Dissertations / Theses on the topic 'Neovascularización'

Las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en todo el mundo y representan uno de los desafíos primordiales en la investigación biomédica. La aterosclerosis es causante de la mayoría de las enfermedades cardiovasculares. Un factor clave en la evolución de la aterosclerosis subclínica hacia un evento isquémico es la vulnerabilidad de la placa aterosclerótica. No se conocen las causas que producen la rotura de alguna de las placas existentes en el árbol arterial mientras que otras se mantienen estables. Se han observado placas coronarias humanas, asociadas a síndromes coronarios agudos, que presentan una mayor acumulación de neovasos. De hecho, se ha descrito que la angiogénesis dentro de las placas ateroscleróticas puede contribuir a la expansión de la íntima, a la transformación pro-trombótica de las células residentes y a crear un fenotipo de placa hemorrágica inestable. Se han localizado células inflamatorias, especialmente monocitos y macrófagos, en áreas de la placa activamente angiogénicas, así como CEs microvasculares (CEm) dentro del núcleo de una placa aterosclerótica coronaria que expresan altos niveles de FT. El FT es una glicoproteína de membrana, considerado el principal responsable de la cascada de coagulación, que contribuye activamente en la formación de neovasos. Nuestra hipótesis de trabajo es que el FT juega un papel clave en la angiogénesis intraplaca. Creemos que la modulación del FT en las CEs podría regular la capacidad angiogénica de éstas, estimular el reclutamiento de pericitos e inducir la formación de vasos maduros, evitando así las continuas hemorragias, favoreciendo la estabilidad de la placa y disminuyendo los episodios trombóticos. El FT conduce a la formación de vasos sanguíneos por medio de una cascada de señalización. Los resultados obtenidos en esta tesis proponen dos vías de señalización desencadenadas a partir de la expresión de FT en las CEm. Por un lado, FT-Akt-ETS1, que estimulan la formación de neovasos; y por otro, el FT-PAR2-SMAD3 que permite que los vasos sean estables. Además, ambas vías estimulan la expresión de CCL2, una proteína que se secreta al medio e induce el reclutamiento de pericitos y células musculares lisas. La inflamación es uno de los factores más influyentes en la placa aterosclerótica, monocitos y macrófagos ejercen un papel protagonista. Los resultados obtenidos en esta tesis determinan que los monocitos ejercen una función esencial en la angiogénesis, ya que estimulan a las CEm a que expresen FT y formen nuevos vasos por medio de la secreción de la proteína Wnt5a y la activación de una vía de señalización de Wnt no canónica. Además, estos monocitos en estrecho contacto con las CEs van diferenciándose en respuesta a los estímulos angiogénicos. El FT endotelial constituye un estímulo para los monocitos, que responden alterando su fenotipo y expresando marcadores típicamente endoteliales. Este cambio fenotípico de los monocitos sugiere una participación activa en la formación y estabilización de neovasos. De esta manera, los monocitos estimulan a las CEs a expresar FT y formar neovasos. Esta expresión de FT endotelial estimula a los monocitos a expandir la población CD16+ y a expresar características endoteliales. De esta manera se genera un ciclo de retroalimentación positiva donde ambos tipos celulares trabajan para la formación y estabilización de los nuevos vasos formados, con el factor tisular como jugador principal.
Cardiovascular disease is the main cause of death worldwide and it is usually the clinical manifestation of underlying atherosclerosis. Our understanding of atherosclerosis has advanced considerably; however, the factors that contribute to its progression and complication are largely unknown. A key factor in the evolution of subclinical atherosclerosis to an ischemic event is the increased vulnerability of atheromatous plaques. Atherosclerosis is characterized by inflammation and neovascular growth that precipitate plaque rupture and subsequent thrombosis. In fact, inflammation in the vessel wall is now considered to play an essential role in the initiation, progression and final steps of atherosclerosis, namely plaque destabilization and eventually plaque rupture. Increasing evidence shows that high neovessel density in atherosclerotic-plaques is associated with hemorrhagic leaky vessels, unstable plaques and high rate of thrombotic episodes. However the mechanisms responsible for neovessel formation are not understood. It has been described that microvascular endothelial cells (mECs), located in the nuclei of coronary atherosclerosis plaque, express high levels of tissue factor (TF). TF is a transmembrane glycoprotein, considered the main trigger of the coagulation cascade. TF expression has been closely linked to angiogenesis and malignancy. Indeed TF is able to initiate cellular signaling mechanisms leading to alteration in patterns of gene expression. In this study, we hypothesized that TF plays a key role in the angiogenic processes intraplaque. TF upregulates the angiogenic activity of mECs and improves microvessel stabilization. TF signaling may induce the formation of mature new vessels that may prevent continuous hemorrhages and improve plaque stability. TF drives the formation of new capillaries through a signaling cascade. We elucidated two signaling pathways triggered by TF expression in mECs. First, TF through the activation of AKT1 and ERK1/2 induce the activation of ETS1, a transcription factor that promote CCL2 expression. Second, TF forms a complex with factor VII, activates PAR2 and, consequently, the transcription factor SMAD3. SMAD3 presents synergisms with ETS1, and also activates expression of CCL2. CCL2 recruits SMC and pericytes to promote vascular stability. Inflammation is a crucial factor in atherosclerosis plaque formation. We demonstrated that monocytes develop an essential role during angiogenesis, since they stimulate mECs to express TF and to form new vessels through Wnt5a secretion. Wnt5a binds to FZD5 receptors in endothelial membrane and triggers intracellular calcium release and NF-.B activation, through a non-canonical pathway. In addition, monocytes have a tight collaboration with ECs and they response to angiogenic stimuli. Moreover, we have observed that monocytes respond to endothelial TF, developing endothelial properties. Thus, there is a positive feedback cycle generation between monocytes and ECs that promotes the formation and stabilization of new vessels.

Evalúa los efectos de la administración intraestromal de Bevacizumab (Avastin) en un modelo de neovascularización corneal en conejos. 10 conejos albinos (neozelandeses) con peso promedio 2.500 gr anestesiados con inyección intramuscular de ketamina 10 mg/Kg peso y tópica (Hidroclorato de Proparacaína 0.5%). Se colocaron 3 suturas con seda 7/0 a nivel de estroma corneal en cuadrante temporal superior en ambos ojos. Cuantificamos la formación de neovasos teniendo como referencia el tamaño de la sutura. Se evaluó los modelos experimentales en lámpara de hendidura en diferentes tiempos: antes de la inducción de la neovascularización, a los 3 días, a los 7 días, a los 14 días y a los 19 días cuando se colocó en Bevacizumab intraestromal: 0.1 ml (25mg/ml) en el ojo derecho, quedando el ojo izquierdo como control; y se evaluaron a los 7, 16 y 22 días post inyección. En éste último día se realizó la enucleación de ambos ojos que fueron llevados a anatomía patológica para ser evaluadas. Del total de 8 conejos: 8 ojos derechos (casos) y 8 ojos izquierdos (controles) se obtuvo una media de 4.75 en número de neovasos corneales con una desviación estándar de 2.76, en comparación con los casos controles cuya media fue 9.25 con una desviación estandar de 3.99, datos estadísticamente significativos. En cuanto a la profundidad, 100% de los casos mostraron vasos superficiales mientras que 100% de los controles se hallaron en el estroma corneal profundo. En cuanto a la longitud del neovaso más largo se obtuvo una media de 1.18mm con una desviación de 0.70 versus una media de 2mm con 1.16 de desviación media, resultado que no resultó significativo. Otros datos tales como la hiperemia y el edema corneal no mostraron diferencias estadisticamente significativas por lo que no fueron relevantes para nuestro estudio. Se concluye que el modelo de neovascularización corneal el Bevacizumab (Avastin) intraestromal redujo significativamente en número y la profundidad de los neovasos corneales.
Trabajo académico

La formación de vasos sanguíneos a partir de otros preexistentes, o angiogénesis, es un proceso esencial en el desarrollo del tejido normal. La mayor parte de la angiogénesis fisiológica ocurre en la etapa embrionaria, y en el adulto, el endotelio vascular es un tejido con un bajo índice de proliferación. Sin embargo, los ovarios presentan cíclicamente procesos asociados a angiogénesis. En el ovario, la angiogénesis acompaña al desarrollo folicular y a la formación del cuerpo lúteo, y de no existir concepción, esta red vascular involuciona. La extraordinaria rapidez con que los vasos sanguíneos aparecen y son reabsorbidos en cada ciclo ovárico, hace de este sistema un modelo ideal para el estudio de los elementos regulatorios de la angiogénesis, por lo que su mejor comprensión podría significar un gran avance para la investigación de la angiogénesis en eventos fisiológicos y patológicos. Distintos elementos regulan la angiogénesis en el ovario y otros tejidos. Entre ellos, el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF[beta]) han sido asociados a eventos importantes en la angiogénesis ovárica fisiológica y patológica. El factor de crecimiento nervioso (NGF) también se ha relacionado con angiogénesis en otros tejidos, como el ganglio cervical superior en ratas neonatas. Además este factor gatilla la proliferación de células endoteliales humanas. NGF, a través de sus receptores trkA y p75, ejerce acciones esenciales tanto en el desarrollo ovárico como en la función del ovario. De hecho, NGF está presente en el ovario humano desde la etapa fetal. Sin embargo, se desconoce si NGF participa en la angiogénesis ovárica. Por otra parte, NGF modula la expresión de TGF[beta]1 y VEGF en distintos tipos celulares, pero tampoco se sabe si en el ovario dicha expresión es regulada por esta neurotrofina. En esta Tesis se propuso estudiar la participación de NGF como factor angiogénico en el ovario, y su acción en los niveles de proteína y mRNA de los factores VEGF y TGF[beta]1. Para cumplir con este objetivo, se trabajó con ovarios de ratas neonatas cultivados con NGF, ovarios de ratones neonatos NGF-deficientes (NGF KO), ratas prepúberes con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y ratones transgénicos prepúberes que sobreexpresan NGF en el ovario. Se analizaron los niveles de mRNA y/o proteína de VEGF y TGF[beta]1 en los ovarios de estos animales. También se cultivaron células de granulosa humana y se estimularon con NGF, para luego determinar los contenidos de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 y los niveles de proteína secretada en el medio de cultivo. Los resultados obtenidos en ovario de roedores y en el cultivo de células de granulosa indican que NGF incrementa tanto el mRNA como la proteína de VEGF. Los niveles de TGF[beta]1 no se modificaron por NGF en los modelos estudiados. Con el objetivo de conocer el mecanismo mediante el cual NGF induce los cambios observados en el ovario, se estudió la participación de trkA, el receptor de alta afinidad para NGF. Se analizaron ovarios de ratones neonatos trkA-deficientes (trkA KO). Se determinó que en estos animales el contenido de mRNA de VEGF y TGF[beta]1 es similar al encontrado en ratones silvestres, probablemente por un sistema de compensación que involucra el aumento de la expresión p75, el receptor de baja afinidad para NGF. También se analizó el efecto de K252a, inhibidor del receptor trkA, en células de granulosa humana tratadas con NGF. La preincubación con el inhibidor revirtió en forma significativa el aumento de mRNA y proteína de VEGF inducido por NGF. A continuación, se quiso saber si NGF inducía la activación de MAPK asociadas a la fosforilación del receptor trkA en el ovario, y si la producción del mensajero o proteína de VEGF y TGF[beta]1 dependía de esta vía de señalización. Para estudiar esto se utilizó el modelo de células de granulosa humana en cultivo. Análisis de western blot mostraron que hubo un incremento significativo en la proporción de proteínas ERK 2 fosforiladas respecto de ERK 2 totales, luego de 5 minutos de estimulación con NGF. Además, el incremento en la expresión de mRNA y proteína de VEGF fue prevenido por la incubación previa con U0126, un inhibidor de la proteína MEK, responsable de la fosforilación de ERK 1/2. El factor de transcripción HIF1 es uno de los responsables de la activación transcripcional de VEGF como respuesta a la hipoxia, pero también frente al estímulo con factores de crecimiento. No se produjo un cambio en el contenido de mRNA de la isoforma inducible de HIF1, HIF1[alfa] en células de granulosa humana estimuladas con NGF 50 ng/ml por 8 horas. Sin embargo, en ovario de rata neonata en cultivo, el contenido de mRNA de HIF1[alfa] aumenta en los tejidos estimulados con NGF por 2 horas. Finalmente, se quiso verificar si existían acciones indirectas de NGF sobre la proliferación de células endoteliales, a través del aumento en los niveles de VEGF. Para esto se realizó un ensayo de angiogénesis in vitro, en el cual el medio condicionado de células de granulosa tratadas con NGF se utilizó para estimular células endoteliales provenientes de cordón umbilical humano (células HUVEC). El medio condicionado no indujo mayor proliferación de células endoteliales, probablemente debido a que la concentración de VEGF en éste era muy baja para estimular la proliferación en las células HUVEC. Sin embargo, es muy importante destacar que estudios in vivo realizados en ratas con niveles ováricos elevados de NGF, inducidos por denervación, y en ratones transgénicos que sobreexpresan NGF en el ovario, demostraron que esta neurotrofina es capaz de incrementar la vascularización en ovario de roedores prepúberes. Los resultados aquí reportados no permiten establecer si el efecto de NGF sobre la vascularización ovárica es una consecuencia del aumento de VEGF. La señalización de NGF es esencial para la ovulación. Por otra parte, se produce un marcado aumento de la expresión ovárica de VEGF en la etapa periovulatoria. Los resultados presentados indican que NGF es capaz de aumentar la expresión de VEGF y la vascularización ovárica. De acuerdo con lo anterior, existiría una asociación entre el alza periovulatoria de NGF, y el aumento de VEGF y de los capilares ováricos. Esto podría tener importantes aplicaciones en el área de la medicina reproductiva y las terapias contra el cáncer, ya que amplía la información acerca de los elementos reguladores de la angiogénesis en el ovario.

Se analizó la utilización de medicamentos biológicos ranibizumab (2,3mg/0.23mL) y bevacizumab (400mg/16mL) en el Servicio de Oftalmología del Hospital Nacional Edgardo Rebagliati Martins durante el periodo mayo 2011-mayo 2012, utilizando el análisis descriptivo-retrospectivo de los reportes de consumo de Farmacia, hoja de trabajo de la Unidad de Mezclas Oncológicas e historias clínicas. Los objetivos de este estudio fueron: determinar el consumo cuantitativo y los costos del ranibizumab y bevacizumab, los resultados de la utilización de los medicamentos biológicos y describir los esquemas de tratamiento. De los 194 pacientes tratados con los medicamentos de estudio, 160 tenían como diagnóstico degeneración macular relacionado con la edad (DMRE) exudativa, 89 del sexo femenino y 71 de sexo masculino de los cuales el 55,6% están dentro del grupo etario 66-80 años. En total, se administraron 319 dosis (319 viales) de ranibizumab y 83 dosis (12 viales) de bevacizumab generando un gasto de S/. 907992,6 nuevo soles de los cuales, aproximadamente, el 93.3% lo genera el ranibizumab. El costo promedio el tratamiento farmacológico de la DMRE exudativa con ranibizumab es S/.5310,00 y con bevacizumab es S/.606.88 nuevo soles. Los pacientes con DMRE exudativa tratados con ranibizumab + bevacizumab y ranibizumab tuvieron una buena evolución en un 32% y 22% respectivamente. La principal prescripción del ranibizumab como monoterapia y en combinación con bevacizumab fue DMRE exudativa y para el bevacizumab (monoterapia) fue retinopatía diabética y edema macular. La DMRE exudativa fue tratada como mínimo 1 mes y como máximo por 12,4 meses durante el cual se administraron en promedio 2,3 números de dosis con intervalos de tiempo que va de 0,9 meses a 9,9 meses de una dosis a otra.
--- The use of biological drugs Ranibizumab (2,3mg/0,23ml) and Bevacizumab (400mg/16ml) was analyzed at the Ophthalmology Service from the National Hospital Edgardo Rebagliati Martins during the period May 2011 – May 2012, using the descriptive – retrospective analysis of the consumer reports of Pharmacy, worksheet of the Oncological Mixtures Unit and medical records. The objectives of the study were: determine the quantitative consumption and the costs of Ranibizumab and Bevacizumab, the results using biological drugs and describe the treatment schemes. Of the 194 total patients treated with the study drugs, 160 had a diagnosis of macular degeneration associated with age (MDAA) exudative, 89 of them female sex and 71 male sex of which 55,6% are in the age group of 66 – 80 years old. A total of, 319 doses (319 vials) of Ranibizumab and 83 doses (12 vials) of Bevacizumab were administered generating an expense of S/. 907992,6 of which approximately 93.3% was generated by Ranibizumab. The average cost for the pharmacological treatment of MDAA exudative with Ranibizumab and Bevacizumab are of S/.5310,00 and S/.606,88 respectively. The patients with MDAA exudative treated with Ranibizumab + Bevacizumab and with just Ranibizumab had a good performance by 32% and 22% respectively. The main prescription of Ranibizumab as monotherapy and in combination with Bevacizumab was for MDAA exudative, and of Bevacizumab (monotherapy) was for diabetic retinopathy and macular edema. The MDAA exudative was treated 1 month as minimum and 12,4 months at the most during which were administered an average of 2,3 numbers of doses with time intervals of 0,9 months up to 9,9 months between each dose. Key words: Ranibizumab, Bevacizumab, antiangiogenic agents, macular degeneration associated with age exudative and choroidal neovascularization.
Tesis

