Academic literature on the topic 'Myopathie pseudo-hypertrophique de Duchenne – Thérapeutique'

La plupart des cas de Dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) sont causés par des mutations dans le gène de la dystrophine qui interrompent le cadre de lecture de l'ARNm. Dans certains cas, l'exclusion artificielle d'un exon permet de restaurer ce cadre de lecture, donnant naissance à une dystrophine plus courte, mais tout de même fonctionnelle. L'objectif de ce travail a été de produire in situ à partir de vecteurs viraux, des molécules d'ARN ciblant les sites spécifiques d'épissage du gène de la dystrophine, pour induire le saut des exons associés à la maladie pendant l'épissage du pré-ARNm. Pour cela, nous avons choisi d'utiliser le petit ARN nucléaire U7 (U7snRNA) comme « navette » et avons dans un premier temps construit un vecteur AAV spécifique du gène de la dystrophine murine, permettant un saut très efficace de l'exon ciblé. Ce saut d'exon induit ainsi une restauration massive et stable de dystrophine, associée à une amélioration significative du phénotype dystrophique chez la souris. En parallèle de ces travaux sur le modèle murin mdx, nous avons développé cette approche sur le modèle canin GRMD de la dystrophie musculaire de Duchenne, et mis en évidence l'efficacité du saut d'exons multiples permettant une restauration importante de dystrophine. Ces résultats très prometteurs obtenus chez la souris mdx et chez le chien GRMD, nous ont conduit à appliquer cette stratégie sur le gène humain de la dystrophine et en particulier sur l'exon 51 pour lequel nous avons pu mettre en évidence un saut d'exon très efficace. L'ensemble de ces résultats indique l'efficacité de l'approche du saut d'exon médiée par U7snRNA, qui pourrait concerner près de 80% des patients DMD
Most cases of Duchenne muscular dystrophy (DMD) are caused by dystrophin gene mutations that disrupt the mRNA reading frame. In some cases, forced exclusion of a single exon can restore the reading frame, given rise to a shorter, but still functional dystrophin protein. Our objective in this work was to produce antisense sequences targeting splice junctions of dystrophin gene to induce removal of disease-associated exons during pre-mRNA processing. To achieve this exon-skipping, we proposed to use the U7 small nuclear RNA as carrier and we first developed AAV vectors harboring chimeric U7snRNA carrying antisense sequences able to promote skipping of exon 23 of the murine dystrophine gene. After intramuscular or intra-arterial injection in mdx mice, we detected efficient skipping of the exon 23 and a long term rescue of dystrophin expression. We next evaluated this strategy in the canine GRMD model and showed the possibility to skip several exons, leading to a very large restoration of dystrophin in injected muscles. These promising results obtained on the mouse and canine models led us to develop the strategy on the human dystrophin gene and especially on the exon 51. We confirmed the skipping of the exon 51 both in vitro in patient myoblasts after transduction with the lentiviral vector and in vivo after intramuscular injection of an AAV-U7ex51 vector in the transgenic hDMD mouse. This study provides evidence on the efficiency of the U7snRNA mediated exon skipping strategy for Duchenne muscular dystrophy, that could concern more than 80% of patients and offers very promising tools for clinical treatment of DMD

La myopathie de Duchenne (DMD) est une maladie pédiatrique incurable causée par l’absence ou l’expression fortement réduite de la dystrophine. La DMD touche un garçon sur 3500-5000 et cause leur décès par arrêt cardio-respiratoire, le plus souvent à la troisième ou quatrième décennie de leur vie. Les myofibres du muscle dystrophique subissent des cycles successifs de dégénérescence et régénérescence, jusqu’à l’épuisement du potentiel régénératif. Les tissus musculaires sont remplacés par des tissus fibrotiques et adipeux. Actuellement, aucune solution médicale satisfaisante n’existe pour traiter la DMD. Le traitement de routine consiste en une administration de glucocorticoïdes. Les futures thérapies développées incluent, en particulier, le transfert de gène et le saut d’exon. Cependant, les résultats des essais cliniques ces dernières années ont indiqué que la restauration de l’expression de la dystrophine n’est pas probablement pas suffisante. L’une des hypothèses est