Dissertations / Theses on the topic 'Mycologie médicale'

Dans le cadre de la recherche de nouveaux produits antifongiques, nous nous sommes proposes de synthetiser la serie de benzyl 2-furylcetones -bromees et la serie de benzyl 2-furylcetones -fluorees diversement substitues. La bromation et la fluoration de la serie de benzyl 2-furylcetones se font en deux etapes. La premiere etape est une bromation de benzyl 2-furylcetones par la resine anionique a#1#6#2br#3#. La deuxieme etape est une fluoration nucleophile de benzyl 2-furylcetones -bromees par la resine anionique a#2#6f#. Les rendements eleves obtenus a chaque etape soulignent l'efficacite et la specificite des supports polymeriques. Les composes sont ensuite soumis a des tests d'activite antifongique vis-a-vis des trois champignons: les candida, les aspergillus et les dermatophytes. Ces tests sont bases sur la mesure de la concentration minimale inhibitrice c. M. I. . A l'issue de ces tests, la benzyl 2-furylcetone -bromee et la benzyl 2-furylcetone -fluoree, se sont revelees etre les plus actives sur tous les champignons. Aussi pour une interpretation approfondie de ces resultats, il a ete effectue l'etude et l'analyse de la relation structure-activite de ces composes au moyen de parametres physico-chimiques selon la methode de hansch. Les correlations obtenues ont permis d'evaluer l'influence d'un substituant, selon sa position et sa nature, sur le cycle benzenique dans l'activite antifongique de ces composes. Les differentes donnees permettent de proposer un mecanisme d'action probable de ces composes avec les candida. La reaction qui justifie l'activite antifongique est de type sn#1 avec les cetones bromees et de type sn#2 avec les cetones fluorees. L'activite antifongique des cetones bromees est meilleure grace au mecanisme sn#1 favorise entre autres par les substituants en ortho qui exercent un effet spatial de resonance

La synthese de 2-furylcetones par condensation d'un acide organique que le furane, en presence d'anhydre trifluoroacetique, en utilisant une resine phosphonique comme catalyseur, dans le notromethane, s'effectue avec d'excellents rendements et une totale selectivite. La bromation de ces cetones par l'ion par bromure fixe sur une resine amionique conduit regioselectivement a des 2 furylcetones -bromees. L'etude de l'activite antifongique de ces composes montre, pour certains d'entre eux, une activite antifongique du meme ordre de grandeur que celle des drogues utilisees. Les 2 furylbromobenzylcetones ortho ou para substituees ayant une activite antifongique notable ont fait l'objet d'une correlation structure-activite. Celle-ci fait ressortir les parametres qui influent sur la reponse antifongique ainsi que sur le mode d'action

Les histidine kinases (HKs) représentent une vaste famille de protéines impliquées dans la perception des signaux environnementaux chez les bactéries, les champignons et les plantes. Ces protéines joueraient notamment un rôle majeur dans l’adaptation aux stresses, mais aussi dans la virulence de nombreux micro-organismes procaryotes et eucaryotes. Si les HKs sont à présent bien connues chez les bactéries et les plantes, tant sur un plan structural que fonctionnel, les connaissances concernant ces protéines chez les autres clades de l’arbre du vivant demeurent plus que fragmentaires. C’est ainsi que le premier objectif de ce travail a consisté en l’exploration in silico de la structure et de la distribution des HKs chez les organismes eucaryotes dans le cadre de plusieurs études bioinformatiques : i) chez les champignons inférieurs, ii)chez les levures bourgeonnantes et enfin iii) à travers l’ensemble des super-groupes eucaryotes. Les HKs n’étant pas retrouvées chez les mammifères, elles suscitent depuis quelques années une attention particulière de la communauté scientifique en tant que nouvelles cibles pour le développement d’antimicrobiens. C’est précisément dans ce contexte que la partie expérimentale de ce projet a été initiée au sein du GEIHP. Cette équipe porte en effet ses efforts sur le filamenteux multi-résistant Scedosporium apiospermum qui se situe au second rang parmi les moisissures capables de coloniser chroniquement les poumons des patients atteints de mucoviscidose. Ainsi, dans l’optique d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques du champignon, la seconde partie de ce projet s’est focalisée sur la caractérisation fonctionnelle des HKs chez Scedosporium apiospermum. En parallèle, cette étude nous a également amenés à développer de nouveaux outils moléculaires adaptés à S.apiospermum en vue de futures études d’imageries de fluorescence et de bioluminescence
