Dissertations / Theses on the topic 'Neuroni'

Frank Rosenblatt, padre del percettrone, nel 1962 sottolineò che l’ obiettivo ultimo della ricerca nel campo delle reti neurali artificiali doveva essere “indagare le strutture fisiche ed i principi neurodinamici che stanno alla base dell’intelligenza naturale”. A differenza di quel che desiderava Rosenblatt, i metodi maggiormente utilizzati e di conseguenza studiati sono quelli supervisionati, non biologicamente plausibili, ritenuti maggiormente efficaci rispetto alle reti che sfruttano metodi di apprendimento ispirati dalla biofisica dei neuroni. L’ obiettivo della tesi è quello di analizzare due metodi di apprendimento non supervisionati basati su sistemi neuronali biologici: il modello di L.Bienenstock, N.Cooper e W. Mundro del 1982 (BCM) ed il modello di D.Krotov e J.Hopfield del 2019, e comprenderne le reali capacità. La prima parte della tesi rappresenta un’ introduzione al concetto di rete neurale artificiale, al significato di rete multistrato e all’ algoritmo di apprendimento della retro propagazione dell’ errore, tipico delle reti supervisionate. La seconda parte della tesi illustra il funzionamento della BCM e della rete di Hopfield e Krotov. Nei risultati riguardanti la rete del 2019, viene riportato un confronto tra questo modello ed un modello addestrato tramite retro propagazione dell’ errore, con cui riesce a competere nel riconoscimento delle immagini appartenenti a due data set: il MNIST ed il CIFAR-10. Per quanto riguarda la BCM, vengono riportati e discussi i risultati di alcune simulazioni effettuate con la rete modello BCM della libreria Plasticity. Lo scopo delle simulazioni era quello di portare i pesi della rete a memorizzare il maggior numero di pattern differenti possibili, appartenenti al data set MNIST.

Trattazione teorica dei neuroni artificiali, con analisi di come questi sono stati sviluppati a partire dall'analisi di un neurone biologico e dal modello matematico di Hodgkin-Huxley, con un approfondimento riguardante gli ipotetici utilizzi.

Le reti neurali sono uno strumento informatico che si è progressivamente affermato dalla sua nascita, e si è distinto per le sue grandi potenzialità. Pur non essendo ancora presente una teoria matematica formale che le descriva, esse sono state approfonditamente studiate da ingegneri e informatici, rendendo il loro studio una branca tanto ampia quanto preziosa. In questa tesi presento alcuni modelli di rete neurale e ne illustro le caratteristiche a livello di topologia, elaborazione e addestramento.

La disciplina della biomatematica, ovvero la matematica applicata alla biologia, ha come obiettivo quello di descrivere fenomeni biofisici attraverso sistemi di equazioni matematiche (i cosiddetti modelli matematici). In questo elaborato si vogliono studiare due modelli matematici che definiscono il fenomeno biomedico della trasmissione di un impulso nervoso. Il modello di Hodgkin-Huxley ed il modello di FitzHugh-Nagumo illustrano infatti la propagazione dell’impulso lungo l’assone di un neurone, regolato da pompe attive di sodio (Na^+) e potassio (K^+). In particolare, questi due modelli sono definiti da sistemi autonomi di equazioni differenziali ordinarie (ODEs). Per descrivere matematicamente tale processo è stato necessario considerare i sistemi autonomi di equazioni differenziali ordinarie, il fenomeno della biforcazione di Hopf e i concetti di punti fissi e di biforcazione. Lo scopo di questa tesi è quindi mostrare come questi modelli, pur essendo semplificazioni di un fenomeno biologico, diano risultati qualitativi in sorprendente accordo con la realtà.

1. Introduzione I neuroni dopaminergici (DA) della substantia nigra pars compacta (SNc) sono tra i più studiati nel sistema nervoso centrale per la loro implicazione nella malattia del Parkinson. Essi presentano un ampio corredo di correnti voltaggio-dipendenti, tra le quali emerge una tipica corrente attivata da iperpolarizzazione, la Ih. Diversamente dalla maggior parte delle cellule nervose, i neuroni dopaminergici della SNc presentano una attività spontanea regolare dopo isolamento o riduzione degli input sinaptici, e non è, quindi, sorprendente che numerosi lavori abbiano indagato il ruolo della Ih nell'attività spontanea. Tuttavia il ruolo della Ih non è stato ancora ben compreso, dal momento che il blocco di questa corrente non sembra comportare nessuna alterazione significativa della frequenza di scarica. Abbiamo, allora, riesaminato il problema studiando la corrente h, in fette sottili di cervello, in condizioni sperimentali che si differenziano dalla maggior parte degli studi precedenti per tre aspetti fondamentali: i) abbiamo utilizzato topi transgenici che esprimono una proteina reporter (GFP) sotto il promotore tirosina idrossilasi (TH), per identificare i neuroni DA della SNc; ii) abbiamo effettuato le registrazioni elettrofisiologiche a 37°C; iii) abbiamo eseguito la maggior parte degli esperimenti in condizioni di patch perforato al fine di lasciare inalterato l’ambiente fisiologico intracellulare. 2. Risultati Il nostro primo obiettivo è stato quello di effettuare un'analisi dettagliata della dipendenza della cinetica e dell’ampiezza della Ih dalla temperatura. Il protocollo di attivazione della corrente h prevedeva una serie di comandi iperpolarizzanti della durata di 4s e le registrazioni erano effettuate a 27°C e 37°C. Abbiamo calcolato che il coefficiente di temperatura (Q10) per la variazione di ampiezza della corrente h è pari 3,73, mentre i valori di Q10 relativi alle velocità di attivazione e deattivazione sono rispettivamente pari a 10,8 e 3,17. Il V50 è di -94,9 ± 1,07 mV a 27°C (n = 13) e -84,2 ± 1,31 mV a 37°C (n = 18). Abbiamo, successivamente, esaminato la modulazione da parte dei nucleotidi ciclici in condizioni di patch perforato a 37°C, in presenza di forskolina (10 μM), un attivatore della adenilato ciclasi, e IBMX (0.1 mM), un inibitore delle fosfodiesterasi, i quali, insieme, inducono un aumento della concentrazione intracellulare di adenosina monofosfato ciclico (cAMP). In queste condizioni abbiamo registrato un aumento dell'ampiezza Ih (da -178,53 ± 23,48 pA in condizioni di controllo a -227,01 ± 34,17 pA con forskolina a -130 mV, n = 8), uno spostamento del V50 di + 4,80 ± 0,68 mV (n = 8) e una riduzione delle costanti di tempo di attivazione di circa il 25%. Dato che questa modulazione è il risultato di un’interazione diretta del cAMP con il canale, abbiamo studiato gli effetti sulla Ih di diversi neurotrasmettitori accoppiati a proteine Gi o Gs, in particolare abbiamo testato la dopamina, la serotonina (5-HT) e la noradrenalina (NA). Il quinpirolo, un agonista dei recettori dopaminergici D2 (30 μM, dopo 3 minuti di applicazione nel bagno), ha indotto una diminuzione dell'ampiezza della Ih del 15% a -130 mV (n = 6), mentre il sulpiride, un antagonista dei recettori dopaminergici D2 (20 μM), ne ha determinato un aumento (n = 5). L'effetto sulla Ih della 5HT (100 μM), dopo 3 minuti di applicazione nel bagno, è stato una riduzione dell’ampiezza del 20% (n = 5); al contrario, l'applicazione nel bagno della NA (100 μM), ne ha indotto un aumento di circa il 12% (n = 8). Infine, abbiamo analizzato il ruolo della corrente h sull’autoritmicità. L'ivabradina (10 μM), bloccante del Ih, ha determinato una marcata iperpolarizzazione (circa -10 mV), che di fatto ha silenziato le cellule; tuttavia, questo effetto sull’attività spontanea era indiretto, poiché se la membrana era ripolarizzata, l’autoritmicità si ripristinava. 3. Conclusioni Gli studi eseguiti a temperatura ambiente sul ruolo e le proprietà della corrente h nei neuroni dopaminergici della SNc sono scarsamente informativi perché, in queste condizioni sperimentali, la corrente è sottovalutato in ampiezza, velocità e, in ultima analisi, nella sua capacità di svolgere alcun ruolo a potenziali fisiologici. Le registrazioni elettrofisiologiche a 37°C, invece, restituiscono un profilo più accurato e veritiero della Ih. La modulazione della corrente h ad opera di sistemi a secondo messaggero, un processo scarsamente esplorato nei neuroni dopaminergici della SNc, sembra essere rilevante, e suggerisce l'esistenza di diversi pathways importanti per il controllo dell’eccitabilità neuronale. La corrente h è, in ultima analisi, molto importante nell’autorimicità perché stabilizza il potenziale di membrana di riposo dei neuroni dopaminergici della SNc in uno stato depolarizzato, ma non ricopre un ruolo di principale nell’attività pacemaker. Questi risultati sono interessanti perché aprono nuove prospettive sul ruolo del canale HCN nei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta.

L’obiettivo di questo elaborato è quello di comprendere se esista una connessione tra neuroni specchio e apprendimento linguistico e, più nello specifico, tra neuroni specchio e lingua straniera. Il primo capitolo fornisce un rapido quadro generale sulla fisiologia del nostro organo pensante per cercare di capire quali siano le aree interessate dal linguaggio e quali siano i metodi di didattica della lingua madre e della lingua seconda. Il secondo capitolo si concentra invece proprio sulla scoperta dei neuroni specchio, evidenziandone soprattutto lo stretto legame con il linguaggio. Infine, il terzo e ultimo capitolo, è costituito interamente dall’intervista che il professor Fogassi mi ha gentilmente concesso. Come in molti sapranno, il professor Fogassi fa parte del gruppo di neuroscienziati che, all’inizio degli anni ’90, hanno scoperto i neuroni specchio. È proprio in questo capitolo, quindi, che il Professore illustra in maniera più approfondita quale sia la connessione tra linguaggio e sistema mirror, quali siano i più recenti esperimenti e le scoperte del settore e, infine, le ricadute che il sistema specchio può avere nella glottodidattica.

Medium-sized spiny neurons (MSNs) are the only neostriatum-projection neurons, and their degeneration underlies some of clinical features of Huntington's disease. We used human developmental biology and exposure to key neurodevelopmental molecules to drive human pluripotent stem (hPS) cells into MSNs. In a feeder-free adherent culture, ventral-telencephalic specification is induced by BMP/TGF-β inhibition and subsequent SHH/DKK-1 treatment. The emerging FOXG1+/GSX2+ telencephalic progenitors are then terminally differentiated, resulting in the systematic line-independent generation of FOXP1+/FOXP2+/CTIP2+/calbindin+/DARPP-32+ MSNs. Similarly to mature MSNs, these neurons carry dopamine- and A2a-receptors, elicit typical firing pattern, and show inhibitory postsynaptic currents, as well as dopamine neuromodulation and synaptic integration ability in vivo. When transplanted into the striatum of quinolinic acid-lesioned rats, hPS-derived neurons survive and differentiate into DARPP-32+-neurons, leading to a restoration of apomorphine-induced rotation behaviour. In summary, hPS cells can be efficiently driven to acquire a functional striatal fate using an ontogeny-recapitulating stepwise method. Moreover, we have established stable HD-iPS cell lines that recapitulating, in vitro, features of the disease can be used for investigating disease mechanisms that underlie HD, representing a platform for in vitro human developmental neurobiology studies and drug screening approaches.

Le caratteristiche strutturali dell’occhio dei Cetacei sono state in passato oggetto di studio. Tuttavia, i dati relativi alla stratigrafia della retina ed alle caratteristiche morfologiche dei neuroni gangliari in essa presenti sono piuttosto ridotti; per questo motivo, l’obiettivo della presente ricerca è stato quello di studiare, mediante metodiche di immunoistochimica, l’uso della microscopia ottica e di opportuni software di analisi immagine, le caratteristiche morfologiche della retina e delle cellule gangliari in essa presenti in differenti specie di Cetacei. Per la presente ricerca sono stati utilizzate come specie di riferimento i seguenti Delfinidi: tursiope (Tursiops truncatus) e stenella striata (Stenella coeruleoalba). Le analisi sulle sezioni interessano l’area, la densità dei neuroni gangliari, la stratigrafia della retina e l’analisi morfometrica degli strati e dei neuroni. I risultati ottenuti indicano come la retina del tursiope e della stenella striata, nonostante un'organizzazione di base assai simile a quella degli altri Mammiferi, mostri caratteristiche qualitative sue proprie. Gli strati retinici sono quelli che si osservano in tutti i Mammiferi e lo spessore totale della retina è, nel tursiope (101,23 µm ) e nella stenella striata (108.35 µm ), pressochè simile ai Mammiferi terrestri (110-220 µm). Nell'ambito della retina, lo strato che presento lo spesso medio maggiore è quello dei granuli interni (SNE); tale dato non coincide con quanto osservato in altri Mammiferi. I neuroni gangliari presenti nella retina di tursiope e stenella striata mostrano, analogamente a quanto osservato in altri Cetacei, una bassa densità cellulare. Nel tursiope e nella stenella striata le aree a maggiore densità cellulare presentano neuroni multipolari di dimensioni minori rispetto a quelle con bassa densità. Questo dato potrebbe indicare una "cellularità" (quantità di superficie occupata da cellule) costante nei differenti distretti retinici. I neuroni gangliari presenti nella retina di tursiope e stenella striata sono disposti in un unico strato, come osservato in numerosi altri Cetacei, ma differisce da quanto osservato nel capodoglio (Physeter macrocephalus) dove tali cellule si dispongono in strati multipli. Neuroni gangliari di grandi dimensioni sono stati osservati sia nel tursiope che nella stenella striata. Tale dato coincide con quanto osservato in altri Odontoceti ed in alcuni Misticeti. Allo stato attuale non è ancora stato dato un chiaro significato funzionale alle cellule gangliari giganti. Un possibile ruolo potrebbe essere quello di condurre, in animali di grossa mole, l'impulso nervoso molto velocemente, grazie alla presenza di un assone provvisto di un diametro notevole. Tale interpretazione non è da tutti accettata in quanto Mammiferi terrestri di grandi dimensioni non presentano nella loro retina neuroni gangliari giganti.

Scopo della tesi è stato studiare nel ratto libero di muoversi i correlati comportamentali (modificazione degli stati veglia/sonno, assunzione di cibo) e della funzionalità cellulare nervosa centrale della manipolazione farmacologica locale del Raphe Pallidus (RPa), area sede di pre-motoneuroni simpatici che regolano processi inerenti la termogenesi. Studi precedenti hanno mostrato, da un lato, che l’iniezione di Oressina A (ORXA) nel ratto a livello del RPa induce un aumento della temperatura cerebrale e della pressione arteriosa, ma solo in presenza di un drive termogenico in atto, indotto dall’esposizione a una temperatura ambientale (Ta) sub-termoneutrale. Dall’altro lato, è stato invece osservato che l’inibizione del RPa, mediante iniezione di un agonista GABA-ergico (muscimolo, MUS), determina nel ratto, specie non-ibernante, un blocco della termogenesi inducendo uno stato ipotermico di pseudo torpore e un’ampia riduzione dell'attività elettrica corticale. I risultati della tesi mostrano che l’iniezione di ORXA nel RPa a una Ta di 24°C, di poco inferiore al valore termoneutrale, induce un ampio e protratto aumento della veglia e un significativo aumento dell’assunzione di cibo. Gli effetti risveglianti sono meno intensi e l’assunzione di cibo non diversa da quella dei controlli dopo iniezione dell’antagonista GABA-ergico GABA-zina o di ORXA a Ta 32°C. Un’indagine immunoistochimica condotta per verificare se tali effetti comportamentali fossero legati a un’attivazione dei neuroni serotoninergici del RPa ha dato risultati negativi. Nel secondo esperimento, gli effetti indotti dall’ipotermia che segue un inibizione del RPa con MUS sull’attività cellulare di aree cerebrali che regolano processi di vigilanza e funzione autonomica sono stati valutati attraverso lo studio immunoistochimico della proteina Tau, della quale è stata osservata un’iperfosforilazione reversibile indotta dal torpore in specie ibernanti. I risultati ottenuti hanno mostrato nel ratto un andamento analogo a quello dell’ibernante naturale, suggerendo che l’iperfosforilazione Tau sia un meccanismo generalizzato di difesa dall’ipotermia della funzione cellulare nervosa.
Aim of this thesis was to assess, in the free behaving rat, the behavioral (wake/sleep states, food intake) and, at a brain level, cellular correlates of the local pharmacological manipulation of the Raphe pallidus (RPa), a brainstem area containing premotor sympathetic neurons regulating thermogenesis. Previous studies have shown that OrexinA (ORXA) injection in the RPa of rats induces an increase in brain temperature and blood pressure, but only in the presence of a thermogenic drive induced by the exposure to a sub-thermoneutral ambient temperature (Ta). Also, the inhibition of RPa in the rat (a non-hibernating species), through the injection of the GABA-ergic agonist (muscimol, MUS) promotes a block of thermogenesis inducing a hypothermic torpor-like state and a large decrease in cortical activity. The results shown in this thesis indicate that ORXA injection in RPa at Ta 24°C, slightly below the thermoneutral range, induces a large and sustained increase in wakefulness and a significant increase in food intake. The wake promoting effects are less intense and the food intake is not different from that of controls, after the injection of either the GABA-ergic antagonist GABA-zine or ORXA at Ta 32°C. An immunohistochemical study aimed at assessing whether these behavioural effects were due to an activation of serotonergic neurons in the RPa gave negative results. In the second experiment, the effects on cell function of the hypothermia which followed the inhibition of RPa by MUS were assessed in brain areas that regulate wake/sleep processes and autonomic function by an immunohistochemical study of Tau protein activity, since Tau has been shown to be reversibly hyperphosphorylated during torpor in hibernating species. The results showed a phosphorylation trend, in the rat, which resembled that observed in natural hibernating species, suggesting that Tau hyperphosphorylation is a general defense mechanism to protect cell function during hypothermia.

L’inibizione presinaptica è un meccanismo di modulazione sinaptica comunemente osservato nelle sinapsi del sistema nervoso centrale e periferico. Questo processo inizia in risposta all’attivazione di un’ampia varietà di recettori presinaptici e porta ad una riduzione della probabilità di fusione delle vescicole con la membrana del terminale sinaptico. Uno dei più comuni meccanismi d’azione consiste nell’inibizione dei canali del calcio voltaggio dipendenti (VDCCs) localizzati nei bottoni presinaptici. Tuttavia, esistono altre forme di inibizione presinaptica con meccanismi che coinvolgono direttamente la machinery di rilascio vescicolare. In questa tesi ho studiato il meccanismo di inibizione presinaptica mediata dal recettore metabotropico del glutammato del tipo III (mGluRs) e dal recettore GABAB nella trasmissione GABAergica dei neuroni dopaminergici della substantia nigra pars compacta (SNc) di ratto. L’AP-4 (100 μM), agonista selettivo del recettore metabotropico del glutammato del tipo III, e il baclofen (10 μM), agonista selettivo del recettore GABAB, riducono reversibilmente la frequenza delle correnti spontanee inibitorie post-sinaptiche (sIPSCs) rispettivamente del 48.5 ± 3.7 % e del 83.6 ± 2.3 % rispetto al controllo, senza avere alcun effetto sull’ampiezza della corrente. L’AP-4, non deprime la frequenza delle correnti inibitorie miniature post-sinaptiche (mIPSCs), registrate in tetrodotossina (TTX, 1 μM) e cadmio (100 μM), mentre è in grado di ridurre la frequenza delle mIPSCs del 75.3 ± 2.8 % rispetto al controllo, in presenza di TTX (1 μM) e bario (1 mM). Al contrario, il baclofen riduce la frequenza delle mIPSCs sia in cadmio (70.0 ± 6.7 % del controllo) sia in bario (52.3 ± 2.9 % del controllo). In TTX e ionomicina (2 μM), il baclofen riduce significativamente la frequenza delle mIPSCs del 71.8 ± 6.9 % del controllo, mentre l’AP-4 non ha effetto. In maniera simile, in presenza di TTX e α-latrotossina (α-LTX, 0.3 nM), la frequenza delle mIPSCs è diminuita del 64.5 ± 4.8 % del controllo dal baclofen, mentre mantiene gli stessi valori in presenza di AP-4. Infine, in continua presenza di baclofen, l’AP-4 non causa un ulteriore riduzione della frequenza delle sIPSCs. La conclusione di questi studi è che i recettori metabotropici del glutammato del tipo III deprimono il rilascio di GABA dai neuroni dopaminergici della SNc , attraverso l’inibizione dei VDCC, mentre i recettori presinaptici GABAB coinvolgono direttamente il rilascio vescicolare del neurotrasmettitore. Inoltre questi due diversi meccanismi di inibizione pre-sinaptica coesistono nello stesso terminale sinaptico. Questa caratterizzazione fornisce nuove conoscenze sul ruolo di questi recettori presinaptici nello studio della fisiologia della substantia nigra e nel loro potenziale uso come target nel trattamento farmacologico di malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson.
Presynaptic inhibition is a mechanism of synaptic modulation normally observed in the synapses of the nervous system. This process starts upon activation of a large number of presynaptic receptors and leads to the decreased probability of vesicles to fuse to the cell membrane. One of the most common mechanism consists in the inhibition of the voltage dependent calcium channels (VDCC) located on the active zone of the presynaptic neuron. However, there is evidence for another form of presynaptic inhibition with a direct impairment of the vescicular release machinery. In my thesis I have investigated the mechanisms of presynaptic inhibition by group III metabotropic glutamate receptors (mGluRs) and GABAB receptors of the GABAergic neurotransmission to dopamine (DA) neurones of the rat substantia nigra pars compacta (SNc). The group III mGluRs agonist L-(+)-2-amino-4-phosphonobutyric acid (AP4, 100 μM) and the GABAB receptor agonist baclofen (10 μM) reversibly depressed the frequency of spontaneous inhibitory postsynaptic currents (sIPSCs) to 48.5 ± 3.7 % and 83.6 ± 2.3 % of control, respectively, with no effect in their amplitude. AP4 did not affect miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) recorded in tetrodotoxin (TTX, 1 μM) and cadmium (100 μM), while in TTX (1 μM) and barium (1 mM), mIPSCs frequency was reduced to 75.3 ± 2.8 % of control. In contrast, baclofen reduced mIPSCs frequency either in cadmium (70.0 ± 6.7 % of control) or barium (52.3 ± 2.9 % of control). In TTX and ionomycin (2 μM), baclofen significantly reduced mIPSCs frequency to 71.8 ± 6.9 % of control, while AP4 had no effect. Similarly, in TTX and α-latrotoxin (α-LTX, 0.3 nM), the frequency of mIPSCs was reduced by baclofen to 64.5 ± 4.8 % of control, but was insensitive to AP4. Finally, in the continuous presence of baclofen, AP4 failed to produce any further reduction of sIPSCs frequency. The conclusion of this study is that group III mGluRs depress GABA release to DA neurons of the SNc through inhibition of presynaptic voltage-dependent calcium channels, while presynaptic GABAB receptors also impair transmitter exocytosis, and both mechanisms coexist on the same synapses. This characterization provides new insights about the role of these presynaptic receptors in the physiology of the substantia nigra and their potential involvement in the treatment of neurodegenerative diseases such as Parkinson’s Disease.

