Academic literature on the topic 'Mutants de l'ARN polymérase C'

This thesis concerns the study of class C gene transcription in the yeast Saccharomyces cerevisiae by taking advantage of temperature sensitive mutants affected at the level of RNA polymerase C. The mutants rpc160-20, rpc160-31and rpc160-41 carry a point mutation in the major subunit (C160) of RNA polymerase C, and the mutant RPC53::H+ carries an integrative disruption of the gene coding for the subunit C53. In vivo, the mutants display an imbalance in the synthesis of the small RNAs transcribed by RNA polymerase C : the synthesis of tRNAs is greatly diminished compared to that of 5S RNA. The structural and functional properties of the mutant RNA polymerases were examined. In vitro studies using reconstituted transcription systems showed that the C160 subunit is involved in the specific transcription of genes. In a general manner, the imbalance in the synthesis of tRNA and 5S RNA is due to a decrease in the amount of mutant RNA polymerase C in the cell, probably because of a lack of enzyme assembly. On the other band, intracellular levels of transcription factors TFIIIB and TFIIIC (τ) are not significantly reduced. Studies of the mutant rpc160-41 showed that RNA polymerase C is involved in the transcription of the gene coding for the yeast small nuclear RNA snR6 (the yeast homologue of the mamalian U6 snRNA). This gene was expressed in vitro in a transcription system that requires RNA polymerase C and TFIIIB fraction
Cette thèse porte sur l'étude du système de transcription des gènes de classe C chez la levure Saccharomyces cerevisiae en se fondant sur l'analyse de mutants thermosensibles affectés au niveau de l'ARN polymérase C. Les mutants rpc160-20, rpcl60-31 et rpc160-41 portent une mutation de la plus grande sous-unité (C160) de l'ARN polymérase C est le mutant RPC53:H+ porte une cassure intégrative du gène codant pour la sous-unité C53. In vivo, les mutants présentent un déséquilibre de la synthèse des petits ARN transcrits par l'ARN polymérase C. La synthèse des ARNt est très fortement diminuée comparée à celle de l'ARN 5S. Les propriétés structurales et fonctionnelles des ARN polymérases C mutées ont été examinées. L'étude in vitro réalisée avec des systèmes de transcription reconstitués a permis de mettre en évidence le rôle de la sous-unité C160 dans la transcription spécifique des gènes. De façon générale, le déséquilibre dans la synthèse d'ARNt et d'ARN 5S est dû à une diminution de la quantité d'enzyme dans les cellules, probablement par défaut d'assemblage de l'enzyme. D'autre part, aucune corégulation du taux d'enzyme C et des facteurs de transcription TFIIIB et TFIIIC (t) n'a été observée. Grâce au mutant rpc160-41 le rôle de l'ARN polymérase C dans la transcription du gène du petit ARN nucléaire snR6 de levure (homologue du snRNA U6 de mammifère) a été mis en évidence. Ce gène a été exprimé dans un système de transcription in vitro qui nécessite de l'ARN polymérase C est la fraction TFIIIB

L'infection par le virus de l'hépatite C (VHC) est un problème majeur de santé publique. Le traitement actuel n'étant efficace que dans 50 % des cas, le développement de nouveaux traitements anti-VHC est nécessaire. L'ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) du VHC est une cible de choix puisqu'elle est nécessaire à la réplication du virus. En utilisant une stratégie combinatoire (SELEX), nous avons sélectionné des aptamères ADN se fixant à la RdRp du VHC. Parmi ces aptamères, 3 présentaient un effet inhibiteur sur la réplication in vitro. Pour 2 d'entre eux, la capacité à se fixer et à inhiber la RdRp a été associée à leur région variable. Ces 2 aptamères, qui présentent des structures secondaires différentes, inhibent spécifiquement la RdRp du VHC par des mécanismes distincts : alors que l'un inhibe l'élongation de la synthèse d'ARN, l'autre agit principalement sur l'initiation. Leur effet sur la réplication dans un contexte cellulaire a aussi été étudié dans le système réplicon