La presente tesis tiene como objetivo principal el desarrollo de un controlador de presión de oxígeno contenido dentro de una cámara hiperbárica que no cuenta con cierre hermético, para que la misma pueda cumplir con las necesidades mínimas indicadas por los especialistas, que serán presentadas en el capítulo 1, de manera óptima, durante el tiempo de tratamiento. Para la elección del controlador se realizaron pruebas experimentales con un microcontrolador PIC, para los diversos tipos de control (P, PI, PD y PID), y, al mismo tiempo, pruebas simuladas con la herramienta Simulink, del programa MATLAB. Además, fueron comparados dos métodos para el diseño del controlador: el método de la respuesta al escalón de Ziegler-Nichols y el método del ángulo faltante. Con los resultados obtenidos, se logró demostrar que es posible compensar las fugas de oxígeno y mantener, el mayor tiempo posible, la presión de trabajo constante, según las especificaciones de los médicos. Finalmente, se concluye que el controlador adecuado para esta aplicación, es el control PID desarrollado con el método de Ziegler-Nichols, por su menor sobreimpulso, menor tiempo de establecimiento y su efecto de corrección del error (eliminación offset).
This thesis' main objective is to develop a controller for the pressure generated by the oxygen contained inside a hyperbaric chamber with no hermetic seal, so that it can accomplish optimally the requisites indicated by the specialists (which will be shown in chapter 1),during the treatment. For the election of the controller, experimental tests were carried out with a PIC microcontroller for the different types of control (P, PI, PD, and PID), as well as simulated tests with MATLAB's Simulink tool. Additionally, two methods for controller design were compared: Ziegler-Nichols' step response method and the root locus approach. With the obtained results, it was demonstrated that the oxygen leaks were able to be compensated, maintaining the pressure operation point constant as much as possible in accordance with the medics' specifications. Finally, it is concluded that the adequate controller for this application is the PID controller designed with Ziegler-Nichols' method due to its smaller overshoot, its smaller settling time and its error correction effect (offset elimination).
Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La preeclampsia es un síndrome caracterizado por remodelación anormal de las arterias espirales, defectuosa vasculogénesis y disfunción en el endotelio vascular materno. Sus características clínicas más importantes son: hipertensión y proteinuria. El objetivo de este estudio fue evaluar el valor predictivo de marcadores bioquímicos relacionados con angiogénesis y estrés oxidativo sobre la ocurrencia de esta enfermedad. Se invitó a participar de este estudio a mujeres embarazadas entre las 11 – 14 semanas y se obtuvieron muestras de sangre que se congelaron hasta ser analizadas. Se seleccionaron todas las muestras de sangre de embarazos preeclámpticos (n=32) y cinco controles para cada caso provenientes de embarazos normotensos (n=143). El análisis multivariado mostró que solamente dos marcadores bioquímicos (sFlt1 y PlGF) y uno clínico (IMC) son independientes y significativamente predictores de la aparición de preeclampsia a las 11-14 semanas de gestación. Además, se demostró que la combinación de éstos, pueden predecir en el primer trimestre de la gestación a más de las mitad de las mujeres que desarrollarán preeclampsia, con solo un 10% de falsos positivos

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La angiogénesis es la generación de nuevos capilares a partir de vasos sanguíneos pre-existentes. Fisiológicamente, se produce sólo en casos excepcionales (inflamación crónica, ciclo menstrual, cicatrización, etc.), y es un mecanismo fundamental para el crecimiento de un tumor, desde los 2 mm3. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. CRT humana (HuCRT) y su dominio N- terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis, inhibiendo así la proliferación de células endoteliales. Anteriormente, en el Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (LIAM), se ha descrito que CRT de Trypanosoma cruzi (TcCRT) es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo (CAM). Estas propiedades también son expresadas por TcCRT y su dominio N-terminal, en ensayos ex vivo e in vitro, en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies de mamíferos, Rattus rattus y Homo sapiens sapiens. Este efecto se correlaciona, en experimentos in vitro, con la inhibición de la morfogénesis capilar, la proliferación y la migración de las células endoteliales y con la internalización de TcCRT por estas células, también descrito en el LIAM. El objetivo general de este estudio fue validar los resultados antiangiogénicos de TcCRT obtenidos in vivo en aves, así como los generados in vitro y ex vivo, con varias especies de mamíferos, usando ahora un ensayo in vivo en un modelo mamífero. Esto se basa en la posibilidad de que las moléculas que regulan la angiogénesis pueden actuar de forma diferente en diferentes especies. Matrigel es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Entre los ensayos in vivo descritos para medir la angiogénesis, está el ensayo de tapón de Matrigel, que se utilizó en esta investigación, que se basa en la siguiente hipótesis: Dadas las propiedades antiangiogénicas que TcCRT expresa en una variedad de ensayos in vitro, ex vivo, en células mamíferas y, también in vivo en aves, entonces, TcCRT inhibirá la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en mamíferos (Mus musculus). Los objetivos específicos para satisfacer esta hipótesis, fueron: 1. Estandarizar el ensayo de tapón de Matrigel in vivo para medir angiogénesis, 2. Estandarizar la concentración de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) por tapón de Matrigel, 3. Determinar la presencia de TcCRT recombinante (rTcCRT) y HuCRT recombinante (rHuCRT) en extracto proteico de tapones de Matrigel, y 4. Cuantificar el efecto de rTcCRT y rHuCRT sobre la angiogénesis en el modelo in vivo de tapón de Matrigel en ratón. 500μl de Matrigel, que contiene 300ng de bFGF (para promover la infiltración de células endoteliales), fueron inoculados por vía subcutánea a ratones C57BL/6. Siete días más tarde, fue posible diseccionar y analizar los tapones, tanto inmunológica e histológicamente. Además, los anticuerpos mono y policlonales, anti-TcCRT y anti- HuCRT reconocieron las proteínas recombinantes en extracto proteico de tapón de Matrigel. rHuCRT y rTcCRT inhibieron la proliferación de células endoteliales promovido por bFGF en los tapones de Matrigel. En síntesis, se demostró que TcCRT inhibe la migración de células endoteliales a una matriz fisiológica semisólida, tal como el Matrigel ubicado subcutáneamente en ratones. Dado que la migración de células endoteliales es un pre-requisito para la morfogénesis capilar, es muy probable que este ensayo se correlacione con la capacidad de inhibición que la molécula parasitaria ejerce in vivo sobre el crecimiento tumoral. Este es el primer estudio que define un efecto antiangiogénico para la calreticulina parasitaria, in vivo en mamíferos. Aun cuando, más indirectamente, este efecto podría correlacionarse con las propiedades antitumorales de T. cruzi, reportadas por otros laboratorios, y recientemente confirmadas en el LIAM

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Evalúa los resultados del tratamiento con ranibizumab en 2 años de seguimiento. Fueron revisadas las historias clínicas de los pacientes sometidos a tratamiento de la membrana neo vascular asociada a la DMAE, durante los años 2011-2012, consignando los datos estadísticos sexo, edad, AV pre tratamiento, AV post tratamiento, grosor macular central pre y post tratamiento, complicaciones oculares y sistémicas. Se trataron 83 pacientes el 51,8% masculinos, mientras que el 48,2% femenino. Con una edad media de 73,36, siendo el pico de la prevalencia de la enfermedad entre los 65-85 años. La media del número de dosis fue de 4,52 por persona; La media de agudeza visual antes del tratamiento fue de 0, 1923 (Snellen= 20/104), y luego del pos tratamiento de 0, 3429 (Snellen= 20/58), lo que representa una ganancia media de 10 letras, luego de concluido el tratamiento (p=0,00). El espesor macular tiene una media de 408,57 micras antes del tratamiento versus una media de 324,16 micras luego de instalado el tratamiento, con una variación media de 84,4 micras (p=0,00). No se reporto ninguna complicaciónes ocular ni sistemicas secundarias al uso de ranibizumab. La enfermedad sistémica coexistente más frecuente fue la hipertensión arterial 36,1 %, diabetes mellitus 9,6%, otras fueron la obesidad, enfermedad renal crónica (1,2%), y un grupo de pacientes que fue el 53,0% no tuvo comorbilidad co-existente. El tiempo de seguimiento medio es de 19,7 meses. El resultado del tratamiento con ranibizumab de la membrana neovascular asociada a la DMAE es la mejora de la agudeza visual y no asociada a complicaciones oculares o sistémicas en el presente estudio.
Trabajo académico

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología
Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger.Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer.

La degeneración macular asociada a la edad (DMAE) es una de las principales causas de ceguera legal en adultos de países desarrollados. Actualmente, todos los tratamientos disponibles para la DMAE exudativa están dirigidos a detener la pérdida de la visión, no habiendo tratamientos que puedan revertir el daño. La progresión de la DMAE exudativa depende de la disregulación entre factores pro- y anti- angiogénicos, con un aumento de los niveles de VEGF y una disminución de los niveles de PEDF. Desarrollar una terapia no invasiva y eficaz para el tratamiento de la DMAE húmeda basada en una fracción activa de PEDF (faPEDF), permitiría mejorar la seguridad y comodidad de aplicación del tratamiento abriendo una nueva vía terapéutica. El objetivo principal de este proyecto es evaluar la eficacia de la administración de una faPEDF sintética por vía tópica con el fin de determinar una nueva vía terapéutica para la neovascularización coroidea (NVC) secundaria a DMAE. En una primera fase in vitro se determinará el efecto antiangiogénico de las diferentes faPEDF mediante ensayos de migración celular, formación tubular y proliferación celular en cultivos primarios de células endoteliales. En una segunda fase in vivo se desarrollará un modelo animal de NVC en ratones como modelo plausible de NVC asociada a DMAE, se valorará el efecto de la administración tópica de la faPEDF en el control de las lesiones neovasculares en el modelo animal y se evaluaran los efectos antiinflamatorios, antiangiogénicos y neurotróficos en la retina de ratón tratada con la faPEDF. Las faPEDF2 y faPEDF3 se mostraron eficaces inhibiendo los efectos del VEGF, la formación tubular, la migración y proliferación celular. La realización de láser verde 532nm con parámetros de 250mW de potencia, 100ms de duración y 50 micras de tamaño de spot fue el modelo más adecuado y reproducible de NVC en ratón. Finalmente, la administración diaria de la faPEDF3 en forma de colirio a una concentración de 1 mg/ml en ratones causó una mayor reducción de la superfície de NVC respecto al placebo y también provocó una disminución en la expresión de VEGF en los ojos tratados respecto al placebo.
Age related macular degeneration (AMD) is a leading cause of legal blindness in adults in developed countries. Currently, all available treatments for wet AMD are aimed at stopping the loss of vision, having no treatment that can reverse the damage. The progression of exudative AMD depends on the dysregulation between pro and anti-angiogenic factors, with increased levels of VEGF and decreased levels of PEDF. Developing a noninvasive and effective therapy for the treatment of wet AMD based on an active fraction of PEDF (afPEDF) would improve the safety and comfort of applying the treatment, enabling a new therapeutic approach. The main goal of this project is to evaluate the effectiveness of the administration of a synthetic afPEDF topically in order to determine a new therapeutic approach for choroidal neovascularization (CNV) secondary to AMD. In a first stage, in vitro assays will be performed to determ the antiangiogenic effect of the different afPEDF by cell migration assays, cell proliferation and tube formation in primary cultured endothelial cells. In a second phase, CNV will be developed in vivo in an animal model of mice as a plausible model of CNV associated with AMD. The effect of topical administration of afPEDF among neovascular lesions in the animal model will be assessed, and inflammatory, angiogenic and neurotrophic effects in the retina of mice treated with faPEDF will be also evaluated. Both afPEDF2 and afPEDF3 were effective in inhibiting the effects of VEGF, tube formation, migration and cell proliferation. Performing 532nm green laser with parameters of 250 mW, 100 ms duration and 50-micron spot size was the most suitable and reproducible model of CNV in mice. Finally, daily administration of afPEDF3 drops at a concentration of 1 mg / ml in mice caused a greater reduction in the area of CNV over placebo and also caused a decreased expression of VEGF treated eyes when compared to placebo.

Angiogenesis is the formation of blood vessels from the pre-existing ones and is required for distributing nutrients and oxygen to the tissues through the blood flow. This process is important for tumour tissues as well, which recruit the neighbouring blood vessels for their survival and propagation, the process termed as tumour angiogenesis. Endothelial cells are those that line the blood vessels and are the key players in the process of angiogenesis. Many anti-angiogenic therapies based on targeting the pro-angiogenic factors have not shown to be completely effective against the tumour vessels and pose adverse side-effects. Since metabolism is the downstream effect of any type of cellular induction, exploring metabolic reprogramming of endothelial cells during angiogenic induction could provide alternative therapeutic strategies for targeting tumour angiogenesis. VEGF is identified to be one of the most versatile and potent pro-angiogenic factors for its roles in multiple steps of blood vessel formation. Hypoxia has also been found to be a key regulator of angiogenesis and has been identified to induce a higher production of VEGF by the tumour and stromal cells. Thus in this thesis we present our observations upon exploring the metabolic reprogramming of endothelial cells in the presence of different stimulating factors to understand their effects in the central carbon metabolic pathways. 1. In the first part of the study, methodologies like the tracer-based metabolomics and fluxomics have been used to explore the effects of external factors like hypoxia and VEGF on endothelial cell metabolism. The results revealed a major metabolic adaptation induced by hypoxic condition compared to normal oxygen condition and a subtle, but disctint changes induced by VEGF under both normoxia and hypoxia in endothelial cells. VEGF also showed a major metabolic effect in glycogen metabolism of endothelial cells which has not been explored in detail in the past. 2. In the next part of the study the direct effect on metabolic pathways upon growing endothelial cells with tumour cells has been explored for the first time. This preliminary observation was made by growing endothelial cells with tumour cells that possessed distinct metastatic abilities of low and high metastasis. It was observed that endothelial cells grown with low metastatic tumours showed changes in metabolic pathways similar to those changes by VEGF, and the high metastatic tumour showed a completely distinct metabolic change reiterating the metastatic characteristics, compared to the other. This pioneering study has revealed that even the same types of tumours, when distinct only by their invasive and metastatic abilities, can cause different metabolic adaptations in their neighbouring cells, especially revealing the changes in endothelial cells. 3. In addition to the above observations we found that glycogen metabolism is active in endothelial cells and targeting the glycogen degradation reduced endothelial cell viability and functions related to angiogenesis in the in vitro and in vivo studies, which showed that targeting glycogen metabolism can be an alternative strategy against tumour angiogenesis. 4. A general characterization of glycogen metabolism in endothelial cells was performed to understand this pathway in detail. This part of the study has revealed the characteristics of the key enzymes related to glycogen metabolism and the changes in their activities following environmental perturbations like differing glucose and oxygen contents. The glycogen metabolism in endothelial cells has not been explored before and this study emphasizes the importance of regulating the environmental factors when this metabolic pathway is considered as a target for anti-angiogenesis. Thus these observations provide us clues on exploring metabolic targets as alternative anti-cancer therapies by affecting endothelial cell viability and function, which in turn will affect the angiogenic process.

