per ottenere indicazioni preliminari sull’andamento nei 10 anni trascorsi dello stato di inquinamento da farmaco del Parco stesso. I risultati ottenuti permettono di ampliare le conoscenze sulla flora enterica del cinghiale selvatico e pongono questioni di sicurezza pubblica sulla gestione dei mammiferi selvatici.
In the field of swine pathology many studies are available about some gastrointestinal bacteria like Lawsonia intracellularis, Helicobacter spp. and Campylobacter spp.. Less studies have been performed for the same bacteria on wild boar, which is strongly phylogenetically related with domestic swine but lives in a different ecological habitat. The aim of this study is to define if, and how, these bacteria can be related with pathological findings on gastrointestinal tracts in wild boar, and to compare these findings with those reported for domestic swine. The wild boar samples have been collected during a culling project in the Regional Park of Gessi Bolognesi e Calanchi dell’Abbadessa (BO) in Italy during the year 2011. Infection with Lawsonia intracellularis has been investigated with immunohistochemistry, while the research of Helicobacter spp. and Campylobacter spp. has been performed with culturing. The identification of isolates has been performed with PCR, multiplex-PCR or RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR) and the phenotypic characters has been investigated for isolates of Helicobacter genus. Slides of gastric and intestinal tracts have been evaluated with different scoring methods taken from literature or built considering cellular inflammatory types and localization. Bacteriological and pathological findings have been correlated with statistical analysis. Finally, in order to compare data with a previous study on antimicrobial resistance performed in the same area in 2002-2004 (Rossi et al. 2007), antimicrobial disk diffusion assays, performed following international standardized methods, have been realized on fecal indicators (Escherichia coli and Enetrococcus faecium) isolated from the culled wild boars. The MIC (Minimal Inhibitory Concentration) of some isolates of Campylobacter lanienae has been evaluated too. Obtained results can implement the knowledge about the gastrointestinal flora of wild boars and can put question on public safety in wild mammals.

The transferrin receptor (TFR-1) has been found to be overexpressed in several solid tumors in humans and, in clinical oncology, has therefore been exploited in a selective anticancer therapy using nanotechnology. The ferritin (HFn), a molecule able to recognize TFR-1, was used to create a nanocage loaded with doxorubicin HFn(DOX). In veterinary medicine there are few studies that evaluate the expression of TFR-1 in tumors especially in mammary cancer and, even fewer are the studies that use it for therapy. The goal of this study is therefore the evaluation of TFR-1 expression in malignant mammary tumors of cats and dogs, either in tumor tissues and in cancer cell lines, and additionally to demonstrate the efficacy of HFn(DOX) in feline and canine mammary tumor cell lines. Interestingly, on tumor sections of different degrees of malignancy, we observed that in cats, the level of TFR-1 protein expression increases with the progression of malignancy, while in the dog a greater expression of the receptor has been identified on tumor sections compared to healthy mammary gland. As regards to the efficacy of the use of HFn(DOX), in feline metastatic mammary cancer cells line, a lower cell proliferation has been observed compared to the administration of the drug alone, at specific concentrations and time points (specifically 0.01 µM after 72 hours from treatment and 0.1 µM after 48 and 72 hours). In dogs, on the other hand, HFn(DOX) was effective only in tumor cells derived from a primary cancer at higher concentrations (5 µM and 12.08 µM after 72 hours) than those used in the cats. Apparently then, canine mammary cancer cells resulted more resistant to doxorubicin than the counterpart in cats, as in the dog it was necessary to use higher concentrations of drug either linked to the nanocage and free. The results of this preliminary study confirmed the presence of the TFR-1 in the mammary tumor of cats and dogs, highlighting a correlation of its expression with the degree of tumor malignancy in particular in the cat, suggesting that the use of engineered nanomolecules could be an effective therapeutic option for mammary cancer in this animal species. For the dog, further studies are mandatory, including more cell lines, or using the nanocage loaded with other drugs. In conclusion, the study demonstrated that the use of engineered molecules that selectively bind to specific receptors over-expressed on neoplastic cells is a promising field of study for new therapeutic horizons also in veterinary medicine.
The transferrin receptor (TFR-1) has been found to be overexpressed in several solid tumors in humans and, in clinical oncology, has therefore been exploited in a selective anticancer therapy using nanotechnology. The ferritin (HFn), a molecule able to recognize TFR-1, was used to create a nanocage loaded with doxorubicin HFn(DOX). In veterinary medicine there are few studies that evaluate the expression of TFR-1 in tumors especially in mammary cancer and, even fewer are the studies that use it for therapy. The goal of this study is therefore the evaluation of TFR-1 expression in malignant mammary tumors of cats and dogs, either in tumor tissues and in cancer cell lines, and additionally to demonstrate the efficacy of HFn(DOX) in feline and canine mammary tumor cell lines. Interestingly, on tumor sections of different degrees of malignancy, we observed that in cats, the level of TFR-1 protein expression increases with the progression of malignancy, while in the dog a greater expression of the receptor has been identified on tumor sections compared to healthy mammary gland. As regards to the efficacy of the use of HFn(DOX), in feline metastatic mammary cancer cells line, a lower cell proliferation has been observed compared to the administration of the drug alone, at specific concentrations and time points (specifically 0.01 µM after 72 hours from treatment and 0.1 µM after 48 and 72 hours). In dogs, on the other hand, HFn(DOX) was effective only in tumor cells derived from a primary cancer at higher concentrations (5 µM and 12.08 µM after 72 hours) than those used in the cats. Apparently then, canine mammary cancer cells resulted more resistant to doxorubicin than the counterpart in cats, as in the dog it was necessary to use higher concentrations of drug either linked to the nanocage and free. The results of this preliminary study confirmed the presence of the TFR-1 in the mammary tumor of cats and dogs, highlighting a correlation of its expression with the degree of tumor malignancy in particular in the cat, suggesting that the use of engineered nanomolecules could be an effective therapeutic option for mammary cancer in this animal species. For the dog, further studies are mandatory, including more cell lines, or using the nanocage loaded with other drugs. In conclusion, the study demonstrated that the use of engineered molecules that selectively bind to specific receptors over-expressed on neoplastic cells is a promising field of study for new therapeutic horizons also in veterinary medicine.

SUMMARY A. OUTCOME OF PATIENTS PRESENTING THEMSELVES TO THE EMERGENCY DEPARTMENT WITH CHEST PAIN Background. Chest pain is one of the most common symptoms presented to the emergency department. It actually accounts for 5% - 8% of the total visits at the emergency room. Yellow triage tag is mainly assigned to patients with chest pain, when there are no alterations in their vital functions. ‘Short-stay observation unit’ is sometimes used for patients suffering from chest pain, which consists of additional monitoring in a specialised area of the emergency department, in order to exclude any case with high probability of acute coronary disease. The following table below shows the results of a retrospective study conducted at the Emergency Department of the “Ospedale dell’Angelo”, hospital located in the Venetian mainland of the Veneto region, in Italy. The study period was between 24th May 2010 and 23rd May 2011. The objective of the study was: -to investigate the outcome of patients with chest pain presenting to an emergency department; - to determine if triage is suitable for identifying chest pain with risk of acute coronary disease; -to evaluate if a ‘short-stay observation unit’ is useful and effective in case of undefined chest pain, that is potentially at risk of acute coronary disease. The results are as follows: 3,980 cases of chest pain were analyzed, which accounted for 4.71% of the 84,554 total visits to the emergency department during the period of the study. Among these, 2,449 patients (61.5%) were discharged, 714 (18.0%) were hospitalized, 4 (0.1%) died and 813 (20.4%) were transferred to short-stay intensive observation for further clinical bioumoral and electrocardiographic monitoring, and / or possible ergometric test. During primary triage, a red or yellow tag was assigned to 78.8% of cases of chest pain and a green or white tag was assigned to 21.2% of cases. The conclusive diagnosis revealed an acute coronary heart disease in 39.9% (285 patients) of the 714 patients who were directly admitted to the emergency room. Of the 813 patients submitted to short-stay observation unit, 73.4% (597 cases) were discharged, whereas 26.6% (216 cases) were admitted. Of 24.5% (199 cases) of the patients submitted to short-stay observation unit, 15.1% (30 cases) were discharged for chronic stable coronary disease and 84.9% (169 cases) were hospitalized for acute coronary syndrome. Finally, 454 patients with acute coronary disease were admitted to the emergency room and to short-stay observation unit, which accounted for 11.4% of the patients presenting themselves to the emergency department with chest pain. The death of four patients was due to complications of acute coronary disease. Furthermore, there was a prevalence of males over females among the patients admitted (64.4% males vs. 35.6% females). Triage proved to be sufficiently sensitive and specific in distinguishing the cases of chest pain for acute coronary disease at high risk from those at low risk. In fact, during primary triage the 78.8% of cases of chest pain were given a red or yellow tag (i.e., potentially life – threatening cases), and the remaining 21.2% of cases were given a green or white tag (therefore no life-threatening). The majority of patients who were given a green or white tag was sent home (84.3% vs. 55.4% of patients with a red or yellow tag), whereas a prevalent percentage of patients who were given a red or yellow tag was hospitalized (21%) or led to short-stay observation unit for further monitoring (23.5%). Patients used to stay in short-stay observation units slightly over 23 hours (23 hours and 32 minutes). Short-stay observation of chest pain at risk of acute coronary disease - in both patients with a yellow tag (high risk) and those with a green or white tag (low or intermediate risk) - turned out to be useful in reducing 'inappropriate' hospitalizations for nonspecific chest pain. In many cases it also allowed a rapid exclusion of acute coronary disease by means of telemetry monitoring, transthoracic echocardiography and ergometric tests, as well as cardiology specialist assessment. Conclusions Despite being a frequent symptom of presentation to the emergency department, acute chest pain and the risks attached require rapid clinical diagnosis and sometimes a diversified approach. If the cause of chest pain is not correctly identified, it could lead to fatal effects on the outcome of patients. Therefore, the intensive short-stay observation unit corresponds to the Chest Pain Unit, where patients with chest pain are further 'examined' to come to a definitive diagnosis, optimizing therapeutic - diagnostic treatments and the available resources. B. ANALYSIS OF IN-HOSPITAL DEATHS IN AN EMERGENCY DEPARTMENT Background. Dealing with critical health and life-threatening conditions is one of the main functions of the emergency department. During the initial assessment of the critically ill patient, assessment and stabilization processes have to be carried out in a very short period of time by following a step by step system, according to a scale of priorities (ABCD); shared and encoded diagnostic and therapeutic workups are often used to assess and stabilize the patient. Nevertheless, some life-threatening situations result in death. This is a retrospective study, conducted at the Emergency Department of the “Ospedale dell’Angelo” located in Mestre, in the north east of Italy. The purpose of the study was: - To analyze the most common causes of death in patients presenting themselves to an emergency department; - To evaluate the autopsy rate among in-hospital deaths, defined as the ratio between the number of autopsies carried out and the total number of deaths examined; - To evaluate the accuracy of clinical diagnosis made by an emergency department at the time of death, taking as a reference standard the autopsy diagnosis. In-hospital deaths were examined between June 2008 and December 2011. Results During the period between June 2008 and December 2011, the total admissions to the emergency room in Mestre amounted to 284,827 cases. Patients who died during this period amounted to 223 persons, representing 0.078% of the total admissions. They presented the following characteristics: 28 cases in 2008, 14 males and 14 females, 50 cases in 2009, 24 males and 26 females; 83 cases in 2010, 41 males and 41 females, 62 cases in 2011, 27 males and 35 females. During the period taken into account (2008-2011), patients who died were 116 females and 107 males, who accounted for, respectively, 52.02% and 47.98% of in-hospital deaths. The average age of females was 83.42 ± 16.76 years ds (cases between 33 and 106 years), whereas the average age of males was 73 years ± 3.53 ds (cases between 22 and 96 years). Among the causes of death, heart, pulmonary and cardiopulmonary diseases represented more than 1/3 of in-hospital deaths both for males and females. Of 223 deaths, an autopsy was required in 12.55% of cases, equal to 28 patients (13 males and 15 females; the average age was, respectively, 59 and 70.2 years). Of 28 autopsy reports, only 23 cases were analyzed, accounting for 82.14%. In evaluating the correlation between the ‘discharge’ diagnosis and the ‘autopsy’ diagnosis, the 23 cases were divided as follows: in 16 cases (69.57%) there was no correlation, whereas in 7 cases (30.43%), the correlation was positive since both diagnoses were equivalent. In the analysis of in-hospital deaths, the average age of death for males was significantly lower than for females (59 vs. 70.26 years). The 'nonspecific' diagnoses related to cardiac arrest and / or cardio respiratory arrest, among others, accounted for 29.2% of cases in males and 37.07% of cases in females. In addition, the most frequent causes of death in females were those related to sepsis and multi-organ dysfunction. The causes of death due to traumatic events, especially road accident traumas, were more frequent in males than in females (15 vs. 3 cases). The analysis of the causes of death in patients undergoing autopsy showed that the totality of cases suffered from severe life-threatening diseases, that rapidly led to death. The most common diseases were heart and vascular diseases, in particular abdominal and brain vascular diseases. Conclusions Innovative therapeutic and instrumental tools do not always contribute to determine the true cause of death in patients. At times, the clinical diagnosis made by physicians is not accurate and it does not reflect the post-mortem examination. The anatomo-pathological assessment is not only extremely useful in medical practice in order to determine the cause of death, but it is also a source of knowledge to improve therapeutic-diagnostic workups, the outcome of the patients, as well as the clinical practice of physicians.
RIASSUNTO Di seguito, si sintetizza lo studio sull’esito dei pazienti che accedono al dipartimento di emergenza per dolore toracico (A) e una breve analisi dei decessi intraospedalieri (B) occorsi nel Pronto Soccorso dell’Ospedale dell’Angelo di Mestre, sito nella provincia veneziana del Veneto. A. OUTCOME DEI PAZIENTI CHE ACCEDONO AL DIPARTIMENTO DI EMERGENZA PER DOLORE TORACICO DELL’OSPEDALE DELL’ANGELO DI MESTRE Introduzione. Il dolore toracico è frequente motivo di accesso ad un dipartimento di emergenza. Rappresenta circa il 5-8% degli ingressi in un Pronto Soccorso (PS). In relazione al metodo di triage, il dolore toracico viene prevalentemente associato al codice cromatico giallo in assenza di alterazioni delle funzioni vitali. Talora, per escludere i casi ad alta probabilità di patologia coronarica acuta tra i pazienti affetto da dolore toracico, si ricorre all’Osservazione Breve Intensiva (OBI) che consiste in un ulteriore monitoraggio clinico strumentale del malato in un’area dedicata del dipartimento di emergenza. Si riporta, di seguito, i risultati di uno studio retrospettivo condotto presso l’Unità Operativa del Pronto Soccorso dell’Ospedale dell’Angelo, situato nella terraferma veneziana della regione Veneto. Il periodo di studio era compreso tra il 24 maggio 2010 e il 23 maggio 2011. Lo scopo dello studio era: -.verificare l’outcome dei pazienti affetti da dolore toracico che accedevano ad un dipartimento di emergenza; - analizzare l’appropriatezza del metodo di triage nell’individuare il dolore toracico a rischio di patologia coronarica acuta; -.valutare l’utilità e l’efficacia dell’”Unità dell’Osservazione Breve” (OBI) nei casi dolore toracico a genesi indefinita, ma a potenziale rischio di patologia coronarica acuta. I risultati sono i seguenti: Sono stati analizzati 3980 casi di dolore toracico, che rappresentavano il 4,71% degli 84.554 accessi totali al dipartimento di emergenza nell’anno considerato. Di questi, 2449 (61,5%) pazienti sono stati inviati a domicilio, 714 (18,0%) sono stati ospedalizzati, 4 sono deceduti (0,1%) e 813 casi (20,4%) trasferiti in OBI per ulteriore monitoraggio clinico, bioumorale ed elettrocardiografico e/o eventuale test ergometrico. Dei 714 pazienti, direttamente ricoverati dal pronto soccorso, la diagnosi conclusiva ha permesso di rilevare, nel 39,9% dei casi (285 pazienti), una patologia cardiaca coronarica acuta. I 4 pazienti deceduti erano evoluti in exitus per complicanze legate alla patologia coronarica acuta. Degli 813 pazienti transitati in OBI, il 73,4% veniva dimesso (597 casi), mentre il 26,6% veniva ricoverato (216 casi). Nel 24,5% dei casi transitati in OBI (199 casi), il 15,1% (30 casi) veniva dimesso per patologia coronarica cronica e stabile mentre l’84,9% (169 casi) veniva ricoverato per sindrome coronarica acuta. In definitiva, venivano ricoverati, dal Pronto Soccorso e dall’OBI, 454 pazienti affetti da patologia coronarica acuta che rappresentavano l’11,4 % dei pazienti che erano giunti al Pronto Soccorso per dolore toracico. Inoltre, tra i pazienti ricoverati vi è una prevalenza dei maschi rispetto alle femmine (maschi 64,4% vs 35,6% femmine). Il metodo di triage si è dimostrato sufficientemente sensibile e specifico nel distinguere i casi di dolore toracico ad alto rischio per patologia coronarica acuta da quelli a basso rischio. Infatti, al triage d’ingresso è stato attribuito il codice rosso o giallo (casi potenzialmente life – threatening) nel 78,8% dei casi di dolore toracico, mentre il codice verde o bianco (casi non ‘life –threatening’) nel rimanente 21,2 % dei pazienti. Per i casi codificati con codice cromatico verde o bianco vi era una prevalenza di invio a domicilio (84,3% vs il 55,4% dei pazienti con codice cromatico rosso o giallo), mentre per quelli codice cromatico rosso o giallo vi era una percentuale relativamente prevalente di pazienti ricoverati (21%) o avviati ad ulteriore monitoraggio in OBI (23,5%). La durata media di permanenza in OBI era di poco superiore alle 23 ore ( 23 ore e 32 minuti). Per i casi di dolore toracico ad alta probabilità per patologia coronarica acuta tra i soggetti con codice cromatico giallo e tra quelli con codice cromatico verde o bianco a rischio intermedio o basso, ‘l’Osservazione Breve Intensiva’ si e’ dimostrata utile nel ridurre i ricoveri ‘inappropriati’ per dolore toracico aspecifico e nel consentire una rapida esclusione della patologia coronarica acuta mediante il ricorso al monitoraggio telemetrico, all’ecocardiografia transtoracica e al test ergometrico nonché alla valutazione specialistica cardiologica. Conclusioni Pur rimanendo frequente motivo di accesso in Pronto Soccorso, il dolore toracico acuto e il rischio ad esso correlato richiedono un rapido inquadramento clinico e talora un approccio diversificato poichè il misconoscimento della patologia ad essa sottesa può produrre effetti fatali sull’outcome dei malati. In tal senso, l’osservazione breve intensiva può ricalcare il modello della Chest Pain Unit presente in altre realtà, ove i pazienti con dolore toracico vengono ulteriormente ‘osservati’ per giungere, in breve tempo, ad una diagnosi definitiva ottimizzando i percorsi terapeutico- diagnostici e le risorse a disposizione. B. ANALISI DEI DECESSI INTRAOSPEDALIERI DI UN DIPARTIMENTO D’EMERGENZA-URGENZA Introduzione. Tra le funzioni principali del dipartimento di emergenza vi è quella di fronteggiare le condizioni sanitarie di criticità e di rischio per la vita. Nella valutazione iniziale del malato critico è necessario attivare, quanto prima, i processi di valutazione e stabilizzazione, seguendo un percorso a gradini (step by step) ove l’ordine è rigidamente preordinato secondo una scala di priorità (A= airway; B= breathing; C= circulation; D= disability).Pur tuttavia, in alcune situazioni ‘life threatening’, l’evoluzione successiva è il decesso. Trattasi di uno studio di tipo retrospettivo condotto presso l’Unità Operativa del Pronto Soccorso dell’Ospedale dell’Angelo sito in Mestre, nel nord est dell’Italia. Scopo dello studio era: - analizzare le cause di decesso di più comune riscontro nei pazienti che afferiscono ad un dipartimento di emergenza; - dei decessi intraospedalieri, valutare il tasso autoptico definito come il rapporto tra il numero di autopsie effettuate sul numero totale dei decessi esaminati; - valutare l’accuratezza della diagnosi clinica formulata in un dipartimento di emergenza al momento del decesso, assumendo come standard di riferimento la diagnosi autoptica. Risultati I decessi intraospedalieri esaminati si riferiscono al periodo compreso tra giugno 2008 e dicembre 201l. Nello stesso periodo, gli accessi totali al Pronto Soccorso di Mestre ammontavano a 284.827 casi. I pazienti deceduti ammontavano a 223 soggetti e rappresentavano lo 0.078% degli accessi totali. Essi erano caratterizzati come segue: 28 casi nel 2008, 14 maschi e 14 femmine; 50 casi nel 2009, 24 maschi e 26 femmine; 83 casi nel 2010, 41 maschi e 41 femmine; 62 casi nel 2011, 27 maschi e 35 femmine. Nel periodo considerato (2008-2011), i pazienti deceduti erano 116 femmine e 107 maschi. L’età media era di 83,42 anni ±16,76 ds (casi di età compresa tra i 33 e i 106 anni) nelle femmine, mentre nei maschi era di 73 anni ± 3,53 ds (casi di età compresa tra i 22 e i 96 anni) e rappresentavano, rispettivamente, il 52,02% e il 47,98% dei decessi intraospedalieri. Tra le cause di decesso, quelle riconducili a patologia cardiaca, polmonare e cardiopolmonare rappresentavano più di 1/3 dei decessi intraospedalieri sia nel gruppo dei maschi che nel gruppo delle femmine. Dei 223 decessi, l’esame autoptico veniva richiesto nel 12,55% dei casi, ossia, in 28 pazienti (13 maschi e 15 femmine; l’età media era, rispettivamente, di 59 e di 70,2 anni). Dei 28 referti autoptici venivano analizzati solo 23 casi, ossia l’82,14% . Nella valutazione della concordanza tra la diagnosi di ‘dimissione’ e quella ‘autoptica’, i 23 casi erano così ripartiti: in 16 casi (69,57%) non vi era concordanza, mentre in 7 casi (30,43%) la concordanza era positiva cioè le due diagnosi erano uniformi e concordanti. Nell’analisi dei decessi intraospedalieri, l’età media dei maschi era significativamente inferiore rispetto alle femmine (59 vs 70,26 anni). Tra le cause di decesso, quelle per patologia cardiaca, polmonare e cardiopolmonare rappresentavano più di 1/3 dei decessi intraospedalieri sia nei maschi che nelle femmine. Le diagnosi ‘aspecifiche’ riconducibili ad arresto cardiocircolatorio e/o cardiorespiratorio e ad altro (exitus e cachessia) rappresentavano il 29,2% dei casi nei maschi e il 37,07% nelle femmine. Inoltre, in queste ultime, erano frequenti le cause riconducibili a sepsi ed a disfunzione multi organo. Le cause di decesso per eventi traumatici, in particolare, i traumatismi della strada erano più frequenti nei maschi rispetto alle femmine (15 vs 3 casi). Nell’analisi delle cause di decesso dei pazienti sottoposti ad autopsia, la totalità dei casi soffrivano di patologie severe, ‘life threatening’, a rapida evoluzione in exitus. Tra queste, erano prevalenti le patologie cardiache e vascolari sia addominali che cerebrali. Conclusioni Pur disponendo di ausili terapeutici e strumentali innovativi, questi non sempre contribuiscono a definire la vera causa di morte dei pazienti. Talora, la diagnosi clinica formulata dai sanitari è approssimativa e non corrispondente all’esame autoptico. L’accertamento anatomo-patologico rimane ancora di grande utilità nella pratica medica per stabilire la causa di morte, ma anche come fonte di conoscenza per migliorare i percorsi terapeutico- diagnostici, l’outcome dei malati nonché la pratica clinica dei sanitari.

