To see the other types of publications on this topic, follow the link: Mutagenèse dirigée.
Dissertations / Theses on the topic 'Mutagenèse dirigée'
Create a spot-on reference in APA, MLA, Chicago, Harvard, and other styles
Consult the top 50 dissertations / theses for your research on the topic 'Mutagenèse dirigée.'
Next to every source in the list of references, there is an 'Add to bibliography' button. Press on it, and we will generate automatically the bibliographic reference to the chosen work in the citation style you need: APA, MLA, Harvard, Chicago, Vancouver, etc.
You can also download the full text of the academic publication as pdf and read online its abstract whenever available in the metadata.
Browse dissertations / theses on a wide variety of disciplines and organise your bibliography correctly.
1
Travé, Gilles. "Etude fonctionnelle de l'annexine I par mutagenèse dirigée." Toulouse 3, 1992. http://www.theses.fr/1992TOU30183.
Full textAbstract:
Ce travail a porte sur une proteine liant les phospholipides acides en presence de calcium: l'annexine i. Nous avons tout d'abord mis au point en combinant genie genetique et biochimie, un systeme d'expression/modification/purification d'annexines i recombinantes. Ce systeme a ete ensuite applique a l'etude de 2 motifs structuraux precis de l'annexine i: la sequence de 9 acides amines proposee pour l'inhibition de la pla2, situee dans l'helice d du domaine iii, et le site calcium consensus situe dans la boucle a-b du domaine ii. Concernant la phospholipase a2, les resultats obtenus laissent penser que la sequence etudiee n'intervient pas dans le phenomene d'inhibition de la phospholipase, dans les limites du test utilise. Ceci nous amene, dans la discussion, a proposer un mode d'action alternatif des peptides antiflammine, ainsi qu'a favoriser un modele d'action de l'annexine quant a cette activite anti-phospholipase. Concernant le site calcium du domaine ii, nos resultats nous permettent tout d'abord des conclusions structurales, concernant le role de chacun des residus mutes dans la reponse de la proteine au calcium et aux lipides. De plus, ils nous permettent de proposer, dans la discussion, des modeles concernant l'activation du monomere par le calcium pour des phenomenes apparemment differents: liaison aux lipides, agregation de particules lipidiques, liaison a l'actine, auto-association de monomeres
2
Cagnon, Christine. "Etude des résistances aux antibiotiques glycopeptidiques par mutagenèse dirigée." Toulouse, INSA, 1991. http://www.theses.fr/1991ISAT0012.
Full textAbstract:
L'étude structurale et fonctionnelle des résistances aux antibiotiques glycopeptidiques a été envisagée en étroite collaboration avec le Laboratoire de cristallographie biologique de l'IBMC de Strasbourg. Un outil génétique performant pour l'ingénierie des protéines a été mis en place. Il est composé d'une famille de vecteurs permettant le clonage de gènes étrangers dans Escherichia coli, le séquençage et la mutagenèse dirigée. Leur expression est soumise au contrôle d'un promoteur fort inductible à l'arabinose. La protéine produite peut être recueillie dans le cytoplasme ou le periplasme. De plus, une cassette de fusion avec le gène LACZ permet d'obtenir éventuellement une protéine fusionnée à la beta-galactosidase active. Après purification, un clivage spécifique permet de séparer les deux proteines. L’expression des gènes de résistance aux antibiotiques glycopeptidiques a ete envisagée après la mise en place de tests permettant de detecter l'activité de résistance in vivo et in vitro. Un test quantitatif a été mis au point. La protéine SH BLE a été produite dans Escherichia coli et a été purifiée et cristallisée. La détermination de sa structure tridimensionnelle par la méthode de diffraction des rayons X est freinée par des problèmes d'anisomorphisme des derivés lourds du cristal. Une première mutagénèse pour introduire une seconde cystéine sur la protéine n'a pas permis de contourner cette difficulté. Les protéines SA BLE et Tn5 ble sont également produites dans Escherichia coli. Il a été montré que le codon d'initiation de la traduction de SA BLE est un GIG. Les purifications de ces deux protéines se sont avérées plus délicates que pour la protéine SH BLE. Enfin, des expériences de mutagenèse dirigée sur le gène de la protéine SH BLE ont été réalisées.
3
Bezzine, Sofiane. "Etude des relations structure-fonction des lipases pancréatiques par mutagenèse dirigée." Aix-Marseille 3, 1999. http://www.theses.fr/1999AIX30031.
Full text
4
Pham, Viet-Laï. "Aminopeptidase B : modélisation moléculaire et étude du site actif par mutagenèse dirigée." Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066546.
Full textAbstract:
L’aminopeptidase B (Ap-B ; EC 3. 4. 11. 6) hydrolyse les acides aminés basiques en N-terminal de peptides et est impliquée dans la maturation d’hormones et probablement de neuropeptides selon un mécanisme original récemment mis en évidence. À ce jour, un seul de ses substrats physiologiques a été identifié, le glucagon qui, de par l’action successive de la NRD convertase puis de l’Ap-B, est transformé en miniglucagon. Ces deux hormones participent à la régulation de l’homéostasie du glucose chez les Mammifères. Une autre particularité de l’Ap-B est de présenter, in vitro, une activité résiduelle de type e��poxyde hydrolase, capable d’hydrolyser le leucotriène A4 (LTA4) en leucotriène B4, un médiateur lipidique de l’inflammation. A l’inverse, son plus proche parent phylogénétique, la Leucotriène A4 Hydrolase (LTA4H ; EC 3. 3. 2. 6) possède, en plus de son activité époxyde hydrolase, une activité aminopeptidase toutefois moins spécifique. Une analyse structurale et fonctionnelle de l’Ap-B est nécessaire pour mieux comprendre les mécanismes catalytiques de l’enzyme et pour parvenir à la conception d’inhibiteurs spécifiques, dont l’utilisation devrait nous éclairer sur l’ensemble de ses fonctions in vivo. Nous avons mis au point un système d’expression et de purification de l’Ap-B chez E. Coli avant d’entreprendre une analyse fonctionnelle par mutagenèse dirigée d’un certain nombre de résidus potentiellement impliqués dans l’activité de l’enzyme. Ces acides aminés ont été identifiés par alignement des séquences des protéines de la famille M1 à laquelle appartiennent l’Ap-B et la LTA4H. Cette étude a, par ailleurs, permis d’identifier 3 sous-familles distinctes d’aminopeptidases. Cette famille M1 est caractérisée par la présence d’un motif de fixation du cation Zn2+ de type HEXXHX18E. Les mutations des résidus de ce motif conduisent à une perte totale de l’activité de l’Ap-B, confirmant ainsi le rôle essentiel de ces résidus dans le mécanisme catalytique. La famille M1 est également caractérisée par la présence d’un second motif consensus (GXMEN). Nous avons également muté l’ensemble des résidus de ce second motif. Si les mutations des acides aminés M, E et N conduisent à une perte de l’activité, les mutations du résidu G en sérine ou proline donnent naissance à deux protéines actives. Le mutant G298S a des propriétés proches de l’enzyme sauvage, tandis que le mutant G298P présente une modification de sa spécificité de substrat (clivage de R, K, P et A), de son profil d’inhibition et de son activité en présence d’ions Cl-. L’analyse de ces mutants par dichroïsme circulaire et spectrométrie de fluorescence montre que les structures globales de ces enzymes ne semblent pas perturbées. Dix autres acides aminés ont également été mutés et leur étude fonctionnelle est en cours. Les similitudes structurales et fonctionnelles de l’Ap-B et de la LTA4H dont la structure 3D est connue, nous a permis de construire un modèle moléculaire de la structure de l’Ap-B. Ce modèle a été utilisé pour, d’une part, essayer de comprendre le rôle du résidu Glycine du motif GXMEN et, d’autre part, pour mettre en évidence un certain nombre de différences entre l’Ap-B et la LTA4H, en particulier au niveau du site actif et des propriétés potentielles d’interactions protéine-protéines de l’Ap-B. En parallèle, nous avons mis au point un second système d’expression et de purification de l’Ap-B à partir d’un vecteur baculovirus et de cellules d’insectes. Ce système nous permet d’obtenir une quantité suffisante d’enzyme pour mettre au point les conditions de cristallogenèse de la protéine<br>Aminopeptidase B (Ap-B ; EC 3. 4. 11. 6) cleaves basic residues at the N-terminus of peptides and participates in hormone and neuropeptide processing through an original mechanism recently described. The only known physiological substrate of Ap-B is the glucagon, which is processed into miniglucagon by NRD convertase and Ap-B. In mammals, these hormones are involved in the regulation of glucose homeostasis. One second characteristic of Ap-B is that the enzyme exhibits, in vitro, a residual ability to hydrolyze leukotriene A4 (LTA4) into the pro-inflammatory lipid mediator leukotriene B4. Inversely, LTA4 hydrolase (LTA4H ; EC 3. 3. 2. 6), the closest homologous protein of Ap-B, possesses, besides an epoxyde hydrolase activity, an aminopeptidase activity of broader specificity. Both proteins belong to the M1 family of Zn2+-aminopeptidases. A structure-function analysis is needed for a detailed understanding of the enzymatic mechanisms of Ap-B and to aid in the design of inhibitors, which could be used to determine its whole in vivo functions. In order to carry out a functional analysis by site-directed mutagenesis, we developed an expression system and a purification procedure of Ap-B using E. Coli. Amino acid residues potentially involved in the aminopeptidase activity are identified using alignments of primary structures of proteins from the M1 family. This study allowed us to identify 3 distinct M1 sub-families. This M1 family is characterized by the presence of a HEXXHXn=18E Zn2+- binding motif. Mutations of these residues lead to a total loss of activity and confirm their essential roles in catalysis. The major part of the M1 family members (Ap-B, LTA4H,…) constitutes the main sub-family and possesses a second consensus motif (GXMEN). Mutations of the M, E or N residues also lead to a total loss of aminopeptidase activity. Surprisingly, replacement of the conserved glycine into a serine or a proline created two new active enzymes. The G298S mutant exhibits properties similar to the wild type enzyme, whereas the G298P mutant shows a modification of its substrate specificity (recognizing R, K, P and A), its inhibition profile and its behavior towards Cl-. Fluorescence spectroscopy and circular dichroïsm analyses did not show any fundamental modification in the mutant structures. Ten other residues were mutated in the Ap-B primary structure and their functional studies are in progress. The sequence and catalytic similarities shared between Ap-B and LTA4H and the determination of the X-ray structure of LTA4H led us to build a 3D structural model of Ap-B. This model was used, on one hand, to better understand the enzymatic role of the glycine residue of the GXMEN motif and, on the other hand, to highlight functional differences between Ap-B and LTA4H, particularly at the level of their active site and of their proteinprotein interaction properties. In parallel, we also developed a second system of expression and purification of Ap-B using baculovirus and insect cells. This system allows us to purify a sufficient amount of protein for crystallogenesis assays
5
Roberge, Claude. "Mutagenèse dirigée des gènes T moyen et grand T du virus du polyome." Mémoire, Université de Sherbrooke, 1987. http://hdl.handle.net/11143/11708.
Full textAbstract:
La délétion dl97 s'étend des nucléotides 1367 à 1396 et touche une région codante commune aux antigènes T moyen et grand T du virus du polyome. Le T moyen mutant MT97, affecté par cette délétion, perd son potentiel de transformation de lignées établies in vitro et son pouvoir de tumorigenèse in vivo. Le grand T mutant LT97, affecté par cette délétion, présente une efficacité accrue d'immortalisation et, contrairement au grand T sauvage, il est capable de complémenter le T moyen tant pour la transformation de cellules primaires in vitro que pour la tumorigenèse in vivo. Ce comportement pourrait s'expliquer par l'inaptitude de ce mutant à initier la réplication de l'ADN viral et, par conséquent, à exercer un effet cytopathique. Afin de mieux comprendre le rôle des antigènes tumoraux du virus du polyome dans la transformation néoplasique et la réplication de l'ADN viral, nous avons utilisé la technique de mutagenèse par boucle de délétion afin d'introduire des mutations ponctuelles dans la région du génome du virus du polyome correspondant à la délétion dl97. Nous avons construit 6 T moyen mutants, qui conservent tous leur potentiel de transformation, ainsi que 4 grand T mutants dont 3 sont incapables d'initier la réplication de l'ADN viral et présentent un potentiel accru d'immortalisation, ces deux propriétés paraissant liées.
