Academic literature on the topic 'NCp7 du VIH-1'

Le controle de la replication du vih-1 se fait a differents stades du cycle viral ou interviennent proteines cellulaires et proteines virales. Ainsi, des petites proteines virales comme ncp7 ou tat jouent un role essentiel dans la replication du vih-1. La proteine de la nucleocapside ncp7 permet l'hybridation rapide de deux acides nucleiques complementaires et facilite ainsi la transcription inverse. Nous avons pu montrer par dichroisme circulaire, que cette proteine ne denature pas l'arn transfert#l#y#s#,#3. Quant a la proteine tat, elle active la transcription des genes du vih-1 et participe aux dereglements cellulaires lies a l'infection. Connaitre la structure de cette proteine devrait faciliter la comprehension au niveau de son role biologique. Par modelisation moleculaire, nous avons pu predire une heterogeneite structurale entre variants de la proteine tat provenant de souches vih-1 differentes. Six variants de la proteine tat de taille variable ont pu etre obtenus par synthese peptidique. Ces variants synthetiques sont capables de penetrer dans les cellules, de se diriger dans le noyau et d'activer la transcription des genes sous le controle du promoteur viral. Cependant, cette efficacite de trans-activation varie en fonction des variants testes. Le dichroisme circulaire a permis de montrer des differences au niveau des structures secondaires. Il existe donc des differences conformationnelles entre les variants qui semblent etre liees a une heterogeneite fonctionnelle. Des etudes rmn-2d de tat bru, issue d'une souche virale europeenne, ont ete realisees et permettrons de determiner plus precisement ces differences structurales observees entre les variants de tat. Toutes ces etudes ont pour but de cibler des regions de la proteine tat conservees quelle que soit la souche virale du vih afin de concevoir des inhibiteurs capables de se fixer sur tous les variants.

Les fonctions catalytiques de l'intégrase (IN) du Virus de l'Immunodéficience humaine (VIH-1) sont strictement nécessaires pour l'intégration du génome viral dans les cellules hôtes. Aujourd'hui, trois inhibiteurs anti-IN appartenant à la famille des dikétoacides sont utilisés en thérapie : le raltegravir, l'elvitegravir et le dolutegravir. Cependant, les patients traités par ces médicaments développent des mutations de résistance. Dans ce travail, nous cherchons à mieux comprendre le mécanisme d'interaction de ces drogues avec l'ADN viral. Ce travail a également contribué à la conception de molécules qui devraient être dotées d'une affinité augmentée pour l'ADN, permettant de surmonter le problème de la résistance virale. La compréhension du mécanisme d'inhibition de IN s'est poursuivie par l'étude de deux anticorps monoclonaux anti-K159 (peptide 147-175 du coeur catalytique de IN), 4C6 et 4F4. Les résultats montrent que les anticorps reconnaissent leurs épitopes dans l'IN. D'autre part, du fait de son implication dans de nombreuses étapes du cycle du VIH-1, nous ciblons la protéine 7 de la nucléocapside (NCp7). Pour ce faire, nous avons étudié la structure de nos systèmes (NCp7 et NCp7-ADN) et nous avons pu déterminer les interactions clés responsables de la structuration, ainsi que des fonctions, de ces systèmes. Dans un second temps, nous avons évalué les interactions de NCp7 avec un inhibiteur éjecteur de zinc (C247) de la famille des thioesters. Enfin, sur le plan méthodologique, nous avons raffiné dans le potentiel SIBFA (Sum of Interaction Between Fragments Ab initio computed) la représentation des doublets libres de type sp et sp2 dans les molécules conjuguées<br>The catalytic functions of integrase (IN) of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) are strictly necessary for the integration of the viral genome into the host cells. To this day, three anti-IN inhibitors belonging to the diketoacids are used in therapy: raltegravir, elvitegravir and dolutegravir. However, under treatments with these drugs, patients develop resistance mutations. In this work, we seek to better understand the interaction of the three drugs with viral DNA. This work also contributed to the design of novel molecules. These should be endowed with increased DNA binding affinities as a step towards overcoming viral resistance. The understanding of the inhibition mechanism of IN was pursued by the study of two monoclonal antibodies, 4F4 and 4C6, which are directed against sequence 147-175 of the catalytic core of HIV-1 IN, a peptide denoted K159. The results show that the antibodies recognize their epitopes in IN. We also aim to target an HIV-1 nucleocaspid protein NCp7 involved in many stages of the viral cycle. We have thus studied the structure of NCp7 and its viral DNA complex. We were able to determine the interactions responsible for the structuring and thus the functions of these complexes. Then, we evaluated the interactions of NCp7 with an inhibitor of the thioester family, C247, which acts as a zinc ejector. Finally, from the methodological standpoint, we have refined in SIBFA (Sum of Interaction Between Fragments Ab initio computed) the representation of the sp2 and sp lone pairs in conjugated molecules