Histidine kinases (HKs) represent a broad family of proteins involved in the perception of environmental signals in bacteria, fungi and plants.These proteins play a major role in stress adaptation, but also in the virulence of many prokaryotic and eukaryotic microorganisms. Although HKs are now well known in bacteria and plants, both structurally and functionally, knowledge about these proteins in other clades of the living tree remains more than fragmentary. Thus the first objective of this work was the in silico exploration of the structure and distribution of HKs in eukaryotic organisms through several bioinformatics studies : i) in the lower fungi, ii)in budding yeasts, and finally iii) across all eukaryotic supergroups. Since HKs are not found in mammals, they have been attracting attention in recent years from the scientific community as new targets for the development of antimicrobials. It is precisely in this context that the experimental part of this project was initiated in the GHEIHP. This team is focusing on the multi-resistant filamentous Scedosporiumapiospermum, which ranks second among the molds capable of chronycally conolizing the lungs of cysticfibrosis patients. Thus, in order to identify new therapeutic targets of the fungus, the second part of this project focused on the functional characterization of HKs in S. apiospermum. In parallel, this study also led us to develop new molecular tools adapted to S. apiospermum for future studies of fluorescence or bioluminescence imaging

Les biomatériaux insérés dans la cavité orale, tout particulièrement les prothèses dentaires amovibles en résine, constituent des surfaces propices à la formation de biofilms incorporant des levures du genre Candida, à l’origine de candidose. Les levures, comme d’autres micro-organismes, adaptent leur prolifération à l’environnement par des molécules dites du quorum sensing. D’autre part, la contamination du milieu oral est contrôlée par de nombreuses protéines sécrétées par les glandes salivaires, mais leur utilisation en hygiène est peu documentée. Le but de ce travail est d’étudier l’effet anti-biofilm de molécules du quorum sensing et de protéines exocrines, le lysozyme et la lactoperoxydase, dans la perspective de réduire la colonisation des surfaces de prothèses dentaires par des levures du genre Candida et par conséquent de prévenir une stomatite prothétique. A cette fin, des biofilms à Candida ont été produits dans des plaques multi-puits à fond plat en polystyrène et quantifiés par coloration au cristal violet. L’effet de deux molécules du quorum sensing - tyrosol et farnésol - sur la formation des biofilms à Candida a été investigué in vitro sur la souche de référence ATCC 10231 et sur des souches cliniques isolées à partir de prothèses dentaires. Le tyrosol et le farnésol à hautes concentrations (> 6 mM et > 1 mM respectivement) entraînent une limitation de la formation de biofilms sans altérer la croissance fongique tandis que des concentrations plus faibles (~ 1 mM et ~ 1 µM respectivement) favorisent la formation de biofilms. Le lysozyme présente aussi un effet dépendant de la dose sur la formation de biofilms par Candida: promoteur de la formation de biofilms à une concentration de 1000 µg/ml et inhibiteur de la formation de biofilms à des concentrations plus faibles (3 et 10 µg/ml). Les composés hypohalogéneux (> 500 µM) produits par un système peroxydase limitent la croissance des levures et par conséquent leur capacité à former des biofilms in vitro. Un seul trempage ex vivo de prothèses amovibles pendant 5 minutes dans une solution d’ions hypohalogéneux (2000 µM) entraîne une diminution d’au moins 1 unité logarithmique du nombre de Candida dans 58,3 % des cas (N = 23) alors qu’un trempage dans de l’eau n’a aucun effet sur la colonisation de la prothèse :cet effet est statistiquement significatif (Chi carré, p = 0,0006, test de Fisher, p = 0,0009).
Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)
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L’avènement de la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a révolutionné la microbiologie en permettant l’identification précise des bactéries et des levures en seulement quelques minutes. En 2010, la MALDI-TOF SM n’était pas applicable à l’identification des champignons filamenteux. Un protocole d’identification générant des spectres interprétables de champignons filamenteux fut d’abord mis au point, suivi par le développement d’une architecture de banque originale. Enfin une banque de références solides, intégrant des références pour la majorité des espèces de moisissures impliquées en pathologie humaine, fut créée en collaboration avec le BCCM/IHEM. Les qualités d’identification de cette banque ont été démontrées non seulement à l’échelle localemais également à l’échelle nationale . Dans un second temps, nous sommes intéressés à l’identification des levures. Nous avons déterminé qu’une extraction complète est le meilleur protocole d’identification des levures en utilisant la banque de référence Bruker ™. Afin d’améliorer le diagnostic clinique,nous avons testé un protocole d’identification sur un séries de 6192 levures isolées de prélèvements cliniques reçus au laboratoire pendant un an. Enfin nous avons pu démontrer en utilisant nos « systèmes » d’identification par MALDI-TOF MS la sous-estimation de la diversité des espèces de moisissures et de levures isolées des prélèvements cliniques, lorsqu’on ne disposait que de techniques conventionnelles d’identification. La mise à disposition d’un tel outil ouvre de grandes perspectives dans le domaine de la mycologie, tant d’un point de vue épidémiologique que clinique
During the last decade, MALDI-TOF MS has revolutionized microbiology by enabling the accurate identification of bacteria and yeast in only few minutes1. At the beginning of this work in 2010, MALDI-TOF MS was not yet optimized for mold identification. To meet this need, we established an identification protocol to generate interpretable mold spectra. The structure of the reference database was developed taking intoaccount the heterogeneity of molds in culture. Finally, a comprehensive reference database,including references for the majority of molds encountered in human pathology, was created in collaboration with the BCCM/IHEM. Identification performance of this database was tested and validated at both a local scale and an international scale . We also determined the best-adapted pre-treatment protocol to identify yeasts in a routine setting. The protocol was tested on a panel of 6192 yeast isolates recovered from clinical samples submitted to our laboratory over the course of one year. Using our fungal identification system, we were able to identify morphologically similar species and highlight the underestimation of fungal pathogen diversity. The development of our MALDI-TOF MS-based fungal identification system presents numerous opportunities in the field of mycological, from both an epidemiological and clinical point of view. In subsequent studies, defining the clinical meaning of emerging species identified via MALDI-TOF MS will profoundly modify our perspective of fungal diseases

Parmi les espèces de levures du clade CTG, certaines sont responsables de candidoses tandis que d’autres présentent des potentiels en biotechnologie. Depuis quelques années, nous assistons à une intensification des recherches sur ces levures. Cependant, leur code génétique particulier a ralenti la mise au point d’outils génétiques pour la plupart d’entre elles. Cette thèse vise à développer des outils moléculaires standardisés pour un grand nombre d’espèces de levures du clade CTG. Nous avons d’abord conçu des vecteurs d’expression adaptés à l’espèce M. guilliermondii. Par la suite, nous avons caractérisé le gène de résistance à l’acide mycophénolique IMH3.2 afin de l’utiliser comme marqueur de sélection lors de la transgénèse d’espèces du clade CTG. Enfin, nous avons mis au point une série de vecteurs permettant la manipulation génétique de ces espèces. Ce travail a conduit à la conception d’une large gamme d’outils utilisable dans un grand nombre de ces levures, pré-requis essentiel aux futurs recherches en mycologie médicale et au développement de stratégies de biologie synthétique