6
Laporte, Stéphane. "Caractérisation moléculaire du récepteur à l'angiotensine II de type 1 par mutagenèse dirigée." Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1997. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk3/ftp04/nq26386.pdf.
Full text
7
Chodorge, Matthieu. "Optimisation des stratégies pour l'évolution dirigée des protéines." Montpellier 2, 2005. http://www.theses.fr/2005MON20008.
Full text
8
Cedrone, Frédéric. "Evolution dirigée de l'Epoxyde Hydrolase d'Aspergillus niger : de la mise en place de la technologie aux premiers mutants." Aix-Marseille 2, 2004. http://www.theses.fr/2004AIX22053.
Full text
9
Goulet, Marie-Claire. "Évolution adaptative des cystatines végétales et modulation de leur activité inhibitrice par mutagenèse dirigée." Thesis, Université Laval, 2007. http://www.theses.ulaval.ca/2007/24509/24509.pdf.
Full text
10
Fréchet, Mathide. "Rôle de la surexpression de L'ADN polymérase ß dans la mutagenèse spontanée et induite." Toulouse 3, 2001. http://www.theses.fr/2001TOU30075.
Full text
11
Dubois, Stéphanie. "Étude de structure-fonction de deux UDP-glucoronosyltransférases humaines, UGT2B15 et UGT2B17, par mutagenèse dirigée." Thesis, National Library of Canada = Bibliothèque nationale du Canada, 1999. http://www.collectionscanada.ca/obj/s4/f2/dsk2/ftp01/MQ41892.pdf.
Full text
12
Richard, Françoise. "Mutagenèse, modélisation et pharmacologie des récepteurs de la neurotensine couplés aux protéines G, NTS1 et NTS2." Nice, 2001. http://www.theses.fr/2001NICE5684.
Full text
13
Koné, Fankroma Martial Thierry. "Méthode de criblage haut-débit pour l'évolution dirigée de glycosidases en transglycosidases : application à la β-glycosidase de Thermus thermophilus". Nantes, 2009. http://www.theses.fr/2009NANT2044.
Full textAbstract:
L’évolution dirigée constitue une nouvelle approche pour explorer les relations structure/fonction des protéines et constitue également une stratégie efficace pour générer de nouvelles activités enzymatiques. Cependant, l'ingénierie de transglycosidases par les méthodes d'évolution dirigée est limitée par l’absence de systèmes de criblage à haut débit pour ces activités enzymatiques. Nous avons développé dans ce travail une nouvelle méthode de criblage haut-débit qui permet de détecter sur des colonies intactes de E. Coli, une activité transférase sur des mutants de glycosylhydrolases faiblement hydrolytiques. Cette méthode est basée sur le suivi par imagerie digitale de la réactivation des mutants par un accepteur de groupement glycosyle. Cette approche a été appliquée a la β-glycosidase de Thermus thermophilus (Ttβgly), enzyme appartenant à la famille 1 des glycosylhydrolases, dans le but de la faire évoluer en transglycosidases. Avec les meilleurs clones isolés par cette stratégie, des rendements de transglycosylation de 70 - 80 % sont atteints pour la synthèse de trisaccharides (Gal-cellobiose). Cette stratégie a été ensuite testée pour le criblage d’autres activités transglycosidasiques de manière à cerner les limites de ce criblage. En particulier, deux systèmes d’exportation (TAT et SRP) des mutants dans le périplasme ont été évalués pour permettre d’appliquer le criblage sur des substrats donneur ou accepteur qui ne pénètrent pas dans la bactérie. Enfin, une activité N-acetyl-glucosaminidase a été génére��e de novo sur la Ttβgly par une approche mixte de mutagenèse dirigée et aléatoire. En fonction des mutations introduites, nous montrons qu’il est possible de contrôler le type de mécanisme utilisé pour l’hydrolyse<br>Directed evolution provides a new approach to explore the structure/function relationship in proteins and also provides an efficient strategy to generate new enzymatic activities. However, the engineering of transglycosidases by directed evolution methodologies is limited by the lack of high-throughput screening systems for these enzymatic activities. In this work we developed a new high-throughput screening method (HTS) which allows the detection of transferase activity of low hydrolytic glycosylhydrolases mutants in intact E. Coli cells. This method is based on the digital imaging monitoring of reactivation of mutants by an acceptor of glycosyl group. This approach has been applied to the glycosylhydrolases family 1 β-glycosidase from Thermus thermophilus (Ttβgly), in order to reveal evolution toward transglycosidase. From the best isolated clones obtained by this strategy, yields of transglycosylation up to 70 - 80 % were performed for trisaccharides synthesis (Gal-cellobiose). This strategy has also been tested for the screening of other transglycosidases activities in order to determine the limits of this screening. In particular, two export systems (TAT and SRP) of mutants in the periplasmic space have been tested to apply the screening on donor or acceptor substrates which do not penetrate in the bacterium. Finally, de novo N-acetyl-glucosaminidase activity has been generated on the Ttβgly by a mixed approach of directed and random mutagenesis. According to the mutations performed, we show that it is possible to control the type of mechanism used for the hydrolysis
14
Senay, Claire. "L'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine, l'UGT1A6 : étude mécanistique et structurale de la protéine recombinante." Nancy 1, 1997. http://www.theses.fr/1997NAN12165.
Full textAbstract:
Les UDP-glucuronosyltransférases appartiennent à une famille d'enzymes membranaires impliquées dans le métabolisme des médicaments de substances endogènes (hormones, bilirubine) et la synthèse de macromolécules polysaccharidiques (glycosaminoglycanes). Nous avons développé la caractérisation du site actif de l'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine glucuronoconjuguant les composés phénoliques plans, l'UGT1A6. L'enzyme recombinante est exprimée de façon stable dans les cellules V79. Au cours de ce travail, la modification chimique de cette enzyme par des inhibiteurs irréversibles tels que les carbodiimides ou la butanedione à permis de mettre en évidence la présence de résidus arginine, aspartique/glutamique impliqués dans la réaction de glucuronoconjugaison. La position de ces acides aminés essentiels a été postulée par alignement de séquence d'après leur conservation entre isoformes. La mutagenèse dirigée de ces résidus a été réalisée. Elle a permis de confirmer la contribution importante des résidus His 54 et Arg 52 dans la réaction de glucuronoconjugaison, après caractérisation des mutants en termes cinétiques et immunologiques. [. . . ]
15
Parent, Jean-Luc. "Étude de la relation structure/fonction du récepteur du "platelet-activating factor" humain par mutagenèse dirigée." Thèse, Université de Sherbrooke, 1996. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/4087.
Full textAbstract:
Le "platelet-activating factor" (PAF) est un puissant médiateur phospholipidique produisant un large éventail de réponses biologiques. Le récepteur du PAF (PAFR) fait partie de la superfamille des récepteurs couples aux protéines G (RCPGs). Ce récepteur lie le PAF avec haute affinité et est couplé à de multiples voies de signalisation menant à des réponses biologiques pouvant être inhibées par une variété d'antagonistes du PAF structurellement distincts.L'objectif principal de mes travaux de doctorat consistait à caractériser la relation structure/fonction du PAFR humain par voie de mutagenèse dirigée. Nous cherchions à déterminer des acides aminés du PAFR pouvant être impliqués dans le couplage à la protéine G et dont la mutation pourrait mener à des changements de structure de la protéine, conférant une activité constitutive au récepteur. Nous avons donc muté deux résidus adjacents, Ala230 et Leu231, de la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire du PAFR en Glu et Arg, respectivement. La substitution de Leu231 par un Arg (mutant L231R) amena deux modifications majeures: (1) une activité constitutive accrue du PAFR en termes de production d'inositol phosphates (IPs) et (2) une plus grande affinité du récepteur pour le PAF (agoniste), mais non pour le WEB2086 (antagoniste). Le mutant L231R semble pouvoir atteindre au moins deux conformations distinctes: (i) un état de haute affinité plus élevé que le récepteur de type sauvage (WT) dépendant du couplage à la protéine G et (ii) un état découplé du récepteur d'affinité plus haute que l'état correspondant du récepteur WT. La substitution de l'Ala230 par un Glu résulta aussi en deux modifications majeures: (1) une perte d'activation du récepteur en termes de production d'IPs suite à une stimulation au PAF et (2) une baisse d'affinité marquée du récepteur pour le PAF et non pour le WEB2086. Des expériences de liaison utilisant du GTP[gamma]S ont démontré que le mutant A230E possède une basse affinité, inhérente à la molécule du récepteur. Nous avons également utilisé la mutagenèse dirigée afin d'étudier le rôle du résidu Asp63 situé dans le 2e domaine transmembranaire (DTM), des acides aminés Phe97 et Phe98 du 3e DTM, ainsi que des résidus Asn285 et Asp289 du 7e DTM, dans la liaison des ligands, dans l'activation et la régulation de la conformation du PAFR. La substitution de l'Asp63 par un Asn résulta en l'abolition du couplage à la protéine G et de la production d'IPs suite à une stimulation au PAF, et augmenta l'affinité du récepteur pour l'agoniste. D'autre part, les résultats obtenus de la mutation de l'Asp289 en Ala et en Asn indiquent que le résidu 289 n'est pas requis pour la liaison du PAF, mais que la formation de ponts hydrogénés impliquant ce résidu pourrait être essentielle à l'activation du récepteur. Lorsque l'Asn285 fut mutée en Ala, le récepteur résultant montrait des caractéristiques identiques au récepteur WT. Nos résultats suggèrent que les résidus 63, 97, 98, 230, 231, 285 et 289, ainsi que la partie C-terminale de la 3e boucle intracellulaire influencent la conformation et la transition d'état inactif à actif du PAFR.
16
Garcia, Mathilde. "Localisation d'ARNm et biogenèse mitochondriale chez la levure Saccharomyces cerevisiae." Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077044.
Full textAbstract:
La localisation d'ARN messagers, en assurant une production protéique locale, constitue un processus important pour l'édification de structures complexes et leur remodelage en fonction de la physiologie cellulaire. Les mitochondries constituent, à cet égard, un exemple fascinant d'organisation supramoléculaire. Elles résultent de l'assemblage en divers complexes de près de 800 protéines pour la plupart codées dans le génome nucléaire et traduites dans le cytoplasme. Il a précédemment été montré qu'une fraction importante de ces protéines est traduite au voisinage de la mitochondrie chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Au cours de ma thèse, je me suis attachée à comprendre le rôle et les mécanismes de la traduction site-spécifique impliquée dans la biogenèse mitochondriale. Ces études ont nécessité le développement de deux méthodes d'analyses quantitatives de la localisation des ARN : une approche biochimique basée sur l'analyse par PCR quantitative ou puces à ADN de fractionnements mitochondriaux et une approche in vivo basée sur une hybridation in situ fluorescente suivie d'une analyse quantitative des distances intracellulaires. Mon travail de thèse a permis de souligner l'importance des processus post-transcriptionnels pour la biogenèse de la mitochondrie. Ainsi, la protéine PuDp de liaison aux ARNm contrôle la localisation mitochondriale d'un sous groupe d'ARN messagers codant des protéines impliquées dans les étapes précoces de la biogenèse mitochondriale. Pour d'autres ARN messagers comme ATP2 la traduction site-spécifique serait le résultat d'un couplage entre les processus de traduction et d'import protéique mitochondrial. Puisque des ARN messagers appartenant à des classes fonctionnelles distinctes utilisent des modalités différentes pour sélectionner leur site de traduction, nous proposons un modèle de biogenèse mitochondriale basée sur des groupes d'ARN messagers co-régulés au niveau post-transcriptionnel<br>Heterogeneous macromolecules distribution leads to specialized cellular domains. Messenger RNA localization and local protein production are important processes for complex cellular structure building and remodelling with physiology changes. In that respect, mitochonEria are a fascinating example of supramolecular organization. They come from the assembling in various complexes of 800 proteins most of them encoded by nuclear gènes and synthesized by cytoplasmic ribosomes. We previously showed that, in yeast Saccharomyces cerevisiae, a large fraction of thèse proteins are translated in the vicinity of mitochondria. During my PHD studies, I analysed the role and the mechanism underlying this site-specific translation phenomenon. In that goal, we developed two quantitative analyse of RNA localisation: a biochemical approach based on quantitative PCR or microarray analysis of mitochondrial fractions and an in vivo approach based on fluorescent in situ hybridization followed by quantitative cell distances analysis. My results emphasize how important are post-transcriptional process in mitochondrial biogenesis. For instance, PuDp mRNA binding protein control the mitochondrial localization of a sub-class of messenger RNA encoding proteins responsible for the early steps of mitochondrial biogenesis. For others, like ATP2 mRNA, site-specific translation seems to be the result of a coupling of their translation and mitochondrial protein import. Since messenger RNA implicated in distinct mitochondrial functions use different pathway to determine their translation site, we propose a model of coordinated biogenesis of mitochondria based on mRNA groups co-regulated at post-transcriptional level
17
Canaan, Stéphane. "Etude des relations structure-fonction de la lipase gastrique humaine par mutagénèse dirigée et par cristallographie." Aix-Marseille 3, 1999. http://www.theses.fr/1999AIX30060.
