Dissertations / Theses on the topic 'NCp7 du VIH-1'

Le controle de la replication du vih-1 se fait a differents stades du cycle viral ou interviennent proteines cellulaires et proteines virales. Ainsi, des petites proteines virales comme ncp7 ou tat jouent un role essentiel dans la replication du vih-1. La proteine de la nucleocapside ncp7 permet l'hybridation rapide de deux acides nucleiques complementaires et facilite ainsi la transcription inverse. Nous avons pu montrer par dichroisme circulaire, que cette proteine ne denature pas l'arn transfert#l#y#s#,#3. Quant a la proteine tat, elle active la transcription des genes du vih-1 et participe aux dereglements cellulaires lies a l'infection. Connaitre la structure de cette proteine devrait faciliter la comprehension au niveau de son role biologique. Par modelisation moleculaire, nous avons pu predire une heterogeneite structurale entre variants de la proteine tat provenant de souches vih-1 differentes. Six variants de la proteine tat de taille variable ont pu etre obtenus par synthese peptidique. Ces variants synthetiques sont capables de penetrer dans les cellules, de se diriger dans le noyau et d'activer la transcription des genes sous le controle du promoteur viral. Cependant, cette efficacite de trans-activation varie en fonction des variants testes. Le dichroisme circulaire a permis de montrer des differences au niveau des structures secondaires. Il existe donc des differences conformationnelles entre les variants qui semblent etre liees a une heterogeneite fonctionnelle. Des etudes rmn-2d de tat bru, issue d'une souche virale europeenne, ont ete realisees et permettrons de determiner plus precisement ces differences structurales observees entre les variants de tat. Toutes ces etudes ont pour but de cibler des regions de la proteine tat conservees quelle que soit la souche virale du vih afin de concevoir des inhibiteurs capables de se fixer sur tous les variants.

Les fonctions catalytiques de l'intégrase (IN) du Virus de l'Immunodéficience humaine (VIH-1) sont strictement nécessaires pour l'intégration du génome viral dans les cellules hôtes. Aujourd'hui, trois inhibiteurs anti-IN appartenant à la famille des dikétoacides sont utilisés en thérapie : le raltegravir, l'elvitegravir et le dolutegravir. Cependant, les patients traités par ces médicaments développent des mutations de résistance. Dans ce travail, nous cherchons à mieux comprendre le mécanisme d'interaction de ces drogues avec l'ADN viral. Ce travail a également contribué à la conception de molécules qui devraient être dotées d'une affinité augmentée pour l'ADN, permettant de surmonter le problème de la résistance virale. La compréhension du mécanisme d'inhibition de IN s'est poursuivie par l'étude de deux anticorps monoclonaux anti-K159 (peptide 147-175 du coeur catalytique de IN), 4C6 et 4F4. Les résultats montrent que les anticorps reconnaissent leurs épitopes dans l'IN. D'autre part, du fait de son implication dans de nombreuses étapes du cycle du VIH-1, nous ciblons la protéine 7 de la nucléocapside (NCp7). Pour ce faire, nous avons étudié la structure de nos systèmes (NCp7 et NCp7-ADN) et nous avons pu déterminer les interactions clés responsables de la structuration, ainsi que des fonctions, de ces systèmes. Dans un second temps, nous avons évalué les interactions de NCp7 avec un inhibiteur éjecteur de zinc (C247) de la famille des thioesters. Enfin, sur le plan méthodologique, nous avons raffiné dans le potentiel SIBFA (Sum of Interaction Between Fragments Ab initio computed) la représentation des doublets libres de type sp et sp2 dans les molécules conjuguées<br>The catalytic functions of integrase (IN) of Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) are strictly necessary for the integration of the viral genome into the host cells. To this day, three anti-IN inhibitors belonging to the diketoacids are used in therapy: raltegravir, elvitegravir and dolutegravir. However, under treatments with these drugs, patients develop resistance mutations. In this work, we seek to better understand the interaction of the three drugs with viral DNA. This work also contributed to the design of novel molecules. These should be endowed with increased DNA binding affinities as a step towards overcoming viral resistance. The understanding of the inhibition mechanism of IN was pursued by the study of two monoclonal antibodies, 4F4 and 4C6, which are directed against sequence 147-175 of the catalytic core of HIV-1 IN, a peptide denoted K159. The results show that the antibodies recognize their epitopes in IN. We also aim to target an HIV-1 nucleocaspid protein NCp7 involved in many stages of the viral cycle. We have thus studied the structure of NCp7 and its viral DNA complex. We were able to determine the interactions responsible for the structuring and thus the functions of these complexes. Then, we evaluated the interactions of NCp7 with an inhibitor of the thioester family, C247, which acts as a zinc ejector. Finally, from the methodological standpoint, we have refined in SIBFA (Sum of Interaction Between Fragments Ab initio computed) the representation of the sp2 and sp lone pairs in conjugated molecules