Hepatitis C (HCV) infection is a major health problem worldwide. The current therapy is not effective for half of treated patients thus, the development of new and specific drugs are urgently needed. Among the viral functions essential for viral replication, one of the most attractive targets for the development of drugs is the RNA dependant RNA polymerase (RdRp). Using a combinatorial approach (SELEX), DNA aptamers which bind specifically the HCV RdRp were selected. Three of these aptamers are able to inhibit the RNA synthesis in vitro. The binding and the inhibitory potential of 2 of these aptamers were associated with the random region. These aptamers, which display different secondary structures, inhibit specifically HCV RdRp by 2 distinct mechanisms : one is able to inhibit elongation whereas the other acts predominantly on initiation. The effect of the aptamers on HCV replication in a cellular context was studied with replicon system

L'une des principales cibles pour la thérapie visant le virus de l'hépatite C (VHC) est l'ARN polymérase dépendante de l'ARN NS5B indispensable à la réplication du génome virale. NS5B est l'une des enzymes clefs du cycle virale de VHC et son activation met en jeu aussi bien des interactions intramoléculaires que des interactions avec des cofacteurs viraux et cellulaires au sein du complexe de réplication. Nous avons développé une nouvelle stratégie d'inhibition de NS5B basée sur l'élaboration de peptides courts dérivés de motifs exposés à la surface de l'enzyme dans le but de cibler les nombreuses interactions impliquées dans l'activation de cette protéine. En associant une analyse fine de la structure cristallographique de NS5B avec de la modélisation moléculaire, nous avons élaboré des peptides courts mimant les motifs « hotspot » de la protéine. Ces peptides ont été évalués sur système réplicon de génotype 1b et nous avons ainsi identifié un peptide leader Moon1 de 15 résidus correspondant à un motif hautement conservé du domaine "thumb". Dans ce travail, nous avons étudié en détail la structure et le mécanisme moléculaire de ce nouvel inhibiteur de NS5B. Moon1 inhibe l'activité polymérase de la forme sauvage de NS5B ainsi que celle de mutants résistants au inhibiteurs nucléosidiques et non nucléosidiques. Nous avons démontré que la fixation de Moon1 entraine un changement de conformation de NS5B et se fait préférentiellement avec NS5B dans une conformation fermée. Ce peptide inhibe spécifiquement l'interaction entre NS5B et l'ARN double brin, indépendamment de la présence d'ions métalliques et de manière dose-dépendante. Moon1 bloque la transition entre l'étape d'initiation de novo de la synthèse d'ARN et l'extension du primer. Nous avons démontré que les résidus essentiels à l'activité de Moon1 sont hautement conservés à travers les différents génotypes et sous-types de VHC. De plus, nous avons établi une séquence minimale pour l'activité de Moon1. Nos travaux permettent de valider l'intérêt d'une stratégie interfaciale ciblant une enzyme clef du cycle du VHC et les interactions intra et intermoléculaires nécessaires à son activation
The non-structural protein RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) NS5B plays a key role in hepatitis C virus (HCV) replication and is currently considered as one of the most relevant target to develop safe anti-HCV agents. Although many small molecules have been identified as inhibitors of NS5B, very few are active in clinic. The structure and function of NS5B have been well characterized and as other polymerases, NS5B adopts a typical “right-hand” conformation containing the characteristic fingers, palm and thumb subdomains. The activation of NS5B requires conformational changes involving intramolecular contacts as well interactions with viral proteins and host factors in the replication complex. We developed a new strategy for NS5B inhibition based on short interfacial peptides derived from NS5B surface accessible motifs that target protein-protein interfaces or essential motifs involved in NS5B-activation. Combining the NS5B crystallogaphic structure and molecular modelling, we have designed short peptides derived from NS5B surface “hotspots” that were screened using HCV genotype 1b replicon cell system. We have identified Moon1, a short 15-residu peptide, derived from a well-conserved motif located in the NS5B thumb domain that inhibits HCV replication in the low nanomolar range. Moon1 tightly binds NS5B in a conformational-dependent manner and induces NS5B conformational changes. This peptide specifically inhibits double-stranded RNA/NS5B interactions in a dose-dependent and metal ions-independent manner. Moon1 blocks the transition between RNA de novo initiation and primer-extension. We showed that residues required for Moon-1 anti-polymerase activity are well-conserved among HCV genotypes and subtypes and a minimal Moon1 active motif was established. Taken together, these results demonstrate that NS5B structural dynamics constitute an attractive target for HCV chemotherapeutics and for the design of more specific new antiviral drugs