Full textAbstract:
L'adnc de la lipase gastrique humaine (hgl) a ete exprime dans le systeme baculovirus/cellules d'insecte. La proteine est secretee en grande quantite dans le surnageant du milieu de culture avec une masse moleculaire plus faible (45kda) que la proteine native (50kda) due a une glycosylation reduite. La hgl recombinante (hglr) est purifiee en deux etapes chromatographiques en presence de 10% d'isopropanol et possede des caracteristiques biochimiques similaires a celles de la hgl native. Par mutagenese dirigee, nous avons montre que le pont disulfure (non essentiel pour l'activite enzymatique) est situe entre les cysteines 227 et 236 et que la cysteine libre (244) n'intervient pas directement dans l'activite catalytique. La modification des 4 sites potentiels de n-glycosylation n'affecte pas le comportement de l'enzyme aux interfaces. La glycosylation aurait plutot un role protecteur vis-a-vis de l'action proteolytique de la pepsine. La cristallogenese de la hglr a permis de resoudre pour la premiere fois a 3a de resolution, la structure 3d d'une lipase acide de mammifere. La proteine globulaire se decompose en plusieurs elements structuraux superposes : le corps, le cap et le lid qui rendent la triade catalytique (ser 1 5 3-asp 3 2 4-his 3 5 3) inaccessible au solvant. Le lid recouvre la serine catalytique et le cap pourrait etre le site de fixation des lipides. Les 4 sites potentiels de glycosylation sont occupes et la position proposee pour le pont disulfure a ete confirmee. La cysteine libre est trop eloignee (5a) du centre actif pour participer directement a la catalyse. Le trou de l'oxyanion est preforme et constitue des residus gln 1 5 4 et leu 6 7. La connectivite de la hgl et le cap sont analogues a ceux des carboxypeptidases a serine. La lipase lysosomale homologue a la hgl a ete modelisee et quelques mutations, conduisant a la polycorie cholesterolique, peuvent etre expliquees sur la base de ce modele.
18
Dubreuil, Olivier. "Amélioration de la spécificité de reconnaissance d'un anticorps anti-progestérone par évolution moléculaire dirigée." Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066100.
Full text
19
Duclos, Stéphanie. "Etude par mutagenèse dirigée et modélisation moléculaire du site actif de l'UDP-N-acétylgalactosamine : polypeptide N-acétylgalactosaminyltransférase 1." Orléans, 2003. http://www.theses.fr/2003ORLE2035.
Full textAbstract:
La O-glycosylation de type mucine est initiée par une famille d'enzymes, les UDP-GalNAc:polypeptide N-acetylgalactosaminyltransférases (ppGalNAc-Ts), qui catalysent le transfert d'un résidu GalNAc sur les Ser/Thr des protéines. Les études structurales de ces enzymes sont essentielles au développement d'inhibiteurs spécifiques de chaque isoforme qui seront utilisés pour explorer le rôle fonctionnel des O-glycannes. Dans un premier temps, nous avons développé un système d'expression performant utilisant les levures pour produire la ppGalNAc-T1 bovine dans des quantités adaptées à l'étude structurale. Des expériences de mutagenèse dirigée nous ont permis d'évaluer l'importance de résidus conservés (Cys, Trp) dans le maintien de la structure 3D et/ou l'activité de l'enzyme. Parallèlement, la réalisation d'une modélisation par homologie d'une partie du site de fixation de l'UDP-GalNAc/Mn++ a suggéré l'implication dans la fixation du substrat de certains aminoacides qui ont été mutés pour confirmer ce modèle.
20
Vaglio, Philippe. "Etude de la relation structure-fonction de la protéine kinase CK2 par mutagenèse dirigée des résidus basiques conservés." Montpellier 1, 1996. http://www.theses.fr/1996MON1T029.
Full text
21
Le, Bas Audrey. "Etude par mutagénèse dirigée de l'environnement de deux cofacteurs du cytochrome b6f : l'hème ci et la chlorophylle." Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077125.
Full textAbstract:
Lors de la photosynthèse oxygénique, le complexe membranaire cytochrome b₆f transfère les électrons entre les deux photosystèmes, par l'intermédiaire de transporteurs liposoluble plastoquinone et hydrosoluble plastocyanine. La structure cristallographique du complexe b₆f a révélé la présence d'un groupe d'oxydo-réduction supplémentaire, Thème Ci et a permis de positionner les molécules de chlorophylle et p-carotène. Néanmoins, leur absence dans l'homologue mitochondrial cytochrome b₆f soulève la question de leur rôle au sein du complexe. Une étude par mutagénèse dirigée de leur environnement a donc été entreprise, au sein de l'algue verte unicellulaire, Chlamydomonas reinhardtii. Les complexes mutants ont été analysés par biochimie, spectroscopie in vivo et in vitro et cristallographie aux rayons X. La mutation F40L de la sous-unité IV élargie la poche du site Qi : Thème Ci devient plus accessible à l'oxygène provoquant la destruction de Thème en conditions réductrices. Néanmoins, elle ne permet pas de stabiliser la fixation d'une plastoquinone. Le mutant A140F, du site de liaison du cycle chlorine de la chlorophylle, a permis d'obtenir pour la première fois un complexe b₆f assemblé ne possédant pas ce pigment. L'activité de transfert d'électrons fortement diminuée est corrélée à des changements structuraux du site Qo, retrouvés dans les structures cristallographiques des cytochromes b₆fet bc₁ en présence de différents inhibiteurs. Ces mouvements semblent donc être un mécanisme important de contrôle de l'oxydation du substrat afin d'éviter les court-circuits et la production d'espèces réactives de l'oxygène<br>In oxygenic photosynthesis, the membrane protein cytochrome b₆f complex transfers electrons between the two photosystems, through a liposoluble transporter, plastoquinone and a soluble carrier plastocyanine. The X-ray structure of cytochrome b₆f has revealed the presence of a supplementary redox group, haem ci, and located a chlorophyll and a p-caroten inside the complex. However, the absence of these cofactors in the mitochondrial homologous protein, cytochrome bc₁ raises the question of their role. A site-directed mutagenesis study of their environment was achieved in unicellular green algae, Chlamydomonas reinhardtii, to assess their fonction. Mutated complexes were analysed by biochemistry, in vivo and in vitro spectroscopy and x-ray crystallography. The mutation F40L in subunit IV opens the access of the Qi site to haem ci for oxygen which destroys the haem under reducing conditions but it does no help to stabilise a plastoquinone in the Qi site. Mutation A140F, in the chlorine ring binding pocket, is the first assembled cytochrome b₆fthat does not have its chlorophyll pigment. The strong reduction in the electron transfer activity is correlated to structural changes found in the Qo site of cytochromes b₆f and bc₁ upon ligand binding. It suggests that those movements are an important mechanism, which controls substrate oxydation in the Qo site and avoids short-circuit and formation of reactive oxygen species
22
Drevelle, Antoine. "Évolution dirigée de la néocarzinostatine : ingénierie d’une ossature protéique alternative aux anticorps." Paris 11, 2007. http://www.theses.fr/2007PA112185.
Full textAbstract:
Les anticorps monoclonaux sont des outils moléculaires remarquables utilisés dans des applications thérapeutiques, diagnostiques et biotechnologiques. Néanmoins, certains inconvénients, liés à leur structure moléculaire, entraînent des coûts élevés de développement et de production. Malgré d’importants efforts de recherche ces limitations n’ont pu être dépassées. C’est pourquoi plusieurs laboratoires développent des ossatures alternatives aux anticorps monoclonaux. Il s’agit d’effectuer par évolution dirigée un remodelage fonctionnel sur une ossature protéique différente des anticorps et présentant des propriétés plus favorables. Les travaux décrits dans ce manuscrit concernent différents aspects du remodelage fonctionnel de la néocarzinostatine (NCS). Le chapitre I porte sur la résolution de structures de complexe NCS-ligand. Ces mutants de NCS sont capables de reconnaître de façon spécifique la testostérone, un ligand non naturel. Le chapitre II présente les résultats obtenus pour un projet d’optimisation de l’ossature NCS visant à supprimer ses ponts disulfure pour disposer d’une ossature fonctionnelle dans le compartiment cytoplasmique. Ce travail a permis d’isoler des mutants sans pont disulfure, exprimés sous forme soluble et repliée dans le cytoplasme bactérien. Ces mutants devraient permettre de développer des applications intracellulaires de type interférences à protéine. Le chapitre III concerne le remodelage des boucles exposées de la NCS dans l’objectif de créer des interactions protéine-protéine entre la NCS et des cibles d’intérêt. Ce chapitre décrit les outils développés pour construire une bibliothèque de mutants optimisée pour le repliement<br>[Monoclonal antibodies are powerful tools in biomedical sciences. Nevertheless, they present some limitations, due to their molecular structures, responsible for high cost of development and production. Despite intense research, these limitations haven’t been overcome. That’s why several laboratories try to develop alternative proteic scaffold to monoclonal antibodies. They use directed evolution to perform functional remodelling of alternative scaffold with better properties. This work deals with functional remodelling of néocarzinostatine (NCS). The 1st chapter presents the structure of complexes between evolved NCS mutant and a new ligand. These mutants binds tightly an unnatural ligand : testosterone. The 2nd chapter present the results obtained for scaffold optimisation to cytoplasmic expression. The aim is to remove disulfide bonds of NCS-scaffold to allow cytoplasmic expression. This work has led to new mutants expressed in soluble and folded form in bacterial cytoplasm. Those mutants should allow the development of intracellular targeting applications. The 3rd chapter deals with functional remodelling of scaffold exposed loops to create new binding site for protein recognition. The strategy and developed tools to obtain high quality mutant library are described in this chapter. ]
23
Houle, Vicky. "Détermination de l'impact de la glycosylation sur l'activité et la stabilité de l'endopolygalacturonase de S. cerevisiae par mutagenèse dirigée." Thèse, Université du Québec à Trois-Rivières, 2007. http://depot-e.uqtr.ca/1297/1/030000040.pdf.
Full text
24
Désiré, Nathalie. "Interêt de la mutagenèse dirigée et de la quantification des virus persistants dans le contexte de l'infection à VIH." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077012.