Les propriétés chaperonnes de la NCp7 permettent de réarranger les acides nucléiques de manière à favoriser leurs conformations les plus stables. Ces propriétés sont indispensables à la réplication virale du VIH-1. Nous avons utilisé et développé différentes approches expérimentales basées sur des techniques de fluorescence pour approfondir la compréhension de ces propriétés à l'échelle moléculaire. En utilisant la fluorescence résolue en temps de la 2-Aminopurine, nous avons ainsi caractérisé la liaison de la NCp7 de manière site-spécifique. Nous avons également montré que la restriction de la mobilité locale des bases oligonucléotidiques en réponse à la liaison de la NCp7 constitue une composante mécanistique essentielle de l'activité chaperonne. Nos études ont permis de mieux comprendre le rôle de la NCp7 dans les mécanismes réactionels impliqués lors des étapes du premier et du second saut de brin au cours de la réverse transcription. Enfin, nous avons développé une approche par spectroscopie de fluorescence à l'échelle de la molécule unique afin d'étudier la dynamique de la liaison de la NCp7 sur les acides nucléiques<br>The NCp7 chaperone properties constitute a set of features allowing the NCp7-directed folding of nucleic acids into their most stable conformations. These properties are critical for the viral replication of HIV-1. We used and developed different experimental approaches based on fluorescence techniques in order to further characterize these properties at the molecular level. Using time-resolved fluorescence of 2-aminopurine, we characterized site- specfically the binding of NCp7. We demonstrated that the restriction of the local base mobility in response to the NCp7 binding is a key mechanistic component of the NCp7 chaperone activity. Our studies allowed us to further understand the role of the first and second strand transfer involved in the reverse transcription. Finally, we developed a single-molecule fluorescence spectroscopy setup to study the binding kinetics of NCp7 onto oligonucleotides

Mon travail de thèse a été basé sur la caractérisation de l'interaction entre Gag (NCp7) et la RPL7 en milieu cellulaire et in vitro ainsi sur son rôle fonctionnel dans le cycle viral. La polyprotéine Gag du VIH-1 orchestre l’assemblage de la particule virale, en favorisant l’encapsidation de l'ARN génomique viral par son domaine NCp7, et en recrutant des protéines virales et cellulaires. Notre hypothèse est de savoir, si Gag peut contrôler sa propre synthèse et par conséquence la transition entre traduction et encapsidation de l'ARN génomique dans les particules naissantes. Nous avons étudié les protéines cellulaires, identifiées par double hybride, qui peuvent interagir avec Gag et NCp7. La RPL7 humaine est l'une de ces protéines de la grande sous-unité 60S ribosomique. Elle se compose de 248 acides aminés et a la capacité d'inhiber la traduction. Cette fonction peut expliquer le «switch» entre la traduction et de l'encapsidation de l'ARN génomique. Les résultats ont montré que Gag était capable d'interagir avec d'autres protéines que la RPL7 de la sous-unité 60S, par son domaine NCp7<br>Thesis work was based on characterization of interaction between Gag (NCp7) and RPL7 in cellular environment and in vitro and its functional role in the viral cycle. Gag polyprotein of HIV-1 orchestrates assembly of the virus particle, especially by driving packaging of the viral genomic RNA through its NCp7 domain, and by the recruitment of viral and cellular protein partners. Our hypothesis was to know, whether Gag can control its own synthesis and consequently the transition between translation and packaging of the genomic RNA into nascent particles. We investigated cellular proteins, identified by a two-hybrid assay, which can interact with Gag and NCp7. Human RPL7 is one such protein from large ribosomal subunit 60S. It consists of 248 amino acids and has the ability to inhibit translation. This function can explain the 'switch' between translation and packaging of the genomic RNA. Results showed that Gag was capable of interacting with RPL7 and other proteins from 60S subunit, through its NCp7 domain