Le virus de l'hépatite C(VHC) est l'agent étiologique de la plupart des cas d'hépatites non-A non-B post-transfusionnelles ou sporadiques. Les traitements actuels proposés étant inefficace dans 50 % des cas, le développement de traitements anti-VHC nouveaux et spécifiques est donc nécessaire. Parmi les fonctions virales essentielles à la réplication virale, une des cibles les plus attractives pour le développement d'anti-viraux est l'étape de synthèse de l'ARN génomique assurée par l'ARN polymérase dépendante (NS5B) codée par le génome du VHC. Afin d'étudier l'initiation de la synthèse d'ARN à partir du génome du VHC, nous avons utilisé des ARN transcrits in vitro correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN (-) et (+) comme matrices pour la synthèse d'ARN catalysée par la NS5B purifiée du VHC. Les résultats de ces expériences montrent que la capacité de synthèse de l'enzyme n'est pas la même suivant la matrice ARN utilisée, et que les 341 premiers nucléotides correspondant à l'extrémité 3' de l'ARN (-) sont les plus efficacement copiés par l(enzyme. L'importance et la forte conservation de cette région ARN nous a encouragé à développer une stratégie antisens afin d'obtenir des séquences oligonucléotidiques qui pourraient bloquer ou ralentir la réplication de l'ARN viral. Parmi les ODN complémentaires de l'extrémité 3' de l'ARN (-) testés, 4 inhibent la synthèse d'ARN avec un IC50 inférieure à 1 uM. Cette inhibition est séquence spécifique et l'introduction d'une modification 2'-O-méthyl ou phosphoramidate abaisse l'IC50 nM et 30 nM respectivement) d'environ 12 fois pour l'un des 4 ODN inhibiteurs, l'ODN7. Nos résultats suggèrent que l'ODN7 inhibent la synthèse d'ARN en interférant avec des motifs structuraux important pour une initiation efficace de la synthèse d'ARN, présents à l'extrémité 3' de l'ARN(-).

Chez les eucaryotes, les ARN-polymérases, responsables de la transcription des gènes, sont composées d'un grand nombre de sous-unités : l'ARN polymérase C de la levure est bien étudiée suivant l'approche consistant à analyser la fonction de ses sous-unités par le clonage et l'étude de leur gène de structure. Le gène RPC53 a été cloné par détection immunologique et identifié selon des critères indépendants; ce gène, unique dans le génome, est contenu dans le chromosome IV et n'est lié à aucun autre gène d'ARN-polymérase. L'analyse de sa séquence montre que la sous-unité C53 n'est homologue à aucune autre sous-unité d'ARN-polymérase, que le gène est assez faiblement transcrit et semble co-régulé avec d'autres gènes de l'ARN-polymérase C; la protéine correspondante, d'une taille de 47. 000 d, est très basique, essentiellement structurée en α-hélice : elle contient un motif-consensus impliqué dans l'exportation vers le noyau cellulaire. L'inactivation du gène par disruption confère aux cellules un phénotype létal récessif et montre que la sous-unité C53 comporte une fonction essentielle pour la cellule. Des études de complémentation de cette inactivation ont révélé un allèle du gène RPC53 dont la séquence diffère notablement du premier mais qui est fonctionnel : ces différences de séquence témoignent d'un polymorphisme prononcé du gène RPC53, surtout dans une courte région qui pourrait correspondre à une partie de la protéine séparant deux domaines fonctionnels distincts. L'étude fonctionnelle de la sous-unité C53, abordée par l'utilisation d'anticorps immune-purifiés sur une protéine de fusion, et plus globalement, par la mutagénèse in vitro du gène RPC53 et 1'analyse des mutants sélectionnés, indique que cette sous-unité est impliquée dans la transcription des ARN de transfert et pourrait intervenir dans la sélection des promoteurs utilisés par l'ARN-polymérase C.