Full textAbstract:
Dans le contexte de l'infection à VIH, l'apparition d'infections opportunistes et de certaines affections néoplasiques est notamment dues à la réactivation de virus persistants. Parmi ces infections virales persistantes on retrouve les infections dues aux virus l'HTLV-1 et l'HHV-8. La quantification du virus HHV-8 confirme que lors des pathologies évolutives associées à ce virus, la charge virale HHV-8 est plus élevée et semble être corrélée avec la gravité de la maladie. En ce qui concerne le virus HTLV-1, la médiane de charge provirale HTLV-1 retrouvée chez des sujets atteint de TSP/HAM est 6 fois plus élevée que chez les patients asymptomatiques. La charge provirale HTLV-1 sanguine n'était pas modifiée par la co-infection par le VIH. Enfin, la mesure de l'ADN-VIH-1, dans les PBMC de patients au stade de primo-infection VIH-1 mis sous traitement antirétro viral nous a permis d'observer une diminution de la charge provirale entre JO et M12. La deuxième partie de notre travail porte sur l'étude de la variabilité génétique du VIH-1 au cours des traitements antirétroviraux. Nous avons mis en évidence une insertion d'une lysine puis d'une arginine sur le gène de la TI au niveau de la région 100-105 qui n'avait jamais été décrite. L'insertion est responsable de la perte de fonctionnalité de l'enzyme due à une importante modification de la TI. Nous n'avons pas mis en évidence de bénéfice pour le virus à acquérir les mutations V75A et G190E. Puis nous avons étudié un groupe de patients traités par 3 analogues nucléosidiques et qui présentaient une réponse virologique partielle au traitement. Le profil de mutation majoritairement retrouvé était représenté M184V avec les 4 TAMs de profil 2 : D67N, K70R, T215F K219E<br>Our aim was therefore to develop a method for quantifying proviral HIV-1 DNA, HTLV-1 DNA and HHV-8 DNA using real-time PCR that would be sensitive, reproducible and have a high throughput. The application of this technique to the rnonitoring of patients with primary HIV-1 infection has confirmed that HAART decreases the proviral load but has also shown that a detectable viral reservoir persists in the majority of patients. The hight viral loads of HHV-8 in MDC desease correlating with clinical symptoms and low viral load correlating with asymptomatic periods. The difference between HTLV-1 proviral load in TSP/HAM and asymptomatic moninfected patients was statiscally signifiant, but there were no difference between the HTLV-1 monoinfected and HTLV-l/HIV-1 coinfected groups. The hight viral loads of HHV-8 in MDC desease correlating with clinical symptoms and low viral load correlating with asymptomatic periods. HIV genetic variability is the result of the inability of HIV-1 RT to proofread nucleotide sequences during replication. We have identified a HIV virus presenting the G190E mutation along with a V75A mutation and with an insertion in the 100-105 of the RT encoding region. The addition of the insertion to G190E may increase the activity of the RT. Antiretroviral Therapy in HIV-1 infected patients may result in persistent moderate virological failure. In patients with persistently low levels of viremia under triple NRTIs including a thymidine analogue, most of the patients developed TAMs-2. The substitution at codon 219 in association with T215F is a glutamic acid (K219E) that could help viruses bearing TAM-2 in fîtness and resistance to drugs
25
Bordes, Florence. "Ingénierie du système d’expression Yarrowia lipolytica pour l’évolution dirigée et l’étude structurale de la lipase Lip2 de Yarrowia lipolytica." Toulouse, INSA, 2008. http://eprint.insa-toulouse.fr/archive/00000395/.
Full textAbstract:
La lipase Lip2 de Y. Lipolytica est un biocatalyseur prometteur d’un point de vue biotechnologique. Elle est déjà utilisée dans l’industrie pour sa capacité à hydrolyser les lipides et présente d’autre part une sélectivité intéressante envers différents types de substrats (résolution de mélanges racémiques, ester de DHA, …). Cependant, du fait de sa faible thermostabilité et d’une sélectivité encore insuffisante, les applications industrielles ne sont pas encore développées pour ses capacités de bioconversion à forte valeur ajoutée. Dans le but d’améliorer les propriétés de cette lipase, nous avons développé au cours de ce travail de thèse deux outils permettant de faire évoluer ce biocatalyseur d’intérêt par évolution dirigée d’une part et par évolution rationnelle d’autre part. La première partie de la thèse a donc consisté à mettre au point un système d’expression pour le criblage haut débit d’activités enzymatiques chez la levure Yarrowia lipolytica. Le principal apport réside dans la construction de la souche JMY1212, qui contient une plate-forme d’intégration génomique où la cassette d’expression va s’intégrer de manière ciblée. Ainsi, les taux de transformation, le niveau d’expression, et la répétabilité du système ont été rendus compatibles avec le criblage haut-débit. La reproductibilité du système a également été assurée par l’utilisation d’outils robotisés et l’optimisation de la croissance et de l’expression protéique en microplaque. Ces travaux ont permis d’obtenir le premier système d’expression eucaryote dédié à l’évolution dirigée d’enzymes. Ce système d’expression a été utilisé pour construire une banque de variants de la lipase Lip2. Un crible sur la thermostabilité a permis d’obtenir un variant de thermostabilité améliorée. Les temps de demi-vie ont été améliorés d’un facteur 21 à 127 selon les températures. Cette caractérisation a permis de mettre en évidence que l’agrégation de l’enzyme et l’interchange des ponts disulfures étaient les principaux mécanismes impliqués dans la dénaturation thermique de Lip2. L’étude des relations structure-fonction d’une enzyme passe par la connaissance de sa structure. Des essais de cristallisation de l’enzyme ont donc été initiés. L’obtention de cristaux utilisables pour la détermination de la structure 3D a nécessité la déglycosylation de l’enzyme par voie enzymatique. Plusieurs conditions de cristallisation ont été obtenues. L’une d’entre elle a permis l’enregistrement d’un jeu de données à 1,7 Å. Différentes méthodes pour recouvrer l’information de phase ont été expérimentées. Le phasage des données par remplacement moléculaire n’a pas permis de donner de solution. Les techniques de phasage ab initio (remplacement isomorphe ou MAD) sont en cours ; à ce jour cependant aucun des métaux lourds testés n’est fixé dans l’édifice cristallin. La méthode de bioincorporation de sélénométhionines directement dans la lipase, qui paraît la plus prometteuse, a été initiée. Ce type de production n’a encore jamais été réalisé chez Y. Lipolytica et les premiers résultats, bien qu’encourageants, demandent encore des mises au point. Par ailleurs, un modèle de la structure 3D a pu être généré par homologie avec des enzymes de structure tridimensionnelle connue. Celui-ci a permis de cibler avec succès des acides aminés à modifier pour améliorer la résolution de mélanges racémiques d’intérêt pharmaceutiques<br>Yarrowia lipolytica Lip 2 lipase is a promising lipase from a biotechnological point of view. It has already been used in industrial applications for its ability to hydrolyse lipids and because of its interesting selectivity towards different types of substrates (racemic mixtures resolution, DHA ester, … ). However, the low thermostability and insufficient selectivity of this enzyme have prevented the development of industrial applications for high value added bioconversion products. In order to improve its properties, we have followed a double approach to engineer this enzyme using directed evolution and rational design. The first part of the work describes the set up of an expression system for the high throughput screening of enzymatic activities in the yeast Yarrowia lipolytica. The main novelty of this method lies in the use of JMY1212 strain which was constructed on purpose. It contains a genomic docking platform, in which the insertion of the expression cassette was done in a targeted way. Thus, transformation efficiency, expression level, and reproductibility of the full process were then compatible with high-throughput screening in the yeast Yarrowia lipolytica. Furthermore, the reproducibily of the full process was ensured by using robots and optimizing growth and protein expression in 96-well microplates. This work led to the obtention of the first eukaryotic expression system devoted to directed evolution. This expression system was used to create a library of Lip2 variants which was subsequently screened on thermostability to isolate a variant with improved thermostability. Mutant’s half-lives were 21 to 127 times higher than wild type lipase depending on the temperature. The characterisation of this variant required the optimisation of the expression system and the set up of the lipase purification method. The variant characterisation permitted to reveal that aggregation and disulfide interchange were the main mechanisms involved in Lip 2 thermal denaturation. To gain a deeper insight of structure-activity relationships, crystallographic studies have been undertaken. Crystallisation trials have been set up using the deglycosylated enzyme. Crystals obtained led the recording of a 1. 7 Å data set. Different methods have been attempted to retrieve the phase information without success. Data phasing by molecular replacement failed to resolve the structure. Although ab initio phasing by isomorphous replacement is still in progress, none of the heavy metals tested has been fixed in crystals to date. The method of selenomethionine bio-incorporation directly into the lipase for Multiple Anomalous Diffraction (MAD) phasing, has been initiated. This kind of production in Y. Lipolytica has never been reported yet. It gave some promising preliminary results although, it still requires adjustments. A 3D model of Lip2 has also been generated by homology with enzymes of known structure. This model allowed the identification of amino acids which were changed sucessfully to improve the racemic resolution of important class of pharmaceuticals
26
Lacroix, de Lavalette Agnès de. "Etude des relations structure/fonction dans le complexe cytochrome b6f." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077011.
Full textAbstract:
Les oxydoréductases de la famille des cytochromes bc1/b6f font partie des chaînes de transfert d'électrons. Dans la photosynthèse oxygénique, le cytochrome b6f (cyt b6f) catalyse le transfert d'électrons du plastoquinol à un transporteur soluble (plastoycanine ou cyt c6). Le cyt b6f est partiellement homologue au cytochrome bc1 impliqué dans la respiration et la photosynthèse anoxygénique. Malgré leur similarités, ces deux complexes présentent des différences au niveau des sous-unités et, le cyt b6f contient des cofacteurs additionnels : une chlorophylle a (Ch1), un β-carotène et un hème de type c', Thème ci. Leur rôle dans la fonction du complexe reste encore un mystère malgré l'existence de la structure cristallographique. Ce travail utilise les récentes données structurales pour établir, par mutagenèse dirigée, des relations structure/fonction au sein du cyt b6f. Des mutants des sites natifs de l'hème ci et de la Ch1 ont été construits. Les propriétés physico-chimiques de Thème ci des mutants ont commencé à être caractérisées, permettant d'émettre des hypothèses sur le rôle protecteur de cet hème contre la génération de ROS, ainsi que sa participation à un mécanisme de double réduction de la quinone pour éviter la formation d'une semiquinone dans le site Qi. Sur la base d'études de biochimie et d'analyse fonctionnelle, nous avons conclu qu'en plus d'un rôle structural, la chlorophylle et sa poche de liaison sont probablement impliquées dans le mécanisme de transition d'états, une fonction spécifique au cyt b6f. Les premières structures cristallographiques de deux mutants du site Qi ainsi que celle d'un mutant de la chlorophylle ont été obtenues<br>Oxidoreductases of the cytochrome bc1/b6f family are ubiquitous in electron transfer chains. In oxygenic photosynthesis, as carried out by chloroplasts and cyanobacteria, cytochrome b6f catalyzes electron transfer from hydroplastoquinone (PQH2) to either plastocyanin or cytochrome c6. Cytochrome b6f shares a partial homology with cytochrome bc1, which is involved in respiration and anoxygenic photosynthesis. Despite the above similarities, the bc1 and b6f complexes feature some differencies in subunit composition and cytochrome b6f contains additional cofactors, including one molecule of chlorophyll a (Chka), one of β-carotene and a c-type heme, heme ci. Their role in the complex function is still a mystery despite the crystallographic structure. This thesis exploits recent structural data to establish structure/function relationships using site directed mutagenesis. Mutants in the native sites of chlorophyll and hem ci have been constructed. Some of the physico-chemical properties of mutant's ci heme are characterized in this work. A protective role against ROS generation and participation to a quinone double reduction mechanism to avoid the production of a semiquinone in the Qi site are put forward. We addressed then the question of the possible role of the chlorophyll. Based on a combined biochemical and functional analysis, we conclude that, besides playing a structural role in the complex, the chlorophyll and its binding pocket are likely implicated in the regulation of state transitions a function that is specific to cytochrome b6f complexes. The first crystallographic structures of two Qi site mutants and one chlorophyll mutant were obtained during this thesis
27
Jeanneau, Charlotte. "Bioanalyse et ingénierie de glycosyltransférases." Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077059.
Full text
28
Goudeau, Bertrand Michel. "Mécanismes moléculaires impliqués dans la genèse des desminopathies." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077014.