Les propriétés chaperonnes de la NCp7 permettent de réarranger les acides nucléiques de manière à favoriser leurs conformations les plus stables. Ces propriétés sont indispensables à la réplication virale du VIH-1. Nous avons utilisé et développé différentes approches expérimentales basées sur des techniques de fluorescence pour approfondir la compréhension de ces propriétés à l'échelle moléculaire. En utilisant la fluorescence résolue en temps de la 2-Aminopurine, nous avons ainsi caractérisé la liaison de la NCp7 de manière site-spécifique. Nous avons également montré que la restriction de la mobilité locale des bases oligonucléotidiques en réponse à la liaison de la NCp7 constitue une composante mécanistique essentielle de l'activité chaperonne. Nos études ont permis de mieux comprendre le rôle de la NCp7 dans les mécanismes réactionels impliqués lors des étapes du premier et du second saut de brin au cours de la réverse transcription. Enfin, nous avons développé une approche par spectroscopie de fluorescence à l'échelle de la molécule unique afin d'étudier la dynamique de la liaison de la NCp7 sur les acides nucléiques<br>The NCp7 chaperone properties constitute a set of features allowing the NCp7-directed folding of nucleic acids into their most stable conformations. These properties are critical for the viral replication of HIV-1. We used and developed different experimental approaches based on fluorescence techniques in order to further characterize these properties at the molecular level. Using time-resolved fluorescence of 2-aminopurine, we characterized site- specfically the binding of NCp7. We demonstrated that the restriction of the local base mobility in response to the NCp7 binding is a key mechanistic component of the NCp7 chaperone activity. Our studies allowed us to further understand the role of the first and second strand transfer involved in the reverse transcription. Finally, we developed a single-molecule fluorescence spectroscopy setup to study the binding kinetics of NCp7 onto oligonucleotides

Mon travail de thèse a été basé sur la caractérisation de l'interaction entre Gag (NCp7) et la RPL7 en milieu cellulaire et in vitro ainsi sur son rôle fonctionnel dans le cycle viral. La polyprotéine Gag du VIH-1 orchestre l’assemblage de la particule virale, en favorisant l’encapsidation de l'ARN génomique viral par son domaine NCp7, et en recrutant des protéines virales et cellulaires. Notre hypothèse est de savoir, si Gag peut contrôler sa propre synthèse et par conséquence la transition entre traduction et encapsidation de l'ARN génomique dans les particules naissantes. Nous avons étudié les protéines cellulaires, identifiées par double hybride, qui peuvent interagir avec Gag et NCp7. La RPL7 humaine est l'une de ces protéines de la grande sous-unité 60S ribosomique. Elle se compose de 248 acides aminés et a la capacité d'inhiber la traduction. Cette fonction peut expliquer le «switch» entre la traduction et de l'encapsidation de l'ARN génomique. Les résultats ont montré que Gag était capable d'interagir avec d'autres protéines que la RPL7 de la sous-unité 60S, par son domaine NCp7<br>Thesis work was based on characterization of interaction between Gag (NCp7) and RPL7 in cellular environment and in vitro and its functional role in the viral cycle. Gag polyprotein of HIV-1 orchestrates assembly of the virus particle, especially by driving packaging of the viral genomic RNA through its NCp7 domain, and by the recruitment of viral and cellular protein partners. Our hypothesis was to know, whether Gag can control its own synthesis and consequently the transition between translation and packaging of the genomic RNA into nascent particles. We investigated cellular proteins, identified by a two-hybrid assay, which can interact with Gag and NCp7. Human RPL7 is one such protein from large ribosomal subunit 60S. It consists of 248 amino acids and has the ability to inhibit translation. This function can explain the 'switch' between translation and packaging of the genomic RNA. Results showed that Gag was capable of interacting with RPL7 and other proteins from 60S subunit, through its NCp7 domain