Introduzione: Le Cardiopatie Congenite (CC), sono le anomalie congenite più frequenti alla nascita, con un'incidenza di 1 su 100 nati vivi. La placenta è l'organo fetale più complesso, in grado di garantire lo sviluppo e la crescita fetale durante la gravidanza. Sebbene lo sviluppo della placenta e del cuore avvenga in parallelo, il rapporto tra questi due organi risulta sconosciuto e trattato solo di recente. Metodi: Abbiamo condotto uno studio osservazionale retrospettivo, includendo i pazienti nati esclusivamente presso l'ospedale G. Gaslini, tra gennaio 2014 e marzo 2018 con una diagnosi prenatale di CC e un’analisi anatomopatologica della placenta, per un totale di 151 pazienti. I feti affetti da CC sono stati divisi in 5 categorie, basate sulla fisiologia cardiovascolare, come segue: (1) ventricolo singolo con ostruzione aortica, (2) ventricolo singolo con ostruzione polmonare, (3) due ventricoli emodinamicamente instabili, (4) trasposizione delle grandi arterie, (5) due ventricoli emodinamicamente stabili. Per ogni paziente, sono stati considerati i seguenti dati: peso placentare assoluto, alterazioni macroscopiche e vascolari del cordone ombelicale, indice di massa corporea materna (BMI), genere, restrizione di crescita intrauterina fetale e neonatale (IUGR), anomalie extracardiache, procedura chirurgica o percutanea nel periodo neonatale. Per l’analisi statistica è stato utilizzato il test esatto di Fisher, con il quale abbiamo studiato il rapporto di dipendenza fra una specifica variabile e le CC; un p <0,05 è stato ritenuto significativo per la dipendenza. Risultati: Solo quattro variabili hanno mostrato una significatività scientifica: l'intervento neonatale (p = 0,000008), le anomalie associate extracardiache (p = 0,012), l'edema del cordone ombelicale (p = 0,007) e il genere (p = 0,015). Nonostante avessimo riscontrato un'alta incidenza di inserimento anomalo del cordone ombelicale nelle placente di neonati cardiopatici, il risultato dell’analisi di Fisher non ha dimostrato alcuna dipendenza tra i gruppi CC e questa variabile (p = 0,379). Conclusione: Dallo studio dei nostri risultati, non riteniamo che il peso della placenta possa predire la diagnosi di CC, come precedentemente riportato in letteratura. Sulla base della nostra esperienza, non possiamo considerare l'inserimento anormale del cordone come un fattore ad alto rischio per CC. Pertanto, non riteniamo necessario ampliare la metodica di screening ecografico mediante l’analisi della modalità di inserimento del cordone. Contrariamente, la presenza di edema del cordone ombelicale è risultata dipendente dalle CC quindi, potrebbe essere ritenuto un fattore di rischio per CC. Analogamente, anche il genere è risultato dipendente dalle CC, con una forte associazione fra il sesso maschile e le CC Mayor. Per il futuro, riteniamo necessario implementare lo studio con l’inserimento di un gruppo di controllo e con l’inclusione di altre variabili cliniche e strumentali del feto e della placenta.
Introduction: Congenital heart diseases (CHD) are the most frequent congenital anomalies at birth, with an incidence of 1 in 100 live births. The placenta is the most complex fetal organ, responsible of fetal development and growth during pregnancy. Although the development of the placenta and heart occurs in parallel, the relationship between these two organs is unknown and only recently elucidated. Methods: We conducted a retrospective observational study, including patients born exclusively at the G. Gaslini hospital, between January 2014 and March 2018 with a prenatal diagnosis of CHD and an anatomopathological analysis of the placenta, for a total of 151 patients. Fetuses with CHD Mayor were divided into 5 categories, based on cardiovascular physiology, as follows: (1) single ventricle with aortic obstruction, (2) single ventricle with pulmonary obstruction, (3) two hemodynamically unstable ventricles, (4) transposition of the great arteries, (5) two hemodynamically stable ventricles. For each patient, the following data were considered: absolute placental weight, macroscopic and vascular alterations of the umbilical cord, maternal body mass index (BMI), gender, fetal and neonatal intrauterine growth restriction (IUGR), extracardiac anomalies, surgical procedure or percutaneous in the neonatal period. For statistical analysis, the Fisher test was used, with which we studied the dependency ratio between a specific variable and the CHD; a p <0.05 was considered significant. Results: Only four variables showed scientific significance: neonatal surgery (p = 0.000008), associated extracardiac anomalies (p = 0.012), umbilical cord edema (p = 0.007) and gender (p = 0.015). Although we had found a high incidence of abnormal insertion of the umbilical cord in the placentas of heart disease infants, the result of Fisher's analysis showed no dependence between the CHD groups and this variable (p = 0.379). Conclusion: From the analysis of our results, we do not believe that the weight of the placenta can predict the diagnosis of CHD, as previously reported in the literature. Based on our experience, we cannot consider abnormal cord insertion as a high risk factor for CHD. Therefore, we do not consider it necessary to expand the ultrasound screening method by analyzing the cord insertion method. Conversely, the presence of edema of the umbilical cord was found to be CHD dependent therefore, it could be considered a risk factor for CHD. Similarly, gender was also dependent on CHD, with a strong association between the male sex and CHD Mayor. For the future, we believe it is necessary to implement the study with the inclusion of a control group and with the inclusion of other clinical and instrumental variables of the fetus and placenta.

La deregolazione della espressione genica rappresenta il segno distintivo delle neoplasie. Sebbene le lesioni geniche sono state oggetto delle più importanti ricerche scientifiche in campo oncologico degli ultimi anni, i ricercatori stanno acquisendo sempre maggiori certezze sul fatto che le modificazioni epigenetiche a livello del DNA giochino un ruolo di primo piano nel processo di oncogenesi. Tali modificazioni si verificano a livello della cromatina nucleare, senza alterare in alcun modo la sequanza nucleotidica delle basi azotate da cui è composto il DNA stesso, e si manifestano attraverso dei pattern specifici di espressione genica che risulta ereditabile attraverso successive divisioni cellulari. Allo stato attuale delle conoscenze, il marcatore epigenetico meglio noto è la metilaizone del DNA. L’iniziale scoperta di un livello ridotto di metilazione globale del DNA nei tumori, è stato subio accompagnato dalla identificazione di loci ipermetilati a livello dei geni oncosoppressori. Attualmente è inoltre noto che il pattern di metilazione del DNA si verifica in un background di complessità strutturale cromatinica ed è influenzato dalla modificazione della struttura degli istoni, comunemente alterati nelle cellule neoplastiche. Tutti gli studi oncologici si propongono come obiettivo la precoce identificazione delle lesioni neoplastiche e la determinazione del rischio evolutivo in termini prognostici. La possibilità di individuare zone di ipermetilazione del DNA è da considerarsi pertanto un promettente strumento diagnostico in campo oncologico dal momento che aberranti eventi di metilazione intervengono frequentemente all’interno del DNA delle cellule neoplastiche, verificandosi precocemente nel processo di oncogenesied è possibile che specifici pattern di ipermetilazione siano presenti in differenti neoplasie. Marcatori molecolari di metilazione possono inoltre essere utilizzati per ottimizzare le classificazioni delle neoplasie, per predire la prognosi dei pazienti oncologici e la risposta alla terapia. L’aspetto sicuramente più significativo è che in virtù della loro natura dinamica e della loro potenziale reversibilità, le modificaizoni epigenetiche possono rappresentare dei bersagli terapeutici nella cura delle neoplasie. Dal momento che interessanti studi molecolari hanno individuato la presenza dei marcatori epigenetici anche nelle neoplasie urologiche ed, in particolare, anche in quelle del rene, nel nostro lavoro abbiamo analizzato lo stato di metilazione globale e di acetilazione istonica in 50 carcinomi renali a cellule chiare sottoposti ad interventi di chirurgia radicale, allo scopo di valutare il loro valore diagnostico e prognostico, accanto ai consueti parametri clinico-patologici. Dal nostro studio è emerso che la percentuale media di metilazione globale del DNA era significativamente maggiore nel tessuto neoplastico rispetto a quello sano, mentre la acetilazione istonica è risultata minore nelle cellule neoplastiche rispetto a quelle non neoplastiche del parenchima renale circostante. Sebbene non sia emersa una correlazione statisticamente significativa con la sopravvivenza, il livello di metilazione globale del DNA è risultato maggiore nei pazienti con carcinomi di grado istologico peggiore indicando che, al di là del grado istologico di Fuhrman, il pattern di metilaizone globale e di acetilazione istonica rappresentino dei possibili marcatori di aggressività nei carcinomi renali a cellule chiare.
Deregulation of gene expression is a hallmark of cancer. Although genetic lesions have been the focus of cancer research for many years, it has become increasingly recognized that aberrant epigenetic modifications also play major roles in the tumorigenic process. These modifications are imposed on chromatin, do not change the nucleotide sequence of DNA, and are manifested by specific patterns of gene expression that are heritable through many cell divisions, The best-known epigenetic marker is DNA methylation. The initial finding of global hypomethylation of DNA in human tumors was soon followed by the identification of hypermethylated tumor-suppressor genes. Moreover, we now know that DNA methylation occurs in a complex chromatin network and is influenced by the modifications in histone structure that are commonly disrupted in cancer cells. Early detection and risk assessment remain high priorities in oncology. Detection of hypermethylated DNA is considered a promising diagnostic tool in cancer because aberrant methylation events are abundant in tumors, occur early in the tumorigenic process, and different cancers exhibit specific hypermethylation patterns DNA methylation markers can also be used for disease classification, and to predict prognosis and response to therapy. Because of their dynamic nature and potential reversibility, epigenetic modifications are appealing therapeutic targets in cancer. We investigated global methylation and histone acetylation in 50 conventional clear cell renal carcinomas, treated with radical nephrectomy, to assess their possible role as diagnostic biomarkers. The features considered in this study were patient age, tumor size and grade, percentage of 5-methylcytosine and Acetyl-Histone (Lys 9) expression in tumor tissue. All considered parameters were correlated with patient specific survival. The mean percentage of global cellular methylation in tumoral tissue was significantly higher compared to normal peritumoral tissue, while the intensity of cellular methylation was significantly higher in normal tissues than in tumoral tissue. The mean percentage of histone cellular acetylation in tumoral tissue was significantly lower compared to normal peritumoral tissue, while the intensity of mean acetylation in neoplastic tissue was similar to the normal tissue. Fuhrman grade resulted to be statistically significant for prognosis. Global DNA methylation and histone acetylation in tumoral tissue did not correlate with survival. The percentage of global DNA methylation was significantly higher in grades 3 and 4 tumors. Fuhrman grade is still considered the most important factor for patient survival; the percentage of global methylation increases with increasing Fuhrman grade; global hypermethylation and histone hypoacetylation can have a role as markers of aggressiveness.

La perdita della comunicazione cellulare può portare ad una crescita deregolata e dunque alla trasformazione neoplastica. Gli scopi dello studio di dottorato sono stati di individuare il rapporto funzionale di alcuni fattori di crescita (FC) e dei loro recettori (RTC) in tipi di neoplasie e displasie degli animali domestici, quali: 1. Amplificazione del proto-oncogene ERBB2 e sovra-espressione del RTC erb-b2. in tumori mammari della gatta. 2. Espressione di erb-b2, di recettori ormonali, di citocheratine luminali, basali e marcatori mioepiteliali in carcinomi mammari a cellule chiare del cane. 3. Proliferazione microvascolare ed espressione di FC dell’angiogenesi e RTC (PDGF, VEGF, PDGFR-alfa e PDGFR-beta) in tumori dei plessi coroidei del cane. 4. Ruolo di FGF-2 in relazione a proteine strutturali e del ciclo cellulare nella differenziazione della cartilagine di accrescimento in vitelli con condrodisplasia di Ellis van Creveld. Nei tumori mammari felini il gene HER2 era amplificato e la proteina erbB2 era sovraespressa in un sottogruppo di tumori. L’ibridazione in situ a fluorescenza è il metodo ottimale per identificare l’amplificazione genica e per riscontrare falsi positivi e negativi ottenuti con l’immunoistochimica. Il carcinoma mammario glycogen-rich può essere considerato uno nuovo sottotipo istologico di tumore mammario del cane, PAS positivo, dPAS labile, con un fenotipo triplo negativo, dunque erbB2 negativo. I carcinoma dei plessi coroidei correlavano significativamente con l’indice Ki67 e la proliferazione microvascolare glomeruloide. I corpi glomeruloidi possono essere utilizzati come marcatori istologici di malignità e il PDGFR-beta risulta coinvolto nella loro formazione. La prematura degradazione del collagene II, una perdita di collagene X, unitamente ad una perdita di FGF2, suggeriscono che la sindrome EvC bovina è un disordine di differenziazione condrocitaria, caratterizzata da una differenziazione accelerata ed un’ipertrofia prematura. L’identificazione di alterazioni patologiche dei FC e dei RTC possono indirizzare scelte terapeutiche mirate nelle displasie e nelle neoplasie animali.
The loss of cells communication can lead to a deregulated growth and therefore to the neoplastic transformation. The aims of the phD study were to identify the relationship of growth factors (GF) and their tyrosine Kinase receptors (TKR) in types of neoplasia and dysplasia of domestic animals, as: 1. Amplification of the ERBB2 proto-oncogene and over-expression of the TKR erbB2 in feline mammary carcinoma. 2. Expression of erbB2, hormonal receptors, luminal, basal and myoepithelial markers in canine mammary clear cell carcinoma. 3. Microvascular proliferation and expression of angiogenic growth factors and their TKR (PDGF, VEGF, PDGFR-alpha and PDGFR-beta) in the canine choroid plexus tumors. 4. Role of Fibroblast Growth Factor-2 in relation to the structural and cell cycle proteins and the differentiation of the growth plate in calves with chondrodysplasia of Ellis van Creveld. In feline mammary carcinoma the HER2 gene was amplified and erbB2 protein was overexpressed in a subset of tumors. Fluorescence In situ hybridization is the method to identify the gene amplification and to detect false negatives and false positives obtained with immunohistochemistry. The glycogen-rich carcinoma can be considered a new histological subtype of canine mammary tumor, PAS positive, dPAS labile, expressing a triple-negative phenotype, therefore resulting erbB2 negative. Choroid plexus carcinomas significantly correlates with the Ki67 proliferation index and with the glomeruloid microvascular proliferation. Glomeruloid bodies may be used as a marker of malignancy in the canine choroid plexus tumors and PDGFR-beta is involved in their formation. The premature degradation of collagen II, a loss of the collagen X, together with a loss of FGF2, suggest that the bovine EvC syndrome is a disorder of chondrocyte differentiation, characterized by an accelerated and premature differentiation. Identification of the GF and TKR changes may direct targeted therapeutic choices in dysplasia and neoplasia of domestic animals.