Full textAbstract:
Les myopathies myofibrillaires sont des maladies génétiques neuromusculaires. Leur caractéristique histologique est l'accumulation intrasarcoplasmique de desmine. La desmine forme un réseau tridimensionnel qui maintient l'intégrité fonctionnelle et structurale des myofibrilles. Les manifestations cliniques des myopathies myofibrillaires sont hétérogènes. Le phénotype majeur est une faiblesse progressive des muscles squelettiques. A l'hétérogénéité clinique correspond une variabilité génétique. Des mutations de la desmine, l'alpha B-cristalline, la myotiline, la sélénoprotéine N, ZASP ou la filamine C ont été identifiées. Nos recherches portent sur les mécanismes moléculaires des myopathies myofibrillaires dues à des mutations de la desmine ou desminopathies. Nous avons découvert de nouvelles mutations dans le domaine central et la région C-terminale non hélicale de la protéine (queue). Les mutations du domaine central touchent des éléments structuraux nécessaires à la formation du réseau ; les mutations de la queue des résidus potentiellement phosphorylables ou inclus dans des motifs structuraux conservés. Les études fonctionnelles des mutants du domaine central soulignent leur incapacité à former un réseau et leur effet dominant négatif sur le réseau sauvage. Les mutants de la queue de la desmine forment souvent un réseau similaire au réseau sauvage, indiquant un mécanisme pathologique distinct. Nous introduisons 2 caractéristiques des desminopathies : la sévérité de la maladie dépend de la position de la mutation dans le domaine central et certaines mutations sont pathologiques si elles sont combinées à d'autres mutations de la desmine ou d'autres gènes<br>Myofibrillar myopathies are a group of inherited neuromuscular disorders. Their histologic feature is an intrasarcoplasmic accumulation of desmin. Desmin produces an extensive filament network which maintains the structural and functional integrity of the myofibrils. Clinical presentations of myofibrillar myopathies are varied. The predominant presenting symptom is a progressive weakness of skeletal muscles. Myofibrillar myopathies are caused by mutations of desmin, B-crystallin, myotilin, selenoprotein N, ZASP or filamin C gènes. Our work focuses on molecular mechanisms involved in myofibrillar myopathies with desmin mutations, the so-called desminopathies. Here we report new desmin variants mainly located in the central rod domain, and in the non-alpha-helical carboxy-terminal "tail" domain. Mutations of the rod domain disrupt important structural relationships for desmin filament assembly. Tail mutations are potential in vivo phosphorylation sites or are part of conserved structural motifs. Rod mutations are assembly-incompetent and able to disrupt a pre-existing filamentous network in a dominant-negative fashion. Most of tail mutations display a filamentous network similar to the wild-type control, indicating a distinct disease mechanism. In this report, we also show strikingly different pathogenic effects of desmin rod mutations depending on their location, and we describe mutations exhibiting pathogenic potentials only if combined with other mutations in desmin or other genes
29
Mazza, Catherine. "17-hydroxystéroïde déshydrogénase humaine de type I : analyse des relations structure-fonction par mutagenèse dirigée et cristallographie des rayons X." Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015), 1997. http://www.theses.fr/1997GRE10214.
Full textAbstract:
La 17-hydroxysteroide deshydrogenase de type 1 (17-hsd1) est responsable de la synthese de l'stradiol, strogene biologiquement actif implique dans le declenchement et la proliferation des cancers du sein hormono-dependants. Cette enzyme appartient a la famille des deshydrogenases reductases a chaine courte dans laquelle les residus ser142 tyr155 et lys159, tres conserves, sont supposes intervenir dans le transfert de proton. La 17-hsd1 presente une specificite exclusive, mais inexpliquee vis-a-vis des steroides possedant un cycle a aromatique. De plus, elle utilise, in vitro, aussi bien le nad#+ que le nadp#+ comme cofacteur. Au cours de ce travail, nous avons tente d'identifier les interactions qui regissent ces specificites et de proposer un mecanisme reactionnel. Pour ce faire, des mutants s142a, y155f, s142a/y155f, k159m, h221l, h221q et -17-hsd1 (deletion des 38 residus c-terminaux) ont ete construits et exprimes dans le systeme baculovirus-cellules d'insecte. Les parametres de cinetique enzymatique de ces mutants ont ete compares a ceux de l'enzyme sauvage et une etude structurale a ete menee sur certains de ces mutants. Ainsi, des complexes h221l/nadp#+/stradiol, -17-hsd1/nadp#+/estradiol, h221l/nad#+ et h221q/stradiol ont ete resolus respectivement a 2. 7 a, 1. 9 a, 3. 0 a et 2. 7 a de resolution. Ces structures nous montrent une image detaillee des interactions enzymes-nadp#+ dans lesquelles intervient une boucle mobile (191-199), desordonnee dans toutes les structures precedemment decrites. Stabilisee uniquement en presence de cofacteur, cette boucle se rabat sur le site actif et le protege du solvant. De plus, le residu phe192 stabilise le groupement nicotinamide par un contact hydrophobe fort. Conjointement, ces deux elements favorisent le transfert d'hydrure. Par ailleurs, le groupement 2-phosphate du nadp#+ est stabilise par deux interactions ioniques avec les residus arg37 et lys195 et par une liaison hydrogene avec la ser11. Cette stabilisation demontre la preference de l'enzyme pour le coenzyme nadp(h) et souligne l'originalite de la 17-hsd1 dans laquelle un des deux residus basiques est situe en dehors du motif rossmann fold. De plus, l'analyse des proprietes catalytiques et du mode de liaison de l'stradiol pour les deux mutants h221l et h221q suggere que la liaison hydrogene normalement observee entre le residu his221 et l'oxygene o#3 du steroide joue un role primordial dans le determinisme de la specificite de l'enzymze vis-a-vis des substrats possedant un cycle a aromatique. Enfin, l'analyse structurale du site catalytique des complexes ternaires associee a la perte d'activite enzymatique des mutants s142a, y155f, s142a/y155f et k159m nous a permis de proposer un mecanisme catalytique dans lequel le residu tyrosine jouerait le role d'acide en donnant son proton a l'oxygene o#1#7, le residu serine stabiliserait l'intermediaire reactionnel et contriburait a reduire le pka de la tyrosine alors que le role principal de la lysine serait de stabiliser le groupement nicotinamide.
30
Nguyen, Thi Kim Chi. "Caractérisation génétique et biochimique par mutagenèse dirigée et aléatoire, de répresseurs impliqués dans la réponse au stress acides phénols chez Bacillus subtilis." Dijon, 2009. http://www.theses.fr/2009DIJOS061.
Full textAbstract:
Ce travail a porté sur la caractérisation des mécanismes génétiques et biochimiques impliqués dans la PASR, la réponse au stress acide phénol, chez Bacillus subtilis. Cela a été réalisé grâce à des stratégies de génétique et biologie moléculaire comme la génétique inverse, la mutagenèse aléatoire par PCR ou par transposition, la délétion de gènes, la complémentation de gènes. Les éléments impliqués dans la PASR ont été identifiés, en particulier PadR, le régulateur transcriptionnel de l’expression du gène padC qui codent pour l’acide phénol décarboxlyase, élément clé de la PASR. Les séquences du promoteur du gène padC et les résidus acides aminés impliqués dans la fonctionnalité de PadR ont pu être identifiés par une stratégie mettant en œuvre, d’une part la mutagenèse dirigée du promoteur de padC, et la mutagenèse aléatoire par Error-prone PCR du gène padR, et d’autre part un criblage et une analyse fonctionnelle de ces éléments in vivo dans des souches mutantes de B. Subtilis construites pour ces objectifs. Cette analyse in vivo a été couplée à des études in vitro d’empreintes DNAseI et d’EMSA, ainsi qu’à une co-expression hétérologue chez E. Coli de ces gènes impliqués. Ce travail a également montré qu’un gène inconnu yveFG tronqué, donc supposé non-fonctionnel, co-transcrit avec padC, codait pour un peptide yveF modérateur de l’expression de padC. La réparation de ce gène yveFG et son expression chez B. Subtlis a montré qu’il codait pour un répresseur non activable du gène padC<br>The aim of this work was to characterize the genetic and biochemical mechanisms involved in the PASR, the phenolic acid stress response induced by phenolic acids Bacillus subtilis. By genetics and molecular biology strategies, like reverse genetic, PCR or transposon random mutagenesis, gene deletion, complementation of strains, and gene expression, the main components of the PASR were identified and quantified. Site-directed and random mutagenesis of respectively the promoter of padC encoding the phenolic acid decaroxylase, and PadR, the repressor of the padC expression, allowed us to identify the site of binding of PadR with this promoter, as well as the amino-acid residues involved in the functionality of PadR. Results obtained by the use of reporter strains of B. Subtilis construct for this aim, were confirmed by in vitro foot-printing and EMSA, and heterologous co-expression of the genes in E. Coli. This work provides evidence that a supposed non-functional truncated yveFG gene, co-transcript with padC, encoded a YveF peptid which is a moderator of the padC expression, and that the repaired gene was a non-inactivable repressor of padC expression
31
Gholami, Alireza. "Caractérisation des domaines de la protéine de matrice des lyssavirus impliqués dans l'induction de l'apoptose." Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077152.
Full textAbstract:
La protéine de matrice (m) des lyssavirus possède un rôle important dans la morphogenèse virale. Dans cette étude, nous avons mis en évidence que la protéine m du virus mokola (mok) un virus peu pathogene du génotype 3 est dirige vers la mitochondrie, et induit par la voie mitochondriale une apoptose précoce, contrairement à celle d'un virus de génotype 1 (tha). Par des mutations de délétion de m-mok, nous avons démontré qu'une région située entre les acides aminés 67 à 86 de cette protéine (fragment m1-7), retient toutes ces propriétés. Une analyse par le système double hybride en levure et par co-immunoprécipitation montre que le partenaire cellulaire de m-mok dans ce contexte est la sous unité 1 de la cyt c oxydase (cc01), ceci contrairement à m-tha. Nous avons également démontré que m1-7 est implique dans la mort cellulaire médiée par trail. L'analyse par mutagenèse dirigée, basée sur la différence des séquences peptidiques de m-mok et m-tha nous a permis de démontrer l'indépendance de ces deux voies d'induction de mort cellulaire programmée dans le modèle lyssavirus. La modulation de ces deux voies est gouvernée par deux résidus clés en position 77 et 81 de m. Les structures tridimensionnelles de m de lyssavirus et de vesiculovirus obtenues a partir de leurs cristaux ont permis de localiser différents domaines et motifs fonctionnels et structuraux de m. Ces structures ont révèléc un mode unique d'auto association de m participant très probablement à la régulation du dialogue avec la cellule hôte<br>The matrix protein (m) of lyssaviruses plays a pivotal role during the viral life cycle. We have shown here that m of the mokola virus (mok, a lyssavirus of low pathogenicity, belonging to genotype 3) migrates into the mitochondria and induces an early cell death through mitochondrial pathway, conversely to m of a genotype 1 lyssavirus (tha). Different m-mok truncated mutants have shown that the region involved in this activity is located between residues 67-86 of the molecule (mutant m1-7) where a mitochondrial localization signal also resides. Using a yeast double hybrid system as well as co-immunoprecipitation we have found that the cellular partner of m-mok involved in cell death induction is the subunit 1 of mitochondrial cyt c oxidase complex (cco1). This interaction was not seen with m-tha. We have shown that m1-7 is also involved in cell death induction through a trail-dependant pathway. Site-directed mutagenesis analyses based on amino acid sequence differences of m-tha and m-mok led us to show the independence of the two pathways of the programmed cell death in lyssavirus model which are modulated by two key residues at positions 77 and 81 of m. By resolving the three-dimensional structure of lyssavirus and vesiculovirus m through their crystallization, different structural and functional motifs and domains of m were shown. Those structures have shown a new model of self-association that contributes most probably to regulation of dialogue with the host cell
32
Marie-Claire, Cynthia. "Affinement du modèle tridimensionnel de la néprilysine (EC 3. 4. 24. 11) par mutagenèse dirigée : étude de la maturation de la thermolysine (EC 3.4.24.27)." Paris 5, 1997. http://www.theses.fr/1997PA05P627.
Full text
33
Claperon, Cédric. "Etude du sous-site S1 de l'aminopeptidase A par modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée. Exploration de la spécificité de substrat de cette enzyme." Paris 5, 2008. http://www.theses.fr/2008PA05P612.
Full textAbstract:
L’aminopeptidase A est une glycoprotéine homodimérique intégrale de type II appartenant à la famille des aminopeptidases monozincs. Elle possède deux caractéristiques : elle est activée par le calcium et présente une spécificité de substrat pour les résidus N-terminaux acides qui devient stricte en présence de calcium. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques et sélectifs de l’APA a permis de démontrer que cette enzyme est impliquée in vivo dans la conversion de l’angiotensine II cérébrale en angiotensine III. L’APA cérébrale se présente donc comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l’hypertension. Ainsi, la conception de composés capables de franchir la barrière hémato-encéphalique, d’inhiber dans le cerveau l’APA et de bloquer la conversion de l’angiotensine II en angiotensine III, pourraient constituer une nouvelle classe d’antihypertenseurs à action centrale. Afin de développer de tels composés, l’étude de l’organisation du site actif de l’APA a été entreprise. L’introduction d’un atome de calcium dans le modèle 3D a permis de visualiser une poche hydrophile, dans laquelle l’atome de calcium est lié par l’Asp-213 et l’Asp-218. L’implication de ces résidus dans la liaison du calcium et dans la spécificité de substrat de l’APA a été vérifiée par des expériences de mutagénèse dirigée. L’analyse du modèle nous a permis de visualiser, au sein du sous site S1, un autre résidu, la Thr-348, qui semble impliquer dans la spécificité de substrat pour les résidus N-terminaux acide de l’APA. La validation du rôle de la Thr-348 a été effectuée par mutagénèse dirigée<br>Aminopeptidase A is a type II integral membrane-bound protease belonging to the zinc metalloprotease family, the zincins. APA pocesses two characteristics: It contains a calcium ion that increases its enzymatic activity and specifically cleaves N-terminal acid residues, that is increased in the presence of calcium. In-vivo, APA converts brain angiotensin II to angiotensin III. However, angiotensin III is one of the effector peptides of the brain renin-angiotensin system and exerts a tonic stimulatory action on the central control of blood pressure. Central inhibition of APA results in a large decrease in arterial blood pressure in spontaneously hypertensive rats, suggesting that APA might constitute a putative therapeutic target for the treatment of hypertension. Introduction of a calcium atom in the 3D model allowed us to visualized an hydrophilic pocket, in which the calcium atom in bound to Asp-213 and Asp-218. The implication of these residues in calcium binding and substrate specificity was studied by site directed mutagenesis studies. The analysis of the 3D model revealed Thr-348, which seems to be implicated in APA substrate specificity. The role of this residue was demonstrated by site directed mutagenesis studies
34
Phalipou, Sylvie. "Etude des sites de liaison des antagonistes peptidiques linéaires du récepteur V1a de la vasopressine par une approche de marquage covalent et de mutagénèse dirigée." Montpellier 2, 1998. http://www.theses.fr/1998MON20130.