Class IA PI3K (PI3K) functions have been widely investigated over the last two decades. PI3K signalling is located at the crossroads of many cell surface receptors sending signals to coordinate multiple cellular functions such as cell growth, survival, motility, and metabolism. Fine-tune regulation of PI3K signalling in cells is needed to ensure the functionality of tissues and organs. However, it is still not clear how or even which PI3K isoforms are concerted into precise morphogenic events. On the other hand, PI3K activity plays central roles in several cellular processes critical for cancer progression. Hence, PI3K pathway inhibition is considered an important target for therapeutic intervention in cancer, and progress in the clinical area is being monitored by many clinical trials with PI3K inhibitors. We were interested in investigating the role of PI3K activity in endothelial cells during the process of angiogenesis. Although ECs express all class I PI3K isoforms, only inactivation of the catalytic subunit p110α in endothelial cells (not p110β or p110δ inactivation) leads to vascular defects in the embryo (Graupera et al. 2008). This indicates that p110α activity in ECs is required in a cell- autonomous manner to ensure proper vascular development and remodelling during the embryogenesis. However, progress in the understanding of how p110α-PI3K signalling regulates the different steps of vascular morphogenesis has been hampered by embryonic lethality that both the constitutive and endothelial specific p110α mutant mice exhibit. By using a tamoxifen-inducible endothelial Cre line in mouse and genetic and pharmacological approaches in zebrafish embryos, we have found that p110α signalling is required to maintain vessel stability. The lack of p110α activity leads to endothelial tubular structures composed of single cells that show an elongated shape with multiple protrusions and no lumen. These ECs fail in the elongation of the inter-endothelial contacts during the sprout outgrowth. Furthermore, I found that p110α is involve in the initial steps of fusion and is necessary for proper establishment of a new connection. Finally, I identifyed that p110α negatively controls actomyosin contractility independently of Rho/ROCK signalling pathway and that this control could be exerted through the regulation of MLC phosphatase activity by the impact on mRIP and/or MYPT proteins.
La señalización PI3K de clase IA se requiere de una manera autónoma en células endoteliales para el correcto crecimiento de los vasos sanguíneos. Aunque las células endoteliales expresan todas las isoformas de la clase IA de PI3Ks, sólo la subunidad catalítica p110α es necesaria para la angiogenesis fisiológica. Sin embargo, poco se sabe sobre el papel de p110α -PI3K en las diferentes etapas de la morfogénesis vascular. Mediante la generación de una línea inducible Cre endotelial de ratón y la inactivación genética y farmacológica de la proteína en embriones de pez cebra, hemos encontrado que la señalización a través de la proteína p110α es necesaria para mantener la estabilidad del los vasos sanguíneos. La falta de la actividad de la proteína p110α da lugar a la formación de una vasculatura aberrante formada por estructuras endoteliales muy delgadas compuestas por células individuales que emiten múltiples protrusiones y carecen de lumen. Durante la elongación del nuevo brote vascular las células endoteliales no puede elongar la superficie de adhesión entre células endoteliales y por tanto no pueden sufrir reordenamientos necesarios para el crecimiento del nuevo vaso. También hemos visto que la proteína p110α está implicada en la estabilización de los nuevos contactos durante el proceso de anastomosis vascular y su inactivación da lugar a inestabilidad vascular y la aparición de desconexiones en entre vasos. La falta de la proteína p110α se asocia con un aumento en la formación de los cables de actina cortical e hiperfosforilacion de la cadena ligera de la miosina. Por tanto, identificamos que la ruta de señalización p110α-PI3K controla negativamente la contractilidad de las fibras de actomiosina de forma independiente a la via de señalización Rho-ROCK y que este control podría ser ejercido a través de la regulación de la actividad de la fosfatasa MLC a través de las proteínas mRIP y/o MYPT1.

La hipertensió portal és una síndrome clínica caracteritzada per un augment de la pressió en el sistema venós portal hepàtic. Les malalties cròniques del fetge, i més concretament la cirrosi hepàtica, són la principal causa d’hipertensió. Estudis recents han demostrat que la neovascularització patològica juga un paper molt important en la fisiopatologia de la hipertensió portal contribuint a l’augment del nombre de vasos al territori esplàncnic i a la formació dels vasos portocol·laterals. Els vasos col·laterals portosistèmics amb més importància en la hipertensió portal són les varius gàstriques i les esofàgiques, i són les responsables d’una de les complicacions més severes d’aquesta síndrome: el sagnat gastrointestinal agut. El desenvolupament dels vasos portocol.laterals és un procés complex i dinàmic que implica la reobertura de canals col·lapsats d’origen embrionari i la formació de novo de nous vasos, a través de fenòmens actius d’angiogènesi. Conèixer bé com es formen aquests vasos, aprofundir en els mecanismes i molècules reguladores d’aquests processos i dissenyar una estratègia terapèutica innovadora i segura per disminuir aquesta vasculatura patològica són els objectius generals que justifiquen la present tesi doctoral. D’aquesta recerca han sorgit dos estudis, dels quals en presento les seves hipòtesis, objectius i resultats particulars: ESTUDI 1: Identificació i caracterització de cèl·lules progenitores vasculars i el seu possible paper en la neovascularització associada a la hipertensió portal. Identificar i caracteritzar en profunditat aquesta població en el territori vascular esplàncnic, ja sigui en el teixit in situ o bé aïllada en cultiu cel·lular. Estudiar si aquesta població s’activa i participa de manera directa en la neovascularització associada a la hipertensió portal, contribuïnt a la nova vasculatura patológica, i esbrinar si la proteïna reguladora de la traducció CPEB4 hi té un paper determinant. Els resultats d’aquest primer estudi demostren l’existència d’una població progenitora resident en les diferents capes del vas sanguini que és capaç de sortir de la quiescència, activant-se i incorporant-se de manera directa en els nous vasos sanguinis que sorgeixen durant la progressió de la malaltia. L’estudi també demostra que la proteïna CPEB4 té un paper en la quiescència/ proliferació de les cèl.lules amb caràcter progenitor. ESTUDI 2: Inhibició específica per teràpia gènica de VEGFR2 en cèl·lules endotelials en ratolins amb hipertensió portal. Validar l’eficàcia de les seqüències d’ARN interferent dissenyades per reduir l’expressió proteica dels nivells de VEGFR2 “in vitro” i “ in vivo” així com testar-ne la seva captació específica mitjançant liposomes o complexes lipídics. Analitzar també els efectes i el potencial terapèutic del tractament amb ARN interferent per a VEGFR2 sobre la neoangiogènesi i la hipertensió portal. Els resultats d’aquest estudi demostren que l’ús de seqüències d’ARN interferent contra l’expressió de VEGFR2 poden reduir dràsticament la col·lateralització portosistèmica si aquesta s’aplica de manera preventiva. Aquest silenciament redueix tant el nombre de vasos nous del territori extra-hepàtic com el remodelat dels vasos que ja es coneixia que ocorria durant la progressió de la malaltia, sense tenir efectes en la homeòstasi dels vasos preexistents. En conclusió, aquesta tesi doctoral pretén aprofundir en els mecanismes moleculars i cel·lulars de la nevovascularització ocorreguda durant el desenvolupament de la hipertensió portal per tal de poder oferir noves dianes terapèutiques en relació a les malalties cròniques del fetge.
Portal hypetension (PH) is the most important complication of chronic liver disease. PH is characterised by increased portal pressure and portosystemic collateral vessel formation. Recent studies have demonstrated that pathological neovascularisation plays an essential role in multiple aspects and even in formation and remodelling of collateral vessels, responsibles of many complications in chronic liver diseases. Understanding the mechanisms regulating pathological neovascularisation and lay the foundation for improved targeting therapy, innovative and safe, are the main objectives for this doctoral thesis. In particular, two studies comprise the current thesis. The justifications, objectives and results of both studies are summed up below: 1. To identify and charcterize a vascular wall-resident stem/progenitor population with vasculogenic potential and an active role in the neovascularization during development of chronic portal hypertension. To find out the role of the regulatory protein CPEB4 in that pathological events. The results demonstrate that adult healthy mesenteric vessels harbour a population of vascular resident progenitor cells that proliferate, differentiate into vasculogenic cell types and structurally functionally contribute to abnormal neovessel formation during chronic portal hypertension. Mechanistically, the CPEB4 protein is an important factor responsable for the proliferative activity of that cell population. 2. To investigate the therapeutic potential of an innovative liposomally-formulated short-interfering RNA (siRNA) capable to attenuate the production of the receptor of VEGF, KDR or VEGR2, in order to reduce the portosystemic collateralization and ameliorate the complications of portal hypertension. The findings of that study demonstrate that the therapy with si RNA KDR-lipoplexes is capable to efficiently and specifically target KDR expression in vascular endothelial cells in vivo, reducing notably the formation and remodelling of potosystemic collateral vessels in portal hypertension. That therapeutical strategy works on a sufficient magnitude to induce therapeutic effects but not a complete dissapearance of KDR, very important to maintain vascular homeostasis of healthy vessels. In conclusion, the present doctoral thesis aimed to deepen in molecular and cellular mechanisms involved in the formation and remodelling of vascular vessels that occur during portal hypertension. The findings unveiled in these studies could be relevant to design new therapeutic options in the chirrosis and chronic liver diseases field.

Role of TGFβ in physiological angiogenesis and ovarian cancer Transforming Growth Factor Beta (TGFβ) is a signalling pathway involved in a wide range of cellular processes such as proliferation, differentiation, angiogenesis, migration and homeostasis. In addition, it has been broadly related with pathological situations like cancer or other diseases. In this thesis we have been focused on two of its receptors; the TβRI called ALK5, ubiquitously expressed, and ALK1, an endothelial cell-restricted receptor. In the first part of this work we have studied the role of ALK1 in angiogenesis. Loss of function mutations in ALK1 cause a subtype of hereditary haemorrhagic telangiectasias (HHTs) characterized by vasculature malformations. Currently, there is no suitable treatment to cure these patients. To study the ALK1 role in vascular development, we have used the retina mouse model and seeking to find a treatment for these patients, we have used a mouse model for HHTs. This mouse model has a heterozygous alteration in ALK1, as in homozygosis die at +/- mice resulted in abnormal endothelial cell proliferation mid-gestion. The alteration on ALK1 and increased retinal vessel width without affecting pericyte coverage, migration or elongation of the ECs. We have shown that genetic and pharmacological inhibition of PI3K signalling +/- abolished the increase in vessel width in ALK1 retinas and normalized vasculature. Overall, our results suggest the potential for using PI3K inhibitors as new therapeutic agents for treating HHTs. In the second part of this work we have searched for new therapeutic targets for treating epithelial ovarian cancer. Firstly, we analysed the TGFβ signalling pathway in these tumours. Using a Tissue Micro Array (TMA) with patient samples we found high Smad2 phosphorylation, a read-out of ALK5 activation, in epithelial ovarian cancer tumoral cells, independently of tumour subtype (high-grade serous or endometrioid). To evaluate the impact of TGFβ receptor inhibition on tumoral growth, we used different models of human epithelial ovarian cancer orthotopically grown in nude mice (OVAs); two high-grade serous carcinoma and one endometrioid carcinoma. We have confirmed that the histological properties and the levels of phosphoSmad2 expression pattern were maintained on the ovarian tumour mouse models compared to its human primary tumours samples. Treatment with a TGFβRI&II dual inhibitor, LY2109761, caused a significant reduction in tumour size in all these models, affecting cell proliferation rate. On the contrary, TGFβ inhibition did not affect ovarian tumour cell capacity to disseminate in our models. We identified Insulin Growth Factor (IGF)1 receptor as the signal positively regulated by TGFβ implicated in ovarian tumour cell proliferation. We have demonstrated that our TMA samples had high IGF1R protein levels and that phosphoSmad2 and IGF1R protein levels significantly positively correlated. Inhibition of IGF1R activity by treatment with a blocker antibody (IMC- A12) or with a tyrosine kinase inhibitor (linsitinib) inhibited ovarian tumoral growth in vivo. At the molecular level TGFβ signalling positively controls IGF1R levels by two mechanisms. Induction of mRNA IGF1R levels in some cell lines or tumour samples, whereas a change on IGF1R protein localization was observed in others. In fact, TGFβ inhibition decreased IGF1R protein levels by controlling its stability; increasing IGF1R internalization and degradation through the lysosome. When IGF1R levels were decreased by shRNA treatment, ovarian cancer cell lines grew less and LY2109761 lost its capacity to block tumoral ovarian cell proliferation. Overall, our results suggest an important role for the TGFβ signalling pathway in ovarian tumour cell growth through the control of IGF1R signalling pathway. Moreover, it identifies anti-TGFβ inhibitors as being of potential use in new therapies for ovarian cancer patients as an alternative to IGF1R inhibition, being used in clinical trials.
Aquest treball estudia el paper de la família del Factor de Creixement Transformant (TGFβ) en el càncer d’ovari i en una altra patologia, la telangectàsia hemorràgica hereditària (HHT). Mutacions de pèrdua de funció del receptor ALK1 causen un subtipus de HHT caracteritzat per malformacions vasculars. Per analitzar el rol d'ALK1 en el desenvolupament vascular, hem utilitzat un model animal d'HHT. Les alteracions obtingudes han estat una proliferació anormal de les cèl.lules endotelials i un augment de l'amplitud dels vasos de la retina dels ratolins ALK1+/-. Hem demostrat que una inhibició genètica o farmacològica de la via de senyalització de PI3K aboleix l'augment de l'amplitud de vasos i la vasculatura queda normalitzada, suggerint el potencial ús dels inhibidors de PI3K com a nous agents terapèutics pel tractament d'aquests pacients. En la segona part d'aquest treball, hem buscat nous agents terapèutics pel tractament del càncer d'ovari. Utilitzant mostres de pacients, hem observat alts nivells de Smad2 fosforilat en les cèl.lules tumorals de càncer d'ovari, independentment del tipus de tumor. El tractament amb l'inhibidor de TGFβRI&II, LY2109761, en els models ortotòpics de càncer d'ovari causa una reducció significativa de la mida tumoral, afectant la proliferació cellular. Hem identificat el receptor del Factor de Creixement de la Insulina (IGF)1 com la via implicada en la proliferació de les cèl.lules tumorals d'ovari, la qual és regulada positivament per TGFβ. La inhibició de l'activitat d'IGF1R inhibeix el creixement del tumor d'ovari in vivo. A nivell molecular, TGFβ controla els nivells de mRNA d'IGF1R i també la seva internalització i degradació proteica a través del lisosoma. Quan els nivells d'IGF1R són disminuïts per la utilització d'un shRNA, LY2109761 perd la capacitat de bloquejar la proliferació de la cèl.lula tumoral d'ovari. Aquests resultats postulen que TGFβ. té un paper important en el creixement cellular del tumor d'ovari a través del control de la senyalització d'IGF1R. A més, identifica els inhibidors contra TGFβ com a noves teràpies pels pacients de càncer d'ovari com una alternativa als inhibidors d'IGF1R.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La búsqueda de tratamientos alternativos para el cáncer es un gran desafío para la comunidad científica moderna, ya que la aparición de resistencia a los tratamientos utilizados, por parte de los diversos tipos de tumor, es un problema aún sin resolver. Se ha visto y comprobado que la angiogénesis (desarrollo de nuevos vasos a partir de vasos preexistentes) es un fenómeno estrechamente ligado al crecimiento tumoral y la capacidad metastásica del cáncer, por lo que su limitación es un nuevo camino de investigación en búsqueda de un tratamiento definitivo. Con el objetivo de estudiar el efecto angiogénico tumoral analizamos el efecto del implante intramuscular profundo de tumor TA3-MTX-R. en el modelo de ratón (Mus musculus) AJ hembras, clínicamente sanas. Para ello, se utilizaron 2 grupos de 8 ratones cada uno. Un grupo control (A) al cual se le aplicó suero fisiológico y un grupo experimental (B), al cual se le inoculó por vía intramuscular tumor el mismo día. A los ratones se les realizó mediciones del crecimiento tumoral y se esperó hasta la muerte natural de estos, debido al tumor primario y sus metástasis. Se realizó estudio histológico e inmunohistoquímico con conteo de los capilares en un área de estudio estándar, para evaluar angiogénesis, tanto en tumor como en tejidos blanco de metástasis. Los resultados se analizaron estadísticamente, mostrando un importante aumento en la angiogénesis de los ratones con tumor versus los controles. Se constató también que el tumor tiene la capacidad de sacar a las células endoteliales de su estado de reposo del ciclo celular (G0), para hacerlas entrar en una proliferación acelerada

Sarcomas are a group of malignancies characterized by their bad prognosis and the absence of effective treatments. Median survival of advanced sarcoma patients is only one year in spite of treatment. Therefore, it is mandatory to identify new therapeutic strategies. Our hypothesis is that the inhibition of angiogenesis and the mTOR pathway in sarcomas in combination with active cytotoxic agents enhances each strategy alone without increase in toxicity. To confirm such hypothesis, we conducted two phase I trials with associated preclinical studies which have been published in international scientific journals. Article 1: Phase I trial of sorafenib in combination with ifosfamide in patients with advanced sarcoma: a Spanish group for research on sarcomas (GEIS) study. Background: This phase I trial assessed safety, pharmacokinetics (PK), dose limiting toxicity (DLT), maximum tolerated dose and recommended dose (RD) of the combination of sorafenib plus ifosfamide in patients with advanced sarcoma. Methods: Twelve sarcoma patients (9 soft-tissue, 3 bone sarcoma) were treated with sorafenib plus ifosfamide (starting doses 200 mg bid and 6 g/m(2) respectively). A 3 + 3 dose escalation design with cohorts of 3-6 patients was used. A study to assess the in vitro efficacy of the combination was also conducted. Results: Three DLTs were observed: fatigue grade 4 with sorafenib 400 mg bid plus ifosfamide 6 g/m(2) and encephalopathy and emesis grade 3 with sorafenib 400 mg bid plus ifosfamide 7.5 g/m(2). Other toxicities included diarrhea, hand-foot syndrome, mucositis, neutropenia, skin rash and thrombocytopenia. There were no relevant effects on PK of sorafenib but an increase in ifosfamide active metabolite 4-hydroxy-ifosfamide was observed. Eight patients achieved stable disease lasting more than 12 weeks. An additive effect was observed in vitro. Conclusions: RD was sorafenib 400 mg bid plus ifosfamide 6 g/m(2), allowing administration of active doses of both agents. Limited preliminary antitumor activity was also observed. A phase II study is currently ongoing.
Los sarcomas son un grupo de tumores caracterizados por su mal pronóstico y la ausencia de tratamientos efectivos. La mediana de supervivencia de los pacientes afectos de sarcoma avanzado es de tan solo 1 año a pesar de recibir tratamiento. Por lo tanto, es necesario encontrar nuevas estrategias terapéuticas efectivas. Nuestra hipótesis es que la inhibición de la angiogénesis y de la vía de mTOR en sarcomas en combinación con agentes citotóxicos activos potencia la actividad anti tumoral de cada una de las estrategias terapéuticas por separado sin toxicidad significativa. Para confirmar dicha hipótesis realizamos dos ensayos clínicos fase I con experimentos preclínicos asociados que han sido publicados en revistas científicas internacionales. Artículo 1: Ensayo clínico fase I de sorafenib en combinación con ifosfamida en pacientes con sarcoma avanzado: un estudio del Grupo Español de Investigación en Sarcomas (GEIS). Este ensayo clínico fase I evaluó la seguridad, la farmacocinética, la toxicidad limitante de dosis, la dosis máxima tolerada y la dosis recomendada de la combinación de sorafenib más ifosfamida en pacientes con sarcoma avanzado. La dosis recomendada fue sorafenib 400 mg bid más ifosfamida 6 g/m2, un esquema que permite la administración de dosis activas de ambos fármacos. También se observaron signos preliminares de actividad antitumoral. Artículo 2: Ensayo clínico fase I y evaluación de la eficacia preclínica del inhibidor de mTOR sirolimus más gemcitabina en pacientes con tumores sólidos avanzados Llevamos a cabo un ensayo clínico fase I en pacientes con tumores sólidos avanzados para identificar la dosis recomendada, evaluar la PK, la actividad farmacodinámica y la eficacia antitumoral preclínica de la combinación de sirolimus y gemcitabina. La dosis recomendada fue sirolimus 5 mg al día más gemcitabina 800 mg/m2. Además, se observó actividad antitumoral en los modelos preclínicos de sarcoma, así como inhibición de la vía de mTOR.