La perdita della comunicazione cellulare può portare ad una crescita deregolata e dunque alla trasformazione neoplastica. Gli scopi dello studio di dottorato sono stati di individuare il rapporto funzionale di alcuni fattori di crescita (FC) e dei loro recettori (RTC) in tipi di neoplasie e displasie degli animali domestici, quali: 1. Amplificazione del proto-oncogene ERBB2 e sovra-espressione del RTC erb-b2. in tumori mammari della gatta. 2. Espressione di erb-b2, di recettori ormonali, di citocheratine luminali, basali e marcatori mioepiteliali in carcinomi mammari a cellule chiare del cane. 3. Proliferazione microvascolare ed espressione di FC dell’angiogenesi e RTC (PDGF, VEGF, PDGFR-alfa e PDGFR-beta) in tumori dei plessi coroidei del cane. 4. Ruolo di FGF-2 in relazione a proteine strutturali e del ciclo cellulare nella differenziazione della cartilagine di accrescimento in vitelli con condrodisplasia di Ellis van Creveld. Nei tumori mammari felini il gene HER2 era amplificato e la proteina erbB2 era sovraespressa in un sottogruppo di tumori. L’ibridazione in situ a fluorescenza è il metodo ottimale per identificare l’amplificazione genica e per riscontrare falsi positivi e negativi ottenuti con l’immunoistochimica. Il carcinoma mammario glycogen-rich può essere considerato uno nuovo sottotipo istologico di tumore mammario del cane, PAS positivo, dPAS labile, con un fenotipo triplo negativo, dunque erbB2 negativo. I carcinoma dei plessi coroidei correlavano significativamente con l’indice Ki67 e la proliferazione microvascolare glomeruloide. I corpi glomeruloidi possono essere utilizzati come marcatori istologici di malignità e il PDGFR-beta risulta coinvolto nella loro formazione. La prematura degradazione del collagene II, una perdita di collagene X, unitamente ad una perdita di FGF2, suggeriscono che la sindrome EvC bovina è un disordine di differenziazione condrocitaria, caratterizzata da una differenziazione accelerata ed un’ipertrofia prematura. L’identificazione di alterazioni patologiche dei FC e dei RTC possono indirizzare scelte terapeutiche mirate nelle displasie e nelle neoplasie animali.
The loss of cells communication can lead to a deregulated growth and therefore to the neoplastic transformation. The aims of the phD study were to identify the relationship of growth factors (GF) and their tyrosine Kinase receptors (TKR) in types of neoplasia and dysplasia of domestic animals, as: 1. Amplification of the ERBB2 proto-oncogene and over-expression of the TKR erbB2 in feline mammary carcinoma. 2. Expression of erbB2, hormonal receptors, luminal, basal and myoepithelial markers in canine mammary clear cell carcinoma. 3. Microvascular proliferation and expression of angiogenic growth factors and their TKR (PDGF, VEGF, PDGFR-alpha and PDGFR-beta) in the canine choroid plexus tumors. 4. Role of Fibroblast Growth Factor-2 in relation to the structural and cell cycle proteins and the differentiation of the growth plate in calves with chondrodysplasia of Ellis van Creveld. In feline mammary carcinoma the HER2 gene was amplified and erbB2 protein was overexpressed in a subset of tumors. Fluorescence In situ hybridization is the method to identify the gene amplification and to detect false negatives and false positives obtained with immunohistochemistry. The glycogen-rich carcinoma can be considered a new histological subtype of canine mammary tumor, PAS positive, dPAS labile, expressing a triple-negative phenotype, therefore resulting erbB2 negative. Choroid plexus carcinomas significantly correlates with the Ki67 proliferation index and with the glomeruloid microvascular proliferation. Glomeruloid bodies may be used as a marker of malignancy in the canine choroid plexus tumors and PDGFR-beta is involved in their formation. The premature degradation of collagen II, a loss of the collagen X, together with a loss of FGF2, suggest that the bovine EvC syndrome is a disorder of chondrocyte differentiation, characterized by an accelerated and premature differentiation. Identification of the GF and TKR changes may direct targeted therapeutic choices in dysplasia and neoplasia of domestic animals.

The aim of this experimental thesis focuses on the study of eye diseases related to the involvement of growth factors, of inflammatory cytokines in chronic-inflammatory, and of tissue remodeling. Particular emphasis has been addressed to the physiopathology of the eye surface and the complex relationships existing between cells and mediators in the immune response. Furthermore, the research has been directed to molecular events that control these biological responses. The lost in regulation of the inflammatory processes corresponds to the loss of control of the production/action of cytokines followed by the onset of inflammatory or autoimmune pathologies. Immunohistochemical technique has been performed in order to evaluate the physiopathological behaviour of inflammatory cytokines and of some growth factors (TGF-b1, IL-1b, IL-6, TNF-a and VEGF) located in the ocular tissues. Samples were obtained from human patients affected by glaucoma, diabetic retinopathy and macular degeneration. Our main purpose was to assess the levels of expression and localization of pro-inflammatory cytokines by immunohistochemistry in order to identify their involvement in the pathology, assuming for them a role in the modulation of these factors as a potential therapeutic target. Our study has shown an imbalance between pro- and anti-inflammatory cytokine plays a key role in the pathogenesis of retinal diseases. This disproportion within a complex regulatory network is related to some immunological processes that promote autoimmunity, chronic inflammation and / or tissue destruction. We were able to confirm that the inflammatory process involves a complex cascade of molecular and cellular biological signals, altering the physiological responses of the ocular tissues. The transmission electron microscopy investigation (TEM) showed that at the site of the lesion cells the probable release of molecular signals produces changes in the affected area: dilation of blood vessels resulting in increased blood flow and vascular permeability, exudation of fluid containing proteins such as immunoglobulins and invasion by leukocytes. It is well known that chronic and prolonged inflammation is a fundamental feature in some diseases such as atherosclerosis, obesity, diabetes, rheumatoid arthritis, asthma and various types of cancer. These diseases are strictly connected with their ocular manifestations: diabetic retinopathy, scleritis, uveitis, dry eye syndrome and ocular tumours. It should be noticed that pharmacological and clinical advances occur in areas apparently distant from application in ophthalmology, but they should be potentially used also in the ocular field by a translational application. Since many ocular tissues have a immune-privileged system to protect the delicate visual apparatus, the control of the acute inflammation is regulated by the same pathways and mediators that manage inflammatory responses in other organs. These scientific informations not only provide further support to the chronic inflammation, that plays a significant role in the pathogenesis of diabetic retinopathy, but also suggest that the inflammatory process is active even before retinopathy (diabetic and/or proliferative) is clinically diagnosed. Therefore, the alteration of the profile of some cytokines might be useful both as a predictive marker as well as an important target for the development of new therapeutic treatments. A novel pharmacological approach to treat eye inflammation may be represented by progress in the cellular therapy. In recent years, research has been devoted to the development of cell therapy applied to eye diseases producing a remarkably increased risk of visual impairment. Recently, cellular therapy has evolved into two research pathways: one finalized to a remodeling of the structure and the relative functions of specific tissues using stem cells; the other one has been focused on the restore of the immunological homeostasis controlling the harmful effects caused by inflammatory diseases.
Questo lavoro di tesi sperimentale è rivolto allo studio di alcune patologie oculari e al coinvolgimento di alcuni fattori di crescita e citochine infiammatorie in alcune condizioni cronico-infiammatorie e nel rimodellamento tissutale, con particolare interesse per la fisiopatologia della superficie oculare e al legame complesso tra cellule e mediatori nella risposta immune innata ed acquisita. Nello svolgimento dell’attività di ricerca particolare interesse è stato rivolto agli eventi molecolari deputati al controllo e allo spegnimento di queste risposte biologiche. La mancata regolazione dei processi infiammatori corrisponde infatti alla perdita del controllo della produzione/azione delle citochine e determina come conseguenza l’insorgere di patologie infiammatorie croniche o autoimmuni. In questo lavoro di tesi è stato valutato, mediante l'utilizzo della tecnica immunoistochimica, il ruolo fisiopatologico di alcune citochine infiammatorie e di alcuni fattori di crescita (TGF-b1, IL-1b, IL-6, TNF-a e VEGF) in tessuti oculari umani ottenuti da pazienti affetti da glaucoma, retinopatia diabetica ed degenerazione maculare in confronto ad analoghi tessuti umani normali. Pertanto il nostro principale scopo è stato quello di valutare i livelli di espressione e la localizzazione delle citochine pro-infiammatorie mediante tecnica immunoistochimica in modo da poter identificare il loro coinvolgimento nella patologia ipotizzando per esse un ruolo nella modulazione di tali fattori come potenziale bersaglio terapeutico. Come dimostrato nel nostro studio uno sbilanciamento tra citochine pro- e anti-infiammatorie giuoca un ruolo fondamentale nella patogenesi delle patologie retiniche. Tale sbilanciamento nell’ambito di un complesso network regolatorio è correlato ad alcuni processi immunologici che favoriscono autoimmunità, infiammazione cronica e/o distruzione tissutale. Nello svolgimento del lavoro di tesi è stato ulteriormente confermato come il processo infiammatorio comporti una complessa cascata di segnali biologici molecolari e cellulari, che alterano le risposte fisiologiche del tessuto oculare interessato. L'analisi in microscopia elettronica (TEM) ha evidenziato come presso il sito della lesione le cellule rilascino verosimilmente segnali molecolari che causano una serie di modificazioni nella zona interessata: dilatazione dei vasi sanguigni, con conseguente aumento del flusso sanguigno e della permeabilità vascolare, essudazione di liquidi contenenti proteine come le immunoglobuline ed invasione da parte dei leucociti. Risulta ampiamente noto come l’infiammazione cronica e prolungata sia una caratteristica determinante per malattie come aterosclerosi, obesità, diabete, artrite reumatoide, asma e diversi tipi di tumore. Molte di queste malattie si caratterizzano per una ormai consolidata manifestazione oculare: retinopatia diabetica, sclerite, uveite, sindrome dell’occhio secco e neoplasie oculari. Questo ci porta ad osservare attentamente anche i progressi farmacologici e clinici che si registrano in aree apparentemente distanti dall’applicazione in campo oftalmologico, ma che potenzialmente, per traslazione, potrebbero essere utilizzabili in prospettiva anche in campo oculare. Infatti, nonostante molti tessuti oculari abbiano un sistema immuno-privilegiato o altamente evoluto per proteggere il delicato apparato visivo, l’indispensabile controllo dell’infiammazione acuta è regolato dalle stesse vie generali e da mediatori e cellule effettrici che gestiscono le risposte infiammatorie in altri organi. Queste informazioni scientifiche non soltanto conferiscono ulteriore supporto al fatto che l’infiammazione cronica svolga un ruolo significativo nella patogenesi della retinopatia, ma suggeriscono, inoltre, che il processo infiammatorio si attivi prima ancora che la retinopatia (diabetica e/o proliferativa) sia clinicamente diagnosticata. L’alterazione nel profilo di alcune citochine potrebbe, quindi, diventare sia un marker predittivo, che un importante target per lo sviluppo di future opzioni terapeutiche. Un percorso radicalmente diverso dall’approccio farmacologico nella cura delle patologie infiammatorie oculari potrebbe in futuro essere rappresentato dai progressi dalla terapia cellulare. Negli ultimi anni si è evidenziato un crescente interesse per la possibile applicazione della terapia cellulare ad alcune patologie oculari che incidono maggiormente sul rischio di disabilità visiva. La terapia cellulare si può dividere in due ampie classi: una, attraverso l’impiego di cellule staminali, finalizzata al rimodellamento della struttura e della relativa funzionalità di specifici tessuti e cellule; l’altra, che utilizza cellule immunitarie nel ruolo di potenziali immunomodulatori dell’infiammazione, diretta al ripristino dell’omeostasi immunologica attraverso il controllo degli effetti nocivi provocati dalle patologie infiammatorie.

Sebbene il sistema nervoso enterico (“enteric nervous system”, ENS) svolga un ruolo cruciale nella patogenesi della Scrapie ovina, non esistono tuttavia in letteratura dati sulle popolazioni cellulari progressivamente coinvolte nel corso dell’infezione, né sugli eventuali danni morfo-funzionali da esse subiti. Il presente studio è stato condotto sui plessi mienterici e sottomucosi dell’ileo di 46 pecore di razza Sarda, recanti diversi polimorfismi del gene Prnp (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARR, ARR/ARR). I suddetti animali, infettati per os all’età di 8 mesi con un ceppo di Scrapie precedentemente caratterizzato nel topo, sono stati sacrificati mediante eutanasia a determinati intervalli di tempo post-infezione (p.i.). E’ stata quindi valutata, tramite immunoistochimica ed immunofluorescenza indiretta su sezioni tissutali e su preparati “wholemount”, l’immunoreattività (IR) nei confronti della PrPSc, del “marker” panneuronale Hu C/D, dell’ossido-nitrico sintetasi (nNOS), della calbindina (CALB) e della proteina fibrillare acida gliale (GFAP). In 8 pecore con genotipo ARQ/ARQ, clinicamente sane e sacrificate a 12-24 mesi p.i., nonché in 5 ovini clinicamente affetti (2 con genotipo ARQ/ARQ, 3 con genotipo ARQ/AHQ), questi ultimi sacrificati rispettivamente a 24, 36 e 40 mesi p.i., le indagini immunoistochimiche hanno consentito di dimostrare la presenza di PrPSc a livello sia dell’encefalo (obex), sia dell’ENS, in particolar modo nei plessi mienterici. In tali distretti il deposito della PrPSc risultava pienamente compatibile con un interessamento delle cellule enterogliali (“enteroglial cells”, EGCs), mentre occasionalmente si notava un contestuale coinvolgimento della componente neuronale ivi residente. In conclusione, i dati della presente indagine consentono di ipotizzare un verosimile coinvolgimento delle EGCs e dei neuroni residenti a livello dei plessi dell’ENS nella patogenesi della Scrapie sperimentale realizzata per os in ovini di razza Sarda.
The enteric nervous system (ENS) is believed to play a key role in the pathogenesis of sheep Scrapie infection, although no information exists on the ENS cytotypes which are progressively involved, nor on the morpho-functional damage of such cells in the time course of infection. We investigated the ileal myenteric (MPs) and submucosal plexuses (SMPs) of 46 Sarda breed sheep carrying different PrP genotypes (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARR, ARR/ARR), which had been orally dosed with Scrapie at 8 months of age and euthanized at definite time intervals post-infection (p.i.). PrPSc immunoreactivity (IR), along with pan-neuronal marker Hu C/D, nitric oxide synthase (nNOS), calbindin (CALB) and glial fibrillary acidic protein (GFAP)-IR, were evaluated by means of immunohistochemistry (IHC) and indirect immunofluorescence (IF) on paraffin-embedded sections and wholemount preparations. Eight clinically-healthy ARQ/ARQ sheep euthanized at 12-24 months p.i., along with 2 ARQ/ARQ (euthanized at 24 months p.i.) and 3 ARQ/AHQ (euthanized at 36 and 40 months p.i., respectively) clinicallyaffected sheep, showed IHC evidence of PrPSc in both their brain (obex) and ENS, especially in MPs. PrPSc deposition was fully compatible with an involvement of enteroglial cells (EGCs) and, occasionally, also with an involvement of neurons residing within ileal ENS plexuses. In conclusion, EGCs and neurons residing within ileal ENS plexuses may be likely involved in the pathogenesis of oral experimental Scrapie infection in Sarda breed sheep.