Full textAbstract:
Ce travail a pour objectif d'etudier le site de liaison des antagonistes du recepteur v#1#a humain de la vasopressine. Nous avons cartographie les zones d'interaction des antagonistes peptidiques lineaires avec le recepteur v#1#a de facon directe par la technique de marquage de photoaffinite. Nous avons developpe, caracterise pharmacologiquement et fonctionnellement deux analogues photoactivables de l'avp : le #1#2#5i3n#3phpa-lva et le #1#2#5ilys(3n#3phpa)#8ho-lva. Les recepteurs v#1#a exprimes dans les cellules cho sont photomarques de facon specifique par ces ligands et sont observes sur gel sds-polyacrylamide sous la forme de deux proteines glycosylees radioactives de 85-90 kda et 46 kda. Celle de 46 kda resulte du clivage de la proteine de 85-90 kda par une protease presente dans la preparation membranaire des cellules. Afin de delimiter les zones de contact entre le recepteur et ses ligands, l'espece proteique de 46 kda photomarquee par le #1#2#5i3n#3phpa-lva a ete fragmentee par les proteases v8 et/ou lys-c. L'identite du plus petit fragment photomarque (poids moleculaire de 6 kda) issu de la digestion par la protease v8, a ete verifiee par mutation des sites de clivage de l'enzyme. Nous avons conclu que le #1#2#5i3n#3phpa-lva se lie de facon covalente au recepteur v#1#a humain dans la region du septieme domaine transmembranaire (asn#3#2#7ile#3#4#7). De meme, la proteine de 46 kda photomarquee par le #1#2#5ilys(3n#3phpa)#8ho-lva a ete fragmentee chimiquement (bromure de cyanogene) et/ou enzymatiquement (proteases lys-c et asp-n). Le plus petit fragment photomarque a un poids moleculaire de 2,5 kda et represente la premiere boucle extracellulaire du recepteur (asp#1#1#2pro#1#2#0). A l'aide de ces resultats, nous proposons un modele d'interaction de ces ligands avec le recepteur v#1#a humain. Le positionnement des deux ligands dans la poche de liaison du recepteur est similaire a celui de l'avp, ces ligands lineaires adoptant le meme type de conformation que les ligands cycliques.
35
Melet, Armelle. "Etude par mutagenèse dirigée de la topologie des sites actifs et des spécificités de substrats des cytochromes P450 2C9 et 2C8 humains." Paris 5, 2004. http://www.theses.fr/2004PA05P602.
Full textAbstract:
Ce manuscrit présente une étude fonctionnelle et structurale de deux enzymes du métabolisme des médicaments : les cytochromes P450 CYP2C9 et CYP2C8 humains. Nous avons utilisé les outils de la biologie moléculaire (mutagenèse dirigée, construction de chimères) afin d'évaluer l'importance fonctionnelle de plusieurs résidus de ces hémoprotéines. Le choix des mutations s'est appuyé sur l'analyse in silico de modèles de complexes enzyme/substrat, sur les structures RX publiées et les alignements de séquences entre CYP2Cs. Neuf mutants du CYP2C9, 21 mutants du CYP2C8 et 4 chimères CYP2C8/2C9 ont ainsi été construits au cours de cette thèse. Après expression dans la souche de levure W(R), leurs propriétés catalytiques ont été comparées à celles de l'enzyme sauvage. Les résultats obtenus, présentés en deux parties, mettent en évidence trois résidus clés du site actif du CYP2C9 (Ser365, Phe114 et Phe476) ainsi que six résidus clés du CYP2C8 (Arg97, Ser100, Ser114, Phe201, Phe205, Arg241)<br>This manuscript deals with the functional and structural study of two drug metabolism enzymes : human cytochromes P450 CYP2C9 and CYP2C8. Molecular biology tools (site-directed mutagenesis, chimera construction) were used to assess the functional importance of several amino-acids in these hemoproteins. The choice of mutations was based on the in silico analysis of modelled enzyme/substrate complexes, on published X-ray structures and alignment of CYP2Cs sequences. Nine mutants of CYP2C9, 21 mutants of CYP2C8 and 4 CYP2C8/2C9 chimera were thus constructed during this PhD thesis. After expression in the yeast strain W(R), their catalytic properties were compared to those of the wild type enzyme. The overall results, presented in two parts, highlight the critical role of 3 key residues for the CYP2C9 active site (Ser365, Phe114 et Phe476) and of 6 key residues for CYP2C8 (Arg97, Ser100, Ser114, Phe201, Phe205, Arg241
36
Chamberland-Chanteloube, Valérie. "Etude par mutagenèse dirigée de la relation entre la structure de la mésentéricine Y105 et sa fonction bactéricide à l'encontre de Listeria." Limoges, 1997. http://www.theses.fr/1997LIMO0034.
Full textAbstract:
La mesentericine y105 est une bacteriocine de 7 acides amines secretee par la bacterie lactique leuconostoc mesenteroides. Elle appartient au groupe des bacteriocines actives sur le genre bacterien listeria et presente le motif consensus caracteristique tyr-gly-asn-gly-val- x- cys dans sa partie n terminale. Le peptide a ete produit chez escherichia coli par la technologie de l'adn recombinant. Il est purifie sous la forme d'une proteine de fusion contenant une sequence polyhistidine. La mesentericine recombinante est obtenue par clivage enzymatique (endoproteinase aspn) et chimique (le bromure de cyanogene) de la proteine de fusion, comportant 4 copies de la mesentericine. Elle est ensuite caracterisee par le sequencage n ter des acides amines et la mesure de sa masse par spectrometrie. Testee pour son activite anti-listeria, la mesentericine y105 recombinante est conforme au peptide naturel. La mesentericine reduite par le dithiothreitol a une activite identique a la mesentericine oxydee ce qui suggere que le pont disulfure naturellement present entre les residus cysteine 9 et 14 n'est pas indispensable a l'activite de la bacteriocine. Une strategie de mutagenese dirigee a ete developpee afin de determiner les roles respectifs de la region consensus n terminale et de la region asn#1#7#- asn#3#1 dont la structure predite est une helice amphiphile. Les mutations de la region n terminale engendrent des peptides dont l'activite anti-listeria est diminuee a des degres variables. Le motif consensus qui s'avere donc necessaire pour l'activite anti-listeria, pourrait etre implique dans la reconnaissance des cellules cibles. En revanche, la modification ou l'elimination de l'helice conduisent a des peptides inactifs. Sur la base de ces resultats, un modele d'action de la mesentericine sur les cellules de listeria est propose.
37
Lazar, Noureddine. "Structure secondaire et activité biologique : relations structure-fonction dans le PF4 Humain et la Prosomatostatine." Paris 6, 2003. http://www.theses.fr/2003PA066181.
Full text
38
Melin, Patricia. "Caractérisation par mutagenèse dirigée des sites moléculaires impliqués dans la modulation pharmacologique du canal chlorure CFTR par la Génistéine, la Phloxine B et la Glibenclamide." Poitiers, 2006. http://www.theses.fr/2006POIT2339.
Full textAbstract:
La mucoviscidose est due à des mutations du gène codant pour le canal chlorure CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). L’étude de la relation structure-fonction pharmacologique vise à déterminer les sites d’actions de modulateurs directs de la protéine CFTR. Nos travaux ont permis de caractériser des résidus impliqués dans les sites d’actions de deux inhibiteurs allostériques (Génistéine, PhloxineB)-la glycine 551 dans le site inhibiteur-la glycine 1349 dans le site activateur. Nos résultats montrent aussi l’implication du résidu lysine 978, localisé la boucle cytoplasmique 3, dans le site d’action du glibenclamide, inhibiteur de CFTR. Nos travaux identifient le rôle des glycines du motif signature des transporteurs ABC dans la modulation pharmacologique du canal CFTR. Nos résultats suggèrent que la boucle cytoplasmique 3 est placée près du pore du canal CFTR et pourrait attirer le glibenclamide près du pore du canal CFTR<br>Cystic Fibrosis is the most common lethal genetic disease caused by gene mutations encoding CFTR chloride channel. Because there is a lack of knowledge of molecular sites of action of CFTR potentiators or inhibitors, we investigated residues involved in direct effect of Genistein, PhloxinB and glibenclamide. We used site-directed mutagenesis combined to functional analysis of CFTR chloride channels (patch-clamp and iodide efflux). Our results show that the glycine residues G1349 and G551 within the ABC signature motifs play critical role in, respectively, the activation and inhibition of CFTR by PhloxinB and Genistein. We also probed evidences for a role of lysine 978, located on cytoplasmic loop 3, in CFTR inhibition by glibenclamide. This study highlights the important role of ABC signature motifs in the pharmacological regulation of CFTR. Our data also suggests a position, physically close to the pore, of the cytoplasmic loop 3 which can attract glibenclamide near the pore of CFTR
39
Rozenfeld, Raphaël. "Etude du site actif de l'aminopeptidase A par modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée. Définition du rôle du domaine C-terminal de cette enzyme." Paris 5, 2004. http://www.theses.fr/2004PA05P607.
Full textAbstract:
L'aminopeptidase A (APA), est responsable in vivo de la production de l'angiotensine III, peptide effecteur du système rénine-angiotensine cérébral, qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle. Le blocage de la formation de ce peptide dans le cerveau par un inhibiteur spécifique et sélectif de l'APA entraîne un effet antihypertenseur chez les rats hypertendus. L'APA apparaît donc comme une cible dans le traitement de l'hypertension, ce qui justifie la conception d'inhibiteurs spécifiques et sélectifs de cette enzyme. Pour développer de tels composés, nous étudions la topologie du site actif de l'APA par modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée. La fonction des résidus identifiés dans le modèle comme étant impliqués dans la liaison du substrat, et la liaison du calcium, ion activateur de l'APA, a été confirmée par mutagenèse dirigée. Les données apportées dans ces études aideront à la conception rationnelle d'inhibiteurs de l'APA<br>Aminopeptidase A (APA) is responsible for the production of angiotensin III in vivo, which is the effector peptide of the brain renin-angiotensin system, by exerting a tonic stimulatory effect on the central control of blood pressure. The blockade of the formation of this peptide in the brain by a selective and specific APA inhibitor leads to a decrease of blood pressure in hypertensive rats. APA is thus a therapeutic target for the treatment of hypertension, which justifies the conception of specific and selective inhibitors of this enzyme. In order to develop such compounds, we study the organization of the APA active site by molecular modeling and site-directed mutagenesis. The role of the residues identified in the model as being involved in the binding of the substrate and of the calcium ion, which activates APA was confirmed by site-directed mutagenesis. The data collected in these studies will help in the rational design of APA inhibitors
40
Nguyen, Thiên-Ân. "Relations structure-fonction dans la superfamille des Cytochromes P450 : études Bioinformatiques." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077157.