que la restauration de l’expression de la dystrophine ne suffit pas à inverser une pathologie dystrophique à un stade avancé. De ce fait, il est nécessaire d’étudier les mécanismes, l’impact et la réversibilité de pathologies secondaires. Dans ce contexte, la première partie de ma thèse a consisté à sélectionner un miRNA dérégulé d’un intérêt particulier, impliqué dans une pathologie secondaire de la DMD. Des travaux préliminaires de mon groupe de recherche (avant mon arrivée) ont identifié un grand nombre de miRNAs dérégulés dans la DMD. Dans la première partie de ma thèse, j’ai quantifié certain de ces miRNAs dans des biopsies musculaires du modèle GRMD (model canin de la DMD) et sélectionné miR-379, un miRNA normalisé par les glucocorticoïdes selon nos données préliminaires. J’ai ensuite identifié et validé EIF4G2 comme cible directe de miR-379. EIF4G2 est un facteur de traduction impliqué dans le contrôle cellulaire de l’apoptose, de la différenciation et de l’activité mitochondriale. J’ai ensuite identifié une cible traductionnelle d’EIF4G2, nommée ici ProtX, une protéine connue pour être impliquée dans l’activité mitochondriale. Pour des raisons de confidentialité et de brevetabilité, l’identité exacte de cette protéine ne peut pas être révélée dans ce résumé. J’ai ensuite démontré dans des myoblastes humains et des cellules iPS que miR-379, EIF4G2 et ProtX sont impliqués dans la régulation de l’activité mitochondriale et le contrôle de l’engagement cellulaire (des cellules iPS) et la différenciation myogénique. Il est intéressant de noter que ProtX a été envisagé précédemment comme un modifier potentiel dans la DMD. Je présente dans cette thèse une voie de signalisation qui pourrait expliquer l’action des glucocorticoïdes sur les dysfonctionnements mitochondriaux chez les patients DMD. L’un des futurs objectifs de mon groupe de recherche est l’évaluation dans des modèles de la DMD du potentiel thérapeutique de la surexpression de ProtX
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a paediatric muscle disease that affects one in 3500-5000 boys and causes death by cardio-respiratory failure, most often at the third or fourth decade of life. DMD is caused by the lack or the drastically reduced expression of dystrophin. The myofibers in the dystrophic muscle undergo successive cycles of degeneration and regeneration, until exhaustion of the regenerative potential. The degenerated contractile tissues are replaced by fatty fibrotic tissue. At present, there is no satisfactory medical solution for the DMD disease. Routine treatment is of glucocorticoid drugs. Therapeutic development effort is focused in particular on gene replacement and exon skipping technologies. However, disappointing results from recent years’ clinical trials employing these experimental therapies indicated that restored dystrophin expression might not be enough. One hypothesis is that the restoration of dystrophin expression is not enough for the reversion of an advanced-stage dystrophic pathology. Accordingly, in order to propose complementary therapeutic solutions, it is necessary to investigate the mechanisms, impact and reversion of secondary pathologies. In this context, the first part of my thesis comprised a screening for miRNAs that might be involved in DMD secondary pathology. Early work in our research group (before my arrival) identified a large number of dysregulated miRNAs in DMD. Thus, I profiled some of these miRNAs in muscle biopsies of the GRMD (a dog model for DMD), and selected for further investigations miR-379, which is, according our previous data in the group, glucocorticoid responsive in DMD. I then identified and validated the EIF4G2 gene as a direct target of miR-379. EIF4G2 is a translation factor that is involved in the control of apoptosis differentiation, and mitochondrial activities. I then identified a translational target of EIF4G2, named here ProtX, known to be involved in mitochondrial activity. For confidentiality reasons, the exact identity of this protein cannot be disclosed yet. In a set of experiments in human myoblast and iPS cells, I then demonstrated that miR-379, EIF4G2 and ProtX are involved in the tuning of mitochondrial activity and in the control of cellular engagement (of IPS cells) and myogenic differentiation. Interestingly, ProtX has been suggested in the past as a potential modifier in the DMD disease. Taken together, I am presenting here a signalling pathway that might link the glucocorticoid response to mitochondrial dysfunction in DMD patients. A future goal of our research group is the evaluation of the therapeutic potential thus signalling pathway in the DMD disease in animal model experimentation