Sebbene il sistema nervoso enterico (“enteric nervous system”, ENS) svolga un ruolo cruciale nella patogenesi della Scrapie ovina, non esistono tuttavia in letteratura dati sulle popolazioni cellulari progressivamente coinvolte nel corso dell’infezione, né sugli eventuali danni morfo-funzionali da esse subiti. Il presente studio è stato condotto sui plessi mienterici e sottomucosi dell’ileo di 46 pecore di razza Sarda, recanti diversi polimorfismi del gene Prnp (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARR, ARR/ARR). I suddetti animali, infettati per os all’età di 8 mesi con un ceppo di Scrapie precedentemente caratterizzato nel topo, sono stati sacrificati mediante eutanasia a determinati intervalli di tempo post-infezione (p.i.). E’ stata quindi valutata, tramite immunoistochimica ed immunofluorescenza indiretta su sezioni tissutali e su preparati “wholemount”, l’immunoreattività (IR) nei confronti della PrPSc, del “marker” panneuronale Hu C/D, dell’ossido-nitrico sintetasi (nNOS), della calbindina (CALB) e della proteina fibrillare acida gliale (GFAP). In 8 pecore con genotipo ARQ/ARQ, clinicamente sane e sacrificate a 12-24 mesi p.i., nonché in 5 ovini clinicamente affetti (2 con genotipo ARQ/ARQ, 3 con genotipo ARQ/AHQ), questi ultimi sacrificati rispettivamente a 24, 36 e 40 mesi p.i., le indagini immunoistochimiche hanno consentito di dimostrare la presenza di PrPSc a livello sia dell’encefalo (obex), sia dell’ENS, in particolar modo nei plessi mienterici. In tali distretti il deposito della PrPSc risultava pienamente compatibile con un interessamento delle cellule enterogliali (“enteroglial cells”, EGCs), mentre occasionalmente si notava un contestuale coinvolgimento della componente neuronale ivi residente. In conclusione, i dati della presente indagine consentono di ipotizzare un verosimile coinvolgimento delle EGCs e dei neuroni residenti a livello dei plessi dell’ENS nella patogenesi della Scrapie sperimentale realizzata per os in ovini di razza Sarda.
The enteric nervous system (ENS) is believed to play a key role in the pathogenesis of sheep Scrapie infection, although no information exists on the ENS cytotypes which are progressively involved, nor on the morpho-functional damage of such cells in the time course of infection. We investigated the ileal myenteric (MPs) and submucosal plexuses (SMPs) of 46 Sarda breed sheep carrying different PrP genotypes (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ, ARQ/ARR, ARR/ARR), which had been orally dosed with Scrapie at 8 months of age and euthanized at definite time intervals post-infection (p.i.). PrPSc immunoreactivity (IR), along with pan-neuronal marker Hu C/D, nitric oxide synthase (nNOS), calbindin (CALB) and glial fibrillary acidic protein (GFAP)-IR, were evaluated by means of immunohistochemistry (IHC) and indirect immunofluorescence (IF) on paraffin-embedded sections and wholemount preparations. Eight clinically-healthy ARQ/ARQ sheep euthanized at 12-24 months p.i., along with 2 ARQ/ARQ (euthanized at 24 months p.i.) and 3 ARQ/AHQ (euthanized at 36 and 40 months p.i., respectively) clinicallyaffected sheep, showed IHC evidence of PrPSc in both their brain (obex) and ENS, especially in MPs. PrPSc deposition was fully compatible with an involvement of enteroglial cells (EGCs) and, occasionally, also with an involvement of neurons residing within ileal ENS plexuses. In conclusion, EGCs and neurons residing within ileal ENS plexuses may be likely involved in the pathogenesis of oral experimental Scrapie infection in Sarda breed sheep.

The use of companion animals as a cancer model for human oncology is leading to a better understanding of many cancerogenic aspects and to new therapeutic approaches. The high incidence, the histopathology, some tumorigenic aspects and the estrogen-independency, make of the feline mammary carcinoma a suitable model for the study of hormonal-independent breast cancers. In the present work, immunohistochemical evaluations of the expression of hormonal receptors, of the oncogene HER-2, of the oncosoppresor p53, of different cytoplasmic filaments (cytokeratins, vimentin, alpha-smooth muscle actin), of calponin, and of the proliferation marker Ki67 have been performed on feline mammary neoplasia, hyperplastic/dysplastic lesions, and normal mammary gland in 81 queens. The results are compared with the morphological aspects of the tumours and with the anamnestic and the follow-up data. Data obtained have allowed general considerations about neoplastic categories and more specific considerations about the expression of each marker. The cytoplasmic filaments have been investigated to better understand the histogenetic aspects of the feline mammary tumour and to eventually evaluate the presence of a "basal-like" group of cancers as described in women. The expression of basal cytokeratins (cytokeratin 5/6 and 14), that showed a positive correlation, and the high incidence of vimentin expression might suggest a pluripotent cell, a basal cell or a terminal duct as origin of the mammary tumours in the cat. In addition, the analysis of a-sma , calponin, and ck14 showed the presence of a myoepithelial component that was not always detected in routine histological sections, even when highly malignant, allowing in this way a better classification of the lesions. Regarding expression of specific markers, lower expression levels of HER-2 than what described within literature were observed, suggesting that this gene might not play a fundamental role in the feline mammary tumours development. Ki-67 presented a significant difference in expression between neoplastic and hyperplastic lesions, it positively correlated with grading, survival, and p53 expression, confirming its well-known role as indicator of the biological behavior of a neoplastic population. Finally, evidence of a large group of hormone-independent feline mammary tumours confirms a general more aggressive nature of these neoplasia in the feline species.

Il nostro studio prospettico ha lo scopo di identificare dei parametri biomolecolari (EGFR, PTEN, p-Akt, HER3, c-Met, IGF1R) la cui espressione, nei carcinomi mammari metastatici HER-2/neu positivi, possa predire la risposta al trastuzumab, considerando che la percentuale di non progressione ad un anno dall’inizio del trattamento è del 40% circa. Materiali e Metodi: Sono state valutate l’espressione immunoistochimica di EGFR, PTEN, pAkt, HER, c-Met e IGF1R e l’amplificazione del gene EGFR tramite FISH in 101 carcinomi mammari metastatici HER-2/neu positivi trattati con trastuzumab. Le pazienti, con follow-up noto, sono state controllate fino al decesso o a settembre 2009. Le pazienti sono state distribuite (“modalità di risposta”) nei gruppi di resistenza, di refrattarietà o di risposta al trastuzumab. Sono stati considerati 13,0 mesi come cut-off per considerare una paziente come rispondente o non rispondente al trattamento. Risultati: Nella casistica, la percentuale di risposta al trastuzumab è del 40,2%. Lo stato recettoriale ha mostrato una correlazione statisticamente significativa diretta con PTEN (P=0,021 e P=0,005 per recettori estrogenici e progestinici) ed inversa con EGFR (P=0,006 per recettori estrogenici) e pAkt (P=0,031 per recettori progestinici). E’ stata evidenziata una correlazione bassa e inversa tra PTEN e pAkt (P<0,001). Esistono correlazioni statisticamente significative tra il parametro “modalità di risposta” e pAkt ed EGFR. L’analisi discriminante ha selezionato i parametri EGFR e pAkt con sensibilità del 57,6%, specificità del 73,8%, accuratezza del 64,4%, valore predittivo positivo del 75,5% e predittivo negativo del 55,4%. Conclusioni: La paziente, in virtù del suo profilo d’espressione, se assegnata al gruppo di predizione dei rispondenti, avrà una probabilità del 75,5% di rispondere al trastuzumab. Ciò va oltre quel 40% di risposta globale che non considera lo specifico profilo molecolare della neoplasia.
Aim: According to the literature, the patients with HER-2/neu positive metastatic breast cancer (MBC) who respond to treatment based on trastuzumab plus chemotherapy are less than 40%. The aim of this study was to identify features that help us to better predict the response to trastuzumabcontaining regimen in this group of patients. Materials and Methods: The immunohistochemical expression of EGFR, PTEN, pAkt, HER-3, c- Met and IGF1R and the EGFR gene status were evaluated in 101 cases of HER-2/neu+ MBC. All the patients had been treated with trastuzumab-based regimens and had a well-known follow-up until September 2009. According to the “type of response to treatment”, the patients were subdivided in three groups: resistant, refractory or respondent. The patients without progression in the first 13.0 months of trastuzumab-containing therapy were considered as responders, the other ones as non-responders. Results: The percentage of responders was 40.2%. A statistically significant direct relation was seen between PTEN expression and ER and PR expression (P=0.021 and P=0.005, respectively), whereas a negative one was present between ER and EGFR (P=0.006) and between PR and p-Akt expressions (P=0.031). A statistically significant low, inverse relation was seen between PTEN and pAkt (P<0.001). A statistically significant direct relation was seen between the “type of response to treatment” and pAkt and EGFR. A discriminant analysis was performed by using EGFR and pAkt. The sensibility was 57.6%, the specificity was 73.8%, the accuracy was 64.4%; positive predictive value was 75.5% and negative predictive value was 55.4%. Conclusions: We demonstrated that a mathematical model based on the immunohistochemical expression of EGFR and pAkt can increase the level of response prediction in patients with HER- 2/neu+ MBC treated with trastuzumab-containing regimen: 75.5% of patients mathematically assigned to “responders group” has a time to progression longer than 13 months.

In the last 10-15 years, the production of farmed marine fish species has increased rapidly, mainly as a consequence of improved breeding and husbandry methods and technologies. However, severe production bottlenecks, such as high larval mortality, skeletal malformations, susceptibility to stress and disease, remain to be solved. The application of genomic technologies offers much promise to rapidly increase our knowledge on molecular mechanisms underlying key productive traits in farmed species. In the present study, many efforts were invested in order to provide genomic tools for the study of two fish species of great importance for the European aquaculture; the gilthead seabream (Sparus aurata) and the European sea bass (Dicentrarchus labrax¬). To this end, we report here on the development of two oligo DNA microarray for both S. aurata and D. labrax. All the available ESTs from the gilthead sea bream were used to design two longer (60mer) probes for each transcript using Agilent SurePrint™ technology. This microarray platform was then validated to assess its reproducibility and accuracy on two early stages of gilthead sea bream development, respectively one-day and four days old larvae. Correlation between technical replicates was always > 0.99, with strong positive correlation between paired probes. Cross-validation of microarray data was then carried out using quantitative (q)RT-PCR; a statistically significant positive correlation was obtained comparing expression levels for each target gene across all biological replicates. For the European sea bass, probe design was positively completed for 19,035 target transcripts; high levels of reliability, and reproducibility of the microarray platform were confirmed by qPCR validation and biological replicates analysis. The oligo microarray was then applied to profile gene expression in mandibles and whole-heads of fish affected by prognathism, a skeletal malformation that strongly affect sea bass production. Statistical analysis identified 242 transcripts that are significantly down-regulated in deformed individuals compared to normal fish. Functional annotation of significant genes gives new insights on putative mechanisms involved on mandibular prognathism development. In this study we describe also the identification and characterisation of a NITR gene complex D. labrax, encoded in a single genomic region spanning 270 kilo bases (kb). In total, 27 NITR genes and 3 pseudogenes, organized in a tandemly arrayed cluster, were identified. Comparison of the predicted peptide structure across D. labrax NITRs shows considerable variations; these genes maintain the three major genomic organizations that appear to be essentially conserved among fish species along with new features presumably involving processes of intron loss, exon deletion, and acquisition on new exons. Comparative analyses of all published NITR genes suggest that these receptors follow birth-and-death model of gene evolution in which duplication events together with lineage-specific gain and loss of individual members contributed to the rapid diversification of individual gene families
Negli ultimi 10-15 anni, la produzione di specie marine in acquacoltura è cresciuta molto rapidamente; diverse limitazioni, tuttavia, non sono ancora state superate (per es. elevata mortalità larvale, suscettibilità a stress e patologie, sviluppo di malformazioni scheletriche). La genomica funzionale può fornire gli strumenti per una migliore conoscenza dei meccanismi molecolari responsabili di tratti produttivi di forte interesse economico nelle specie allevate. Nel presente studio, numerosi sforzi sono stati investiti allo scopo di sviluppare e sfruttare strumenti di genomica funzionale per lo studio di due specie di primaria importanza per l’acquacoltura europea, l'orata (Sparus aurata) e il branzino (Dicentrarchus labrax¬); di seguito viene riportato lo sviluppo di due piattaforme microarray a oligonucleotidi per entrambe le specie. Tutti i trascritti disponibili di orata sono stati utilizzati per la sintesi di due sonde a oligonucleotidi (60meri) per ciascun trascritto utilizzando la tecnologia Agilent SurePrint™. La riproducibilità e l’accuratezza della piattaforma microarray sono state quindi testate in due stadi precoci di sviluppo di orata: due e quattro giorni dalla schiusa. La correlazione tra le repliche tecniche si è sempre rivelata elevata (r >0,99) e forte correlazione è stata osservata anche tra le coppie di sonde per ciascun trascritto. La Real-time RT-PCR è stata quindi utilizzata per cross-validare i dati di espressione del microarray; anche in questo caso è stata ottenuta una correlazione statisticamente significativa per ciascun gene target in tutte le repliche biologiche. Per il branzino, il disegno delle sonde è stato effettuato per 19.035 trascritti target; l’elevata affidabilità e riproducibilità della piattaforma è stata confermata tramite Real-time RT-PCR e analisi delle repliche biologiche. Il microarray è stato quindi impiegato per analizzare i profili di espressione genica in mandibole e teste di esemplari di branzino affetti da prognatismo, una malformazione scheletrica che ne compromette pesantemente la produzione e la commerciabilità. Analisi statistiche hanno permesso di identificare 242 trascritti sottoespressi negli esemplari prognati rispetto ai controlli; una annotazione funzionale di questi fornisce nuove informazioni sui potenziali meccanismi coinvolti nello sviluppo di questa malformazione. Nel presente studio viene anche descritta l’identificazione e la caratterizzazione, in branzino, dei recettori Novel Immune-type Receptor (NITR). In totale sono stati identificati 27 geni e 3 pseudogeni, organizzati in cluster in una regione genomica di circa 270 kb. I membri di questo cluster sono caratterizzati da una elevata variabilità; i NITR, infatti, mantengono tre organizzazioni genomiche principali, che appaiono conservate in diverse specie di teleostei, oltre a forme nuove che coinvolgono processi di perdita di introni, delezioni di esoni o loro nuova acquisizione. Analisi comparative tra tutti i geni NITR finora noti sembrano suggerire che questi seguano il modello evolutivo noto col nome di “birth-and-death”, nel quale eventi di duplicazione, assieme alle perdite/acquisizioni di singoli membri, contribuiscono alla rapida evoluzione di diverse famiglie geniche.

Background- Chronic kidney disease (CKD) and replacement therapies (dialysis or transplantation) increase the risk of native kidneys cancer. Acquired multicystic kidney disease in dialysis patients and immunosuppressive therapy in transplant recipients might be relevant factors for the development of renal cancer. International guidelines do not clearly recommend specific screening protocols for these categories of patients, although the early diagnosis could lead to an excellent prognosis. Objectives- To retrospectively analyze the cases of renal neoplasms of the native kidneys in chronic renal failure patients and renal transplant recipients that underwent nephrectomy at the Kidney and Pancreas Transplant Center at Hospital-University of Padua. The histological type of the tumor, grading, stage at diagnosis and prognosis of these patients were evaluated and compared with the data reported in the literature in uremic patients and in the general population. In the prospective phase of the study: the histopathological analysis and the flow cytometry of the kidneys have been addressed to study the expression of costimulatory molecules at the level of renal epithelial cells, to determine their function as non-professional APC (Antigen Presenting Cell). The activation status of intraepitelial lymphocyte population have been evaluated. Methods- From April 2007 to June 2013, 18 patients with chronic kidney disease (CKD) and/or kidney transplant recipients underwent nephrectomy because of renal tumor at the Kidney and Pancreas Transplant Center at Hospital-University of Padua. Were analyzed: the cause of the CKD, the type of replacement therapy, the timing of kidney transplantation, immunosuppressive therapy, the histological type of the tumor, the Fuhrman grade, and patient outcomes. Thereafter, between December 2014 and December 2015, 16 patients (5F/11M). were enrolled in the study. Indications for nephrectomy were: polycystic disease (APKD) 13 patients, suspected malignancy of the native kidney 3 patients, 1 patient underwent trasnsplantectomy of his kidney, performed for the detection of an aneurysm of the renal artery. Histological examination showed: neoplasms 2 cell carcinomas (Furhman Furhman 4 and 2 respectively), 1 papillary carcinoma Results- The average age of the patients at the time of nephrectomy was 53.4 ± 11.2 years. Six patients were receiving dialysis (hemodialysis in 2 and 4 on peritoneal dialysis), while 12 patients had a kidney transplant and 1 had previously pancreas and kidney transplantation. One patient developed 2 bilateral metacronous neoplasia and 1 benign tumor. Histological examination showed 17 cases of malignancy (9 clear cell carcinomas and 8 papillary carcinomas) and 3 benign tumors (2 papillary adenoma and a renal oncocytoma). The stage at diagnosis was: in 16 cases T1, and in 1 case T2. All patients underwent nephrectomy: 12 laparoscopically, 5 with laparotomy and 2 by lombotomic approach. All patients were asymptomatic at diagnosis, which took place during ultrasound performed for other reasons and subsequently confirmed at the CT-scan with contrast and / or MRI. After a mean follow-up of 22 ± 20 months, two patients died of causes unrelated to renal cancer and there were no local or distant recurrence of the tumor, in the absence of adjuvant treatment. The flow cytometry seems to show a greater expression of CD80, HLAABCm, HLAABCr; HLADRm and HLADRr; where HLAABCm and HLADRm represent the average intensity of fluorescence per cell, while HLAABCr and HLADRr represent the percentage of cells that exceed the gate and are therefore classified as positive. The expression of MCHC seems to increase in transplant recipient than in non-transplant patients; probably because immunosuppressive therapy, preventing rejection, leads an inhibition of T cell. Conclusions- The diagnosis of kidney cancer which is carried out within the program of follow-up in kidney transplant patients and screening in uremic patients allows to detect cancer in its early stages, improving outcomes and reducing the need for adjuvant therapy. The expression of costimulatory molecule CD80 in patients with renal carcinoma might suggest an activation of immunosurveillance in the carcinogenesis of the kidney. Further studies are needed to clarify the role of immunosuppressive therapy in the immunosurveillance.
Introduzione- L’insufficienza renale cronica (IRC) e specialmente la terapia sostitutiva (dialisi e trapianto), aumentano il rischio di riscontrare tumori dei reni nativi. I fattori che possono essere implicati sono la malattia renale multicistica acquisita nei dializzati e la terapia immunosoppressiva nei pazienti trapiantati. Nelle linee guida internazionali mancano tuttavia delle chiare indicazioni sulla tipologia di screening a cui sottoporre questi pazienti , benché in caso di diagnosi precoce la prognosi di queste neoplasie possa risultare ottima. Scopo dello studio- nella fase retrospettiva dello studio è stata analizzata la casistica di neoplasie renali dei reni nativi in pazienti affetti da insufficienza renale cronica e in pazienti trapiantati di rene e sottoposti a nefrectomia presso l’U.O.C. Trapianti di Rene e Pancreas dell’Azienda Ospedale-Università di Padova. L’istotipo del tumore, il grading, lo stadio alla diagnosi e la prognosi di questa tipologia di pazienti sono stati valutati e confrontati con i dati riportati in letteratura relativi a pazienti uremici e nella popolazione generale. Nella fase prospettica: l'analisi istopatologica e citofluorimetrica dei reni sono state indirizzate allo studio dell'espressione delle molecole di costimolazione a livello delle cellule epiteliali renali, per determinare la loro funzione di antigen presenting cell non professionali. Sono state inoltre analizzate le sottopopolazioni linfocitarie T residenti ed il loro stato di attivazione. Materiali e metodi: Da Aprile 2007 a Giugno 2013, 18 pazienti affetti da IRC e/o trapiantati di rene sono stati sottoposti a nefrectomia per riscontro di neoplasia renale presso la U.O.C. Trapianti Rene e Pancreas dell’Azienda Ospedale- Università di Padova. Sono stati analizzati: la causa dell’IRC, il tipo di terapia sostitutiva, il timing del trapianto di rene, la terapia immunosoppressiva, l’istotipo della neoplasia, il grado Fuhrman, e l’outcome dei pazienti. Successivamente tra dicembre 2014 e dicembre 2015, sono stati arruolati nello studio 16 pazienti (5F/11M). Le indicazioni all’intervento di nefrectomia sono state malattia policistica dell’adulto (APKD) 13 pazienti, sospetta neoplasia del rene nativo 3 pazienti, 1 paziente è stata sottoposta ed espianto di autotrapianto di rene, effettuato per il riscontro di un’aneurisma dell’arteria renale primitiva. Sono state riscontrate le seguenti neoplasie renali 2 carcinomi a cellule chiare (Furhman 4 e Furhman 2 rispettivamente), 1 carcinoma papillare. Risultati- L’età media dei pazienti al momento della nefrectomia era 53.4±11.2 anni. Sei pazienti erano in trattamento dialitico (2 in emodialisi e 4 in dialisi peritoneale), mentre 11 pazienti erano trapiantati di rene e 1 era trapiantato di pancreas e rene. Un paziente ha presentato due neoplasie maligne bilaterali metacrone ed un tumore benigno. L’esame istologico ha evidenziato 17 casi di neoplasia maligna (9 carcinomi a cellule chiare e 8 carcinomi papillari) e 3 di tumore benigno (due adenomi papillari e un oncocitoma renale). Lo stadio alla diagnosi era: in 16 casi T1 ed in un caso T2. Tutti i pazienti sono stati sottoposti a nefrectomia: 12 per via laparoscopica, 5 per via laparotomica e 2 per via lombotomica. Tutti i pazienti erano asintomatici alla diagnosi, che è avvenuta in corso di ecografia eseguita per altre ragioni e successivamente confermata all’esame TAC con mezzo di contrasto e/o RM. Dopo un follow-up medio di 22±20 mesi, due pazienti sono deceduti per cause non collegate alla neoplasia renale e non si sono verificate recidive locali o a distanza della neoplasia, in assenza di trattamento adiuvante. L’analisi puramente descrittiva della citofluorimetria sembra evidenziare una maggiore espressione di CD80, HLAABCm, HLAABCr; HLADRm e HLADRr; dove HLAABCm e HLADRm rappresentano l'intensità media della fluorescenza per cellula, mentre HLAABCr e HLADRr rappresentano la percentuale di cellule che superano il gate e sono quindi catalogate come positive. L’espressione di MCHC aumenta nei pazienti trapiantati rispetto ai non trapiantati in quanto il rene trapiantato sta esprimendo antigeni in modo non tollerigeno in quanto organo non self, la terapia immunosoppressiva determina un’inibizione del linfociti T a valle del CD80, impedendo il rigetto. Conclusioni- La diagnosi delle neoplasie renali che viene effettuata nell’ambito di programma di follow-up nel paziente trapiantato di rene e di screening nel paziente uremico consente di individuare neoplasie in stadio precoce, migliorandone l’outcome e riducendo la necessità di terapie adiuvanti. Sembra esserci un’attivazione nel processo di immunosorveglianza suggerito dall’ elevata espressione della molecola di costimolazione CD80 nei pazienti affetti da neoplasie renali. Rimane da chiarire il ruolo della terapia immunosoppressiva nell’immunosorveglianza.