Full textAbstract:
Les cytochromes P450 (CYP) sont des enzymes responsables de la biotransformation de composés exogènes, aussi bien dans les phénomènes de détoxication que d'intoxication par formation d'entités réactives. La forme hépatique humaine la plus abondante (CYP 3A4) est responsable du métabolisme de plus de 60 % des médicaments utilisés actuellement, entraînant de nombreuses interactions médicamenteuses indésirables. La connaissance des mécanismes moléculaires de fonctionnement de ces CYPs au moyen de modèles prédictifs est d'un intérêt primordial pour les industriels. L'obtention de ces modèles par modélisation comparative est toutefois pénalisée par la dispersion en séquences dans cette superfamille. Une méthode originale de reconstruction des CYPs basée sur l'identification au sein de cette famille des blocs structuralement conservés (CSB) est proposée ici. Ces CSBs définissent un repliement commun aux CYPs et sont considérés comme la signature structurale de la superfamille. Les CSBs sont codés en termes d'informations statistiques (profile) puis alignés sur les séquences de CYP de structure inconnue, par un outil d'alignement multiple (Caliseq) créé pour produire l'alignement multiple optimal pour les reconstructions par modélisation comparative. Caliseq sert aussi à détecter des séquences originales de CYP dans une banque ou un génome. Le modèle structural obtenu permet de suggérer des mutations pour observer les modifications du comportement de la protéine vis-à-vis de ses substrats spécifiques. Le cas du CYB2B6 est un exemple concret où le modèle a suggéré des mutations permettant d'augmenter l'affinité de l'enzyme pour un substrat spécifique utilisé en chimiothérapie<br>Cytochromes P450 (CYP) are monoxygenase enzymes involved in biotransformations of exogenous compounds in detoxification processes, but also in intoxication by generation of reactive species. CYP 3A4, the most abundant isoform present in human liver, is responsible for the metabolisation of more than 60% of drugs used in therapy, leading to unwanted drug-drug interactions. The knowledge and understanding of mechanisms underlying substrate recognition and transformation is of outstanding interestfor setting up reliable predictive tools in pharmaceutical companies. Achievement of CYP models by homology modeling is however limited by the high diversity of sequences in this superfamily. An original method based on the identification of Common Structural Blocks (CSB) within the family, is proposed here to rebuild structural models despite their low sequence identity. CSBs define a common fold of the CYPs and are used as a structural signature of the superfamily. A multiple alignment tool able to align successive profiles (calculated in each CSB) on the CYP sequences of unknown structure, has been developed to make use of the structural information beneath the CSBs, in one hand to give reliable multiple alignments used in homology modeling, and in the other hand, to search for new CYP sequences in databanks or genomes. When the structural model is obtained, in silico mutation experiments can be performed to monitor changes in the behavior of the protein towards its specifies substrates. A successful example is shown through CYP2B6 case, in which mutations suggested by the model led to significant increase of its affinity towards a specific substrate used in chemotherapy
41
Cukierman, Lisa. "Etude de la fonction de claudine-1 dans l'entrée du virus de l'hépatite C." Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077213.
Full textAbstract:
Le virus de l'hépatite C (VHC) est un pathogène humain. Au cours de nos études, nous avons observé que le sodium butyrate inhibe spécifiquement la réplication du VHC. Nous proposons que le traitement par le sodiunr butyrate module l'expression de gènes impliqués dans la réplication du VHC. Afin de mieux comprendre la fonction de claudine-1, nous avons élaboré une stratégie de mutagénèse dirigée. Nous avons démontré que les mutations altérant les sites présumés fonctionnel de claudine-1 ne son pas importants pour l'entrée de VHC. En revanche, nous avons identifié sept nouveaux acides aminés critiques pour l'infection du VHC de 6 sous-types différents. Six de ces mutants appartiennent au motif très conservé W-GLW-C-C de la famille des claudines. Nous proposons que ces contacts cellule-cellule formés par les résidus du motif très conservé W-GLW-C-C soient des domaines membranaires spécialisés requis pour l'entrée de VHC<br>Hepatitis C virus (HCV) is a human pathogen. In the course of our studies we made the observation that sodium butyrate specifically inhibits HCV replication. We propose that the sodium butyrate treatment changes the expression of genes which encode cellular factors that are involved in HCV replication. In order to better understand claudin-1 function, we developed a mutagenesis strategy of the protein. We showed that mutations affecting putative functional domains of claudin-1 were not required for HCV entry into target cells. On the other hand, we identified seven residues that are critical for entry of HCV isolates drawn from six different subtypes. Six of them belong to the highly conserved motif W-GLW-C-C of claudins family. We propose that cell-cell contacts formed by claudin-1 may generate specialized membrane domains that are amenable to HCV entry
42
Martin-Schmitt, Caroline. "Contribution des bases moléculaires à la physiopathologie d'une porphyrie hépatique aiguë : la coproporphyrie héréditaire et son variant phénotypique l'hardéroporphyrie." Paris 6, 2008. http://www.theses.fr/2008PA066190.
Full textAbstract:
Chez l’homme, les mutations du gène CPO codant pour la coproporphyrinogène III oxydase, sixième enzyme de la voie de biosynthèse de l’hème sont à l’origine de deux pathologies différentes. La majorité des mutations est responsable du phénotype de coproporphyrie héréditaire, porphyrie hépatique aiguë, autosomique dominante. Seule la mutation faux sens K404E, codée par l’exon 6 du gène CPO est responsable du phénotype «hardéroporphyrie», caractérisé par une symptomatologie hématologique de transmission autosomique récessive. Nous avons analysé les caractéristiques enzymatiques de mutants produits par mutagenèse dirigée en système procaryote. Les résultats obtenus montrent que cinq acides aminés (D400-K404) jouent un rôle dans la rétention de l’hardéroporphyrinogène au niveau du site actif de l’enzyme et que leur mutation est responsable du phénotype «hardéroporphyrie». Nous avons réalisé d’autre part l’étude exhaustive clinique, biologique et moléculaire de 56 patients coproporphyriques suivis au Centre Français des Porphyries.
43
Emond, Stéphane. "Evolution dirigée de l'amylosaccharase par la technique MutaGen™ pour l'obtention de variants thermostables." Toulouse, INSA, 2007. http://eprint.insa-toulouse.fr/archive/00000313/.
Full textAbstract:
L'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (AS) est une transglucosidase qui utilise le saccharose comme donneurs d'unités glucosyle pour synthétiser un polymère de type amylose et glucosyler efficacement des accepteurs comme le glycogène. Ce biocatalyseur est un outil industriel prometteur par sa capacité remarquable à utiliser un substrat abondant et peu coûteux (le saccharose) pour la synthèse de polymères ou de glucoconjugués d'intérêt. L'AS est cependant une enzyme peu adaptée aux contraintes industrielles du fait de son faible niveau d'activité (kcat = 1 mol/s), sa thermostabilité médiocre (Temps de demi-vie (30°C) = 21 h) et sa résistance limitée aux solvants organiques. Pour améliorer ces propriétés, une approche d'ingénierie combinatoire (ou évolution dirigée) reposant sur l’utilisation de la technique de mutagénèse aléatoire MutaGen brevetée par la société Millegen a été appliquée à l’AS. Dans un premier temps, trois banques de variants comportant plus de 105 clones ont été construites par réplication infidèle catalysée par les polymérases mutagènes d’origine humaine, pol beta et pol eta. L’analyse des séquences d’un échantillon représentatif montre que la diversité accessible par cette méthode (taux et types de mutation) dépend de la polymérase employée, ce qui démontre l’intérêt et la souplesse de cette nouvelle approche. Un protocole d’isolement de variants thermostables ou résistants au DMSO comprenant une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivi d’un criblage automatisé au format microplaque a ensuite été optimisé. Le coefficient de variance du procédé a été réduit de 27 à 12. 5%, ce qui permet de minimiser le taux de faux positifs. Appliqué au criblage de plus de 7000 variants actifs, le protocole développé a permis d’identifier 3 variants présentant une augmentation d’un facteur 3. 5 à 10 de la thermostabilité à 50 °C. Les modèles des variants thermostables ont été construits. Dans le cas du meilleur variant (R20C/A451T), l’analyse structurale indique que l’augmentation de thermostabilité est liée à la réorganisation du pont salin impliquant R20 et la création d’une liaison hydrogène médiée par T451. Ce variant est la seule amylosaccharase active à 50°C, capable de produire des chaînes d’amylose de degré de polymérisation moyen de 52 avec un rendement 3 fois plus élevé que celui observé pour l’enzyme sauvage à 30°C<br>Amylosucrase from Neisseria polysaccharea (AS) is a transglucosidase that uses sucrose as glucosyl unit donor to synthesize an amylose-type polymer and to glucosylate efficiently acceptor molecules like glycogen. Due to its ability to use sucrose which is a cheap and readily available substrate, AS is a promising industrial biocatalyst for the synthesis of amylose polymers or glucoconjugates of interest. However, the development of industrial processes involving AS is limited by its low catalytic efficiency on sucrose alone (turn-over = 1 mol/s), its thermostability (Half-life (50°C) = 3 min) and its weak resistance to organic solvents. A directed evolution approach using MutaGen, a new random mutagenesis method patented by MilleGen (Labège-Innopole, France), was applied to improve the properties of AS. First, three AS variant libraries were constructed by replicating the DNA sequence encoding wildtype AS with mutagenic human polymerases pol beta and pol eta. The sequence analysis of randomly chosen clones showed that the error rate and the kind of mutations generated can be monitored following the polymerases employed. A process enabling the identification of variants displaying higher thermostability or increased resistance toward DMSO was then optimized. It consists of two successive steps: (i) an in vivo selection which eliminates inactive variants followed by (ii) automated screening of active variants to isolate mutants displaying enhanced features. The coefficient of variance of the screening process was decreased from 27% to 12. 5%, minimizing false positive rate. Around 7,000 active AS variants were screened for increased thermostability using this procedure. These experiments led to the identification of three improved variants (two double mutants and one single mutant) showing 3. 5 to 10-fold increased half-lives at 50°C compared to the wild-type enzyme. In silico comparative analysis between the wild-type AS structure and the modeled variants allowed to highlight molecular features implicated in thermostability enhancement. In the case of the most thermostable variant isolated (R20C/A451T), the observed enhancement could be the result of a reorganization of salt bridges in the vicinity of C20 and the introduction of a hydrogen bond between Thr451 and Asp488 in AS flexible loop 8. This double mutant is the most thermostable amylosucrase known to date. When employed at 50°C, it produces amylose chains with a mean degree of polymerization of 52 with a yield up to 3 times higher than that obtained for such amylose chain synthesis with the wild-type enzyme at 30°C
44
Caron, Carolyn-Ann. "Étude des sites de liaison du récepteur CCR2b pour les protéines G et pour son ligand, le MCP-1, à l'aide de la mutagenèse dirigée." Mémoire, Université de Sherbrooke, 1999. http://savoirs.usherbrooke.ca/handle/11143/3177.
Full textAbstract:
Des études ont démontré que la partie N-terminale des récepteurs de chémokines est très importante pour la liaison à leurs ligands. Le premier aspect de ce travail de maîtrise a été d'investiguer, par mutagénèse dirigée, l'importance de la région N-terminale du CCR2b pour sa liaison au MCP-1. Afin de cerner les régions où les résidus spécifiques à la liaison du MCP-1, des mutants de délétion (D15, D23, D31) et de substitution (4A, 3A, A20, A21, A22) ont été créés. Des essais de cytofluorométrie, de liaison au MCP-1 et de production d'inositols phosphates (IPs) ont été faits pour caractériser les mutants. En cytofluorométrie, les résultats ont démontrés qu'absolument tous les mutants, incluant le D31 sont exprimés à la surface cellulaire. Puisque le D31 est exprimé, mais ne lie pas le MCP-1 et par le fait même n'est pas fonctionnel, il serait intéressant de faire des tests d'infection au VIH-1, afin de vérifier si les mêmes sites de liaison au MCP-1 sont requis pour l'infection des cellules par le VIH-1."--Résumé abrégé par UMI.
45
Drone, Jullien. "Synthèse sélective d'oligosaccharides : utilisation de glycosidases obtenues par mutagenèse ponctuelle et par évolution dirigée : tentatives de création d'une activité hydratase à partir d'une pectate lyase." Nantes, 2006. http://www.theses.fr/2006NANT2038.