La polyprotéine de structure Gag du VIH-1 est responsable de l’assemblage des particules virales dans les cellules infectées. Au niveau moléculaire, cette protéine s’oligomérise en formant des complexes Gag-Gag autour de deux plates-formes moléculaires, d'une part l'ARN génomique via son domaine NCp7 (NucleoCapsid protein 7) et d'autre part, la membrane plasmique via son domaine MA (Matrice). De plus, lors du trafic de Gag dans la cellule, Gag détourne les protéines ESCRT comme TSG101 et ALIX de la machinerie cellulaire afin de bourgeonner et d’être libérées dans le milieu extracellulaire. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle du domaine NCp7 seul ou au sein de Gag (GagNC) dans les interactions Gag-Gag et Gag-TSG101 en utilisant des approches biochimiques et de la microscopie de fluorescence quantitative. Les résultats ont montré que l'absence du domaine NCp7 affecte l’oligomerisation de Gag qui s’accumule alors dans le cytoplasme sous forme d’agrégats de taille importante. Par ailleurs, le trafic intracellulaire de Gag est affecté par les mutations dans le domaine GagNC avec une augmentation importante de temps nécessaire à Gag pour arriver à la membrane plasmique. Enfin, nous avons montré que GagNC i) renforce l’interaction entre le domaine p6 de Gag et TSG101 et ii) par sa fonction dans le trafic de Gag, est responsable de la localisation de TSG101 à la PM. Sur la base de ces résultats, des études sont maintenant en cours pour développer des tests afin d’identifier des molécules possédant un potentiel anti virale<br>The Gag structural polyprotein of HIV-1 orchestrates viral particle assembly in producer cells, in a process that requires two platforms, the genomic RNA on the one hand and a membrane with a lipid bilayer, on the other. During its transportation from translating ribosomes to plasma membrane, Gag hijacks cellular proteins of the cytoskeleton and the ESCRT proteins like TSG101, Alix, etc., to egress viral particles. However, a number of questions remain to be answered before they are clearly apprehended. In this thesis, , we studied the role of the NC domain alone or as part of Gag (GagNC) in Gag-Gag and Gag-TSG101 interactions, which are essential for the assembly and budding of HIV-1 particles using quantitative fluorescent microscopy and biochemical approach. Results, showed that the absence of NC domain lead to (1) an accumulation of Gag as large aggregates that are dispersed in the cytoplasm, (2) a decrease of Gag-Gag condensation and (3) a delay for Gag-Gag complexes in reaching the PM, (4) improved interaction between Gag and TSG101, and (5) by its virtue in Gag trafficking docks TSG101 to the PM. This regulatory effect of NCp7 domain in either TSG101 or Gag or both protein- regulated pathways during virus budding can be exploited to develop inhibitors targeting HIV-1

La protéine de nucléocapside (NC) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) joue de nombreux rôles dans les phases précoce et tardive de l’infection. La NC est une protéine à deux doigts de zinc, chaperonne des acides nucléiques. Nous avons cherché de nouveaux partenaires cellulaires de la NCp7 et identifié une protéine de liaison aux ARNs, Upstream of N-ras (Unr), dont l’interaction avec Gag et NCp7 a été confirmée. L’interaction entre Gag et Unr est dépendante de l’ARN et médiée par le domaine NC. Unr est une ITAF (IRES transacting factor) régulant la traduction médiée par plusieurs IRESs cellulaires et viraux. L’ARN génomique du VIH-1 possède deux IRESs dont un localisé dans la région non traduite en 5’ qui permet aux ARNm viraux de conserver un fort niveau de traduction lorsque la traduction coiffe-dépendante de la cellule est affaiblie par l’arrêt du cycle viral induit par l’infection. En utilisant un système de dual luciférase, nous avons montré qu’Unr est une ITAF dont la surexpression stimule l’IRES VIH-1. Des mutations ponctuelles de cet IRES, dans un motif consensus de liaison à Unr, altèrent à la fois l’activité de l’IRES et sa réponse à Unr suggérant que l’activité IRES dépend fortement de Unr. L’effet d’Unr sur l’IRES est inhibé par la surexpression de NCp7 mais pas par celle de Gag dont l’effet stimulateur sur l’IRES est additif de celui d’Unr suggérant un rôle d’Unr différent dans les phases précoce et tardive de l’infection. Pour finir, le knockdown de l’expression d’Unr entraîne une diminution significative de l’infection par un pseudovirus non réplicatif soulignant l’implication fonctionnelle d’Unr dans la phase précoce<br>The Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) nucleocapsid protein (NC), as a mature protein (NCp7) or as a domain of the polyprotein Gag, plays several important roles in both the early and late phase of the infection. NC is a nucleic acid chaperone protein with two zinc fingers. We searched for new cellular protein partners of NCp7 and identified the RNA binding protein Unr, Upstream of N-ras, whose interaction with both Gag and NCp7 was confirmed. Unr interaction with Gag is RNA