Background Immunological and histopathological features in pig-to-primate renal xenotransplantation are widely studied. Only limited data have been reported about clinical-pathological findings in primate recipients of life-supporting renal xenografts. In the present study we have evaluated the clinical- pathological parameters especially with regard to hematological parameters and biochemestry. In particular, the presence and the significance of quantitative and qualitative proteinuria were evaluated in xenotransplanted non-human primates in which the kidney function is supported exclusivelly by the transplanted organ. Methods Eight captive-bred, bilaterally nephrectomized cynomolgus monkeys (Macaca fascicularis), recipient of a life-supporting transgenic porcine kidney, were included in the present study. Donors were α1,3-galactosyltransferase gene-knockout (GTKO) pigs transgenic for human CD39, CD55, CD59 and fucosyltranferase. Primates were subdivided into two groups accordingly to immunosuppressive therapy. The hematological and biochemical parameters primarily involved in evaluation of renal function have been monitored starting 11 days before transplantation until the end of the experimental study. Quantitative and qualitative analysis of proteinuria, evaluated with urinary protein to creatinine ratio (UPC ratio) and sodium dodecyl sulphate-agarose gel electrophoresis (SDS-AGE) respectively, have been performed. Results The main hematological and biochemical changes recorded after transplantation were a progressive anemia, a severe and progressive decrease of total proteins. In urine samples, the measurement of UPC ratio was low before transplantation and increased after transplantation. Similarly, SDS-AGE was negative before transplantation but evidenced bands consistent with mixed (i.e. tubular and glomerular) proteinuria in all the samples collected post-transplantation. Conclusions The complete evaluation of clinical and pathological condition of primates undergoing renal xenotransplantation, including monitoring of the blood and urine parameters, is an important diagnostic aid in the daily evaluation of these patients and is thought to be helpful to set any supportive care and increase the profile of welfare in animals. Moreover, the evaluation of UPC ratio and the use of SDS-AGE technique in urine samples of cynomolgus monkeys recipient of a life-supporting transgenic porcine kidney, may be considered a valid, cheap and less time consuming than more sophisticated technique methods in monitoring the proteinuria in post-transplanted period. Nevertheless, proteinuria and presence of LMW proteins can be consistently found in urine after transplantation, independently on the fluctuations of creatinine values and/or of the status of renal functions.
Il modello sperimentale di xenotrapianto renale suino-primate non umano, è stato ampiamente studiato dal punto di vista immunologico ed istopatologico. In letteratura sono presenti solo pochi lavori che hanno come principale obbiettivo, la valutazione clinico-patologica dei soggetti riceventi. Il nostro lavoro è volto a fornire una valutazione clinico-patologica dei soggetti donatori e dei soggetti riceventi mediante monitoraggio dei parametri ematologici e biochimici, le cui variazioni, in queste specie animali ed in queste condizioni sperimentali, non sono mai state oggetto di studio. Inoltre, il monitoraggio della proteinuria e la sua valutazione quali-quantitativa assumono particolare importanza in questi pazienti nei quali, a causa della nefrectomia bilaterale a cui vengono sottoposti, la funzionalità renale è unicamente sostenuta dall’organo trapiantato. Materiali e metodi Nel presente lavoro sono stati valutati otto primati bilateralmente nefrectomizzati (Macaca fascicularis) riceventi un rene di suino donatore α1,3-galactosyltransferase gene-knockout (GTKO) e transgenico per le seguenti proteine: CD39, CD55, CD59 e fucosiltranferasi. I primati sono stati divisi in due gruppi sperimentali a seconda del protocollo immunosoppressivo utilizzato. I parametri ematologici e biochimici, primariamente coinvolti nella funzione renale, sono stati monitorati quotidianamente a partire dal giorno 11 antecedente al trapianto sino alla fine della vita sperimentale dei primati. Lo studio qualitativo e quantitativo delle proteine urinarie, è stato effettuato mediante il rapporto proteine-creatinina urinaria (UPC ratio) ed elettroforesi in sodium dodecyl sulphate-agarose gel electrophoresis (SDS-age). Risultati Le principali alterazioni ematologiche e biochimiche osservate nei primati nel periodo post-trapianto sono state un’anemia progressiva ed un marcato e progressivo decremento delle proteine sieriche. Nei campioni d’urina, la valutazione del rapporto UPC, basso nelle valutazioni pre-trapianto, si presentava aumentato nel periodo post-trapianto. Allo stesso modo lo studio elettroforetico in SDS-age dei campioni di urina del periodo post trapianto ha permesso di identificare bande riferibili a proteinuria mista (tubulare e glomerulare), assenti invece nella fase pre-trapianto. Conclusioni La valutazione clinico-patologica completa dei primati sottoposti a xenotrapianto renale comprendente monitoraggio di parametri ematologici ed urinari è di importante ausilio diagnostico nella valutazione quotidiana di questi pazienti e si ritiene possa essere d’aiuto per impostare eventuali terapie di supporto ed accrescere il profilo di benessere negli animali. La valutazione del rapporto UPC e l’uso della metodica di elettroforesi in SDS-age per l’analisi dei campioni urinari provenienti da primati sottoposti a xenotrapianto renale, rappresentano dei mezzi diagnostici poco costosi, validi e sensibili per il monitoraggio della proteinuria post–trapianto. Tuttavia, nel nostro gruppo sperimentale, la proteinuria e la presenza di proteine LMW è stata riscontrata nei campioni dell’immediato post-trapianto, indipendentemente dalle fluttuazioni della creatinina e/o dalla condizione della funzionalità renale.

Fish photobacteriosis is an infectious disease that affects several fish species living in marine temperate waters. Its causative agent is the Gram-negative bacterium Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp). Fish photobacteriosis represents a serious health problem for the majority of intensive sea bream hatcheries, with 90–100% mortality during disease outbreaks. Larvae and juveniles are the most susceptible stages. A potential strategy to prevent fish photobacteriosis is to select for animals that are genetically resistant to it. Resistance to Phdp infection has low medium hereditabilty (0.12-0.45) and it is costly to measure, thus the best option for selective breeding is marked assisted selection. Aim of this work is to identify genetic loci involved in disease resistance in the gilthead sea bream (Sparus aurata) through an integrated genomic approach. A QTL analysis for resistance to photobacteriosis was carried out on an experimental population of 500 offspring, originating from eight sires and six dams in a single mass-spawning event and experimentally infected with Phdp. A total of 151 microsatellite loci were genotyped in the experimental population, and half-sib regression QTL analysis was carried out on two continuous traits, body length at time of death and survival, and for two binary traits, survival at day 7 and survival at day 15, when the highest peaks of mortality were observed. Two significant QTLs were detected for disease resistance. The first one was located on linkage group LG3 affecting late survival (survival at day 15). The second one, for overall survival, was located on LG21, which allowed us to highlight a potential marker (Id13) linked to disease resistance. A significant QTL was also found for body length at death on LG6 explaining 5-8% of the phenotypic variation. Microarray-based experiments were used to analyse changes at the transcriptome level upon Phdp experimental infection in sea bream juvenile head kidney. An update of the oligo-DNA microarray developed by Ferraresso et al. (2008) was produced by adding 6,412 novel unique transcripts. Statistical analysis identified 293 transcripts significantly up-regulated and 123 transcripts down-regulated leading to an infection response mainly associated to the more immediate innate immune system. It was observed, however, a significant predominance of anti-inflammatory mediators/signals, which help controlling excessive collateral damage to host tissue and cells due to host response, but, in so doing, might also reduce the effectiveness of immune mechanisms responsible for the clearance of the pathogen. Independent testing of a selection of differentially expressed genes with real-time RT-PCR confirmed microarray results. Differentially expressed genes based on microarray analysis were mapped onto the stickleback genome, to find a possible co-localization of the loci contributing to disease resistance or susceptibility. These genes, which putatively co-localize with genome-wide significant QTLs, represent a starting point to refine the candidate regions for the already identified QTLs and might constitute potential markers for the implementation of selective breeding programs for photobacteriosis resistance.
La fotobatteriosiosi ittica, causata dal batterio Gram negativo Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp), è una patologia infettiva che colpisce diverse specie di pesci che vivono in acque marine temperate. La fotobatteriosi rappresenta un reale problema sanitario per gran parte degli allevamenti intesivi di orata (Sparus aurata), con tassi di mortalità che possono raggiungere il 90-100%; gli stadi larvali e giovanili sono i più suscettibili all’infezione. Una possibile strategia per prevenire la patologia prevede la selezione di animali geneticamente resistenti a essa. La resistenza alla fotobatteriosi presenta un’ereditabilità medio bassa (0.12-0.45) e la sua stima risulta dispendiosa, di conseguenza, la strategia migliore per l’attuazione di programmi di miglioramento genetico per questo tratto è la selezione assistita da marcatori. Scopo di questo progetto è l’identificazione di loci genetici coinvolti nella determinazione della resistenza all’infezione in orata, mediante un approccio genomico integrato. Un’analisi di QTL per la resistenza alla fotobatteriosi è stata effettuata considerando una popolazione di 500 individui, generati da 8 maschi e 5 femmine, infettati sperimentalmente con Phdp e genotipizzati utilizzando 151 loci microsatelliti. I dati ottenuti sono stati elaborati attraverso un’analisi di regressione half-sib per due caratteri con distribuzione continua, la lunghezza al momento del decesso e la saprovvivenza, e per due caratteri binari, la sopravvivenza al giorno 7 e al giorno 15, associati ai maggiori picchi di mortalità. Per la resistenza alla fotobatteriosi sono stati identificati due QTL significativi. Il primo, coinvolto nella sopravvivenza al giorno 15, è stato associato al LG3. Il secondo, per la sopravvivenza al termine del challenge, è stato collocato nel LG21, per cui è stato possibile anche identificare un potenziale marcatore (Id13) associato alla resistenza alla patologia. Per la lunghezza al momento del decesso è stato individuato un QTL significativo nel LG6, in grado di spiegare il 5-8% della varianza fenotipica. La tecnologia microarray è stata impiegata per analizzare i cambiamenti a livello trascrizionale nel rene cefalico di orate sottoposte a un’infezione sperimentale con Phdp. La piattaforma microarray a oligonucleotidi, sviluppata da Ferraresso e colleghi (2008), è stata aggiornata aggiungendo 6412 nuovi trascritti unici. Le analisi statistiche dei dati di espressione hanno identificato 293 trascritti significativamente sovraespressi e 123 trascritti significativamente sottoespressi, associati a una risposta all’infezione che coinvolge principalmente i più immediati meccanismi del sistema immunitario innato. È stata rilevata, inoltre, una significativa predominanza di molecole antinfiammatorie che aiutano a controllare gli eccessivi danni collaterali ai tessuti dovuti alla risposta dell’ospite, ma così facendo, porterebbero anche a una riduzione dell’efficacia dei meccanismi immunitari responsabili dell’eliminazione del patogeno. I saggi di espressione in Real time RT-PCR hanno confermato i risultati di microarray. I geni differenzialmente espressi sono stati localizzati nel genoma di Gasterosteus aculeatus, per trovare una possibile co-localizzazione dei loci che contribuiscono alla resistenza all’infezione o alla suscettibilità. Questi geni, che apparentemente si collocano nelle stesse regioni dei QTL significativi, rappresentano un punto di partenza per raffinare la localizzazione dei QTL qui identificati e potrebbero raprresentare dei potenziali marcatori per la selezione di linee di animali maggiormente resistenti alla fotobatteriosi

Efficient uptake of oxygen and removal of carbon dioxide are essential conditions for life, and for normal growth and development in many species. Neurons in the brainstem chemoreceptors are distributed in specialized cental detect and regulate the presence of CO2 and/or changes in pH through a variety of responses. In so doing, these central chemoreceptors regulate extrauterin breathing actively responding through a variety of responses. Differences between prenatal and postnatal chemoreception appear to be primarily dependent on central inhibition in fetal life of the ventilatory responses to hypoxia and/or hypercapnia, with localization to the rostral lateral pons in the parabrachial/Kölliker-Fuse complex. The inhibitory effects of this complex are significantly reduced after the birth. Thus, chemoreception would function differently in the fetus than in the newborn, and birth would be associated with an abrupt change in the parabrachial/Kölliker-Fuse complex function. Experimental studies on animal models have identified the retrotrapezoide nucleus (RTN) as one of the main sites of central chemoreception and respiratory control. Numerous studies have RTN elected as one of the most important regions mediating central chemoreception. The RTN appears to integrate central and peripheral chemoreceptor information, providing an important role in respiratory function. The objectives of the study were: to locate and describe the cytoarchitecture of the nucleus retrotrapezoide (RTN) in the human fetus and infant, and ensure that the RTN, given its essential role in animal studies for the maintenance of respiration, showed abnormalities in victims of death sudden unexplained intrauterine (SIUD) and sudden infant syndrome (SIDS). Many studies have shown the expression of a transcription factor in neurons of the NRT: PHOX2B gene that was used as a marker. Three groups of Italians Caucasian children were autopsied, and by using immunohistochemistry has been studied the expression of PHOX2B gene. A group of positive neurons has been identified located within the caudal pons, contiguous to the facial/parafacial (PFN) complex, potentially the human homologous RTN (hRTN), already known in the mouse. In 71% of the cases has been observed structural abnormalities and/or expression of the PHOX2B gene hRTN vs. 10% of controls. In 85% of cases with alterations was also observed agenesis of the complex PFN. This study was conducted to determine the possibility of tracing the anatomical borders and cytoarchitecture of the human homologue of the RTN, by using immunohistochemical techniques. Views longstanding literature regarding the involvement of cardio-respiratory alterations in the sudden infant death syndrome (SIDS) pathogenesis, and the role of hNRT in regulation of breathing chemoreception, it has been hypothesized that abnormalities of development the RTN can play a critical role in SIDS and SIUD etiology.