La polyprotéine de structure Gag du VIH-1 est responsable de l’assemblage des particules virales dans les cellules infectées. Au niveau moléculaire, cette protéine s’oligomérise en formant des complexes Gag-Gag autour de deux plates-formes moléculaires, d'une part l'ARN génomique via son domaine NCp7 (NucleoCapsid protein 7) et d'autre part, la membrane plasmique via son domaine MA (Matrice). De plus, lors du trafic de Gag dans la cellule, Gag détourne les protéines ESCRT comme TSG101 et ALIX de la machinerie cellulaire afin de bourgeonner et d’être libérées dans le milieu extracellulaire. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle du domaine NCp7 seul ou au sein de Gag (GagNC) dans les interactions Gag-Gag et Gag-TSG101 en utilisant des approches biochimiques et de la microscopie de fluorescence quantitative. Les résultats ont montré que l'absence du domaine NCp7 affecte l’oligomerisation de Gag qui s’accumule alors dans le cytoplasme sous forme d’agrégats de taille importante. Par ailleurs, le trafic intracellulaire de Gag est affecté par les mutations dans le domaine GagNC avec une augmentation importante de temps nécessaire à Gag pour arriver à la membrane plasmique. Enfin, nous avons montré que GagNC i) renforce l’interaction entre le domaine p6 de Gag et TSG101 et ii) par sa fonction dans le trafic de Gag, est responsable de la localisation de TSG101 à la PM. Sur la base de ces résultats, des études sont maintenant en cours pour développer des tests afin d’identifier des molécules possédant un potentiel anti virale<br>The Gag structural polyprotein of HIV-1 orchestrates viral particle assembly in producer cells, in a process that requires two platforms, the genomic RNA on the one hand and a membrane with a lipid bilayer, on the other. During its transportation from translating ribosomes to plasma membrane, Gag hijacks cellular proteins of the cytoskeleton and the ESCRT proteins like TSG101, Alix, etc., to egress viral particles. However, a number of questions remain to be answered before they are clearly apprehended. In this thesis, , we studied the role of the NC domain alone or as part of Gag (GagNC) in Gag-Gag and Gag-TSG101 interactions, which are essential for the assembly and budding of HIV-1 particles using quantitative fluorescent microscopy and biochemical approach. Results, showed that the absence of NC domain lead to (1) an accumulation of Gag as large aggregates that are dispersed in the cytoplasm, (2) a decrease of Gag-Gag condensation and (3) a delay for Gag-Gag complexes in reaching the PM, (4) improved interaction between Gag and TSG101, and (5) by its virtue in Gag trafficking docks TSG101 to the PM. This regulatory effect of NCp7 domain in either TSG101 or Gag or both protein- regulated pathways during virus budding can be exploited to develop inhibitors targeting HIV-1

La protéine de nucléocapside (NC) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) joue de nombreux rôles dans les phases précoce et tardive de l’infection. La NC est une protéine à deux doigts de zinc, chaperonne des acides nucléiques. Nous avons cherché de nouveaux partenaires cellulaires de la NCp7 et identifié une protéine de liaison aux ARNs, Upstream of N-ras (Unr), dont l’interaction avec Gag et NCp7 a été confirmée. L’interaction entre Gag et Unr est dépendante de l’ARN et médiée par le domaine NC. Unr est une ITAF (IRES transacting factor) régulant la traduction médiée par plusieurs IRESs cellulaires et viraux. L’ARN génomique du VIH-1 possède deux IRESs dont un localisé dans la région non traduite en 5’ qui permet aux ARNm viraux de conserver un fort niveau de traduction lorsque la traduction coiffe-dépendante de la cellule est affaiblie par l’arrêt du cycle viral induit par l’infection. En utilisant un système de dual luciférase, nous avons montré qu’Unr est une ITAF dont la surexpression stimule l’IRES VIH-1. Des mutations ponctuelles de cet IRES, dans un motif consensus de liaison à Unr, altèrent à la fois l’activité de l’IRES et sa réponse à Unr suggérant que l’activité IRES dépend fortement de Unr. L’effet d’Unr sur l’IRES est inhibé par la surexpression de NCp7 mais pas par celle de Gag dont l’effet stimulateur sur l’IRES est additif de celui d’Unr suggérant un rôle d’Unr différent dans les phases précoce et tardive de l’infection. Pour finir, le knockdown de l’expression