Language can be loosely defined as the ability to associate sounds and meanings through grammar rules. The problem of its origin, the definition of its characteristics and its social and philosophical implications are a constant factor crossing the disciplines and fields of research which are very distant with each other, ranging from religion to linguistics, from anthropology to archeology, from psychology to neuroscience. More recently, two subjects of particular interest for this work have taken a great interest in the origin of language: prehistoric archeology and neuroscience, which have merged in what Renfrew (2008) defines "neuroarcheology". The approach taken in this work aims to integrate the data derived from the ancient technical behavior with the data of neurophysiology to support the motor theory about the origin of language, according to the intuition of Liberman (1985, 1991, 2000) who identifies the last constituents of speech not in the sounds, but in the articulatory gestures evolved exclusively in the service of language. The study is based on the assumption that language production and lithics assemblages possess a common neural substrate, to be found in the involvement of the motor system in cognitive processes (Fadiga, Craighero 2006; Fadiga, Craighero 2007; Rizzolatti, Arbib 1998). As shown by recent data, Broca's area (area which is located at the foot of the third frontal convolution of the left hemisphere, corresponding to the Broadmann areas 44 and 45 ), in addition to its traditional functions (linguistic production, activation during listening), seems also involved in motor tasks such as the execution of actions and the observation of similar actions performed by others (Arbib 2000; Buccino 2005). Broca's area, in fact, is involved in the production and observation of manual and orofacial gestures. These data allowed to hypothesize that this area may represent a central hub for the connection between language, movement and sensory-motor processes (Fadiga, Craighero 2006). The immediacy with which we understand the actions of others has suggested the existence of a mechanism of direct and immediate understanding where the actions performed by others are directly represented in the observer's motor system, which contains, therefore, a motor copy of the actions observed by allowing a better understanding, prior to any process of cognitive elaboration. The mechanism underlying the ability to understand others is represented by the "mirror neurons" (Rizzolatti et al. 1996). Human language may be regarded, therefore, as the evolutionary refinement of an implicit communication system based on finalist representations of actions of hand and mouth, as the precursor of Broca's area was equipped, before the emergence of language, with a system of gesture recognition through the organization and interpretation of motor sequences in terms of goals for the actions (Rizzolatti, Arbib 1998). It can be assumed, therefore, that our ancestors were endowed with a brain region in which objectives and programs were represented in a syntactic way (Fadiga, Craighero 2007). The activation of the Broca's area to the observations of the actions could therefore constitute the neurobiological connection to the motor origin of the well-contructed speech and, functionally speaking, the tool-making the intermediate step between the representation of actions and the verbal communication (Fadiga et al. 2007; Peeters et al. 2009). To support what is outlined in these theoretical premises, experimental data will be shown in order to study the cortical representation during the observation of tools (that is of tools easy to grasp with a functional purpose) by detecting cortical excitability.

L’obbiettivo del nostro studio è stato quello di comprendere il meccanismo che controlla la regolazione del flusso sanguigno cerebrale nel corpo calloso (CC) umano con il fine di spiegare l’effetto BOLD, precedentemente scoperto da Fabri e collaboratori nel 2011. Le analisi per determinare la presenza, il numero, la distribuzione e la morfologia delle cellule immunopositive all’enzima ossido nitrico sintetasi neuronale (nNOS) sono eseguite sul corpo calloso e sul’indusium griseum (IG). L’Ossido nitrico (NO) è un neurotrasmettitore gassoso largamente diffuso nel cervello umano ed ha, tra le altre funzioni, un potente effetto vasodilatante e perciò contribuisce a regolare il flusso sanguigno cerebrale. Sezioni seriali sagittali ottenute da blocchetti in paraffina e da taglio del tessuto in congelato sono state utilizzate per l’analisi immunoistochimica sul CC e sul IG. L’intensa marcatura che si è ottenuta ha dimostrato la presenza di cellule immunopositive al nNOS, e grazie alla microscopia a fluorescenza ne è stata confermata la loro natura neuronale e astrocitaria. Cellule neuronali immunopositive all’nNOS sono state osservate sia nel CC che nell’IG mentre gli astrociti che lo esprimono erano solo presenti nel CC. I neuroni nNOS positivi hanno mostrato diverse morfologie e risultavano essere piu abbondanti a 1mm a partire dalla linea mediana, per l’IG e a 4mm per il CC con un picco di massima abbondanza nel corpo del CC. In alcuni casi questi nueroni erano localizzati principalmente nell’interfaccia tra IG e CC e piu specificatamente in prossimita delle arterie piali, arteriole che originano dall’arteria sopracallosale che poi si affosano nel corpo calloso. La presenza di neuroni nNOS positivi in prossimità di vasi sanguigni, in questi due tessuti suggeriscono un loro plausibile ruolo nella regolazione neurovascolare del CC che potrebbero quindi ipoteticamente spiegare l’effetto BOLD osservato in risonanza. l’IG inoltre potrebbe giocare un ruolo attivo nel controllo della vascolarizzazione del CC, ed è quindi probabile e che non sia solo un tessuto di rimanenza embrionale come precedentemente si riteneva ma un tessuto con un sua funzione specifica. Infine è stata osservata per la prima volta la presenza di astrociti nNOS positivi nel corpo calloso umano. Queste cellule variavano nella presenza, nel numero e nelle loro distribuzione in base a diverse condizioni di ossigenazione sistemica che avvenivano nel momento del decesso. Infatti nei soggetti deceduti dopo una breve ipossia gli astrociti nNOS positivi erano assenti, mentre risultavano essere molto abbondanti nei soggetti deceduti con un ipossia prolungata. L’immunopositività degli astrociti sembrerebbe quindi essere correlata alla durata dell’ipossia cerebrale al momento della morte.
The aim of the present study is to investigate the possible mechanism for the control of cerebral blood flow in the corpus callosum (CC), that could explain the BOLD effect previously found (Fabri et al., 2011). The presence, number, distribution and morphology of neuronal Nitric Oxyde Sinthase (nNOS) positive cells was investigated in the corpus callosum (CC) and indusium griseum (IG). Nitric Oxyde (NO) is a gaseous neurotransmitter largely diffused in the brain, whichexerts a powerful vasodilatory effect, and therefore it can contribute to regulate the cerebral blood flow. Sagittal serial sections from paraffin or frozen autoptic specimens of human adult CC and overlying IG were processed for immunohistochemistry and immunofluorescence analysis, using an antibody against the neuronal form of the enzyme Nitric Oxyde Synthase (nNOS). The stainings revealed the presence of many nNOS immunopositive cells. By double labeling technique with immunofluorescence at confocal microscopy, it has been shown that in the CC both neurons and astrocytes positive to nNOS antibody were present, and their number varied in different conditions, as detailed below. In the IG, only neurons nNOS positive were found. Neurons showed different morphologies, were more numerous 1 mm apart from the medial line in IG and 4 mm in CC, with a peak over the body of the CC. In some cases, they were located at the boundary between IG and CC, more densely packed in proximity to the pial arteries penetrating into the CC. The significant presence of nNOS immunopositive neurons in these two structures suggests that they might have a role in the neurovascular regulation of CC, moreover the IG could plays a functional role in the adult brain. The presence of nNOS positive astrocytes in the human CC has been here demostrated for the first time. As previously mentioned, their number and distribution varied in different conditions: nNOS positive astrocytes were absent in samples from subjects deceased after a short hypoxia; their number and labeling intensity increased with the hypoxia prolongation. Neuronal NOS immunopositivity of CC astrocytes seems thus related to the hypoxia duration and the consequent brain damage.

The mesolimbic dopaminergic pathway plays an important role in the genesis of emotional arousal and behavioral activation in response to stimuli that provide a reward. This neural circuitry is also active in the early stages of learning and stabilization of addictive behavior due to substances abuse. Isolated animals have a different sensitivity to natural or artificial reinforcers. Accordingly, experimental evidences suggest that exposure to stress can deeply modify eating behavior. In light of these evidences the aim of this study was to investigate the influence of a chronic stress, like social isolation at weaning, on the sensitivity of mesocorticolimbic dopaminergic neurons to anticipation and consumption of food. Rats have been food restricted using a protocol that consists in training the animals to consume their meal for only two hours for day. Using vertical microdialysis, extracellular concentrations of dopamine in response to anticipation and consumption of food were measured both in the mPFC and the NAC. In PFC of GH rats extracellular DA increased (+180%) 80 minutes before food presentation showing the maximal increase (+350%) during food intake. On the contrary, in the NAc of GH rats no significant changes were observed. In SI animals trained to food restriction the increase in mPFC DA output observed in GH animals was completely blunted, while, in the NAc, 40 min before the presentation of the food, a significant increase in extracellular concentrations of DA was observed. Our results show that exposure to chronic stress modified the response of mesocortico-limbic dopaminergic neurons to an enjoyable stimulus and suggest that these changes might be important to explain the greater sensitivity to abuse that is observed in individuals subjected to stressful stimuli. This underlying alteration in brain function might be a crucial mechanism that predisposes individuals to impulsive behavior and increases the risk of developing addiction.

Rationale: The heart is mainly innervated by the sympathetic nervous system that is involved in the fight or flight response. Sympathetic neurons (SNs), whose cell bodies are placed in the stellate and superior cervical ganglia, mediate the main physiological mechanism increasing the frequency and force of cardiac contraction through release of norepinephrine. Recently, we have reported that SNs regulate heart trophism through stimulation of β2 adrenergic receptors and repression of muscle specific ubiquitin ligases (i.e. Murf1 and Atrogin1) but not much is known about the effects of SNs on sarcomeres. Nerve growth factor (NGF) released by the myocardium controls cardiac innervation by SNs after binding to its receptor (TrkA) and is required for neuronal survival. Thus, bidirectional coupling between SGNs and the heart takes place: the heart needs to be coupled to the SNs to receive norepinephrine stimulation for an efficient increase in heart contraction, and conversely, SNs are coupled to the heart for neurotrophic stimulation that is required for neuronal viability. However, whether a cell-cell interaction occurs in the SN-heart coupling is not known. An interaction between the muscle and the neuron that has been well described both in terms of function and structure, is the neuro-muscular junction (NMJ), characterized by membrane thickenings, acetylcholinergic receptor clustering, reduced intermembrane space (70-50 nm) and neurotrophin release by the postsynaptic myocyte (e.g. NT3, NT4). Considering the interaction between the SNs and the heart (neuro-cardiac junction, NCJ), this study aims i) to evaluate the effects of anterograde SN stimulation on sarcomeric structures, ii) to determine whether specific cellular structures are present at the SN/Cardiomyocyte (CM) contact site, iiI) to investigate the role of SGN/CM contact in NGF-mediated signaling. Results: To analyze changes in sarcomere structure, cultured CMs were treated with adrenergic stimuli (clenbuterol, phenylephrine and norepinephrine) or nutrient/serum deprived by HBSS incubation. Since starvation and sympathetic denervation share common targets (e.g. ubiquitin ligases), we can make a parallelism between the two pro-atrophic stimuli for alterations in the sarcomeres. Incubation with adrenergic agonists did not cause significant changes, whereas starvation caused a 41.86% decrease in sarcomere area, suggesting that sarcomere degradation is faster than its synthesis. This result was confirmed by experiments of in live imaging performed on CMs transfected with a construct encoding for the z-line localized RFP-zasp. To understand whether all sarcomeric proteins share the same fate during HBSS treatment, immunofluorescence (IF) and western blot (WB) analyses were performed on different proteins localized in the sarcomeres. While α actinin and cardiac tropoinin (cTn) I showed delocalization and degradation, no significant changes were measured for cTnT upon HBSS treatment, suggesting that sarcomeric proteins are degraded in different ways. To understand which protein degradation system is involved in sarcomere disassembly, we considered the autophagy-lysosome and ubiquitin proteasome systems (UPS). WB and IF analyses supported the activation of both systems in cells treated with HBSS. In live imaging of CMs co-transfected with constructs encoding for RFP-zasp and EGFP-LC3 showed LC3 enrichment near sarcomeres in nutrient/serum deprived cells, suggesting that autophagy may be involved in sarcomere degradation. Moreover, IF staining showed ubiquitin marked sites near the M-line of sarcomeres in cells incubated with HBSS, suggesting that ubiquitin ligases may be involved in sarcomere disassembly. Since Murf1 is a muscle specific ubiquitin ligase, localized in the M-line of sarcomeres and upregulated upon nutrient/serum deprivation, we evaluated its role. Its overexpression caused a 88.57% decrease in the sarcomere area, when compared to controls, whereas its silencing in starved CMs did not prevent sarcomere degradation (446.19 ±35.65 vs 144.91 ±26.25 μm2 of sarcomeric area in controls and silenced CMs respectively). These results were confirmed by in live imaging on RFP-zasp transfected CMs, and suggest that UPS and in particular Murf1 are involved in HBSS induced sarcomeric disassembly and that Murf1-mediated degradation is not the only process. Considering the analysis of the neuro-cardiac interaction, IF staining on rat heart cryosections showed dense innervation of the heart by sympathetic neurons that mainly interact with CMs when compared to other cardiac cell types that are well represented in the heart (e.g. cardiac fibroblasts, CFs). Electron microscopy on mouse heart slices and rat SN/CM co-cultures showed a close association between SNs and CMs (intermembrane distance around 70 nm), neurotransmitter vesicle accumulation and increased membrane protein density. These data support that a direct interaction between the sympathetic neurons and the CMs exists. To analyze such interaction, SN/CM co-cultures were developed by isolating sympathetic ganglia neurons (SGN) from the superior cervical ganglia and CMs from the hearts of neonatal rats. Both cell types were characterized using IF staining for dopamine β-hydroxylase, a maker for noradrenergic neurons, and for α actinin, a sarcomeric protein. Moreover, IF staining showed an enrichment of cell-to-cell adhesion molecules including β-catenin and cadherin at the contact sites between processes and CMs. Such enrichment developed after 2 weeks of co-culture, suggesting that SGN/CM co-cultures are subjected to time dependent maturation. In spotted co-cultures allowing to identify processes on wither CMs or non CM cardiac cells (mainly fibroblasts), a higher area occupied by processes was measured on CMs when compared to the other cardiac cells after NGF withdrawal (67.11 ±12.36% vs 3.79 ±1.12% of area occupied by processes respectively), supporting the preferential interaction of SGNs with CMs. This idea is further supported by the observation that SGNs develop larger contact sites on CMs than in other cardiac cells (82.88 ±1.3% decrease in contact area on non CM cardiac cells when compared to CMs). Taken together, all these data suggest that SGNs establish a direct and stable interaction with CMs and not other cardiac cells. Since the myocardium is known to produce NGF that is required for SN viability, the functional role of the NCJ was assessed considering NGF signaling. This neurotrophin is synthesized by CMs, as detected by the western blot analysis. Transfection of CMs with siRNA against NGF caused a 72.91% decrease of the neurotrophin expression, reducing neuronal density in SGN/CM co-cultures (65.72 ±9.33% decrease in mean neuronal density when compared to the scramble siRNA). This effect was abolished by the addition of NGF in the culture medium and supports that SGNs are dependent on CM derived NGF. NGF binding to its receptor enables TrkA activation, endocytosis and retrograde transport to the neuronal soma. TrkA retrograde movements were assessed by monitoring transport velocity, using imaging in transiently TrkA-DsRed2 transfected SGNs. The speed of retrograde TrkA-DsRed2 movements depended on the presence of NGF (0.32 ±0.06 vs 0.19 ±0.03μm/s in presence or absence of NGF). In co-cultures, retrograde movements were higher and faster in processes contacting CMs than those contacting other cardiac cells (0.24 ±0.05 vs 0.11 ±0.02μm/s respectively), supporting the idea that TrkA is activated on CMs and not on the other cardiac cells and that SGN survival requires CM derived NGF. Since SGNs interact with CMs and depend on CM released NGF, we tested the hypothesis that the NCJ is necessary for neuronal survival. IF on mouse heart slices showed TrkA enrichment at SGN/CM contact site, suggesting that NGF signaling may be involved in the NCJ. Moreover, CM-conditioned medium did not prevent neuronal death (58.21 ±10.42% decrease in mean neuronal density when compared to SGN/CM co-cultures), suggesting that NGF in the medium is not sufficient for neuronal survival. Consistently, we measured NGF concentration in CM-conditioned medium and it was a 1000-fold lower than the minimal dose required for neuronal survival (0.13 ±0.08pM). To evaluate whether a single cell-to-single cell NGF signaling occurs between SGNs and CMs, co-cultures were co-transfected with siRNA against NGF and a plasmid encoding for the GFP that allows the identification of NGF silenced CMs. Sympathetic processes on NGF-silenced CMs showed a 19.56 ±4.01% decrease in the neuro-cardiac contact area when compared to those on untransfected CMs of the same co-culture, supporting that direct cell-cell NGF mediated signaling is present. Moreover, co-cultures were transfected with a construct encoding NGF in order to detect NGF accumulation in processes using the IF. Only processes in contact with transfected CM contained NGF puncta, while those in contact with untransfected cells of the same co-culture did not contain NGF (43.43 ±10.77 vs 4.17 ± 4.1% of processes on transfected or un-transfected CMs). Taken together, these data suggest that the establishment of a neuro-cardiac interaction is necessary to allow NGF signaling. In the end of this work, we interfered with NGF signaling using different strategies. First, we used an anti-NGF antibody to sequester NGF. Second, since from TEM analysis we detected sites of cell-to-cell distance of 10nm, we used the smaller TrkA antagonist c(92-96). Third, we used k252a that has a size comparable to that of c(92-96) and that is membrane permeable. Whereas every approach worked on SGNs alone leading to a significant reduction in neuronal density, only k252a was able to reduce neuronal density in co-cultures (73.24 ±4.18% decrease in mean neuronal density when compared to the control), suggesting that the NCJ is an isolated microenvironment protected from diffusion. Since k252a led to neuronal loss in co-cultures, we used this inhibitor to estimate NGF concentration at the contact site, incubating SGNs alone with k252a and NGF at increasing concentrations. The estimated concentration was 1.4 ±0.03nM, 3.5 times higher than the minimal dose required for neuronal survival, supporting that the NCJ is characterized by high NGF concentration. Conclusions: Taken together, our results suggest that sympathetic neurons establish a direct interaction with CMs and that they are dependent on CM derived NGF. Morever, NGF-dependent pro-survival signal to the SGN needs this direct interaction that facilitates NGF activation of TrkA thanks to the development of an isolated microdomain characterized by a high NGF concentration and TrkA enrichment. Finally, sarcomere dismantlement during atrophic remodeling involves the activation of protein degradation systems and in particular of the ubiquitin ligase Murf1, whose regulation by SNs may affect sarcomere structure
Introduzione: il cuore è innervato principalmente dal sistema nervoso simpatico coinvolto nella risposta ‘lotta o fuga’. I neuroni simpatici (NS) sono collocati nei gangli stellato e cervicale superiore e mediano il principale meccanismo fisiologico per aumentare la frequenza e la forza di contrazione cardiaca attraverso il rilascio di noradrenalina. Recentemente abbiamo riportato che i NS regolano il trofismo cardiaco attraverso la stimolazione dei recettori β2 adrenergici e la repressione delle ubiquitina ligasi muscolo specifiche (ovvero MuRF1 e Atrogin1), ma non si conoscono gli effetti dei NS sui sarcomeri. Il fattore di crescita neuronale (NGF) è rilasciato dal miocardio e controlla l’innervazione cardiaca da parte dei NS dopo il legame al suo recettore (TrkA) ed è necessario per la sopravvivenza neuronale. Di conseguenza l'accoppiamento tra neuroni simpatici e il cuore riguarda una comunicazione bidirezionale: il cuore ha bisogno di essere accoppiato ai NS per ricevere lo stimolo noradrenergico per un aumento efficiente della contrazione del cuore, e, viceversa, i NS sono accoppiati al cuore per ricevere lo stimolo neurotrofico che è necessario per la sopravvivenza dei neuroni. Tuttavia, non si conosce se è presente un’interazione cellula-cellula nell’accoppiamento tra cuore e neuroni. La giunzione neuromuscolare (GNM) costituisce un’interazione tra il muscolo e il neurone, ben descritta sia in termini di funzione che di struttura. E’ caratterizzata da ispessimenti della membrana, accumulo dei recettori acetilcolinergici, ridotto spazio intermembrana (70-50 nm) e rilascio di neurotrofine da parte dei miociti (ad esempio NT3, NT4). Considerando l'interazione tra i NS ed il cuore (giunzione neuro cardiaca, GNC), questo studio ha lo scopo di i) valutare gli effetti della stimolazione anterograda dei NS sulle strutture sarcomeriche, ii) determinare se strutture cellulari specifiche sono presenti a livello del sito di contatto tra NS e cardiomiocita, iii) studiare il ruolo del contatto tra cardiomiociti e neuroni nella segnalazione mediata da NGF. Risultati: Per analizzare i cambiamenti nella struttura del sarcomero, colture di cardiomiociti sono state trattate con stimoli adrenergici (clenbuterolo , fenilefrina e norepinefrina) oppure con HBSS. Poiché la rimozione di nutrienti e la denervazione simpatica agiscono su meccanismi comuni, possiamo fare un parallelismo tra i due stimoli proatrofici sull’alterazione nei sarcomeri. L’incubazione con agonisti adrenergici non ha causato cambiamenti significativi, mentre l’HBSS ha provocato una diminuzione del 41.86% dell’area sarcomerica, suggerendo che la degradazione dei sarcomeri è più veloce rispetto alla loro sintesi. Questo risultato è stato confermato da esperimenti di imaging in tempo reale su CM trasfettati con un costrutto codificante per la RFP-zasp, proteina localizzata nella linea z. Per capire se le proteine sarcomeriche condividono lo stesso destino durante il trattamento con HBSS, sono state effettuate analisi di immunofluorescenza (IF) e western blot (WB). Mentre α actinina e troponina cardiaca (cTn) I hanno mostrato delocalizzazione e degradazione, non sono stati misurati cambiamenti significativi per cTnT in seguito al trattamento con HBSS, suggerendo che le proteine sarcomeriche sono degradate in modi diversi. Per capire quale meccanismo di degradazione delle proteine è coinvolto nello smantellamento dei sarcomeri, abbiamo considerato il sistema autofagico-lisosomale e ubiquitina-proteasoma. Analisi di WB e IF hanno mostrato l'attivazione di entrambi i sistemi in cellule trattate con HBSS. In esperimenti di imaging in tempo reale su cardiomiociti co-trasfettati con costrutti codificanti per RFP-zasp e EGFP-LC3 è stato osservato l’arricchimento di LC3 vicino ai sarcomeri in seguito a deprivazione di nutrienti e siero, suggerendo che l’autofagia potrebbe essere coinvolta nella degradazione dei sarcomeri. Inoltre analisi di IF hanno mostrato una marcatura per l’ubiquitina in corrispondenza della linea M dei sarcomeri in cellule incubate con HBSS, suggerendo che le ubiquitina ligasi potrebbero essere coinvolte nello smantellamento dei sarcomeri. Poiché MuRF1 è un’ubiquitina ligasi muscolo specifica localizzata nella linea M dei sarcomeri e sovraespressa in condizioni di digiuno, abbiamo valutato il suo ruolo nella degradazione delle proteine sarcomeriche. La sua sovraespressione ha provocato un calo dell’area sarcomerica dell’88.57% rispetto ai controlli, mentre il suo silenziamento in cardiomiociti incubati con HBSS non ha impedito la degradazione dei sarcomeri (446.19 ±35.65 vs 144.91 ±26.25μm2 di area sarcomerica nei controlli e nei cardiomiociti silenziati e incubati con HBSS rispettivamente). Questi risultati sono stati confermati da esperimenti di imaging in tempo reale su cardiomiociti trasfettati con RFP-zasp, e suggeriscono che il sistema ubiquitina-proteasoma ed in particolare Murf1 siano coinvolti nella degradazione dei sarcomeri, anche se quello mediato da Murf1 non è l’unico meccanismo. Considerando l'analisi dell’interazione neuro-cardiaca, le analisi di IF su criosezioni di cuore di ratto hanno mostrato densa innervazione del cuore da parte dei neuroni simpatici che sembrano interagire soprattutto con cardiomiociti rispetto ad altri tipi cellulari che sono ben rappresentati nel cuore (ad esempio fibroblasti cardiaci, FC). L’analisi di microscopia elettronica su criosezioni cardiache di topo e ratto e co-culture di NS e cardiomiociti ha mostrato una stretta associazione tra NS e cardiomiociti (con una distanza intermembrana di circa 70nm), accumulo di vescicole di neurotrasmettitore e l'aumento della densità delle proteine di membrana. Questi dati supportano l’esistenza dell'interazione diretta tra i neuroni simpatici e i cardiomiociti. Per analizzare tale interazione, sono state sviluppate co-culture di NS e cardiomiociti, isolando i neuroni simpatici gangliari (NSG) dai gangli cervicali superiori e i cardiomiociti dal cuore dei ratti neonati. Entrambi i tipi cellulari sono stati caratterizzati analizzando in IF la dopamina β-idrossilasi, un marcatore per i neuroni noradrenergici, e l’α actinina, una proteina sarcomerica. Inoltre l’arricchimento di molecole di adesione cellula-cellula, tra cui β catenina e caderina, è stato osservato nei siti di contatto tra processi simpatici e cardiomiociti. Tale arricchimento è stato misurato dopo 2 settimane di co-coltura, suggerendo che co-culture di neuroni e cardiomiociti sono sottoposte a maturazione in funzione del tempo. In co-colture a spot, che consentono di identificare processi in contatto con cardiomiociti o altre cellule cardiache (principalmente fibroblasti), una superficie superiore era occupata dai processi simpatici su cardiomiociti rispetto alle altre cellule cardiache dopo la rimozioni dell’NGF (67.11 ±12.36% vs 3.79 ±1.12% della superficie occupata da processi rispettivamente), sostenendo la presenza di un’interazione preferenziale tra neuroni e cardiomiociti. Questo concetto è ulteriormente supportato dall'osservazione che i neuroni simpatici sviluppano contatti più grandi sui cardiomiociti che su altre cellule cardiache (82.88 ±1.3% di diminuzione della superficie di contatto su altre cellule cardiache rispetto ai cardiomiociti). Nell’insieme, questi dati suggeriscono che i NS stabiliscono un’interazione diretta e stabile con i cardiomiociti e non altre cellule cardiache. Poiché si conosce che il miocardio produce NGF che è necessario per la vitalità dei NS, il ruolo funzionale della GNC è stato valutato considerando il signaling mediato dall’NGF. Questa neurotrofina è sintetizzata dai cardiomiociti, come rilevato dalle analisi di western blot. La trasfezione di siRNA contro l’NGF nei cardiomiociti ha causato una diminuzione del 72.91% nell'espressione della neurotrofina e ridotto la densità neuronale in co-culture di neuroni e cardiomiociti (65.72 ±9.33% di diminuzione della densità neuronale rispetto alla trasfezione con il siRNA di controllo). Questo effetto è stato abolito dall'aggiunta di NGF nel mezzo di coltura e supporta che i neuroni dipendono dall’NGF prodotto dai cardiomiociti. Il legame dell’NGF al suo recettore TrkA consente la sua attivazione, endocitosi e trasporto retrogrado al soma neuronale. Sono stati valutati i movimenti retrogradi del TrkA, monitorando la velocità di trasporto utilizzando tecniche di imaging in tempo reale in co-culture con NS trasfettati con il costrutto TrkA-DsRed2. La velocità dei movimenti retrogradi del TrkA-DsRed2 nei neuroni dipende dalla presenza di NGF (0.32 ±0.06 vs 0.19 ± 0.03μm/s in presenza o assenza di NGF). In co-culture, i movimenti retrogradi erano più alti e più veloce nei processi in contatto con cardiomiociti rispetto ad altre cellule cardiache (0.24 ±0.05 vs 0.11 ±0.02μm/s rispettivamente), sostenendo l'idea che il TrkA è attivato sui cardiomiociti e non sulle altre cellule cardiache e che i neuroni dipendono da NGF derivato da cardiomiociti. Poiché i NS interagiscono con i cardiomiociti e sono dipendenti dall’NGF che questi rilasciano, abbiamo testato l'ipotesi secondo cui la GNC sia necessaria per la sopravvivenza neuronale. Analisi di IF su criosezioni di cuore murino hanno mostrato accumulo di TrkA nel sito di contatto tra il cardiomiocita e il NS, suggerendo che il signaling mediato dall’NGF potrebbe essere coinvolto nella GNC. Inoltre, terreno condizionato da cardiomiociti non ha impedito la morte neuronale (58.21 ±10.42% di diminuzione della densità neuronale rispetto alla co-cultura), suggerendo che l’NGF nel mezzo non sia sufficiente per la sopravvivenza neuronale. Coerentemente abbiamo misurato la concentrazione di NGF nel terreno condizionato da cardiomiociti ed è risultata 1000 volte inferiore rispetto alla dose minima necessaria per la sopravvivenza neuronale (0.13 ±0.08pM). Per valutare se il signaling mediato dall’NGF avviene da una singola cellula all’altra, co-culture sono state co-trasfettate con siRNA contro l’NGF e un plasmide codificante per la GFP che permette l'identificazione dei cardiomiociti silenziati per la neurotrofina. I processi simpatici su cardiomiociti silenziati hanno mostrato una riduzione del 19.56 ±4,01% della zona di contatto neuro-cardiaca rispetto ai cardiomiociti non trasfettati della stessa co-coltura, a sostegno del fatto che il singaling dell’NGF sia localizzato nel sito di contatto tra una cellula e l’altra. Inoltre, le co-colture sono state trasfettate con un costrutto codificante per l’NGF per rilevare l’accumulo della neurotrofina nei processi utilizzando tecniche di IF. Solo i processi in contatto con i cardiomiociti trasfettati contenevano accumuli di NGF, mentre quelli a contatto con cardiomiociti non trasfettati non possedevano NGF (43.43 ±4.17 vs 10.77 ±4.1% dei processi in contatto con cardiomiociti trasfettati e non rispettivamente). Nel loro insieme, questi dati suggeriscono che la presenza dell’interazione neuro-cardiaca sia necessaria per consentire la segnalazione dell’ NGF. Alla fine di questo lavoro abbiamo interferito con il signaling dell’NGF utilizzando diverse strategie. In primo luogo abbiamo utilizzato un anticorpo anti-NGF per sequestrare la neurotrofina dal terreno. In secondo luogo, poiché nelle analisi di microscopia elettronica abbiamo rilevato siti di distanza cellula-cellula di 10nm, abbiamo usato un antagonista del TrkA più piccolo dell’anticorpo, il c(92-96). In terzo luogo abbiamo utilizzato il k252a che ha una dimensione paragonabile a quella del c(92-96) e che è permeabile alle membrane. Considerando che ogni approccio ha funzionato sui NS, causando una significativa riduzione della densità neuronale, solo il k252a è stato in grado di ridurre la densità neuronale in co-colture (73.24 ±4.18% di diminuzione della densità neuronale media rispetto al controllo), suggerendo che la GNC è un microambiente isolato protetto dalla diffusione. Poiché il k252a ha causato la riduzione neuronale in co-colture, abbiamo usato questo inibitore per stimare la concentrazione di NGF nel sito di contatto, incubando i neuroni da soli con k252a e NGF in concentrazioni crescenti. La concentrazione stimata è stata di 1.4 ±0.03nM, 3.5 volte superiore alla dose minima necessaria per la sopravvivenza neuronale, supportando che la GNC è caratterizzata da un'alta concentrazione di NGF. Conclusioni: Nell’insieme, i nostri risultati suggeriscono che i neuroni simpatici stabiliscono un’interazione diretta con i cardiomiociti e che dipendono dall’NGF derivato dai cardiomiociti. Inoltre, il signaling mediato dall’NGF necessita di questa interazione diretta che facilita l’attivazione del TrkA grazie allo sviluppo di un microdominio isolato e caratterizzato da una elevata concentrazione di NGF e dall’arricchimento del TrkA. Infine, lo smantellamento dei sarcomeri comporta l'attivazione dei sistemi di degradazione delle proteine e, in particolare, dell’ubiquitina ligasi MuRF1, la cui modulazione da parte dei NS può modificare la struttura del sarcomero