The fungal CTG clade includes well-known yeasts of clinical importance and/or biotechnological potential. Thus, albeit being intensively studied over the last 30 years, their uncommon genetic code precludes the use of the widely available markers and reporter systems for genetic approaches in these microorganisms. We provide here a toolbox to genetically manipulate a wide range of CTG clade species. Firstly, we developed a new series of versatile controllable expression vectors for M. guilliermondii. After, we characterized MPA-resistant gene IMH3.2 et used it as a drug resistance marker in several yeast species. Finaly, we provide a molecular toolbox suitable to genetically manipulate a broad range of prominent species from the CTG clade. This versatile toolkit represents a new starting point for successful developments of research in medical mycology in the CTG clade but also will expedite synthetic biology strategies in these microorganisms for biotechnological applications

Le but de ce travail a été de mieux comprendre les défenses mises en œuvre par l’hôte infecté par le champignon opportuniste humain Aspergillus fumigatus (Af). 1) Un modèle d’infection a été redéveloppé chez l’organisme modèle Drosophila melanogaster. Seules les mouches mutantes pour le gène MyD88 de la voie immunitaire Toll succombent à l’injection d’une poignée de conidies, sans toutefois qu’Af dissémine dans l’hôte. Ce travail a révélé que ce n’est pas la réponse immunitaire qui joue un rôle prépondérant dans la défense de l’hôte, mais sa capacité de résilience à l’exposition à des mycotoxines sécrétées par Af. 2) Un crible génétique d’envergure a été établi pour identifier des lignées transgéniques mutantes ARNi sensibles à l’infection par Af. 6.471 lignées ont été criblées et 241 gènes-candidats identifiés, dont peu fonctionnent dans la réponse immunitaire. Ainsi, ce travail a contribué à identifier de nombreux gènes impliqués dans la résilience de l’hôte à Af et ses mycotoxines
The overarching goal of this work is to better understand host defenses against the human opportunistic fungus Aspergillus fumigatus (Af). 1) An infection model has been reestablished in the genetic model organism Drosophila melanogaster. Only flies mutant for the immune response Toll pathway gene MyD88 succumb to the injection of a handful of conidia even though Af is unable to disseminate throughout its host. This work revealed that it is not the immune response that plays a cardinal role in host defense but its resilience capacity to the exposure to some mycotoxins secreted by Af. 2) A large-scale genetic screen has been implemented to identify transgenic RNAi mutant lines susceptible to Af infection in survival experiments. 6,471 lines have been screened and 241 candidate genes identified, few of which are known to act in the immune response. Thus, this work has contributed to identifying numerous genes involved in host resilience to Af and to some of its mycotoxins