dependent and mediated by its NC domain. Unr is an ITAF (IRES trans-acting factor) regulating the translation driven by several IRESs. The HIV-1 genomic mRNA harbors two IRESs elements: one of them found within the HIV-1 5’-Untranslated region drives HIV-1 mRNA translation when the cap-dependent translation is diminished due to the infection-induced cell cycle arrest. Using a dual luciferase assay, Unr was shown to act as an ITAF, increasing the HIV-1 IRES dependent translation. Point mutations of the HIV-1 IRES in a consensus Unr binding motif were found to alter both the IRES activity and its activation by Unr suggesting a strong dependency of the IRES on Unr. Unr stimulation effect is furthermore counteracted by NCp7, but not by Gag overexpression, which increases the IRES activity in an additive manner to Unr suggesting a differential Unr effect on the early and late phases of the infection. Finally, knockdown of Unr in HeLa cells leads to a decline in infection by a non-replicative lentivector proving its functional implication in the early phase

La protéine de nucléocapside (NC) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1) joue un rôle majeur dans les différentes étapes du cycle viral du VIH-1 : soit comme domaine fonctionnel de la polyprotéine Gag (NC-Gag) dans les phases tardives du cycle viral, soit sous sa forme mature NCp7 dans les phases précoces. Afin de mieux comprendre le rôle de la forme mature dans le cycle viral, nous avons cherché de nouveaux partenaires cellulaires spécifiques de la NCp7 et identifié la protéine nucléolaire, hNoL12, impliquée dans la maturation des ARNs ribosomaux. L’interaction NCp7/hNoL12 a été confirmée par co-IP, FRET-FLIM et double hybride chez la levure et le domaine d’interaction a été localisé entre les a.a. 22 et 61 correspondant au domaine 5’-3’-exonucléase de hNoL12. Nous avons développé un test pour caractériser cette activité et montré qu’elle est spécifique des ARN simples brins. Enfin, l’extinction de l’expression de hNoL12 entraine une diminution significative de l’infection par un lentivecteur modèle des phases précoces de l’infection soulignant l’implication fonctionnelle de hNoL12 dans cette phase de l’infection. Dans un second projet, nous nous sommes intéressés au devenir de la NCp7 dans les cellules infectées, suite à la transcription inverse. Nous avons généré des vecteurs lentiviraux composés de protéines NCp7 fusionnées à une étiquette tétracysteine permettant son marquage spécifique avec le dérivé de la fluorescéine (FlAsH). Nous avons alors étudié, par microscopie confocale, la distribution intracellulaire de la NCp7 dans des conditions proches de l’infection. Nos résultats indiquent qu’une grande partie de la NCp7 se dissocie du PIC durant son transport dans le cytoplasme. Toutefois, la perte de la NCp7 est une étape tardive qui se déroule proche du noyau confirmant ainsi que la décapsidation a lieu à la membrane nucleaire juste avant l’entrée du complexe de préintegration dans le noyau. Le troisième projet a porté sur le développement d’antiviraux ciblant la NCp7. Nous avons travaillé sur la vectorisation et la caractérisation des propriétés antivirales en milieu cellulaire, d’un peptide sélectionné in vitro pour sa capacité à inhiber l’action chaperonne de la NCp7. L’activité antivirale du peptide vectorisé vis-à-vis d’une infection par un vecteur lentiviral basé sur le VIH-1 s’est révélée décevante<br>The Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) nucleocapsid protein (NC) plays a major role in the different steps of theviral lifecycle under its two forms; either as a domain of the polyprotein Gag (NC-Gag) in the late phase or as a matureNCp7 protein in the early phase. In order to better understand the role of the mature form in the viral cycle, we searchedfor new NCp7 specific cellular partners and identified the nucleolar protein hNoL12 which is known to be involved inthe maturation of ribosomal RNAs. The NCp7/hNoL12 interaction was confirmed by co- IP, FRET-FLIM, and yeast twohybrid. The interaction domain was localized between a.a. 22 and 61 on hNoL12; which corresponds to its putative 5’-3’-exonuclease domain. We developed an assay to monitor this activity and found it to be specific of single strand RNA.Finally, the cellular knockdown of hNoL12 resulted in a significant decrease in the infection by a pseudovirus mimickingthe early phase of the infection, emphasizing the functional involvement of hNoL12 in this phase. In a second project, wewere interested in the fate of the viral incoming NCp7 in the infected cells, after reverse transcription. We thus generatedlentiviral vectors composed of NCp7 fused to a tetracysteine tag enabling its specific labeling with the fluoresceinderivative FlAsH. We then studied by confocal microscopy, the