La stimolazione termica è una tecnica esplorata negli ultimi anni in quanto promettente per il differenziamento cellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che questo metodo può indurre il differenziamento di diverse tipologie cellulari, dalle staminali alle tumorali, probabilmente attraverso cambiamenti della capacità della membrana e delle proprietà biofisiche dei canali ionici. Tuttavia, i meccanismi che sostengono questo processo restano a oggi sconosciuti. Il presente progetto ha l’obiettivo di studiare gli effetti della stimolazione termica sul comportamento di un modello in vitro di neuroni dei gangli delle radici dorsali (DRG), la linea cellulare F-11, caratterizzata nel nostro laboratorio. Queste cellule possono esprimere canali ionici e recettori di membrana, caratteristici dei neuroni sensoriali, e possono essere impiegate come modello per studiare i meccanismi coinvolti nella proliferazione e nel differenziamento neuronale. Inizialmente, per valutare gli effetti della tecnica di riscaldamento sul modello cellulare scelto, abbiamo effettuato esperimenti di stimolazione “in bulk” utilizzando un incubatore. Le cellule sono state poste nell’incubatore ed esposte a temperature diverse per intervalli di tempo differenti, per due giorni consecutivi. Analisi morfologiche e funzionali sono state condotte a partire dalla semina fino a 8 giorni. I risultati hanno mostrato una differenza significativa nella lunghezza dei neuriti e nelle proprietà elettrofisiologiche (potenziale di membrana, densità di corrente di Na+ e K+, e frequenza della scarica dei potenziali d’azione) nei campioni mantenuti a 41,5°C per 30 minuti rispetto al controllo (mantenuto a 37°C). È stata inoltre condotta un’analisi dei segnali intracellulari di Ca2+ indotti da capsaicina, per verificare l’eventuale coinvolgimento dei canali TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) negli effetti indotti dal calore. I risultati hanno mostrato segnali intracellulari di Ca2+ maggiori nelle cellule riscaldate rispetto al controllo, suggerendo che l’esposizione al calore potrebbe influenzare l’espressione e/o le proprietà dei canali TRPV1, permeabili al Ca2+. Inoltre, il saggio della lattato-deidrogenasi (LDH) ha permesso di escludere effetti citotossici della metodica utilizzata sui campioni trattati. Considerando questi risultati, abbiamo studiato gli effetti di una stimolazione termica localizzata, ottenuta tramite l’irraggiamento di nanoparticelle Prussian Blue (PBNP) con un laser nel vicino infrarosso (NIR). Le PBNP sono state applicate sulla superficie esterna delle petri in cui sono state seminate le cellule, evitando in questo modo il contatto tra di esse e le cellule. Anche con questo approccio si sono registrate differenze significative nella lunghezza dei neuriti e nelle proprietà elettrofisiologiche, confermando l’induzione al differenziamento. Per verificare che l’effetto sulle proprietà cellulari potesse mantenersi nel tempo, ulteriori analisi delle proprietà morfologiche e funzionali sono state condotte a tempi successivi agli 8 giorni. I risultati hanno mostrato che le cellule F-11 possono mantenere un fenotipo differenziato anche a 12 giorni. Le tecniche di riscaldamento utilizzate in letteratura sono risultate efficaci per modificare l’eccitabilità dei neuroni e hanno effetti sulla morfologia, ma a oggi non sono stati ancora riportati gli effetti funzionali. Inoltre, le cellule primarie rappresentano un modello ideale per studiare i neuroni sensoriali, ma la loro disponibilità è limitata. L’uso di una linea immortalizzata ha permesso di effettuare uno studio funzionale degli effetti del riscaldamento, e i risultati ottenuti dimostrano che una stimolazione termica localizzata può essere un metodo promettente per indurre il differenziamento e supportano la possibile applicazione futura di questa tecnica come una nuova strategia per modificare il comportamento neuronale in vivo.
Heating represents a promising approach to induce neurite outgrowth and neuronal function recovery. In previous studies, protocols with different temperatures (from 38°C to 50°C) and durations (from milliseconds to several days) could induced differentiation of different cell types like Xenopus laevis oocytes, cultured mammalian cells, neurons, stem cells and cancer cells. This effect has been attributed to changes in cell membrane capacitance and in ion channel properties, but the underlying mechanism remains so far unknown. The present project was aimed to investigate the eventual modifications, induced by two approaches of thermal stimulation, on the behaviour of a model of dorsal root ganglion (DRG) neurons, the F-11 cell line, previously characterized in our laboratory. These cells could express ion channels and cell membrane receptors consistent with those of sensory neurons and could be employed as a good model to study neuronal proliferation and differentiation mechanisms. Initially, to test if heating could effectively induce differentiation of our cellular model, we performed experiments of bulk stimulation: cells were placed in an incubator at different time and temperature combinations for two consecutive days. Thus, morphological and functional analysis were performed to investigate neuronal differentiation until 8 days. Results showed a significant difference in neurite elongation and in electrophysiological properties (resting membrane potential, Na+ and K+ current density and action potential frequency) in samples maintained at 41,5°C for 30 minutes versus 37°C samples. An intracellular Ca2+ signal analysis evoked by Capsaicin was performed to verify the involvement of TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) channels in the effects of heating. Results showed that the Ca2+ signal was higher in heated cells compared to the control, suggesting that the treatment could increase the expression and/or the properties of TRPV1 channels, which are permeable to Ca2+. Moreover, we performed a lactate dehydrogenase activity (LDH) assay to verify if the treatment could induce cell stress and results showed that heat had no detrimental effects on F-11 cells. Considering these results, we investigated the effects of a scalable thermal stimulation method, established by irradiating Prussian Blue nanoparticles (PBNPs) with a near infrared laser. A disk of PBNPs-PVA was placed on the outer surface of the petri dish in which the cells were seeded, avoiding a direct contact between the material and the cells, and it was irradiated by a near infrared laser to increase culture medium temperature to 41,5°C. Neurite elongation was significantly increased in irradiated cells compared to non-irradiated control cells and significant differences were also observed during the functional analysis by patch-clamp technique. To verify if the effects on cellular properties could be maintained for a longer period, we performed a functional investigation also on heated and irradiated cells after 12 days in culture. Results showed that F-11 cells could maintain a differentiated phenotype also after 12 days in culture. The heating techniques used in literature could modify neuron excitability and had effects on cell morphology and staining, but the functional effects has not been reported so far. Moreover, primary cells represent an ideal model to study sensory neurons, but their availability is limited. The use of an immortalized cell line allowed to perform a functional study on the effects of heating, and the results demonstrated that a targeted thermal stimulation could be a promising approach to induce cell differentiation and support the future application of this method as a strategy to modify neuronal behaviour in vivo.

Spinal muscular atrophy (SMA) is the most common genetic cause of childhood disease and results from selective loss of α motor neurons. SMA is caused by mutations or deletions of the telomeric copy of the survival motor neuron 1 gene (SMN1). This gene is fundamental for the assembly and regeneration of spliceosomal small nuclear ribonuclear proteins (snRNPs) in all cellular types. The mechanism by which SMN deletion is responsible of selective neuro-muscular defect and specific motor neurons degeneration is still unknown, even if some studies suggested an additional neuronspecific function of the protein. In this work, we investigated in neurons the role of SMN and LSm1 to LSm7, which is involved in mRNA degradation in HeLa cells and may well require the SMN protein for assembly and/or function. We constructed stable neuroblastoma cell lines by RNA interference that express low level of SMN protein and can be considered as a pathological model of SMA. We found that decreased expression of SMN protein does not influence the assembly of snRNPs nor of the LSm1-7 complex. In these cellular clones, LSm1 protein assembles in the cytoplasm as punctuated structures (P-bodies) that are also found in control cells and all other cell types. Moreover, SMN knock-down clones showed an atypical localization of heavy chain neurofilaments (NFH) that fuse in the soma. Overexpressing SMN in wild type neuroblastoma (SH S5Y5) we observed the presence of aggregates in inclusion bodies, suggesting the interaction between SMN and NFH. Even if SMN knock-down resemble the pathological condition of SMA, the level of downregulated protein may be not enough to interfere with the snRNPs biogenesis. We can speculate that in primary culture neurons exists a different regulatory pathway. In fact, experiments on neurons from spinal cord, Purkinje cells and hippocampal neurons demonstrated a mechanism of dendritic localization never seen in cell lines. We showed for the first time that LSm1 protein, beside to localize in P-bodies in the soma, can distribute on the dendrites in punctuate structures that contain no degradation enzymes such as Dcp1a. Further, LSm1 binds specific dendritic mRNAs suggesting an involvement in the mRNA transport and/or in the local protein synthesis. In conclusion, we dimostrated that LSm1 can form new complexes with specific neuronal tasks and hypothesize that the presence of SMN is crucial for the function of these complexes.