La myopathie de Duchenne est une affection musculaire létale de l'enfant causée par le déficit d'une protéine, la dystrophine. Parmi les modèles animaux spontanés, le chien dystrophique est considéré comme la meilleure " phénocopie " de la maladie humaine et se place comme un modèle " préclinique " incontournable dans l'évaluation de stratégies thérapeutiques. Le but de ce travail fut de tester, chez le chien dystrophique, l'intérêt clinique de deux voies thérapeutiques prometteuses élaborées dans le modèle murin. A. Surexpression d'utrophine par la voie du monoxyde d'azote. Une faible mais significative surexpression d'utrophine a pu être montrée dans le muscle des chiens sains traités par la L-arginine ou la molsidomine mais non dans le muscle dystrophique du fait d'une très forte surexpression spontanée préexistante. L'analyse de paramètres cliniques, biochimiques et histologiques n' a pas permis de déceler de bénéfice biologique. Cette piste métabolique demeure prometteuse mais l'étude réalisée sur le chien GRMD justifie le développement préalable à toute application thérapeutique de molécules produisant une surexpression particulièrement élevée d'utrophine. B. Thérapie cellulaire et greffe de moelle osseuse. Nous avons démontré les potentialités myogéniques des cellules souches lors de greffe de moelle osseuse chez le chien dystrophique mais n'avons pu mettre en évidence de bénéfice clinique. Cette étude confirme le caractère prometteur de la greffe de cellules souches mais le faible nombre de fibres dystrophine positives observées au sein du muscle interdit toute application thérapeutique immédiate. Il est donc nécessaire de trouver un moyen de mobiliser ces cellules et de les attirer au sein du muscle pour atteindre un seuil thérapeutique
Duchenne Muscular Dystrophy is a lethal X-linked childhood myopathy caused by mutations that abolish the expression of dystrophin in muscle. Among natural models of DMD, the canine model offers the best phenocopy for human disease, and is considered a high benchmark for preclinical studies. In this work, dystrophic dogs were used to evaluate the clinical relevance of two promising systemic therapeutical strategy elaborated in the murine model. A. Utrophin overexpression and the NO way. If we observed a slight but significant utrophin overexpression in the muscle of normal control dog treated by L-arginin or Molsidomin, we couldn't discriminate the same modification in GRMD muscle as it exhibits spontaneous strong utrophin overexpression. Using a combination of clinical, biochemical, and histological evaluation, we couldn't neither demonstrate a therapeutic benefit. In conclusion, the NO way to induce utrophin overexpression remains pertinent but very efficient molecules need to be developed as a very high utrophin amount seems a prerequisite to obtain therapeutic benefit. B. Cell therapy and bone marrow transplantation. The myogenic participation of stem cells was evaluated in normal bone marrow engrafted dystrophic dogs. Although clinical investigations showed no obvious improvement of the dystrophic phenotype, significant increased of dystrophin positive fibers (DPF) number in dystrophic muscles were detected. This study confirmed the promising potential of stem cell transplantation, however the low level of DPF observed limit their therapeutic relevance and impose further studies to mobilize these cells out of the bone marrow compartment and attract them into the damaged muscle

La Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie létale récessive liée à l’X, causée par des mutations dans le gène de la dystrophine, sans aucun traitement efficace disponible. Le développement de thérapies efficaces nécessite l'utilisation de modèles animaux dystrophiques et immunotolérants pour les cellules humaines. En collaboration avec James Di Santo à l'Institut Pasteur, une nouvelle souche mutante de souris a été créée: le modèle Rag2−Il2rb−Dmd−. Ce nouveau mutant ne présente plus de cellules T et B, ni de cellules NK. Il porte également une mutation dans le gène de la dystrophine. Cette étude porte sur la caractérisation morphologique et immunohistochimique du phénotype musculaire de cette nouvelle souris mutante, sa comparaison avec le modèle murin DMD le plus utilisé (mdx) et son utilisation potentielle pour évaluer le potentiel régénératif de progéniteurs myogéniques humains. Les résultats obtenus dans cette thèse ont montré que le phénotype dystrophique est similaire entre les deux modèles. L’analyse de la régénération musculaire a donné des résultats très prometteurs. La souris Rag2−Il2rb−Dmd− montre un pic de régénération spontanée entre 10 et 16 semaines, ce qui fait 6 semaines de régénération intense. Les données obtenues après transplantation de myoblastes humaines ont confirmé que le nouveau modèle est très bien adapté à la greffe des cellules myogéniques, qui participent de façon efficace à la régénération musculaire. Cet aspect est très important car il permet d’étudier le comportement de cellules souches humaines à potentiel myogénique dans un contexte dystrophique naturel
The Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a lethal recessive X-linked disease caused by mutations in the dystrophin gene, no effective treatment is available up to date. The development of effective therapies requires the use of animal models both dystrophic and immunotolerant for human cells. In collaboration with James Di Santo at the Pasteur Institute, a new mutant strain of mice was created: the Rag2−Il2rb−Dmd−. This mutant lacks T and B cells, as well as NK cells. It also harbours a mutation in the dystrophin gene. This study focuses on the morphological and immunohistochemical characterization of the muscle phenotype of the new mutant mouse, its comparison with the most used DMD model (mdx) and its potential use to evaluate the regenerative potential of human myogenic progenitors. The results obtained in this thesis have shown that the dystrophic phenotype is similar between the two models. Analysis of muscle regeneration has yielded very promising results. The Rag2−Il2rb−Dmd− mouse shows a peak of spontaneous regeneration between 10 and 16 weeks, which is six weeks of intense regeneration. Results obtained after transplantation of human myoblasts have confirmed that this new model is very suitable for myogenic cells transplantation, which can effectively participate in muscle regeneration. This is very important because allows to study the behaviour of human myogenic stem cells in natural dystrophic context

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est due à des mutations du gène DMD causant l’absence de protéine dystrophine (Dys). La structure modulaire de la Dys a permis d’envisager une stratégie de saut d’exon thérapeutique pour permettre l’expression d’une Dys tronquée mais fonctionnelle. Tous les exons n’étant pas dispensables, l’équipe a développé une stratégie de trans-épissage thérapeutique (TET) pour réparer la fin des transcrits DMD. Des transcrits réparés ainsi que de la Dys issue du TET ont été détectés in vivo. Une stratégie d’échange d’exon (EE) a aussi été développée, a fait ses preuves in vitro puis a été évaluée in vivo chez des souris wt et mdx par injection de vecteurs AAV exprimant les molécules d’EE. La détection des génomes viraux (GV) a révélé une différence du nombre de GV présents dans les muscles injectés wt vs mdx, nous faisant supputer que les cycles de dégénérescence/régénération caractérisant les muscles dystrophiques pouvaient causer une perte des GV. Nous avons étudié le maintien des GV d’AAV dans 3 modèles DMD : les souris mdx et double KO (DMD-/-UTRN-/-), et le chien GRMD. Une perte des GV a été observée dans ces 3 modèles : à court terme si la dose de vecteur thérapeutique injectée est insuffisante ou si le vecteur n’est pas thérapeutique, et à long terme après injection d’une dose optimale de vecteur thérapeutique. Le TET étant pertinent pour les maladies dominantes, nous avons développé une stratégie de TET pour réparer les transcrits HTT, dont l’expansion de la séquence polyQ de l’exon 1 cause la maladie de Huntington. Des transcrits trans-épissés ont été détectés in vitro de façon reproductible, mais en faible quantité