La polymérase NS5B du virus de l’hépatite C (VHC) porte une activité ARN polymérase ARN-dépendante essentielle pour la réplication de l'ARN génomique viral. Cette réplication implique la synthèse d'un intermédiaire de réplication de polarité négative. In vitro et probablement in vivo, la NS5B initie la synthèse d'ARN par un mécanisme de novo qui nécessite des interactions spécifiques entre la polymérase virale et des éléments des ARN viraux. Dans une première partie nous avons étudié le rôle du GTP et d’un domaine C-terminal nommé linker de la polymérase. Nos résultats démontrent que des concentrations élevées de GTP sont nécessaires pour la transition de l'initiation à l'élongation de la synthèse de l'ARN. Des mutations dans le linker à la position 556 ne modifient pas la concentration de GTP nécessaire pour la transition. Toutefois, l'initiation de la synthèse d'ARN est augmentée par la mutation S556K. Une analyse structurale menée en parallèle suggère une implication directe du linker dans l'initiation de novo de la synthèse de l'ARN. Dans les deuxièmes et troisièmes parties, nous avons étudié le rôle de motifs ARN dans la traduction et la synthèse de l’'ARN du VHC. Nous avons démontré que la tige boucle SL-E1 formée par la région entre les nt 177 et 222 de l'extrémité 3' de l’ARN (-) est importante pour la synthèse d'ARN in vitro par la NS5B recombinante et dans les cellules Huh7 exprimant le complexe de réplication (RC) du VHC. SL-E1 est impliquée dans l’initiation de la synthèse d’ARN, au moins in vitro. Nous avons également étudié le rôle des tiges boucles SLV et SLVI du gène core. Nos données n'ont pas montré de rôle évident de ces séquences ou de leur complément dans la synthèse de l'ARN in vitro par la NS5B recombinante et en culture cellulaire par le RC du VHC. Nous avons confirmé leur effet négatif sur la traduction IRES dépendante par interaction ARN-ARN longue distance entre SL-VI et le 5'UTR et démontré que le miR122 ne peut pas empêcher cet interaction. Par contre, la présence de SL-VI prévient l’inhibition de la traduction induite par l’interaction entre le domaine III de l’IRES et la tige boucle 5BSL3.2 en 3’ du génome. Ces résultats démontrent la complexité des interactions ARN/ARN et ARN/protéines dans la régulation de la réplication virale
The hepatitis C virus (HCV) NS5B protein displays a RNA-dependent RNA polymerase activity essential for replication of the viral RNA genome. This replication involves the synthesis of a replication intermediate of negative polarity. In vitro and likely in vivo, the NS5B initiates RNA synthesis by a de novo mechanism which requires specific interactions between the polymerase and viral RNA elements. In the first part of results, we described a combined structural and functional analysis of HCV-NS5B to study the role of a C-terminal segment (termed linker) and of GTP in RNA synthesis. Our results demonstrated that high GTP concentrations are necessary for the transition from the initiation to the elongation of RNA synthesis, and that linker mutations at position S556 did not modify the GTP requirement of NS5B for this transition. However, the initiation of RNA synthesis was greatly enhanced by a S556K mutation. These results together with a structural analysis point to the direct involvement of the linker in the de novo initiation of RNA synthesis. In the second and third parts of results, we studied the role of RNA elements in RNA synthesis. We demonstrated that the SL-E1 stem–loop formed by nucleotides 177–222 from the 3’-end of the HCV (-) RNA is important for RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in Huh7 cells by HCV replication complex (RC). We also showed that SL-E1 is involved in initiation of RNA synthesis, at least in vitro. Then we studied the role of other viral RNA elements in core coding sequences (SLV and SLVI stem loops) and the involvement of the microRNA miR122 in RNA translation and RNA synthesis. For SLV and SLVI, our data did not show any clear role of these core-coding sequences or of their complement in the (-) RNA in RNA synthesis both in vitro by the recombinant NS5B and in cell culture by HCV-RC. We confirmed their negative effect on HCV-IRES translation through long range RNA-RNA interaction between SL-VI sequences and the 5’UTR and demonstrated that miR122 cannot disrupted this interaction and switches the region to an open conformation. Conversely, our data indicated that the SL-VI domain can counteract the negative effect of the interaction between the domain III of IRES and the 5BSL3.2 stem loop localized at the 3’end of the genome. These results point to the complexity of RNA/RNA and RNA/proteins interactions in the HCV replication cycle