E’ sempre più accettata l’ipotesi secondo cui le malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson siano di origine multifattoriale (“multiple hit hypothesis”), cioè siano causate dalla concomitante o ripetitiva presenza di diversi fattori che cooperano alla morte cellulare. Tra questi quelli ambientali occupano un posto rilevante. Sebbene una grande varietà di processi neurologici potrebbero essere influenzati da neurotossine ambientali, il sistema dopaminergico sembra essere quello più colpito. Negli ultimi 10 anni si è rivolta sempre maggiore attenzione alla L-BMAA (L-β-N-methylamino-L-alanine), un aminoacido non proteico trovato nei semi della Cycas micronesica, che sembra essere alla base dell’ “ALS-PDC complex”, una sindrome complessa caratterizzata da sintomatologie cliniche tipiche della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), del morbo di Parkinson e dell’Alzheimer. Recenti scoperte hanno dimostrato che questa tossina viene prodotta da una grande varietà di cianobatteri del genere Nostoc presenti in tutto il mondo. Pertanto, potenzialmente, tutta la popolazione umana potrebbe essere esposta a tale sostanza. Ciò potrebbe determinare il suo accumulo nell’organismo, sia in forma libera che legata alle proteine, da cui verrebbe poi rilasciata lentamente durante il catabolismo proteico. Sulla base di queste considerazioni abbiamo voluto analizzare gli effetti di questo aminoacido sulle cellule dopaminergiche della SNc da un punto di vista elettrofisiologico, farmacologico, morfologico e tossicologico. La BMAA (3 mM, 10 psi 1.0 s) causa una depolarizzazione dei neuroni dopaminergici della SNc inducendo una corrente entrante (media = 454.48 ± 34.65, n = 73) e aumenti transienti della concentrazione di calcio intracellulare (R medio = 0.368 ± 0.062, n = 13). Questi effetti sono mediati prevalentemente dall’attivazione dei recettori metabotropici del glutammato di gruppo I (mGluR1), in quanto vengono ridotti reversibilmente dall’antagonista selettivo, CPCCOEt (100 μM) (corrente: 41.56 ± 3.61 % del controllo, n = 24; calcio: 28.43 ± 5.96 % del controllo, n = 7). La corrente, ma non il calcio, indotta dalla BMAA è ridotta in piccola parte dal CNQX (10 μM) (corrente: 93,09 ± 1,97 % del controllo, n = 24; calcio: 100.17 ± 9.93 % del controllo, n=6), antagonista competitivo dei recettori AMPA. Nelle cellule dopaminergiche della SNc gli aumenti di calcio indotti dall’attivazione dei recettori mGluR1 sono mediati dai canali SOCs/TRPC. Infatti, sia le correnti entranti che le variazioni di calcio intracellulare indotte dalla BMAA sono ridotte dagli antagonisti di tali canali, SKF 96365 (100 μM) (corrente: 42.125 ± 4.35 % del controllo, n = 8; calcio: 43.57 ± 7.9 % del controllo, n = 7) e Ruthenium Red (20 μM) (corrente: 27.05 ± 8.3 % del controllo, n = 6). Inoltre, nonostante la BMAA in presenza di carbonato presenti una struttura chimica simile a quella dell’acido glutammico, essa non viene ricaptata dalla cellule dopaminergiche attraverso il trasportatore degli aminoacidi eccitatori EAAT. E’ interessante notare che negli interneuroni GABAergici della SNc la BMAA attiva i recettori AMPA, ma non quelli metabotropici, senza indurre variazioni della concentrazione del calcio intracellulare. In queste cellule, tuttavia, l’agonista selettivo degli mGluR1, il DHPG (30 μM), evoca correnti entranti, a dimostrazione della presenza degli mGluR1 sugli interneuroni GABAergici. A conferma della sua potenziale tossicità, esposizioni prolungate di fettine mesencefaliche (12, 20 e 30 minuti) alla BMAA inducono cambiamenti irreversibili su numerose proprietà cellulari. Tali modificazioni sono accompagnate dal rilascio massivo del citocromo C (Cyt C) nel citoplasma delle cellule dopaminergiche che viene completamente bloccato dall’aggiunta, nel mezzo di perfusione, di antagonisti dei recettori mGluR1 e AMPA. I dati che ho riportato in questa tesi forniscono una chiara e plausibile dimostrazione di come la BMAA può essere tossica verso le cellule dopaminergiche della SNc, causando i sintomi neurologici della malattia di Parkinson.
It is well known that several neurodegenerative diseases, such as Parkinson disease, have a multifactorial origin (multiple hit hypothesis), which suggests that neuronal loss is a result of multiple factors. Among them, environmental factors are the most important. Although a variety of neurological processes can be adversely affected, the dopaminergic system appears to be a major target for environmental neurotoxins. The hypothesis that L-BMAA (L-β-methylamino-L-alanine), a nonprotein amino acid found in the Cycas micronesica seeds in western pacific islands, is involved in the development of amyotrophic lateral sclerosis/Parkinson-dementia complex (ALS-PDC complex) has risen and fallen since its initial proposal in 1987. In the last ten years the interest for this toxin has grown due to the discovery that it can be produced by many strains of Nostoc cyanobacterias, present throughout the world. Moreover L-BMAA can bind proteins. This bound form may function as an endogenous neurotoxic reservoir, accumulating and being released during protein catabolism. In order to analyze the effects of this amino acid, we have performed electrophysiological, pharmacological, morphological and toxicological studies on dopaminergic neurons of SNc. In these neurons puff-application of L-BMAA (3 mM, 10 psi 1.0 s) causes an inward current (mean = 454.48  34.65, n = 73) and a transient increase of intracellular calcium (R mean = 0.368 ± 0.062, n = 13). These effects are mediated by the activation of group I metabotropic glutamate receptors (mGluR1) and they are reversibly blocked by the application of the antagonist CPCCOEt (100 μM) (current: 41.56 ± 3.61 % of control, n = 24; calcium: 28.43 ± 5.96 % of control, n = 7). Bath application of CNQX (10 μM), a competitive antagonist of AMPA receptors, partially inhibits the L-BMAA-induced current (current: 93,09 ± 1,97 % of control, n = 24) but it has no effect on the calcium concentration (100.17 ± 9.93 % of control, n = 6). SOCs/TRPC channels are present in the dopaminergic cells of SNc and they mediate the intracellular calcium increase due to the activation of mGluR1. Indeed SKF 96365 (100 μM) and Ruthenium Red (20 μM), two antagonists of TRPC channels, are able to reduce the L-BMAA-induced inward current (42.125 ± 4.35 % of control, n = 8 and 27.05 ± 8.3 % of control, n = 6 respectively). Moreover SKF 96365 (100 μM) reduces the intracellular calcium increase induced by L-BMAA (43.57 ± 7.9 % of control). It is known that L-BMAA, in the presence of carbonate, has a chemical structure similar to glutamic acid, however it is not re-uptaken by EAATs, the excitatory amino acid transporters. Interestingly, in GABAergic interneurons, L-BMAA activates AMPA receptors but not mGluR1, and this activation causes inward current without any change in intracellular calcium concentration. However mGluR1 are present in these neurons because application of DHPG (30 μM), the selective agonist, produces inward currents. In order to confirm the toxic effects of this amino acid we have treated midbrain slices with L-BMAA for 12, 20 and 30 minutes and we have seen irreversible modification of cellular properties (decrease in membrane resistance, inability to evoke firing, elevated intracellular calcium). As a consequence of the treatments, cytocrome C is released in the cytoplasm, but in the presence of AMPA and mGluR1 antagonists, this effect is blocked. In conclusion this study demonstrates that L-BMAA could be considered a possible toxic agent for the dopaminergic neurons and provides new insights into the role of this amino acid in the aetiology of Parkinson disease.

Neuronal plasticity is the capability of neurons to change the structure, function and organization of neurons in response to new experiences. Behavioral studies in rodents, have shown that changes in the environment, in different periods of life, can lead to profound and lasting effects on neuronal plasticity as reflected by increased vulnerability or resilience to stress. Post-natal stress, such as maternal separation, have a deep impact not only for the offspring, but also for mothers, and lead to neuroendocrine, behavioral and structural changes in the brain. Neuroplasticity was evaluated both in mothers and offspring. Mothers were killed 21 days after delivery the day of the weaning and we analized density and morphology of dendritic spines and arborization of the dendritic tree in granule cells of hippocampus. Another goal of our study is to verify on the offspring, if stress induced by insufficient maternal care in the first 15 days of life increases the vulnerability to chronic stress conditions in adulthood. In this research, we used two experimental protocols of maternal separation, a) one group of pups was separated from their mothers for 15 min (short maternal separation), b) pups from the second group were separated for 3h (long maternal separation), every day from the 3rd to day 15th after birth respectively. The weaning day half of the rats belonging to the different groups was isolated for 60 days, while another group was isolated for 30 days then re-grouped for another 30 days. The results obtained were compared with those of rats never separated from their mothers (control), but subjected or not to social isolation. After sacrifice of offspring, we studied the density and morphology of dendritic spines, the arborization of dendritic tree and neurogenesis in the hippocampus. The results obtained in mothers showed that maternal separation reduced dendritic arborization in granule cells of hippocampus, and density of hippocampal dendritic spines is decreased in mothers after maternal separation. The results obtained in the offspring showed that social isolation induced a reduction of the arborization of the dendritic tree, variation of morphology and a reduction of the density of the dendritic spines, and a decrease of neurogenesis in animals not separated from the mother and in the separated ones. In rats subjected to re-group after 30 days of social isolation stress, the morphology and density of dendritic spines, arborization of the dendritic tree and the neurogenesis were completely reverted when compared to animals that have never been separated from their mothers (controls). In contrast, in animals subjected to maternal separation for 3 h, the social enrichment (re-grouped) failed to revert the effects of social isolation stress. In rats exposed to maternal separation for 15 min, social isolation for 60 days did not induce any change in the parameters studied. These results demonstrate that in the offspring, a short maternal separation of the animals in the first 15 days of life increase resilience to chronic stress during adult life. These data suggest that, in the offspring, high maternal care that result from a short maternal separation, increase resilience to chronic stress during adulthood. On the contrary, a lower maternal care as a consequence of a long maternal separation, reduce resilience and increase vulnerability to chronic stress, impairs neuronal plasticity and effect cognitive functions and emotional state. These results show that maternal separation during early post-natal period, have a negative effects on neuronal plasticity, both in mothers and offspring

The brain is the most complex of biological systems and our knowledge on the developmental mechanisms underlying its formation and organization have been based on studies in rodents. Little is know about the human brain development. To shed light on the telencephalic developmental program in humans we investigated the transcriptional profile that distinguish the developing striatum from the cortex and we define the molecular set that identify the different populations present in the differentiating striatum from 2 to 20 gestational weeks. This thesis represent the first description of the spatio-temporal expression profile that drive the differentiation of striatal precursors towards a medium spiny neurons fate and molecularly define the striatal compartments. New striatal determinants were identified and unexpected differences from mouse striatal development were discovered. Finally we compared the transcriptional profiles of the developing striatum and cortex with striatal and cortical primary neurons differentiated in vitro. We found an enrichment of function-related transcripts in human primary neurons that were confirmed by electrophysiological analysis revealing the presence of (i) Na+, K+ and Ca2+ currents, (ii) GABA, glutamate and dopamine receptors response and (iii) spontaneous synaptic activity.

L’osservazione delle azioni è in grado di evocare nel sistema motorio dell’osservatore un’attività comparabile a quella associata all’esecuzione della stessa azione. Tale capacità d trasformare la rappresentazione sensoriale delle azioni altrui nella propria rappresentazione motoria concernente la medesima azione – i.e. meccanismo specchio – gioca un ruolo fondamentale nella comprensione delle azioni e nell’apprendimento motorio tramite imitazione. L’osservazione delle azioni è in grado di favorire l’accesso al sistema motorio anche quando sussistono deficit motori agli arti, favorendo i processi di riorganizzazione corticale motoria e migliorando le abilità d’esecuzione del movimento. Sulla base di questo principio, un approccio riabilitativo basato sull’osservazione delle azioni (Action Observation Treatment – AOT) si è dimostrato efficace nel migliorare le funzioni motorie in diverse patologie neurologiche. Lo scopo di questa tesi è quello di discutere il ruolo dell’osservazione delle azioni nel favorire il recupero e il perfezionamento delle abilità motorie. La prima parte della tesi riporta uno studio clinico pilota che ha dimostrato l’efficacia della AOT nel miglioramento delle funzioni motorie dell’arto superiore nei bambini affetti da paralisi cerebrale infantile. Questo studio presenta due principali elementi innovativi. Il primo consiste nella somministrazione e nel monitoraggio da remoto del trattamento, in modo da permettere l’implementazione delle sessioni riabilitative direttamente a casa del bambino. Il secondo è l’introduzione dell’interazione remota fra bambini partecipanti come fattore attivo di trattamento. La differenza di abilità manuali fra pari è risultata essere associata all’efficacia del trattamento, indicando che è preferibile per il bambino osservare un compagno con abilità superiori alle proprie al fine di incrementare le probabilità di miglioramento. Questo studio apre l’AOT tradizionale a nuovi scenari, in cui i bambini possono simultaneamente essere beneficiari ed erogatori all’interno del processo di apprendimento motorio. La seconda parte della tesi ha lo scopo di esplorare i substrati neurofisiologici dell’apprendimento motorio delle azioni tramite la loro osservazione attraverso uno studio di Stimolazione Magnetica Transcranica (TMS). In relazione alla recente interruzione delle attività sperimentali conseguente alla pandemia, questa parte della tesi richiederà un tempo aggiuntivo per essere ultimata. Pertanto, è stata richiesta una proroga semestrale per la consegna finale della tesi.
The observation of an action is able to trigger in the observer’s motor system an activity similar to that evoked by the correspondent action execution. Such a capacity to transform the sensory representations of other’s actions into one’s own motor representation concerning the same action – i.e. mirror mechanism – plays a key role in action understanding and imitation-driven motor learning. Action observation is able to access the cortical motor system even when limb motor function is impaired, favoring cortical reorganization and ultimately affecting motor abilities in action execution. On this basis, a rehabilitative approach grounded on action observation (i.e. Action Observation Treatment – AOT) have proven effective in improving motor function in several neurological disorders. The aim of the thesis is to discuss the role of action observation in driving the recovery and the perfectioning of motor abilities. The first part of the thesis reports a clinical pilot study demonstrating the effectiveness of AOT for the improvement of upper limb motor function in children with cerebral palsy. This study presents two main elements of novelty. The first is the remote treatment delivery and monitoring, allowing the implementation of rehabilitative sessions at patient’s own home. The second is the introduction of child-to-child remote interaction as driving-factor of motor improvement. In particular, child-to-child difference in hand motor ability is linked to improvement, suggesting that it is preferable for a child to observe a leading peer with superior motor skills to his own. This study extends traditional AOT approaches to novel social-enriched scenarios by which children could simultaneously be both recipient and leader within the motor learning process. The second part of the thesis aim to investigate the neurophysiological substrates of observational learning in healthy subjects, by means of a Transcranial Magnetic Stimulation study (TMS). Since the recent interruption of the experimental activities due to the pandemic, this part needs additional time to be completed. Thus, a six-months extension for the completion of the thesis has been requested.

Il Nucleo Rosso (NR) e' una strutture mesencefalica che proietta al midollo spinale tramite la via rubro-spinale e al cervelletto tramite la via rubro-olivare. Il NR e' un centro di integrazione motoria, implicato nel controllo dei movimenti degli arti. Le afferenze cerebellari e corticali al NR sono principalmente di natura glutamatergica ma anche noradrenergica. In tale contesto, lo scopo di questo lavoro e' di verificare l'azione modulatoria della NA sulla risposta eccitatoria evocata dal Glu in neuroni rubrali. Inoltre e' parso utile valutare il ruolo dei recettori alfa2 e beta in tale modulazione. Le indagini sperimentali sono state effettuate in vivo su ratti Wistar mantenuti in anestesia profonda (1,3 g/Kg) e consistevano nella registrazione dell'attivita' elettrica da singoli neuroni rubrali durante singole microapplicazioni di glutammato da solo o insieme a NA o a suoi agonisti e/o antagonisti per i recettori alfa2 e beta. I nostri risultati indicano che la NA modifica la risposta eccitatoria evocata dal Glu in neuroni rubrali inducendo decrementi e in qualche caso incrementi di tale risposta. Inoltre gli effetti indotti dall'applicazione dell'amina sono dose-dipendenti e reversibili. Gli effetti della NA erano indipendenti dalla modulazione diretta esercitata sulla frequenza di scarica di base, infatti, la modulazione della risposta al Glu e' stata osservata in neuroni in cui la frequenza di scarica di base incrementava, decrementava o non subiva alcun effetto in seguito al rilascio di NA. L'applicazione di clonidina, un agonista per i recettori alfa2, ha determinato una riduzione della risposta eccitatoria evocata dal Glu in tutti i neuroni rubrali saggiati. A confermare il coinvolgimento dei recettori alfa2 nella depressione indotta dalla NA sulla risposta al Glu, sono state effettuate delle applicazioni di ioimbina, antagonista dei recettori alfa2, che bloccava l'effetto inibitorio esercitato dalla NA o dalla clo. L'applicazione di isoproterenolo, un agonista per i recettori beta noradrenergici, ha determinato un incremento della responsivita' al Glu in neuroni rubrali e in alcuni casi decrementi di tale risposta. L'applicazione di timololo, un antagonista dei recettori beta accentua ulteriormente l'effetto inibitorio esercitato dalla NA sulla risposta al Glu. In conclusione, poiche', presenta un'affinita' piu' elevata per i recettori adrenergici di tipo alfa2 che per i beta, questi risultati suggeriscono che, mentre una moderata attivazione delle vie noradrenergiche tende a deprimere la responsivita' al Glu e quindi il firing dei neuroni rubrali, un'attivita' intensa delle stesse vie avrebbe effetto opposto sulla funzionalita' del NR, cioe' un potenziamento dell'attivita' di trasmissione delle informazioni corticali e cerebellari.
The Red Nucleus (RN) is a mesencephalic structure which projects to the spinal cord by the rubrospinal pathway and to the cerebellum by the rubro-olivary pathway. The RN is believed to play a role mostly in motor control and is also involved in other functions such as the response to hypoxia and also in behavioural tasks. The cerebellar and cortical afferents to RN are mostly glutamatergic, but a diffuse noradrenergic projection from locus coeruleus is also delivered to the nucleus. In fact, the background spiking activity of RN neurons can be modified by noradrenaline (NA). The aim of this work was to ascertain whether NA is able to influence the responsiveness of RN neurons to glutamate (GLU) and the role of alfa2 e beta adrenoceptors on this modulation. The effects of NA on the excitatory responses evoked by GLU in single rubral neurons were studied by a microiontophoresis technique on male Wistar rats anaestethized with urethane (1.3 g/Kg). Applications of NA (2-30 nA) induced mainly a significant and reversible depression of glu-evoked excitations in all the tested neurons. This action of NA was dose-dipendent and could block GLU responses totally. These effects were independent of the direct modulation exerted by NA on the background firing rate of RN neurons. Applications of clonidine (a alfa2 noradrenergic receptor agonist) induced a strong depression of GLU-evoked excitations in all tested neurons Moreover, the alfa2 selective antagonist yohimbine was able to block the depressive action of NA on GLU responses partially or totally. In contrast, applications of isoproterenol (a beta noradrenergic receptor agonist) induced modest enhancements of GLU responses and the most significant action of beta antagonist timolol was to increase the depressive action of NA on GLU responses. These results indicate that moderate doses of NA, mostly involving alfa2 receptors, depress the cortical and cerebellar transmission to RN neurons. The recruiting of beta adrenoceptor, presumably by high doses of NA, can partially reduce, and in some cases invert, this trend.

In this thesis we studied Neuritin (also called Nrn or cpg15), a GPI-anchored protein identified among a pool of candidate plasticity-related genes induced by kainate in rat hippocampal dentate gyrus (Nedivi, Hevroni et al. 1993). It has been shown that it is involved in neurites elongation and in promoting synaptic maturation (Putz, Harwell et al. 2005). Neuritin acts in a non-cell autonomous manner to coordinately regulate the growth of apposing dendritic and axonal arbors. Its expression is regulated by neurotrophines, NGF, calcium levels and androgens. Our previous studies demonstrated that NGF up-regulates Nrn expression during PC12 neuron differentiation, and that Nrn enhances the differentiating effects of NGF on PC12 cells favoring the extension of longer neurites (Cappelletti, Galbiati et al. 2007). Interestingly, Nrn expression peaks during neuronal development and, particularly, in the embryonic proliferative zones. During embryogenesis one of the most important aspects is the active neuronal migration in order to reach the final position and obtain the correct development of the nervous system. The migration of neurons and precursor cells involves molecular mechanisms which are often similar to those involved in neurite outgrowth. The generation of the GnRH neuron network, that plays a key role in the regulation of the reproduction system, represent a particular example of neuronal migration. These neurons generates from the olfactory epithelium and move to the hypothalamus where they exerts their regulatory function. For this reason a neuronal immortalized cell line of GnRH neurons, named Gn11 cells, is considered a good model to study neuronal migration (Radovick, Wray et al. 1991; Maggi, Pimpinelli et al. 2000; Cariboni, Maggi et al. 2007). A preliminary microarray analysis performed on Gn11 cells showed neuritin as one of the most abundant genes expressed in this cell line, leading us to hypothesize that it is involved in the neuronal migration process. To demonstrate this hypothesis, we analyzed neuritin mRNA and protein expression levels in different cell lines, characterized by a different migratory behavior. Interestingly, neuritin expression is much higher in migrating than in non-migrating cells. In Boyden microchemotaxis and wound-healing assays, the migratory ability of Gn11 cells is reduced when neuritin expression is silenced, while it is increased by neuritin over-expression. We also demonstrated through a Boyden microchemotaxis assay that the over-expression of Nrn in primary culture of ganglionic eminences (the area generating the migrating interneurons) increases interneuron migration. Furthermore, our hypothesis is strenghtened by results obtained with the selective elettroporation of ganglionic eminences of rat’s E16 brain slices indicating an increased migration of interneurons when neuritin is over-expressed. Post-translational modifications of alpha-tubulin are known to be associated with microtubule dynamics. ICC and Western blot analyses showed an enrichment of stable microtubules, that likely reflects the diminished migratory capability of the cells, in neuritin silenced cells; moreover, neuritin over-expression, that induces an increase in the migratory ability in the cells, is also able to up-regulates the tyrosinated form of a-tubulin reflecting the presence of more dynamic microtubules. Altogether these data demonstrate a novel function of neuritin in promoting migration of neuronal cells, both in vitro and in vivo, through the modulation of microtubule stability, and makes neuritin a good candidate as a therapeutic target for different diseases in which cellular migration is involved. Cappelletti, G., M. Galbiati, et al. (2007). "Neuritin (cpg15) enhances the differentiating effect of NGF on neuronal PC12 cells." J Neurosci Res 85(12): 2702-2713. Cariboni, A., R. Maggi, et al. (2007). "From nose to fertility: the long migratory journey of gonadotropin-releasing hormone neurons." Trends Neurosci 30(12): 638-644. Maggi, R., F. Pimpinelli, et al. (2000). "Immortalized luteinizing hormone-releasing hormone neurons show a different migratory activity in vitro." Endocrinology 141(6): 2105-2112. Nedivi, E., D. Hevroni, et al. (1993). "Numerous candidate plasticity-related genes revealed by differential cDNA cloning." Nature 363(6431): 718-722. Putz, U., C. Harwell, et al. (2005). "Soluble CPG15 expressed during early development rescues cortical progenitors from apoptosis." Nat Neurosci 8(3): 322-331. Radovick, S., S. Wray, et al. (1991). "Migratory arrest of gonadotropin-releasing hormone neurons in transgenic mice." Proc Natl Acad Sci U S A 88(8): 3402-3406.

The NaChip project (IST-2001-38915) aims to the realization of a non-invasive system for monitoring the electrical activity of neurons culture. Such device is a silicon microchip containing EOSFET (Electrolyte Oxide Silicon Field Effect) transistors, through which it is possible to record the electrical activity from nervous cells. This device has an elevated signal/noise ratio, an intrinsic characteristic of the instrument. To improve the relationship of the signal/noise ratio, this job focuses on the improvement of the cell-transistor connection, through the accumulation of sodium channels at the neuron-to-substrate interface. We have used B1 and B2 auxiliary subunits of Nav1.2 channel, that, interacting through their extracellular domain with particular proteins, respectively contactin 1 (CNT1) and tenascin C (TNC), can carry the accumulation of the sodium channel in the cell/transistor interface. Through the creation of fluorescent fusion proteins for B1 and B2, it has been possible to analyze the effect of the overexpression of the chimeras in E18 rat hippocampal neurons, and their role in the sorting of the channel in the presence of substrate coatings. Such analysis has been carried out by means of TIRF microscopy, that allows the observation of the adhesion zone of the cell with an elevated signal/noise ratio. This has brought us to the discovery of an unexpected effect of B2 in the considerable increaseing of the dendritic branching, thus allowing to take advantage of such characteristic in order to improve the electrical coupling connection cell/transistor and to increase the signal/noise ratio. The necessity of a selective transfection of a single neuron over the recording zone, has carried to the development of a innovative and not using the stimulation site EOSC (Electrolyte Oxide programmed technique Semiconductor Capacitor). This site can been used for ectroporation of a limited number of cells in adhesion, allowing to put inside the cell various types of molecules as it will be explained in the present job.