The research project has been developed on the equine inflammatory respiratory diseases, which can be divided in Recurrent Airway Obstruction (RAO) and Inflammatory Airway Disease (IAD). The aim of this study was to investigate immune-related genes expression in the respiratory tract of IAD and RAO-affected horses. Clinical examination and endoscopy were performed. On the Broncho-Alveolar Lavage (BAL) fluid, obtained during endoscopy, cytological and microbiological analysis were performed to evaluate correlations between the gene expressions values and the clinical parameters. A first analysis was developed by real time RT-PCR comparing the gene expression profile of 10 immune-related target genes (IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-13, IL-17, TNFa, INF?, TGF-ß1, NF?-ß and TRL 4) in the BAL of healthy horses and RAO-affected ones, on which sampling was performed twice within 15 days. The aim was to deepen the effects of the respiratory disease on the equine immune system and to assess a potential temporal evolution of the gene expression values and of the other parameters considered. In addition, biopsies of the bronchial tissue were obtained and subsequent, histological evaluation and gene expression analyses were performed. Six of the target genes showed a significant expression values increase in the RAO group compared to the control one. A positive statistical correlation between the amount of mucus in the airways and the expression of some genes investigated was found. Regarding inflammatory mediators expression in the biopsy tissue, neither of target genes was significantly differentially expressed between the RAO horses and the control group. The second part of the research project included also the study of IAD. On all horses, clinical investigations and assessments of gene expression profiles were carried out twice within 15 days, at the diagnosis moment and at the end of the pharmacological treatment. Considering the results of the first study, no biopsies of the respiratory tissue were performed. The development of a microarray platform specific for equine immune-related genes, provide a global view of the pathways involved in the IAD and RAO inflammatory response. The statistical analyses showed that 379 transcripts (55 up-regulated and 324 down-regulated) were significantly differentially expressed between the IAD group and control horses and 1763 genes (903 up-regulated and 860 down-regulated) between the RAO-affected horses and the healthy animals. Between IAD-affected horses and RAO animals, were showed significant differences of the respiratory rate at rest and of the amount of mucus in the airways. Some transcripts involved in the genesis, length and motility of the respiratory epithelium cilia, were down-regulated both in IAD and in RAO horses. In the IAD population, has been demonstrated the over-expression of genes coding for inflammatory mediators. Some of the transcripts up-regulated in the RAO group, are involved in the inflammatory response, bronchoconstriction, apoptosis and hypoxia pathway. In the same disease, some genes involved in the genesis of the protective muco-protein film of the respiratory epithelium were under-expressed. The analyses carried out by the software Gene Sets Enrichment Analysis (GSEA) showed that the pathway activated during human asthma, is also enriched in equine RAO, albeit marginally significant (False Discovery Rate <25%, p value 0.08 ). The low quality of the RNA extracted from the BAL of some samples, did not allow to reach a significant number of horses, considered before and after the pharmacological treatment, to assess the effect of the therapy on gene expression profiles. In conclusion, the present studies provided information about the immunological mechanisms activated during the most important equine respiratory diseases. In the future, the information obtained could lead to the development of new therapies for IAD and RAO, by the inhibition of molecules involved in the pathogenesis of these diseases, as is already done in human medicine. The involvement of the same pathway in human asthma and equine RAO, could suggest a possible role of horses as animal model for the study of human chronic respiratory diseases.
Il lavoro di ricerca svolto nell’arco dei tre anni di dottorato, è stato articolato in due progetti sviluppati nell’ambito delle malattie respiratorie su base infiammatoria che colpiscono gli equini. Tali patologie possono essere distinte in due grandi gruppi: Recurrent Airway Obstruction (RAO) ed Inflammatory Airway Disease (IAD). Lo scopo dei progetti di ricerca si è basato sull’indagine dei profili di espressione di geni immuno-correlati nell’albero respiratorio di cavalli affetti da IAD e RAO, in relazione ad un gruppo di controllo. Su tutti i soggetti, sono stati eseguiti gli esami clinici mirati alla valutazione dell’apparato respiratorio, l’esame endoscopico e l’esame citologico e microbiologico da Broncho-Alveolar Lavage (BAL), per valutare le potenziali correlazioni esistenti tra i profili di espressione genica ed i parametri clinici. Il primo progetto è stato sviluppato comparando cavalli sani con soggetti affetti da RAO, su cui i campionamenti sono stati ripetuti due volte nell’arco di 15 giorni, al fine valutare una potenziale evoluzione temporale dell’espressione genica e degli altri parametri considerati nella ricerca. Inoltre, sono state eseguite biopsie del tessuto bronchiale, sottoposto sia a valutazione istologica che ad analisi di espressione genica. Mediante real time RT-PCR, sono stati indagati i profili di espressione di 10 geni target immuno-correlati (IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-13, IL-17, TNFa, INF?, TGF-ß1, NF?-ß e TRL 4), sei dei quali hanno dimostrato una aumento statisticamente significativo dei livelli di espressione nel gruppo RAO rispetto al gruppo di controllo. Le analisi statistiche condotte, hanno riscontrato una correlazione positiva tra la quantità di muco nelle vie aeree e l’ espressione di alcuni dei geni indagati. Non sono state evidenziate differenze di espressione, dei geni inclusi nello studio, tra i tessuti bioptici prelevati dai soggetti affetti da RAO e quelli ottenuti dal gruppo di controllo. Il secondo progetto di ricerca, è stato sviluppato ampliando la casistica dei cavalli affetti da RAO ed introducendo lo studio della IAD. Su tutti i soggetti, le indagini cliniche e le valutazioni dei profili di espressione genica sono state condotte sia al momento della diagnosi che al termine del trattamento farmacologico della durata di 15 giorni. Valutati i risultati del primo lavoro, non sono state eseguite biopsie del tessuto respiratorio. Lo sviluppo di una piattaforma microarray specifica per i geni immuno-correlati di cavallo ha permesso di ottenere una visione globale dei pathway coinvolti nella risposta infiammatoria delle due patologie. Le analisi statistiche effettuate hanno evidenziato una differenza di espressione significativa per 379 trascritti (di cui 55 sovra-espressi e 324 sotto-espressi) tra il gruppo IAD ed il gruppo di controllo e per 1763 geni (di cui 903 sovra-espressi e 860 sotto-espressi) tra i pazienti affetti da RAO ed i soggetti sani. Da un punto di vista clinico, sono state riscontrate differenze statisticamente significative sia della frequenza respiratoria a riposo che della quantità di muco presente nelle vie aeree dei cavalli affetti da IAD rispetto ai soggetti RAO. Tra i geni sotto-espressi nei due gruppi di cavalli affetti da malattia respiratoria, hanno acquistato importanza alcuni trascritti coinvolti nella genesi, lunghezza e motilità dell’apparato ciliare dell’epitelio respiratorio. Nella popolazione IAD, è stata dimostrata la sovra-espressione di geni codificanti per mediatori coinvolti nella risposta infiammatoria. I geni sovra-espressi nel gruppo RAO, caratterizzati da maggior rilievo, sono coinvolti nella risposta infiammatoria, nella broncocostrizione, nella via apoptotica e nel pathway dell’ipossia. Nella medesima patologia, si sono mostrati sotto-espressi anche alcuni geni coinvolti nella genesi del film muco-proteico di protezione dell’epitelio respiratorio. Lo studio condotto mediante Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), ha evidenziato che il pathway attivato in corso di asma umano, viene arricchito anche nella patologia RAO equina, sebbene la significatività statistica sia marginale (False Discovery Rate < 25%, p value 0,08). Non è stato possibile valutare l’effetto della terapia farmacologica sui profili di espressione genica, poiché la bassa qualità dell’RNA estratto dal BAL di alcuni campioni non ha permesso di raggiungere un numero significativo di soggetti valutati prima e dopo il trattamento terapeutico. Gli studi effettuati hanno quindi permesso di far luce su alcuni dei meccanismi immunologici che stanno alla base delle patologie respiratorie equine di maggiore importanza veterinaria ed economica. In futuro, le informazioni ottenute, potrebbero condurre allo sviluppo di nuovi mezzi terapeutici per l’inibizione delle molecole coinvolte nello sviluppo di IAD e RAO, come già avviene in medicina umana. Infine, il coinvolgimento di un medesimo pathway nell’asma umano e nella RAO equina, potrebbe condurre all’utilizzo di tale specie come modello animale per lo studio delle patologie respiratorie croniche umane.

Fish pasteurellosis is an infectious disease that affects several fish species living in marine temperate waters. Its causative agent is the Gram - bacterium Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp Vibrionaceae). Fish pasteurellosis represents a serious health problem for the majority of intensive sea bream hatcheries, with 90-100% mortality during disease outbreaks. Larvae and juveniles are the most susceptible stages. A potential strategy to prevent fish pasteurellosis is to select for disease-resistant animals. Aim of this work is to develop and optimise a set of genomic tools to analyse the genetics of disease resi stance and growth in the gilthead sea bream (Sparus aurata L.). To this end, genomic tools are first developed (repeat-enriched genomic libraries, linkage maps, marker sets for genetic analysis), then applied to the experimental population, which consisted of approximately 3000 animals, originating from uncontrolled crosses between several brodstock fish (mass spawning). The entire population was experimentally infected with a highly virulent strain of Phdp. Mortality was monitored for 20 days, every 12 hours. Upon completion of challenge experiment, genetic profiles at nine microsatellite loci were obtained for 1800 animals and for all (256) broodstock fish, for parentage assignment. A subset of families defined by means of genetic analysis was used to calculate heritability for growth and survival to infection. For growth, h2 ranged between 0.34 and 0.37. For disease resistance, h2 for survival at day 5 after infection was 0.4, while it decreased to 0.1 for day 10 after inferito. Using 90-100 microsatellite markers well spaced on the sea bream genome map, a whole-genome scan for growth and disease-resistance QTL was performed on five full/halfsib families (with n of individuals >70) for a total of 600 animals.

This study aimed to determine the immunophenotypical characterization of canine Sertoli cells (SCs) and related tumors and canine ovarian neoplasms. In veterinary literature histological and immunohistochemical aspects of canine Sertoli cell tumor (SCT) are poorly investigated and data on normal testes of mature and immature dogs are absent. In human medicine, numerous studies have shown that during maturation from fetal to adult testis, SCs undergo a process of differentiation whereby the expression of some markers is maintained, while other markers disappear and others are acquired. The comparison between the expression of cellular markers in normal and neoplastic testes may make clearer the temporal sequence of markers appearance in the dog, important for understanding the mechanisms underlying their re-expression in disorders of the adult testis. The analogies observed between canine and human species might clarify if the dog could be considered a good animal model for human testicular cancer. To evaluate the expression of Sertoli cell markers in normal and neoplastic canine testes, formalin fixed and paraffin embedded sections of testes from 2 fetuses, 15 newborns (from 0 to 20 days old), 5 puppies (from 43 days to 6 months old), 14 adult dogs and 21 canine SCTs (20 benign and 1 metastatic malignant SCT) were processed for histology and immunohistochemistry (ABC method) with antibodies against vimentin (1:1000), CKAE1/AE3 (1:3000), desmin (1:300), INH α (1:40) and AMH (1:30000). Histologically, 13/20 benign SCTs were classified as classical SCTs while 7/20, showing intracytoplasmic vacuoles, were considered “lipid rich”. The malignant SCT, largely necrotic, was composed of large cystic tubules lined by numerous layers of poorly-differentiated neoplastic SCs characterized by marked anisocytosis and anisokaryosis. The mitotic index of the SCTs ranged from 0 to1.6, with the highest value recorded in the malignant SCT. Immunohistologically, vimentin was always expressed by normal SCs from puppies and adults and by all SCTs taken in consideration. On the other hand, only 1 foetus and 4 newborns were positive immunolabelled. INH α was present exclusively in fetal and neonatal testes and in 13/21 SCTs, while desmin and CKAE1/AE3 were never present within normal testes but exclusively expressed by 7/21 and 5/21 SCTs, respectively. Finally, AMH was always expressed by foetal and neonatal testes, by the youngest puppies (43-45 days old) and by all the SCTs taken in consideration. We speculate that the expression of CKAE1/AE3, INH α, desmin and AMH observed in SCTs and not in mature testes may be a manifestation of de-differentiation. In fact, neoplastic SCs re-express foetal and neonatal makers, normally lost with maturation, demonstrating an immature phenotype. The re-expression of immunophenotypical markers of immaturity has been already described in several testicular pathologic conditions and the identification of the mechanisms via which this “cellular reversal maturation” occurs should be further investigated. Regarding ovarian canine epithelial tumours, given the variety of histological features that characterize this lesion and that can cause diagnostic difficulties or misinterpretation, the aim of this study was to investigate the reliability of the marker HBME-1 in canine normal ovaries, granulosa cell tumors, and epithelial ovarian neoplasms to determine whether this marker could be included in an immunohistochemical panel for differential diagnoses of canine ovarian tumors. Samples were obtained from 4 normal ovaries, 10 granulosa cell tumors, and 18 epithelial ovarian tumors. After formalin fixation and paraffin embedding, tissue sections were stained with hematoxylin and eosin and probed immunohistochemically for the HBME-1 marker. Granulosa cells and related tumors were consistently negative for HBME-1. Normal ovarian surface epithelium and 17 out of 18 ovarian epithelial tumors were positive for HBME-1. The results suggested that HBME-1 would be a useful marker for the differential diagnosis of ovarian tumors in the dog.

Mammary tumors are the most common neoplasms in female dogs. Available data regarding the etiopathogenesis, the epidemiology and the biological behavior of this type of tumor are still incomplete and controversial. It is widely known that they are highly heterogeneous in morphology and that the lack of precise histopathological diagnostic criteria does not allow an adequate standardization of the diagnosis. Based on these considerations, and as a part of an international collaboration, we studied in details some aspects regarding the classification of these neoplasms. This allowed us to define precise criteria for the distinction between benign and malignant mammary tumors and to write a new classification for the hyperplastic/dysplastic and neoplastic lesions of canine mammary gland. The new classification is a modification of the internationally accepted WHO classification and incorporates some new morphological entities. These standardized criteria were applied on 2143 samples of canine mammary tissue. Other specific morphological characteristics were also evaluated. Relations between all the results obtained, and signalment, and follow-up data were investigated to improve the knowledge about the epidemiology and biological behavior of canine mammary tumors. We noticed that some dog breeds were less represented as carriers of malignant tumors and that in general the incidence of malignant tumor increased with age. In addition, we found that spayed animals, compared to intact ones, tend to have slightly different, apparently more aggressive, mammary tumors. For many tumors subtypes a specific biological behavior was recognized. Of particular interest was the immunohistochemical study of a new tumor subtype (carcinoma and malignant myoepithelioma) characterized by the presence of malignant myoepithelial cells. The prognostic value of different parameters such as tumor diameter, invasion of the lymphatic system, grade of malignancy, presence of peripheral infiltration and of a micropapillary pattern were discussed in details.
Il tumore mammario è la neoplasia più frequente nei cani femmina. I dati relativi all’eziopatogenesi, all’epidemiologia e al comportamento biologico di questa forma tumorale sono ancora in parte incompleti e controversi. È risaputo inoltre che tale forma tumorale è caratterizzata da un’elevata eterogeneità morfologica e la mancanza di precisi e definiti criteri diagnostici istopatologici rende spesso difficile un’adeguata standardizzazione nella formulazione della diagnosi. Da queste considerazioni è nata l’esigenza di approfondire alcuni aspetti classificativi nell’ambito di una collaborazione internazionale che ha portato alla definizione di criteri precisi per la distinzione tra forme neoplastiche benigne e maligne e alla stesura di una nuova classificazione per le lesioni iperplastiche/neoplastiche della mammella del cane. Tale classificazione si ispira al precedente sistema classificativo internazionale (WHO), ma risulta rielaborata e integrata con alcune nuove entità morfologiche. Applicando questi criteri e la nuova classificazione su 2143 campioni di tessuto mammario canino e mettendo i risultati ottenuti in relazione ad altre specifiche valutazioni morfologiche e a dati segnaletici e di follow-up è stato possibile mettere in risalto alcuni aspetti, in parte noti e in parte nuovi, relativi all’epidemiologia e al comportamento biologico di questa forma tumorale. Si sono ad esempio messi in evidenza la presenza di razze meno rappresentate tra i soggetti portatori di tumori mammari maligni, un aumento di incidenza delle forme maligne al crescere dell’età e una certa tendenza degli animali sterilizzati, rispetto agli interi, a presentare forme tumorali leggermente diverse, apparentemente più aggressive. Per molte delle tipologie tumorali descritte è stato riconosciuto un comportamento biologico specifico. È stato particolarmente interessante a fini classificativi e prognostici approfondire lo studio, con ausilio immunoistochimico, di una nuova tipologia tumorale (carcinoma e mioepitelioma maligno) caratterizzata dalla presenza di cellule mioepiteliali maligne. È stata inoltre dimostrata o in altri casi confermata e dettagliata, la valenza prognostica di alcuni parametri quali il diametro tumorale, l’invasione del sistema linfatico, il grado istologico di malignità, l’infiltrazione periferica e la presenza di pattern micropapillare.

Diagnostic test validation is challenge for the clinical pathologist when a new instrument or a new analyzer is introduced in the lab. The aim of this work is to assess the analytical and/or clinical performances of novel biomarker to evaluate a possible application as a useful marker in veterinary medicine. Four different objectives are investigate: 1. Haematological parameters: two new gates are draw, in particular a “high fluorescent region” to identify canine blood samples with cell of probable neoplastic origin that need further investigation and a gate to identify “high fluorescent platelet fraction” in macrothrombocytopenic Norfolk terrier. Both gates are useful to perform a correct diagnosis with a better outcome for the patients. 2. Inflammatory markers: the measurement of dROMs (derivative of reactive oxygen metabolites) in serum of dogs with leishmaniasis showe a strong involvement of these compounds in the symptomatic or the asymptomatic Leishmania infections, and could be use to identify dogs with sub-clinical forms. Another studies involve the validation of a new test for IFN-γ measurement after incubation of feline leukocytes with immunogenic peptides. This study is from one side a draw up of a new test with consequently assessment of analytical performances, and from another side a pathogenic study about FIP infection in cats. The paraoxonase 1 activity in dogs is the last inflammatory maker investigated, and results show a probable biological behaviour as a negative acute phase protein. 3. Hypertension markers: homocysteine and entothelin-1 (ET-1). Hypertension usually is secondary to diseases that indirectly could affect the systemic pressure, mainly renal and heart diseases. Homocysteine appears increased in dogs with both heart and kidney disease, but the clinical usefulness and the sensibility is not enough for positive impact on patient management. ET-1 appeared with higher sensibility and specificity in dogs with chronic kidney diseases and with hypertension, and its related with the severity of disease and could be a useful marker for the monitoring the follow up. 4. Development of new methods to investigate sialic acid characteristics and to assess if the different molecules bind to sialic acid molecules could interact with the development of the pathology. Results show an increased metastatic potential when sialic acid has α2,6 conformation in dogs with mammary tumour, and in cats the total sialic acid serum concentration is related to the immune response of cats during Coronavirus infections. 5. At last, evaluation of analytical performances of urine protein-to-creatinine ratio: it’s a commonly used test, but this study revealed a high imprecision that could affect test results.