Hepatic cirrhosis is a largely diffused pathology caused by alcohol abuse and hepatitis C in developed countries, whereas hepatitis B is the cause in most parts of Asia and sub-Saharan Africa. It's characterized by development of regenerative nodules delimited by fibrous septa. Regenerative nodules are composed by proliferating hepatocytes, entrapped by deposition of extracellular matrix, and have been shown to be involved in growth factor production, in particular VEGF, which is responsible of angiogenic induction that culminates with formation of a dense network of blood vessels into fibrous septa. The newly formed blood vessels of fibrous septa connect the vessels of the portal region with terminal hepatic veins, determining an alternative route of the blood flow that, in this way, is redirected into the systemic circulation bypassing the liver. At pre-hepatic level, the cirrhosisrelated portal hypertension induces development of new blood vessels that shunt the portal blood into the systemic circulation. As consequence of both intrahepatic and pre-hepatic angiogenesis, the liver cannot metabolize several blood components such as drugs, nutrients, toxins, and bacteria, with obvious deleterious effects. Despite angiogenesis is one of the main complications of liver cirrhosis and VEGF has a pivotal role in the control of blood vessels formation, the molecular mechanisms that govern VEGF expression during angiogenesis and hepatic cirrhosis are poorly understood. In order to address whether CPEB family of proteins may have a function in the regulation of angiogenesis in liver diseases, we analysed the expression of CPEBl and CPEB4 in liver of patients affected by hepatic cirrhosis. The expression of CPEBl and CPEB4 was increased in regenerative nodules, compared with basal levels of expression detected in healthy hepatic parenchyma. Interestingly, also VEGF expression was higher in regenerative nodules. The numerous fibrous septa that characterized cirrhotic livers resulted highly vascularized, and the endothelium of newly formed blood vessels expressed high levels of CPEB1, CPEB4 and VEGF. The description of CPEB1, CPEB4 and VEGF expression in healthy and cirrhotic conditions represented a first cue of CPEB-mediated translational regulation of VEGF mRNA during angiogenesis. To prove the accuracy of this hypothesis we implemented two animal models that allowed the study of intrahepatic and prehepatic angiogenesis correlated with liver cirrhosis. CBDL experiments performed in rats enabled to recapitulate the histopathological conditions observed in human hepatic cirrhosis. Cirrhotic rat livers showed deep histological perturbations, with high proliferation of blood vessels and biliary ducts. Compared with control healthy samples, the expression of CPEB1, CPEB4 and VEGF in pathological liver was strongly increased. These proteins localized at level of both, blood vessels and biliary ducts. Partial portal vein ligation (PPVL) experiments performed in rats enabled to show an important correlation between CPEBl and CPEB4 expression with VEGF synthesis and consequent high vascularization of mesentery. In angiogenic condition, both pre-existing and newly formed blood vessels expressed CPEB1, CPEB4 and VEGF at level of endothelium, smooth muscle and adventitia, tissues that playa pivotal role in the development of the vascular net. To better define the mechanistic relevance of these correlations, we characterized the endothelial cell line HSV. In this in vitro model we modulated the levels of CPEBl and CPEB4, and showed a direct involvement of this two proteins in the translational regulation of VEGF mRNA. Taking advance of the ability of HSV cells to form blood vessel like structure in an in vitro angiogenesis assay, we were able to show that CPEBl and CPEB4 are required for VEGF synthesis and secretion, which in turn are essential to create the correct microenvironment necessary to activate the cells and induce the formation of a dense network of vascular structures on Matrigel. Our results suggest that CPEBl drives the nuclear cleavage of VEGF 3'UTR while CPEB4 is responsible of its cytoplasmic polyadenylation.
"Regulación de la angiogénesis a través del control traduccional mediato par las proteínas CPEB " En muchas enfermedades hepáticas cr6nicas, la angiogénesis es una importante característica patológica y juega un papel crucial en la progresión de la fibrogénesis hepática a cirrosis, y en la aparición y agravamiento de la hipertensión portal, la cual determina las principales complicaciones de la enfermedad. A pesar de que es evidente que VEGF es el principal efector de la angiogénesis patológica, los mecanismos moleculares que gobiernan la activación post-transcripcional de su síntesis durante la cirrosis hepática son en gran parte desconocidos. En este trabajo se muestra que la síntesis de VEGF está regulada a través de funciones secuenciales y no redundantes de dos miembros de la familia de las proteínas CPEB:. CPEB1 y CPEB4. Por 10 tanto, CPEB1 promueve el procesamiento alternativo de ambos los pre-ARNm de CPEB4 y VEGF, acortando las 3'UTRs y excluyendo elementos de inhibición de la traducción de los transcritos maduros. Como resultado de este procesamiento alternativo, CPEB4 se sobreexpresa, y polyadenyla el ARNm de VEGF, aumentando aún más su traducción. Entonces, se requieren tanto CPEB1 como CPEB4 para la síntesis de VEGF y la consecuente angiogénesis. Por tanto, todas las proteínas se sobreexpresan de forma secuencial en pacientes y en modelos animales de cirrosis hepática e hipertensión portal, y ambos ratones knock-out para CPEB1 y CPEB4 no lograron activar la angiogénesis tras la inducción de hipertensión portal. A través del análisis de la angiogénesis en ensayos in vitro, las muestras de humanos y modelos animales, nuestros resultados ponen de relieve el papel crucial de CPEBs en la neovascularización patol6gica, en el marco de la hipertensión portal y cirrosis, e identifican CPEBs como potenciales nuevas dianas moleculares para el tratamiento de la enfermedad hepática cr6nica y otras enfermedades dependientes de la neovascularización, como el cáncer.

In response to nutritional variation, white adipose tissue (WAT) undergoes a physiological remodelling that involves qualitative and quantitative changes in resident cells and is coordinated with angiogenesis. In a condition of chronic over nutrition WAT expansion is associated to insufficient vascularisation which in turn leads to local hypoxia, inflammation and adipocytes death (hallmark of obesity). Currently, enhanced WAT angiogenesis is believed to be a promising intervention to ameliorate obesity associated metabolic dysfunctions. However, we still lack understanding of the cell intrinsic function of endothelial cells in WAT remodelling. Here we take advantage of our mouse model of PTEN (a dual lipid/protein phosphatase that counterbalance the activity of PI3K) deletion in ECs to promote vessel growth, in a cell autonomous manner. To this end, we crossed Ptenflox/flox mice with PdgfbiCreERT2 transgenic mice that express a tamoxifen-inducible Cre recombinase in ECs; 4-hydroxytamoxifen was administered in vivo at postnatal day 1 (P1) and P2 to activate Cre expression. Increased ECs proliferation, induced by PTEN loss, promotes vascular hyperplasia exclusively in WAT and leads to a progressive loss of WAT mass. PTEN null ECs undergo a metabolic switch towards an oxidative metabolism; in vivo inhibition of - oxidation is sufficient to revert both vascular hyperplasia and loss of WAT mass. Enhanced adipose vascularisation prevents from high fat diet induced WAT hypertrophy, limits body weight gain and improves glucose tolerance. Taken together our results suggest that, under obesogenic stimuli, more functional ECs prevent unhealthy WAT expansion and consequently the onset of obesity related comorbidity.

Local invasion is a key cell-biological event in the metastatic cascade. In response to a changing microenvironment, cancer cells may act using two main strategies of invasion: single cell invasion and collective invasion. Determining how tumor cells initiate and sustain local invasive behavior might help to improve patient diagnosis and lead to the development of new intervention modalities. Therefore, the aim of this thesis is to elucidate which molecular mechanisms are involved in PanNETs invasion before and after anti-angiogenic therapies. Results from our group have demonstrated an irreversible increase in the incidence of invasive tumors during anti-angiogenic treatment in the RIP1-Tag2 mouse model. The RIP1-Tag2 mouse model is a valuable prototype of stepwise progression of tumorigenesis, and for this reason represents an appropriate choice for studying invasion in PanNETs. In addition, three dimensional models were developed with the aim of verifying the collective cell invasion process in βTC4 spheroids from RIP1-Tag2 tumors. First, the morphology of RIP1-Tag2 tumors was described as collective tumor cell invasion, both before and after anti-angiogenic treatment. In detail, CLDN4 expression was associated with a high invasion capacity, reflected in the barrier function stability and adhesion union between cells. Cells and spheroid βTC4 models, in turn, demonstrated the functional implication of CLDN1 in the invasion of cancer cells. Finally, in clinical samples of PanNETs patients, CLDN1 was directly associated with tumor progression. In summary, we identified a new link between barrier claudins, specifically 1 and 4, and the collective cell invasion process. In the future, through further validations, these markers could be used as tumor progression biomarkers for PanNETs tumors, as well as potential targets to intervene in collective invasion.
La invasión local es un evento biológico celular clave en la cascada metastásica. En respuesta al microambiente tumoral, las células pueden actuar utilizando dos estrategias principales de invasión: la invasión de células individuales y la invasión colectiva. Determinar cómo las células tumorales inician y mantienen el comportamiento invasivo local podría contribuir en la mejora del diagnóstico del paciente y conducir al desarrollo de nuevas modalidades de intervención. Por lo tanto, el objetivo de esta tesis es determinar cuáles son los mecanismos moleculares involucrados en la invasión de PanNETs antes y después de las terapias anti angiogénicas. Resultados previos de nuestro grupo demostraron un aumento irreversible en la incidencia de tumores invasivos durante el tratamiento anti angiogénico en RIP1-Tag2. Los ratones transgénicos RIP1-Tag2 son un prototipo detallado de la progresión gradual en la tumorigénesis, por ello representan un modelo animal ideal para estudiar el proceso de invasión in vivo. Además, se desarrollaron modelos tridimensionales buscando verificar el proceso de invasión colectiva en esferoides βTC4 derivados de tumores RIP1-Tag2. En primer lugar, la morfología de los tumores RIP1-Tag2 se ha descrito como colectiva tanto antes y como después de la inhibición farmacológica de la angiogénesis. En detalle, la expresión de CLDN4 ha sido asociada a la capacidad de invasión colectiva, reflejada en la estabilidad de la función barrera y la integridad de la adhesión entre las células. Las células y esferoides βTC4, por su parte han demostrado la implicación funcional de CLDN1 en la invasión de células cancerosas. Finalmente, una asociación directa entre la expresión de CLDN1 y la progresión tumoral ha sido observada en las muestras clínicas de pacientes PanNETs. En resumen, hemos descrito una nueva conexión entre las claudinas de barrera, especialmente las CLDN1/4 y el movimiento colectivo de invasión tumoral. En el futuro, a través de validaciones adicionales, estos marcadores podrían ser aplicados como biomarcadores de progresión tumoral de PanNETs, así como potenciales dianas para la modulación de la invasión colectiva.

Como otros tumores sólidos, el sarcoma de Ewing (SE) requiere de un aporte vascular adecuado que permita nutrir y oxigenar a las células tumorales. En el SE, la vascularización tumoral se encuentra caracterizada principalmente por los procesos de vasculogenesis, mimetismo vascular y angiogénesis. Considerando la participación de CAV1 en el aporte vascular, nos planteamos demostrar que CAV1 juega un papel importante en el desarrollo vascular de la enfermedad. Estableciendo tres nuevos modelos de baja expresión de CAV1 en células se SE (RDES, SKES1 y TC71), fue posible observar la reducción en el desarrollo tumoral en xenoinjertos, y a su vez esta reducción fue relacionada con la disminución en la densidad micro-vascular. Este trabajo demuestra el efecto directo del silenciamiento de CAV1 sobre el proceso angiogénico en el SE, regulando la respuesta de la célula endotelial ante las señales producidas por la célula tumoral. Nuestros resultados mostraron que las células endoteliales presentan mayor migración ante el estímulo de las señales producidas por la célula tumoral. Mediante el análisis de expresión de diferentes factores utilizando RT-PCR, fue posible determinar que la expresión de bFGF era afectada en los modelos analizados como efecto del silenciamiento de CAV1. Para determinar el mecanismo molecular a través del cual CAV1 regula la angiogénesis en el sarcoma de Ewing, partimos del análisis de expresión de 3 miembros de la familia Eph descritos como pieza clave en el desarrollo vascular. La expresión del receptor EphA2 en los modelos de baja expresión de CAV1 mostró una disminución en los clones, donde el silenciamiento de CAV1 conlleva la redistribución y reducción EphA2. Los análisis mostraron además una interacción entre ambas proteínas. Establecida la relación EphA2/CAV1, analizamos el efecto de la estimulación de EphA2 a partir de EfnA1 y confirmamos que las células con baja expresión de CAV1 presentaban una respuesta menor. La estimulación resultó en el incremento de la fosforilación de AKT, sugiriendo que los efectos podrían depender de la actividad quinasa del receptor. Para respaldar esto, las células RDES y TC71 fueron transfectadas con un dominante negativo de EphA2 que no modificaba la expresión de CAV1 (EphA2-Kd). Los modelos EphA2-Kd reprodujeron los resultados observados en los modelos de baja expresión de CAV1. La estimulación del modelo TC71-EphA2-Kd con la proteína recombinante EfnA1, mostró tanto la activación de AKT como la sobreexpresión de bFGF, reproduciendo en cierta medida lo observado por el silenciamiento de CAV1 y destacando la importancia de la actividad dependiente de quinasa de EphA2 en el proceso angiogénico de la enfermedad. Considerando que CAV1 es necesario para el correcto funcionamiento de las rutas de señalización controladas por EphA2 en el SE, decidimos determinar la implicación de CAV1 y EphA2 en el mimetismo vascular de la enfermedad. Se decidió analizar el papel independiente de quinasa del receptor EphA2 como una posible pieza clave en el proceso de mimetismo vascular en el SE. Nuestros resultados mostraron que el silenciamiento de CAV1 reduce el desarrollo de vasos miméticos in vivo e impide la formación tubular in vitro. Además, el efecto de bloquear la actividad quinasadependiente del receptor EphA2 mostró que la actividad quinasa del receptor no afecta al proceso de mimetismo vascular en esta entidad tumoral. Para confirmar la participación de EphA2 en el proceso de formación de vasos miméticos, se transfectó un mutante que carece de toda la región citoplasmática del receptor EphA2 (ΔCyto), eliminando así sus funciones dependientes e independientes de quinasa. Los resultados mostraron que el bloqueo total del receptor tenía un efecto negativo en la formación de estructuras tubulares. Estos resultados confirman la importancia de la actividad prooncogénica del receptor EphA2 en el sarcoma de Ewing.
We established low CAV1 expressing models by knocking down CAV1 in TC71, RDES and SKES1 Ewing sarcoma (ES) cells by stably transfecting a previously validated shRNA construct. In vivo studies showed a decrease in tumor volume from the CAV1 knocked-down clones when compared with controls. This correlated with a reduction in microvascular density (MVD) and higher levels of necrosis. Conditioned media from CAV1 knocked-down cells showed reduced capability to promote migration of endothelial cells with no changes in proliferation. Different pro-angiogenic factors were analyzed by RT-PCR in the models and, downregulation of bFGF was observed in all four. Results suggested that CAV1 was indirectly affecting bFGF expression. EphA2 expression was observed in ES cell lines and tumor samples. CAV1 knocked-down cells showed a reduction in EphA2 phosphorylation as well as a displacement from the membrane to the cytoplasm. Furthermore, we showed that the CAV1/EphA2 interaction was necessary for Eph-mediated signaling. To further support these results, RDES and TC71 cells were stably transfected with a dominant negative of EphA2 that did not alter the expression of CAV1 (EphAh2-kd). EphA2-Kd models were able to replicate the effects observed in the CAV1 knocked-down models, where the stimulation of the TC71-EphA2-Kd model with the recombinant protein EfnA1, showed both the activation of AKT and the overexpression of bFGF. These results replicate the effect of silencing CAV1 and highlighted the importance of the kinase-dependent activity of EphA2 in the angiogenic process in ES. We decided to analyze the kinaseindependent role of EphA2 as a possible key in the process of vascular mimicry in ES. Our results showed that the silencing of CAV1 reduces the development of mimetic vessels in vivo and prevents the tubular formation in vitro. In addition, our results showed that the kinase-dependent activity of the receptor does not affect the process of vascular mimicry in ES. Moreover, we stably transfected a mutant that lacks all the cytoplasmic region of EphA2, blocking its kinase-dependent and –independent activities. Results showed a negative effect on the formation of tubular structures. These results confirm the importance of the pro-oncogenic activity of EphA2 in ES.