Wolfram syndrome (WS) is a rare genetic disorder caused by mutations in the WFS1 gene leading to a wide spectrum of clinical dysfunctions, among which blindness, diabetes and psychiatric traits are the most prominent. WFS1 encodes for the ER-resident transmembrane protein wolframin (WFS1), whose structure and functions are only partially understood, making the comprehension of the aetiopathological events underlying the syndrome yet incomplete. The following thesis project aims at better deciphering wolframin function under physiological and pathological conditions. In particular, we focused on the study of both recessive and dominant forms of WS1. Firstly, we established relevant cellular models from human derived samples to unveil pathological mechanisms at the root of specific WS1 symptoms (PART I). Noticeably, to our knowledge this is the first report of patient’s specific neuronal characterisation. Besides the described role played by wolframin in counteracting cellular stress, we shed light on two undescribed pathological mechanisms. The first one implies glial population, which exerts a peculiar non-cell-autonomous activity further damaging WFS1 knock out neurons. This toxicity appears to be prompted by ER stress pathways occurring in mutant astrocytes, which cause their activation and subsequent secretion of inflammatory mediators. In this scenario, the use of specific molecules able to mitigate the triggering event, such as chemical chaperones, positively affecting neuronal cultures, preventing cell death (PART II and III). Besides, neuroinflammation appears to be a hallmark of WS1 murine tissues too, preceding retinal ganglion cell loss. This feature is most likely responsible for the early visual defects observed in mutant mice (PART IV). In addition, after structural and functional studies on dominant mutants, we described for the first time a new putative role played by WFS1 in autophagy regulation via its LC3 binding domains. Our findings indicate that wolframin oligomerisation might not only be a key event in its functioning, but also the cause of dominant pathology, as suggested by mutants’ aggregation tendency (PART V). Finally, the study of WS1 psychiatric features in knock out mice, uncovered DA-related neurodegenerative and behavioural defects occurring during disease. Nonetheless, electrophysiological recordings of MSNs residing within the NAc, unveiled their basal excitability propensity due to the altered capacitance of these cells. Furthermore, the impaired D1R-mediated response elicited by DA, further addressed their overexcitability to a defective channel tuning, thus implying that wolframin loss compromises dopaminergic signalling (Part VI). Overall, this work provides deeper understanding on WS1 pathophysiology, highlighting the importance of characterising specific mutations in relevant cellular settings to unveil novel pathways and possible therapies.
La sindrome di Wolfram (WS) è una rara malattia genetica causata da mutazioni nel gene WFS1 che porta a un ampio spettro di sintomi, tra cui le più importanti sono cecità, diabete e tratti psichiatrici. WFS1 codifica per la proteina transmembrana wolframina (WFS1) che risiede nell'ER e la cui struttura e funzione sono solo parzialmente comprese, rendendo ancora incompleta la comprensione degli eventi eziopatologici alla base della sindrome. Il seguente progetto di tesi mira a decifrare meglio la funzione della wolframina in condizioni fisiologiche e patologiche. In particolare, ci siamo concentrati sullo studio delle forme sia recessive che dominanti di WS1. In primo luogo, abbiamo stabilito modelli cellulari rilevanti da campioni derivati dall'uomo per svelare i meccanismi patologici alla radice dei sintomi specifici della WS1 (PARTE I). A nostra conoscenza, questo è il primo rapporto sulla caratterizzazione neuronale specifica di pazienti. Oltre al ruolo descritto svolto dalla wolframina nel contrastare lo stress cellulare, abbiamo fatto luce su due meccanismi patologici non descritti. Il primo attribuisce alla popolazione gliale, una peculiare attività non cello-mediata che danneggia ulteriormente i neuroni già difettivi di WFS1. Questa tossicità sembra essere indotta dallo stress dell'ER che si verifica negli astrociti mutanti, che ne causa la loro attivazione e la successiva secrezione di mediatori dell'infiammazione. In questo scenario, l'utilizzo di molecole specifiche in grado di mitigare l'evento scatenante, quali chaperon chimici, ha effetti positivi sulle colture neuronali, prevenendone la morte cellulare (PARTE II e III). Inoltre, la neuroinfiammazione sembra essere un segno distintivo anche dei tessuti murini WS1, che precede la perdita delle cellule gangliari retiniche. Questa caratteristica è molto probabilmente responsabile dei primi difetti visivi osservati nei topi mutanti (PARTE IV). In secondo luogo, studi strutturali e funzionali sulle mutazioni dominanti, ci hanno permesso di identificare per la prima volta un nuovo ruolo putativo svolto da WFS1 nella regolazione dell'autofagia attraverso i suoi domini di legame LC3. I nostri risultati indicano che l'oligomerizzazione della wolframina potrebbe non essere solo un evento chiave nel suo funzionamento, ma anche la causa delle patologie dominanti, come suggerito dalla tendenza all'aggregazione dei mutanti (PARTE V). Infine, lo studio delle caratteristiche psichiatriche della WS1 in topi knock out, ha rivelato eventi neurodegenerativi e difetti comportamentali correlati alla dopamina (DA) che si verificano lungo il decorso della malattia. Le registrazioni elettrofisiologiche dei neuroni MSN che risiedono all'interno del NAc, hanno messo alla luce una loro basale propensione all'eccitabilità dovuta all'alterata capacità di queste cellule. L'alterazione della risposta suscitata dalla DA e mediata dal recettore D1R, ci ha permesso di attribuire questa sovraeccitabilità a una modulazione difettiva dei canali ionici, indicando così che la perdita di wolframina compromette la segnalazione dopaminergica (Parte VI). Nel complesso, questo lavoro fornisce una comprensione più profonda della fisiopatologia WS1, evidenziando l'importanza di caratterizzare mutazioni specifiche in contesti cellulari specifici per svelare nuovi meccanismi e possibili terapie.

La degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA) del mesencefalo ventrale è considerata uno dei segni distintivi della malattia di Parkinson (PD) e del Parkinsonismo. La loro suscettibilità al danno e la loro adattabilità e plasticità sono state inizialmente studiate in modelli animali per comprendere i meccanismi cellulari e molecolari e l'azione delle terapie farmacologiche. La recente introduzione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSCs) e lo sviluppo di protocolli per la loro differenziazione in neuroni con un fenotipo DA ha permesso la valutazione diretta dei meccanismi cellulari del PD e del Parkinsonismo, il meccanismo d'azione dei farmaci antiparkinsoniani e le applicazioni esplorative di vari aspetti della terapia cellulare. Lo scopo di questa tesi è la generazione e la caratterizzazione fenotipica di neuroni DA umani utilizzabili come strumento per lo sviluppo di una varietà di dispositivi terapeutici basati sulla terapia cellulare, in particolare dispositivi elettronici impiantabili interamente organici. Questi dispositivi sono stati progettati per essere impiantati in modelli animali di PD per una terapia loco-regionale guidata da stimoli elettrici e chimici per supportare l'attecchimento dei precursori dei neuroni DA, massimizzando la loro differenziazione e funzione. Al fine di ottenere precursori di neuroni DA umani di alta qualità e riproducibili che siano in grado di differenziarsi e maturare in neuroni DA funzionali che rispondono a stimoli elettrici e chimici, questo lavoro è stato organizzato in quattro sottoprogetti principali. Il primo sottoprogetto è stato dedicato all'ottimizzazione dei metodi di differenziazione delle iPSCs umane in precursori dei neuroni DA mesencefalici utilizzando un protocollo precedentemente pubblicato (Fedele et al. 2017). Questi precursori dei neuroni DA possono essere espansi per diversi passaggi e conservati in azoto liquido per qualsiasi uso futuro. Il secondo sottoprogetto è stato dedicato alla differenziazione dei precursori DA mesencefalici in neuroni DA maturi che sono stati caratterizzati mediante immunofluorescenza, PCR quantitativa, HPLC ed analisi elettrofisiologiche. Il fenotipo DA dei neuroni è stato studiato testando la loro risposta a due agonisti dopaminergici (pramipexolo e piribedil) attualmente utilizzati per il trattamento del PD. Dati recenti hanno dimostrato un effetto neurotrofico prodotto da un agonista antiparkinsoniano del recettore DA D2/D3, il ropinirolo (Collo et al. 2018). Sulla base di questi risultati, sono stati valutati gli effetti cellulari e molecolari di pramipexolo e piribedil sui neuroni DA umani studiando i cambiamenti morfologici correlati alla plasticità strutturale e l'attivazione delle vie intracellulari. Sono state studiate anche le proprietà neuroprotettive e neurorigenerative di questi due agenti farmacologici. Il terzo sottoprogetto è stato dedicato allo studio degli effetti della stimolazione elettrica sulla plasticità strutturale dei neuroni DA umani. Diversi lavori hanno dimostrato che la stimolazione elettrica può promuovere la differenziazione neuronale e la crescita dei neuriti di vari tipi di cellule neuronali in vitro, tra cui PC12 e cellule staminali neurali umane. Il quarto sottoprogetto è stato dedicato alla generazione di iPSCs umane da cellule mononucleate del sangue periferico (PBMCs) donate da nuovi controlli sani e pazienti affetti da un Parkinsonismo, l’atrofia multisistemica (MSA). I cloni di iPSCs ottenuti dal controllo e dal paziente sono stati sottoposti a caratterizzazione fenotipica per esaminare la presenza di marcatori di pluripotenza mediante immunofluorescenza, PCR quantitativa, analisi del cariotipo, pluripotenza e capacità di differenziazione nei tre foglietti embrionali. Le iPSCs sono state successivamente differenziate in neuroni DA mesencefalici e valutate per la loro risposta farmacologica agli agonisti dopaminergici.
The degeneration of dopaminergic (DA) neurons of the ventral mesencephalon is considered one of the hallmarks in Parkinson’s disease (PD) and Parkinsonism. Their susceptibility to damage and their adaptability and plasticity were initially studied in animal models in order to understand the cellular and molecular mechanisms and the action of pharmacological therapeutics. The recent introduction of human inducible pluripotent stem cells (iPSCs) technology and the development of protocols for their differentiation into neurons with a DA phenotype has permitted the direct evaluation of cellular mechanisms of PD and Parkinsonism, the mechanism of action of anti-parkinsonian drugs and the exploratory applications of various aspects of cell therapy. The aim of this thesis was the generation and phenotypic characterization of human DA neurons amenable to be used as a tool for the development of a variety of therapeutic devices based on cell therapy, in particular implantable whole-organic electronic devices. These devices were designed to be implanted in animal models of PD for a loco-regional therapy driven by electrical and chemical stimuli to support the engraftment of DA neuron precursors, maximizing their differentiation and function. In order to achieve high quality and reproducible human DA neuron precursors that are able to differentiate and mature into functional DA neurons that respond to electrical and chemical stimuli, therefore amenable to the above described use, this work was organized in four main subprojects. The first subproject was dedicated to the optimization of the methods of differentiation of human iPSCs into mesencephalic DA neuron precursors using a previously published protocol (Fedele et al. 2017). These DA neuron precursors can be expanded for several passages and stored in liquid nitrogen for any future use. The second subproject was dedicated to the differentiation of mesencephalic DA precursors into mature DA neurons that were characterized by immunofluorescence, quantitative PCR, HPLC and electrophysiological analyses. The DA phenotype of the neurons was investigated by testing their response to two dopaminergic agonists (i.e., pramipexole and piribedil) currently used for the treatment of PD. Recent data have demonstrated a neurotrophic effect produced by an anti-parkinsonian DA D2/D3 receptor (D2R/D3R) agonist, ropinirole (Collo et al. 2018). Based on these findings, the cellular and molecular effects of pramipexole and piribedil on human DA neurons were evaluated by studying morphological changes related to structural plasticity and the activation of intracellular pathways. The neuroprotective and neuroregenerative properties of these two pharmacological agents were also studied. The third subproject was dedicated to the study of the effects of the electrical stimulation on the structural plasticity of human DA neurons. Several reports have shown that electrical stimulation can promote neuronal differentiation and neurite growth of various neuronal cell types in vitro, including PC12 (Jing et al. 2019) and human neural stem cells (Stewart et al. 2015). The fourth subproject was dedicated to the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) donated from a novel set of healthy controls and patients affected by a Parkinsonism, i.e., the multiple system atrophy (MSA). The iPSC clones obtained from the control and the patient underwent a phenotypic characterization to examine the presence of pluripotency markers by immunofluorescence and quantitative PCR analysis, karyotype analysis, pluripotency and trilineage differentiation potential. The iPSCs were subsequently differentiated into mesencephalic DA neurons and assessed for their pharmacological response to dopaminergic agonists.

In questa tesi sono state studiate le attività neuronali del nucleo cuneato esterno, delle cellule del Purkinje del cervelletto intermedio e del nucleo interposito durante movimenti passivi dell¿arto anteriore in ratti anestetizzati. Lo scopo principale di questo studio era quello di identificare e comparare gli schemi di attivazione neuronale tra le strutture precerebellari e cerebellari. L¿attività di scarica dei neuroni è stata correlata con diversi aspetti della cinematica del movimento dell¿arto riguardanti sia le caratteristiche del vettore velocità che la posizione. I dati sulla posizione dell¿arto sono stati studiati applicando la tecnica di analisi delle componenti principali ad un gruppo comune di dati identificando due principali schemi di scarica che spiegavano la maggior parte della varianza. Una componente caratterizzava l¿attività legata al movimento del nucleo cuneato esterno e dei neuroni corticali cerebellari, mentre l¿altra rifletteva l¿attività neuronale del nucleo interposito. Entrambe le componenti principali erano legate alla cinematica globale dell¿arto ma, mentre la maggior parte della varianza dell¿attività delle cellule del cuneato esterno e delle cellule del Purkinje veniva spiegata dall¿orientamento dell¿asse dell¿arto, la scarica dei neuroni dell¿interposito si relazionava meglio alle variazioni di lunghezza dell¿arto. Attraverso l¿analisi di regressione multipla applicata ai dati del vettore velocità si è dimostrato che l¿attività delle cellule del Purkinje e dei neuroni del cuneato risultava maggiormente collegata alla componente direzionale del vettore velocità ed all¿intero vettore, mentre la scarica dei neuroni del nucleo interposito presentava anche una significativa relazione con la componente scalare. Questa differenza nella rappresentazione della cinematica dell¿arto osservata nel nucleo cuneato esterno e nella corteccia dello spinocerebello comparata con quella del nucleo interposito viene discussa in relazione al ruolo specifico che queste strutture potrebbero giocare anche durante il controllo attivo dei movimenti dell¿arto. Nonostante ogni struttura mostri specifiche caratteristiche, nel complesso si mantiene un quadro funzionale in cui si delinea una rappresentazione globale dei parametri cinematici dell¿arto sia nei neuroni precerebellari che in quelli cerebellari

ABSTRACT Mitochondria are the energy producing organelles in eukaryotic cells providing ATP through oxidative phosphorylation (OXPHOS). Mitochondria are highly dynamic and undergo fission, fusion and move into the cell along the microtubules to generate the mitochondrial network. Mitochondrial dynamics play a critical role in the control of organelle shape, size, number, function and quality control of mitochondria. It is regulated by several GTPases that play an important role in fusion and fission processes. In mammals, mitochondrial fusion is controlled by Mitofusin 1 (Mfn1), Mitofusin 2 (Mfn2) and Optic atrophy protein 1 (Opa1), while mitochondrial fission is regulated by Dynamin related protein 1 (Drp1). The aim of this study is to understand how mitochondrial distribution in neuronal cells is affected by mitochondria function and/or morphology. We use Drosophila melanogaster , whose genome contains homologs for all mitochondrial fusion and fission proteins, as a modelorganism to study how loss of fusion and fission protein modify the axonal distribution and motility of mitochondria. We demonstrate that loss of Marf (Mitochondrial associated regulatory factor, homologous to human mitofusins) or Opa1 causes an accumulation of mitochondria in the soma, a defect in the axonal distribution of mitochondria, a severe depletion of mitochondria in neuromuscular junctions (NMJs) and reduced mitochondrial motility. Simultaneous loss of Drp1 rescues the Opa1 phenotype very robustly while loss of Marf essentially does not. Viability data however show the opposite trend. The expression of Marf RNAi or Opa1 RNAi cause lethality, and so does the double down regulation of Opa1 and Drp1. Conversely individuals expressing Marf RNAi and Drp1 RNAi simultaneously survive and are comparable to the controls. We then examined possible alterations of mitochondrial function by analyzing the mitochondrial respiratory capacity, the activity of the respiratory chain complexes and ATP production capacity. The data show that individuals where Marf, Opa1 or simultaneously Opa1 and Drp1 are down-regulated display severe alterations in mitochondrial function, while there are no obvious energy defects in individuals in which the expression of Marf and Drp1 is simultaneously reduced. Collectively our results obtained suggest that mitochondrial morphology is important for a homogeneous distribution of mitochondria along the axon and their transport to synapses and that these mechanisms are independent of mitochondria function.
RIASSUNTO I mitocondri sono organelli essenziali per la cellula e la loro funzione primaria è di produrre energia sottoforma di ATP. I mitocondri sono organelli altamente dinamici:processi di fusione e fissione delle membrane mitocondriali ne controllano la forma, la lunghezza e il numero e un equilibrio tra i due meccanismi è fondamentale per una corretta morfologia mitocondriale. Numerose proteine sono coinvolte nei processi di fusione e fissione mitocondriale: Mitofusina 1 e Mitofusina 2 (Mfn1 e Mfn2) e Optic atrophy 1 (Opa1) regolano i processi di fusione mitocondriale, mentre Dynamin-related protein 1 (Drp1)mediala fissione. Drosophila possiede il gene mitochondrial assembly regulatory factor (MARF), espresso in modo ubiquitario ed omologo al gene MFN2. Nel tessuto muscolare la riduzione di espressione di Marf induce frammentazione e alterazione della morfologia del mitocondrio. Inoltre, mutanti di Marf mostrano una severa deplezione dei mitocondri nelle giunzioni neuromuscolari (NMJs) ed un’alterazione della morfologia della giunzione caratterizzata dall’aumento nel numero e da una riduzione nella dimensione dei bottoni sinaptici. Un altro aspetto della dinamica mitocondriale, oltre ai processi di fusione e fissione, è la motilità dei mitocondri, che deve essere altamente regolata soprattutto in cellule come i neuroni. Il trasporto mitocondriale e la continua ridistribuzione dei mitocondri lungo l’assone è essenziale per il mantenimento dell’integrità assonale e delle normali funzioni della cellula. Studi hanno messo in evidenza come la mancanza di mitocondri a livello delle giunzioni neuromuscolari in Drosophila comprometta la trasmissione sinaptica e come difetti nel trasporto mitocondriale assonale siano implicati nello sviluppo di disordini neurologici e malattie neurodegenerative (Chan, 2006). Lo scopo di questo lavoro è quello di capire il ruolo della morfologia e della funzione mitocondriale nella distribuzione intracellulare dei mitocondri nei neuroni. Per fare questo abbiamo utilizzato Drosophila melanogaster, organismo modello efficace per l’analisi della funzione genica, inclusa quella di geni responsabili di patologie umane. L’analisi della morfologia mitocondriale è stata effettuata utilizzando linee di Drosophilache esprimono in vivo un transgene per RNA interference e che permette di ridurre l’espressione di geni endogeni coinvolti nei processi di fusione e fissione mitocondriale, quali Marf, Opa1 e Drp1. Abbiamo inoltre creato linee che esprimono contemporaneamente i trangeni per RNAi di Marf e Drp1 o Opa1 e Drp1, con lo scopo di bilanciare i meccanismi di fusione e/o fissione. Ci siamo soffermati in particolare sullo studio di due aspetti principali, la morfologia e la funzionalità mitocondriale, per capire se difetti nella morfologia e nella funzionalità mitocondriale siano collegate e concorrano insieme allo sviluppo di patologie.Numerose patologie neurodegenerative sono infatti caratterizzate da alterazioni del trasporto mitocondriale e spesso questo è associato a difetti nella morfologia e nella funzionalità mitocondriale. Per studiare la morfologia mitocondriale, le linee UAS-RNAi sono state incrociate con una linea che contiene il promotore ELAV per l’espressione tessuto-specifica nei neuroni ed esprime una GFP mitocondriale. Abbiamo analizzato la morfologia dei mitocondri, sia nel corpo cellulare sia negli assoni e la distribuzione mitocondriale in assoni lunghi come i motoneuroni e assoni corti come quelli del nervo ottico e la distribuzione mitocondriale nella giunzione neuromuscolare.I risultati ottenuti mostrano che frammentazione dei mitocondri e alterazione della distribuzione mitocondriale assonale in individui in cui sia ridotta l’espressione di proteine di fusione. Inoltre si osserva una diminuzione della percentuale dei mitocondri mobili e del numero assoluto dei mitocondri anterogradi e retrogradi. Questi dati dimostrano che vi è una stretta correlazione tra morfologia mitocondriale e distribuzione dei mitocondri, in particolare in assoni lunghi. Inoltre analizzando le linee Marf RNAi Drp1 RNAi e Opa1 RNAi Drp1 RNAi, nelle quali gli eventi di fusione e fissione ridotti ma sono in equilibrio tra loro, si osserva un miglioramento la morfologia, la distribuzione e il trasporto mitocondriale assonale in modo particolare nel caso di Opa1 e non nel caso di Marf. Abbiamo cercato di capire quindi se in questi individui vi fossero alterazioni delle funzionalità mitocondriali attraverso l’analisi della capacità respiratoria mitocondriale, dell’attività dei complessi della catena respiratoria e della capacità di produzione di ATP. I risultati ottenuti dimostrano che morfologia e funzionalità mitocondriale non sempre sono collegate tra loro hanno effetti diversi nella modulazione della distribuzione mitocondriale assonale. In conclusione possiamo affermare che solamente la morfologia e la dimensione del mitocondrio sembrano essere essenziali per la corretta distribuzione mitocondriale assonale.

Study of spatio-temporal dynamics of cGMP in olfactory sensory neurons in culture with FRET based sensors.
Studio delle dinamiche spazio-temporali di cGMP in neuroni sensoriali olfattivi in coltura tramite utilizzo di sonde geneticamente codificate basate su FRET.