intracellular distribution of NCp7 containing viralparticles in conditions close to the infection. Our results showed that an important proportion of the NCp7 moleculesdissociates from the PIC during its transport in the cytoplasm. However, the loss of NCp7 is a late step of this processand seems to take place close to the nucleus suggesting that the dissociation of the capsid occurs at the nuclear membranejust before the nuclear entry of the PIC. The third project concerns the development of antiviral inhibitors targetingNCp7. We worked on the vectorization and the characterization of the antiviral properties of a peptide selected in vitrofor its ability to inhibit the NCp7 chaperone activity. The inhibitory activity of the vectorized peptide on infection ofHeLa cells by a HIV-1 based lentiviral vector was found deceiving

L'implication de NCp7 dans de nombreuses étapes du cycle de réplication rétroviral fait de cette protéine une cible idéale pour la conception d'agents anti-VIH-1. Par son activité de protéine chaperone, NCp7 permet de stimuler le premier saut de brin lors de la transcription inverse de l'ARN génomique. Cette étape, qui requiert une hybridation entre la séquence TAR et sa séquence complémentaire cTAR, situées aux extrémités 3' de l'ARN génomique et de l'ADN proviral, nécessite une importante déstabilisation intramoléculaire de ces séquences. A l'aide d'oligonucléotides marqués à leurs extrémités 3' et 5' par des chromophores, nous avons analysé par spectroscopie de fluorescence et d'absorption le rôle de NCp7 dans cette déstabilisation. Ce travail nous a également permis de mettre en évidence l'existence d'un couplage excitonique entre les deux sondes. Ce couplage est dû à l'extrême proximité des deux sondes et provoque une variation des propriétés spectrales. Il représente ainsi un outil apte à déceler tout changement structural aux extrémités de la tige de TAR. En présence de NCp7, l'ensemble de nos résultats suggère qu'une concentration saturante de peptide active l'ouverture transitoire des paires des bases dans les parties les moins stables des oligonucléotides, et déplace l'équilibre vers les formes ouvertes des tiges-boucles en augmentant les effets de fraying spécifiques aux extrémités de TAR. Cette activation est strictement dépendante des deux doigts de zinc présents dans la NCp7<br>Due to its critical involvement in several key steps of the retroviral cycle, the nucleocapsid protein, NCp7, represents an ideal target for a chemotherapy against HIV-1. Due to its chaperone activity, NCp7 dramatically stimulates HIV-1 minus strand transfer during genomic RNA reverse transcription. During this step, in a reaction mediated by base-pairing of the TAR sequence with its complementary sequence cTAR, localized at the 3' ends of RNA and DNA reactants, these highly stable stem-loops sequences have to be unfolded. In order to examine the nature and the extent of the helix detabilizing activity of NCp7 upon TAR and its derivatives by fluorescence and absorbance techniques, we have used doubly labelled sequences. Here we report that in the closed form of the stem, the two probes are held close together, inducing the formation of a ground state intramolecular heterodimer and leading to important spectral changes. This heterodimer can be used to investigate short-range modifications of the stem structure. Taken together our data show that a saturating amount of NCp7 activate the transient opening of base-pairs in the least stable parts of the stem, and shift the equilibrium toward open species, suggesting that NCp7 enhances fraying of the stem terminus. This destabilisation effect clearly depends on zinc-fingers motifs

Le cycle de réplication du VIH l'interaction de protéines virales avec l'ARN et l'ADN viraux. Nous avons étudié l'interaction entre Vpr ou la NCp7 et des petits oligonucleotides et le primer binding site (PBS), respectivement. Le PBS forme une tige-boucle et interagit avec la NCp7 lors de la transcription inverse, induisant un transfert de brin. Notre étude montre que la NCp7 glisse entre ses deux sites de liaison sur le PBS, déstabilisant ainsi sa structure pour faciliter le transfert de brin. Vpr interagit avec l'ADN viral et participe à son import dans le noyau des cellules. Après avoir déterminé la structure en "leucine zipper" de Vpr(52-96), nous avons montré par RMN, fluorescence et Biacore une interaction entre Vpr(52-96) et les acides nucléiques. La résolution des éléments importants pour l'interaction entre la NCp7 et Vpr et leurs cibles nucléotidiques, pourrait être utilisée dans le cadre de la recherche d'agents anti-viraux<br>HIV replication cycle requires viral protein interactions with viral RNA and DNA. We studied the interaction between Vpr, regulation protein and NCp7, nucleocapsid