BACKGROUND Cardiovascular diseases are the world’s number one death cause, accounting for 17.1 million deaths a year. There is still much unknown about cardiovascular diseases and their physiological underlying mechanism. Understanding the nature of complex biological processes occurring in both healthy and diseased heart tissue requires identifying the compounds involved and determining where they are located. Summary METHODS We have investigated a complementary mass spectrometry imaging (MSI) approach using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) and secondary ion mass spectrometry (SIMS) on the major areas of rat heart: the pericardium, the myocardium, the endocardium, and the great vessels to study the native distribution and identity of atomics, lipids, peptides and proteins in rat heart sections. 40 layers of horizontal tissue slices were acquired and reconstructed into a 3 D dataset. RESULTS Surface rastering of heart tissue sections generated multiple secondary ions in a mass range up to 1500 m/z. In the negative spectra we identified cholesterol related ions that show high intensity in both atrias, the aorta, the pulmonary artery and the outline both ventricles. The m/z 105 (choline) signal localizes in both atrias, aorta, pulmonary artery, in the atrioventricular valves and semilunar valves but is not present in ventricles surface. DAG species with probable identifications as Oleic, Linoleic [OL]+ at m/z 602 and [OO]+ (Oleic, Oleic) at m/z 604, can be detected. The images of 3D reconstruction show a highly complementary localization between Na+, K+, ion at m/z 145 and ion at m/z 667. Na+ is localized to tissue regions corresponding to atrias, while K+ is strongly localized to tissue regions corresponding to ventricles surface.The ion at m/z 667 localized very precisely within the aortic wall and the ion at m/z 145 is primarily located to the atria regions. CONCLUSIONS To promote further research with cardiovascular disease, we report the identification of characteristic molecules that map the spatial organization in a rat heart’s structure. A series of images obtained from successive sections of animal heart could, in principle, be used to produce a molecular atlas. Such tissue atlases (based optical images) are widely used for anatomical and physiological reference. The specific aim of this project is to optimize the data obtained from Heart SIMS a analysis and the 3-D reconstructive techniques developed to aid in investigating and visualizing differential molecular localizations in heart rat structures. The results reported here represent the first 3D molecular reconstruction of rat heart by SIMS imaging.
Introduzione Le malattie cardiovascolari rappresentano nel mondo la prima causa di morte, contando 17.1 milioni di morti ogni anno. Attualmente i meccanismi fisiopatologici alla base delle patologie sono in larga parte ancora sconosciuti. Capire la natura dei complessi processi biologici in atto sia nel miocardio cardiaco sano che malato richiede l’identificazione e la localizzazione degli stessi elementi molecolari coinvolti. METODO Utilizzando tecniche complementari di spettrometria di massa d’immagine (SMI) quali la spettrometria di massa a ioni secondari (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) e la spettrometria di massa a desorbimento /ionizzazione laser assistita da matrice (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) abbiamo analizzato le principali componenti del cuore del ratto: il pericardio, il miocardio, l’endocardio, le valvole e i grandi vasi al fine di studiare ed identificare l’originale distribuzione di atomi, lipidi, peptici e proteine nel tessuto cardiaco normale. Quaranta sezioni di tessuto cardiaco sono state acquisite e ricostruite ottenendo un database tridimensionale. RISULTATI L’analisi della superficie delle sezione di tessuto cardiaco ha generato molteplici ioni secondari con un intervallo di massa che raggiunge i 1500 m/z. Utilizzando la modalita’ negativa abbiamo identificato il colesterolo e gli ioni relativi ad esso che mostrato un alta intensita’ in entrambi gli atri, l’aorta, l’arteria polmonare e pericardio. La colina corrispondente a 105 m/z di massa molecolare risulta essere localizzata in entrambi gli atri, aorta, arteria polmonare, valvole atrioventricolari e valvole semilunari ma non risulta essere presente sulla superficie ventricolare. Sono state identificate molecole appartenenti al diacilglicerolo come acido Oleico, Linoleico [OL]+ corrispondenti alla massa molecolare di 602 m/z e [OO]+ (Oleico,Oleico) con massa molecolare di 604 m/z. Le immagini ottenute dalla ricostruzione tridimensionale mostrano una specifica localizzazione complementare tra il sodio, il potassio e gli ioni con massa molecolare di 145 m/z e 667 m/z. Il sodio e’maggiormente localizzato nelle regioni cardiache corrispondenti agli atri, mentre il potassio e’ maggiormente localizzato nelle regioni corrispondenti alla superficie ventricolari. Lo ione con massa molecolare di 667 m/z e’ localizzato con molta precisione all’interno della parete dell’aorta e lo ione con massa molecolare di 145 m/z e’ localizzato a livello delle regioni atriali. CONCLUSIONI Al fine di promuovere un’ulteriore ricerca in patologia cardiovascolare, riportiamo l’identificazione delle caratteristiche molecole che mappano l’organizzazione spaziale delle strutture cardiache del cuore del ratto. Una serie di immagini ottenute da sezioni successive del cuore potrebbero inizialmente essere utilizzate come un atlante molecolare e similmente, ad un atlante basato sulle immagini ottiche, essere ampiamente utilizzato come referente sia dal punto di vista fisiologico che anatomico. L’aiuto apportato da questo progetto e’ l’ottimizzazione dei dati ottenuti dall’analisi SIMS e lo sviluppo della tecnica per la ricostruzione tridimensionale al fine di investigare e visualizzare le differenti molecole localizzate nelle strutture del cuore di ratto. I risultati qui riportati rappresentano la prima ricostruzione tridimensionale ottenuta con immagini SIMS, del cuore di ratto.

While the phenotypic changes involved in the Barrett’s esophageal oncogenic "cascade" are now well established, the molecular profiling of this pathway remains defective. The understanding of the molecular dysregulations underlying the development and progression of cancer has recently been expanded by the characterization of new classes of noncoding RNA gene products, such as the microRNAs (or miRNAs) and the transcribed utraconserved regions (T-UCR). MiRNAs are "endogenous silencers" targeting a large number of genes, and working as tumor suppressors or tumor promoters depending on the activity of the targeted genes. MiRNA dysregulation plays a significant part in cancer molecular pathways alteration, prognosis, and responsiveness to therapies. Over the three years of the PhD program, I focused my research mainly on miRNAs expression profiling in Barrett’s carcinogenesis and in Barrett’s metaplastic lesions by miRNAs microarray analysis (OSU-CCC version 4.0; Ohio State University). I also investigated the expression and localization of specific miRNAs by in situ hybridization, correlating these results with the expression of the corresponding gene targets. Main studies: i) miRNA expression profiling of Barrett's carcinogenesis; ii) miR-145 targeting of GATA6 in collaboration with the University Medical Center Utrecht; iii) HER2-miR-125a-5p/miR-125b loop in gastroesophageal neoplasms; iv) miRNA expression profiling of metaplastic lesions included in the definition of Barrett's mucosa. Ultra Conserved Regions (UCRs) are a class of 481 noncoding sequences conserved among humans, mice and rats. The majority (93%) of UCRs are transcribed (called T-UCRs) in normal human tissues, and are altered at the transcriptional level in human tumorigenesis. In the last year of the PhD program I investigated T-UCRs dysregulation in Barrett’s carcinogenesis by T-UCR microarray analysis (OSU-CCC version 4.0; Ohio State University). The obtained results were validated in an independent series of esophageal biopsy samples and in two murine models of Barrett’s esophagus (i.e., esophagogastric-duodenal anastomosis in mice and rats). This study identified, for the first time, a critical role for T-UCRs in the neoplastic transformation of the esophageal mucosa and pinpointed transcribed ultraconserved noncoding RNAs as a unique class of genes involved in the pathobiology of Barrett’s esophagus.
L’esofago di Barrett è il più importante fattore di rischio per lo sviluppo dell’adenocarcinoma esofageo. La diagnosi di mucosa di Barrett (MB) è definita dalla sostituzione della mucosa esofagea nativa con mucosa ghiandolare intestinalizzata (i.e. metaplasia intestinale [MI]). Recentemente, anche metaplasie di tipo non intestinale (i.e. metaplasia gastrica [MG]) sono state associate ad un aumentato rischio di evoluzione neoplastica. Profili molecolari di espressione possono indagare il significato biologico e preneoplastico delle differenti lesioni metaplasiche esofagee. I microRNA (miRNA) sono una classe di piccole molecole di acido ribonucleico non codificante che regolano l’espressione di circa un terzo dei geni umani mediante meccanismi trascrizionali e traslazionali. L’alterata espressione dei miRNA è di fondamentale importanza in patologia umana ed è stata descritta nella cancerogenesi di Barrett. La famiglia delle Ultra Conserved Regions (UCRs) è una classe di 481 sequenze non codificanti conservate tra uomo, ratto e topo. La maggior parte (93%) è trascritta (definite come T-UCRs) nei tessuti normali e la loro espressione è alterata nei tumori. Non sono mai state studiate nella carcinogenesi di Barrett. Gli obiettivi di questo dottorato di ricerca sono stati: i) esplorare il ruolo della deregolazione dei miRNA nella genesi delle lesioni metaplasiche esofagee; ii) definire biologicamente la sequenza delle lesioni metaplasiche che insorgono nella carcinogenesi di Barrett; iii) individuare nuovi marcatori molecolari da introdurre nella diagnostica delle lesioni associate all'esofago di Barrett; iv) identificare miRNA o T-UCR deregolati nel processo di carcinogenesi di Barrett. Principali risultati: i) lo studio del profilo di miRNA deregolati nella carcinogenesi di Barrett; ii) definizione dei profili di espressione dei miRNA legati alle lesioni metaplasiche esofagee; iii) il ruolo della deregolazione di miR-125a-5p/miR-125b e della loro regolazione dell'espressione di HER2 nelle neoplasie gastroesofagee; iv) il ruolo del miR-145 nella acquiszione del fenotipo intestinale e del suo targeting di GATA6; v) lo studio del profilo delle T-UCR deregolate nella carcinogenesi di Barrett. I presenti studi contribuiscono a chiarire le basi molecolari delle alterazioni metaplasiche e displasiche incluse nella oncogenesi di Barrett. In futuro i miRNA potranno essere introdotti nella pratica clinica come biomarcatori diagnostici e prognostici. I risultati ottenuti dovranno essere validati su grandi casistiche multicentriche con follow-up clinico-endoscopico.

RESEARCH OF XENOBIOTIC FACTORS, ESPECIALLY OF NICOTINE E COTININE, ON HISTOLOGICAL SAMPLES COLLECTED FROM FETUSES AND NEWBORNS DEAD FOR NATURAL CAUSES. As Sudden Infant Death Syndrome still holds many unknown etiopathogenetic aspects and as analytic chemical instruments and methods have appreciably improved in the past years, samples of 35 corpses, represented by fetuses and newborns dead for natural causes, have been subjected to analytical research for xenobiotic substances. Kidney, liver, lung, brain, skin, and sometimes small amounts of hair, have been collected during autopsy, for a total of 151 samples. All the samples have been analyzed first by screening tests for toxicological substances and then by ICP-MS analysis for 61 different metals. At last, all the 151 samples have been subjected to UPLC/MS-MS technique for the relief and dosage of nicotine and cotinine.

Background. La nascita pretermine si accompagna ad un aumentato rischio di sviluppare un danno neurologico, che può presentarsi con diversi quadri patologici, in relazione all’entità del danno e all’età gestazionale del neonato. L’identificazione precoce dei fattori di rischio di danno neurologico nella popolazione dei nati prematuri è di fondamentale importanza per migliorare l’assistenza al neonato sia durante il ricovero in Terapia Intensiva Neonatale, sia per guidare e personalizzare il follow-up post-dimissione. Mentre diversi studi hanno evidenziato un significativo ruolo dei fattori postnatali precoci sullo sviluppo di tali lesioni, il ruolo dell’ambiente intrauterino e della patologia placentare sullo sviluppo di tali lesioni non è ancora stato del tutto chiarito. L’analisi istologica placentare può fornire indicazioni preziose circa la possibile eziopatogenesi delle lesioni cerebrali neonatali e, nella sua componente fetale, rappresenta un ottimo tessuto di partenza per l’identificazione di nuovi biomarker. Metodi. Lo studio, che ha interessato 289 neonati pretermine < 32 settimane gestazionali ricoverati alla nascita presso la U.O. Terapia Intensiva Neonatale tra gennaio 2012 e ottobre 2017, ha valutato il ruolo di numerosi fattori di rischio perinatali sullo sviluppo di lesioni cerebrali della prematurità (emorragia intraventricolare, emorragia cerebellare, lesioni della sostanza bianca), diagnosticate mediante RM al termine di età corretta. È stata inoltre effettuata la ricerca di un’associazione tra tali lesioni e le caratteristiche istopatologiche placentari, rivalutate secondo la recente classificazione di Amsterdam. Inoltre, su un sottogruppo di tali soggetti è stata eseguita l’analisi proteomica con spettrometria di massa del liquido amniotico e dell’amnion prelevati alla nascita, analizzata tramite Weight Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA). Per l’analisi statistica dei fattori di rischio è stata effettuata una analisi descrittiva dei dati mediante l’utilizzo del t test di Student per le variabili continue e il test χ2 o il Fisher's exact test per le variabili categoriche. È stata inoltre effettuata una analisi univariata dei fattori considerati e successivamente multivariata considerando unicamente le variabili statisticamente significative o borderline all’analisi univariata. Risultati. Lo studio ha evidenziato una significativa correlazione tra lesioni cerebrali e alcune caratteristiche perinatali, confermando le osservazioni di studi precedenti (presenza di emorragia cerebellare [OR: 8.14], ventilazione meccanica nelle prime 72 ore [OR: 2.67] e pervietà del dotto di Botallo trattata farmacologicamente [OR: 2.6]. Dopo correzione per l’età gestazionale, uno dei fattori di rischio indipendenti più importanti nel determinare il rischio neurologico, e nello specifico, di emorragia intraventricolare è risultata essere la corioamnionite coinvolgente il versante materno di stadio 1 [OR: 2.92] e stadio 3 [OR: 4], mentre non emersa alcuna correlazione tra reperti placentari e altre lesioni cerebrali. Dallo studio di proteomica è emerso un pattern di co-espressione proteica caratteristico in caso di corioamnionite interessante il versante fetale della placenta [ME brown: indice di Pearson 0.9; p < 0.05]. L’identificazione delle componenti proteiche presenti in tale pool potrebbe portare all’identificazione di uno o più nuovi marker di corioamnionite che dosato nel sangue neonatale, o possibilmente, in quello materno potrebbe essere utilizzato per guidare una precoce valutazione del rischio di lesione cerebrale nel neonato pretermine. Conclusioni. Dalla combinazione di entrambi gli studi emerge la evidente complessità del quadro di infiammazione della diade madre/feto che consta della corioamnionite istologica (solo di recente definita) e della meno oggettivabile, addirittura se non solo sospetta, corioamnionite clinica (febbre materna). Il fattore più importante per capire il coinvolgimento del futuro neonato, del suo essere più o meno “pre-condizionato” dallo stato materno, più o meno prono a sviluppare patologie neonatali, è la presenza di FIRS (Fetal Inflammatory Response Syndrome) che è verosimile debba prevedere l’infiammazione della membrana amniotica e presentare valori di proteomica significativamente alterati sul versante fetale a dimostrazione del coinvolgimento di questa componente. Rimane indiscutibile la multifattorialità delle lesioni cerebrali ed il preponderante ruolo dell’età gestazionale nella loro insorgenza. Tali osservazioni, insieme alla doverosa continua ricerca di biomarker plausibili come il nostro studio ha cercato di dimostrare, sottolineano l’importanza della ottimizzazione del timing del parto prematuro, nel quale il bilancio tra rischi di una nascita troppo pretermine ed i benefici dall’escludere il feto/neonato da un ambiente ostile, quale quello gravidico in corso di infiammazione, vanno ponderati con estrema accortezza.
Background. Preterm birth is associated with an increased risk of brain injuries, which may present with a broad spectrum of clinical features, depending on the severity and the gestational age. The early identification of risk factors for neurological damage in the preterm population is important to improve the perinatal care and to guide the subsequent follow-up. While several studies have highlighted a significant role of early postnatal factors on the development of these lesions, the possible role of the intrauterine environment and the placental pathology has not yet been fully clarified. Placental histological analysis can provide valuable information on the etiopathogenesis of neonatal brain lesions and, in its fetal component, it represents an valuable tissue for the identification of new biomarkers. Methods. The study, which involved 289 preterm infants <32 gestational weeks admitted at birth at our Neonatal Intensive Care Unit between January 2012 and October 2017, evaluated the role of numerous perinatal risk factors on the development of brain lesions of prematurity (intraventricular haemorrhage, cerebellar haemorrhage, white matter lesions), diagnosed by MRI at corrected age. A research project was also carried out to find an association between these lesions and placental histopathological characteristics, re-evaluated according to the recent Amsterdam classification. Furthermore, proteomic analysis with mass spectrometry of the amniotic fluid and amnion was performed on a subgroup of these subjects, analyzed by Weight Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA). For the statistical analysis of risk factors, a descriptive analysis of the data was carried out using the Student's t test for continuous variables and the χ2 test or Fisher's exact test for categorical variables. A univariate analysis of the factors considered and subsequently multivariate was also carried out considering only the statistically significant or borderline variables in the univariate analysis. Results. The study highlighted a significant correlation between brain lesions and some perinatal characteristics, confirming the observations of previous studies (presence of cerebellar hemorrhage [OR: 8.14], mechanical ventilation in the first 72 hours [OR: 2.67] and patency of the Botallo duct treated pharmacologically [OR: 2.6]. After correction for gestational age, one of the most important independent risk factors in determining the neurological risk, and specifically, of intraventricular hemorrhage, was stage 1 chorioamnionitis involving the maternal side [OR : 2.92] and stage 3 [OR: 4], while no correlation emerged between placental findings and other brain lesions. The proteomics study revealed a pattern of protein co-expression characteristic in case of chorioamnionitis involving the fetal side of the placenta [ ME brown: Pearson index 0.9; p <0.05] The identification of the protein components present in this pool could b lead to the identification of one or more new markers of chorioamnionitis which, when measured in neonatal blood, or possibly, in maternal blood, could be used to guide an early assessment of the risk of brain injury in the preterm infant. Conclusions. The hystopatogenesis of the inflammation of the mother / fetus dyad consisting of histological chorioamnionitis (only recently defined) and the less objectified, often only suspected, clinical chorioamnionitis (maternal fever) is complex. The most important factor to understand the involvement of the future newborn, of his being more or less "pre-conditioned" by the maternal state, more or less prone to developing neonatal brain complications, is the presence of FIRS (Fetal Inflammatory Response Syndrome) which shows significantly altered proteomic values on the fetal side. The multifactoriality of brain lesions and the preponderant role of gestational age in their onset remains indisputable. These observations, together with the necessary continuous search for plausible biomarkers as our study tried to demonstrate, underline the importance of optimizing the timing of premature birth, in which the balance between the risks of a preterm birth and the benefits of excluding the fetus / newborn from a hostile environment, such as that of pregnancy in the course of inflammation, must be weighed with extreme caution.