Nas últimas décadas, houve aumento progressivo das infecções hospitalares por leveduras principalmente, do gênero Candida. A fonte de infecção pode ser endógena ou exógena, desde que esporos unicelulares de leveduras, permanecem viáveis por meses sobre superfícies bióticas ou abióticas. Diversas espécies de leveduras são encontradas em pele e mucosas de indivíduos sadios. Em estado saprofítico ainda, as leveduras encontram-se no trato gastrintestinal humano mas, a relação entre a presença desses microorganismos e sua patogenicidade está associada a diversos fatores predisponentes, tais como: número e variedade de sítios topográficos colonizados, uso prolongado de antibióticos, infecções associadas causadas por outros microorganismos e particularmente, distúrbios imunológicos ou metabólicos. Leveduras do trato gastrintestinal podem ser transmitidas, via fecal-oral diretamente ou de modo indireto, de indivíduo para indivíduo. A transmissão de uma cepa em estado saprofítico para um hospedeiro suscetível, pode resultar em colonização seguida de infecção. A gravidade do quadro clínico depende de condições do hospedeiro e características do agente etiológico que engloba fatores de virulência e resistência a antifúngicos. Esses atributos são importantes em Candida albicans na qual, enzimas com atividade de fosfolipase e proteinase são marcadores de virulência. De outro modo, fenótipos de resistência, ocorrem, com maior freqüência, em espécies não-Candida albicans. Dada a possibilidade de instalação de doença endógena e a dispersão de cepas virulentas e resistentes, a partir de colonização gastrintestinal, estudos que contribuam para a determinação desses agentes constituintes da microbiota de pacientes internados, são importantes para o conhecimento da história natural das infecções nosocomiais por leveduras. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o trato intestinal como fonte potencial de infecção hospitalar por leveduras, descrevendo as espécies prevalentes nas primeiras horas de internação e possíveis alterações temporais, quanto a fenótipo de virulência e resistência a antifúngicos. Foram analisadas 281 amostras de leveduras isoladas de 66 crianças internadas em unidades de pediatria e semi-intensiva de hospitais públicos das cidades de São Paulo e Guarulhos, Brasil. As amostras foram isoladas de fezes coletadas nas primeiras horas de internação e durante o período de internação. A identificação das leveduras quanto a gênero e espécie foram realizadas por métodos tradicionais, analisando aspectos morfológicos e fisiológicos. A capacidade de produção de enzimas, fosfolipase e proteinase, foram verificadas conforme proposto por Price et al. 1982 e Ruchël et al., 1982. A sensibilidade aos antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FZ), itraconazol (IZ), cetoconazol (CZ) e nistatina (NIS) foram analisada pela técnica de difusão por discos (CECON São Paulo, Brasil). Amostras resistentes ou com sensibilidade intermediária, foram re-avaliadas pelo método de microdiluição segundo NCCL (1997) modificado por EUCAST (2002). As espécies isoladas foram: Candida tropicalis (32,7%), C.albicans (29,9%), C.parapsilosis (27, 1%), Trichosporon cutaneum e T.inkin (3,2%), Rhodotorula mucilaginosa e R.glutinis (0,7%), C.krusei (3,6%), C.guilliermondii (2,1%), C.glabrata (0,4%) e C.kefyr (0,4%). A atividade enzimática foi observada na maioria das 84 amostras de C. albicans, sendo 96% de fosfolipase e 95% de proteinase. Entre as espécies não-albicans do gênero Candida foi verificada atividade em 97% de fosfolipase e 67% de proteinase. Amostras menos sensíveis às drogas azólicas, ou seja, amostras resistentes ou com sensibilidade dependente da dose, foram encontradas em 4,3% das 281 amostras de leveduras, sendo maior porcentagem observada em C.krusei (90%). Conclui-se que existem leveduras de diversas espécies em fezes de população pediátrica hospitalizada, com fenótipos de virulência e resistência a antifúngicos. A manutenção desses fenótipos durante o período de internação pode representar fator de risco para infecção hospitalar endógena, ou ainda, fonte de dispersão de patógenos em potencial, no meio ambiente hospitalar.