Full textAbstract:
L'objectif de cette thèse est, d'une part, axée sur les glycosidases modifiées pour la synthèse d'analogues de l'antigène H-1 et, d'autre part, de créer une activité hydratase à partir d'une pectate lyase. A cet effet, nous avons évalué trois glycosynthases et des transglycosidases. Nos résultats montrent que les glycosynthases permettent d'obtenir des disaccharides avec des rendements quasi quantitatifs. De plus, les transglycosidases permettent la synthèse de composés de transglycosylation avec des rendements de 60 à 75% selon l'accepteur utilisé. La modification de la pectate lyase de Thermotoga maritima (TmPel) aux travers d'approches complémentaires a été tentée. Nos efforts pour l'évolution dirigée de TmPel nous ont permis de mettre au point un système de sélection in vivo dans Escherichia coli pour la recherche de nouvelles activités enzymatiques. Nous avons également construit un modèle de TmPel permettant de discuter des possibilités d'ingénierie rationnelle<br>The aim of this PhD thesis was first to use modified glycosidases for the synthesis of antigen H-1 analogs and second to generate an hydratase activity from a pectate lyase. In this end, we evaluated three glycosynthases and transglycosidases. We showed that glycosynthases can synthesize disaccharides with nearly quantitative yields. Furthermore, transglycosidases can synthesize transglycosylation compounds with 60 to 75% yields depending of the acceptor. Modification of the Thermotoga maritima pectate lyase (TmPel) was attempted with complementary approaches. Our efforts for the directed evolution of TmPel led us to the development of an in vivo selection system in Escherichia coli allowing the seak of new enzymatic activities. We also constructed a model of TmPel to discuss about its rationnal engineering
46
Schauer, Kristine. "Etude du métabolisme du nickel chez Hélicobacter pylori." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077146.
Full textAbstract:
Le nickel est un métal de transition qui est essentiel à la survie de la bactérie pathogène Helicobacter pylori au sein de sa niche unique, l'estomac humain. En effet, le nickel est le cofacteur de deux protéines indispensables à la virulence de ce pathogène, l'uréase et l'hydrogénase. Cependant la concentration intracellulaire de ce métal doit être strictement contrôlée car s'il est en excès, il provoque des effets toxiques pour la cellule. Etant donné la basse concentration en nickel dans l'homme, H. Pylori a besoin d'un système de transport à haute affinité pour importer suffisamment d'ions nickel. Nous avons montré que le passage les ions nickel à travers la membrane externe de H. Pylori dépend également du système TonB/ExbB/ExbD et du récepteur FrpB4. Des mutants portant des délétions des gènes tonB/exbB/exbD ou du gène frpB4 sont affectés dans la capacité à transporter du nickel lors d'une incubation à pH acide. La protéine NikR est un régulateur transcriptionnel qui répond à la concentration intracellulaire en nickel et régule un grand nombre de gènes chez H. Pylori. La structure cristallographique de NikR métallée en nickel ou non a été déterminée. Cette étude nous a permis d'identifier des acides aminés qui sont impliqués dans l'incorporation du nickel à un site de haute affinité et de proposer un mécanisme de fixation du nickel asymétrique dans NikR. Finalement, nous avons caractérisé plusieurs protéines de H. Pylori impliquées dans la détoxification du nickel et dans son incorporation au sein des deux métallo-enzymes à nickel. En conclusion, ce travail nous a permis de mieux comprendre la contribution du nickel dans la physiologie et la virulence de H, pylori<br>The transition metal nickel is essential for the survival of the pathogen Helicobacter pylori in the human stomach because of its function as a cofactor of the important colonization factors urease and hydrogenase. Given the low concentration of nickel ions in the gastric environment, its scavenging is challenging. By analogy to the TonB/ExbB/ExbD-dependent high affinity uptake of iron-complex across the outer membrane, thé TonB/ExbB/ExbD machinery and the nickel-regulated TonB-dependent receptor FrpB4 of H. Pylori were shown to sustain nickel uptake under acidic conditions. This transport mechanism enables H. Pylori to scavenge nickel in order to combat acidity. To better understand the pleiotropic control mechanism of the nickel-dependent transcriptional regulator NikR of H. Pylori, its structure was determined using X-ray crystallography. This analysis demonstrated that the solvent accessibility and nickel localization at the two sides of the NikR tetramer were different implying a mechanism of asymmetric nickel binding and nickel incorporation. Finally, the role of different nickel binding proteins in the distribution and storage of nickel in H. Pylori was investigated. Nickel toxicity experiments demonstrated that the nickel-binding extension of HspA protects H. Pylori from nickel overload. Analyses of the interacting partners of urease revealed a physical interaction between the urease and hydrogenase accessory proteins in vivo. In conclusion, my Ph. D. Work shed light on thé importance of the nickel metabolism for the specific adaptation of H. Pylori to its unique niche and revealed new insights into general regulation and transport mechanisms in bacteria
47
Diribarne, Gaëlle. "Etude de la régulation du facteur de transcription P-TEFb par la protéine HEXIM1 et l'ARN non codant 7SK." Paris 7, 2010. http://www.theses.fr/2010PA077143.
Full textAbstract:
Le P-TEFb est un facteur positif de Mongation de la transcription par TARN polymérase IL C'est à ce jour le seul complexe cycline-CDK (Cycline T-CDK9) régulé par un ARN non codant. Le P-TEFb existe sous deux formes en équilibre dans la cellule : une petite forme active et une grande forme inactive, qui comprend en plus du P-TEFb, la protéine HEXIM et TARN non codant 7SK. Le 7SK modifierait la conformation de HEXIM et démasquerait son domaine d'interaction avec la Cycline T. Différents stimuli, comme une inhibition de la transcription, conduisent à la dissociation du grand complexe P-TEFb. Nous avons mis en évidence une nouvelle zone de contact direct entre HEXIM et la Cycline T par mutagenèse. L'interaction entre HEXIM et le P-TEFb existe bien dans les cellules. Elle est en effet détectable par des expériences de FRET et de couplage covalent. Ces expériences indiquent surtout l'existence d'un complexe, non décrit précédemment, entre HEXIM et le P-TEFb, qui se maintient lors d'un arrêt de la transcription. Par ailleurs, nous avons montré le recrutement des partenaires inhibiteurs du P-TEFb, HEXIM et 7SK, sur des sites de transcription, par des techniques de microscopie et des immunoprécipitations de la chromatine. HEXIM et 7SK pourraient ainsi contrôler l'activation spatiotemporelle du P-TEFb sur les sites de transcription<br>P-TEFb is a positive elongation factor for RNA polymerase II transcription. It is a unique example of a CDK-cyclin complex (CDK9-Cyclin T) regulated by a non-coding RNA. P-TEFb exists under two forms in equilibrium in the cell: a small active one, and a large inactive one, also containing the HEXIM protein and the 7SK non coding RNA. 7SK would change HEXIM conformation and unmask its domain of interaction with the cyclin subunit of P-TEFb. Many stimuli, as transcription inhibition, result in the dissociation of the large inactive P-TEFb complex. We characterized a new domain of HEXIM implicated in its direct contact with Cyclin T by mutagenesis. HEXIM and P-TEFb interact in the cell, as confirmed by FRET and crosslinking experiments. These experiments mainly showed a new HEXIM/P-TEFb complex, which resists to transcriptional arrest. We also demonstrate the recruitment of P-TEFb inhibitory partners, HEXIM and 7SK, on transcription sites, by microscopy and chromatin immunoprecipitation experiments. HEXIM and 7SK would thus control the spatio-temporal activation of P-TEFb on transcription sites
48
Hommais, Antoine. "Etude d'anomalies moléculaires du facteur willebrand et de sa protéase ADAMTS13 responsables d'une longueur anormale des multimères de facteurs willebrand." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077055.
Full textAbstract:
Le facteur Willebrand (VWF) et sa protéase spécifique, une métalloprotéase appelée ADAMTS13, sont deux acteurs majeurs du maintien de l'équilibre hémostatique de la microcirculation. Le VWF est une glycoprotéine plasmatique multimérique, dont la fonction est de promouvoir l'adhésion et l'agrégation plaquettaire. La multimérisation du VWF se fait par l'assemblage des sous-unités de VWF en dimères puis en multirnères impliquant les domaines CK et D3. Les multimères de très haut poids moléculaire possèdent la plus forte capacité adhésive. Celle-ci est finement contrôlée in vivo par ADAMTS13 dont le rôle primordial est de limiter leur taille par hydrolyse. Le but de ce travail est d'améliorer notre compréhension des mécanismes impliqués dans la synthèse et le catabolisme du VWF et de l'importance de la taille des muïtimères de VWF dans son interaction avec les plaquettes. Après avoir reproduit par mutagenèse dirigée des anomalies moléculaires, nous les avons caractérisées. Nous avons montré que la mutation A2801D du domaine CK en modifiant sa conformation entraînait une anomalie de la dimérisation du VWF. Nous avons également montré que les mutations Cl 157F et C1234W induisent une multimérisation anormale, ainsi qu'une sécrétion ralentie, associé à une rétention intracellulaire. Démontrant le rôle primordial et complexe joué par le domaine D3 dans la biosynthèse et la fonction du VWF. L'étude de 4 mutations d'ADAMTS13 S203P, R268P, R507Q et A596V, nous a permis de montrer l'existence de plusieurs mécanismes à l'origine d'un déficit en ADAMTS13. L'ensemble de ce travail fait apparaître le rôle primordial joué par le couple VWF/ADAMTS13 dans la balance hémostatique<br>The Von Willebrand factor (VWF) and his cleaving protease, ADAMTS13 a métalloprotease, were two majors acting in the hemostasis balance in the microcirculation. The VWF is a multimeric glycoprotein, mediates adhesion and platelet aggregation in the vessel wall. VWF dimerizes between CK domains and mutlimerization of dimmers is achevied by forming disulfide bonds between D3 domains. Ultralarge VWF multimers are biologically the most active in platelet interaction. The adhesive property is regulated in vivo by ADAMTS13. ADAMTS13 cleaving VWF multimers and limit here size. The objective of this work was improved our comprehension of biosynthesis and degradation of VWF and the importance of the size of VWF multimers in platelets interaction. We reproduced mutations by directed mutagenesis and we characterized molecular anomalies. We demonstrated that A2801D mutation in CK domain by inducing an abnormal conformation involved a defected dimerizaton of VWF. We demonstrated that Cl 157F and C1234W mutations induced a impaired multimerization, with a slower secretion associated to a intracellular retention. This result demonstrated the importance and complexity of D3 domain in biosynthesis and fonction of VWF. In study of 4 ADAMTS13 mutations, S203P, R268P, R507Q and A596V, we demonstrated the existence of different mechanisms to induce a deficit of ADAMTS13. This study show the importance of the VWF/ADAMTS13 couple in the delicate hemostasis balance
49
Delaire, Myriam. "Mutagénèse dirigée au site actif de la béta-lactamase TEM-1 : définition du rôle de différents résidus dans le mécanisme enzymatique." Toulouse, INSA, 1992. http://www.theses.fr/1992ISAT0023.
Full textAbstract:
Les beta-lactamases constituent la voie majeure de resistance aux beta-lactamines, antibiotiques tres utilises. Plusieurs residus de la beta-lactamase tem-1 d'escherichia coli, situes au niveau de la cavite catalytique de la proteine, ont ete etudies. Pour cela, chacun de ces residus a ete substitue par 15 autres acides amines grace a la methode de suppression informationnelle. Apres analyse de l'activite des variants ainsi obtenus, certains revertants ont ete construits par mutagenese dirigee, puis cinetiquement caracterises par microacidimetrie. A l'aide de ces donnees, mais aussi grace aux informations apportees par la structure tridimensionnelle de la proteine tem-1 resolue a 1,8 a, le role de chaque residu a alors pu etre determine. Ainsi, il apparait que l'arginine 244 intervient dans l'hydrolyse enzymatique en destabilisant le complexe enzyme-produit. La methionine 69 et la leucine 169 jouent quant a elles un role different: ces deux residus imposent des contraintes structurales au niveau du site actif qui permettent de maintenir une topologie optimale pour la fixation et l'hydrolyse des differents substrats de l'enzyme. Enfin, l'acide glutamique 166 est essentiel pour la catalyse enzymatique; ce residu intervient en tant que base generale dans l'etape de deacylation. La comparaison des structures tridimensionnelles de l'enzyme sauvage et du variant e166y, determinees a l'ibmc de strasbourg, a egalement apporte des indications sur l'adaptation conformationnelle de la beta-lactamase tem-1
50
Courtois, Fabienne. "Etudes mécanistiques de la cyclopropane Fatty Acid synthase d' Escherichia coli." Paris 6, 2006. http://www.theses.fr/2006PA066017.
Full text