protein and short oligonucleotides and Primer Binding Site (PBS) respectively. The PBS structures as a stem loop and interacts with the NCp7 during reverse transcription. This interaction induces strand transfer. Our study proves the capacity f NCp7 to slide between its two binding sites on the PBS, thus opening its secondary structure, which is necessary to the strand transfer. Vpr interacts with viral DNA and facilitates its import in cell nucleus. Having determined a "leucine zipper" dimer structure of Vpr(52-96), we showed by NMR, fluorescence and surface plasmon resonance an interaction between Vpr(52-96) and nucleic acids. Finding out structural features necessary for the interaction between the NCp7 and Vpr and their nucleotidic targets could be used to design new antiviral agents

La protéine NCp7 du VIH-1 est une cible thérapeutique de choix car, en plus d’être conservée, elle intervient lors de nombreuses étapes du cycle rétroviral. A ce jour, peu de données existent concernant l’interaction possible de NCp7 avec les membranes lipidiques. Or il a récemment été montré que, lors de l’assemblage des virions, le précurseur Gag adopte une conformation repliée qui permettrait à son domaine NC d’interagir avec la membrane plasmique. Dans le but de tester cette hypothèse nous avons utilisé NCp7 sous sa forme mature. Nos résultats indiquent que NCp7, libre ou liée à des acides nucléiques, se lie aux membranes lipidiques chargées négativement, possède la capacité de recruter les lipides chargés négativement de manière à optimiser sa liaison sur la membrane et peut également déstabiliser ces membranes. Finalement, en utilisant un système modèle, nous avons mis au point les conditions de travail pour la poursuite de cette étude à l’aide de la microscopie super-résolutive<br>The NCp7 protein is an interesting antiviral target since it is conserved and plays a numerous key roles in the HIV-1 replication cycle. Interestingly, while only few data are currently available on the possible interaction of NCp7 with lipid membranes, it has been recently shown that during assembly, the Gag precursor can adopt a bent conformation where the NC domain may interact with the plasma membrane. In order to check this hypothesis we used the mature NCp7. Our data indicated that the NCp7 protein, free or bound with nucleic acids, binds to negatively charged lipid membrane with high affinity, can recruit negatively charged lipids to optimize its binding to lipid membranes and has the ability of to destabilize negatively charged lipid membranes at high concentrations. Finally, by using a receptor/ligand model system we established the working conditions to investigate Gag/membrane interactions by high resolution microscopy

La protéine de nucléocapside du VIH-1 NCp7 assume plusieurs fonctions au cours du cycle de réplication du VIH-1. Elle est notamment impliquée dans la facilitation des transferts de brin qui se produisent au cours de la transcription inverse. Celle-ci consiste en une suite d'étapes qui permet la conversion du génome ARN simple brin en une molécule d'ADN double-brin. Au cours de ce processus deux transferts de brin obligatoires se produisent. Je me suis intéressé au premier transfert de brin dans lequel l'ADN néo-synthétisé migre de l'extrémité 5' du génome vers l'extrémité 3'. Les séquences ADN et ARN principalement impliquées ont été identifiées: il s'agit de l'ARN TAR et de son complémentaire l'ADN cTAR. Ces séquences, longues d'une cinquantaine de résidus, se replient en structures tiges-boucles; l'association TAR-cTAR est facilitée par la protéine de nucléocapside du VIH-1 (NCp7). Dans notre travail, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l'ADN cTAR et à ses I interactions avec la protéine de NCp7. Dans la première partie nous avons étudié la partie supérieure de l'élément cTAR (mini-cTAR: 26 résidus, cette taille a été choisie pour rendre possible l'étude par RMN). Les résultats indiquent que la tige haute (située entre la boucle apicale et la boucle interne) est \ stable, tandis que la tige basse (située entre la boucle interne et l'extrémité libre) est fortement déstabilisée. L'étude des propriétés structurales et dynamiques de la molécule montre que des échanges conformationnels se produisant au sein de la boucle interne seraient à l'origine de la déstabilisation de la tige basse. Les études d'interaction de la NC sur cette molécule nous ont permis de montrer que la NC se fixait sur la séquence T₂₄GG₂₆ située à l'extrémité 3' de la molécule. L'observation d'un nombre important de nOes intermoléculaires et la bonne résolution des spectres nous ont permis de déterminer la structure tridimensionnelle du complexe. La thymine située à l'extrémité 5' interagit avec les résidus du premier doigt de zinc N-terminal et la guanine située à l'extrémité 3' est insérée dans un plateau hydrophobe dans le deuxième doigt de zinc C-terminal. Des comparaisons avec les autres complexes NC:ADN/ARN résolus soulignent que la protéine semble capable de reconnaître la polarité des chaînes d'acides nucléiques (ADN: le premier doigt de zinc reconnaît les résidus d'acide nucléique situés à l'extrémité 5' alors que le deuxième doigt de zinc reconnaît les résidus situés à l'extrémité 3' l'ARN: l'inverse semble se produire). Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de la sélection par la NC du site TGG nous avons entrepris des études de relaxation du isC sur l'élément mini-cTAR. Les résultats, analysés avec le programme MODELFREE montrent que plusieurs guanines non appariées sont impliquées dans des appariements transitoires et ne peuvent donc constituer des sites d'interaction forts. Afin d'examiner l'impact de l'allongement de l'ADN mini-cTAR sur la fixation par la NC, nous avons étudié l'interaction entre la NC(11-55) et Emini-cTAR (33 résidus, une version "allongée" de mini-cTAR). La NC apparaît de nouveau capable de reconnaître avec une certaine préférence une guanine (située dans la boucle interne). Nous observons aussi d'intéressants effets de déstabilisation des structures secondaires par laNC. Les résultats sont discutés en les comparant avec les données de la littérature<br>The NCp7 nucleocapsid protein of HIV-1 has several fonctions during the replication cycle of HIV-1. It is particularly involved in the facilitation of strand transfer that occur during reverse transcription. It consists in a succession of steps that allows the conversion of the single stranded RNA genome in a double stranded DNA. During this process two strand transfer occur. I am interested in the first strand transfer in during which the neo-synthesized DNA migrates from the 5 'extremity of the genome to the 3' extremity. DNA and RNA sequences mainly involved have been identified: the TAR RNA and its complementary DNA cTAR. These sequences, long of about fifty residues, fold in stem-loops structures; the TAR-cTAR association is facilitated by the nucleocapsid protein of HIV-1 (NCp7). In our work, we are particularly interested in cTAR DNA and its interactions with the NCp7 protein. In the first part we have studied the upper part of the cTAR element (mini-cTAR: 26 residues, this size was chosen to make possible the study by NMR). The results indicate that the upper stem (located between the apical loop and internal loop) is stable, while the lower stem (between the internal loop and the free end) is strongly destabilized. Structural and dynamic properties studies of j the molecule show that a conformational exchange occurring within the internal loop could be I responsible for the destabilization of the lower stem. Interaction studies of the NC in this molecule show that the NC binds to the sequence T24GG26 located at the 3 'end of the molecule. The observation of a large number of intermolecular nOes and high resolution spectra permit the resolution of the three dimensional structure of the complex. ! Thymine located at the 5 'end interacts with residues of the N-terminal zinc knuckle and guanine located at the 3' end is inserted into a hydrophobic plateau in the C-terminal zinc knuckle. Comparisons with other complex NC: DNA / RNA resolved show that the protein seems able to j recognize the polarity of the chains of nucleic acids (DNA: the first zinc finger recognizes the nucleic acid residues located at the 5 ' while the second zinc finger recognizes residues located at the 3 'RNA: the reverse seems to happen). To better understand the molecular basis of selection the TGG site by the NC we undertook studies of 13C relaxation of the element mini-cTAR. The results, analyzed with the program MODELFREE show that several unpaired guanines are involved in transient pairing and can not be constitute a strong sites of interaction. To examine the impact of the elongation in DNA mini-cTAR on the binding of the NC, we studied the interaction between NC (11-55) and Emini-cTAR(33 residues, an "extended" version of mini-cTAR). The NC appears again able to recognize with preference a guanine (located in the internal loop). Interestingly, we also observe the destabilization secondary structures by the NC. The results are discussed in comparison with literature data

La protéine NCp7 est une cible potentielle de choix pour une thérapie anti-VIH car elle est impliquée dans de nombreuses étapes du cycle viral, et sa séquence est hautement conservée. En combinant les techniques de spectroscopie de fluorescence et de RMN, nous avons montré que NCp7 modifie la conformation de la boucle de PBS et déstabilise l’extrémité supérieure de la tige. De ce fait, NCp7 active l’hybridation de PBS en stimulant la formation de complexes boucle-boucle, alors qu’en absence de protéine l’extrémité protrudente constitue le site principal de nucléation. Les modifications de la boucle de PBS induites par NCp7 permettent la formation d’homodimères qui jouent probablement un rôle dans la variabilité génétique du virus. Les propriétés spectroscopiques de la 8-vinyl-déoxyadenosine, un analogue fluorescent de l’adénine, ont été étudiées. Par ses propriétés, cette sonde apparaît supérieure à la 2-AP<br>The NCp7 protein is a potential target for an anti-HIV therapy since it is involved in numerous stages of the viral cycle, and its sequence is highly conserved. By combining fluorescence spectroscopy and RMN techniques, we showed that NCp7 modifies the conformation of the PBS loop and destabilizes the upper extremity of the stem. Therefore, NCp7 activates the PBS annealing by stimulating the formation of “kissing complexes”, while in absence of protein, the protruding extremity constitutes the main nucleation site. The modifications of PBS loop inferred by NCp7 also allow homodimers of PBS, which probably play a role in the genetic variability of the virus. The spectroscopic properties of the 8-vinyl-déoxyadenosine, a fluorescent analogue of the adenine, were studied. By its properties, this probe seems superior to the 2-AP

La protéine de la nucléocapside (NC) possède un rôle important dans le cycle de viral du VIH-1 grâce à sa propriété chaperone des acides nucléiques (NA) qui implique la reconnaissance de son résidu Trp37 avec un résidu Guanine de l'acide nucléique cible. Nous avons caractérisé cette reconnaissance dynamique Trp37-G en utilisant des séquences impliquées dans la transcription inverse et l'assemblage de l'ARN génomique. En utilisant les analogues nucléosidiques fluorescents thienoguanosine (thG) et 2-thiényl-3-hydroxychromone (3HCnt), nous avons déterminé l'ensemble des constantes de vitesse cinétiques du mécanisme d’hybridation de la séquence (-)PBS avec (+)PBS en absence et en présence de NC. Nous avons également étudié le rôle du NA sucre dans les complexes NC-ARN et NC-ADN, puisque la protéine NC se lie avec la polarité opposée aux séquences d'ADN et d'ARN. Nous avons confirmé que l'interaction du résidu Trp37 avec les amino-acides de type guanines était critique lors de la formation des complexes avec les deux mutants d’ARN et d’ADN de PBS et de SL3. Enfin, nous avons réalisé un criblage de potentiels inhibiteurs de la protéine NC et examiné les touches identifiées à partir d’un test basé sur la fluorescence de la sonde thG<br>Nucleocapsid protein (NC) plays crucial roles in HIV-1 life cycle through its nucleic acid (NA) chaperoning property that involves recognition of it’s Trp37 residue with a Guanine residue of the target nucleic acid sequences. Herein, we characterized this dynamic Trp37-G recognition with sequences involved in reverse transcription and genomic RNA packaging. Using the fluorescent thienoguanosine (thG) and 2-thienyl-3-hydroxychromone (3HCnt) nucleoside analogues, we determined the whole set of kinetic rate constants for annealing of (-)PBS with (+)PBS in the absence and presence of NC. We also investigated the role of NA sugar in NC-RNA and NC-DNA complexes, as NC binds with opposite polarity to DNA and RNA sequences. We confirmed that the interaction of the Trp37 residue with guanines was critical for the formation of complexes with both RNA and DNA variants of PBS and SL3. Finally, we performed screening of NC inhibitors and tested the selected hits on a thG-based assay

La NCp7 est impliquée dans de nombreuses étapes du cycle viral notamment la rétrotranscription. Ceci en fait une cible potentielle pour un traitement anti-HIV. Par son activité chaperonne, elle permet de stimuler le premier saut de brin. Ce dernier consiste en la déstabilisation et l'hybridation des séquences TAR et cTAR du génome viral. C'est à l'aide de séquences cTAR marquées à leurs extrémités 3' et 5' par des chromophores et différentes techniques de spectroscopie de fluorescence et d'absorption que nous avons pu mettre en évidence l'importance des structures primaire et secondaire de la NCp7 et de cTAR dans le premier saut de brin. L'activité déstabilisatrice est fortement dépendante des bulges et de la boucle interne de cTAR. D'autre part, cette activité dépend également de la présence du Trp37 ainsi que de la présence des deux doigts de zinc de la NCp7 dans leur conformation native. Ensuite, nous avons pu mettre en évidence que la NCp7 favorisait la formation de l'homodimère de mutants de la partie haute de cTAR par formation d'un complexe boucle-boucle. Finalement, nous avons étudié une nouvelle sonde fluorescente analogue à l'adénine (la 8-vinyl-déoxyadénosine) qui est une solution alternative à la 2-aminopurine.