At the last decades the nosocomial infections caused by yeasts raised significantly especially by Candida yeasts. The infections source can be endogen or exogenous, since spores of unicellular and multicellular are kept viable for months and several yeasts species are found in skin and mucosa of healthy people. In a saprophytic state yeasts are found in the human gastrointestinal tract but the relationship between the presence of these microorganisms and their pathology is associated with several facts such as: number, variety of sites colonized, effective use of antibiotics, associated infections caused by another microorganisms and mainly disturbance in due to lack of immunity and metabolic. Yeasts in the gastrointestinal tract can be transmitted fecal-oral direct or indirectly from an individual to another. The transmission of a strain in a saprophytic state to a host can result in colony followed by infection. The infection can be serious depending on the host conditions and the etiologic agent that includes virulent factor and resistance to antifungal drugs. These attributes are important to Candida albicans in which enzymes with phospholipase activity are responsible for virulent factors. Resistance phenotypes, otherwise it should occur more frequently in non-albicans species. Concerning the possibility of an endogen disease and the spread of virulent and resistant strains, from the gastrointestinal colony, studies that contribute to determine these agents that constitute the microbiota of patients, are important to know the natural story of nosocomial infections caused by yeasts. This work aims at evaluating the intestinal tract as a source of hospital infections by yeasts describing the remaining species in the first hours and a possible change depending on the time that may happen to virulent phenotypic and resistance to ant fungi. Two hundred eighty one yeast samples from sixty-six children attended in pediatric and semi-intensive units in 2 public hospitals located in São Paulo and Guarulhos cities in Brazil were analyzed. The fecal samples were collected at the first hours after and during their arrival at the hospital. To identify the yeasts according to their gender and species traditional methods were used, analyzing morphological and physiological aspects. The ability to produce enzymes phospholipase and proteinase was verified the same way it was proposed by Price et al. 1982 and Ruchel et al. 1982. The sensibility to antifungals: amphotericin B (AMB), f1uconazole (FZ), ketoconazole (CZ) e nistatin (NIS), was analyzed by the diffusion technical by disks (CECON São Paulo, Brazil). Resistant samples or with intermediate sensibility were confirmed by micro-dilution method according to NCCLS (1997) modified by EUCAST (2002). The isolated species were: Candida tropicalis (30%), C.parapsilosis (27%), C.krusei (4%), Trichosporon cutaneum e T.inkin (3%), Rhodotorula mucilaginosa e R.glutinis (2%), C.guilliermondii (2%), C.glabrata (1%) and C.kefyr (1%). Enzymatic activity was verified in most of the 84 C.albicans samples being 96% of phosfolipase and 95% of proteinase production. Among the non-albicans species of Candida it was observed 97% of phospholipase and 67% of proteinase activity. Less sensitive samples to azoic drugs including resistant or SDD sensibility, which depends on the achieved dose, were found in 4.3% of the 281 samples of yeast. The hugest percentage was observed in C.krusei (90%). We can conclude that different yeast species occur in stools of pediatric population hospitalized, including virulent strains and antifungal resistant phenotypes. The persistent of these phenotypes in the intestinal tract during hospitalization period may represents a risk facto r contributing to endogen infection, or play a role in dissemination of potential pathogens inside a nosocomial environment.

Criptococose é uma doença causada pelo fungo C. neoformans que têm grande importância atualmente, devido ao aumento da população imunocomprometida,. Além disso, existem poucas opções terapêuticas contra micoses profundas. Neste trabalho foi avaliado se a via de biossíntese do triptofano seria um bom alvo para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Com o uso da tecnologia de RNA de interferência, concluiu-se que esta via de síntese é essencial para a sobrevivência desta levedura, sendo, portanto, um ótimo alvo. Ainda neste estudo, demonstrou-se que a letalidade decorre da baixa captação de triptofano pelas permeases de aminoácidos, as quais sofrem repressão catabólica pela fonte de nitrogênio e efeito negativo da temperatura. Foram testados dois inibidores específicos que atuam sobre a antranilato sintase e a triptofano sintase, duas enzimas cruciais para a conversão do corismato em triptofano. Ambos compostos causaram inibição do crescimento de C. neoformans e C. gattii.
Cryptococcosis is a disease caused by C. neoformans, currently of great importance due to the increase in immunocompromised population. Furthermore, there are few therapeutic options for treating this disease. This study evaluated the tryptophan biosynthetic pathway as a possible target for the antifungal development. By using RNA interference technology we concluded that this metabolic pathway is essential for the survival of this yeast, and, therefore, it is a good target. In the same study, it was demonstrated that lethality results from the low uptake of the tryptophan amino acid by permeases, which undergo nitrogen catabolite repression and negative effect of temperature. Two specific inhibitors acting on the anthranilate synthase and tryptophan synthase, two key enzymes for the conversion of chorismate into tryptophan were tested. Both compounds caused growth inhibition of C. neoformans and C. gattii.

Os objetivos deste estudo foram: re-identificar 70 isolados de Candida em micoteca por método tradicional e API 20C; identificar a presença de C. dubliniensis; determinar e comparar as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) das amostras, frente a sete antifúngicos (E-test); caracterizar molecularmente as amostras seqüenciais de Candida pela técnica de PFGE; estudar e comparar o perfil genotípico de isolados de C. albicans e C. parapsilosis, através da análise de marcadores microsatélites e cariotipagem. O nível de concordância entre o método tradicional e o API 20C foi de 93%. Nenhum isolado de C. dubliniensis foi identificado no estudo. Em relação à sensibilidade antifúngica, a maioria das amostras apresentou alta porcentagem de sensibilidade às sete drogas testadas. A análise molecular pela técnica de PFGE, mostrou seis perfis de cariótipos diferentes em 24 amostras seqüenciais. Em relação à comparação das técnicas de PFGE e microssatélites, observamos que a última mostrou maior poder discriminatório para as amostras de estudadas.
This study was aimed to: identify the 70 isolates of Candida in a culture collection by the traditional method and by API 20C; identify the presence of C. dubliniensis; determine and compare the minimum inhibitory concentrations (MICs) of these samples in regard to the seven drugs (E-test); molecularly characterize sequential samples from the same patient by the PFGE technique; study the genotypic profile of all the isolates of C. albicans and C. parapsilosis by means of the microsatellite technique and compare the results with those obtained by the PFGE technique. The level of agreement between the traditional method and the API 20C was 93%. No isolate of C. dubliniensis was identified in the study. In relation to antifungal susceptibility, most of the samples presented a high percentage of susceptibility to the seven drugs tested. The molecular analysis by the PFGE technique revealed six different karyotype profiles among 24 sequential samples. In the comparison between the PFGE and microsatellite, the latter showed a greater discriminatory power for samples.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas.
Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here.
FAPESP: 2008/55975-8
TEDE

A cromoblastomicose é uma infecção fúngica subcutânea causada por fungos da família Dematiceae sendo o principal agente etiológico o fungo Fonsecaea pedrosoi (F. pedrosoi). Estes fungos induzem uma lesão crônica na pele de freqüente recidivas. O objetivo do trabalho foi avaliar alguns aspectos imunológicos na cromoblastomicose experimental através de dois modelos de infecção pelas vias: intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.). No primeiro modelo de infecção pela via s.c. em camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi, ocorreu a cura espontânea da infecção em aproximadamente 4 semanas. Na subtipagem de linfócitos T em linfonodos regionais ocorreu um predomínio de células T CD4+ que foi constante até a 4ª semana de infecção, no entanto, observamos aumento significativo de linfócitos T CD8+ ao longo da infecção sugerindo que essa população tenha também uma importante participação no controle da doença. Os ensaios de linfoproliferação demonstraram, na 1ª semana de infecção, elevado índice de proliferação celular quando as células de linfonodos foram estimuladas in vitro com antígenos de F. pedrosoi, além da liberação principalmente da citocina IFN-γ, já na 4ª semana de infecção não foi detectado proliferação celular. Esses resultados sugerem que no início da infecção a resposta celular seja mediada principalmente por linfócitos T CD4+ produtores de IFN-γ, o que nos sugere, que neste modelo experimental, polarize uma resposta de células T do tipo Th1. No segundo modelo de infecção, via intraperitoneal (i.p.), camundongos BALB/c infectados com 106 conídios de F. pedrosoi mostraram desenvolvimento de infecção crônica com preservação da imunidade celular mesmo após a 8ª semana. Ainda pela via i.p., os camundongos C57BL/6 nocautes de T CD4+ apresentaram uma maior carga fúngica no início da infecção e em tempos mais tardios a carga fúngica foi semelhante aos camundongos controles (C57BL/6); esses mesmos animais nocautes não apresentaram uma ativação da resposta celular medida pelo teste de HTT (Hipersensibilidade do Tipo Tardio). Quando avaliamos o padrão de citocinas, a citocina IFN-γ produzida pelos órgãos baço e fígado apresentou menores níveis no início da infecção quando comparado ao camundongos controle. Já os níveis de IL-10 aumentaram gradativamente ao longo da infecção e IL-4 não apresentou diferenças em relação ao controle. Nos camundongos nocautes para coa (C57BL/6 CD8 \"KO\"), a carga fúngica, os níveis de citocinas e o teste de HTT foram semelhantes aos animais controle. Esses resultados mostraram que pela via i.p. os linfócitos T, principalmente células T CD4+ são importantes no controle inicial da infecção. Em tempos mais tardios a infecção foi controlada mesmo em camundongos deficientes de linfócitos TCD 4+ ou T CD8+, sugerido que outras células como macrófagos ou NK, estariam atuando de forma mais efetiva no controle da infecção.
Abstract not available.

A resposta imune adaptativa do tipo Th1 é necessária para proteção contra P. Brasiliensis. Sabendo que células dendrítica são APCs eficientes na ativação da resposta imune mediada por células, investigamos o potencial dessas células em iniciar a resposta imune inata em camundongos suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J) a PCM. Inicialmente, observamos que células dendríticas pulmonares de camundongos B10.A são mais fagocíticas quando comparadas com células de camundongos A/J. Além disso, observamos que a fagocitose na presença de laminarina foi inibida somente em células dendríticas pulmonares de animais B10.A. A produção de citocinas por células dendríticas pulmonares de camundongos A/J mostrou baixa concentração de IL-10, IL-12 e TNF-α. Ao contrário, células dendríticas pulmonares de camundongos B10.A produziram altas concentrações de TNF-α e IL-10, mas, a produção de IL-10 foi significativamente inibida na presença de laminarina. Nós também observamos que células dendríticas pulmonares de camundongos TLR-2KO foram deficientes na produção de IL-10. Além disso, a expressão gênica para TLR-2 aumentou após infecção em camundongos B10.A, mas não nos A/J. Posteriormente, observamos que a capacidade de células dendríticas pulmonares de camundongos suscetíveis em induzir ativação de células T foi diminuída. De acordo com nossos resultados, sugerimos que P. brasiliensis induz células dendríticas regulatórias em camundongos suscetíveis, os quais promovem a produção de IL-10, contribuindo para a suscetibilidade de camundongos B10.A contra a infecção por P. brasiliensis.
An adaptive Th1-type immune response is required for protection against P.brasiliensis. Knowing that DC are the most effective APCs for inducing cellmediated immune responses, it is thus important to investigate lung DC and their potential to initiate an immune response in mice susceptible and resistant to PCM. Initially, we observed that lung DC from susceptible mice were more phagocytic than cells from resistant mice and we observed that phagocytosis in the presence of laminarin was inhibited only in DC from susceptible mice. Cytokines produced by DC from resistant mice showed a low concentration of IL-10, IL-12 and TNF-α. In contrast, DC from susceptible mice produced a high concentration of TNF-α and IL-10, but IL-10 production was significantly inhibited in the presence of laminarin. We also observed that DC from TLR-2KO mice presented a defective production of IL-10. We found that the gene expression for TLR2 is increased after infection in B10.A, but not in A/J mice. Thus, the capacity of lung DC from susceptible mice in inducing T cell activation was decreased. In conclusion, our data suggest that P.brasiliensis induces regulatory DC in susceptible mice, which promotes IL-10 production contributing to the susceptibility of B10.A mice against P.brasiliensis infection.