La proteína Alex3 forma parte de la familia de genes exclusiva de los mamíferos euterios Armcx, caracterizada por presentar una alta expresión en el SNC, por encontrarse localizada en clúster en el cromosoma X y porque se originaron a partir de la retrotransposición del gen Armc10 y una rápida duplicación en tándem en una evolución temprana de los mamíferos euterios. Las proteínas Armcx/Armc10 poseen primariamente una localización subcelular bimodal, encontrándose asociadas a la membrana externa mitocondrial y en el núcleo celular, localización que concuerda con sus secuencias proteicas que poseen putativos dominios de localización en estos compartimentos. La sobreexpresión de las proteínas Armcx/Armc10 produce una profunda alteración de la red mitocondrial, demostrando que esta familia de proteínas juega un papel importante en la regulación de la dinámica y agregación mitocondrial y al menos, la sobreexpresión de la proteína Alex3, no induce cambios en los parámetros bio-energéticos mitocondriales, tales como el consumo de oxígeno, el potencial de membrana, el contenido de DNA mitocondrial, la actividad de la citocromo c oxidasa o la recaptación de Ca2+, ni alteran el balance de fisión/fusión mitocondrial. Tanto la sobreexpresión como el silenciamiento de las proteínas Alex3 y Armc10 en neuronas hipocampales se ha visto alteran la distribución y transporte mitocondrial. Las proteínas Alex3 y Armc10 interaccionan con el complejo Kinesina/Miro/Trak2, regulador del transporte mitocondrial, lo cual sugiere que esta familia de proteínas regularían el transporte y dinámica mitocondrial a través de este complejo de proteínas. La interacción de Alex3 con este complejo también se ha visto es dependiente de los niveles de Ca2+, reduciéndose la interacción de estas proteínas cuando los niveles de Ca2+ son elevados. Por otra parte, la vía de señalización asociada a proteínas Wnt se ha visto induce la degradación de la proteína Alex3 por un proceso independiente del proteosoma. Esta degradación no depende de los componentes de la vía canónica Dishevelled, GSK3-β y β-catenina ni de los componentes no canónicos JNK, CAMKII y calcineurina, habiéndose demostrado que la PKC y la CK2 juegan un papel principal en el control y degradación de los niveles de la proteína Alex3 de forma dependiente e independiente de las vías de señalización de Wnt. De manera similar, la depleción de los niveles intracelulares de Ca2+ también reproduce la degradación de Alex3. Además, la degradación de Alex3 a través de las vías de señalización asociadas a las proteínas Wnt revierte los fenotipos de agregación mitocondrial inducidos por la sobreexpresión de Alex3 y es evitado por la activación de la PKC, lo que sugiere que las proteínas Wnt podrían jugar un papel en el control de la dinámica mitocondrial mediante la regulación de las proteínas Armcx.
Alex3 protein belongs to the eutherian specific family of genes Armcx, characterized by a high expression on the CNS, to be localized in a cluster on the X chromosome and to be originated by retrotransposition of Armc10 gene in a fast duplication in tandem. The Armcx/Armc10 proteins have a primary bimodal localization, both in nucleus and mitochondria as indicate their putative domains. Overexpression of Armcx/Armc10 proteins causes a profound alteration on the mitochondrial net showing that this family of proteins plays an important role in the regulation of the mitochondrial dynamics and at least, the overexpression of Alex3 protein neither change the bioenergetic parameters of mitochondria such as respiration, mitochondrial DNA content or calcium uptake nor alters the mitochondrial fusion/fission rate. Both the overexpression and knock-down of Alex3 and Armc10 proteins in hippocampal neurons alters the mitochondrial distribution and transport. Alex3 and Armc10 interact with the Kinesin/Miro/Trak2 mitochondrial transport regulator complex, suggesting that the Armcx protein family regulates mitochondrial dynamics through this complex. Moreover the interaction of Alex3 with this complex is dependent of calcium levels, diminishing the interaction when calcium levels are high. On the other hand, the Wnt signalling pathway induces the degradation of Alex3 protein in a proteosome independent process. This degradation is independent of the Wnt canonical and non-canonical members Dishevelled, GSK3β, β-catenin, JNK, calcineurin and CAMKII, but showing that the PKC and CKII members play a principal role in the control and degradation of Alex3 protein levels dependently and independently of Wnt pathways. Moreover, Alex3 degradation through Wnt signalling pathways, reverts the mitochondrial aggregation phenotypes and is avoided by PKC activation, suggesting that Wnt proteins can play a role in the control of mitochondrial dynamics through the regulation of Armcx proteins.

The cellular prion protein (PrPC) is a cell surface glycoprotein predominantly expressed in the central nervous system. A modification of the mainly α-helical PrPC into an isoform enriched in β-strands generates the prion, the infectious particle at the basis of fatal prion diseases. In spite of PrPC’s intimate involvement in prion propagation, its physiological function remains enigmatic. Past observations have supported the possibility that PrPC regulates Ca2+ homeostasis, a notion that has been recently reinforced by the demonstration that PrPC controls Ca2+ fluxes in domains close to the neuronal plasma membrane, and interacts physically with a ionotropic glutamate receptor, thus protecting from glutamate excitotoxicity. Recently, however, it has been proposed that PrPC serves as a high-affinity receptor for soluble amyloid-β (Aβ) oligomers implicated in Alzheimer’s disease (AD), and this interaction could thus be crucial for AD-related synaptic dysfunctions. In light of this background, using genetically-encoded Ca2+ probes targeting different cell domains of cerebellar granule neurons expressing, or not, PrPC, this work focused on whether PrPC regulates local Ca2+ fluxes arising from the activation of storeoperated Ca2+ entry (SOCE), and/or of glutamate receptors. We found that, with respect to PrPC-expressing neurons, the absence of PrPC caused alterations of several local Ca2+ fluxes, indicating that PrPC could act as a key component of the system(s) controlling neuronal Ca2+ homeostasis. As to the molecular mechanism enabling PrPC to exert such control, the results showed the implication of Fyn tyrosine kinase and of the Ca2+-induced-Ca2+-release from the ryanodine receptor. The study has also analyzed whether soluble Aβ oligomers could affect the PrPC-dependent regulation of Ca2+ homeostasis. Obtained results have shown that the acute treatment of neurons with Aβ oligomers abrogates the control of PrPC over Fyn and SOCE, and alters mitochondrial Ca2+ uptake after stimulation of ionotropic glutamate receptors. This data thus suggests a PrPC-dependent mechanism for Aβ-induced neuronal Ca2+ dyshomeostasis.
La proteina prionica (PrPC) è una glicoproteina di membrana espressa maggiormente nel sistema nervoso centrale. A seguito di una modificazione in un’isoforma ricca di foglietti β, essa genera il prione, la particella infettiva responsabile delle malattie da prioni. Sebbene la sua implicazione nelle malattie da prioni sia ormai acclarata, la funzione di PrPC nelle cellule deve essere ancora chiarita. Osservazioni passate hanno evidenziato che PrPC possa essere implicata nell’omeostasi del Ca2+. Successivamente, tale possibilità è stata supportata anche dalla dimostrazione che essa regola i flussi di Ca2+ in domini prossimi alla membrana plasmatica dei neuroni e dal fatto che interagisca direttamente con un recettore ionotropico del glutammato, prevenendo in tal modo l’eccitotossicità indotta dal glutammato. Recentemente, è stato anche proposto che la PrPC funga da recettore ad alta affinità per gli oligomeri solubili del peptide amiloide β (Aβ) implicati nella malattia di Alzheimer (AD) e che l’interazione PrPC- Aβ sia cruciale per la disfunzione neuronale osservata nella malattia. Alla luce di queste nozioni, questa tesi ha analizzato se la PrPC regoli l’ingresso di Ca2+ indotto dalla deplezione dei depositi intracellulari (SOCE) o dalla stimolazione dei recettori del glutammato, utilizzando a tal fine neuroni granulari di cervelletto isolati da topi esprimenti, o no, la PrPC e sonde sensibili al Ca2+ indirizzate a specifici compartimenti neuronali. Questo studio ha dimostrato che, rispetto ai neuroni con la PrPC, l’assenza di PrPC causa alterazioni in molti flussi locali di Ca2+, a indicare come la PrPC possa essere implicata nei complessi sistemi adibiti al controllo dell’omeostasi neuronale del Ca2+. Abbiamo inoltre trovato come ciò passi attraverso la modulazione della tirosin chinasi Fyn e del rilascio del Ca2+-indotto dal Ca2+ da parte del recettore rianodinico. Il lavoro ha inoltre analizzato se gli oligomeri solubili del peptide Aβ alterino il controllo esercitato dalla PrPC sull’omeostasi del Ca2+. I risultati ottenuti hanno evidenziato che il trattamento acuto dei neuroni con tali oligomeri altera la regolazione della PrPC sul SOCE e su Fyn e l’ingresso di Ca2+ nel mitocondrio a seguito dell’attivazione dei recettori ionotropici del glutammato. Questi dati suggeriscono pertanto l’esistenza di un meccanismo PrPC-dipendente che causa dis-omeostasi neuronale del Ca2+ indotta dal peptide Aβ.

Il complesso amigdaloideo (o amigdala) è una struttura cerebrale pari, composta da sostanza grigia, di forma ovoidale e localizzata nella parte profonda della regione rostromediale del lobo temporale di ciascun emisfero cerebrale. L’amigdala è costituita da 14 nuclei, diversificati sulla base delle loro caratteristiche citoarchitettoniche, immunoistochimiche e di connessione. Tale struttura è molto importante nella regolazione del comportamento emotivo, intervenendo nella genesi di paura, ansia, aggressività e comportamento sessuale. L’amigdala, inoltre, interviene anche nella memoria implicita e, tramite le connessioni con la formazione ippocampale, nell’acquisizione e consolidamento della memoria esplicita. I Cetacei mostrano un forte sviluppo cerebrale, ma i dati in letteratura riferiti al complesso amigdaloideo ed alle sue caratteristiche in questo ordine sono esigui e le ricerche in questo campo sono solo agli inizi. Il presente studio ha valutato topografia, estensione, citoarchitettura ed espressione della sostanza P (SP) nel tursiope (Tursiops truncatus). I neuroni immunoreattivi per la sostanza P sono stati osservati in tutti i nuclei profondi dell’amigdala di tursiope. Gli aspetti morfologici dei neuroni immunorettivi per la SP presenti nei nuclei amigdaloidei profondi di tursiope sono paragonabili a quelli dei neuroni immunoreattivi per la calbindina-D28k evidenziati nei medesimi nuclei da precedenti lavori condotti su Roditori e Primati. Tale aspetto, insieme al fatto che i neuroni SP-immunoreattivi nel ratto possono esprimere anche calbindina-D28k, somatostatina e NPY, indica come i neuroni SP immunoreattivi possano esercitare un controllo inibitorio agendo sia sull'albero dendritico (dendriti prossimali e distali) che sul soma dei neuroni piramidali. La bassa densità di neuroni contenenti SP presenti nei nuclei profondi di tursiope è in accordo con il ridottissimo numero di neuroni SP-immunoreattivi presenti negli stessi nuclei di Uomo e di ratto.

Il trigono della vescica urinaria (UBT) è un'area limitata attraverso la quale penetrano nella vescica la maggior parte dei vasi e fibre e in cui le fibre nervose e neuroni intramurali sono più concentrati. Mediante l’utilizzo combinato di un tracciante retrogrado(FB) e dell’immunoistochimica sono stati valutati il fenotipo e l’area del soma dei neuroni dei gangli spinali (DRG), dei neuroni post-gangliari, il fenotipo dei gangli della catena simpatica (STG) e i gangli mesenterici caudali (CMG) innervanti l’UBT. - Caratterizzazione dei neuroni dei DRG con: peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP)(30±3%, 29±3%, rispettivamente), sostanza P(SP)(26±8%, 27±12%), ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS)(21±4%; 26±7%), neurofilamento 200kDa (NF200)(75±14%, 81±7% ) , transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%, 43±6%) e isolectina-B4-positivi (IB4) (56±6%;43±10%). I neuroni sensoriali, distribuiti da L2 a Ca1 (DRG), hanno presentato una localizzazione segmentale, mostrando maggior densità nei DRG L4-L5 e S2-S4. I neuroni sensoriali lombari sono risultati significativamente più grandi di quelle sacrali (1.112±624μm2 vs716±421μm2). Complessivamente, questi dati indicano che le vie lombari e sacrali probabilmente svolgono ruoli diversi nella trasmissione sensitiva del trigono della vescica urinaria. -I neuroni FB+ della STG e dei CMG sono risultati immunoreattivi per la tirosina idrossilasi (TH)(66±10,1%, 53±8,2%, rispettivamente), la dopamina beta-idrossilasi (DβH)(62±6,2%, 52±6,2%), neuropeptideY (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP(24±3%, 22±3%), SP(22±2%; 38±8%), polipeptide intestinale vasoattivo (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS(15±2%; 33±8%), trasportatore vescicolare dell'acetilcolina (VAChT)(15±2%; 35±5%), leu-encefalina (LENK)(14±7%; 26±9%), e somatostatina (SOM)(12±3%;32±7%).Il numero medio di neuroni FB+ (1845,1±259,3) era nella STG in L1-S3, con i pirenofori più piccoli (465,6±82.7μm2). Un gran numero (4287,5±1450,6) di neuroni FB+ di piccole dimensioni (476,1±103,9μm2) sono stati localizzati lungo il margine dei CMG. Il maggior numero (4793,3±1990,8) di neuroni FB + è stato osservato nel plesso pelvico, dove i neuroni marcati erano raggruppati in micro-gangli e con pirenoforo ancora più piccolo (374,9±85,4 μm2).
The urinary bladder trigone (UBT) is a limited area through which the majority of vessels and nerve fibers penetrate into the urinary bladder and where nerve fibers and intramural neurons are more concentrated. The phenotype and soma cross-sectional area of dorsal root ganglion (DRG) neurons, the extramural post-ganglionic autonomic neurons, the phenotype of sympathetic trunk ganglia (STG) neurons and caudal mesenteric ganglia (CMG) neurons innervating the porcine UBT were evaluated by coupling retrograde tracer technique and immunohistochemistry. -Porcine lumbosacral DRG neurons were characterized neurochemically: calcitonin gene-related peptide (CGRP)(30±3%; 29±3%, respectively), substance P (SP)(26±8%; 27±12%), neuronal nitric oxide synthase (nNOS)(21±4% and; 26±7%), neurofilament200kDa (NF200)(75±14%; 81±7%), and transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%; 43±6%), and labeled for isolectin-B4 (IB4)(56±6%; 43±10%). UBT sensory neurons, which were distributed from L2 to Ca1 DRG, had a segmental localization, showing their highest density in L4–L5 and S2–S4 DRG. The lumbar UBT sensory neurons were significantly larger than sacral ones (1,112±624µm2 vs. 716±421µm2). Taken together, these data indicate that the lumbar and sacral pathways probably play different roles in sensory transmission from the UBT. -STG and CMG FB+ neurons were IR for tyrosine hydroxylase (TH)(66±10.1%; 52.7±8.2%, respectively), dopamine beta-hydroxylase (DβH)(62±6.2%; 52±6.2%), neuropeptide Y (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP (24±3%; 22±3%), SP (22±2%; 38±8%), vasoactive intestinal polypeptide (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS (15±2%; 33±8%), vesicular acetylcholine transporter (VAChT)(15±2%; 35±5%), leuenkephalin (LENK)(14±7%; 26±9%), and somatostatin (SOM)(12±3%; 32±7%). A mean number of 1845.1±259.3 FB+ neurons were localized in the L1-S3 STG, which appeared as small pericarya (465.6±82.7µm2). A large number (4287.5±1450.6) of small (476.1±103.9µm2) FB+ neurons were localized mainly along a border of both CMG. The largest number (4793.3±1990.8) of FB+ neurons was observed in the pelvic plexus (PP), where labeled neurons were often clustered within different microganglia and had smaller soma cross-sectional area (374.9±85.4 µm2).

Il trigono della vescica urinaria (UBT) è un'area limitata attraverso la quale penetrano nella vescica la maggior parte dei vasi e fibre e in cui le fibre nervose e neuroni intramurali sono più concentrati. Mediante l’utilizzo combinato di un tracciante retrogrado(FB) e dell’immunoistochimica sono stati valutati il fenotipo e l’area del soma dei neuroni dei gangli spinali (DRG), dei neuroni post-gangliari, il fenotipo dei gangli della catena simpatica (STG) e i gangli mesenterici caudali (CMG) innervanti l’UBT. - Caratterizzazione dei neuroni dei DRG con: peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP)(30±3%, 29±3%, rispettivamente), sostanza P(SP)(26±8%, 27±12%), ossido nitrico sintasi neuronale (nNOS)(21±4%; 26±7%), neurofilamento 200kDa (NF200)(75±14%, 81±7% ) , transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%, 43±6%) e isolectina-B4-positivi (IB4) (56±6%;43±10%). I neuroni sensoriali, distribuiti da L2 a Ca1 (DRG), hanno presentato una localizzazione segmentale, mostrando maggior densità nei DRG L4-L5 e S2-S4. I neuroni sensoriali lombari sono risultati significativamente più grandi di quelle sacrali (1.112±624μm2 vs716±421μm2). Complessivamente, questi dati indicano che le vie lombari e sacrali probabilmente svolgono ruoli diversi nella trasmissione sensitiva del trigono della vescica urinaria. -I neuroni FB+ della STG e dei CMG sono risultati immunoreattivi per la tirosina idrossilasi (TH)(66±10,1%, 53±8,2%, rispettivamente), la dopamina beta-idrossilasi (DβH)(62±6,2%, 52±6,2%), neuropeptideY (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP(24±3%, 22±3%), SP(22±2%; 38±8%), polipeptide intestinale vasoattivo (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS(15±2%; 33±8%), trasportatore vescicolare dell'acetilcolina (VAChT)(15±2%; 35±5%), leu-encefalina (LENK)(14±7%; 26±9%), e somatostatina (SOM)(12±3%;32±7%).Il numero medio di neuroni FB+ (1845,1±259,3) era nella STG in L1-S3, con i pirenofori più piccoli (465,6±82.7μm2). Un gran numero (4287,5±1450,6) di neuroni FB+ di piccole dimensioni (476,1±103,9μm2) sono stati localizzati lungo il margine dei CMG. Il maggior numero (4793,3±1990,8) di neuroni FB + è stato osservato nel plesso pelvico, dove i neuroni marcati erano raggruppati in micro-gangli e con pirenoforo ancora più piccolo (374,9±85,4 μm2).
The urinary bladder trigone (UBT) is a limited area through which the majority of vessels and nerve fibers penetrate into the urinary bladder and where nerve fibers and intramural neurons are more concentrated. The phenotype and soma cross-sectional area of dorsal root ganglion (DRG) neurons, the extramural post-ganglionic autonomic neurons, the phenotype of sympathetic trunk ganglia (STG) neurons and caudal mesenteric ganglia (CMG) neurons innervating the porcine UBT were evaluated by coupling retrograde tracer technique and immunohistochemistry. -Porcine lumbosacral DRG neurons were characterized neurochemically: calcitonin gene-related peptide (CGRP)(30±3%; 29±3%, respectively), substance P (SP)(26±8%; 27±12%), neuronal nitric oxide synthase (nNOS)(21±4% and; 26±7%), neurofilament200kDa (NF200)(75±14%; 81±7%), and transient receptor potential vanilloid1 (TRPV1)(48±13%; 43±6%), and labeled for isolectin-B4 (IB4)(56±6%; 43±10%). UBT sensory neurons, which were distributed from L2 to Ca1 DRG, had a segmental localization, showing their highest density in L4–L5 and S2–S4 DRG. The lumbar UBT sensory neurons were significantly larger than sacral ones (1,112±624µm2 vs. 716±421µm2). Taken together, these data indicate that the lumbar and sacral pathways probably play different roles in sensory transmission from the UBT. -STG and CMG FB+ neurons were IR for tyrosine hydroxylase (TH)(66±10.1%; 52.7±8.2%, respectively), dopamine beta-hydroxylase (DβH)(62±6.2%; 52±6.2%), neuropeptide Y (NPY)(59±8%; 66±7%), CGRP (24±3%; 22±3%), SP (22±2%; 38±8%), vasoactive intestinal polypeptide (VIP)(19±2%; 35±4%), nNOS (15±2%; 33±8%), vesicular acetylcholine transporter (VAChT)(15±2%; 35±5%), leuenkephalin (LENK)(14±7%; 26±9%), and somatostatin (SOM)(12±3%; 32±7%). A mean number of 1845.1±259.3 FB+ neurons were localized in the L1-S3 STG, which appeared as small pericarya (465.6±82.7µm2). A large number (4287.5±1450.6) of small (476.1±103.9µm2) FB+ neurons were localized mainly along a border of both CMG. The largest number (4793.3±1990.8) of FB+ neurons was observed in the pelvic plexus (PP), where labeled neurons were often clustered within different microganglia and had smaller soma cross-sectional area (374.9±85.4 µm2).

Nel modello sperimentale di malattia di Parkinson con 6-hydroxidopamine (6-OHDA) assistiamo ad un incremento della Fosfodiesterasi 1B ( PDE1B) mRNA associato ad un aumento della proteina PDE1B nello striato ratto. L’obbiettivo della ricerca era capire l’espressione funzionale della PDE1B nei diversi sottotipi di neuroni striatali: neuroni medi di proiezione ed interneuroni. Abbiamo indagato, tramite la doppia marcatura con anticorpi, la localizzazione della PDE1B con Calbindina (CALB) per i neuroni di proiezione e con la Cholina Acetyltrasferasi (ChAT), Parvalbumina ( PV) e Ossido nitrico sintetasi (NOS) per gli interneuroni. Lo studio si avvaleva di tecniche di microscopia confocale (CLSM) e della comparazione tra lo striato del lato di controllo e lo striato del lato leso con 6- OHDA. L’immunoreattivita della PDE1B aumentava nel lato leso ma dalla colocalizzazione con la CALB emergeva una diminuizione di cellule CALB+ (58,7% del lato sano contro 37% lato leso) come conseguenza della lesione. La colocalizzazione con gli interneuroni ChAT, PV, NOS risultava invariata nei due lati. Questi risultati lasciano pensare ad una impatto particolare che la deafferentazione dopaminergica ha sui neuroni striatali di proiezione che aumentano il loro contenuto in PDE1B. L’aumento della PDE1B puo’ spiegare alcuni nuovi aspetti della patogenesi di malattie neurodegenerative dei gangli della base.
In the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model of Parkinsonism, up-regulation of phosphodiesterase (PDE) 1B mRNA occurs in striatal neurons, associated with increased expression of PDE1B immunoreactivity. Our aim was to assess the functional expression of PDE1B in different subtypes of striatal neurons. We have investigated the co-localization of PDE1B in calbindin-positive projection neurons or CHAT-, PV-, and NOS-positive interneurons. Standard confocal microscopy techniques were performed, comparing lesioned vs. unlesioned striatum. PDE1B immunoreactivity increased in a sub-population of unidentified striatal neurons, but a significant decrease of PDE1B-positive calbindin co-localizing neurons emerged (from 63 to 37%) as a consequence of 6-OHDA lesion. At odds with this data, PDE1B co-localization resulted unchanged in CHAT-, PV- and NOS-positive interneurons. These preliminary results confirm that dopamine deprivation has a peculiar impact on the expression of PDE1B in different striatal cell types. Further analysis of double label immunofluorescence is in course to identify the sub-population of striatal neurons carrying on the increased expression of PDE1B in dopamine denervated striatal neurons. Increased of PDE1B may explain some new aspects of pathogenesis of degenerative basal ganglia disease.