Le projet de thèse se focalise sur la synthèse de biomolécules et se subdivise en deux parties. La première partie concerne la conception et la synthèse de dérivés de produits naturels d'intérêt thérapeutique nommés aurones en vue de mettre au point de nouvelles molécules à activité antivirale. Récemment, les aurones ont été identifiées comme étant des inhibiteurs de l'ARN-polymérase ARN-dépendante (NS5B) du virus de l'hépatite C (VHC). Cette enzyme, présente chez le virus mais absente chez l'homme, joue un rôle central dans la réplication virale. Suite à ces résultats antérieurs, les efforts ont été poursuivis et, dans le cadre de cette thèse, nous avons entrepris,d'une part, la synthèse d'analogues originaux dont le cycle B des aurones a été remplacé par des hétérocycles et, d'autre part, la synthèse depseudodimères d'aurones dans le but d'affiner les exigences structurales pour améliorer l'effet inhibiteur.L'activité a été évaluée selon des tests enzymatiques et cellulaires et a permis d'identifier quelques candidats doués d'une bonne activité inhibitrice et d'une faible toxicité. La deuxième partie du projet de thèse, sans lien avec la première partie,concerne des aspects plus fondamentaux et porte sur la synthèse de nouveaux surfactants agissant comme agents stabilisants lors des procédures d'extraction et de cristallisation des protéines membranaires. Les surfactants sont des composants clés dans le domaine de la biologie structurale et de la biochimie des protéines membranaire. Ils sont nécessaires pour maintenir les protéines membranaires dans leur état fonctionnel après extraction. La grande majorité des protéines membranaires est riche en résidus basiques à l'interface. Sur la base de cette caractéristique, une nouvelle famille de surfactants est développée et testée sur des protéines membranaires appartenant aux pompes d'efflux ABC multi-résistantes
The PhD project focuses on biomolecules and is divided into two parts. The first part concerns the design and synthesis of natural product derivatives with therapeutic interest in order to develop new molecules with antiviral activity. Recently, aurones were identified as new inhibitors of hepatitis C virus (HCV) NS5B polymerase. Following these results, efforts were continuedand we undertook, on the one hand,the synthesis of original analogues in which the aurone B-ring was replaced by a heterocyclic rings and, on the other hand, the synthesis of aurone pseudodimers in order to refine the structural requirements to improve the inhibitory effect. The potent NS5B inhibitory activity combined with their low toxicity make aurones attractive drug candidates against HCV infection. The second part of the PhD thesis is unrelated to the first part and concerns more fundamental aspects. It focused on the synthesis of new surfactants acting as stabilizing agents during extraction of membrane proteins (PM). Surfactants are required for maintaining PM in their functional state after extraction from membrane lipid matrix. The vast majority of PM shares a net enrichment in basic residues at the interface between membrane and cytoplasm, a property known as the positive inside rule. Based on this feature, a new family of surfactants is developed and tested on membrane proteins belonging to the multidrug ABC efflux pumps family

Le contrôle traductionnel par la régulation de la taille des queues poly(A) est essentiel durant le développement précoce de nombreux organismes. Deux types de régulation de la taille des queues poly(A) peuvent exister : la polyadénylation cytoplasmique, qui consiste en l'ajout de résidus adénylés à l'extrémité 3' d'un ARNm et qui va activer sa traduction, et la déadénylation, qui consiste au raccourcissement de la queue poly(A) d'un ARNm cible et qui conduit à sa déstabilisation et/ou sa répression traductionnelle. Les poly(A) polymérases non canoniques de type GLD-2 ont été mises en évidence chez différents organismes. Elles sont impliquées dans la polyadénylation cytoplasmique. Chez les vertébrés, elles interagissent avec CPEB (Cytoplasmic polyadenylation element binding protein). Chez la drosophile, nous avons étudié un homologue de GLD-2, Wispy (Wisp). Des expériences in vivo et in vitro montrent que Wisp est une poly(A) polymérase cytoplasmique et mettent en évidence son interaction physique avec l'homologue de CPEB, Orb. Wisp et Orb agissent dans la polyadénylation cytoplasmique lors de l'ovogenèse tardive, notamment pour l'arrêt en métaphase I et la progression de la méiose après ce stade, et lors de l'embryogenèse précoce. La poly(A) polymérase canonique (PAP) est aussi impliquée dans la polyadénylation cytoplasmique avec Orb, lors des étapes plus précoces de l'ovogenèse. En conclusion, deux poly(A) polymérases, la PAP et Wisp, sont requises de façon séquentielle pour la polyadénylation cytoplasmique pendant l'ovogenèse de drosophile. Chez la drosophile, le mécanisme de déadénylation est étudié lors de l'embryogenèse précoce, pendant laquelle de nombreux ARNm maternels sont dégradés. Cette déadénylation est réalisée par le complexe de la déadénylase CCR4 qui est recruté de façon spécifique sur des ARNm cibles grâce à des protéines de liaison à l'ARN, telles que Smaug et Pumilio. Nos résultats mettent en évidence un rôle de la protéine de liaison à l'ARN, Bicaudal-C (Bic-C), dans la déadénylation, lors de l'ovogenèse précoce. Elle recrute le complexe de déadénylation de CCR4. Des cibles de Bic-C sont identifiées, dont l'ARNm Bic-C lui-même, qui est autorégulé par déadénylation. De plus, des résultats montrent que Bic-C pourrait avoir un double rôle à la fois dans la déadénylation et dans la polyadénylation cytoplasmique.