Tumor progression is a complex conundrum of events that involve not only tumor cells, but also their surrounding microenvironment. Accounting to the natural dependency of tumors on angiogenesis, its therapeutic targeting remains a valid stroma-directed strategy in the fight against cancer. However, standard antiangiogenics fail to produce enduring beneficial effects due to the appearance of resistance, often as a consequence of intratumor hypoxia triggered by vessel trimming. In the case of neuroendocrine tumors (NETs), which are characterized by their low aggressiveness, high heterogeneity and vessel content, new therapeutic approaches are being explored to overcome such hurdles, where conventional therapies stumble. In this context, blockade of semaphorin 4D (Sema4D), a proangiogenic molecule with homeostatic roles in the immune system, by a monoclonal antibody (anti-Sema4D) has proved beneficial antitumor effects in the RIP1-Tag2 preclinical mouse model of pancreatic NET (PanNET). Unfortunately, the decrease in tumor burden and increase in survival of anti-Sema4D treated mice followed an increase in local invasiveness and metastasis. Contrary to the thoroughly described mechanisms governing malignization after antiangiogenic therapies, no intratumoral hypoxia was detected after Sema4D blockade. In this doctoral thesis, aiming to decipher this novel form of resistance by which anti- Sema4D treatment acts as a double-edged sword in PanNETs, the two systems involved in Sema4D signaling were studied: the vascular and the immune system. We first described a beneficial antiangiogenic effect, characterized by structural changes in tumor vessels mediated by a pericyte-endothelial cell crosstalk. Incidentally, we found that the aggressive phenotype involved the recruitment of Sema4D-positive tumor-associated macrophages (TAMs) to the tumor ecosystem, which, after becoming activated by anti- Sema4D treatment, triggered tumor cell migration and invasion. Mechanistically, functional characterization of Sema4D-positive TAMs’ secretome revealed cytokine CXCL12 to be one of the molecules involved in the proinvasive program, suggesting the implication of CXCL12/CXCR4 signaling. Comprehensive clinical validation further shed light on the implication of both macrophage-derived Sema4D and CXCR4 in the malignization steps of tumor development in PanNET patients, which undoubtedly unleashes a new range of approaches merging the immunotherapy and the antiangiogenic fields in their shared fight against cancer.
Considerando la dependencia natural de los tumores por la angiogénesis, su explotación como diana dirigida contra el microambiente en el tratamiento del cáncer, supone una válida estrategia terapéutica. No obstante, los antiangiogénicos estándar fracasan a la hora de producir efectos duraderos debido a la aparición de resistencia, habitualmente como consecuencia de la hipoxia intratumoral. En el caso de los tumores neuroendocrinos (NETs), caracterizados por su alta heterogeneidad y alto contenido vascular, donde la terapia convencional falla, están siendo explorados nuevos abordajes terapéuticos. En este contexto, el bloqueo de la semaforina 4D (Sema4D), una molécula proangiogénica con un papel homeostático en el sistema inmune, utilizando un anticuerpo monoclonal (anti- Sema4D) ha demostrado efectos antitumorales beneficiosos, en un modelo murino de cáncer de páncreas neuroendocrino (PanNET). Lamentablemente, al descenso en el volumen tumoral y al aumento en la supervivencia de los ratones tratados con anti- Sema4D les siguen un aumento en la invasión local y la metástasis. Al contrario de lo esperado, no se detectó hipoxia intratumoral tras el bloqueo de la Sema4D. Con el objetivo de descifrar esta nueva forma de resistencia, en la cual, el tratamiento anti-Sema4D actúa como un arma de doble filo en PanNETs, estudiamos los dos sistemas implicados en la señalización vía Sema4D: el sistema vascular y el inmune. Primeramente, describimos un efecto antiangiogénico beneficioso, caracterizado por un cambio estructural de los vasos tumorales, y mediado por una comunicación cruzada entre células endoteliales y pericitos. A continuación, encontramos que el fenotipo agresivo involucra el reclutamiento de macrófagos positivos para Sema4D al ecosistema tumoral, los cuales, tras activarse por el tratamiento anti-Sema4D, potencian la migración e invasión de las células tumorales. La caracterización funcional de los macrófagos desveló la contribución de la citoquina CXCL12 al programa proinvasivo, sugiriendo una implicación de la señalización vía CXCL12/CXCR4. Finalmente, una validación clínica integral en pacientes de PanNETs arrojó luz sobre la participación de Sema4D derivada de los macrófagos y CXCR4 durante el desarrollo tumoral. En conjunto, nuestros datos reconducen el abanico de estrategias terapéuticas existentes hacia un nuevo enfoque que combina la inmunoterapia y la antiangiogénesis en la lucha común contra el cáncer.

El hígado cirrótico experimenta a lo largo de todo el desarrollo de la enfermedad una serie de cambios estructurales, debidos a la acumulación de matriz extracelular y a la inflamación crónica, que vuelven al tejido hipóxico. La hipoxia tisular provoca la liberación de agentes proangiogénicos, como VEGF-A, que aumentan la irrigación del tejido para compensar la falta de oxígeno. Además, muchas citoquinas sintetizadas por las células inflamatorias o por las células hepáticas estrelladas activadas, también tienen un alto poder angiogénico. Estos nuevos vasos son una puerta de entrada de más infiltrado inflamatorio, estableciéndose así un circuito que se retroalimenta entre angiogénesis e inflamación que lleva a perpetuar la enfermedad. En este contexto, las terapias antiangiogénicas clásicas dirigidas a bloquear VEGF o las vías de los receptores tirosina quinasa, han demostrado ser eficaces en disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepática, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias se han visto relacionadas con multitud de efectos adversos, como trombosis o hipertensión, ya que no sólo inhiben la angiogénesis patológica sino que también afectan a la vasculatura sana (Fischer et al., 2007; Wu et al., 2008). De manera que la necesidad de encontrar nuevas dianas terapéuticas más seguras destinadas a modular la angiogénesis en la cirrosis hepática sigue siendo uno de los objetivos de la investigación científica actual. Cuando la cirrosis pasa a ser descompensada, los pacientes cirróticos desarrollan importantes alteraciones en la homeostasis de los líquidos corporales que dan lugar a la acumulación de ascitis. La formación de ascitis es el trastorno más importante que presentan los pacientes cirróticos y constituye un fenómeno extraordinariamente complejo en el que se han descrito la implicación de diversos sistemas neurohormonales y sustancias endógenas capaces de regular el metabolismo renal de sodio y agua o la reactividad vascular (Arroyo and Jiménez, 2000). La probabilidad de fallecimiento a los 2 años en pacientes cirróticos, una vez que desarrollan ascitis, es del 40%. A pesar de la enorme relevancia clínica de este suceso, actualmente aun no se conocen con precisión todos los mecanismos moleculares implicados en la formación y mantenimiento de la ascitis en la cirrosis. El objetivo global de esta tesis doctoral fue el de investigar la implicación de la vasculatura, tanto sanguínea como linfática, en la patogenicidad de la cirrosis hepática. De manera específica, la tesis está dividida en dos estudios dirigidos a: I. Investigar el papel fisiopatológico del factor de crecimiento placentario (PlGF) en la angiogénesis, la inflamación y la fibrosis hepática. II. Caracterizar la funcionalidad y la estructura de la vasculatura linfática en la cirrosis e investigar su contribución a la formación de ascitis. Estudio I: Durante la progresión de gran cantidad de enfermedades hepáticas crónicas tiene lugar un proceso de neoangiogénesis hepática que agrava profundamente dichas patologías. Además, se ha demostrado que diversos factores angiogénicos también son capaces de activar diferentes subpoblaciones de células hepáticas estrelladas, estableciendo así un vínculo entre inflamación, angiogénesis y fibrosis hepáticas (Thabut et al., 2010; Semela et al., 2008). En este contexto, se ha demostrado que la administración de sunitinib y sorafenib a ratas cirróticas, dos inhibidores multidiana de receptores tirosina quinasa que actúan en las vías de señalización de PDGF y VEGF, conseguía disminuir el grado de angiogénesis, de fibrosis y de inflamación hepáticas, además de disminuir también la presión portal (Mejias et al., 2009; Tugues et al., 2007). Sin embargo, este tipo de terapias dirigidas a inhibir VEGF están asociadas a graves efectos adversos, como trombosis, hipertensión o una disminución de la densidad vascular en órganos sanos (Fischer et al., 2007), ya que VEGF también tiene importantes funciones en la angiogénesis fisiológica. Estudios recientes sugieren que las terapias enfocadas a inhibir el PlGF podrían tener un perfil de bioseguridad mucho más óptimo que las terapias antiangiogénicas clásicas (Fischer et al., 2007; Van de Veire et al., 2010). Esto es así porque la acción angiogénica de PlGF se reduce únicamente a situaciones patológicas (Autiero et al., 2003; Van Steenkiste et al., 2009). Resultados I: La cirrosis está asociada a una sobreexpresión de PlGF, tanto en humanos como en modelos experimentales. Cuando se bloquea la actividad de PlGF en cirrosis se consigue disminuir la angiogénesis hepática y en esplácnica, el infiltrado inflamatorio hepático, la fibrosis y la hipertensión portal; todo ello sin efectos adversos. Estudio II: Una de las complicaciones más severas durante la progresión de la cirrosis es la formación de ascitis, que está asociada con un incremento de la morbilidad y la mortalidad (Moore et al., 2003). Algunos de los mecanismos que contribuyen a la aparición y al mantenimiento de la ascitis son: 1) el incremento de la presión hidrostática intravascular, 2) el descenso de la presión oncótica en el plasma, 3) un aumento de la angiogénesis en el territorio esplácnico y 4) la retención renal de sal y agua (Gines et al., 2004; Van Steenkiste et al., 2009; Henriksen et al., 2005). Sin embargo, la función del sistema linfático en la patogénesis de la ascitis no está bien estudiada. En los pacientes cirróticos compensados, el sistema linfático ayuda a prevenir la aparición de ascitis reabsorbiendo el exceso de fluido, tanto en el hígado, como en las demás regiones de la zona esplácnica. Como consecuencia de esto aumenta el flujo linfático (Witte et al., 1969), lo que estimula la aparición de linfangiogénesis hepática (Tugues et al., 2005). A pesar de ello, este mecanismo compensatorio no es capaz de evitar la formación de ascitis en pacientes con cirrosis descompensada y esto hace hipotetizar que existe una disfunción del sistema linfático en los estadíos más avanzados de la enfermedad. Resultados II: En cirrosis, las células endoteliales linfáticas sobreexpresan eNOS y tienen una sobreproducción de NO que lleva a una pérdida de recubrimiento de los vasos linfáticos por células musculares lisas y a una disfunción del sistema linfático. Cuando se bloquea la actividad de eNOS se consigue recuperar el recubrimiento de vasos linfáticos por células musculares lisas, aumenta el drenaje del sistema linfático y disminuye el volumen de ascitis.
Study I: Placental growth factor (PlGF) is associated selectively with pathological angiogenesis, and PlGF blockade does not affect the healthy vasculature. Anti-PlGF is therefore currently being clinically evaluated for the treatment of cancer patients. In cirrhosis, hepatic fibrogenesis is accompanied by extensive angiogenesis. In this study, we evaluated the pathophysiological role of PlGF and the therapeutic potential of anti-PlGF in liver cirrhosis. Results I: PlGF was significantly up-regulated in the CCl4-induced rodent model of liver cirrhosis as well as in cirrhotic patients. Compared with wild-type animals, cirrhotic PlGF -/- mice showed a significant reduction in angiogenesis, arteriogenesis, inflammation, fibrosis, and portal hypertension. Importantly, pharmacological inhibition with anti-PlGF antibodies yielded similar results as genetic loss of PlGF. Notably, PlGF treatment of activated hepatic stellate cells induced sustained extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation, as well as chemotaxis and proliferation, indicating a previously unrecognized profibrogenic role of PlGF. In conclusion, PlGF is a disease-candidate gene in liver cirrhosis, and inhibition of PlGF offers a therapeutic alternative with an attractive safety profile. Study II: The lymphatic network plays a major role in maintaining tissue fluid homoeostasis. Therefore several pathological conditions associated with oedema formation result in deficient lymphatic function. However, the role of the lymphatic system in the pathogenesis of ascites and oedema formation in cirrhosis has not been fully clarified. The aim of this study was to investigate whether the inability of the lymphatic system to drain tissue exudate contributes to the oedema observed in cirrhosis. Results II: The cirrhotic (CH) rats had impaired lymphatic drainage in the splanchnic and peripheral regions compared with the control (CT) rats. LyECs isolated from the CH rats showed a significant increase in eNOS and nitric oxide (NO) production. In addition, the lymphatic vessels of the CH rats showed a significant reduction in smooth muscle cell (SMC) coverage compared with the CT rats. CH rats treated with L-NMMA for 7 days showed a significant improvement in lymphatic drainage and a significant reduction in ascites volume, which were associated with increased plasma volume. This beneficial effect of L-NMMA inhibition was also associated with a significant increase in lymphatic SMC coverage. In conclusion, the upregulation of eNOS in the LyECs of CH rats causes long-term lymphatic remodelling, which is characterised by a loss of SMC lymphatic coverage. The amelioration of this lymphatic abnormality by chronic eNOS inhibition results in improved lymphatic drainage and reduced ascites.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 suelisuzigan_tese_parte5.pdf: 78044 bytes, checksum: ede6079670fe7d13ddd7e25ead03f505 (MD5) Previous issue date: 2002-05-03
Introduction. Tumor growth and metastasis depend greatly on angiogenesis. There are several angiogenic growth factors able to induce new vessels in renal tumors, but the most important are vascular endothelial growth factor (VEGF) and basic fibroblast growth factor (b-FGF). The aim of our study was to investigate expression of b-FGF and to quantify microvessel density (MVD) in oncocytomas and renal cell carcinomas (RCCs) and to relate these parameters of tumor vascularity to other clinicopathological features. Material and Methods. b-FGF and CD31 immunostaining were performed on formalin-fixed paraffin-embedded archival tissues from Larpac Laboratories files, including 36 RCCs (10 conventional, 10 papillary, 8 sarcomatoid, and 8 chromophobe) and 5 oncocytomas. Angiogenesis was quantified microscopically by two independent observers. Results. b-FGF was positive in all five oncocytomas and only in seven of 36 RCCs: 5 of conventional type, 1 papillary, and 1 chromophobe. All sarcomatoid carcinomas were negative. The expression of b-FGF was not related to tumor size, grade, stage, or short survival in either group. MVD mean value was 124.16 ± 50.1 in oncocytomas and 91.54 ± 52.4 in RCCs. The pattern of vascularization observed in oncocytomas was characterized by a fine vascular network around groups of tumor cells although in RCCs the microvessels tended to be more disorganized. When analyzing only carcinomas, patients who died within 12 months after the diagnosis had a tumoral MVD mean value significantly higher (124.12 ± 75.2) than that observed in patients who were still alive one year after diagnosis (80.34 ± 37.8). ix Conclusion. We demonstrate that b-FGF is expressed more often in oncocytomas than in RCCs but MVD is similar in both groups of tumors. The high expression of b-FGF in oncocytomas may reflect the peculiar pattern of vascularization of these tumors. High MVD in rapidly lethal RCCs is an indication that angiogenesis may be correlated with the degree of malignancy of these tumors.
O desenvolvimento dos tumores e das suas metastases dependem em grande parte da angiogenese tumoral. Existem varios fatores de crescimento capazes de induzir à neoformação vascular nas neoplasias renais, porém, os mais importantes são o fator de crescimento do entotélio vascular (vegf) e o fator de crescimento fibroblástico básico (bfgf). O objetivo deste estudo foi o de investigar a expressão do b-fgf e a densidade microvascular (dmv) nos oncocitomas e nos carcinomas de células renais (ccrs) e correlacionar estes parâmetros da vascularização tumoral com outros ascpectos clínico-patológicos. Material e métodos. O estudo imunohidtoquímico para o b-fgf e o cd31 (densidade microvascular) foi realizado em material fixado em formalina e incluído em parafina de 36 casos de ccrs (10 convencionais, 10 papilíferos, 8 sarcomatóides e 8 cromófobos) e 5 oncocitomas, oriundos de exames anátomo-patológicos por dois observadpres independentes. Resultados. Nota de Resumo Foi encontrada positividade para o b-fgf em todos os 5 casos de oncocitomas e em 7 dos 36 casos de ccrs: 5 do tipo convencional, um papilífero, e um cromófobo. Todos os carcinomas sarcomatóides mostraram-se negativos. A expressão tumoral do b-fgf não apresentou correlação com tamanho tumora, grau histológico, estadio patológico, ou sobrevida a curto prazo em nenhum dos grupos. O valor médio da dvm foi de 124,16 +/- 50,1 nos oncocitomas e de 91,54 +/- 52,4 nos ccrs. O padrão de vascularização observado nos oncocitomas era caracterizado por um delicado leito vascular envolvendo grupos de celulas tumorais, enquanto que nos ccrs a microvascularização se apresentou de forma mais organizada. Entre os carcinomas, os tumores que se mostraram letais nos 12 primeiros meses após o diagnóstico, apresentaram um ídice angiogênico significativamente maior (124,12 +/- 75,2) em relação aos pacientes que ainda permaneciam vivos um ano após o diagnóstico (80,34 +/- 37,8). Conclusão. Demostramos que o b-fgf está expresso mais freqüentemente nos oncocitomas do que nos ccrs. Nota de Resumo Apesar de as dmv ser semelhante em ambos os grupos tumorais, observou-se um padrão de vascularização característico nos oncocitomas. Uma dvm mais elevada nos ccrs, rapidamente letais é indicativo de que a angiogenese possa estar correlacionada com grau de malignidade destes tumores.

Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive lymphoid neoplasm derived from mature B cells genetically characterized by the presence of the t(11;14)(q13;q32) translocation causing cyclin D1 overexpression and therefore cell cycle deregulation. However, other additional secondary genetic alterations also contribute to MCL pathogenesis. Recent studies identified a distinct subgroup of tumors with an indolent clinical behavior even without chemotherapy that tend to present with non-nodal, leukemic disease instead of extensive nodal infiltration. Moreover, recent molecular studies have identified SRY (Sex determining region-Y)-like HMG box-11 (SOX11) as one of the best characterized discriminatory genes between these two clinical subtypes of MCL, being almost exclusively overexpressed in the aggressive presentation of the disease. SOX11 is a high mobility group (HMG) transcription factor (TF) characterized by its critical involvement in embryonic development and neuronal cell differentiation. Although not apparently expressed in any normal cell subtype of the lymphoid system, it has been recently identified as playing a major role in several solid tumors and some subtypes of aggressive lymphomas. However, SOX11 oncogenic mechanisms contributing to the development and progression of these diseases are largely unknown. Although SOX11 function and potential target genes in lymphoid cells are poorly known, its high specific expression in aggressive MCL suggests that it may be an important element in the development and progression of this disease. Two publications resulted from our studies and compose this thesis. In paper I, we initiated the molecular characterization and elucidation of the SOX11-regulated transcriptional program in MCL. We performed an integrative analysis coupling data from human genome-wide promoter analysis by SOX11 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-chip experiments and gene expression profiling (GEP) upon SOX11 silencing in MCL cell lines, and identified target genes and transcriptional programs regulated by SOX11 including the block of mature B cell differentiation, modulation of cell cycle, apoptosis, and stem cell development. Paired box protein 5 (PAX5) stood out as one of SOX11 major direct target genes. We found that SOX11 silencing downregulated PAX5, induced B lymphocyte induced maturation protein 1 (BLIMP1) expression, and promoted the shift from a mature B cell into the initial plasmacytic differentiation phenotype in both MCL primary tumor cells and an in vitro model. We also demonstrated the oncogenic implication of SOX11 expression in the aggressive behavior of MCL as SOX11-knockdown derived tumors displayed a significant reduction on tumor growth compared to SOX11-positive tumors in subcutaneous MCL xenografts. Although our results suggested that SOX11 contributed to tumor development by altering the terminal B cell differentiation program of MCL cells, the specific SOX11-regulated mechanisms promoting the oncogenic and rapid tumor growth of aggressive MCL still remained to be elucidated. Therefore, in paper II, we further characterized the potential SOX11-regulated oncogenic mechanisms by integrating our ChIP-chip data with further analyses including GEP derived from the xenograft SOX11-positive and silenced tumors. Gene ontology analysis of SOX11 target genes and gene set enrichment analyses (GSEA) of the differentially expressed genes in xenografts, human primary tumors and MCL cell lines revealed that blood vessel development and angiogenic gene signatures were significantly enriched in SOX11-positive cells. Consequently, we performed in vitro angiogenic assays and observed that conditioned media derived from SOX11-positive cells induced higher tube formation, proliferation and migration of endothelial cells, corroborated by a prominent higher density of microvessels in human primary tumors and mouse xenografts. Strikingly, gene and protein expression profiling revealed that SOX11-modulation of angiogenesis in MCL was mediated by the upregulation of the pro-angiogencic factor Platelet-derived growth factor-A (PDGFA). Inhibition of the PDGFA pathway impaired angiogenesis development both in vitro and in vivo, and also MCL tumor growth in vivo, representing a promising novel therapeutic strategy for the treatment of aggressive MCL. Overall, we have unraveled and characterized, for the first time, the oncogenic role of SOX11 and the tumorigenic pathways it orchestrates in MCL. Importantly, the elucidation of molecular oncogenic mechanisms that are deregulated by SOX11 in MCL will aid the management and stratification of MCL patients and lead to the development of new therapeutic strategies for this aggressive disease.
Les neoplàsies limfoides són un grup heterogeni de tumors caracteritzats per un event genètic inicial i l’acumulació d’alteracions moleculars secundàries que condicionen la progressió tumoral. Els mecanismes genètics que condueixen a alteracions genètiques primàries són principalment les translocacions cromosòmiques que, generalment, resulten en l’activació d’un proto-oncogen que comporta l’alteració de la proliferació, l’apoptosi o la via de diferenciació de les cèl·lules B. El limfoma de cèl·lules del mantell (LCM) és una neoplàsia limfoide caracteritzada per una proliferació alta de limfòcits B madurs, i és considerada un dels limfomes no Hodgkin (LNH) més agressius amb una supervivència mitjana de 3-4 anys. L’evolució clínica acostuma a ser molt agressiva amb poca resposta al tractament i freqüent recidiva; són pocs els pacients que es curen amb les teràpies actuals. Tot i així, observacions clíniques recents han identificat alguns LCM amb un curs clínic indolent de la malaltia i una llarga supervivència dels pacients, inclòs sense la necessitat de tractament. Estudis d’expressió gènica diferencial han identificat que SOX11, un factor de transcripció neuronal, és un dels gens més ben caracteritzats per diferenciar els subtipus de LCM agressius i indolents ja que se sobre-expressa en els LCM agressius però no en els indolents. SOX11 pertany a la família dels gens SOX que codifiquen per possibles reguladors transcripcionals que desenvolupen funcions importants en diferents processos del desenvolupament. La funció de SOX11 i molts altres membres de la superfamília de proteïnes SOX actualment no es coneix, tot i que es creu que la funció de les proteïnes SOX és, almenys, en part estructural permetent que altres factors de transcripció s’uneixin al solc format a l’ADN i/o reunint elements reguladors, el que facilita la formació de complexes proteics. SOX11 se sobre-expressa constantment en gairebé tots els tumors de LCM agressius, a nivells inferiors en un subgrup de limfomes de Burkitt i limfoblàstics, però no en altres neoplàsies limfoides, en cèl·lules limfoides normals ni en pacients de LCM que segueixen una llarga evolució clínica indolent. Per tant, SOX11 ha estat identificat com a biomarcador en els tumors de LCM i possible factor pronòstic. Tot i que la funció de SOX11 i els seus possibles gens diana en cèl·lules limfoides es desconeixen, la seva alta expressió en els LCM agressius suggereix que SOX11 pot ser un element important en el desenvolupament i progressió d’aquest tumor. Per tant, els objectius d’aquest projecte de tesi doctoral són identificar, caracteritzar i validar les possibles vies oncogèniques regulades per SOX11 per obtenir un millor i major coneixement de la patogènesi del LCM, i trobar possibles candidats per a teràpies específiques per aquest tumor. Per realitzar aquests objectius hem estudiat els gens directament regulats per SOX11 mitjançant immunoprecipitació de cromatina,així com el fenotip associat a la pèrdua de l’expressió de SOX11 en línies cel·lulars de LCM establement transduïdes (model in vitro). A més a més, també hem estudiat l’habilitat tumorigènica de SOX11 mitjançant el xenotransplantament subcutani de les línies cel·lulars generades in vitro en ratolins immunodeficients (SCID) (model in vivo). Un cop hem identificat els possibles gens diana i les vies oncogèniques regulades per SOX11 mitjançant els models in vitro i in vivo, els hem validat en tumors humans primaris del LCM. S’han obtingut dos treballs d’investigació dels estudis que composen aquesta tesi doctoral, publicats a la prestigiosa revista d’hematologia Blood els anys 2013 i 2014. En ambdós treballs hem estudiat els mecanismes moleculars regulats per SOX11 responsables de la patogènesi i el desenvolupament maligne del LCM. El primer treball es centra en la caracterització del bloqueig del desenvolupament dels limfòcits B madurs degut a la sobre-expressió de SOX11 en el LCM, suggerint un diferent desenvolupament en la formació dels subtipus de LCM agressius i indolents. A més, també demostrem que SOX11 és indispensable pel creixement del LCM ja que tumors SOX11-negatius inoculats en ratolins SCID presenten un creixement menor comparat amb els tumors SOX11-positius. En el segon treball hem identificat, per primera vegada, la funció oncogènica de SOX11 en el LCM ja que regula processos angiogènics responsables del major creixement de les cèl·lules SOX11-positives. D’altra banda també mostrem noves aproximacions terapèutiques per aquest tipus de tumor que ajudarien a una millor estratificació i classificació dels pacients de LCM. Al primer article ens hem centrat en identificar les possibles funcions biològiques de SOX11 en el LCM. Combinant anàlisis de microarray d’immunoprecipitació de cromatina i perfil d’expressió diferencial després de silenciar l’expressió de SOX11, hem identificat gens diana i programes transcripcionals regulats per SOX11, incloent el bloqueig de la diferenciació de la cèl·lula B madura, la modulació del cicle cel·lular, l’apoptosi i el desenvolupament de cèl·lules mare. PAX5 apareix com un dels gens diana directes més significatius de SOX11. El silenciament de SOX11 disminueix l’expressió de PAX5, indueix la de BLIMP1 i promou el canvi de fenotip de cèl·lula B madura a la diferenciació plasmacítica inicial, tant en cèl·lules tumorals primàries del LCM com en un model in vitro. Els nostres resultats suggereixen que SOX11 contribueix al desenvolupament tumoral mitjançant la modulació del programa de la diferenciació terminal de la cèl·lula B en el LCM. A més, hem demostrat l’habilitat tumorigènica de SOX11 in vivo mitjançant un model de xenotransplantament de LCM en ratolins SCID. La reducció significativa del creixement tumoral de les cèl·lules amb expressió de SOX11 silenciada comparada amb el creixement de les cèl·lules de LCM amb alts nivells d’expressió de SOX11 dels xenotransplantaments, demostra la implicació de l’expressió de SOX11 en el comportament agressiu d’aquest limfoma. SOX11 se sobre-expressa en diferents tumors sòlids i en la majoria de LCM agressius. En el primer article constituent d’aquesta tesi doctoral hem demostrat que el silenciament de l’expressió de SOX11 redueix el creixement tumoral en un model de xenotransplantament, consistent amb el curs clínic indolent dels pacients del LCM SOX11-negatius. Tot i així, els mecanismes oncogènics directament regulats per SOX11 encara no s’han descrit. Per tant, en el segon treball ens hem centrat en la identificació i caracterització molecular de dits mecanismes. Hem observat que els tumors dels xenotransplantaments murins així com de pacients de LCM SOX11-positius estan enriquits en vies gèniques relacionades amb l’angiogènesi, i presenten una major densitat de microvasos comparada amb els tumors derivats dels xenotransplantaments i els tumors humans primaris SOX11-negatius. A més, el medi cel·lular condicionat derivat de cèl·lules SOX11-positives indueix una major proliferació, migració, formació de tubs, i activació de vies de senyalització angiogèniques en cèl·lules endotelials in vitro. Hem identificat el factor pro-angiogènic PDGFA com un gen diana directe de SOX11 en cèl·lules de LCM, la inhibició del qual elimina els efectes angiogènics accentuats en cèl·lules endotelials in vitro. Per altra banda, PDGFA està sobre-expressat en cèl·lules SOX11-positives tant en cultius cel·lulars de LCM, xenotransplantaments com en pacients de LCM. In vivo, el tractament dels xenotransplantaments SOX11-positius amb el fàrmac imatinib, un inhibidor del receptor de PDGFA, disminueix la neo-vascularització i el creixement tumoral de dites cèl·lules, equilibrant-lo al creixement tumoral de les cèl·lules SOX11-negatives. El nostre estudi identifica, per primera vegada, que SOX11 regula senyals de supervivència angiogèniques en el LCM, demostrant la seva implicació oncogènica en el comportament i progressió agressius d’aquest tumor maligne. A més a més, recalca la via SOX11-PDGFA com una possible diana terapèutica pel subtipus agressiu del LCM, una malaltia en la que encara actualment hi ha poques opcions terapèutiques duradores i complertes. En general, les conclusions d’aquest treball de tesi doctoral han estat les següents: 1. Identificació dels gens diana i les vies transcripcionals regulades per SOX11 en el LCM mitjançant experiments in vitro i in vivo. 2. Caracterització del bloqueig de la diferenciació dels limfòcits B madurs com a mecanisme del desenvolupament dels diferents subtipus de LCM agressius i indolents. Dit bloqueig està mediat per la sobre-expressió de PAX5 mitjançant SOX11. 3. Demostració de la implicació oncogènica de SOX11 en la patogènesi del LCM. 4. Caracterització de la regulació de processos angiogènics per part de SOX11 com a mecanisme oncogènic responsable del creixement tumoral del LCM agressiu. Dita regulació està mediada per la sobre-expressió de PDGFA mitjançant SOX11. 5. Identificació de possibles noves dianes terapèutiques en el LCM.