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by mutations in DMD gene which abolish the synthesis of dystrophin protein (Dys). The modular structure of Dys allowed to imagine a therapeutic exon skipping strategy, in order to express a truncated but functional Dys. As all exons are not dispensable, a therapeutic trans-splicing strategy has been developed in the team to repair the end of DMD transcripts. Repaired transcripts and a small amount of dystrophin resulting from trans-spliced transcripts were detected in vivo. An exon exchange (EE) strategy was also developed, and showed its efficiency in vitro. It was then tested in vivo in wt and mdx mice by injections of AAV vectors encoding exon exchange molecules. The detection of AAV viral genomes (VG) revealed an important difference between VG copy numbers contained in wt vs mdx injected muscles, suggesting that degeneration/regeneration cycles characterising dystrophic muscles could cause a loss of VG. We studied AAV VG persistence in three models of DMD: mdx and double KO (DMD-/-UTRN-/-) mice, and GRMD dog. A loss of VG was observed in the three models: in the short term when the dose of therapeutic vector injected is unsufficient or when the vector is not therapeutic, and in the long term even when an optimal dose of therapeutic vector is injected. As therapeutic trans-splicing is relevant for dominant diseases, we developed a trans-splicing strategy to repair HTT transcripts, in which polyQ sequence expansion in exon 1 leads to Huntington disease. We developed pre-trans-splicing molecules and tested them in vitro: trans-spliced transcripts were detected in a reproducible way, but always in low amounts

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie musculaire récessive liée au chromosome X qui représente la forme la plus fréquente et la plus sévère des dystrophies musculaires. Aujourd'hui, il n'existe pas de traitement curatif de cette maladie d'issue fatale. Une preuve d’efficacité thérapeutique a été établie dans l’UMR pour une population de cellules souches adultes résidentes du muscle, nommées cellules MuStem, dans le modèle gros animal de la maladie, le chien Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD). Dans la présente thèse, une étude comparée du profil d’expression génique du muscle de chiens sains, GRMD et GRMD transplantés ainsi qu’une étude de l’expression de miRNAs nous a permis d’investiguer l’impact moléculaire de la thérapie cellulaire MuStem mais également d’approfondir la physiopathologie du chien GRMD. L’administration systémique de cellules MuStem modifie l’expression de 31 gènes impliqués dans les voies de la régénération, du complexe ubiquitine-protéasome et du métabolisme. Elle permet également de corriger l’expression tissulaire des miR-1, miR-133 et miR-486. Un second volet a visé à approfondir la caractérisation de cellules MuStem désormais isolées chez l’Homme à partir de prélèvements musculaires. De manière intéressante, nous avons décrit que les cellules MuStem humaines expriment les facteurs de pluripotence Klf4, Nanog et Oct3-4. L’étude de ces cellules en conditions oxydative et hypoxique a également démontré leur capacité d’adaptation aux changements environnementaux. L’ensemble de ces résultats nous permet de mieux définir, au sens large, les cellules MuStem qui se présentent comme potentiel produit thérapeutique pour la DMD
Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive muscle disease that represents the most severe and common form of muscular dystrophy. No curative treatment exits to date for this fatal genetic disease. A proof of concept/efficacy has been demonstrated in the Unit for a population of muscleresident stem cells, named MuStem cells, using the large animal model of the disease, the Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD) dog. In the present thesis, a comparative study of the global gene expression profile (transcriptome) of the healthy, GRMD and transplanted GRMD dog muscle as well as a miRNA study allowed us to investigate the molecular impact of MuStem cell therapy and to improve our knowledge of the GRMD dog pathophysiology. Systemic delivery of MuStem cells modifies the expression of 31 genes implicated in regeneration, ubiquitin-proteasome complex and metabolism pathways. It also restores tissue expression of miR-1, miR-133 and miR-486. A second part dealt with the characterization of MuStem cell isolated from human muscle samples. Interestingly, we describe that human MuStem cells express the pluripotency factors Klf4, Nanog and Oct3-4. The study of these cells in oxidative and hypoxic conditions also demonstrated their property of adaptability to environmental changes. All these results allow us to define better MuStem cells that are presented as a potential therapeutic product for DMD