d’Unr entraîne une diminution significative de l’infection par un pseudovirus non réplicatif soulignant l’implication fonctionnelle d’Unr dans la phase précoce<br>The Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) nucleocapsid protein (NC), as a mature protein (NCp7) or as a domain of the polyprotein Gag, plays several important roles in both the early and late phase of the infection. NC is a nucleic acid chaperone protein with two zinc fingers. We searched for new cellular protein partners of NCp7 and identified the RNA binding protein Unr, Upstream of N-ras, whose interaction with both Gag and NCp7 was confirmed. Unr interaction with Gag is RNA dependent and mediated by its NC domain. Unr is an ITAF (IRES trans-acting factor) regulating the translation driven by several IRESs. The HIV-1 genomic mRNA harbors two IRESs elements: one of them found within the HIV-1 5’-Untranslated region drives HIV-1 mRNA translation when the cap-dependent translation is diminished due to the infection-induced cell cycle arrest. Using a dual luciferase assay, Unr was shown to act as an ITAF, increasing the HIV-1 IRES dependent translation. Point mutations of the HIV-1 IRES in a consensus Unr binding motif were found to alter both the IRES activity and its activation by Unr suggesting a strong dependency of the IRES on Unr. Unr stimulation effect is furthermore counteracted by NCp7, but not by Gag overexpression, which increases the IRES activity in an additive manner to Unr suggesting a differential Unr effect on the early and late phases of the infection. Finally, knockdown of Unr in HeLa cells leads to a decline in infection by a non-replicative lentivector proving its functional implication in the early phase

La protéine de nucléocapside (NC) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) joue un rôle majeur dans les différentes étapes du cycle viral du VIH-1 : soit comme domaine fonctionnel de la polyprotéine Gag (NC-Gag) dans les phases tardives du cycle viral, soit sous sa forme mature NCp7 dans les phases précoces. Afin de mieux comprendre le rôle de la forme mature dans le cycle viral, nous avons cherché de nouveaux partenaires cellulaires spécifiques de la NCp7 et identifié la protéine nucléolaire, hNoL12, impliquée dans la maturation des ARNs ribosomaux. L’interaction NCp7/hNoL12 a été confirmée par co-IP, FRET-FLIM et double hybride chez la levure et le domaine d’interaction a été localisé entre les a.a. 22 et 61 correspondant au domaine 5’-3’-exonucléase de hNoL12. Nous avons développé un test pour caractériser cette activité et montré qu’elle est spécifique des ARN simples brins. Enfin, l’extinction de l’expression de hNoL12 entraine une diminution significative de l’infection par un lentivecteur modèle des phases précoces de l’infection soulignant l’implication fonctionnelle de hNoL12 dans cette phase de l’infection. Dans un second projet, nous nous sommes intéressés au devenir de la NCp7 dans les cellules infectées, suite à la transcription inverse. Nous avons généré des vecteurs lentiviraux composés de protéines NCp7 fusionnées à une étiquette tétracysteine permettant son marquage spécifique avec le dérivé de la fluorescéine (FlAsH). Nous avons alors étudié, par microscopie confocale, la distribution intracellulaire de la NCp7 dans des conditions proches de l’infection. Nos résultats indiquent qu’une grande partie de la NCp7 se dissocie du PIC durant son transport dans le cytoplasme. Toutefois, la perte de la NCp7 est une étape tardive qui se déroule proche du noyau confirmant ainsi que la décapsidation a lieu à la membrane nucleaire juste avant l’entrée du complexe de préintegration dans le noyau. Le troisième projet a porté sur le développement d’antiviraux ciblant la NCp7. Nous avons travaillé sur la vectorisation et la caractérisation des propriétés antivirales en milieu cellulaire, d’un peptide sélectionné in vitro pour sa capacité à inhiber l’action chaperonne de la NCp7. L’activité antivirale du peptide vectorisé vis-à-vis d’une infection par un vecteur lentiviral basé sur le VIH-1 s’est révélée décevante<br>The Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) nucleocapsid protein (NC) plays a major role in the different steps of theviral lifecycle under its two forms; either as a domain of the polyprotein Gag (NC-Gag) in the late phase or as a matureNCp7 protein in the early phase. In order to better understand the role of the mature form in the viral cycle, we searchedfor new NCp7 specific cellular partners and identified the nucleolar protein hNoL12 which is known to be involved