En aquesta tesi s’ha realitzat l’avaluació de l’eficàcia de la teràpia antiangiogènica i la teràpia dirigida a receptors ErbBs en tumors germinals testiculars (TGTs). Tot i que els TGTs són dels tumors amb taxes de curació més elevades, la incidència de la malaltia va augmentant en les poblacions caucàsiques i encara hi ha pacients que presenten resistència al cisplatí, amb l’agreujant de que són pacients joves entre 15 a 35 anys. En primer lloc hem observat que els receptors ErbB1, ErbB2 i ErbB3 s’expressen de manera generalitzada en els TGTs ortotòpics de diferent component histològic, mantenint a més a més el patró d’expressió del tumor primari a xenògraft. En un d’aquest models, el coriocarcinoma TGT38, es va avaluar l’eficàcia de les teràpies dirigides contra els receptors ErbBs. En estudis previs s’havia observat que aquest tumor no responia a les teràpies dirigides a ErbB1, malgrat presentava uns elevats nivells d’expressió del receptor. En aquest estudi, per contra, hem observat que el tractament dirigit de manera dual al bloqueig d’ErbB1 i d’ErbB2, tractant amb lapatinib, comprometia en un 50% el creixement tumoral, així com provocava la inhibició de les vies de senyalització efectores ERK1/2, AKT i STAT3. Demostrem doncs que l’activitat d’ErbB2 dimeritza amb ErbB3, i aquest heterodímer té un paper clau en el creixement tumoral del TGT38, així com en la proliferació de cel•lular de tumor testicular in vitro, i que confereix la resistència de novo a les teràpies dirigides a ErbB1. L’altra teràpia estudiada en aquesta tesi és l’antiangiogènica, que hem avaluat utilitzant pazopanib, inhibidor dels receptors de VEGF, dels receptors de PDGFalfai -beta,i c-KIT. Hem observat com aquest fàrmac bloqueja significativament el creixement tumoral del tumor sensible a cisplatí TGT38, així com una activitat antitumoral sinèrgica amb lapatinib. Per altra banda també hem observat un bloqueig significatiu en el TGT44, un model tumoral que presenta resistència a cisplatí, característica mantinguda del tumor primari on ja va presentar refractorietat al quimioterapèutic. En ambdós models tumorals hem observat que pazopanib tenia una activitat antiangiogènica i antitumoral, així com també hem observat com bloquejava la proliferació de cèl•lules tumorals de TGTs in vitro presentant més efecte en les cèl•lules amb resistència a cisplatí que en les sensibles. En aquesta línia d’investigació hem observat com PDGFRbeta, un dels receptors diana de pazopanib, es sobre expressa en els fenotips resistents de parelles sensibles-resistents a cisplatí, tant de línies cel•lulars de TGTs com de tumors ortotòpics testiculars. Hem demostrat també que el principal efector d’aquest receptor és AKT, observant també una sobre activació d’aquest en les cèl•lules resistents a cisplatí comparat amb les sensibles; així com una activació en presència de PDGF-BB i una disminució en presència de shRNAs pel receptor o del tractament amb pazopanib. En aquest estudi hem descrit doncs l’activació de la via de PDGF-BB/ PDGFRbeta/AKT com a nou mecanisme de resistència adquirida a cisplatí. A més a més hem observat una elevada expressió de PDGFRbetaen la majoria de TGTs humans analitzats. El conjunt dels resultats presenten a pazopanib com a possible agent per una teràpia alternativa al tractament dels pacients de TGT sensibles o resistents a cisplatí, sol o en combinació amb teràpies dirigides a receptors ErbBs.
Cisplatin resistance in testicular germ cell tumor (TGT) patients is still a clinical challenge, and the aim of this study has been the study of different therapies for TGT. On one hand we’ve detected high expression of ErbB1, ErbB2 and ErbB3 receptors in different human TGTs and that the expression pattern was maintained to the orthotopic animal models generated. We’ve described that the heterodimer ErbB2/ErbB3 has an important role in tumor growth of a TGT model in vivo and in in vitro tumor testicular cells and its activity might explain the de novo resistance to pure ErbB1 receptor inhibitors. We’ve shown that treatment with lapatinib caused a 50% inhibition in TGT38 tumor growth, a coriocarcinoma ortotopic tumor sensitive to cisplatin. Moreover, in this model we observed that lapatinib treatment in combination to pazopanib had an additive effect blocking tumor growth. Furthermore, pazopanib had an important antitumoral effect in a new orthotopic model generated from a metastatic TGT refractory to first-line cisplatin chemotherapy (TGT44). Pazopanib main targets are the VEGFRs, PDGFRs and c-KIT receptor, and in this work we’ve observed that not only had antiangiogenic effect in vivo, besides it had antitumoral activity also in in vitro TGT cells. Moreover the antiproliferative effect was stronger in cisplatin-resistant cells than in the sensitive counterparts. Our results indicated that there was an overexpression of PDGFRbetaand an AKT overactivation in cisplatin-resistant cells, compared with sensitive cells. When PDGFRbetalevels were decreased CDDP-resistant cells behaved like sensitive cells, and PDGF-BB stimuli was the only that activated AKT phosphorilation. These results suggested that PDGFRbetaoverexpression was responsible for AKT overactivation, presenting the PDGFRbeta-AKT pathway as a pathway involved in the development of cisplatin resistance in TGT cells. Furthermore we also found overexpression of PDGFRβ in CDDP-resistant choriocarcinoma orthotopic tumor versus their CDDP-sensitive counterpart, and we found high PDGFRbetalevels in human testicular tumors. All together, these results present pazopanib as possible agent for an alternative treatment of cisplatin-sensitive and cisplatin-refractory TGT patients, alone or in combination with anti-ErbB therapies.

ANTECEDENTS: La síndrome de la hipertensió portal és la més greu complicació de les malalties cròniques del fetge. Estudis anteriors del nostre grup i altres grups de recerca en models experimentals d’hipertensió portal i cirrosi han demostrat l’existència d’un procés actiu d’angiogènesi en l’establiment d’aquesta malaltia. Aquests processos angiogènics estan regulats per factors proangiogènics, com VEGF, entre d’altres, i factors antiangiogènics. HIPÒTESI: L’ús de factors antiangiogènics endògens pot ser una estratègia d’inhibició de l’angiogènesi patològica en malalties com la hipertensió portal i la cirrosi més segura i efectiva que els tractaments antiangiogènics tradicionals. OBJECTIU: Determinar la implicació dels factors antiangiogènics endògens VASH1 i PEDF com a reguladors de l’angiogènesi patològica en la hipertensió portal i cirrosi hepàtica, i avaluar experimentalment noves estratègies terapèutiques pel tractament d’aquesta malaltia basades en aquests factors. METODOLOGIA: Anàlisi de l’expressió de PEDF i VASH1 en fetge i mesenteri en diferents models experimentals (CBDL, PPVL i/o CCl4) i en mostres de fetges cirròtics humans, determinant la seva implicació durant el procés de la malaltia i comparant amb l’expressió de factors proangiogènics com VEGF. A continuació, estudi dels efectes de la sobreexpressió de VASH1 i PEDF en les alteracions vasculars i hemodinàmiques de rates amb hipertensió portal i cirrosi biliar secundària, fent servir pautes de tractament profilàctiques (prevenció) i terapèutiques (intervenció). RESULTATS OBTINGUTS: Caracterització del patró d’expressió de VASH1 i PEDF en relació al factor VEGF, observant un augment d’aquests factors tan en fetge com en mesenteri de diferents models animals i en fetges cirròtics humans. Demostrant, en el cas de VASH1, una regulació per retroalimentació negativa de VASH1/VEGF, i en el cas de PEDF, suggerint un mecanisme compensatori dirigit a reduir els efectes patològics de VEGF. Per altra banda, la sobreexpressió de factors antiangiogènics endògens com PEDF i VASH1 es tradueix en efectes beneficiosos, tant esplàncnics com intrahepàtics, en animals amb hipertensió portal i cirrosi com són baixada de la pressió portal, disminució en la formació de vasos col.laterals portosistèmics, reducció de la fibrogènesi en fetge i disminució de l’angiogènesi en fetge i mesenteri. CONCLUSIONS: Els estudis realitzats en la present tesi doctoral evidencien que els factors antiangiogènics VASH1 i PEDF poden ser noves estratègies terapèutiques contra la hipertensió portal i cirrosi hepàtica gràcies a les seves propietats antiangiogèniques i antifibròtiques.
1) Disruption of negative feedback loop between vasohibin-1 and vascular endothelial growth factor decreases portal pressure, angiogenesis, and fibrosis in cirrhotic rats. Pathological angiogenesis represents a critical hallmark for chronic liver diseases. Understanding the mechanisms regulating angiogenesis is essential to develop new therapeutic strategies that specifically target pathological angiogenesis without affecting physiological angiogenesis. Here we investigated the contribution and therapeutic impact of the endogenous angioinhibitor vasohibin-1 in portal hypertension and cirrhosis. The spatiotemporal expression profiling of vasohibin-1 and its relationship with vascular endothelial growth factor (VEGF), angiogenesis, and fibrogenesis was determined through the analysis of human cirrhotic liver specimens, widely accepted in vivo animal models of portal hypertension and cirrhosis, and in vitro angiogenesis assays. Effects of vasohibin-1 overexpression by adenoviral-mediated gene transfer on angiogenesis, fibrogenesis, and portal hypertension-associated hemodynamic alterations were also studied in rats. We found that vasohibin-1 and VEGF are up-regulated, in mesentery and liver, in cirrhotic and precirrhotic portal hypertensive rats and cirrhosis patients. Our results are consistent with vasohibin-1/VEGF cascades being spatially and temporally coordinated through a negative-feedback loop driving pathological angiogenesis. Paradoxically, further overexpression of vasohibin-1 by adenoviral gene transfer exerts multifold beneficial effects in portal hypertension and cirrhosis: reduction of pathologic angiogenesis, attenuation of liver fibrogenesis partly mediated through inhibition of hepatic stellate cell activation, and significant decreases in portocollateralization, splanchnic blood flow, portohepatic resistance, and portal pressure. The explanation for this apparent contradiction is that, unlike endogenous vasohibin-1, the ectopic overexpression is not regulated by VEGF and therefore disrupts the negative-feedback loop, thus generating constant, but lower levels of VEGF synthesis sufficient to maintain vascular homeostasis but not pathological angiogenesis. Conclusion: Our study provides evidence that vasohibin-1 regulates portal hypertension-associated pathological angiogenesis and highlights that increasing vasohibin-1 might be a promising novel therapeutic strategy for portal hypertension and cirrhosis. 2) Antiangiogenic and antifibrogenic activity of pigment epithelium-derived factor (PEDF) in bile duct-ligated portal hypertensive rats. Antiangiogenic strategies have been proposed as a promising new approach for the therapy of portal hypertension and chronic liver disease. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) is a powerful endogenous angiogenesis inhibitor whose role in portal hypertension remains unknown. Therefore, we aimed at determining the involvement of PEDF in cirrhotic portal hypertension and the therapeutic efficacy of its supplementation. PEDF expression profiling and its relationship with vascular endothelial growth factor (VEGF), neovascularisation and fibrogenesis was determined in bile duct-ligated (BDL) rats and human cirrhotic livers. The ability of exogenous PEDF overexpression by adenovirus-mediated gene transfer (AdPEDF) to inhibit angiogenesis, fibrogenesis and portal pressure was also evaluated in BDL rats, following prevention and intervention trials. PEDF was upregulated in cirrhotic human and BDL rat livers. PEDF and VEGF protein expression and localisation in mesentery and liver increased in parallel with portal hypertension progression, being closely linked in time and space with mesenteric neovascularisation and liver fibrogenesis in BDL rats. Furthermore, AdPEDF increased PEDF bioavailability in BDL rats, shifting the net balance in the local abundance of positive (VEGF) and negative (PEDF) angiogenesis drivers in favour of attenuation of portal hypertension-associated pathological neovascularisation. The antiangiogenic effects of AdPEDF targeted only pathological angiogenesis, without affecting normal vasculature, and were observed during early stages of disease. AdPEDF also significantly decreased liver fibrogenesis (through metalloproteinase upregulation), portosystemic collateralisation and portal pressure in BDL rats. This study provides compelling experimental evidence indicating that PEDF could be a novel therapeutic agent worthy of assessment in portal hypertension and cirrhosis.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química. Ingeniero Civil Químico
Uno de los mayores desafíos para la ingeniería de tejidos óseos es el desarrollo de estructuras que puedan promover la formación de hueso y estimular la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis). El biovidrio es un material prometedor en el área de regeneración ósea y corresponde a un vidrio cerámico que puede ser dopado con distintos elementos, permitiendo otorgarle nuevas funcionalidades. En particular se destacan los iones metálicos terapéuticos, tales como el cobalto, debido a su capacidad de mejorar la angiogénesis. Esta tesis pretende desarrollar vidrios dopados con cobalto mediante el método sol-gel y estudiar los efectos que tiene la incorporación de este ión en las propiedades finales del material. Se sintetizaron mediante 2 métodos sol-gel distintos vidrios bioactivos ternarios (60SiO2-36CaO-4P2O5 %mol) dopados con 1, 2 y 4%mol de CoO, buscando obtener micro y nanopartículas (método 1 y 2 respectivamente). El área específica, la nanotopografía y el rol del cobalto en la estructura, ya sea como óxido intermediario o modificador de red, de los materiales obtenidos dependen del método de síntesis. Todos presentaron una disminución de la bioactividad al incorporar cobalto, pero las micropartículas presentaron mejores propiedades de liberación de cobalto. Así también, las micropartículas presentaron mejores resultados de viabilidad celular en comparación con las nanopartículas, asociado a las mayores áreas superficiales y mayor liberación de calcio de estas últimas. Por otro lado, todos los materiales presentaron una capacidad alcalinizadora que afectó negativamente tanto a las células SaOS-2 como Ea.HY, durante los ensayos de citocompatibilidad y migración. Se prepararon mediante fundido compósitos de PDLLA con un 10% en peso de vidrios sintetizados por el método 1. Después de 28 días de inmersión en SBF no se observó la formación de apatita mediante SEM o DRX, pero el análisis EDS indica una razón Ca/P relacionada a esta fase mineral. Además, la incorporación de vidrio en una matriz polimérica permitió regular la liberación de iones, mitigando los efectos alcalinizadores. Los compósitos con biovidrios dopados con cobalto presentaron mayores migraciones que el compósito con vidrio ternario, pero faltan estudios de los factores angiogénicos para determinar el efecto terapéutico del cobalto. Los efectos del dopaje con cobalto y la incorporación de estos vidrios en matrices poliméricas descritos en este trabajo proporcionan información importante a la hora de decidir el uso de estos materiales en ingeniería de tejidos y regeneración ósea.

La via de Calcineurina (Cn)- Factor Nuclear de Cèl·lules T Activades (NFAT) ha estat descrita clàssicament com a via de senyalització essencial en el funcionament de les cèl·lules T del sistema immunològic i amb els NFATc com a factor de transcripció clau en la resposta immunitària contra els òrgans trasplantats. Actualment s'usen fàrmacs com la Ciclosporina A i el FK506 per a inhibir la calcineurina i la conseqüent activació de NFAT en teràpies immunosupressores per al tractament del rebuig d'òrgans. Aquests fàrmacs, però, inhibeixen la totalitat d'activitat fosfatasa de la calcineurina de manera que no només la via Cn-NFAT en resulta afectada. Com a conseqüència, el tractament amb aquests fàrmacs porta associat tota una llista d'efectes secundaris indesitjats. La proteïna RCAN3 sencera i/o el pèptid RCAN3178-210 (pèptid derivat de la proteïna RCAN3, aminoàcids 178-210) inhibeixen específicament la via de Cn-NFATc mitjançant competició de RCAN3 amb NFATc per unir-se a calcineurina mitjançant un motiu aminoacídic similar en les dues proteïnes anomenat PxIxIT. RCAN3, per tant, pot ser un regulador específic i, el més important, endogen de la via Cn-NFAT. Donat que els factors de transcripció NFATc estan implicats en varis processos del desenvolupament tumoral (pàncrees, pell, mama), l'objectiu principal d’aquest treball és determinar l’efecte biològic i funcional de la sobreproducció de RCAN3 i del pèptid R3178-210 que conté el motiu PxIxIT com a inhibidor de la via de Cn-NFATc en la progressió tumoral i avaluar la possibilitat d’usar aquesta proteïna o pèptid, o derivats o mimètics d’aquests, en el tractament de la progressió tumoral i metàstasi en el càncer de mama humà triple negatiu (TNBC) usant ratolins com a models ortotòpics d'aquest tipus de càncer. La hipòtesi d'aquest treball és que RCAN3 i el pèptid CIC inhibeixen la progressió tumoral mitjançant la inhibició de la via de Cn-NFATc i serien per se possibles nous agents terapèutics antitumorals. Els resultats indiquen que la sobreproducció de RCAN3, així com el pèptid R3178-210 inhibeixen la translocació dels NFATc a nucli afectant així la transcripció de gens dependents de NFAT (com el gen proangiogènic de la Ciclooxigenasa 2 (cox-2) i el gen proinflamatori de la Interleukina 8 (Il-8)) i el nivell de producció de les corresponents proteïnes (COX-2 i IL-8). En models ortotòpics TNBC, s'ha observat una reducció significativa en el volum dels tumors que sobrexpressen RCAN3 possiblement com a conseqüència d'una alteració en l'angiogènesi tumoral. A més, aquests tumors presenten un increment en l'apoptosi cel·lular i una disminució en el número de cèl·lules en proliferació en comparació amb els tumors control. Els tumors RCAN3 també presenten una reducció en el número de cèl·lules immunitàries infiltrades en el tumor. Aquest resultat es creu que podria ser degut, entre d'altres factors, a l'efecte indirecte de la sobrexpressió de RCAN3 sobre il-8. El TNBC és un càncer que fàcilment crea metàstasis a partir d'una transició epitelio-mesenquimal (TEM) i per això s'han analitzat marcadors que s'associen a la formació de metàstasis com S100A4 i marcadors TEM com la e-cadherina i la vimentina. Els resultats indiquen que els tumors RCAN3, tot i no presentar canvis en les proteïnes epitelio-mesenquimals escollides, presenten una inhibició del marcador premetastàtic S100A4. Respecte als tumors R3178-210, s'han obtingut els mateixos resultats, tot i que amb significances una mica més modestes. Aquest fet reforça el paper clau dels aminoàcids 178-210 de RCAN3 en a la regulació endògena de la via Cn-NFAT i la seva implicació en càncer TBNC. Finalment s'ha realitzat una primera aproximació experimental per utilitzar el pèptid R3178-210 com a eina terapèutica i els resultats preliminars han sigut que, malgrat no observar reducció en el volum tumoral dels animals tractats amb el pèptid, sí que es repeteix l'efecte inhibitori sobre l'angiogènesi.
The members of the human regulators of calcineurin (RCAN) protein family are endogenous regulators of the calcineurin (CN)-cytosolic nuclear factor of activated T-cells (NFATc) pathway activation. This function is due to the presence of a highly conserved aminoacidic motif in RCAN3 protein, which has been shown to compete with NFATc for the binding to CN. As a consequence, RCAN3 is able to inhibit NFATc activation by CN. Very recently, emerging roles for NFATc proteins in transformation, tumour angiogenesis and metastasis have been described in different cancer cell types. In this work, we report that the overexpression of RCAN3 dramatically inhibits tumour growth and tumour angiogenesis in an orthotopic human Triple Negative Breast Cancer mouse model. We also observed a decrease in proliferative cells and an increase in apoptotic cells compared to control tumours. We suggest that RCAN3 exerts these effects in a CN-dependent manner, as mutation of the aminoacidic motif in RCAN3 abolishes the tumour suppressor effect. Moreover, the expression of the R3178-210 peptide, spanning the motif of RCAN3, is able to reproduce all the antitumor effects of RCAN3 full-length protein. Also we show that RCAN3 and the R3178-210 peptide inhibit the CN-NFATc signalling pathway and the induction of the NFATc-dependent gene cyclooxygenase-2 and IL-8. Our work suggests that the R3178-210 peptide possess potent tumour suppressor properties and therefore constitutes a novel lead for the development of potent and specific antitumoral agents. With these results, we've done a first approach using the peptide R3178-210 as a treatment against this disease. We've treated the tumours with the peptide and we've seen that although no changes in tumour volume were observed, the effect on tumour angiogenesis repeated significantly. We propose the targeting of the CN-NFATc pathway in the tumour cells could constitute an effective way to hamper tumour progression by impairing the paracrine network among tumour, endothelial and immune tumour infiltrated cells.