Le gène de la dystrophine dont l'atteinte est responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) code pour un transcrit musculaire de 14 kilobases et pour une famille de transcrits issus de promoteurs et/ou d'épissages alternatifs. Il existe une hétérogénéité des manifestations cliniques associées à la présence de mutations dans le gène de la dystrophine qui incitent à rechercher un ou plusieurs autres gènes non encore caractérisés tout entiers contenus dans une des introns de ce gène, ou intriqués avec lui. Nous avons caractérisé différents transcrits initiés à partir d'un promoteur alternatif localisé dans l'intron 62. Le criblage de banques d' ADNc de foie et de lymphocytes humains ne nous a pas permis de mettre en évidence de nouveaux transcrits alternatifs. Afin d'élargir la recherche à des transcrits totalement distincts de ceux déjà connus, nous avons entrepris d'utiliser la sélection d' ADNc par hybridation sur des chromosomes artificiels de levures (YAC). Nous avons utilisé des fragments de PCR-Alu obtenus à partir d'un YAC couvrant la région génomique correspondant aux exons 1 à 25 de la dystrophine pour sélectionner dans une banque de cœur d'éventuels ADNc issus du locus DMD. Nous avons isolé un clone de 270 bases, dont nous avons localisé l'origine dans l'intron 2 du gène. La deuxième partie de ce travail a été consacrée à une collaboration avec le laboratoire de Michel Perricaudet (Villejuif), portant sur le transfert d'un minigène de dystrophine médié par un vecteur adénoviral dans le muscle de souris mdx. Nous avons démontré l'efficacité de cette approche chez des souris nouveau-nées, en obtenant une expression dans 5 à 60% des fibres musculaires et une correction à long terme (6 mois) des anomalies histologiques observées chez ces mutants dépourvus de dystrophine. Nous avons testé l'effet de la dose injectée, et de l'âge des animaux au moment de l'injection. Ceci a permis de mettre en évidence, en même temps que d'autres équipes, l'existence d'une réaction immunologique chez les animaux lorsqu'ils ne sont pas injectés dans les premiers jours de vie, ainsi qu'une baisse nette du nombre de fibres infectées à partir de l'âge de 25 jours.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie génétique touchant le gène DMD sur le chromosome X, entraînant l'absence d'une protéine du cytosquelette : la dystrophine. Son incidence à la naissance est d’environ un nouveau-né sur 3500 garçons. La dystrophine étant normalement exprimée dans tous les types musculaires, son absence se manifeste par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques, lisses et cardiaque, conduisant au décès du patient vers l'âge de 30 ans par insuffisance cardiaque ou respiratoire.Deux caractéristiques majeures de la DMD sont, d'une part, une concentration calcique cytoplasmique anormalement élevée, liée notamment à une activation excessive des récepteurs à la ryanodine (RyRs) et, d'autre part, un déficit en NAD+ entraînant une altération du métabolisme énergétique. Cette dérégulation majeure de l’homéostasie calcique, couplée au déficit énergétique, conduisent in fine à la mort cellulaire.L'enzyme CD38 est justement un consommateur important de NAD+, afin de produire deux seconds messagers, le NAADP et l'ADPR cyclique, connus pour être des modulateurs positifs des RyRs. Le rôle de CD38 n’étant pas connu dans la DMD, et son activité pouvant être délétère dans cette pathologie, nous avons donc émis l'hypothèse que son inhibition pourrait être bénéfique sur ces deux aspects importants de la pathologie.Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons réalisé plusieurs expériences chez la souris mdx, le modèle murin de la DMD. Tout d’abord, notre étude montre que CD38 est plus exprimée et plus active chez la souris mdx que chez la souris WT, renforçant ainsi l’intérêt de la cibler dans la DMD. Afin de tester le potentiel thérapeutique de notre stratégie, nous avons traités des souris mdx avec un inhibiteur de CD38. Chez les souris traitées, l’endurance est améliorée et la force musculaire restaurée. Afin d’approfondir le rôle de CD38 chez la souris mdx sur le long terme, nous avons ensuite généré un double mutant en croisant des souris mdx avec des souris CD38-/-. Nous avons d'abord évalué l'impact de CD38 sur la consommation de NAD+, en mesurant les taux de NAD+ dans différents muscles : nos résultats montrent un déficit majeur de NAD+ dans tous les tissus de souris mdx, et une restauration à des valeurs normales chez la souris mdx/CD38-/-. Nous observons également une réduction considérable de l'activité calcique spontanée dans les cardiomyocytes de souris mdx/CD38-/-, associée à une normalisation de la sensibilité des RyRs dans ces cellules. Pour étudier les effets fonctionnels de l'inhibition de CD38 dans la DMD, nous avons ensuite évalué des paramètres clés de cette pathologie. Les données obtenues chez la souris mdx/CD38-/- montrent une importante amélioration du phénotype histologique et fonctionnel, avec une réduction de la fibrose musculaire accompagnée de bénéfices importants sur les performances musculaires et respiratoires ainsi qu’un rétablissement total de la fonction cardiaque. Enfin, dans un protocole de stress bêta-adrénergique, la délétion de CD38 chez la souris mdx a également permis de prévenir les dommages histologiques et l'hypertrophie cardiaque induits par l'isoprotérénol, qui simule l'apparition d'une cardiomyopathie chez les patients atteints de DMD.Notre étude montre que CD38, plus active et plus exprimée chez la souris mdx, contribue de manière importante à son phénotype dystrophique. Une réduction de son activité permet de réduire l’excès de Ca2+, de rétablir le niveau de NAD+, et d’obtenir des bénéfices fonctionnels importants chez la souris. Enfin, notre étude sur des myotubes humains issus de patients DMD montre qu’un anticorps anti-CD38 réduit l’excès de Ca2+ libéré, soulignant ainsi que notre stratégie innovante ciblant CD38 pourrait être rapidement disponible pour les patients, grâce au développement d’anticorps thérapeutiques anti-CD38 déjà sur le marché
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common rare disease, affecting about one in 3500 newborn boys in the world. This genetic disease originates from the loss of function of a gene carried by the X chromosome, encoding dystrophin, a protein of the subsarcolemmal cytoskeleton complex. Dystrophin is normally expressed in all muscle types and its absence leads to membrane fragility. The disease is manifested by progressive degeneration of skeletal, smooth and cardiac muscles, which leads to the patient death at about 30 years of age, due to cardiac or respiratory failure.Two major consequences of the absence of dystrophin are a muscular abnormal high cytoplasmic Ca2+ concentration linked to an excessive ryanodine receptors activation, and a deficit in cellular NAD+ levels leading to impaired energetic metabolism. This Ca2+ dysregulation will induce many pathophysiological Ca2+-dependent processes which, coupled with energetic impairment, leads to muscle cells necrosis or apoptosis.Interestingly, the enzyme CD38, is an important NAD+ consumer through its production of two-second messengers, namely NAADP and cyclic ADPR, known to be positive modulators of ryanodine receptors. Actually, CD38 contribution to DMD pathophysiology is not known. We hypothesized that CD38 activity could be deleterious in this pathology, and thus that its inhibition could be beneficial in DMD.We performed experiments in the mdx mouse, which is the main DMD rodent model. The first highlight of our study is that CD38 is actually more expressed and more active in the mdx mouse compared to WT, showing its high potential as therapeutic target in DMD. We then performed as proof of concept pharmacological experiments with a CD38 inhibitor. We found that mdx mice treated displayed endurance (grid time) and strength (grip test) restored to normal values. In order to study the long term role of CD38 in the mdx mouse, we then generated double mutant by crossing mdx mice with CD38-/- mice. We first evaluated the impact of CD38 on NAD+ consumption, by measuring NAD+ levels in various muscle tissues in mdx and in mdx/CD38-/-mice. Our data showed a dramatic deficit of NAD+ levels in all muscles extracted from mdx mice, whereas NAD+ levels were fully restored to normal values in mdx/CD38-/-mice. We also observed a considerable reduction in the pathological spontaneous Ca2+ activity in cardiomyocytes extracted from mdx/CD38-/- mice, associated with a normalization of RyR sensitivity. To further evaluate the beneficial effects of targeting CD38 in DMD, we then measured key histological and functional parameters in the mdx/CD38-/- mouse. The data obtained in mdx/CD38-/- mice demonstrated that deletion of CD38 in mdx mice strongly improves the structural and functional phenotype since we have a clear reduction in the onset of fibrosis and a very significant improvement of skeletal and respiratory function and a full recovery of the cardiac function. Finally, we show that deleting CD38 in mdx mice also prevented isoproterenol-induced heart failure and hypertrophy, a protocol which simulates the onset of cardiomyopathy in DMD patients.All these data strongly support the hypothesis that CD38 is a major contributor of the DMD phenotype and that a reduction in CD38 activity could prevent or delay the cellular damages resulting from both a deficit in NAD+ levels and a disruption of Ca2+ homeostasis in DMD. Last but not least, our study shows that the treatment of human myotubes derived from DMD patient with an anti-CD38 antibody reduces excessive Ca2+ release in these cells. This result strongly suggest that our innovative strategy could be rapidly applied in DMD patients, thanks to the recent development of human therapeutic anti-CD38 antibodies

Les approches thérapeutiques de la DMD basées sur la transplantation de myoblastes se sont heurtées à un faible taux de survie cellulaire et une dispersion limitée des cellules. L'identification de cellules souches au sein de tissus adultes et la définition de leur potentiel myogénique ont ouvert de nouvelles perspectives. Dans un 1er temps, nous avons utilisé les propriétés d'adhérence des cellules dérivées du muscle afin d'isoler dans un modèle aviaire des cellules progénitrices résidantes du muscle distinctes des myoblastes, les LAC (late adherent cells). En utilisant la technique de préplating, nous avons montré, comme cela avait été démontré chez la souris, qu'une fraction marginale de cellules présente un défaut initial d'adhérence à une matrice collagénique et que celle-ci se compose de cellules immatures ou peu engagées dans le programme myogénique. De plus, nous avons démontré que ce défaut ne peut être attribué à la méthodologie employée et que ces cellules ne sont pas générées in vitro. Dans un 2nd temps, nous avons mis en évidence dans un modèle canin que les propriétés de quiescence, de forte capacité de prolifération, de faible capacité de fusion in vitro, de phénotype et de multipotence faisaient des LAC des cellules souches musculaires : les MDSC (Muscle Derived Stem Cells). Après injection intramusculaire chez le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy), modèle cliniquement relevant de la DMD, les MDSC participent à la formation de fibres musculaires, permettent une restauration de la dystrophine, et génèrent des cellules satellites. L'ensemble de ces caractéristiques positionne les MDSC comme des candidates intéressantes pour la thérapie de la DMD
Therapeutic approaches for Duchenne Muscular Dystrophy by myoblast transplantation have been hindered by poor survival rates and the limited spread of the injected cells. Stem cell identification in adult tissues and the definition of their myogenic potential have open new prospects. First, we used the muscle-derived cell’s adhesion properties in an avian model to isolate progenitor cells residing in skeletal muscle and that are distinct from myoblasts: the LAC (Late-Adherent Cells). Using the preplating technique, we showed that a marginal cell fraction displays an initial adhesion defect to collagen matrix and that it is composed of cells poorly committed in myogenic program and immature progenitor cells, as this has been previously described in mice model. Also, we demonstrated that this defect could not be attributed to the methodological approach and that the LAC are not generated in vitro by myoblasts. Second, we showed in canine model that the LAC are characterized by an initial quiescent status, a high in vitro proliferation rate as well as a low fusion ability, a phenotype and a multi-lineage differentiation potential that defined them as muscle stem cells: the MDSC (Muscle Derived Stem Cells). After intramuscular injection in dystrophic GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy) dogs that represent clinically relevant animal model for DMD, we established that MDSC are able to participate in muscle fiber formation, to allow recovery of dystrophin expression and to generate satellite cells. Collectively, these results qualify MDSC as potential candidates for future cell therapy for DMD