Il carcinoma del colon rappresenta il terzo tumore maligno per incidenza e mortalita` nei Paesi occidentali e uno dei modelli meglio caratterizzati di progressione neoplastica da un punto di vista molecolare. Negli ultimi anni, e` emersa con grande vigore l’importanza dei mediatori solubili presenti nel microambiente tumorale nel modulare l’azione delle proteine coinvolte nella sopravvivenza e nella morte cellulare per promuovere la progressione tumorale. Nel presente studio abbiamo analizzato l’espressione di proteine coinvolte nella riparazione dei danni del DNA, nella sopravvivenza e nella morte cellulare nella sequenza adenoma-carcinoma del carcinoma del colon. Inoltre, abbiamo valutato il ruolo della citochina pro-infiammatoria IL-6, presente negli stati di infiammazione cronica ed acuta dell’intestino, sulla modulazione dell’espressione di Bax, Ku70, Ku86 e Clasterina e delle loro interazioni. Abbiamo dimostrato che l’azione di IL-6 avviene a livello di alterata espressione o alterata localizzazione e, di conseguenza, alterata funzione delle proteine coinvolte nella riparazione dei danni del DNA e nella sopravvivenza. Cio` rende il condizionamento da parte di questi fattori flessibile e adattabile ai vari stadi dell’evoluzione del tumore. Infine, abbiamo valutato se la over-espressione della forma secretoria della Clasterina (sCLU) osservata in tumori aggressivi potesse essere correlata ad un aumento del suo rilascio in circolo. La presenza di sCLU e` stata quindi valutata nel sangue e nelle feci di pazienti affetti da carcinoma del colon e in soggetti esenti da neoplasie intestinali giungendo alla conclusione che i livelli di Clasterina secreta possono avere valore prognostico per il carcinoma del colon.
Colon cancer is the third most common malignancy in the Western countries for incidence and mortality and it is one of the best characterized molecular models of cancer progression. Recently, the role of tumour microenvironment soluble mediators has emerged as an important factor in modulating the action of proteins involved in cell survival and cell death, promoting cancer progression. In this study, we have analysed the expression of proteins involved in DNA damage repair, in cell survival and in cell death in the adenoma-carcinoma sequence of colon cancer. Moreover, we have evaluated the role of the pro-inflammatory cytokine IL-6 (present in the bowel chronic and acute inflammatory state) on the modulation of the expression of Bax, Ku70, Ku86 and Clusterin and on their interactions. We have demonstrated that the action of IL-6 microenvironment factor occurs through altered expression or localization modifying the function of proteins involved in DNA damage repair and cell survival. Hence, the action of these factors is flexible and adaptable to the diverse stages of tumour evolution. Finally, we have assessed the possible correlation between the over-expression of the secreted form of Clusterin (sCLU) observed in the most aggressive tumours and its release in circulation. The presence of sCLU has been evaluated in the blood and stool of colon cancer patients and in individuals without bowel neoplasia. We conclude that the level of secreted Clusterin has a prognostic value for colon cancer.

The epidermal growth factor receptor (EGFR) is a transmembrane receptor with tyrosine-kinase activity that can be activated by different ligands. This event triggers a cascade of signals downstream with effects on cell survival and proliferation. The mutational event of EGFR is able to induce the constitutional activation that can be effectively blocked by the administration of drugs with anti-receptor activity. The evaluation of EGFR mutational profile is a fundamental survey to select patients affected by advanced non-small cell lung cancer (NSCLC), which can undergo treatment with specific drugs. In fact, EGFR mutations are reported in a subpopulation of patients ( 8-20 %) with NSCLC, which grows in non-smokers, being female and belonging to Asian race. The most frequent mutations (90 % of the mutated samples) are located in Exon 19 (in-frame deletions: E746 - A750 ) and Exon 21 of the EGFR (point substitutions: L858R). Different technologies are used to evaluate the EGFR mutational status, including Sanger Sequencing, Pyrosequencing and Real Time PCR. Immunohistochemistry has also been proposed, even if not validated as a possible investigation complementary to those of molecular type. The purpose of the present work is to carry out a comparative analysis of these technologies (Sanger Sequencing, Pyrosequencing and Immunohistochemistry) in a series of patients with primary non-small cell lung cancer. The evaluation of the results took into account both the accuracy of the methods and other factors such as execution time, complexity of the procedure and cost/benefit ratio. Using tumor cell lines containing scalar dilutions of EGFR mutated alleles (1, 10, 20, 50%) we preliminarily stated that the Pyrosequencing in our hands, within a tumor population, is able to detect 10% of mutated alleles compared to 20% of mutated alleles detected by Sanger Sequencing. Then, we validated the diagnostic accuracy of these methods in our laboratory as part of two programs of quality controls developed at the national level on external occurences. The comparative research between Sanger Sequencing and Pirosequencing was carried out on 258 primary lung carcinomas, including 229 adenocarcinomas, using archival histological material formalin-fixed and paraffine-included which comprised materials of surgical origin both from therapeutic procedures (lung resections) and from diagnostic procedures (biopsies). The frequency of mutation detected by Pyrosequencing was 13,1% , higher than the one observed using Sanger Sequencing of 11,4%. Over the entire population of primary lung cancer with EGFR mutation (n=26), the gain in sensitivity of Pyrosequencing compared to Sanger Sequencing was 15,4% (4/26 cases). It is interesting to note that the cases identified as mutated by Pyrosequencing (not by Sanger Sequencing) came from samples characterized by reduced tumor cells (2 biopsies and 2 surgical microdissections). This finding is particularly significant taking into account the fact that EGFR mutation study is at present almost exclusively carried out on bioptic material taken from patients with lung cancer in advanced phase and thus inoperable. We then evaluated the diagnostic accuracy of immunohistochemistry in identifying typical mutations of EGFR. For this purpose, 73 adenocarcinomas with mutational profile related to Pyrosequencing [41 cases mutated for Exon 19 of EGFR (E746–A750del) and 31 mutated for Exon 21 (L858R)] were immunocolored using antibodies anti-E746-A750del for Exon 19 and anti-L858R for Exon 21. The diagnostic accuracy of immunohistochemistry was found to be between 80,3% (antibody anti-E746- A750del) and 90,7% ( antibody anti-L858R) with absolute specificity and sensitivity ranging from 67,7% to 69,0%. Overall, the immunohistochemical technique, even if limited to the identification of the two most frequent mutational events, turned out to be accurate enough and with much lower costs and execution times faster than molecular investigations. To sum up, our research proves both the suitability and the superiority of Pyrosequencing compared to Sanger Sequencing as for the ability to detect the presence of EGFR mutations in a consecutive series of primary non-small cell lung carcinomas. On the contrary, immunohistochemistry turned out to be a technique less sensitive in determining mutational arrangements of the same cases. Since this technique proved to get the same specificity and to be less expensive and faster than the first two, it is possible to use it in clinical diagnostics as preliminary screening investigation of the most frequent mutational events.

From the second half of past century to nowadays aquaculture keeps on being the fastest-growing animal-food-producing sector, so that it has provided the 46% of total food fish supply in 2010. However, we are faced with a few problems closely connected to some aspects that are still unknown in the biology of certain relevant species such as the gilthead seabream (Sparus aurata). Functional genomics can offer very well-grounded tools to get information about the molecular mechanisms which are involved in physiological processes whose consequences may be very high also from an economic point of view. The issue concerning how the marine organisms and populations react to climatic changes is a question of paramount importance which is still rather unsettled. The gilthead bream is very sensitive to low temperatures, so that it does not survive when temperature falls under 5°C. In fact, in winter time the breeding cause often huge economic losses to their owners since the mortality rate rises because of metabolic syndrome known as winter disease. In this study we considered the gene expression profiles of Sparus aurata individuals which have been exposed to low temperatures, in experimental conditions that could represent as realistic as possible the winter season. The gene expression profile can be used as a tool to link up the genotype to the physiology and to the phenotype. Moreover, the study looked into populations coming from regions with different climatic conditions (Veneto and Sicily), by assuming a different tolerance to cold exposition. Four groups of wild sea bream (120±16 g), coming in pairs from the two regions, were exposed for 21 days to two temperature treatments: 16 ± 0.3 °C (control groups) and 6.8 ± 0.3 °C (cold groups). Liver and gill samples were collected during acute (0, 6 and 24 hours) and chronic exposure (21 days). The gene expression profiles were analyzed using an oligo-nucleotide microarray technology, with about 19,715 ESTs. Results revealed a complex transcriptomic response to cold with many molecular pathways involved among which: lipid and carbohydrate metabolism, regulation of heat shock proteins (HSPs) and other protein chaperones, protein degradation and repair, regulation of cell death, RNA and DNA metabolism, immune response. The earliest transcriptional response is linked to oxidative stress and anti-oxidant/survival cell response, suggesting an immediate disturbance of systemic oxygen balance. The largest transcriptional difference between cold and control groups occurred during long-term exposure, involving primarily several genes of lipid metabolism with a role in the re-allocation of energy sources and immune-related genes indicating an immunosuppressive effect of cold exposure. The data on the liver and gill transcriptome of the gilthead sea bream exposed to cold provide a starting point to investigate physiological mechanisms underlying long term cold adaptation in fish and to address future research for the identification of cold tolerant S. aurata strain for aquaculture.
Dalla seconda metà del secolo scorso ad oggi l‟acquacoltura continua ad essere il settore delle produzioni animali in più rapida crescita, con il 46% di pesce fornito sul totale consumato nel 2010. Rimangono, tuttavia, problematiche strettamente legate ad aspetti ancora sconosciuti nell‟ambito della biologia di alcune specie d‟interesse come l‟orata comune (Sparus aurata). La genomica funzionale può fornire validi strumenti per ottenere informazioni sui meccanismi molecolari coinvolti nei processi fisiologici importanti anche da un punto di vista economico. Come le popolazioni e le specie marine reagiscono ai cambiamenti climatici è una questione di importanza centrale ancora non del tutto risolta. L‟orata comune risente fortemente del freddo, non sopravvivendo a temperature inferiori ai 5°C e spesso, durante l‟inverno, gli allevamenti subiscono ingenti danni economici per l‟elevata mortalità data dalla sindrome metabolica winter disease. In questo studio sono stati valutati i profili di espressione genica di individui di S. aurata esposti alle basse temperature, in condizioni sperimentali che fossero il più realistiche possibile con la stagione invernale. Il profilo di espressione genica può servire come strumento per legare il genotipo alla fisiologia e al fenotipo. Sono state, inoltre, esaminate popolazioni provenienti da regioni con condizioni climatiche diverse, Veneto e Sicilia, ipotizzando una differente tolleranza al freddo. Quattro gruppi di orate (120±16 g), provenienti a coppie dalle due regioni, sono state esposte per 21 giorni a due trattamenti di temperatura: 16 ± 0,3 °C (gruppi di controllo) e 6,8 ± 0,3 °C (gruppi dei trattati). Campioni di fegato e branchia sono stati raccolti durante esposizione acuta (0, 6 e 24 ore) e cronica (21 giorni). I profili di espressione sono stati analizzati usando un microarray a oligo-nucleotidi con circa 19.715 geni. I risultati hanno rivelato una risposta trascrizionale complessa per la risposta al freddo, con numerosi pathway coinvolti: metabolismo di lipidi e carboidrati, heat shock protein (HSP) e chaperoni, degradazione proteica, apoptosi, metabolismo di RNA e DNA, risposta immunitaria. La prima risposta è legata allo stress ossidativo, suggerendo un disturbo immediato del bilancio dell‟ossigeno a livello sistemico, mentre le più grandi differenze trascrizionali tra trattati e controlli si rilevano durante l‟esposizione a lungo termine, e coinvolgono principalmente geni del metabolismo lipidico per la ridistribuzione delle riserve energetiche e geni dell‟immunità per l‟importante effetto immuno-soppressivo del freddo. I dati del trascrittoma di branchia e fegato di orate esposte alle basse temperature forniscono un punto di partenza per indagare i meccanismi fisiologici sottostanti l‟adattamento al freddo a lungo termine nei pesci e per indirizzare ricerche future volte all‟identificazione di ceppi di S. aurata resistenti al freddo in acquacoltura.

Feline chronic and recurrent inflammatory and mucocutaneous diseases represent a frustrating problem in veterinary clinical practice. These diseases such as ulcerative and allergic dermatides, feline lymphoplasmacytic chronic gingivostomatitis, rhinitis and pododermatitis recur frequently have a poor therapeutic response, have often an unknown etiology, have been poorly characterized pathogenically and may demonstrate progression to neoplasia. The aim of this study was to analyze some aspects of the etiology (viral antigen component), the histopatological aspects of ulcerative dermatides with eosinophilic component and the role of feline herpes virus 1. The role of viral antigens and type of plasma cell population present in feline lymphoplasmacytic gingivostomatitis and to better characterize the lesions of the linear presentation of feline eosinophilic granuloma complex. Ulcerative eosinophilic dermatitis is common in cats however the forms associated with feline herpes virus 1 seem uncommon. The disease is characterized by cutaneous ulcers secondary to epidermal, adnexal and dermal necrosis. Differential diagnoses for feline ulcerative and eosinophilic dermatitis include for FHV-1 lesions, mosquito bite hypersensitivity and eosinophilic granuloma complex. Histopathological diagnosis of FHV-1 dermatitis is based on the detection of the intranuclear inclusion bodies. In cases where intranuclear inclusions are missing (eg. severe necrosis, chronic or recurrent cases) but clinical and histological findings are compatible with FHV-1 dermatitis, IHC and PCRs were applied and results were compared. Our main results was that when clinical signs and histopathology suggest FHV-1 infection in the absence of typical inclusion bodies, IHC should be the preferred diagnostic test; PCR may be useful for initial screening, but due to false positives is not sufficient for a definitive diagnosis. This is due to the presence in latency of the virus in previously infected cats. Feline gingivostomatitis is a common disease in cats; many viral, bacterial, allergic, immunoresponsive alteration have been implicated in the disease. We evaluated the presence of antigens of Feline leukemia virus, the persistence of Feline Calicivirus, the type of plasmacells (IgG, IgM, IgA) and the possible transformation of plasmacells during the chronic process by evaluation of Ki67 (proliferation index) and clonality. Surprisingly, the majority of cases had IgG plasmacells that demonstrate to proliferate and in some instances to represent a clonal proliferation. Feline eosinophilic granuloma is a common, clinically heterogeneous syndrome affecting skin, mucocutaneous junctions and oral mucosa: clinical presentation are unified by a similar histopatological pattern. The lesions have been subdivided clinically according with presentation and lesion location. The most common cutaneous presentation is linear granuloma. In this form distinctive, hairless, well circumscribed, firm, pink red elevated plaques develop in a strikingly linear pattern on the caudal thighs, forelegs or less commonly the neck or thorax. We evaluated the histological inflammatory process and identified vessel walls by immunohistochemistry (Factor VIII and CD31). Histology demonstrate that the linear pattern may be the consequence of the inflammation associated not only to the connective tissue but with the vessel walls representing most likely a lymphangitis.

Spinocerebellar ataxias (SCAs) are a genetically heterogeneous group of cerebellar degenerative disorders, characterized by progressive gait unsteadiness, hand incoordination and dysarthria. The mutational mechanism in spinocerebellar ataxia type1 (SCA1), a dominantly inherited form of SCA, consists of an expanded trinucleotide CAG repeat that encodes a polyglutamine tract in ataxin1. Mutant SCA1 transgenic mice present pathological cerebellar signs with concomitant progressive Purkinje neuron atrophy and relatively little cell loss, at least in the early stage of life; this evidence suggests that the SCA1 phenotype is not the result of cell death per se, but a possible effect of cellular dysfunction that occurs before neuronal demise. In the present study we correlated the earliest histopathological changes in both homozygous and heterozygous transgenic SCA1 mice, 2 and 6 months old, to the mitochondrial oxidative metabolism in cerebellar cells. Our results showed selective Cytochrome c Oxidase (COX) deficiency in Purkinje cells (PC). Analysis on COX-competent and -deficient PC, isolated by laser-microdissector, demonstrated that the observed oxidative dysfunction is related to mitochondrial DNA (mtDNA) depletion. In conclusion, we provide evidence of a selective oxidative metabolism defect in neuronal PC expressing mutant ataxin. This defect could represent one of the earliest pathogenetic step of the Purkinje cells’ suffering in SCA1 disease.

Introduction: Feline Vaccine-Associated Sarcomas (FVAS) are mesenchimal neoplasms whose treatment is still unrewarding. Wide surgery with megavoltage radiotheraphy is considered the gold standard treatment in FVAS. Radiotheraphy units are not available for veterinary patients in Italy, moreover the usefulness of chemotherapy as an adiuvant tool is far to be proven. The aim of this retrospective study is to compare clinical outcome of cats treated with wide surgery alone or in combination with two different doxorubicin-based chemotherapy protocols. Methods: The medical records of cats with histologically confirmed diagnosis of FVAS were reviewed. Feline patients were enrolled in three different treatment groups. Group A: doxorubicin (1mg/Kg every three weeks) twice before and twice after wide surgery; group B: four doxorubicin cycles after wide surgery (1mg/Kg every three weeks); group C: wide surgery alone. In each group the frequence of local recurrence (χ2test p< 0.05) and the disease free interval (DFI) for not censored data (Kaplan-Meier and log-rank-test p<0.05) has been evaluated. Results: The median follow up was 501 days. The recurrence rate was calculated in 50% in group A, 20% in group B and 29% group C. The median DFI was 476 days in group A and was not reached in group B and C but ranged from 40 to 476 days. No statistically significant differences were not found between the groups. Conclusion. Adjuvant and neoadjuvant chemotherapy did not seem to influence the DFI. Further studies are needed to definetivily delineate the therapeutic role of doxorubicin in FVAS.