La Cardiomiopatia Aritmogena (CA) è un malattia genetica cardiaca, causata principalmente da mutazioni nei geni che codificano le proteine desmosomiali e rappresenta una delle principali cause di morte improvvisa cardiaca (SCD) nei giovani e negli atleti. La CA è caratterizzata da una sostituzione fibro-adiposa del miocardio, che genera un substrato pro-aritmogeno e porta nel tempo ad insufficienza cardiaca. Al momento, la CA è ancora una malattia incurabile, dato che diversi aspetti della sua patogenesi rimangono ignoti. La ricerca condotta fin ad oggi si è sempre concentrata sui cardiomiociti (CM), perché aventi i desmosomi, ma le proteine desmosomiali sono espresse ubiquitariamente. Qui, testeremo l'ipotesi che "la CA è una malattia del network cellulare cardiaco", che è coordinato dai neuroni simpatici cardiaci (cSN), attraverso la noradrenalina (NA) e il poco studiato Neuropeptide-Y (NPY). Inoltre, pensiamo che bloccando selettivamente i recettori dei neurotrasmettitori simpatici, attraverso il repurposing dei farmaci, si possa prevenire la patologia. Per testare le nostre ipotesi, useremo: due modelli murini knock-in che portano mutazioni nelle proteine desmosomiali, biopsie cardiache umane e campioni di sangue. Il Capitolo 1 dei risultati presenterà i dati che dimostrano come NPY inneschi l'adipogenesi nelle cellule mesenchimali stromali MSC cardiache isolate da pazienti affetti da CA, che sono la fonte adipogenica nel miocardio di CA umano. Inoltre, qui dimostriamo che le mutazioni associate a CA influenzano direttamente la biologia delle MSC cardiache ed extra-cardiache (comprese quelle del midollo osseo), proponendo il nuovo concetto di ‘CA come una malattia che, pur manifestandosi con un cortocircuito cardiaco improvviso, si sviluppa con il contributo di più tipi di cellule e organi’ (Capitolo 2). In linea con un ruolo chiave dei SN nella patogenesi della malattia, lo stress psicosociale accelera la progressione della malattia (Capitolo 3), le mutazioni associate a CA hanno un ruolo diretto sulla biologia dei SN e sull'innervazione cardiaca (Capitolo 4) e l'ablazione dei SN cardiaci, e l'antagonismo di NPY, impedisce l’insorgenza di aritmie, il rimodellamento e la disfunzione cardiaca nei topi affetti da CA (Capitolo 5). I risultati presentati in questa tesi possono aumentare le conoscenze sull'identità di questo killer, e contribuire all'identificazione di una nuova terapia in grado di contrastare la CA e ridurre l'incidenza di morte improvvisa cardiaca nella popolazione giovane.
Arrhythmogenic Cardiomyopathy (AC) is a genetic cardiac disorder, mainly caused by mutations in genes encoding desmosomal proteins, which represents one of the main causes of arrhythmic sudden death (SCD) in the young and athletes. AC is hallmarked by fibro-fatty myocardial replacement, generating an arrhythmogenic substrate, and leading in time to heart failure. At the time being, AC is still an incurable disease, as several aspects of its pathogenesis remain obscure. Current AC research focused on desmosome-carrying cardiomyocytes (CM), but desmosomal proteins are ubiquitously expressed. Here, we will test the hypothesis that “AC is a disease of the myocardial cellular network”, which is coordinated by cardiac sympathetic neurons (cSNs), through noradrenaline (NA) and the poorly studied Neuropeptide-Y (NPY). Thus, specific interference with SN neurotransmitters, through drug repurposing, may prevent the multi-cellular pathology in AC. To test our hypothesis, we will use two knock-in mouse models, expressing AC-mutant desmosomal proteins, human heart biopsies and blood samples. In strong support of our tenet, Chapter 1 of the result section will present data showing that NPY triggers adipogenesis in AC cardiac Mesenchymal Stromal Cells (c-MSCs), which are the adipogenic source in human AC myocardium. Furthermore, we here show that AC mutations directly affect the biology of cardiac and extra-cardiac MSCs (including those of the bone marrow), offering the novel concept of ‘AC as a disease which, although manifesting with the sudden heart short-circuit, develops with the contribution of multiple cell types and systems’ (Chapter 2). In line with a key role of SNs in disease pathogenesis, we present results demonstrating that i) psychosocial stress which accelerates disease progression (Chapter 3), ii) AC mutations directly impact on SN biology and cardiac innervation (Chapter 4) and iii) cSN ablation, and NPY antagonism, prevent heart structural and functional remodeling, in AC mice (Chapter 5). Our results may increase the knowledge on the identity of this killer, and contribute to the identification of a novel unifying therapy able to counteract AC and reduce the incidence of SCD in the young population.

Recenti studi epidemiologici hanno accertato che, rispetto all’intera popolazione italiana, la categoria dei calciatori presenta una maggiore incidenza di casi di Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA). Una delle principali ipotesi relativa a questo dato è l’eccessivo utilizzo di integratori dietetici e farmaci che servono ad aumentare la performance sportiva ed a diminuire la sensazione di fatica. In particolare, è stato riscontrato che Valina, Leucina e Isoleucina (Branched Chain AminoAcids: BCAA) sono tra i supplementi maggiormente utilizzati tra gli atleti. Per studiare i possibili effetti dei BCAA sulle proprietà elettriche neuronali sono stati effettuati esperimenti elettrofisiologici sui neuroni corticali primari provenienti da topi di controllo trattati con 200 µM di BCAA, ed i risultati ottenuti sono stati confrontati con quanto osservato nei neuroni di controllo non trattati. Questi esperimenti hanno dimostrato che il trattamento induce un significativo aumento nell’eccitabilità neuronale in maniera dose e tempo–dipendente, rispetto ai neuroni di controllo non trattati. Inoltre, altri amminoacidi dotati di una catena laterale non ramificata, come per esempio l’Alanina e la Fenilalanina, non causano alcuna alterazione come quella riscontrata in seguito all’esposizione ai BCAA. Studi condotti in modalità voltage-clamp hanno inoltre dimostrato che i neuroni trattati con i BCAA possiedono correnti voltaggio-dipendenti del Sodio persistente e del Calcio maggiori di quelle dei neuroni di controllo. Ciò indica che le modifiche delle proprietà biofisiche dei potenziali d’azione sono probabilmente dovute all’aumento nella densità in membrana dei canali specifici per queste specie ioniche. La riscontrata ipereccitabilità e le alterazioni di funzionalità dei canali ionici di Sodio persistente e di Calcio indotte dai BCAA in cellule di controllo sono paragonabili a quelle riscontrate nei neuroni ottenuti da un modello murino di SLA, il topo G93A, evidenziando un’importante correlazione tra le due condizioni sperimentali. Inoltre, è stato dimostrato che la Rapamicina, farmaco in grado di bloccare il complesso mTOR, favorisce il ripristino di una frequenza di scarica confrontabile con i valori di controllo, sia in cellule trattate con i BCAA che in neuroni G93A. Ciò potrebbe indicare che il complesso mTOR è coinvolto nelle alterazioni indotte dai BCAA e nella patogenesi della SLA. La comprensione di come i BCAA influiscano sulle proprietà fisiologiche e funzionali dei neuroni corticali può permettere di stabilire un loro possibile coinvolgimento nell’eziopatogenesi della SLA contribuendo alla comprensione del probabile meccanismo d’azione interessato, al fine di individuare nuovi trattamenti terapeutici.
Some epidemiological studies have recently ascertained that, Italian soccer players present a higher risk factor for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), compared to general population. One of the main hypotheses is related to the abuse of dietary supplements and drugs to enhance sporting performance and to reduce the feeling of fatigue. In particular, it has been reported that Valine, Leucine and Isoleucine (Branched-chain Amino Acids: BCAAs) are widely used among athletes. To study the possible effect of BCAAs on neuronal electrical properties, electrophysiological experiments have been performed on primary cortical neurons treated with 200 µM of BCAA and cultured from control embryos. All data have been compared to control values. The experiments have demonstrated that the treatment induces a significant increase of neuronal excitability dose- and time-dependent respect to control. Moreover, the treatment with other aminoacids, such as Alanine and Phenilalanine, doesn’t cause any alteration. Voltage clamp experiments show that, after a long exposition to BCAA, neurons present an increase of the Sodium and Calcium voltage-dependent channel densities. So, those biophysical changes could explain the increase of action potential frequencies observed after BCAA exposure. Both hyperexcitability and the higher Sodium and Calcium densities, induced by BCAA in control cells, were comparable to those obtained in the G93A neurons underlining an important correlation between two experimental conditions. Moreover, a treatment with Rapamycin, an inhibitor of the complex mTOR, was able to revert both the BCAA-induced and the G93A hyperexcitability to control values. These findings strongly indicates that in both cases, the mTOR signalling could be activated. In this way, the understanding of the effect mediated by BCAA on the functionality of primary cortical neurons and the mechanism of action will allow us to learn better the ethiopathogenesis of ALS, thus opening up new strategies for the treatment of this pathology.

Oxytocin, the neurohypophyseal hormone well-known for its hormonal role in lactation and parturition, also exerts a wide range of effects acting in the Central Nervous System as a neuromodulator or neurotransmitter. An increasing number of experimental studies have suggested that, in rodents, central oxytocin exerts also a modulatory role on locomotor activity, but little is known about the cerebral areas in which oxytocin might act to produce this effect. The substantia nigra, a mesencephalic structure which is part of the basal ganglia, a group of interconnected nuclei involved in motor and non-motor functions, receives oxytocinergic projections from the parvocellular compartment of the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Moreover, oxytocinergic receptors and oxytocin receptor messenger RNA have been shown to be present in human and rat substantia nigra, respectively. Furthermore, it has been demonstrated that a significant decrease in the number of oxytocin-immunoreactive neurons occurs in the paraventricular nucleus of patients suffering from Parkinson’s Disease, a progressive neurodegenerative movement disorder characterised by the degeneration of the cell bodies of nigrostriatal dopaminergic neurons projecting to the dorsal striatum. In order to investigate the role of nigral oxytocin in locomotor activity, a combined approach comprehensive of immunohistochemical, behavioural and lesion studies, has been used in male rats. First, the effect on locomotor activity of low and high doses of oxytocin, given intraperitoneally or into the substantia nigra, and of d(CH2)5Tyr(Me)2-Orn8-vasotocin, a selective oxytocin receptor antagonist, given into the lateral ventricles or into the substantia nigra, were studied in male rats habituated to the experimental conditions in order to avoid novelty-induced behavioural effects. Second, the presence of nigral oxytocinergic fibres and their localization with respect to nigral neurons immunoreactive for tyrosine hydroxylase (TH) (a marker of dopaminergic neurons) was investigated by immunohistochemistry. Finally, the effect on spontaneous locomotor activity of the bilateral injection into the substantia nigra of oxytocin-saporin (OXY-SAP), a recently discovered neurotoxin that specifically destroys neurons presenting oxytocinergic receptors on their surface, was studied in relation to the modifications induced in the dopaminergic, glutamatergic and GABAergic systems, assessed by immunohistochemistry using antibodies against TH, vesicular glutamate transporters (VGluT1, VGluT2 and VGluT3) and glutamate decarboxylase (GAD). Together, the results of the above experiments with oxytocin and d(CH2)5Tyr(Me)2-Orn8-vasotocin and those with OXY-SAP, which revealed the existence of a correlation between the changes in locomotor activity found in OXY-SAP-treated rats and the extent of the changes in nigral TH, VGluT1, VGluT2 and VGluT3 immunoreactivities measured at 28 days after OXY-SAP injection, provide support for a modulatory role of oxytocin on locomotor activity at the level of the substantia nigra.

Generating neural stem cells and neurons from reprogrammed human astrocytes is a potential strategy for repair in neurological diseases. It has been recently showed that astrocytes from murine cerebral cortex can be differentiated into neurons by the forced expression of a single transcription factor (Heinrich et al., 2010). While these studies have evaluated astrocyte conversion in the murine context, a similar possibility has yet to be demonstrated in human cells. An essential element for developing such applications with therapeutic value is a thorough comprehension of the mechanisms that regulate reprogramming of adult cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) (Hanna et al., 2010) or directly into another committed lineage, such as fibroblasts converted into neurons and also specific neuronal subpopulations like dopaminergic neurons (Pang et al., 2011, Caiazzo et al., 2011). Here we demonstrate the possibility to obtain progenitors and mature cells of the neural fate directly from human cortical astrocytes with a dedifferentiation into neural stem/progenitor phenotype. Even if for the purpose of autologous cell transplantation in neurological disorders, fibroblasts from patients resemble a much more suitable source of neurons than astrocytes from patients, nevertheless, shading light in the mechanisms that make possible to reprogram astrocytes into NSCs is useful for the final goal of using these cells as endogenous cell source for in situ neural repair in the CNS without any invasive cell graft. Human astrocytes can be reprogrammed into iPSCs, with similar efficiencies to other cells, using the viral expression of four reprogramming factors (Oct4, Sox2, Klf4, and cMyc) (Riuz et al., 2008). Remarkably, overexpression of a single factor like OCT4 in adult cells can induce full reprogramming, as when it is expressed in NSCs (human and mouse) (Kim et al., 2009 a, b) or promote the formation of another phenotype, such as the generation of blood cells with its expression in human fibroblasts (Szabo et al., 2010). These data suggest that the effect of these stem reprogramming factors changes in relationship to the lineage and the differentiation stage of the cells expressing them. In the current work, using the individual expression of OCT4, SOX2, or NANOG, we demonstrated and characterized the direct neural fate conversion of human astrocytes into multipotent neural progenitors, in vitro and in vivo. These cells were generated in a manner that is independent of iPSC production. Individual ectopic expression of the reprogramming factors OCT4 or SOX2 or NANOG into astrocytes, together with specific cytokine/culture conditions, activated the neural stem gene program and induced the generation of cells expressing neural stem/precursors markers. This change of lineage commitment was obtained also in pure CD44+ mature astrocytes and did not require passing through a pluripotent state. These unique astrocytes-derived neural stem cells gave rise to neurons, astrocytes and oligodendrocytes, and showed in vivo engraftment properties. ASCL1 expression further promotes the acquisition of a neuronal phenotype in vitro and in vivo. ASCL1 expression further promotes the acquisition of a neuronal phenotype in vitro and in vivo (Kim et al., 2009). To develop a broader understanding of astrocytes reprogramming we performed a methylation analysis demonstrating that epigenetic modifications underlie this process. These observations indicated that the sites of epigenetic and gene expression changes during reprogramming of astrocytes to NSCs are tightly linked to genes that are functionally important for pluripotency. These data demonstrate restoration of multipotency from human astrocytes, and point out a possible application of cellular reprogramming to endogenous CNS cells for repair of neurological disorders.

Scopo di questa tesi è argomentare l’utilità dello shadowing nella formazione degli interpreti, basandosi sulla Teoria motoria della percezione del linguaggio di Alvin Liberman e muovendosi all’interno del quadro teorico della più ampia embodied cognition, che include teorie sullo sviluppo del linguaggio e sull’acquisizione di seconde lingue. Nella formazione degli interpreti, lo shadowing è un esercizio che consiste nell’immediata ripetizione di quanto udito in cuffia, parola per parola e nella medesima lingua del testo di partenza ed è generalmente utilizzato come esercizio propedeutico alla simultanea, in quanto permette sia di “imparare” ad ascoltare e a parlare contemporaneamente, sia di migliorare la pronuncia e la fluidità in lingua straniera. Tuttavia, all’interno degli Interpreting Studies, ci sono studiosi che lo ritengono un esercizio inutile e, per certi versi, pericoloso poiché porrebbe l’accento su un processo eccessivamente “meccanico” dell’interpretazione. Per argomentare la sua utilità nella didattica dell’interpretazione, in questa tesi, dopo aver presentato le principali teorie sullo sviluppo del linguaggio e sull’acquisizione di seconde lingue, si passeranno in rassegna i risultati di ricerche condotte non solo all’interno degli Interpreting Studies, ma anche nella più ampia prospettiva della didattica delle lingue straniere/seconde, e soprattutto in neurolinguistica e psicologia cognitiva, dove lo shadowing è utilizzato per analizzare i processi cognitivi che sono alla base della ricezione e produzione del linguaggio (articolazione motoria, memoria di lavoro, attenzione selettiva, ecc.). L’ultimo capitolo di questo lavoro sarà dedicato alla descrizione di un approccio estremamente recente sulla percezione e sulla produzione del linguaggio, che coniuga la Teoria motoria della percezione del linguaggio di Liberman (1967) con la recente scoperta dei neuroni specchio, e che getta una luce nuova sull’utilità dello shadowing nella formazione degli interpreti.

Il fattore di trascrizione Sox2 è espresso nel sistema nervoso dall’inizio del suo sviluppo dove è richiesto per il mantenimento delle cellule staminali. Nell'uomo, le mutazioni eterozigoti di Sox2 sono collegate a vari difetti del sistema nervoso centrale, inclusi i difetti visivi. Il sistema visivo è composto dall'occhio, dal nucleo talamico genicolato dorsolaterale (dLGN) e dalla corteccia visiva, che sono altamente interconnessi. L'occhio, infatti, invia le afferenze retiniche ad uno specifico nucleo talamico dorsale, il dLGN, i cui neuroni a loro volta proiettano verso l'area corticale visiva. La corteccia visiva elabora input visivi e proietta al dLGN in un circuito complesso. Numerosi geni sono importanti per il corretto sviluppo del sistema visivo e Sox2 è uno di questi. Sox2 è espresso in tutti e tre i componenti del sistema visivo nel topo; mentre il suo ruolo nello sviluppo della retina è ben descritto si sa poco riguardo al suo ruolo nel talamo. Per studiare l’importanza di Sox2 nel talamo per il corretto sviluppo dell'asse visivo, abbiamo generato un knockout condizionale talamico di Sox2 nei neuroni post-mitotici. Abbiamo osservato che la perdita di Sox2 nel dLGN porta a una forte riduzione delle dimensioni del dLGN, all’alterazione delle proiezioni neuronali retino-talamiche, talamo-corticali e cortico-talamiche e, di conseguenza, a una difettiva definizione dell'area visiva corticale. Abbiamo scoperto che nei mutanti talamici di Sox2 il gene Efna5, importante nel guidare gli assoni retinici verso il dLGN, e i geni SERT e vMAT2 che codificano per trasportatori di serotonina, importanti per la corretta formazione di proiezioni talamo-corticali, sono fortemente sottoregolati nel dLGN mutante. Per identificare tutti i potenziali geni che potrebbero mediare la funzione di Sox2 nel talamo, abbiamo eseguito il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) su dLGN di controlli e mutanti di Sox2. Abbiamo scoperto che i geni deregolati sono arricchiti in geni che codificano per molecole importanti per la guida degli assoni e per molecole coinvolte nella neurotrasmissione e nelle sinapsi. È interessante notare che l'ablazione talamica di un altro fattore di trascrizione, COUP-TF1, porta a difetti del sistema visivo simili a quelli descritti per Sox2. Inoltre, le mutazioni eterozigoti nel gene COUP-TF1 nell'uomo portano all'atrofia ottica e a disabilità intellettive. Abbiamo scoperto che Sox2 e COUP-TF1 sono co-espressi negli stessi neuroni post-mitotici del dLGN. Sorprendentemente, l'espressione di COUP-TF1 non varia nei mutanti talamici di Sox2, facendo nascere la possibilità che Sox2 e COUP-TF abbiano target comuni nel talamo. Pertanto, abbiamo esaminato l'espressione, nei mutanti COUP-TF1, di geni sottoregolati nei mutanti talamici di Sox2 e sorprendentemente abbiamo scoperto che sembrano sovraregolati, suggerendo che i due fattori di trascrizione potrebbero agire sugli stessi geni ma in modo opposto. Per capire meglio se i due fattori di trascrizione regolano geni comuni, stiamo eseguendo l'analisi dell'espressione genica mediante RNA-seq anche sui mutanti talamici COUP-TF1. Inoltre, stiamo generando topi doppi mutanti per Sox2 e COUP-TF1 per scoprire come questi geni regolano espressione genica; è plausibile che regolino geni comuni per bilanciare la loro espressione nei neuroni talamici.
The transcription factor Sox2 is expressed in the nervous system from the beginning of its development where it is required for stem cells maintenance. In humans, Sox2 heterozygous mutations are linked to various central nervous system defects, including visual defects. The visual system is composed of the eye, the dorsolateral geniculate thalamic nucleus (dLGN) and the visual cortex, which are highly interconnected. The eye, in fact, sends retinal afferent to a specific dorsal thalamic nucleus, the dLGN, whose neurons in turn project to the visual cortical area. The visual cortex elaborates visual inputs and projects back to the dLGN in a complex circuit. Several genes are important for the correct development of the visual system and Sox2 is one of them. Sox2 is expressed in all the three components of the visual system in mouse; while its role in the development of the retina is well characterized little is known about its role in the thalamus. To investigate Sox2 requirement in the thalamus for the correct establishment of the visual axis, we generated a thalamic Sox2 conditional knock-out in post-mitotic neurons. We observed that Sox2 loss in the dLGN leads to a strong reduction in size of the dLGN, aberrant retino-geniculate, thalamo-cortical and cortico-thalamic neural projections and, consequently, to a defective patterning of the cortical visual area. We found that in Sox2 thalamic mutants the Efna5 gene, important in guiding retinal axons towards the dLGN, and the serotonin transporters encoding genes SERT and vMAT2, involved in the establishment of thalamo-cortical projections, are strongly downregulated in the mutant dLGN. To identify all the potential genes that could mediate Sox2 function in the thalamus, we performed RNA sequencing (RNA-seq) on control and Sox2 mutant dLGNs. We noticed that misregulated genes are enriched in genes encoding axon guidance molecules and molecules involved in neurotransmission and synapses. Interestingly, thalamic ablation of another transcription factor, COUP-TF1, leads to defects of the visual system similar to the ones described for Sox2. In addition, heterozygous mutations in the COUP-TF1 gene in human lead to optic atrophy and intellectual disabilities. Interestingly, we found that Sox2 and COUP-TF1 are co-expressed in the same post-mitotic neurons of the dLGN. Surprisingly, COUP-TF1 expression does not vary in Sox2 thalamic mutants, arising the possibility that Sox2 and COUP-TF have common target in the thalamus. Therefore, we looked at the expression, in COUP-TF1 mutants, of genes downregulated in Sox2 thalamic mutants and we surprisingly found that they appear upregulated, suggesting that the two transcription factors could act on the same genes but in an opposite way. To better understand if the two transcription factors regulate common genes, we are performing gene expression analyses by RNA-seq also on COUP-TF1 thalamic mutants, with the aim to identify an overlap with Sox2 regulated genes. Moreover, we are generating Sox2 and COUP-TF1 double mutant mice to unveil how these genes regulate gene expression; it is plausible that they regulate common genes to balance their expression in thalamic neurons.

Nel sistema nervoso centrale, gli endocannabinoidi sono rappresentati principalmente da due lipidi: l’anandamide, l’etanolamide dell’acido arachidonico, e il 2-arachidonilglicerolo (2-AG). E’ accertato che gli endocannabinoidi inibiscono in modo retrogrado il rilascio presinaptico di trasmettitori; è peraltro dimostrato il loro coinvolgimento nel fenomeno inibitorio detto slow self-inhibition (SSI) in interneuroni low-threshold spiking (LTS) della corteccia somatosensoriale. L’SSI è indotta in seguito a treni di potenziali d’azione ripetuti in cellule LTS, che esprimono colecistochinina o somatostatina. La SSI è generata dall’attivazione prolungata di un canale K+ ed è associata ad iperpolarizzazione nella stessa cellula. La sintesi di entrambi i cannabinoidi è dipendente dall’aumento della [Ca2+]i come accade durante una elevata attività neuronale. Per verificare se il 2-AG media la SSI in modo autocrino in cellule LTS, abbiamo bloccato la sua biosintesi a partire dalla fosfolipasi C (PLC) e da diacil-glicerolo lipasi (DAGLs). Queste manipolazioni hanno impedito l’insorgenza della SSI. Inoltre, l’attivazione di PLC mediata da recettori metabotropici del glutammato ha prodotto una prolungata iperpolarizzazione, la quale è stata inibita dall’antagonista del recettore cannabinoide di tipo 1 (CB1R) AM-251, e dagli inibitori di PLC e DAGL. La scomparsa della SSI in presenza di bloccanti intracellulari della DAGL conferma che la produzione di endocannabinoidi avviene nello stesso interneurone che va incontro a persistente iperpolarizzazione. Poiché le DAGLs non producono cannabinoidi se non 2-AG, questi risultati identificano tale composto come il mediatore autocrino responsabile della slow self-inhibition postsinaptica in interneuroni corticali LTS. Abbiamo inoltre dimostrato che la SSI è espressa anche da una significativa percentuale (~30%) di neuroni piramidali glutamatergici dello strato II/III della neocorteccia. La SSI è asssente in presenza di AM-251 e in topi CB-/-. Allo stesso modo, la somministrazione esogena di cannabinoidi mima la SSI in una percentuale equivalente di neuroni piramidali, provando un’espressione funzionale somatodendritica di CB1R in cellule glutammatergiche. Questa modulazione autoindotta dell’eccitabilità di neuroni piramidali è generata da un’azione autocrina di endocannabinoidi, poiché la SSI è inibita dal blocco intracellulare della loro sintesi. E’ interessante osservare che i neuroni piramidali che esprimono SSI mostrano un dendrite apicale più lungo e meno ramificato, suggerendo che la SSI può identificare un sottogruppo anatomicamente distinto di neuroni piramidali neocorticali. Risultati preliminari indicano l’esistenza della SSI anche in una frazione di neuroni piramidali dello strato V, e suggeriscono una bidirezionale plasticità a lungo termine della trasmissione sinpatica GABAergica perisomatica in neuroni piramidali corticali dello strato II/III in confronto a quelli dello strato V. In conclusione, i nostri risultati suggeriscono un’autoregolazione omeostatica di una rete di neuroni glutammatergici all’interno dei circuiti corticali, con possibili implicazioni che sono rilevanti per l’attività della neocorteccia sia in condizioni normali che patologiche.
In the central nervous system (CNS), endocannabinoids are identified mainly as two endogenous lipids: anandamide, the ethanolamide of arachidonic acid, and 2-arachidonoylglycerol (2-AG). Endocannabinoids are known to retrogradely inhibit presynaptic transmitter release; however it is demonstrated that they are also involved in slow self-inhibition (SSI) of layer V low-threshold spiking (LTS) interneurons in somatosensory cortex. SSI is induced by repetitive firing in LTS cells, which can express either cholecystokinin or somatostatin. SSI is triggered by an endocannabinoid-dependent activation of a prolonged somatodendritic K+ conductance and associated hyperpolarization in the same cell. The synthesis of both endocannabinoids is dependent on elevated [Ca2+]i such as occurs during sustained neuronal activity. To establish whether 2-AG mediates autocrine LTS-SSI, we blocked its biosynthesis from phospholipase C (PLC) and diacylglycerol lipases (DAGLs), preventing the SSI. Moreover, metabotropic glutamate receptor-dependent activation of PLC produced a long-lasting hyperpolarization which was prevented by the cannabinoid receptor type 1 (CB1R) antagonist AM-251, as well as byPLC and DAGL inhibitors. The loss of SSI in the presence of intracellular DAGL blockers confirms that endocannabinoid production occurs in the same interneuron undergoing the persistent hyperpolarization. Since DAGLs produce no endocannabinoid other than 2-AG, these results identify this compound as the autocrine mediator responsible for the postsynaptic slow self-inhibition of neocortical LTS interneurons. Moreover, here we show that SSI also occurs in a significant percentage (~30%) of neocortical layer II/III glutamatergic pyramidal neurons. SSI was prevented by AM-251 and in CB1-/- mice. Similarly, exogenously application of cannabinoids mimicked SSI in a corresponding percentage of pyramidal neurons, proving functional somatodendritic CB1R expression in glutamatergic cells. This self-induced endocannabinoid modulation of pyramidal neuron excitability resulted from an autocrine action of endocannabinoids, as SSI was prevented by intracellular blockade of endocannabinoid synthesis. Interestingly, pyramidal neurons exhibiting SSI showed a significant less branched and longer apical dendrite than SSI-negative neurons, suggesting that endocannabinoid-mediated SSI can identify an anatomical subtype of pyramidal neocortical neurons. Preliminary results indicate the existence of SSI also in a fraction of neocortical layer V pyramidal neurons, and suggest a bidirectional long-term plasticity of GABAergic perisomatic inhibition in neocortical layer II/III vs layer V pyramidal neurons. In conclusion, our results suggest a homeostatic self-regulation of a glutamatergic network within cortical circuits, with important possible implications for normal and pathological operations of the neocortex.

This literature review explores human mirror neurons from several angles. First it retells mirror neuron history, from the initial discovery in the macaque monkey research through to the experiments determining if there is a human brain homologue. Then the merits of two opposing evolutionary views – mirror neurons as an adaptation or an association, here referring to an adaptation’s byproduct – are discussed. Lastly the autistic mirror neuron dysfunction hypothesis – stating that a faulty mirror neuron system is at the basis of autistic behavioral patterns – is examined for its validity but ultimately found lacking and in need of further development.

Il peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) è una molecola presente nei neuroni del midollo spinale di diverse specie di Mammiferi, inclusi topi, ratti, conigli, cani, gatti, pecore, scimmie e uomo. Nonostante la distribuzione dei neuroni contenenti questo neuropeptide sia stata studiata in maniera dettagliata nel midollo spinale delle suddette specie, non sono disponibili, in letteratura, informazioni relative alla presenza di queste cellule nel midollo spinale dei Cetacei. Di conseguenza, è stata condotta la presente ricerca che ha avuto lo scopo di determinare, mediante metodiche di immunoistochimica, la distribuzione e la morfologia dei neuroni esprimenti il CGRP nel midollo spinale di tursiope (Tursiops truncatus). In questa specie, la distribuzione laminare (secondo Rexed) dei neuroni CGRP-immunoreattivi è assai simile a quella che si osserva nei Roditori, nei Carnivori e nei Primati; infatti, i corpi cellulari immunopositivi sono localizzati soprattutto in corrispondenza dell’apice del corno dorsale (lamine I e II) e nel corno ventrale (lamine VIII e IX). La distribuzione e la morfologia dei neuroni esprimenti CGRP nel midollo spinale di tursiope suggeriscono come tale neuropeptide possa essere coinvolto nella trasmissione delle informazioni sia sensitive (somatiche e viscerali) che motorie. I neuroni CGRP-immunoreattivi localizzati nelle lamine I e II del midollo spinale di tursiope, come dimostrato in altre specie, potrebbero agire da interneuroni modulando le informazioni nocicettive che dai gangli spinali vengono trasmesse al midollo spinale. Nelle lamine I e II sono presenti anche numerosi processi immunopositivi che, oltre ad appartenere a neuroni locali, derivano, molto probabilmente, dai ai neuroni pseudounipolari dei gangli spinali. In accordo con quanto appena affermato, è opportuno sottolineare come le fibre afferenti primarie provenienti dai gangli spinali utilizzino il CGRP per la trasmissione delle informazioni dolorifiche. La presenza di CGRP nei neuroni della lamina VIII, invece, indica come questo neuropeptide possa essere implicato nella trasmissione di segnali di natura motoria, utilizzando meccanismi presinaptici. Infine, la presenza di numerosi motoneuroni immunoreattivi per il CGRP nella lamina IX indicherebbe un’azione diretta svolta da questo neuropeptide nell’interazione tra motoneurone inferiore e muscolo scheletrico.

The cellular prion protein, PrPC, is a membrane-bound glycoprotein abundantly expressed in neurons, and highly conserved among mammals. Its bad reputation originates from the discovery that, following a misfolding process, PrPC is converted into the pathogenic PrPSc isoform. PrPSc has novel physico-chemical and biologic properties, and is the main component of prions, the etiological agents of transmissible spongiform encephalopathies (TSE), which are fatal to both men and animals. Although much is known about the involvement of PrPSc in the onset of TSE, the mechanisms of PrPSc-mediated neurodegeneration and the physiologic function of PrPC are still obscure. Several lines of evidence have attributed to PrPC a plethora of different biologic potentials, possibly by taking part in the activation of signalling pathways. The most reasonable hypothesis for this multi-faceted behaviour is that its function includes an additional multi-potent factor capable of controlling several cell events. Our working hypothesis is that this factor is Ca2+, the pleiotropic carrier of signals that controls the balance between the life and death of the cell. In this work, we have probed the hypothesis by comparing, in primary cultures of cerebellar granule cells derived from wild-type and PrP-knockout mice, local Ca2+ movements, and the expression of major Ca2+-transporting systems. Measurements of Ca2+ fluxes have been accomplished by using recombinant aequorin, a Ca2+-sensitive photo-protein, genetically targeted to different cellular domains, i.e., the plasma membrane, the lumen of the endoplasmic reticulum and the matrix of mitochondria. We found that, with respect to the presence of the protein, the absence of PrPC causes alterations of local Ca2+ movements, and of the expression of channels and pumps selective for the ion. These results may thus allow to conclude that, given the clear intervention of PrPC in Ca2+ homeostasis, PrPC may be part of the cellular system(s) deputed to avoid the toxic accumulation of Ca2+ in the cell.
La proteina prionica cellulare, PrPC, è una glicoproteina di membrana conservata nei mammiferi ed espressa abbondantemente nei neuroni. A seguito di un processo di cambiamento conformazionale, la proteina si converte nell’isoforma patologica PrPSc che, caratterizzata da proprietà chimico-fisiche diverse da quelle della PrPC, costituisce il prione, l’agente eziologico delle encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) fatali sia per l’uomo che per gli altri animali. Sebbene sia ormai accertato il coinvolgimento della PrPSc nelle EST, il meccanismo attraverso cui la PrPSc causa neurodegenerazione e la funzione fisiologica di PrPC sono rimaste ignote. Riguardo alla biologia della PrPC, numerose evidenze sperimentali le hanno attribuito un numero elevato di ruoli, la maggior parte dei quali si esplicherebbe attraverso il coinvolgimento della proteina in multiple vie di segnalazione. Un’ipotesi che più si adatta a tale comportamento multi-sfaccettato, è che la funzione della PrPC si esplichi agendo su un fattore a sua volta multi-potente - in grado quindi di controllare numerosi eventi cellulari – qual’è, ad esempio, lo ione Ca2+. Il Ca2+ è infatti un trasportatore pleiotropico di segnali nella cellula, in grado di controllare eventi che vanno dalla sopravvivenza alla morte della cellula. In questo lavoro di tesi, abbiamo cercato di validare quest’ipotesi comparando, in colture primarie di neuroni granulari di cervelletto ottenuti da topi wild-type o privi di PrPC, sia i movimenti locali di Ca2+ sia l’espressione dei sistemi più importanti deputati all’omeostasi dello ione. Per misurare i flussi di Ca2+, abbiamo utilizzato la foto-proteina, Ca2+-sensibile, equorina, indirizzata a specifici comparti cellulari: la membrana plasmatica, il lume del reticolo endoplasmico e la matrice mitocondriale. Dai risultati ottenuti è emerso che, rispetto a quando è presente, l’assenza della PrPC è causa di alterazioni dei movimenti dello ione in questi domini, ma anche della diversa espressione di canali, o di pompe, per il Ca2+. Ciò permette di concludere che, a fronte del chiaro intervento sull’omeostasi del Ca2+, la PrPC sia un componente del sistema cellulare atto ad evitare l’accumulo tossico dello ione nella cellula.

In particolare in questo lavoro cercherò di analizzare l’utilizzo di reti neurali in ambito economico-finanziario in quanto alcuni dei temi che si riscontrano in economia ben si prestano ad un’analisi attraverso le reti neurali. In particolare nel primo capitolo di questo elaborato descriverò le origini delle reti neurali e alcuni criteri attraverso i quali oggi si classificano le reti stesse. Nel secondo capitolo mi occuperò invece di approfondire quali sono i passaggi da seguire al fine di costruire una rete neurale concentrandomi sulla risoluzione di problemi legati all’ambito economico-finanziario. Infine, nell’ultimo capitolo, mi dedicherò all’analisi di due articoli nei quali vengono confrontati i risultati ottenuti tramite l’utilizzo di diversi tipi di reti neurali accennando anche ad approcci diversi attraverso algoritmi di machine learning.

Questo elaborato concerne la revisione della letteratura scientifica relativa alla teorizzazione e realizzazione tecnologica del memristor, un nuovo componente elettronico teorizzato nel 1971 e realizzato solo nel 2008 nei laboratori della HP (Hewlett Packard, Palo Alto, California). Dopo una descrizione in termini matematici della teoria fisica alla base del dispositivo e del suo funzionamento, viene descritta la sua realizzazione tecnologica e il corrispettivo modello teorico. Succesivamente il lavoro discute la possibile analogia tra il funzionamento del memristor ed il funzionamento di neuroni e sinapsi biologiche all'interno del Sistema Nervoso Centrale. Infine, vengono descritte le architetture recentemente proposte per l'implementazione di reti neurali artificiali fondate su un sistema computazionale parallelo e realizzate mediante sistemi ibridi transistors/memristors.

L’activité électrique des neurones est déterminée par des interactions complexes entre leurs propriétés morphologiques et biophysiques. Les neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire compacte (SNc) présentent une caractéristique morphologique peu commune parmi les neurones de mammifères: leur axone émerge fréquemment d’une dendrite à une distance très variable du soma. Malgré cette importante variabilité dans la localisation de l’axone, peu d’articles ont étudié un lien potentiel entre morphologie neuronale et activité électrique dans ces cellules. Dans un premier article, nous avons exploré l’importante variabilité observée dans les neurones DA en caractérisant de nombreux paramètres morphologiques et biophysiques. Nos résultats suggèrent que la géométrie de l’AIS n’affecte pas significativement la forme du potentiel d’action ni l’activité pacemaker. En revanche, l’activité électrique est influencée par la morphologie et les conductances somatodendritiques. Dans une seconde étude, nous avons caractérisé le développement morphologique des neurones DA au cours des trois premières semaines post-natales. Nous avons observé une croissance asymétrique de l’arbre dendritique: la dendrite portant l’axone semble se complexifier plus que les autres dendrites. Cette asymétrie est associée à une contribution différente de la dendrite portant l’axone et des dendrites ne portant pas l’axone à la forme du potentiel d’action. Ces résultats suggèrent que les neurones DA de la SNc sont robustes aux variations morphologiques de l’axone et que les particularités morphologiques et biophysiques de leur arbre dendritique minimisent l’influence de l’AIS sur leur activité électrique
Neuronal output is defined by the complex interplay between the biophysical and morphological properties of neurons. Dopaminergic (DA) neurons of the substantia nigra pars compacta (SNc) are spontaneously active and generate a regular pacemaking activity. While most mammalian neurons have an axon emerging from the soma, the axon of DA neurons often arises from a dendrite at highly variable distances from the soma. Despite this large cell-to-cell variation in axon location, few studies have tried to unravel the potential link between neuronal morphology and electrical behaviour in this cell type. In a first article, we explored the high degree of cell-to-cell variability found in DA neurons by characterising several morphological and biophysical parameters. While AIS geometry did not seem to significantly affect action potential shape or pacemaking activity, we found that the electrical behaviour of DA neurons was particularly sensitive to somatodendritic morphology and conductances. In a second study, we characterised the morphological development of DA neurons during the first three post-natal weeks. We observed an asymmetric development of the dendritic tree, favouring the elongation and complexity of the axon-bearing dendrite. This asymmetry is associated with different contributions of the axon-bearing and non-axon bearing dendrites to action potential shape. Overall, the two studies suggest that DA neurons of the SNc are highly robust to cell-to-cell variations in axonal morphology. The peculiar morphological and biophysical profile of the dendritic arborization attenuates the role of the AIS in shaping electrical behaviour in this neuronal type

Le cerveau de drosophile est constitué entre autres des mushroom body, siège de la mémoire et de l’apprentissage. Cette structure est composée de différents types de neurones, parmi lesquels les neurones /. Ces neurones se présentent sous une forme orthogonale, avec l’axone qui se divise en une branche dorsale : la branche et une branche médiale : la branche . Le but de cette étude est de comprendre les mécanismes et voies de signalisation mis en jeu lors du développement de ces neurones.Chez la drosophile, la protéine APPL (Amyloïd Precursor Protein-Like) est l’homologue de la protéine APP humaine, connue pour son implication dans la maladie d’Alzheimer chez l’homme. Cette pathologie est caractérisée par une dégénérescence neuronale entraînant des défauts cognitifs et mnésiques. Malgré les nombreuses études focalisées sur la fonction pathologique d’APP durant les dernières décennies, peu de choses sont actuellement connues sur les fonctions physiologiques de cette protéine et notamment pendant le développement. C’est dans cette optique que nous avons étudié la fonction d’APPL et son interaction avec différentes protéines lors du développement des mushroom body. La protéine APPL a été identifiée comme étant un co-récepteur de la voie PCP (Planar Cell Polarity), permettant la régulation de la croissance axonale. Lors du développement, APPL permet le recrutement et l’activation de la protéine ABL (Abelson Tyrosine Kinase), qui phosphoryle DSH (dishevelled) et ainsi active la voie de signalisation permettant la croissance axonale.Le premier volet de cette thèse porte sur la régulation de l’activité ABL lors du développement des neurones /. S’il est établi qu’APPL permet une régulation positive de l’activité kinase d’ABL, je montre ici que la protéine HTT (huntingtine) permet de réguler négativement cette activité. Cette protéine HTT est impliquée dans la maladie de Huntington chez l’homme, une autre pathologie neurodégénérative. Ces travaux démontrent qu’HTT régule le niveau de phosphorylation d’ABL et par conséquent son activité. Le deuxième volet de cette thèse porte sur l’interaction d’APPL avec la protéine ARM (armadillo), homologue de la -caténine, lors du développement des neurones /. Je démontre que cette interaction est indépendante du rôle d’APPL dans la voie PCP. Je démontre aussi que cette interaction entre APPL et ARM est dépendante uniquement de la fonction d’ARM dans la dynamique du cytosquelette d’actine.Enfin le troisième volet de cette thèse porte sur la création de nouveaux allèles mutants pour Appl grâce à la technique du CRISPR-CAS9. La production de ces allèles permet d’avancer d’une part un possible rôle du gène voisin vnd (ventral nervous system defective) dans le développement des mushroom body, et d’autre part une interaction génétique entre Appl et vnd
In the drosophila brain, mushroom bodies are involved in olfactory memory and learning. This structure is composed of different types of / neurons. These neurons form an orthogonal structure, with the branch projecting dorsally and the branch projecting medially. The aim of this study is to understand mechanisms and pathways involved during the development of these neurons.The drosophila APPL protein (Amyloïd Precursor Protein-Like) is the homologue of the human APP, known to be involved in Alzheimer’s disease. This pathology is characterized by neuronal degeneration inducing cognitive and memory defects. In spite of the numerous studies focused on the pathological function of APP during the last decades, few things are known on the physiological functions of this protein and more particularly during the development. This is from this perspective that we studied the APPL function and its interaction with proteins during the mushroom bodies development.The APPL protein was identified as a co-receptor of the PCP pathway (Planar Cell Polarity), involved in the axonal growth regulation. During the development, APPL allows the recruitment and the activation of the ABL protein (Abelson Tyrosine Kinase), which phosphorylates DSH (dishevelled) and so activates the axonal growth pathway.The first part investigates the regulation of ABL activity during the / neuron development. If it’s already established that APPL regulates positively the kinase activity of ABL, I show here that the HTT protein (Huntingtin) allows a negative regulation of ABL activity. In human, HTT is involved in the Huntington’s disease, another neurodegenerative disorder. This thesis work shows that HTT regulates the phosphorylation level of ABL, and therefore its activity.The second part investigates the interaction between APPL and ARM (armadillo), the homologue of the human -catenin, during the development of the / neurons. I show that this interaction is independent of the APPL function in the PCP pathway. Moreover, this interaction between APPL and ARM involves the actin cytoskeleton dynamic function of ARM, and not its Wnt pathway function.The third and last part presents new mutant alleles of APPL obtained with the CRISPR-CAS9 technique. The creation and analysis of these new alleles lead us to propose that vnd (ventral nervous system defective), neighbor gene of Appl, is also involved in / neurons development, and can interact genetically with Appl