inthe maturation of ribosomal RNAs. The NCp7/hNoL12 interaction was confirmed by co- IP, FRET-FLIM, and yeast twohybrid. The interaction domain was localized between a.a. 22 and 61 on hNoL12; which corresponds to its putative 5’-3’-exonuclease domain. We developed an assay to monitor this activity and found it to be specific of single strand RNA.Finally, the cellular knockdown of hNoL12 resulted in a significant decrease in the infection by a pseudovirus mimickingthe early phase of the infection, emphasizing the functional involvement of hNoL12 in this phase. In a second project, wewere interested in the fate of the viral incoming NCp7 in the infected cells, after reverse transcription. We thus generatedlentiviral vectors composed of NCp7 fused to a tetracysteine tag enabling its specific labeling with the fluoresceinderivative FlAsH. We then studied by confocal microscopy, the intracellular distribution of NCp7 containing viralparticles in conditions close to the infection. Our results showed that an important proportion of the NCp7 moleculesdissociates from the PIC during its transport in the cytoplasm. However, the loss of NCp7 is a late step of this processand seems to take place close to the nucleus suggesting that the dissociation of the capsid occurs at the nuclear membranejust before the nuclear entry of the PIC. The third project concerns the development of antiviral inhibitors targetingNCp7. We worked on the vectorization and the characterization of the antiviral properties of a peptide selected in vitrofor its ability to inhibit the NCp7 chaperone activity. The inhibitory activity of the vectorized peptide on infection ofHeLa cells by a HIV-1 based lentiviral vector was found deceiving

L'implication de NCp7 dans de nombreuses étapes du cycle de réplication rétroviral fait de cette protéine une cible idéale pour la conception d'agents anti-VIH-1. Par son activité de protéine chaperone, NCp7 permet de stimuler le premier saut de brin lors de la transcription inverse de l'ARN génomique. Cette étape, qui requiert une hybridation entre la séquence TAR et sa séquence complémentaire cTAR, situées aux extrémités 3' de l'ARN génomique et de l'ADN proviral, nécessite une importante déstabilisation intramoléculaire de ces séquences. A l'aide d'oligonucléotides marqués à leurs extrémités 3' et 5' par des chromophores, nous avons analysé par spectroscopie de fluorescence et d'absorption le rôle de NCp7 dans cette déstabilisation. Ce travail nous a également permis de mettre en évidence l'existence d'un couplage excitonique entre les deux sondes. Ce couplage est dû à l'extrême proximité des deux sondes et provoque une variation des propriétés spectrales. Il représente ainsi un outil apte à déceler tout changement structural aux extrémités de la tige de TAR. En présence de NCp7, l'ensemble de nos résultats suggère qu'une concentration saturante de peptide active l'ouverture transitoire des paires des bases dans les parties les moins stables des oligonucléotides, et déplace l'équilibre vers les formes ouvertes des tiges-boucles en augmentant les effets de fraying spécifiques aux extrémités de TAR. Cette activation est strictement dépendante des deux doigts de zinc présents dans la NCp7<br>Due to its critical involvement in several key steps of the retroviral cycle, the nucleocapsid protein, NCp7, represents an ideal target for a chemotherapy against HIV-1. Due to its chaperone activity, NCp7 dramatically stimulates HIV-1 minus strand transfer during genomic RNA reverse transcription. During this step, in a reaction mediated by base-pairing of the TAR sequence with its complementary sequence cTAR, localized at the 3' ends of RNA and DNA reactants, these highly stable stem-loops sequences have to be unfolded. In order to examine the nature and the extent of the helix detabilizing activity of NCp7 upon TAR and its derivatives by fluorescence and absorbance techniques, we have used doubly labelled sequences. Here we report that in the closed form of the stem, the two probes are held close together, inducing the formation of a ground state intramolecular heterodimer and leading to important spectral changes. This heterodimer can be used to investigate short-range modifications of the stem structure. Taken together our data show that a saturating amount of NCp7 activate the transient opening of base-pairs in the least stable parts of the stem, and shift the equilibrium toward open species, suggesting that NCp7 enhances fraying of the stem terminus. This destabilisation effect clearly depends on zinc-fingers motifs