La obesidad se asocia con un estado de inflamación crónica de bajo grado y es considerada uno de los mayores factores de riesgo cardiovascular y de otro tipo de enfermedades como son la diabetes, hipertensión, arteriosclerosis y trombosis. Se han descrito diversos procesos que tienen lugar en el tejido adiposo y que determinan el desarrollo de la obesidad. Sin embargo, el tejido adiposo no solo se considera un órgano de almacenamiento energético o endocrino, sino que hoy en día también es considerado como una fuente de células madre mesenquimales (ASC). Recientemente las ASC se han convertido en una alternativa de gran interés en terapia celular para regenerar el corazón dañado. Sin embargo se ha sugerido que una alteración en la homeostasis de las células madre desencadenada por un estímulo nocivo, constante y repetitivo, como podría ser el caso de una enfermedad crónica, podría provocar un desequilibrio persistente en el reservorio de éstas células produciendo un cambio prematuro e irreversible del potencial regenerador de las células madre. De hecho, estudios previos han demostrado que la presencia de factores de riesgo cardiovascular, como la hipertensión, la enfermedad coronaria o la diabetes, alteran y merman las propiedades de las células progenitoras circulantes. Del mismo modo, se ha visto que la edad y el género modifican la funcionalidad de las ASC. El objetivo central de esta tesis ha sido el estudiar y caracterizar las ASC derivadas de pacientes obesos. En esta tesis doctoral se ha observado que la presencia de desórdenes metabólicos disminuye el porcentaje de células positivas para ciertos marcadores característicos de ASC, como es el caso de CD90, en el tejido adiposo. Sin embargo, una vez aisladas las ASC, independientemente del índice de masa corporal del donante de las ASC, éstas presentan el 100% de los marcadores característicos confirmándonos la obtención de una población homogénea. No obstante, hemos observado que algunas características importantes y necesarias para el uso de las ASC en la terapia celular se ven afectadas cuando las células se aíslan de pacientes que presentan obesidad mórbida y factores de riesgo cardiovascular. A nivel clínico y en la terapia celular es beneficioso poder obtener el máximo número de células en el menor tiempo posible. El hecho de que observemos una mejora en la velocidad de crecimiento celular al cultivar las ASC en condiciones de hipoxia refuerza el uso de bajas concentraciones de oxígeno a la hora de su expansión para fines clínicos. Sin embargo, el uso de las ASC de pacientes obesos no parece ser tan beneficioso. Estas células presentan un crecimiento celular más lento, una menor capacidad proangiogénica al liberar el factor antiangiogénico trombospondina-1, así como una capacidad de diferenciación disminuida respecto a las ASC de pacientes no-obesos. De hecho, parece ser que las ASC de pacientes obesos se encuentran en un estado de desarrollo menos multipotencial que las de individuos no-obesos, más dirigido hacia la adipogénesis, y a un estado más proinflamatorio. Una de las ventajas del uso de las ASC en la terapia celular es su uso autólogo, sin embargo esta ventaja desaparece en el caso de los pacientes obesos. Aunque se conocen bastante bien los cambios que se producen en el tejido adiposo de los obesos, no está muy estudiado como afectan estos cambios a la población endógena de células madre mesenquimales de éste tejido. Los resultados obtenidos en este trabajo nos ayudan a comprender mejor como la obesidad, y los desórdenes metabólicos que derivan de ella, afectan y modifican a la población de ASC.
The adipose tissue is an endocrine regulator and a risk factor for atherosclerosis and cardiovascular disease when by excessive accumulation induces obesity. Moreover, it has been demonstrated that the adipose tissue is a reservoir of mesenchymal stem cells. The potential use of adipose-derived stem cells (ASCs) from white adipose tissue for organ repair and regeneration has been considered because of their obvious benefits in terms of accessibility and quantity of available sample. However, age, adipose tissue depot site, and gender have been shown to modify the number and the proliferation, differentiation, and angiogenic capacity of ASCs. Our aim was to investigate the mechanisms by which obesity affects subcutaneous white adipose tissue stem cells. Here we report that ASCs from white adipose tissue of patients with obesity have lower proliferative and angiogenic potential than ASCs of nonobese metabolically normal individuals. Moreover, the transcriptomic profile of the stem cells reservoir in obese subcutaneous adipose tissue is highly modified with significant changes in genes regulating stemcellness, lineage commitment and inflammation. In addition to body mass index, cardiovascular risk factor clustering further affect the ASC transcriptomic profile inducing loss of multipotency and, hence, capacity for tissue repair. In summary, obesity produces a detrimental effect on its resident stem cells. In fact, the ASC undifferentiated multipotent state is impaired in obese patients with respect to non-obese individuals. These effects may negatively influence their regenerative potential when used in cell therapy and also in spontaneous repair of minor organ damage. Indeed, ASCs have already been tested in several clinical trials, from repair of heart ischemic injury to Crohn’s disease and multiple sclerosis. However, our observations indicate that the therapeutic strategies based on autologous ASC implantation would be impaired in patients with obesity and metabolic syndrome.

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Tumor growth and progression depend on angiogenesis, a process that involves the formation of new blood vessels from a preexisting vascular endothelium. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a potent mitogen for endothelial cells and its overexpression is associated with tumor growth and metastasis. However, the selection of a alternative splicing site at the end of the exon 8 of VEGF gene results in a sister-family of isoforms, VEGFxxxb, that seems to have anti-angiogenic proprieties. Objectives: The aim of this work was to quantitatively analyze the expressions of VEGF gene isoforms generated by alternative splicing in samples of head and neck squamous cells carcinoma and adjacent normal tissues, and to determine the effect of regulatory proteins in the control of VEGF gene splicing. Methods: The levels of VEGFxxx e VEGFxxxb mRNA and the splicing regulatory proteins SRp55, SRp40, ASF/SF2 and SRPK1 were quantified by real time quantitative PCR. Results: The overexpression of both VEGF isoforms (VEGFxxx and VEGFxxxb) was observed in head and neck squamous cells carcinoma related to normal tissue samples. A positive correlation between VEGFxxx and VEGFxxxb expression was observed in head and neck tumors. Splicing factor ASF/SF2 presented higher expression in tumors when compared to normal tissues. Pharynx tumors presented overexpression of VEGFxxx. VEGFxxxb was underexpressed in oral cavity tumors. Overexpression of both VEGF isoforms was observed in aggressive tumors. There was a positive correlation among ASF/SF2, SRp55 and SRp40 proteins and both VEGF isoforms, and among SRPK1 protein and ASF/SF2, SRp55 and SRp40 in tumor tissues. Conclusions: The results suggest that both VEGF isoforms play a role in angiogenesis promotion in head and neck tumors. VEGF isoforms present differential expression related to the anatomic sites of tumor and tumor aggressiveness. ASF/SF2, SRp55 and SRp40 proteins are involved in the regulation of the VEGF gene splicing mechanism.
O crescimento e a progressão de tumores dependem da angiogênese, processo de formação de novos vasos sanguíneos a partir de um endotélio vascular preexistente. O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um potente mitógeno de células endoteliais e o aumento de sua expressão é associado com crescimento tumoral e metástase. Entretanto, a seleção do sítio alternativo de splicing na extremidade 3 do éxon 8 do gene VEGF resulta em uma família-irmã de isoformas, VEGFxxxb, as quais parecem possuir propriedades anti-angiogênicas. Objetivos: A finalidade deste trabalho foi analisar quantitativamente a expressão de isoformas do gene VEGF geradas por splicing alternativo e de proteínas reguladoras de splicing do gene VEGF em amostras de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e tecidos normais adjacentes. Método: Os níveis de RNA mensageiro das isoformas VEGFxxx e VEGFxxxb e das proteínas reguladoras de splicing SRp55, SRp40, ASF/SF2 e SRPK1 foram quantificados por PCR quantitativo em tempo real. Resultados: Expressão elevada de ambas as isoformas de VEGF (VEGFxxx e VEGFxxxb) foi observada nas amostras de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço quando comparadas às amostras de tecido normal. Correlação positiva entre a expressão de VEGFxxx e VEGFxxxb foi observada em tumores de cabeça e pescoço. O fator de splicing ASF/SF2 apresentou maior expressão em tumores em relação aos tecidos normais. Tumores de faringe apresentaram expressão mais elevada de VEGFxxx em relação aos outros sítios anatômicos. VEGFxxxb apresentou expressão reduzida em tumores de cavidade oral. Expressão elevada de ambas as isoformas de VEGF foi observada em tumores mais agressivos. Correlação positiva foi observada entre as proteínas ASF/SF2, SRp55 e SRp40 e ambas as isoformas de VEGF e entre a proteína SR quinase SRPK1 e ASF/SF2, SRp55 e SRp40 nos tecidos tumorais. Conclusões: Os resultados indicam que ambas as isoformas de VEGF atuam na promoção da angiogênese em tumores de cabeça e pescoço. As isoformas de VEGF apresentam expressão diferencial em relação ao sítio anatômico e em relação à progressão da doença. As proteínas ASF/SF2, SRp55 e SRp40 estão envolvidas na regulação do mecanismo de splicing alternativo do gene VEGF.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014
IGF-1 es un factor de crecimiento que ejerce efectos mitogénicos, de diferenciación, anti-apoptóticos y metabólicos sobre diferentes tipos de células pero también participa en procesos patológicos como la neovascularización (NV) retinal, la cual se encuentra asociada a una excesiva proteólisis de la matriz extracelular (MEC). A nivel de la retina, diferentes enfermedades como la Retinopatía del Prematuro (ROP) y la Retinopatía Diabética Proliferativa (RDP) involucran la NV que puede provocar, en etapas finales de las mismas, la reducción parcial o total de la visión. Se conoce que la hipoxia, principal desencadenante de estas patologías, produce fundamentalmente un desbalance entre factores pro-angiogénicos (VEGF, IGF-1, bFGF, PDGF) y anti-angiogénicos (PEDF, TGF-, Angiostatina, TIMP) que culmina con la NV, siendo este mecanismo en la actualidad el mejor estudiado. Sin embargo, la participación de otros factores independientes de hipoxia como IGF-1, al presente no ha sido completamente esclarecida. Si bien las retinopatías fueron clásicamente consideradas como una enfermedad vascular, evidencias más recientes indican que es también una enfermedad neurodegenerativa, por lo cual más de un tipo celular retinal se ven afectados en este proceso. Al respecto, las células gliales de Müller (CM) que tienen un rol crítico en el mantenimiento de la homeostasis del espacio extracelular así como en la conservación de la integridad de la barrera hemato-retiniana, merecen especial atención en la NV. Su asociación con los vasos retinales así como la capacidad de sintetizar factores como VEGF y metaloproteinasa (MMPs) dejan implícita la relación que existe entre las CM y el desarrollo tanto fisiológico como patológico de la NV retinal. Evidencias preliminares de nuestro laboratorio indican que IGF-1R está altamente expresado en las CM y que bajo estímulo con IGF-1 es capaz de regular la actividad de MMPs, sugiriendo que el sistema IGF-1/IGF-1R participaría en la regulación el complejo proceso de NV en la retina. Por lo cual, el principal interés de esta Tesis fue investigar el efecto de IGF-1 y su receptor sobre la actividad proteolítica extracelular asociada a eventos de migración celular en diferentes modelos experimentales. Para ello, en primer lugar utilizando como modelo experimental in vitro la línea de células gliales humana MIO-M1 demostramos por ensayos de Western blot que IGF-1, al interaccionar con su receptor, promueve la fosforilación del mismo así como la activación de las vías de señalización MAPK/ERK y PI3K/AKT de manera selectiva. A continuación y con el objeto de explorar los efectos de IGF-1 sobre la activación MMPs, se realizaron ensayos de zimografía con los sobrenadantes de 2 células MIO-M1 estimuladas con el factor observándose una disminución relativa de la forma activa de MMP-2, respecto a la obtenida en las células sin estímulo. Esta regulación de la actividad en los sobrenadantes se correlacionó con un incremento en MMP-2 a nivel de lisado celular. Además esta regulación demostró ser mediada por la via de señalamiento intracelular PI3K/AKT. Finalmente, por ensayos de inmunofluorescencia en células MIO-M1 no permeabilizadas observamos, luego del estímulo con IGF-1, una redistribución de la MMP de membrana tipo 1 (MT1-MMP), de MMP-2 y IGF-1R hacia los procesos celulares así como un importante acúmulo de estas proteínas sobre la membrana celular. Finalmente, y considerando que estos hallazgos denotan un fenotipo celular migratorio nos propusimos evaluar por ensayos de herida (scratch wound), el efecto de IGF-1 sobre la capacidad migratoria de las células MIO-M1. Los resultados mostraron que bajo estimulo, las CM incrementaron la capacidad de migración sobre proteínas de matriz extracelular, como colágeno tipo I y laminina siendo este proceso dependiente de la interacción de IGF-1 con su receptor. Habiendo analizado los efectos de IGF-1 sobre la regulación de MMPs en células de Müller, a continuación nos planteamos analizar los efectos de la hipoxia sobre estas proteinasas a modo de reproducir in vitro lo que ocurriría en patologías como las retinopatías. Nuestros estudios, en CM, demostraron que bajo condiciones de hipoxia, si bien la relación de MMP-2/pro-MMP-2 aumentó respecto a normoxia, el efecto de IGF-1 sobre la regulación de MMP-2 fue similar al demostrado en condiciones de normoxia. Además por ensayos de Western blot también observamos que la hipoxia no modifico la expresión proteica de MT1-MMP inducida por IGF-1 en estas células. Finalmente, la relevancia fisiopatológica de los estudios en el modelo in vitro fue evaluada utilizando un modelo de neovascularización inducida por oxigeno (OIR) en ratones, el cual ha sido ampliamente estandarizado y reproducido en nuestro laboratorio a juzgar por la presencia de áreas avasculares así como de ovillos neovasculares hacia la cavidad vítrea. En este modelo se analizó por ensayos de inmunofluorescencia la expresión de IGF-1R observándose en células GFAP positivas, lo cual confirmó que durante el desarrollo IGF-1R se expresa a nivel de astrocitos y bajo condiciones de hipoxia en CM, entre otras. Conociendo que in vitro IGF-1 regula la actividad de MMP-2 en CM, posteriormente evaluamos la expresión de MMP-2 en el tejido retinal. Así, observamos que células positivas para glutamina sintasa (GS) un marcador especifico de CM, fueron positivas para MMP-2 lo cual confirma la expresión de MMP-2, en el modelo in vivo, por las CM. En el modelo de OIR, MMP-2 se expresó preferencialmente en los endfeet de las CM coincidiendo con el área de ovillos NV. Finalmente y con el propósito de analizar la contribución de IGF-1 en los procesos de NV, se administró a P12, por via intraocular, un anticuerpo que bloquea específicamente la activación de 3 IGF-1R, αIR3, en el modelo de OIR. En forma notable, el bloqueo del receptor de IGF-1 logró inhibir la NV así como disminuir el área avascular generando un efecto normalizador en la vasculatura de retinas de animales OIR. En conjunto, estos resultados demuestran que el Sistema IGF-1/IGF-1R regula la actividad de MMP-2 en CM, colaborando con la neovascularización de la retina durante procesos isquémicos proliferativos como las retinopatías. Además, el sistema IGF-1/IGF-1R al actuar como un factor estimulante de la migración de la propia célula de Müller, tendría implicancias tanto durante el desarrollo retinal como en procesos neurodegenerativos. Respecto al primero, actuando como regulador de la migración celular hacia las distintas capas retinales mientras que en el segundo estaría asociado con la aplicación de terapias celulares. Finalmente, el bloqueo terapéutico de IGF-1R en el modelo de OIR, el cual demuestra poseer un gran potencial de normalización de la vasculatura, se convierte en una posible alternativa terapéutica para el tratamiento de las retinopatías proliferativas retinales como la ROP y la RDP.
Lorenc, Valeria Erika. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Sánchez, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
Bregonzio, Claudia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina.
Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Quiroga, Santiago. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Politi, Luis Enrique. Universidad Nacional del Sur. Investigación y desarrollo en Modelado, Identificación y Control de Sistemas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina.