Dissertations / Theses on the topic 'NMD'

Environ un tiers des maladies humaines, héréditaires ou acquises, sont dues à la génération d’un codon stop prématuré (PTC). Le système de contrôle appelé dégradation des ARNm non-sens (NMD) permet de détecter puis de dégrader des ARNm contenant un PTC. Les facteurs principaux de la NMD : UPF1, UPF2 et UPF3 reconnaissent les PTCs en interagissant avec le complexe de terminaison de traduction contenant les ribosomes, les facteurs de terminaison eRF1, eRF3 et la protéine poly(A) binding (Pab1p en levure). Nous avons pu résoudre la structure d'un tel complexe en levure comprenant un ribosome en cours de traduction en présence d’un ARNt dans le site P et de facteurs de terminaisons dans le site A. Aucune densité n’a pu être observée pour Pab1p indiquant la flexibilité de l’interaction avec ce complexe. Nous avons aussi évalué l’impact des facteurs de la NMD sur la terminaison dans un système de traduction in vitro humain. UPF3B retarde la reconnaissance du codon stop et favorise la dissociation des sous-unités ribosomales. UPF2 abolit l’effet de UPF3B tandis que l’addition de UPF1 n’a pas d’influence dans la terminaison. Par in vivo et in vitro pulldowns, nous avons montré que UPF3B interagit avec eRF3a et UPF1 et pourrait constituer le lien manquant entre la terminaison et la NMD. Nos résultats illustrent la complexité des mécanismes de la terminaison et de la NMD
Premature termination codons (PTCs) account for approximately one third of inherited and acquired diseases. A surveillance pathway called nonsense-mediated mRNA decay (NMD) detects and degrades PTC-containing transcripts. NMD core factors UPF1, UPF2 and UPF3 mediate the recognition of PTCs by associating with the terminating translation machinery composed of the ribosome, the release factors eRF1 and eRF3 and the poly(A) binding protein (Pab1p in yeast). Using electron cryo-microscopy, we solved such a complex in yeast and observed the translating ribosome, containing a P-site tRNA and an A-site density for the release factors but not for Pab1p indicating that Pab1p is flexibly bound. We also probed the function of NMD factors in mammalian termination using a reconstituted human in vitro translation system. Surprisingly, we found that UPF3B delayed stop codon recognition and promoted ribosomal dissociation. The addition of UPF2 could abolish UPF3B’s effect on translation termination. UPF1 had no influence in the termination process alone or in combination with UPF2. Using in vitro and in vivo pulldowns we found that UPF3B interacts with eRF3a and UPF1, indicating that UPF3B could be the missing link between termination and NMD. Our results point to a complex interplay between the NMD factors and the termination apparatus

Issus de la transcription pervasive des génomes eucaryotes, les longs ARN non codants (nc) sont aujourd’hui reconnus comme des acteurs clés dans divers processus cellulaires. Ils présentent une expression spécifique du tissu ou type cellulaire, et répondent à divers stimuli, suggèrant que leur expression est contrôlée. Leur dérégulation est associée à des maladies humaines, dont le cancer.Parmi les différents longs ARNnc, les ARN antisens (as) sont synthétisés à partir du brin opposé aux gènes codant des protéines. Malgré leur potentiel régulateur, les ARNas restent peu étudiés, à cause de leur faible abondance cellulaire. En fait, chez la levure, ils sont largement dégradés par l'exosome nucléaire et l'exoribonucléase cytoplasmique Xrn1.Des travaux récents menés chez Saccharomyces cerevisiae ont révélé que les ARNas sont ciblés vers Xrn1 par la voie du Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) qui dépend de la traduction. Cette sensibilité au NMD suggère que les ARNas sont traduits, soulevant la question de leur potentiel codant. D'autre part, les ARNas peuvent former des structures ARN double brin avec les ARNm ‘sens’, les protégeant du NMD. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le ciblage des ARNas vers la traduction/dégradation ou l’appariement/stabilisation restent inconnus.Pour mieux comprendre cette problématique, ma thèse visait à étudier la conservation des mécanismes de dégradation dans le contrôle de ARNas, le rôle de la traduction dans ce processus, ainsi que l'hétérogénéité de l’appariement sens/antisens chez la levure.Tout d'abord, nous avons étudié la dégradation des ARNas chez Naumovozyma castellii, qui contrairement à S. cerevisiae contient le système d’interférence par ARN (ARNi), en examinant l'interaction entre l'exosome nucléaire, Xrn1 et la RNase III Dicer. Nos données ont montré que la dégradation des ARNas dans cette espèce dépend de l'exosome nucléaire et de Xrn1, sans effet majeur de Dicer (Szachnowski*, Andjus* et al., 2019). Elles suggèrent également que la présence de la machinerie d'ARNi cytoplasmique chez N. castellii a renforcé le rôle de l’exosome nucléaire pour restreindre l'expression des ARNas.Chez S. cerevisiae, nous avons montré que les ARNas s'accumulent dans des conditions d'inhibition de l’élongation de la traduction, renforçant l'idée que la traduction détermine leur dégradation. Des analyses Ribo-Seq (en collaboration avec le laboratoire du Dr. Namy à l'I2BC, Gif sur Yvette) ont permis de montrer que les ARNas cytoplasmiques sont activement traduits. De plus, nous avons identifié les bases moléculaires qui ciblent les ARNas vers le NMD. Enfin, nous avons montré qu’un peptide est produit à partir d’un ARNas rapporteur sensible au NMD, et est détecté dans des cellules sauvages, alors que ce transcrit est ciblé vers la dégradation via le NMD. Ces résultats sont décrits dans un preprint déposé sur bioRxiv (Andjus et al., 2022), tandis que l'importance évolutive du NMD dans la modulation des ARNnc a fait l'objet de la revue publiée dans Noncoding RNA (Andjus et al., 2021).Enfin, nous avons pu démontrer la large hétérogénéité de la co-expression des ARNm sens/ARNas à l'échelle du génome, en utilisant les données RNA-Seq de cellules uniques (en collaboration avec le laboratoire du Dr. Posas à l'IRB, Barcelone). De plus, nous avons observé une corrélation entre l'augmentation du niveau des ARNas et le nombre de cellules contenant à la fois l’ARNm sens et et son as, soulevant la question de l'impact de la formation de duplex sur le destin des ARN impliqués.En conclusion, mon projet contribue à reconsidérer l'idée que les ARNas sont dépourvus de potentiel codant, mettant en évidence le rôle de la traduction dans leur dégradation via le NMD. Ce travail chez la levure ouvre des perspectives quant à la régulation des ARNas chez les Eucaryotes supérieurs (les facteurs NMD qui les ciblent étant conservés), et quant au rôle régulateur potentiel des peptides dérivés des ARNas
Initially thought to be by-products of the pervasive transcription of eukaryotic genomes, long non-coding (lncRNAs) progressively emerged as key players in multiple cellular processes. LncRNAs show tissue-specific expression and respond to diverse stimuli, suggesting that their expression is precisely controlled. Their dysregulated expression has been associated to human diseases, including cancer. Several classes of lncRNAs exist, including antisense (as)lncRNAs that are synthesized from the strand opposite to sense protein-coding genes. Despite their regulatory importance, aslncRNAs have been poorly explored due to their low cellular abundance. In fact, in yeast they are extensively targeted by RNA decay machineries – nuclear exosome and cytoplasmic Xrn1 exoribonuclease.Recent works in Saccharomyces cerevisiae revealed that aslncRNAs are mainly targeted to Xrn1 through translation-dependent Nonsense-Mediated Decay (NMD) pathway. The NMD-sensitivity of aslncRNAs suggests that they are translated, raising the question of their coding potential. On the other hand, aslncRNAs can also form double-stranded RNA with their paired-sense mRNAs, at least in some cells, protecting them from NMD. However, the extent and the regulatory mechanisms governing the fate of the aslncRNA either subjected to translation/decay or pairing/stabilization are unknown.In this context, to enlighten the metabolism of aslncRNA, the objective of my thesis was to decipher the evolutionary role of decay machineries in controlling aslncRNAs expression, the role of translation in the degradation of aslncRNAs, and the heterogeneity of sense mRNA and aslncRNAs in yeast.First, we studied aslncRNAs degradation in Naumovozyma castellii, a budding yeast endowed with RNAi, unlike S. cerevisiae, which lost it during evolution, by examining the interplay between the nuclear exosome, Xrn1 and the RNase III Dicer. Our data showed that aslncRNAs decay in this species depends on the nuclear exosome and Xrn1 (with no major effect of Dicer) (Szachnowski*, Andjus* et al., 2019). They also suggest that the presence of cytoplasmic RNAi machinery in N. castellii reinforced nuclear RNA surveillance machinery to temper aslncRNAs expression.In S. cerevisiae, we showed that aslncRNAs accumulate upon translation elongation inhibition, reinforcing the idea that translation controls their decay. Using Ribo-Seq (in collaboration with Dr. Namy’s lab at I2BC, Gif sur Yvette) we defined actively translated aslncRNAs. We demonstrated the molecular bases subjecting aslncRNAs to NMD. Finally, we showed that a peptide is produced from an NMD-sensitive aslncRNA reporter, and is detected in wild-type cells, while the transcript is targeted for degradation via NMD. These results are described in a preprint deposited on bioRxiv (Andjus et al., 2022), while the evolutionary importance of NMD in ncRNA modulation was the subject of the review published in Noncoding RNA (Andjus et al., 2021).Lastly, using single-cell RNA-Seq data (in collaboration with Dr. Posas’s lab at IBR, Barcelona), we observed a large heterogeneity of co-expression of sense mRNA/aslncRNAs at the single cell level genome wide, critical for the metabolism of aslncRNAs. Moreover, we showed a direct correlation between aslncRNAs levels and the number of cells containing both sense and as RNA pairs, raising an intriguing hypothesis on the mechanistic impact of duplex formation on the fate of the involving pair.In conclusion, my project contributed to reconsider that aslncRNAs are devoid of coding potential, highlighting the role of translation in determining their degradation via the NMD. As the NMD factors targeting them are conserved, this work in yeast helps comprehend the aslncRNAs metabolism in higher Eukaryotes. Our work also opens perspectives regarding the possible regulatory roles of the aslncRNA-derived peptides

Le système de contrôle appelé dégradation des ARNm non-sens (NMD) permet de détecter puis de dégrader des ARNm contenant un codon de terminaison prématuré (PTC). Les facteurs principaux de la NMD : UPF1, UPF2 et UPF3 reconnaissent les PTCs en interagissant avec les facteurs de terminaison eRF1, eRF3 et la protéine Poly(A) binding (PABP). La reconstitution d’un système de traduction in vitro a permis d’étudier la terminaison de la traduction en présence des facteurs PABP et UPF1, à l’aide de méthodes de biochimie et de cryo-microscopie électronique. L’étude du rôle du facteur de NMD UPF3B dans la terminaison de la traduction a mis en évidence une double action de cette protéine ; tout d’abord, un retardement de la reconnaissance du codon stop et également la promotion de la dissociation du ribosome. Ce travail a également permis de mettre en évidence une nouvelle interaction entre UPF3B et la kinase SMG1-8-9 et de montrer comment cette interaction affecte l’état de phosphorylation de UPF1. Les résultats de cette étude montrent une interaction complexe entre les différents facteurs de NMD et la kinase SMG1
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is an important eukaryotic quality control mechanism that recognizes and degrades mRNA containing a premature termination codon (PTC). Up-frameshift proteins constitute the conserved core NMD factors (UPF1, UPF2 and UPF3). They mediate the recognition of a NMD substrate, i.e. a ribosome stalled at a PTC. UPF proteins were shown to associate with eukaryotic release factors (eRF1 and eRF3) and were suggested to impede translation termination. We showed that, at a normal termination codon, Poly(A)-binding protein (PABP) stimulates translation termination by directly interacting with eRF3a. Using a reconstituted in vitro translation system, we studied translation termination in the presence of the factors PABP and UPF1 using biochemistry and single particle electron cryo-microscopy (Cryo-EM). Additionally, we analysed the role of the other NMD factors UPF2 and UPF3B in translation termination in vitro. We discovered a novel role for UPF3B in translation termination. Moreover, we observed a novel interaction between UPF3B and the SMG1-8-9 kinase complex. The presence of UPF3B affects the kinase activity of SMG1 and thus the phosphorylation state of UPF1. Our results highlight a much more complex interplay of the NMD factors with the translation termination machinery and SMG1 kinase than anticipated

Différentes observations montrent que la protéine INT6 humaine possède une activité suppresseur de tumeurs. Il a été démontré que chez l'homme le gène int6 était sous-exprimé dans environ 30% des cancers du poumon non à petits cellules et que cette sous-expression était un facteur de mauvais pronostic. Des expériences de criblage double hybride avec INT6 comme appât ont identifié une protéine nommée SLIP1 (SLBP Interacting Protein 1). Un effet de SLIP1 sur la traduction des ARN messager des histones a été montré. Les travaux que j'ai menés indiquent qu'INT6 en interagissant avec SLIP intervient dans le contrôle de la stabilité et de la traduction des ARNs codant pour les histones. Un knockdown d'INT6 provoque une baise des niveaux des histones endogènes sans avoir un effet au niveau d'ARN. Mes études, en révélant un nouveau mécanisme de dans lequel INT6 joue un rôle direct, permettent ainsi de faire le lien entre - d'une part - les fonctions connues de cette protéine dans la traduction et son contrôle et - d'autre part - les effets oncogéniques connus de son altération. Par ailleurs, l'étude de la fonction d'INT6 dans les cellules humaines réalisée par ARN interférence montre une inhibition de la dégradation des ARNm possédant un codon stop prématuré par la voie du Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD). Nous avons étudié son action par rapport aux ARNs HTLV-1. Nous avons observé une stabilisation significative des cibles de NMD. Ceci démontre que la protéine Tax interfère avec cette voie de dégradation des ARN d'une part en empêchant l'interaction entre UPF1 et INT6 et d'autre part en interagissant lui-même avec la protéine UPF1 phosphorylée. En agissant sur le NMD, Tax intervient à un niveau post transcriptionel qui pourrait avantager la réplication virale et aussi permettre la tolérance cellulaire aux mutations liées à l'effet mutagénique établi de Tax.

RNA degradation is ubiquitous and it is clear that it must be carefully controlled to accurately recognise and target appropriate transcripts. There are several pathways for mRNA degradation and decapping is one of the critical steps in determining transcript stability. The focus of this study was the identification and characterisation of factors involved in decapping and their involvement in nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in Aspergillus nidulans. Our studies have shown that disruption of two decapping factors, Dcp1 and the Nudix protein Dcp2, lead only to partial suppression of NMD. This distinguishes A. nidulans from Saccharomyces cerevisiae, where the two decapping factors are required for NMD. Deletion of lsm1, which encodes a component of a heptomeric complex, Lsm1-7, a known promoter of decapping, also partially supressed NMD. To our knowledge this is the first time that the role of Lsm’s in NMD has been described. A similar result was observed when another Nudix family protein, NdxD, was disrupted. We propose that NdxD is a second decapping factor in A. nidulans. Disruption of other factors known to promote decapping and subsequent RNA degradation, Pat1, Dhh1 and Xrn1, did not affect NMD, demonstrating these factors are not required for NMD in A. nidulans. In order to quantify decapping, we set out to establish a simple and reliable assay to quantify the decapped transcripts. The method utilised splinted-ligation through which an RNA adaptor is ligated specifically to the 5’ end of decapped transcripts with the help of splint primer. The primer has a complementary sequences to the RNA adaptor at its 3’ end and the eight random nucleotides at the 5’ end to facilitate hybridisation to any decapped transcript. qRT-PCR was utilised to amplify the ligation products for a specific transcript and used internal primers as a control to assess the relative level of decapped transcripts. This gave a good basis for quantifying the decapped transcripts, however further optimisation is required in order to develop a robust assay. Although it has been known that both Dcp1 and Dcp2 form a decapping complex in yeast, our studies showed that Dcp2 has a significant role in stabilising the uaZ+ transcript, while deletion of dcp1 did not. Fluorescence microscopy has shown that both of these proteins localise primarily to the expected P-body like structures, however, the major proportions of Dcp2 and Dcp1 did not co-localise and were therefore not interacting. These data suggest that the Dcp2 activity is not solely dependent on Dcp1, suggesting a divergence between A. nidulans and S. cerevisiae. Additionally, confocal microscopy was used to characterise the intracellular distribution of CutA and CutB, which are involved in 3’ pyrimidine-tagging of transcripts, promoting decapping and degradation of mRNA. Using GFP and RFP tagged proteins, we determined that CutA is primarily localised in the cytoplasm whereas CutB is primarily, but not exclusively, located in the nuclei. Interestingly deletion of cutB lead to increased levels of CutA in the nuclei suggesting an interplay between the two proteins. Deletion of dcp1 produces an aberrant polysome profile as determined by sucrose gradient centrifugation. The predominant peak correlated with the large (60S) subunit rather than the monosome (80S) peak observed for WT. The small (40S) subunit was also relatively high. These observations distinguished ∆dcp1 from WT and the phenotype of the ∆dcp2 strain was intermediate between the two. The accumulation of 60S peak in ∆dcp1 included a relatively high proportion of 28S rRNA derived fragments. Northern analysis of these putative 60S degradation products and sequencing of two specific fragments suggest that in the ∆dcp1 strain the ribosomes are being cleaved, possibly as part of an rRNA turnover mechanism. Although genetic analysis showed that both ∆dcp2 and a point mutation, dcp2 E148Q, which is likely to disrupt the nuclease activity, are both epistatic to dcp1 with respect to this phenotype. Northern analysis indicates that the degradation products observed in ∆dcp1, ∆dcp2 and WT strains appear very similar, even though the levels vary dramatically. This implies that Dcp2 is probably not directly responsible for these cleavage events or it is one of a number of activities cleaving the rRNA in what appears to be a similar way.

L’ARN hélicase UPF1 est un facteur clé du Nonsense-Mediated Decay (NMD), un mécanisme impliqué dans le contrôle de la qualité des ARNm et la régulation de l’expression des gènes. Malgré d’importantes fonctions chez les plantes, le NMD y est peu décrit. Cette thèse présente l’identification et l’étude des protéines interagissant avec UPF1 chez Arabidopsis. Nous avons identifié un nouveau réseau d’interaction protéine-protéine entre UPF1 et des répresseurs de traduction dans les P-bodies. Nous proposons un modèle dans lequel la répression traductionnelle exerce une action protectrice sur les cibles du NMD. Notre approche a également identifié de nouveaux composants des P-bodies, comme l’endonucléase UCN. Son étude détaillée a révélé un lien direct avec la machinerie de decapping ainsi que de possibles rôles dans la signalisation hormonale ou les mécanismes de défense, suggérant que la modulation de l’expression d’UCN pourrait influencer d’importantes caractéristiques agronomiques. Ce travail décrit des facteurs associés à UPF1 jusqu’alors inconnus, leur étude permettra de découvrir de nouveaux mécanismes impliqués dans l’équilibre entre la traduction, le stockage et la dégradation des ARNm chez les plantes
The RNA helicase UPF1 is a key factor of Nonsense-Mediated Decay (NMD), a paneukaryotic mechanism involved in mRNA quality control and fine-tuning of gene expression. Despite important biological functions in plants, NMD is poorly described compared to other eukaryotes. This thesis presents the identification and study of UPF1 interacting proteins in Arabidopsis. Using approaches based on immunoaffinity and mass spectrometry, we identified a novel protein-protein interaction network between UPF1 and translation repressors in P-bodies. We propose a model in which translation repression exerts a protective action on NMD targets in plants. Our approach also identified novel P-body components, including the UCN endonuclease. A detailed study revealed its direct link with the decapping machinery and possible roles in hormone signaling and defense mechanisms, suggesting that the modulation of UCN expression could influence important agronomical traits. This work describes hitherto unknown UPF1 associated factors, their study will provide novel insights into the mechanisms involved in the balance between mRNA translation, storage and decay in plants

L'instabilité microsatellitaire (MSI) résulte d'une déficience du système de réparation des mésappariements de l'ADN. Cette instabilité est observée dans 10-15% des tumeurs chez l'Homme, incluant les cancers colorectaux (CCR) et de l'estomac (CG). En 2011, notre laboratoire a rapporté la mutation de la chaperonne HSP110 dans les CCR MSI. Cette mutation affecte un microsatellite intronique de 17 thymidines (T17), localisé au niveau de l'intron 8. Les grandes délétions somatiques du T17 (? 5 paires de bases), représentant 25% des CCR MSI, conduisent à l'inactivation complète de la chaperonne HSP110 dans les CCR MSI. De manière remarquable, ces grandes délétions sont prédictives chez les patients d'une excellente réponse à la chimiothérapie adjuvante. Au cours de ma thèse, mes travaux ont visé à étudier l'impact de la mutation d'HSP110 dans les tumeurs gastro-intestinales MSI. Mes résultats démontrent que la mutation du microsatellite T17 d'HSP110 a pour conséquence une diminution de la prolifération cellulaire en partie lié à la diminution de la phosphorylation du facteur de transcription STAT3. En outre, mes résultats suggèrent que cette mutation serait un facteur prédictif de survie chez les patients atteint de CG, indiquant le potentiel théranostique d'HSP110. Enfin, je propose une approche thérapeutique innovante pour les patients atteints de CCR MSI, basée sur la potentialisation de l'expression de transcrits mutants, codant pour des protéines délétères pour la cellule tumorale, à l'instar du dominant négatif HSP110DE9 résultant de la mutation d'HSP110 dont l'ARN semble être régulé par le système NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay)
Microsatellite instability (MSI) results from impaired DNA mismatch repair, being observed in 10-15% of frequent tumors in human, e.g. Colorectal (CRC), Gastric Cancers (GC) and others. In 2011, frequent somatic mutations of the HSP110 chaperone have been reported in MSI CRC by my lab, affecting a T17 intronic DNA repeat located in intron 8. Large (≥ 5 base pairs) bi-allelic somatic deletions of this DNA repeat in tumor DNAs, as observed in about 25% of MSI CRC, lead to complete inactivation of HSP110 by exon 9 skipping and sensitization of tumor cells to chemotherapy. These large deletions are predictive of improved response to adjuvant chemotherapy in CRC patients. During my PhD thesis, I further investigated the role of HSP110 in MSI tumors. My results demonstrate that HSP110 mutation leads to cell proliferation decrease through the reduction of STAT3 transcription factor phosphorylation in CRC tumors (Berthenet*, Bokhari*, et al., Oncogene 2016). Furthermore, I showed that HSP110 mutation is also frequently observed in MSI gastric cancer, leading to very similar pathophysiological consequences during tumor progression and improved patient’s survival independently from tumor stage (Cervera*, Lagrange*, Bokhari* et al., submitted). Finally, I worked on an innovative therapeutic approach that consisted in inhibiting the NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay) system, an ubiquitous process recognizing and degrading mRNAs containing premature termination codons (PTC). The inhibition of NMD leads to the expression of deleterious MSI-driven mutant transcripts such as the HSP110DE9, coding for a dominant negative mutant, derived from HSP110 mutation in MSI cancer cells

Chez Saccharomyces cerevisiae, la voie de dégradation majoritaire des ARN messagers passe par le clivage de la liaison pyrophosphate entre l’ARNm et la structure de la coiffe à l’extrémité 5’. Cette étape, importante pour la dégradation de l’ensemble des ARNm, est particulièrement clé dans la dégradation d’une classe d’ARN instables, cibles de la voie de dégradation nommée nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Cette-dernière permet la dégradation de transcrits contenant un codon STOP prémature et donc dépend de la traduction. D’abord considérée comme une voie de dégradation présente à travers les eucaryotes à cause de la grande conservation de ses facteurs principaux – les protéines Upf -, la découverte des protéines Smg dans C. elegans (Page et al., 1999) et la description du mécanisme SURF/DECID dépendant de la phosphorylation d’Upf1 (Kashima et al., 2006) semblaient indiquer des différences majeures entre les organismes. Récemment, notre laboratoire a décrit l’architecture des complexes NMD chez la levure. Ces-derniers sont centrés autour d’Upf1 et ont été nommés Détecteur et Effecteur. Dans le second, nous avons pu identifier la protéine kinase Hrr25 comme un membre du complexe Upf1 avec les protéines du decapping, Dcp2, Dcp1 et Edc3 (Dehecq et al., 2018). Cette protéine conservée est l’analogue des caséines kinases 1 chez l’humain - CK1delta and CK1epsilon - et elle est impliquée dans de nombreux processus majeurs de la cellule, comme la modification des ARNt, la biogénèse des ribosomes, l’élongation de la transcription et la méiose (Abdel-Fattah et al., 2015 ; Ghalei et al., 2015 ; Ye et al., 2016 ; Nemec et al., 2019). J’ai montré que l’activité kinase de Hrr25 a un rôle dans le NMD qui est indépendant de ses fonctions dans la traduction de l’ARNm mais aussi dans la transcription de l’ADN. Nous avons aussi montré que l’association de Hrr25 avec Upf1 s’appuie sur l’activité kinase de Hrr25 et sur la présence de la protéine portant l’activité decapping, Dcp2. Nous avons pu identifier des résidus Sérine très conservées dans la région C-terminal d’Upf1 levure dont la phosphorylation dépend de Hrr25 et dont la régulation, à l’image de celle impliquée dans d’autres organismes, dépend de la présence d’autres facteurs NMD comme Upf2 et Ebs1 (l’équivalent de Smg5/7). Ces résultats indiquent que les protéines kinase peuvent moduler le NMD par des interactions directes avec les enzymes impliquées dans la dégradation des ARN. Ils suggèrent également que, contrairement à ce que l’on pouvait croire, des protéines kinase sont requises de manière universelle pour le NMD
In yeast, mRNA degradation is mainly initiated through the cleavage of the pyrophosphate bond between the mRNA and the cap structure at its 5’-end. While this step is important for the decay of most mRNAs, it is particularly critical to initiate the degradation of unstable RNA, targets of the NMD machinery. This pathway allows degradation of transcripts that contain a premature termination codon and thus is entirely dependent on translation. First considered as conserved throughout eucaryotes due to high sequence similarity of its core factors – the Upf proteins -, the discovery of the Smg proteins in C. elegans (Page et al., 1999) and the description of the SURF/DECID mechanism depending on phosphorylation of Upf1 (Kashima et al., 2006) indicated a divergence of NMD mechanisms between organisms. However, recently our laboratory described two NMD complexes revolving around Upf1 – named Detector and Effector - and identified the protein kinase Hrr25 as a member of a Upf1-decapping complex (Dehecq et al., 2018). The conserved protein kinase Hrr25 is the yeast equivalent of mammalian casein kinase 1 (CK1delta and CK1epsilon) and is involved in major cellular processes, including tRNA modification, ribosome biogenesis, transcription elongation and meiosis (Abdel-Fattah et al., 2015; Ghalei et al., 2015; Ye et al., 2016; Nemec et al., 2019). I demonstrated that the Hrr25 kinase activity has a role in NMD that is independent of its function in mRNA translation and DNA transcription. The association of Hrr25 to Upf1 was dependent on the kinase activity of the protein and on the presence of the decapping enzyme Dcp2. We identified conserved serine residues located in the C-terminal region of yeast Upf1 whose phosphorylation was dependent on Hrr25 and was modulated, like the phosphorylation of Upf1 in other organisms, by the presence of other NMD factors, such as Upf2 and Ebs1 (SMG5/7 equivalent). These results indicate that protein kinases can modulate NMD by direct interactions with the enzymes involved in RNA degradation and suggest that, contrary to previous beliefs, protein kinases are universally required for NMD

L'épissage des pré-ARNm, le processus nucléaire conduisant à l'assemblage des séquences "exons" de l'ARN messager par élimination des séquences intercalaires ou "introns", est une étape décisive de l'expression de la plupart des gènes chez les métazoaires. Au cours de ce processus, beaucoup d'erreurs peuvent survenir avec des conséquences plus ou moins graves pour le bon fonctionnement de la cellule. Afin de limiter les effets délétères de telles erreurs, différents mécanismes de contrôle de qualité des ARNm épissés ont été mis en place. Parmi eux, le Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) permet de dégrader les ARNm contenant des codons non-sens prématurés (PTC), évitant ainsi l'apparition de protéines tronquées. De par leur ampleur en tant que mécanismes centraux de l'expression génique chez l'homme, l'épissage et le NMD sont fréquemment impliqués dans des pathologies d'origine génétique. Dans certains cas comme l'ataxie télangiectasie ou la neurofibromatose de type I, 54% des mutations responsables de la maladie affectent l'épissage. Environ un tiers des maladies génétiques sont dues à l'apparition de PTC qui induisent le NMD. Dans certains cas, une protéine tronquée pourrait conserver les mêmes propriétés que la protéine sauvage mais le mécanisme de NMD empêche sa synthèse. Par conséquent, l'épissage et le NMD représentent des cibles tout à fait intéressantes qui permettraient, soit de restaurer un épissage correct, soit de permettre l'expression de protéines tronquées et fonctionnelles. Au cours de cette thèse nous avons recherché des inhibiteurs d'épissage et/ou de NMD parmi une collection de 6 000 composés chimiques. Nous avons ainsi pu identifier des composés capables de moduler l'épissage en affectant l'activité de facteurs clefs de la sélection des sites d'épissage, les protéines SR. Nous avons également mis en évidence le premier inhibiteur spécifique du NMD qui bloque spécifiquement la fonction du facteur hUpf1. Ces molécules nous ont permis de disséquer le fonctionnement de ces processus, de proposer un nouveau modèle décrivant le transit des mRNP soumises au NMD par les P-Bodies et ouvrent maintenant la voie à la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques utilisant ces composés
RNA splicing involves the processing of pre-messenger RNA molecules by the excision of introns and the precise joining of exons to form the mature messenger RNA that is exported from the nucleus for translation. Exon usage is often alternative, i. E. The cell decides whether to remove a part of the pre-mRNA as an intron or include this part in the mature mRNA as an alternative exon. Alternative splicing is therefore, a genetically economical process that enables a single gene to increase its coding capacity, allowing the synthesis of several structurally and functionally distinct protein isoforms. To avoid accumulation of aberrantly spliced mRNAs, several quality control processes determine the fate of mRNA in the cell. Among these processes, Nonsense-Mediated mRNA decay (NMD), is able to degrade mRNA containing premature termination codons (PTCs), preventing accumulation of truncated with deleterious effects for the cell. As central mechanisms controlling gene expression any disturbance of either splicing or NMD can lead to genetic diseases. Indeed, the numbers of diseases shown to be caused by a defect in pre-mRNA splicing or NMD is rapidly growing. For example, in ataxia telengectasia or type I neurofibromatosis, 54% of disease-inducing mutations affect mRNA splicing. Moreover, one third of acquired and inherited pathologies are due to nonsense creation that elicits NMD. Consequently, mRNA splicing and NMD represent a potential targets for new therapeutic strategies. During this thesis, we have screened a small chemical library to find splicing and NMD inhibitors. We have identified some molecules that modulate mRNA splicing efficiency by affecting SR proteins activity. We have also isolated the first specific inhibitor of NMD that blocks hUpf1 functions. These compounds allowed us to decipher splicing and NMD mechanisms and to propose a new model to describe the NMD-subjected mRNP transit trough the processing-Bodies. The next challenge will be to demonstrate the functional utility of these molecules in preclinical models of human disease

Approved for public release; distribution is unlimited
Pursuing a ship-based missile defense capability could thrust the naval service into one of the most heated controversies of the past three decades: the congressional debate over the desirability--or danger--of erecting widespread ballistic missile defenses. To better understand the influences on congressional attitudes, this study examines five divisive congressional debates over missile defense. In contrast to traditional explanations that focus on the causal factors underlying congressional voting behavior, this thesis emphasizes the political process of framing issues to create the political climates that shape congressional attitudes and link them to voting decisions. This thesis shows that major shifts in missile defense policy occur when key individuals successfully manipulate powerful images to legitimize and popularize arguments favoring their desired policy option. Understanding how elites use images to shape political attitudes provides a framework for charting and navigating the congressional storm that is likely to surround the deployment of future Navy missile defense systems.

Nonsense mediated mRNA decay (NMD) is a surveillance mechanism that targets transcripts containing premature stop codons (PTCs) for degradation, and that also regulates up to 10% of the whole transcriptome. During the course of my PhD I set out to identify novel NMD factors by performing a genome-wide RNA interference (RNAi) screen in a transgenic strain of Caenorhabditis elegans carrying an NMD reporter. I identified five novel proteins that are putative NMD factors in worms: NGP-1, NPP-20, AEX-6, PBS-2 and NOAH-2. Knock-down of these proteins led to severe developmental defects: worms were either arrested during various larval stages or died prematurely. The only exception was AEX-6, the knockdown of which led to a milder phenotype. Homology analysis of the novel C. elegans NMD factors showed that these proteins are conserved in human, with the exception of NOAH-2, which only has a homologue in Drosophila melanogaster, NOMPA. By performing an NMD assay in human cells, I demonstrated that GNL2 (NGP-1) and SEC13 (NPP-20) are functionally conserved NMD factors in human. Analysis of the consequences of depletion of GNL2, SEC13, UPF1 or UPF2 on the transcriptome of HeLa cells revealed that these four proteins co-regulate a subset of endogenous NMD targets, whilst also independently regulating the expression of other sets of transcripts. The findings presented in this thesis further our knowledge of the biology of NMD in both nematodes and humans. They demonstrate the existence of further regulators of this surveillance pathway, and add a layer of complexity to this fine-tuned biological process.

Deep sequencing of mRNAs (RNA-Seq) is now the preferred method for transcriptome-wide quantification of gene expression. Yet many mRNA isoforms, such as those eliminated by nonsense-mediated decay (NMD), are inherently unstable. Thus a significant drawback of steady-state RNA-Seq is that it provides marginal information on the flux through alternative splicing pathways. Measurement of such flux necessitates capture of newly made species prior to mRNA decay. One means to capture nascent mRNAs is affinity purifying either the exon junction complex (EJC) or activated spliceosomes. Late-stage spliceosomes deposit the EJC upstream of exon-exon junctions, where it remains associated until the first round of translation. As most mRNA decay pathways are translation-dependent, these EJC- or spliceosome-associated, pre-translational mRNAs should provide an accurate record of the initial population of alternate mRNA isoforms. Previous work has analyzed the protein composition and structure of pre- translational mRNPs in detail. While in the Moore lab, my project has focused on exploring the diversity of mRNA isoforms contained within these complexes. As expected, known NMD isoforms are more highly represented in pre-translational mRNPs than in RNA-Seq libraries. To investigate whether pre-translational mRNPs contain novel mRNA isoforms, we created a bioinformatics pipeline that identified thousands of previously unannotated splicing events. Though many can be attributed to “splicing noise”, others are evolutionarily-conserved events that produce new AS-NMD isoforms likely involved in maintenance of protein homeostasis. Several of these occur in genes whose overexpression has been linked to poor cancer prognosis.

La traduction est considérée comme une étape clé de l'expression des gènes permettant à la cellule de s'adapter aux variations de son environnement en réponse aux signaux internes ou externes. Des études bioinformatiques ont montrés que la moitié des ARN messagers chez l'homme portent, en amont de leur phase codante, des éléments régulateurs appelés uORF. Le laboratoire a montré qu'un défaut de terminaison de la traduction par déplétion du facteur de terminaison eRF3 modifie l'expression de gènes dont l'ARNm contient des uORF comme le gène ATF4. Cette modification se fait soit par un mécanisme de réinitiation après traduction de l'uORF soit par une augmentation de la stabilité de l'ARNm résultant d'un défaut de sa dégradation par la voie du "Nonsense-mediated mRNA Decay" (NMD). A travers leur association dans le même complexe et leur implication dans la terminaison de la traduction et la NMD, eRF3 et Upf1 contribuent à la régulation fine de l'expression des gènes. Cependant, on ne sait pas dans quelle mesure ces deux facteurs affectent la traduction et la stabilité des ARNm. Nous avons évalué la traduction par ribosome profiling et le taux de transcrits par RNA-seq dans les cellules humaines déplétées en eRF3 ou en Upf1. Ces analyses nous ont permis de dresser une carte des uORF traduites dans le transcriptome des cellules humaines HCT116. Nous avons également observé que peu de gènes cibles sont communs entre la déplétion en eRF3 ou en Upf1. Nos résultats appuient fortement l'hypothèse qu'il y a au moins deux classes de transcrits portant des uORF, l'une dont la régulation implique la terminaison de la traduction et l'autre dont la régulation implique la NMD
Regulation of gene expression at the translational level is increasingly being recognized as a key mechanism by which cells can rapidly change their gene expression pattern in response to internal or external stimuli. Bioinformatic studies revealed that half of human transcripts present at least one expression regulatory element uORF in the 5’ leader sequence preceding the main ORF. We have previously shown that translation termination disruption caused by eRF3a depletion induces upregulation of the transcriptional activator ATF4 and its targeted genes partly by a translational control at uORFs, and partly in relation to a defect in Nonsense-mediated mRNA Decay activation, increasing ATF4 mRNA stability. Through their physical association and their involvement in translation termination and NMD, eRF3 and Upf1 are regulating the protein and mRNA levels of a significant number of genes and thus contribute to the fine-tuning of their expression. It is not known yet, in what extent both of these factors affect translational control and what is the subset of genes that are regulated by these factors. In this study, we evaluated translation by ribosome profiling and mRNA level by RNA-seq in human cells subjected to either eRF3a or Upf1 depletion. These analyses allowed us to draw a transcriptome-wide map of uORFs and obtained a list of functional uORFs in our reference HCT116 transcriptome. We also observe that only a small fraction of these are common targets for both eRF3a and Upf1. Our results provide strong support for the notion that different classes of transcripts bearing uORFs are regulated either by translational processes involving translation termination or by NMD

Dans le but d'étudier les mécanismes de régulation de l'ontogénèse B , nous avons consacré cette thèse aux perturbations générées par l'insertion d'un marqueur de sélection au sein du locus des chaînes lourdes d'immunoglobulines (locus IgH). En effet, plusieurs travaux de recombinaison homologue au sein du locus IgH ont montré que les effets engendrés par l'insertion du gène de résistance à la néomycine (néo) pouvaient s'avérer plus dramatique que ceux liés à la délétion d'éléments régulateurs. Afin de poursuivre ces études, nous avons réalisé l'insertion d'une "cassette néo" dans des cellules ES de souris en amont de l'activateur Emicrons situé entre le dernier segment JH et le gène Cmicrons. Chez les souris homozygotes (N/N), l'effet "néo" provoque un blocage au stade proB de la maturation cellulaire du à une compétition entre promoteurs induisant l'inhibition de la transcription du locus IgH en amont de l'insertion du gène néo. Malgrè l'absence de transcription, le locus reste accessible aux enzymes de recombinaison et présente des réarrangements V(D)J. Ces résultats confirment la possibilité d'un découplage entre les mécanismes de réarrangements et de transcription. Nous observons des jonctions VJk chez les souris N/N. Bien que les cellules pro-B issues de ces souris soient incapables d'exprimer de chaînes lourdes, l'analyse des transcrits matures de chaînes kappa révèle un faible taux de jonctions VJ induisant un décalage du cadre de lecture (33%). Ainsi, une surveillance des ARNm de chaînes légères kappa semble se produire et conduire à l'inhibition d'épissage ou à la dégradation des ARNm contenant des codons stop prématurés (NMD:"nonsense-mediated mRNA decay"). Nous avons montré que ce processus varie en fonction des segments Jk réarrangés et ne nécessite pas la présence d'un intron en 3' de la terminaison prématurée de la traduction.

Au cours de mon travail de thèse j’ai étudié la relation entre les facteurs participant à la terminaison de la traduction et ceux participant à la dégradation des ARNm chez S. cerevisiae.D’une part, je me suis intéressée au facteur Tpa1, caractérisé pour son rôle dans la terminaison de la traduction et la stabilité des ARNm chez S. cerevisiae et dont l’homologue chez S. pombe, Ofd1, participe au contrôle de la réponse hypoxique. Je me suis basée sur la structure de ce facteur, établie par nos collaborateurs pour comprendre plus précisément la fonction moléculaire de Tpa1 et rechercher des similitudes avec sa fonction chez S. pombe.Tpa1 est composée de deux domaines de type DSBH dont le premier, contenant le site catalytique, présente des homologies structurales avec la famille des prolyl-hydroxylases.Nous avons reproduit l’effet de la protéine Tpa1 sur la translecture in vivo et montré que son site catalytique prédit, ainsi que la présence des deux domaines étaient nécessaires pour cette activité. Nous avons aussi observé que Tpa1 inhibait par un mécanisme inconnu le facteur de transcription Hap1, qui régule des gènes en fonction de la quantité d’oxygène. Basé sur l’existence d’un inhibiteur d’Ofd1 chez S. pombe, nous avons ensuite montré qu’Ett1 (l’homologue de cet inhibiteur chez S. cerevisiae) avait un rôle similaire à Tpa1 dans la translecture. Une étude structurale collaborative d’Ett1 a mis en évidence une région conservée, se liant à une molécule de sulfate et à un ligand inconnu. Cette région est importante pour la translecture. Cependant, le substrat de Tpa1 reste pour l’instant inconnu comme les rôles précis de Tpa1 et Ett1 dans la terminaison de la traduction et dans la réponse à l’hypoxie.D’autre part, j’ai étudié le processus de NMD, particulièrement en me focalisant sur le mécanisme de discrimination entre un codon stop précoce (PTC) et un codon stop normal, et en analysant également la modification post-traductionnelle d’un facteur central du NMD, Upf1. Nous avons mis en évidence, qu’en plus de la région aval, la région en amont du PTCparticipait à sa reconnaissance. Nous avons testé plusieurs hypothèses sur le rôle de cette région, qui ont confirmé son rôle sans permettre de démontrer un mécanisme définitif. En parallèle, l’étude de la protéine Upf1 s’est concentrée sur ses modifications posttraductionnelles, particulièrement par phosphorylation. En effet, une telle modification est importante chez son homologue humain. Nous avons pu confirmer l’existence d’une forme modifiée et démontrer que celle-ci était localisée entre les acides aminés 153 et 971. Cette modification s’est avérée être très labile ce qui n’a pas permis de confirmer qu’il s’agissait d’une phosphorylation, ni de la cartographier plus précisément
During my PhD thesis, I analyzed the relation between factors that participate intranslation termination and those participating in mRNA decay in yeast S. cerevisiae.First, I focused on Tpa1, that had been proposed to participate in translationtermination and mRNA decay in S. cerevisiae, and whose homologue in S. pombe, Ofd1,participates to the control of hypoxic response. Based on the structure of Tpa1, established byour collaborators, I performed functional analysis to understand more precisely the molecularfunction of Tpa1 and similarities with its role in S. pombe. Tpa1 is composed of two DSBHdomains; the first, which contains the catalytic site, has structural homologies with the familyof prolyl-hydroxylase. We could reproduce the effect of Tpa1 on stop codon readthrough invivo and we showed that the predicted catalytic site and the presence of the two domains ofTpa1 were necessary for its activity. We also showed that Tpa1 inhibited one factor, Hap1,implicated in regulation of gene expression by oxygen. The existence of an inhibitor of Ofd1in S. pombe, allowed the identification of Ett1 (its homologue in S. cerevisiae). We showedthat Ett1 has a role similar to the one of Tpa1 in translational readthrough. A collaborativestructural and functional study of Ett1 revealed a conserved region, which binds a sulfate ion,and an unknown ligand. This region is important for the readthrough. However, thesubstrate(s) of Tpa1 remain(s) for the moment unknown, and the precise roles of Tpa1 andEtt1 in translation termination and in response to hypoxia remain to be deciphered.I also analyzed the NMD process by focusing more particularly on the mechanism thatallows the discrimination between a normal stop and a PTC (premature termination codon)and on the analysis of the post-translational modification of an important factor for the NMD,Upf1. This study revealed that, not only the region downstream of the PTC but also theupstream region participates to its recognition. We have tested several hypotheses on the roleof this upstream region, which confirmed its implication but did not reveal a definitivemechanism. In parallel, we started the study of the post-translational modifications of Upf1,and more particularly by phosphorylation. Indeed, the phosphorylation of Upf1 in human isvery important for the NMD process. We could confirm the presence of a modified form ofyeast Upf1 and we have demonstrated that it was localized between amino acids 153 and 971.This modification appeared to be highly labile. This prevented us to confirm definitively thatit was really a phosphorylation and to cartography precisely its location

La traduction des ARNm en protéine est un processus finement régulé grâce aux mécanismes développés par la cellule pour en contrôler l’efficacité et la fidélité. En effet, les ARNm sont sujets à diverses erreurs au cours de leur transcription et leur maturation. En particuliers, les erreurs entrainant l’apparition de codons stop précoces peuvent conduire à la synthèse de protéines tronquées à effet néfaste sur la cellule. C’est pour cela que de tels ARNm sont rapidement dégradés grâce à un mécanisme régulateur appelé la NMD (Nonsence mediated mRNA Decay). Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, cette voie est régie par l’action coordonnée des protéines Upf1, Upf2 et Upf3 formant le complexe de surveillance, mais elle fait également intervenir les facteurs de terminaison classique eRF1 et eRF3, ainsi que d’autres facteurs peu caractérisés tels que la protéine Ebs1. Par ailleurs, la dégradation de ces ARNm défectueux est accélérée par la dégradation rapide de la coiffe ou « decapping ». Au cours de ce travail, nous avons caractérisé des domaines fonctionnels de protéines impliquées dans la détection et la dégradation de ces ARNm. En particuliers, nous nous sommes intéressés à l’étude structurale de la protéine Upf2 qui constitue l’élément central du complexe de surveillance. Nous avons également caractérisé un domaine de la protéine Pat1, puissant activateur du « decapping ». Cette étude nous a permis de mieux comprendre le rôle de ces protéines dans le contrôle qualité et la dégradation des ARNm
MRNA translation process is finely tuned thanks to the regulatory mechanisms evolved by the cell controlling its rate, efficiency and fidelity. Indeed, mRNAs are often subjected to transcription and maturation errors. In particular, mRNA harboring premature stop codons (PTC) in their open reading frames could be translated into truncated proteins with a deleterious impact on the cell. Thus, such mRNAs are rarely detected in the cell as they are rapidly degraded thanks to the NMD (Nonsence mediated mRNA Decay) pathway. In yeast Saccharomyces cerevisiae, this process is governed by the Upf1, Upf2 and Upf3 proteins forming the “surveillance complex”, the termination factors (eRF1 and eRF3) as well as some other poorly characterized factors like Ebs1 protein. In addition, degradation of such mRNAs is enhanced by rapid degradation of the 5’ cap or decapping. In this work, we focused on the characterization of some proteins involved in this process. In particular, we addressed the structural characterization of Upf2 protein, the central component of the surveillance complex. In addition, we characterized a functional domain of Pat1 protein, a strong decapping enhancer. This study allowed us to give a new insight into the role of these proteins in mRNA quality control and decay

Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d'empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n'existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu'un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d'une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu'une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n'est pas exprimé du fait de l'intervention du NMD sur l'ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d'inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l'efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d'un luminomètre. A partir d'un premier criblage d'environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d'inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d'induire la synthèse de protéines entières à partir d'un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l'inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l'apparition d'une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d'inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette.

Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d’empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n’existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu’un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d’une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu’une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n’est pas exprimé du fait de l’intervention du NMD sur l’ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d’inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l’efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d’un luminomètre. A partir d’un premier criblage d’environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d’inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d’induire la synthèse de protéines entières à partir d’un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l’inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l’apparition d’une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d’inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette
MRNAs harboring a premature termination codon are rapidly degraded by a mechanism called nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD is a surveillance pathway that prevents the synthesis of truncated proteins that could be harmful for the cell or simply be non-functional. However in some cases, depending on the position of the premature stop codon, the truncated protein that would be synthesized if there were no NMD would be partially or fully as functional as the wild-type protein. It is noteworthy that premature termination codons are found in approximately one-third of inherited genetic disorders and several forms of cancer. In most of cases the disease arises not because a non-functional or unstable truncated protein is synthesized, but instead because the degradation of the transcript by NMD leads to complete loss of protein production. Therefore, NMD inhibition could be an interesting therapeutic approach in some cases of nonsense-related genetic diseases in which functional truncated proteins can restore the clinical phenotype. We decided to search for NMD inhibitors among thousands of small molecules. We developed a cell-based screening method which couples NMD efficiency into the cell to a luciferase activity that can be measured directly into cells by a luminometer. From a screening of approximately 1500 compounds, we have identified one molecule capable of efficiently inhibit NMD. Interestingly, this compound is also able to induce the synthesis of full-length proteins from an mRNA bearing a premature termination codon. We evaluated the therapeutic potential of this compound in different cellular models of genetic disorders such as Duchenne’s muscular dystrophy, cystic fibrosis and cancer. Our results demonstrate that NMD inhibition in general can be considered as an useful therapeutic approach to rescue PTC consequences in genetic diseases provoked by the apparition of a nonsense mutation. We have also identified another compound that inhibits NMD and uncovers a relationship between the NMD efficiency and the integrity of the cytoskeleton

In eukaryotes, mRNA is in constant flux between an actively translating state and translationally repressed states. Specifically, mRNA degradation and repression factors compete with translation factors to direct mRNAs out of translation for storage or decay. This process often leads to formation of cytoplasmic aggregates. P-bodies are granules that contain mRNA and degradation factors, suggesting they are sites of mRNA decay or storage. Stress granules form in response to stress conditions and contain mRNAs and translation factors.P-bodies and stress granules consist of mRNPs of different compositions, believed to mature and transition between the states. It is proposed that mRNAs transition between the two granules. In the work described below, we use Saccharomyces cerevisiae to demonstrate that a decay factor, Dhh1 is capable of existing in both P-body and stress granule mRNPs. This suggests that a decay factor can be part of two different mRNP complexes. Additionally, we identify two novel components of the stress granule mRNPs, Pbp4 and Lsm12, and determine that they are not essential for stress granule formation. Lastly, we show that the stress granule mRNP factor, Pab1, is not absolutely required for stress granule formation.An important aspect of cytoplasmic mRNA regulation is mRNA quality control. One example of this is nonsense-mediated mRNA decay (NMD), whereby aberrant mRNAs containing premature termination codons are targeted for decay, and can be localized to P-bodies. Upf1-3 and the mRNA decapping complex, Dcp2/Dcp1 are essential for NMD, which requires Upf1 interaction with stalled ribosomal/mRNA complexes to target aberrant mRNA for decapping and degradation. How Dcp2/Dcp1 is recruited to aberrant mRNA is poorly understood.Here, we show by yeast two-hybrid assays that an interaction between Dcp2 and Upf1 is mediated by the decapping stimulator Edc3. Interestingly, Edc3 and Upf2 share overlapping binding sites on the Upf1 N-terminal domain. The decapping stimulator, Pat1, also interacts on the Upf1 N-terminus, but Edc3 and Pat1 are not essential for NMD. Surprisingly, the Upf1-Edc3 interaction does not promote or negatively regulate NMD. Thus, the Upf1-Edc3 and Upf1-Pat1 interactions likely regulate a subset of mRNA transcripts, or are essential for proper NMD under different environmental conditions.

La traduction est considérée comme une étape clé de l'expression des gènes permettant à la cellule de s'adapter aux variations de son environnement en réponse aux signaux internes ou externes. Des études bioinformatiques ont montrés que la moitié des ARN messagers chez l'homme portent, en amont de leur phase codante, des éléments régulateurs appelés uORF. Le laboratoire a montré qu'un défaut de terminaison de la traduction par déplétion du facteur de terminaison eRF3 modifie l'expression de gènes dont l'ARNm contient des uORF comme le gène ATF4. Cette modification se fait soit par un mécanisme de réinitiation après traduction de l'uORF soit par une augmentation de la stabilité de l'ARNm résultant d'un défaut de sa dégradation par la voie du "Nonsense-mediated mRNA Decay" (NMD). A travers leur association dans le même complexe et leur implication dans la terminaison de la traduction et la NMD, eRF3 et Upf1 contribuent à la régulation fine de l'expression des gènes. Cependant, on ne sait pas dans quelle mesure ces deux facteurs affectent la traduction et la stabilité des ARNm. Nous avons évalué la traduction par ribosome profiling et le taux de transcrits par RNA-seq dans les cellules humaines déplétées en eRF3 ou en Upf1. Ces analyses nous ont permis de dresser une carte des uORF traduites dans le transcriptome des cellules humaines HCT116. Nous avons également observé que peu de gènes cibles sont communs entre la déplétion en eRF3 ou en Upf1. Nos résultats appuient fortement l'hypothèse qu'il y a au moins deux classes de transcrits portant des uORF, l'une dont la régulation implique la terminaison de la traduction et l'autre dont la régulation implique la NMD
Regulation of gene expression at the translational level is increasingly being recognized as a key mechanism by which cells can rapidly change their gene expression pattern in response to internal or external stimuli. Bioinformatic studies revealed that half of human transcripts present at least one expression regulatory element uORF in the 5’ leader sequence preceding the main ORF. We have previously shown that translation termination disruption caused by eRF3a depletion induces upregulation of the transcriptional activator ATF4 and its targeted genes partly by a translational control at uORFs, and partly in relation to a defect in Nonsense-mediated mRNA Decay activation, increasing ATF4 mRNA stability. Through their physical association and their involvement in translation termination and NMD, eRF3 and Upf1 are regulating the protein and mRNA levels of a significant number of genes and thus contribute to the fine-tuning of their expression. It is not known yet, in what extent both of these factors affect translational control and what is the subset of genes that are regulated by these factors. In this study, we evaluated translation by ribosome profiling and mRNA level by RNA-seq in human cells subjected to either eRF3a or Upf1 depletion. These analyses allowed us to draw a transcriptome-wide map of uORFs and obtained a list of functional uORFs in our reference HCT116 transcriptome. We also observe that only a small fraction of these are common targets for both eRF3a and Upf1. Our results provide strong support for the notion that different classes of transcripts bearing uORFs are regulated either by translational processes involving translation termination or by NMD

UPF1 (Up-Frameshift 1) est une hélicase multifonctionnelle conservée chez tous les eucaryotes. Elle est essentielle à la voie de surveillance du NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay), qui dégrade des ARNm portant un codon stop prématuré. UPF1 est l’archétype d’une famille d’hélicases qui partagent des corps similaires mais sont impliquées dans des voies cellulaires variées. Cependant, les relations structure-fonction et les caractéristiques biophysiques intrinsèques de ces moteurs moléculaires restent à ce jour peu connues. In vitro, le coeur hélicase d’UPF1 est hautement processif, il traverse des milliers de bases sur l’ARN ou l’ADN et déroule des doubles brins. Dans ce travail, nous avons cherché les facteurs clés régissant cette remarquable processivité en combinant des techniques de biochimie et de biophysique. En particulier, nous avons utilisé des pinces magnétiques pour étudier en temps réel des hélicases à l’échelle de la molécule unique. Contrairement à UPF1, l’hélicase IGHMBP2 de la famille UPF1-like n’est pas processive ; la processivité n’est donc pas un trait conservé au sein de la famille. Grâce à une étude fine de la structure 3D des deux hélicases, nous avons conçu divers mutants que nous avons utilisés pour identifier les éléments structuraux qui modulent la processivité. Notre approche révèle qu’UPF1 a une prise très ferme sur les acides nucléiques, garantissant de longs temps de résidence et d’action qui dictent sa haute processivité. Grâce à la variété de comportements des mutants, nous avons construit un modèle mécanistique expliquant le lien entre énergie d’interaction et processivité. Nous démontrons aussi que la processivité d’UPF1 est requise pour un processus de NMD efficace in vivo. Nous avons utilisé les mêmes outils biochimiques et biophysiques pour étudier une isoforme naturelle d’UPF1 humaine se déplaçant plus vite que l’isoforme majeure, et pour comparer la régulation d’UPF1 humaine et de levure par leurs domaines flanquants. Nous avons également caractérisé l'interaction d’UPF1 de levure avec de nouveaux partenaires. Nos travaux montrent comment la combinaison d'outils biochimiques, biophysiques, structuraux etin vivo offre des aperçus inattendus quant au mode de fonctionnement des moteurs moléculaires
UPF1 (Up-Frameshift 1) is a multifunctional helicase that unwinds nucleic acids and is conserved throughout the eukaryote kingdom. UPF1 is required for the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) surveillance pathway, which degrades mRNAs carrying premature termination codons, among other substrates. UPF1 is the archetype of a family of 11 helicases sharing similar cores but involved in various cellular pathways. However, the structure-function relationship and intrinsic biophysical properties of these molecular engines remain poorly described. In vitro, the UPF1 helicase core is highly processive, it travels along thousands of RNA or DNA bases and unwinds double-strands. In this work, we looked for key factors governing this remarkable processivity. We combined biochemical and biophysical techniques. In particular, we used magnetic tweezers to study helicases in real time at a single molecule scale. In contrast to UPF1, the related IGHMBP2 is not processive, thus processivity is not a shared family trait. Based on the 3D structures of both proteins, we designed various mutants and used them to identify structural elements that modulate processivity. Our approach reveals that UPF1 has a very firm grip on nucleic acids, guaranteeing long binding lifetimes and action times that dictate its high processivity. Thanks to the variety in mutant behaviors, we built a novel mechanistic model linking binding energy to processivity. Furthermore, we show that UPF1 processivity is required for an efficient NMD in vivo. In addition, we used the same biochemical and biophysical tools to investigate a natural human UPF1 isoform moving faster than the major isoform, and to compare the regulation of human andyeast UPF1 by their flanking domains. We also characterized the interaction of yeast UPF1 with new NMD partners. Our work shows how a combination of biochemical, biophysical, structural and in vivo tools can offer unexpected insights into the operating mode of molecular motors

Le complexe EJC (Exon Junction Complex) joue un rôle central dans le couplage des processus post-transcriptionnels chez les métazoaires. Ce complexe multi-protéique est assemblé sur les ARN messagers (ARNm) par la machinerie d’épissage. Organisé autour d’un complexe cœur servant de plate-forme à de nombreux facteurs, les EJCs accompagnent les ARNm dans le cytoplasme et participent à leur transport, leur traduction et leur stabilité. L’importance physiologique de l’EJC est supportée par les nombreux défauts développementaux et les maladies génétiques associées aux composants de l’EJC. Les analyses transcriptomiques révélant un assemblage hétérogène des EJCs renforcent l’hypothèse que les EJCs participent à la régulation de l’expression des gènes. Cependant, malgré une connaissance précise de la structure de ce complexe, les liens fonctionnels entre l’assemblage de l’EJC et la régulation de transcrits spécifiques dans des conditions physiologiques doivent être établis puis caractérisés.Durant cette thèse, j’ai étudié l’expression d’eIF4A3, Y14 et MLN51, trois protéines du cœur de l’EJC, dans des cultures primaires de cellules souches neurales murines (CSN). Les CSN peuvent être différenciées en cellules épendymaires multi-ciliées qui tapissent les ventricules cérébraux et ont un rôle important dans le développement du cerveau. J’ai observé par immunofluorescence dans des CSN quiescentes que les 3 protéines sont concentrées autour du centrosome à la base du cil primaire. Ces localisations reflètent la présence d’EJC assemblés comme le prouve l’étude d’un mutant d’Y14 incapable de former l’EJC
The Exon Junction Complex (EJC) plays a central role in coupling post-transcriptional processes in metazoans. This multi-protein complex is assembled onto messengers RNAs (mRNAs) by the splicing machinery. Organized around a core complex serving as a platform for numerous factors, EJCs accompany mRNAs to the cytoplasm and is involved in mRNA transport, translation and stability. The physiological importance of the EJC is supported by observations associating defects in EJC component expression to developmental defects and human genetic disorders. Transcriptomic studies revealing the non-ubiquitous deposition of EJCs strengthened the hypothesis that EJCs could participate to gene expression regulation. However, despite a precise picture of the structure of the EJC, functional links between EJC assembly and regulation of specific transcripts under physiological conditions is yet to be established.During this thesis, I studied the expression of eIF4A3, Y14 and MLN51 three core proteins of the EJC in primary cultures of mouse neural stem cells (NSCs). NSCs can be differentiated into multiciliated ependymal cells that line all brain ventricles and have important physiological functions in brain development. We observed by immunofluorescence that in quiescent NSCs, all three proteins are concentrated in the vicinity of the centrosome at the base of the primary cilia. This localization reflects the presence of fully assembled EJCs as proved by the study of Y14 mutant that prevent EJC core mounting

La télomérase, composée de l‘ARN TR et de la protéine TERT, responsable du maintien de la longueur des télomères est surexprimée dans la majorité des cellules cancéreuses. La dynamique de la régulation post-transcriptionnelle de TERT sur l‘activation de la télomérase a été étudiée dans le modèle de lymphomagenèse induite par l‘herpesvirus oncogène aviaire de la maladie de Marek. L‘augmentation de l‘activité télomérase des TCD4+ lors de l‘apparition des lymphomes résulte d‘une hausse du transcrit constitutif et de celle des transcrits cibles de la voie de dégradation du « non-sense mediated decay » (NMD) alors que l‘activité télomérase basale des TCD4+ non infectés est contrôlée par les isoformes dominantes négatives. La caractérisation de la protéine virale ICP27 de MDV-1, régulateur potentiel de l‘épissage des gènes, qui s‘exprime pendant la phase de réplication lytique du virus a complété cette étude. ICP27 est capable de co-localiser et d‘interagir avec les protéines SR du splicéosome ainsi que de réguler négativement l‘épissage des gènes cellulaire TERT et viral vIL8 de manière similaire à ICP27 de l‘herpesvirus simplex 1. Le modèle naturel de lymphomagenèse induite par MDV-1 a permis d‘établir pour la première fois un lien entre l‘activation de la télomérase in vivo et la régulation de l‘épissage de TERT, à laquelle pourrait participer la protéine virale ICP27
The telomerase, consisting of an RNA template (TR) and a reverse transcriptase (TERT) maintains telomere length and is highly expressed in the majority of cancer cells. The splicing regulation of TERT was studied in Marek‘s disease (MD), a natural lymphoma induced by MDV-1, the avian MD herpesvirus. Telomerase activation observed in TCD4+ cells at the onset of MD lymphoma was due to an increase of constitutively spliced and « non-sense mediated decay » (NMD) while basal telomerase activity of non infected TCD4+ cells was controlled by dominant negative isoforms. In addition, the viral protein ICP27, a putative regulator of splicing, expressed during MDV-1 lytic infection was characterised. ICP27 co-localized and interacted with spliceosome SR proteins and negatively controlled splicing of TERT and vIL8 viral gene in a way similar to that of ICP27 of herpesvirus simplex 1. The MD model provides the only data on the in vivo regulation of TERT splicing, possibly mediated by ICP27, and telomerase activation during lymphomagenesis induced by a herpesvirus in its natural host

Le Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) détecte et dégrade les ARNs qui ont une terminaison de la traduction précoce. Il affecte une grande diversité d’ARNs cytoplasmiques, c’est la voie majeure de dégradation des ARNs aberrants.Les ARNs ciblés par le NMD chez la levure ont une phase ouverte de lecture courte et un long 3’-UTR. Comment ces caractéristiques permettent une dégradation efficace par le NMD et quelles sont les étapes du mécanisme reste peu clair. À partir de 112 purifications d’affinités suivies d’une analyse en spectrométrie de masse quantitative, nous avons identifié deux complexes distincts impliqués dans le NMD. Ces deux complexes, mutuellement exclusifs, s’articulent autour d’UPF1, la protéine majeure du NMD. Le premier complexe, nommé Détecteur, aurait un rôle dans la reconnaissance des cibles alors que le deuxième complexe, nommé Effecteur, initierait la dégradation des ARNs par une interaction directe avec la machinerie de décapping.Les facteurs impliqués dans ce modèle sont tous conservés à travers les eucaryotes et les étapes décrites sont transposables d’après la littérature. Cela semble indiquer un nouveau paradigme pour le mécanisme du NMD qui s’articulerait autour d’une base universelle commune à laquelle pourrait s’ajouter des étapes spécifiques des organismes ou des types d’ARNs
Nonsense-Mediated mRNA Decay (NMD) detects and degrades RNA for which translation ends prematurely. It affects a large diversity of cytoplasmics RNAs; it is the major decay pathway for aberrants RNAs.In yeast, NMD targeted RNAs have a short open reading frame and a long 3’-UTR. How these two features lead to an efficient degradation through NMD and what are the steps of this mechanism is still unclear.From 112 affinity purifications of NMD factors followed by an analysis using quantitative mass spectrometry, we identified two distinct complexes. Those complexes were mutually exclusive and both contained Upf1, the major NMD protein. A first complex, named Detector, might have a role in the NMD substrates recognition whereas the second one, named Effector, would initiate the degradation through a direct interaction with the decapping machinery.The factors involved in our new model are all conserved throughout eukaryotes and the steps we describe have potential equivalents in other species. Our data suggest a new paradigm for the NMD mechanism that would be organised around a shared universal base to which specific steps could be added in certain organisms or for certain types of RNA substrates

La dégradation de l'ARN est une étape essentielle pour maintenir l'équilibre nécessaire à l'expression des gènes et à leur régulation. Chez les eucaryotes, le modèle le plus courant propose que la dégradation de l'ARN est contrôlée par la vitesse de raccourcissement de la queue poly-A. En dessous d'un certain seuil, la présence d'une courte queue oligo-A entraîne l'activation du décapping et la dégradation de l'ARN. Cependant, la déadénylation progressive n'est pas nécessaire pour une voie majeure de dégradation rapide de l'ARN, la dégradation par le "nonsense-mediated mRNA decay" (NMD), qui se passe indépendamment de la taille d'une queue poly-A. Sur la base de mesures à grande échelle de la longueur de la queue poly-A et d'estimations de la demi-vie de l'ARN, nous proposons qu'un modèle de dégradation indépendant de la déadénylation, similaire au NMD, puisse exister pour d'autres ARN instables. Ce modèle prédit que des changements de vitesse de déadénylation ne devraient pas avoir d'impact sur la demi-vie de ces ARN. Le raccourcissement de la queue des poly-A semble être dans ce cas un processus parallèle et non pas nécessaire pour la dégradation de l'ARN. Comme prédit par notre modèle, un ARN rapporteur instable et insensible au NMD n'est pas stabilisé par une diminution de la vitesse de déadénylation, même s'il est très sensible à l'inactivation du décapping. Ces résultats ont été obtenus dans un système "degron" de déplétion rapide et spécifique de protéines d’intérêt, qui permet d’éviter une perturbation globale du métabolisme des cellules testées. En accord avec ces résultats fonctionnels, nous avons identifié les ARN instables comme une population de molécules d'ARN associées à la protéine de liaison cytoplasmique des poly-A et conclu que de longues queues de poly-A sont une caractéristique naturelle des ARN instables. Nos résultats sont compatibles avec les estimations récentes de la taille des queues poly-A et de la vitesse de dégradation des transcrits et devraient avoir un impact important sur la découverte des mécanismes moléculaires par lesquels la dégradation des ARN est initiée chez les eucaryotes
RNA degradation is a critical step in maintaining the proper balance required for gene expression and its regulation. In eukaryotes, RNA decay is thought to be controlled by the speed of poly-A tail shortening. Below a threshold, the presence of an oligo-A tail leads to decapping activation and rapid RNA degradation. However, progressive deadenylation is not required for a major fast RNA degradation pathway, the nonsense mediated mRNA decay (NMD), which occurs independently of the size of a poly-A tail. Based on large-scale poly-A tail length measurements and RNA half-life estimates, we hypothesize that a deadenylation-independent degradation model, similar to NMD, applies to other unstable RNAs. This model predicts that changes in the deadenylation speed should not impact the half-life of these RNAs. Poly-A tail shortening could be thus considered as a parallel event rather than a requirement for RNA degradation. We found that, as predicted by a deadenylation-independent model of RNA degradation, an unstable reporter RNA that is insensitive to NMD, is not stabilized by an inhibition of deadenylation, even if it is highly sensitive to the decapping activity. These results were obtained in a "degron" system for quick and specific depletion of the proteins, which allows a minimal global perturbation of the tested cells. In line with these functional results, we identified unstable RNAs as a population of RNA molecules associated with the poly-A binding protein and conclude that long poly-A tails are a natural feature of unstable RNAs. Our results are consistent with recent large-scale estimates of poly-A tails length and RNA stability and imply that molecular mechanisms involved in the initiation of RNA degradation in eukaryotes remain to be discovered

Cette thèse se concentre sur les méthodes d’apprentissage pour la transcription automatique de la batterie. Elles sont basées sur un algorithme de transcription utilisant une méthode de décomposition non-négative, la NMD. Cette thèse soulève deux principales problématiques : l’adaptation des méthodes au signal analysé et l’utilisation de l’apprentissage profond. La prise en compte des informations du signal analysé dans le modèle peut être réalisée par leur introduction durant les étapes de décomposition. Une première approche est de reformuler l’étape de décomposition dans un contexte probabiliste pour faciliter l’introduction d’informations a posteriori avec des méthodes comme la SI-PLCA et la NMD statistique. Une deuxième approche est d’implémenter directement dans la NMD une stratégie d’adaptation : l’application de filtres modelables aux motifs pour modéliser les conditions d’enregistrement ou l’adaptation des motifs appris directement au signal en appliquant de fortes contraintes pour conserver leur signification physique. La deuxième approche porte sur la sélection des segments de signaux à analyser. Il est préférable d’analyser les segments où au moins un événement percussif a lieu. Un détecteur d’onsets basé sur un réseau de neurones convolutif (CNN) est adapté pour détecter uniquement les onsets percussifs. Les résultats obtenus étant très intéressants, le détecteur est entraîné à ne détecter qu’un seul instrument permettant la réalisation de la transcription des trois principaux instruments de batterie avec trois CNN. Finalement, l’utilisation d’un CNN multi-sorties est étudiée pour transcrire la partie de batterie avec un seul réseau
This thesis focuses on learning methods for automatic transcription of the battery. They are based on a transcription algorithm using a non-negative decomposition method, NMD. This thesis raises two main issues: the adaptation of methods to the analyzed signal and the use of deep learning. Taking into account the information of the signal analyzed in the model can be achieved by their introduction during the decomposition steps. A first approach is to reformulate the decomposition step in a probabilistic context to facilitate the introduction of a posteriori information with methods such as SI-PLCA and statistical NMD. A second approach is to implement an adaptation strategy directly in the NMD: the application of modelable filters to the patterns to model the recording conditions or the adaptation of the learned patterns directly to the signal by applying strong constraints to preserve their physical meaning. The second approach concerns the selection of the signal segments to be analyzed. It is best to analyze segments where at least one percussive event occurs. An onset detector based on a convolutional neural network (CNN) is adapted to detect only percussive onsets. The results obtained being very interesting, the detector is trained to detect only one instrument allowing the transcription of the three main drum instruments with three CNNs. Finally, the use of a CNN multi-output is studied to transcribe the part of battery with a single network

Le complexe EJC (Exon Junction Complex) joue un rôle central dans le couplage des processus post-transcriptionnels chez les métazoaires. Ce complexe multi-protéique est assemblé sur les ARN messagers (ARNm) par la machinerie d’épissage. Organisé autour d’un complexe cœur servant de plate-forme à de nombreux facteurs, les EJCs accompagnent les ARNm dans le cytoplasme et participent à leur transport, leur traduction et leur stabilité. L’importance physiologique de l’EJC est supportée par les nombreux défauts développementaux et les maladies génétiques associées aux composants de l’EJC. Les analyses transcriptomiques révélant un assemblage hétérogène des EJCs renforcent l’hypothèse que les EJCs participent à la régulation de l’expression des gènes. Cependant, malgré une connaissance précise de la structure de ce complexe, les liens fonctionnels entre l’assemblage de l’EJC et la régulation de transcrits spécifiques dans des conditions physiologiques doivent être établis puis caractérisés.Durant cette thèse, j’ai étudié l’expression d’eIF4A3, Y14 et MLN51, trois protéines du cœur de l’EJC, dans des cultures primaires de cellules souches neurales murines (CSN). Les CSN peuvent être différenciées en cellules épendymaires multi-ciliées qui tapissent les ventricules cérébraux et ont un rôle important dans le développement du cerveau. J’ai observé par immunofluorescence dans des CSN quiescentes que les 3 protéines sont concentrées autour du centrosome à la base du cil primaire. Ces localisations reflètent la présence d’EJC assemblés comme le prouve l’étude d’un mutant d’Y14 incapable de former l’EJC
The Exon Junction Complex (EJC) plays a central role in coupling post-transcriptional processes in metazoans. This multi-protein complex is assembled onto messengers RNAs (mRNAs) by the splicing machinery. Organized around a core complex serving as a platform for numerous factors, EJCs accompany mRNAs to the cytoplasm and is involved in mRNA transport, translation and stability. The physiological importance of the EJC is supported by observations associating defects in EJC component expression to developmental defects and human genetic disorders. Transcriptomic studies revealing the non-ubiquitous deposition of EJCs strengthened the hypothesis that EJCs could participate to gene expression regulation. However, despite a precise picture of the structure of the EJC, functional links between EJC assembly and regulation of specific transcripts under physiological conditions is yet to be established.During this thesis, I studied the expression of eIF4A3, Y14 and MLN51 three core proteins of the EJC in primary cultures of mouse neural stem cells (NSCs). NSCs can be differentiated into multiciliated ependymal cells that line all brain ventricles and have important physiological functions in brain development. We observed by immunofluorescence that in quiescent NSCs, all three proteins are concentrated in the vicinity of the centrosome at the base of the primary cilia. This localization reflects the presence of fully assembled EJCs as proved by the study of Y14 mutant that prevent EJC core mounting

mRNA decay is an important step in gene regulation, environmental responsiveness, and mRNA quality control. One such quality control pathway, Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD), targets transcripts whose translation terminates prematurely. However, the scope and the defining features of NMD-targeted transcripts remain elusive. To address these issues, we re-evaluated the genome-wide expression of annotated transcripts in yeast cells harboring deletions of the UPF1, UPF2, or UPF3 genes. The vast majority of NMD-regulated transcripts are normal-looking protein-coding mRNAs. Our bioinformatics analyses reveal that this set of NMD-regulated transcripts generally have lower translational efficiency, lower average codon optimality scores, and higher ratios of out-of-frame translation. General mRNA decay is predominantly mediated by decapping by the Dcp1-Dcp2 complex and 5' to 3' decay by Xrn1, but the exact mechanism of decapping regulation has remained largely unknown. Several in vitro and in vivo studies have revealed the importance of the C-terminal extension of Dcp2 and the identities of many decapping regulators that interact with the decapping complex. To better understand how decapping regulation is achieved by the C-terminal extension of Dcp2 we generated RNA-Seq libraries from a Dcp2 allele that lacks this portion of Dcp2 along with libraries from strains that contain single deletions of several decapping activators. Our transcriptome-wide results indicate that the C-terminal extension of Dcp2 is crucial for efficient regulation of decapping, and different decapping activators are responsible for targeting different sets of mRNAs. Considering the limited pool of Dcp1-Dcp2 in the cell decapping activators might be in competition for decapping complex binding. Collectively, our results yield valuable insights into the mechanism of substrate selection for mRNA quality control and decay in yeast.

Messenger RNAs are transcribed and co-transcriptionally processed in the nucleus, and transported to the cytoplasm. In the cytoplasm, mRNAs serve as the template for protein synthesis and are eventually degraded. The removal of intron sequences from a precursor mRNA is termed splicing and is carried out by the dynamic spliceosome. In this thesis, I describe the regulated splicing of two transcripts in Saccharomyces cerevisiae. I also describe a study where the mechanisms that control the expression of magnesium transporters are elucidated. The pre-mRNA retention and splicing (RES) complex is a spliceosome-associated protein complex that promotes the splicing and nuclear retention of a subset of pre-mRNAs. The RES complex consists of three subunits, Bud13p, Snu17p and Pml1p. We show that the lack of RES factors causes a decrease in the formation of N4-acetylcytidine (ac4C) in tRNAs. This phenotype is caused by inefficient splicing of the pre-mRNA of the TAN1 gene, which is required for the formation of ac4C in tRNAs. The RES mutants also show growth defects that are exacerbated at elevated temperatures. We show that the temperature sensitive phenotype of the bud13Δ and snu17Δ cells is caused by the inefficient splicing of the MED20 pre-mRNA. The MED20 gene encodes a subunit of the Mediator complex. Unspliced pre-mRNAs that enter the cytoplasm are usually degraded by the nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway, which targets transcripts that contain premature translation termination codons. Consistent with the nuclear retention function of the RES complex, we find that NMD inactivation in the RES mutants leads to the accumulation of both TAN1 and MED20 pre-mRNAs. We also show that the cis-acting elements that promote RES-dependent splicing are different between the TAN1 and MED20 pre-mRNAs. The NMD pathway also targets transcripts with upstream ORFs (uORFs) for degradation. The ALR1 gene encodes the major magnesium importer in yeast, and its expression is controlled by the NMD pathway via a uORF in the 5’ untranslated region. We show that the ribosome reaches the downstream main ORF by a translation reinitiation mechanism. The NMD pathway was shown to control cellular Mg2+ levels by regulating the expression of the ALR1 gene. We further show that the NMD pathway targets the transcripts of the vacuolar Mg2+ exporter Mnr2p and the mitochondrial Mg2+ exporter Mme1p for degradation. In summary, we conclude that the RES complex has a role in the splicing regulation of a subset of transcripts. We also suggest a regulatory role for the NMD pathway in maintaining the cellular Mg2+ concentration by controlling the expression of Mg2+ transporters.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
Eukaryotic gene expression comprises a series of interconnected steps, from transcription to protein synthesis, in which messenger RNAs (mRNAs) are the key intermediates. While the multitude of events that take place throughout the whole process allows for the production of proteins to be controlled at many levels, ensuring maximum efficiency and fidelity, it also makes gene expression susceptible to errors. Eukaryotic cells have developed intricate mRNA quality control mechanisms that recognize and degrade aberrant transcripts. Two examples of these mechanisms are the nonsense-mediated mRNA decay (NMD), which targets mRNAs with premature translation termination codons (PTCs), and the nonstop mRNA decay (NSD), which eliminates mRNAs lacking any in-frame translation termination codons. SMG6 and PM/Scl100 are both ribonucleases which have been implicated in mRNA degradation pathways. One of the mechanisms proposed for mammalian NMD involves an endonucleolytic cleavage of transcripts in the vicinity of the PTC catalyzed by SMG6. On the other hand, the human exosome, which includes the catalytic subunit PM/Scl100, has been associated not only with mRNA surveillance mechanisms, but also with normal mRNA turnover. However, questions relative to the specificity or indispensability of these enzymes in the pathways in which they participate have not yet been answered. The present work aimed to explore the role of SMG6 and PM/Scl100 ribonucleases in the degradation of normal or NSD- and NMD-sensitive mRNAs. The results obtained point to the involvement of SMG6, not only in NMD, but also in NSD and normal mRNA turnover. Moreover, they suggest that SMG6 plays an indirect role on the degradation of NMD targets. PM/Scl100 also appears to intervene in NMD, NSD and normal mRNA turnover; however, the results herein presented suggest that the main contribution to NMD-eliciting transcripts 3’→5’ degradation may be offered by other exoribonucleases.
A expressão génica em eucariotas envolve uma série de etapas interligadas, desde a transcrição do material genético até à síntese da proteína correspondente, nas quais os RNAs mensageiros (mRNAs) são os intermediários cruciais. Embora a panóplia de eventos que ocorrem ao longo de todo o processo permita que a produção proteica seja controlada a vários níveis, também torna a expressão génica vulnerável a erros. As células eucarióticas desenvolveram mecanismos elaborados de controlo de qualidade do mRNA que reconhecem e degradam transcritos anómalos. Dois exemplos destes mecanismos são o decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense (NMD), que detecta mRNAs com codões de terminação da tradução prematuros (PTCs), e o decaimento do mRNA nonstop (NSD), que elimina mRNAs que não possuem codões de terminação da tradução em fase na grelha de leitura. A SMG6 e a PM/Scl100 são ambas ribonucleases já implicadas em vias de degradação de mRNAs. Um dos mecanismos propostos para o NMD em mamíferos envolve a clivagem endonucleolítica dos transcritos na proximidade do PTC, catalizada pela SMG6. Por outro lado, o exossoma humano, que inclui a subunidade catalítica PM/Scl100, já foi associado não só a mecanismos de vigilância do mRNA, mas também ao turnover do mRNA. No entanto, questões relativas à especificidade ou indispensabilidade destas enzimas nos mecanismos nos quais participam ainda não têm resposta. O presente trabalho teve como objectivo explorar o papel das ribonucleases SMG6 e PM/Scl100 na degradação de mRNAs normais ou sensíveis ao NSD e ao NMD. Os resultados obtidos apontam para o envolvimento da SMG6, não só no NMD, mas também no NSD e no turnover do mRNA. Para além disso, sugerem também que a SMG6 desempenha um papel indirecto na degradação de alvos do NMD. A PM/Scl100 também parece intervir no NMD, no NSD e no turnover do mRNA; no entanto, os resultados aqui apresentados sugerem que a principal contribuição para a degradação 3’→5’ de transcritos que desencadeiam o NMD é oferecida por outras exoribonucleases.

Increased expression and activity of the MYC protein is a widespread cancer hallmark and renders tumor cells addicted to sustained activation of a variety of other gene products. Identification of those dependencies can offer new therapeutic approaches against MYC-driven tumors. Previous studies showed that RNA processing events have a critical role in MYC-induced tumorigenesis and survival. Moreover, we and others observed that multiple genes encoding RNABinding Proteins (RBPs) were positively regulated upon MYC activation in various cell types. Hence, we hypothesized that the activity of specific RBPs could become rate-limiting for the growth and/or survival of MYC-overexpressing cells. Toward the identification of those RBPs, we set up high-throughput genetic dropout screens, involving both RNAi and CRISPR/Cas9 technologies. We designed lentiviral shRNA and sgRNA libraries targeting 730 RBPs, which we transduced in cell lines allowing controlled super-activation of MYC, in order to identify genes whose expression was specifically required in this condition. A series of candidates emerged from our screens, including UPF1 and XRN1, two RBPs involved in mRNA turnover and in particular in nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Biological validation in different systems confirmed our screening results and allowed us to extend our observations to other NMD factors, thus identifying NMD as a critical pathway in MYC-overexpressing cells. Addressing the mechanisms underlying the synthetic lethality between MYC and NMD shall not only allow us to unravel this unexpected crosstalk, but shall also pave the way toward the development of new therapeutic opportunities against MYC-dependent tumors.

Les projets développés au cours de cette thèse ont pour objectif d’explorer l’intérêt thérapeutique d’approches antisens ciblant les transcrits d’immunoglobulines (Ig) dans le traitement du myélome multiple (MM) et d’autres gammapathies monoclonales. Cette stratégie consiste à provoquer un saut d’exon à l’aide d’oligonucléotides antisens (ASO) pour induire la synthèse d’Ig tronquées et l’apoptose des plasmocytes tumoraux (Brevet WO 2017/089359). L’effet toxique des Ig sans domaine V résulte d’une amplification incontrôlée du stress du RE et de la réponse UPR (« Unfolded Protein Response »). Nous avons montré que des traitements à l’aide d’ASO dirigés contre les ARN pré-messagers de l’Ig monoclonale induisaient une forte toxicité dans des lignées de myélome et une régression tumorale dans un modèle de xénogreffe avec des injections intratumorales d’ASO. Bien que des améliorations en terme de biodistribution in vivo de ces ASO soient nécessaires, cette approche capable de cibler spécifiquement le clone tumoral en épargnant les plasmocytes sains pourrait permettre un traitement personnalisé des patients atteints de MM. De surcroît, nous avons également observé une diminution drastique de la production d’Ig à la suite d’un traitement par un ASO générique ciblant l’exon CH1γ, aussi bien dans les LB humains stimulés ou dans des lignées de myélome; cet ASO pouvant être utilisé chez tous les patients exprimant une IgG. En parallèle, nous avons exploré les liens entre stress protéique et surveillance des ARN dans les plasmocytes. Contrairement aux données de la littérature concernant des cellules non-lymphoïdes, nous avons mis en évidence une coopération entre le mécanisme de NMD (« Nonsense-Mediated mRNA Decay ») et l’UPR (« Unfolded Protein Response ») dans les plasmocytes, qui est rendue possible grâce par une faible activation de la voie PERK de l’UPR. Cette thèse a pour but de mieux comprendre l’impact des Ig tronquées dans les cellules sécrétrices d’anticorps et le lien étroit entre survie des plasmocytes et stress protéique associé à la synthèse massive d’Ig
The thesis projects aimed to explore the therapeutic value of antisense approaches targeting immunoglobulin (Ig) transcripts in the treatment of multiple myeloma (MM) and other monoclonal gammopathies. This strategy consists in inducing an exon skipping using antisense oligonucleotides (ASO) to provoke the synthesis of truncated Ig and apoptosis of tumor plasma cells (Patent WO 2017/089359). The toxic effect V domain-less Ig is the consequence of an uncontrolled amplification of ER stress and the UPR (Unfolded Protein Response). We have shown that treatments with ASO directed against monoclonal Ig (mo-Ig) pre-mRNAs induced strong toxicity on myeloma cell lines and regression of tumor xenografts after intratumoral ASO injections. Although improvements in terms of in vivobiodistribution of ASOs are necessary, this approach capable of specifically destroying the tumor clone could allow a personalized treatment of MM patients and spare healthy plasma cells. We have also observed a drastic decrease in Ig production after treatment of stimulated human B cells or myeloma cells with a generic ASO targeting the exon CH1γ that can be used in all patients expressing IgG. In parallel, we explored the relationship between protein stress and RNA surveillance in plasma cells. In contrast with previously published data from non-lymphoid cells, we have demonstrated a cooperation between the mechanism of NMD (Nonsense-Mediated mRNA Decay) and UPR in plasma cells, favored by the low activation of the PERK pathway of the UPR. Therefore, these works have shed new light on the impact of truncated Ig in antibody-secreting cells and, on the close link between the proteic stress associated with massive Ig synthesis and plasma cell survival

Chez l'homme, l’épissage joue un rôle central dans la coordination des différents processus de l'expression génique en déposant sur les ARNm nucléaires un complexe protéique nommé EJC (de Exon Junction Complex). Les premières études fonctionnelles montrent que ce complexe est impliqué dans l'export, la traduction, la localisation et la dégradation des ARNm. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé à la composition de l’EJC. Après avoir exprimé et purifié les protéines supposées constituer ce complexe, nous avons mené divers expériences d’interaction in vitro. Cette étude nous a permis de reconstituer le cœur de l’EJC et d’éclaircir l’assemblage de celui-ci. Ce mécanisme passe par la stabilisation d’une hélicase ATP dépendante sur l’ARN via trois partenaires. Nous avons ensuite mis en évidence une interaction entre le cœur de l’EJC et le complexe ASAP constitué de RNPS1, Acinus et SAP18. Les protéines Acinus et surtout RNPS1 s'avèrent être des facteurs d’épissage lorsqu’ils sont adressés sur un ARN pré-messager. J’ai voulu comprendre les rôles physiologiques de la présence de ces protéines sur l’EJC. Si un EJC est déposé à chaque jonction exonique, les ARN en cours d'épissage contiendraient à la fois des EJC et encore plusieurs introns. La présence de facteurs d’épissage recrutés par l’EJC pourrait réguler l’épissage des introns voisins. En parallèle de ce travail, j'ai étudié l'EJC chez D. Melanogaster. Chez cet organisme, les protéines homologues à celles constituant le cœur de l'EJC chez l'homme sont très conservés et impliquées dans un processus de localisation d'ARNm inédit chez l'homme. Cependant, l'existence de l'EJC chez la drosophile n'a jamais été démontrée
In human cells, splicing plays a key role in coordinating of different processes of genic expression by loading a protein complex called EJC (for Exon Junction Complex) on nuclear mRNA. Initial functionnal studies showed that the EJC is implicated in export, localisation, translation and decay of mRNA. During my PHD, I studied the EJC composition. After expression and purification of proteins potentially involved in this complex, I performed interaction experiments in vitro. This work allowed me to reconstitute the EJC core and clarify its assembly process. This mecanism acts by locking an ATP-dependent helicase onto RNA by three protein partners. Then, I have shown a direct interaction between the EJC core and the ASAP complex composed of RNPS1, Acinus and SAP18. Acinus, and most of all, RNPS1 are splicing enhancers when they are targeted to pre-mRNA. I wanted to understand the physiological role of these proteins bound to the EJC. If an EJC is loaded on each exonic junction, some RNA should contain at the same time the EJC and remaing introns. The presence of splicing factors recruted by the EJC could regulate splicing of the neighbouring introns. In parallel to this, I have studied the EJC in D. Melanogaster. In this organism, proteins homologus to the EJC core components are well conserved and implicated in a localization process never seen in human. However, EJC existence has never been demonstrated in drosophila

Le processus aléatoire des recombinaisons V(D)J permet d’obtenir un répertoire d’anticorps (Ac) ou immunoglobulines (Ig) hautement diversifié. En revanche, le caractère imprécis des jonctions V(D)J conduit à l’apparition de décalages du cadre de lecture dans deux tiers des cas. Ainsi, la plupart des cellules B hébergent des allèles d’Ig avec des réarrangements V(D)J non-productifs au sein de leur génome. Plusieurs études incluant celles menées au laboratoire ont montré que ces allèles non-productifs sont transcrits mais subissent une régulation post-transcriptionnelle impliquant le mécanisme de dégradation des ARNm appelé NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay ». Cette surveillance ARN diminue ainsi le taux d’ARNm codant pour des chaînes d’Ig tronquées. En revanche, l’impact de l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs sur la production d’Ig aberrantes reste jusqu’ici peu exploré. L’étude de ce processus appelé NAS (« Nonsense-associated Altered Splicing »), et en particulier du phénomène de saut d’exon, présente un grand intérêt car cet épissage alternatif peut permettre la synthèse d’Ig tronquées présentant des délétions internes. Les projets développés lors de cette thèse ont révélé la toxicité des chaînes d’Ig dépourvues de domaine variable (V) dans les plasmocytes, et mis en évidence l’existence d’un nouveau point de contrôle au cours de la différenciation plasmocytaire. Ce phénomène nommé TIE-checkpoint (Truncated-Ig Exclusion) conduisant à l’élimination des plasmocytes exprimant des Ig tronquées, est la conséquence d’un saut d’exon lors de l’épissage des transcrits Ig non-productifs. Pour étudier les évènements de NAS lors de l’épissage des transcrits d’Ig dans les plasmocytes, il faut par conséquent limiter l’activation du TIE-checkpoint. A l’aide d’un modèle murin présentant un exon non-sens additionnel au locus IgH, nous avons pu analyser in vivo l’épissage alternatif par « saut d’exon » des transcrits d’Ig non-productifs. En effet, l’élimination de cet exon addtionnel aboutit à la synthèse d’une chaîne d’Ig normale et non à la production de chaînes tronquées. Cette étude a été menée dans des cellules B primaires et des plasmocytes. Les résultats obtenus ont révélé que l’hypertranscription des gènes d’Ig, qui accompagne la différenciation plasmocytaire, favorise l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs, par un phénomène de saut d’exon. Nous avons également étudié les éventuelles connexions entre le mécanisme de NMD, impliqué dans la surveillance des ARNm, et l’UPR (« Unfolded Protein Response ») permettant de réguler l’homéostasie protéique dans les plasmocytes. De façon originale, nous avons identifié une boucle de régulation positive entre les processus de surveillance ARN (NMD) et protéique (UPR, autophagie, protéasome). La mise en évidence de cette coopération dans les plasmocytes constitue un exemple unique au vue de la littérature et, aurait pour effet de limiter la synthèse d’Ig tronquées tout en autorisant la synthèse massive d’Ig. Enfin, nous avons étudié le rôle de l’épissage des transcrits d’Ig non-codants (appelés transcrits I « germinaux ») au cours du processus de CSR « Class Switch Recombination ». Cette étude a apporté des précisions sur le rôle des sites donneurs d’épissage des exons I et révélé que la reconnaissance de ces sites d’épissage module l’intensité de la transcription de la région « switch » S adjacente, et par conséquent, son accessibilité à AID « Activation-Inducedcytidine Deaminase » lors de la CSR
The random V(D)J recombination process contributes to the generation of a vast immunoglobulin (Ig) repertoire. However, imprecise V(D)J junctions lead to the appearance of frameshift mutations in two-third of the cases. Hence, numerous B-lineage cells retain non-productively V(D)J rearranged Ig alleles in their genome. Several studies including ours have shown that these non-productive alleles are transcribed but rapidly degraded by NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay », thus decreasing the level of mRNA encoding truncated Ig. However, less is known about the impact of alternative splicing on non-productive Ig transcripts, and especially « exon skipping », with regard to the production of truncated Ig with internal deletions. During my thesis, we have shown that truncated Ig chains lacking variable (V) domain exhibted toxic effects in plasma cells revealing a new « Truncated-Ig Exclusion » (TIE-) checkpoint during plasma cell differentiation. The TIE-checkpoint eliminates plasma cell-expressing truncated Ig, as a consequence of exon skipping during splicing of non-productive Igκ transcripts. However, the TIE checkpoint activation limits the analysis of NAS (« Nonsense associated Altered Splicing ») of Ig transcripts in plasma cells. Using a mouse model harboring an additional frameshift-inducing V exon at the IgH chain locus, we could analyze NAS of non-productive Ig transcripts in primary B cells and plasma cells. This study revealed that hypertranscription of Ig genes accompanying plasma cell differentiation favors alternative splicing of non-productive Ig transcripts. We also investigated potential connections between the NMD mechanism, involved in mRNA surveillance, and the UPR (« Unfolded Protein Response ») pathway that regulates protein homeostasis in plasma cells. Interestingly, we identified a positive regulatory loop between RNA (NMD) and protein (UPR, autophagy, proteasome) surveillance processes. In view of the literature, the occurrence of such cooperation is unique to plasma cells, and this should help to limit the expression of truncated Ig while allowing massive Ig synthesis. Finally, we studied other aspects of Ig RNA splicing, and investigated the role of splice donor site on non-coding « germline » I transcripts during CSR (« Class Switch Recombination »). Using dedicated mouse models, we found that the deletion of Iƴ1 splice donor site drastically decreased CSR to IgG1. Overall, this study demonstrated that the recognition of I exon donor splice site enhances transcription of « switch » regions S, facilitating their opening and the subsequent recruitment of AID « Activation-Induced cytidine Deaminase » during CSR

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Biologia, Especialidade de Biologia Molecular
Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a quality control mechanism that detects and rapidly degrades mRNAs carrying premature translation-termination codons (PTCs). Mammalian NMD depends on both splicing and translation, and requires recognition of the premature stop codon by the cytoplasmic ribosomes. Surprisingly, some published data have suggested that nonsense codons may also affect the nuclear metabolism of the nonsense-mutated transcripts. Therefore, we hypothesized that human β-globin transcripts sensitive to NMD could have a singular subcellular localization and processing state in mammalian cells nuclei. To determine if PTCs could influence nuclear events, we have established mouse erythroleukemia (MEL) cell lines stably transfected with wild-type or PTC-containing human β-globin genes. Subsequently, we analyzed the accumulation of NMD-competent β-globin transcripts versus wild-type counterparts using two different approaches: visualization of transcripts localization by fluorescence in situ hybridization (FISH); and quantification of pre-mRNA steady-state levels by ribonuclease protection assays (RPA) and reverse transcription-coupled quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). FISH analysis shows that MEL cells stably expressing PTC-containing β-globin transcripts present a marked tendency to display an abnormal speckled-like pattern of localization in the nucleus. However, in addition to the presence of the PTC, other effectors may act on the β-globin transcripts localization, as some wild-type β-globin MEL cells presented this abnormal FISH phenotype as well. On the other hand, our analyses by RPA and RT-qPCR clearly show that β- -globin pre-mRNAs carrying NMD-competent PTCs, but not those containing a NMD-resistant PTC, exhibit a significant decrease in their steady-state levels relatively to the wild-type or to a missense-mutated β-globin pre-mRNA. Conversely, in non-erythroid HeLa cells, human β-globin pre-mRNAs carrying NMD-competent PTCs accumulate at normal levels. Half-life analysis of these pre-mRNAs in MEL cells demonstrate that their low steady-state levels do not reflect significantly lower pre-mRNA stabilities when compared to the normal control. Furthermore, our results also provide evidence that the relative splicing efficiencies of intron 1 and 2 are unaffected. In conclusion, our set of data highlights potential nuclear pathways that induce a selective downregulation of PTC-containing β-globin pre-mRNA in MEL cells, albeit not affecting their stability or splicing effectiveness. These specialized nuclear pathways, which may act in concert with the general NMD mechanism, might discriminate the NMD-sensitive transcripts as abnormal in a promoter- and/or cell line-specific manner, probably to obtain optimal NMD activity.
Fundação para a Ciência e Tecnologia - (SFRH/BD/31920/2006); financial support [Centro de Investigação em Genética Molecular Humana (CIGMH) and Center for Biodiversity, Functional and Integrative Genomics (BioFIG)]

Breast cancer is the most common malignancy affecting women in the Western world. At present, several risk factors have been identified and, among them, the most significant is a positive family history for the disease due to the presence of inherited predisposing germline alterations. Despite the discovery of many susceptibility genes, among which the highly penetrant BRCA1 and BRCA2 are the most relevant, more than 70% of the genetic predisposition to breast cancer remains unexplained. During my three-years Ph.D., I used different analytical approaches to investigate DNA alterations and loci that could be relevantly implicated in the aetiology and progression of hereditary breast cancers. As first project on non informative BRCA1/2 families, I was involved in the assessment of the pathogenetic role of the BRCA1 p.Val1688del allele, which recurs in the Northeast Italy. Unclassified variants (UVs) provide a considerable challenge in the clinical management of high-risk families. Indeed, the absence of conclusive data on UVs pathogenicity, due to the lack of an evident deleterious effect on protein function, prevents their use in the identification of individuals predisposed to breast cancer development. To assess the pathogenetic role of BRCA1 p.Val1688del, we used the integrated multifactorial likelihood model described by Goldgar et al. (2004). Several independent evidences were derived from epidemiologic and linkage studies as well as histopathology, LOH and evolutionary conservation analyses, in 12 families carrying the p.Val1688del allele. All the evidences were than properly evaluated to obtain, from each, the probability of the observed data given that the variant is a deleterious mutation, against the probability of the observed data under the hypothesis that the variant is neutral. The likelihood ratios were integrated to obtain a combined odd of variant causality, resulting in a clear assessment of the BRCA1 p.Val1688del pathogenicity. Indeed, the final integrated odd of 349,000:1 in favor of disease causality largely exceeds the established cut off 1,000:1 needed to state the deleterious effect of the variant. The second project, described herein, focused on the identification of molecular alterations involved in non-BRCA1/BRCA2 breast cancers. To this purpose, I performed a comprehensive genomic profile of the breast cancer cell line HCC1500, which was established from a patient who probably harboured a predisposing germline mutation affecting genes other than BRCA1 and BRCA2. Indeed, despite the early age of disease development and a positive family history for breast and colon cancer, we did not detect any deleterious BRCA1, BRCA2 or TP53 alteration. The HCC1500 cell line was analysed by two complementary approaches: i) a novel combined strategy named GINI (Gene Identification by NMD Inhibition; Noesie and Dietz, 2001) for the identification of nonsense mutations at the transcriptome level, and ii) a copy number alteration (CNA) analysis that was achieved by array-based high-density SNP genotyping. This approach led to the identification of genes specifically mutated by either point mutations or major genomic rearrangements. In particular, we identified an intronic substitution in the PNLIPRP3 gene, which is predicted to create a PTC by altering pre-mRNA splicing. Moreover, high-resolution CNA analysis allowed the detection of small homozygously deleted regions as well as focal amplifications, involving single or few genes. A gene selection based on the specific biological function and/or type of mutation and/or previously reported involvement in cancer pathways, allowed the definition of a relatively small number of candidate breast cancer genes that will deserve further and more specific investigation. Finally, among the minor research projects that I will not discuss in my thesis, I was also directly involved in studies carried out by our research group as part of an international consortium, named CIMBA (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2), whose aim is the identification of genetic factors implicated in the modification of BRCA1 and BRCA2 penetrance (Chenevix-Trench et al., 2007). Candidate single nucleotide polymorphisms (SNPs), most of which derived from genome-wide association studies, were genotyped in 213 BRCA1/2 mutation carriers from our cohort by the taqman allele discrimination technique, and subsequently statistically analyzed together with the data obtained from more than 30 study groups world-wide. The genotyping of SNP alleles in thousands of BRCA1/BRCA2 mutation carriers provide the necessary statistical power for the identification of significant association between common SNPs with typical low effects and specific subclasses of individuals at higher risk. These studies were carried out on more than 9400 BRCA1 and 5600 BRCA2 mutation carriers and allowed the identification of a significant association between rs3817198 in LPS1 and rs13387042 at 2q35 (already found to be associated with increased breast cancer risks in the general population) and increased breast cancer risk in BRCA2 and both BRCA1 and BRCA2 mutation carriers, respectively. The identification of genetic modifiers of breast cancer risk not only will favor a better understanding of breast cancer predisposition and pathogenesis but will also allow more precise cancer risk estimates and will represent a useful tool for the design of new therapeutic approaches.
Il tumore della mammella e’ la neoplasia più frequente nelle donne dell’Occidente. Ad oggi sono stati identificati alcuni fattori di rischio per lo sviluppo della neoplasia mammaria, ma il maggiormente significativo è la presenza di storia familiare, che è associata alla presenza nei membri della famiglia di alterazioni germinali predisponenti. Fino ad oggi sono stati identificati alcuni geni responsabili dell’aumento di rischio per lo sviluppo del tumore della mammella, tra cui i più rilevanti sono i geni ad alta penetranza BRCA1 e BRCA2. Tuttavia più del 70% dell’eccesso di rischio che si riscontra in casi familiari di tumore della mammella rispetto la popolazione generale non trova ad oggi un riscontro in alterazioni genetiche predisponenti. Durante il mio dottorato mi sono occupata dell’identificazione di alterazioni genetiche coinvolte nella predisposizione e progressione del tumore eredo-familiare della mammella in cui sono state escluse mutazioni chiaramente patogenetiche dei geni BRCA1/BRCA2. In un primo progetto ho partecipato alla caratterizzazione del ruolo patogenetico della variante BRCA1 p.Val1688del, identificata come variante di incerto significato clinico (Unclassified Variant, UV) e riscontrata frequentemente in pazienti provenienti dalla regione Veneto. In assenza di un chiaro effetto deleterio sulla funzionalità della proteina, le UV non possono essere utilizzate per l’identificazione e la sorveglianza degli individui ad alto rischio per lo sviluppo della neoplasia mammaria. Allo scopo di chiarire il ruolo patogenetico della delezione p.Val1688del, abbiamo utilizzato un approccio multi fattoriale, descritto da Golgar et al. (2004), attraverso il quale evidenze di diversa natura vengono integrate per derivare un rapporto di probabilità in favore della patogenicità o neutralità della variante. A questo scopo, i membri di 12 famiglie portatrici della variante sono stati analizzati per ottenere dati quali la co-segregazione della variante con il fenotipo tumorale, la co-presenza di mutazioni patogenetiche nel gene BRCA1, l’istopatologia del tumore, la perdita di eterozigosi (LOH) e la conservazione filogenetica del residuo aminoacidico alterato. Assunta l’indipendenza delle evidenze raccolte, i rapporti di probabilità associati a ciascuna evidenza sperimentale e clinica sono stati combinati, ottenendo un valore di 349000:1 in favore del ruolo patogenetico della variante, che supera di molto il cut off di 1000:1 stabilito per poter classificare la variante come alterazione predisponente. Il secondo progetto di cui mi sono occupata riguarda la definizione del profilo genetico della linea cellulare di carcinoma mammario HCC1500, derivata da una paziente con probabile tumore eredo-familiare della mammella. Nonostante l’età precoce di insorgenza e la storia familiare di tumore della mammella e del colon, il coinvolgimento dei geni BRCA1, BRCA2 e TP53 è stato escluso mediante screening mutazionale. La linea HCC1500 è stata quindi analizzata mediante due approcci complementari: i) l’identificazione di mutazioni nonsenso mediante l’utilizzo di un’approccio di analisi recentemente descritto chiamato GINI (Gene Identification by NMD Inhibition; Noesie and Dietz, 2001), e ii) l’identificazione di alterazioni numeriche mediante l’utilizzo di array per la genotipizzazione di un elevato numero di SNP, una recente tecnologia che permette un’elevata risoluzione di analisi. Mediante questo approccio è stato possibile identificare singoli geni mutati con specifiche alterazioni puntiformi o a causa di più estesi riarrangiamenti genomici. In particolare, nel gene PNLIPRP3 abbiamo identificato una sostituzione intronica che, modificando lo splicing del pre-mRNA, potrebbe dare origine ad un trascritto con mutazione troncante. Inoltre, l’elevata risoluzione dell’analisi per lo studio delle alterazioni cromosomiche numeriche, ci ha permesso di identificare singoli o pochi geni coinvolti in delezioni in omozigosi, amplificazioni di piccole regioni e riarrangiamenti intragenici derivanti da eventi di amplificazione o delezione. Sulla base di criteri quali la funzione biologica e mutazioni ritenute rilevanti per la selettività con cui alterano specifiche regioni codificanti, abbiamo selezionato alcuni geni che, prioritariamente ad altri, andrebbero confermati e analizzati in maggior dettaglio con ulteriori studi.. Un terzo progetto che ho seguito direttamente, ma che comunque non tratterò nella mia tesi, riguarda l’identificazione di fattori genetici coinvolti nella modificazione del rischio per i soggetti portatori di mutazione BRCA1 e BRCA2. Tale progetto si inserisce nell'ambito di un consorzio internazionale, denominato CIMBA (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2; (Chenevix-Trench et al., 2007). SNP identificati prevalentemente attraverso studi di associazione genome-wide sono stati genotipizzati in 213 carriers di mutazione BRCA1/2 della nostra casistica mediante discriminazione allelica con sonde TaqMan. L’analisi statistica è stata effettuata sui dati genotipici provenienti da più di 30 gruppi di lavoro, permettendo la raccolta di dati derivanti da migliaia di individui. In questo modo è possibile ottenere la potenza statistica necessaria per l’identificazione dell’associazione tra polimorfismi con debole effetto e un aumentato rischio di sviluppo del tumore della mammella in specifiche sottoclassi di soggetti già portatori di mutazione nei geni ad alta penetranza BRCA1/2. Effettuati su più di 9400 e 5600 carriers di mutazione rispettivamente di BRCA1 e BRCA2, tali studi hanno permesso di identificare un’associazione significativa tra gli SNP rs3817198 (LPS1) e rs13387042 (2q35) ed un aumentato rischio in soggetti portatori di mutazioni BRCA2, e, nel secondo caso BRCA1 o BRCA2. L’identificazione e studio di fattori genetici modificatori permetterà di acquisire una più approfondita conoscenza della predisposizione e patogenesi del tumore della ereditario mammella, ma anche di stimare con migliore precisione il rischio di sviluppo della neoplasia così come di fornire utili informazioni per l'identificazione di nuovi approcci terapeutici.

International Telemetering Conference Proceedings / October 28-31, 1996 / Town and Country Hotel and Convention Center, San Diego, California
The Ballistic Missile Defense Organization (BMDO) is developing new Theater Missile Defense (TMD) and National Missile Defense (NMD) weapon systems to defend against the expanding ballistic missile threat. In the arms control arena, theater ballistic missile threats have been defined to include systems with reentry velocities up to five kilometers per second and strategic ballistic missile threats have reentry velocities that exceed five kilometers per second. The development and testing of TMD systems such as the Army Theater High Altitude Area Defense (THAAD) and the Navy Area Theater Ballistic Missile Defense (TBMD) Lower Tier, and NMD systems such as the Army Exoatmospheric Kill Vehicle and the Army Ground-Based Radar, pose exceptional challenges that stem from extreme acquisition range and high telemetry data transfer rates. Potential Central Pacific range locations include U.S. Army Kwajalien Atoll/Kwajalein Missile Range (USAKA/KMR) and the Pacific Missile Range Facility (PMRF) with target launches from Vandenberg Air Force Base, Wake Island, Aur Atoll, Johnston Island, and, possibly, an airborne platform. Safety considerations for remote target launches dictate utilization of high-data-rate, on-board instrumentation; technical performance measurement dictates transmission of focal plane array data; and operational requirements dictate intercepts at exoatmospheric altitudes and long slant ranges. The high gain, high data rate, telemetry acquisition requirements, coupled with loss of the upper S-band spectrum, may require innovative approaches to minimize electronic noise, maximize telemetry system gain, and fully utilize the limited S-band telemetry spectrum. The paper will address the emerging requirements and will explore the telemetry design trade space.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
As mutações nonsense são mutações pontuais que originam codões de terminação prematura (PTCs). A expressão de genes portadores de PTCs pode levar à síntese de proteínas truncadas. As proteínas truncadas caracterizam-se por serem menores e, na maioria das vezes, não possuem função biológica, apesar de poderem ter funções deletérias para a célula. Em condições normais, transcritos portadores de PTCs são degradados rapidamente através do processo de nonsense mediated mRNA decay (NMD). Quando um PTC atinge o sítio A ribossomal, os fatores de terminação da tradução ligam-se ao mesmo e a tradução termina imediatamente. A terapia de supressão consiste numa abordagem terapêutica que tem o objetivo de utilizar compostos de baixo peso molecular para induzir a incorporação de aminoacil-tRNAs quase cognatos, moléculas que possuem complementaridade para dois dos três nucleótidos de um códão de stop, quando o ribossoma atinge um PTC. Assim, a tradução não termina prematuramente. Estudos anteriores mostraram que alguns aminoglicósidos possuem a capacidade de suprimir PTCs responsáveis por doenças, como fibrose quística e distrofia muscular de Duchenne. Algumas mutações nonsense são responsáveis pela β-talassemia. Neste estudo foram utilizados dois aminoglicósidos, canamicina e gentamicina, de modo a avaliar a sua capacidade em aumentar a competitividade de tRNAs quase cognatos com os fatores de terminação da tradução pelo sítio A ribossomal, na presença de um PTC, evitando dessa forma a terminação prematura da tradução.
Nonsense mutations are point mutations that originate premature termination codons (PTCs). The expression of PTC-containing genes may lead to the synthesis of truncated proteins. Truncated proteins are shorter proteins that at most times do not have biological function, but may have deleterious functions for the cell. In regular conditions, PTC-containing transcripts are taken to rapid decay, through nonsense mediated mRNA decay (NMD). When a PTC reaches the ribosomal A-site, translation release factors bind it and translation immediately stops. Suppression therapy is a therapeutic approach that aims to suppress PTCs by using low molecular weight compounds to induce the incorporation of near cognate aminoacyl tRNAs, molecules that show complementarity to two of the three nucleotides of a stop codon, when the ribosome reaches a PTC. Thus, translation does not prematurely terminates. Previous studies have shown that some aminoglycosides have the ability to suppress PTCs responsible for diseases like cystic fibrosis and Duchenne muscular dystrophy. Some nonsense mutations are responsible for β-thalassemia disease. In this study two aminoglycoside compounds, kanamycin and gentamicin, were used in order to evaluate their capacity to increase the competition of near cognate aminoacyl tRNAs with translation release factors by the ribosomal A-site, when the ribosome reaches a PTC, therefore avoiding the premature termination of translation.

UPF1 (Up-Frameshift 1) est une hélicase multifonctionnelle conservée chez tous les eucaryotes. Elle est essentielle à la voie de surveillance du NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay), qui dégrade des ARNm portant un codon stop prématuré. UPF1 est l’archétype d’une famille d’hélicases qui partagent des corps similaires mais sont impliquées dans des voies cellulaires variées. Cependant, les relations structure-fonction et les caractéristiques biophysiques intrinsèques de ces moteurs moléculaires restent à ce jour peu connues. In vitro, le coeur hélicase d’UPF1 est hautement processif, il traverse des milliers de bases sur l’ARN ou l’ADN et déroule des doubles brins. Dans ce travail, nous avons cherché les facteurs clés régissant cette remarquable processivité en combinant des techniques de biochimie et de biophysique. En particulier, nous avons utilisé des pinces magnétiques pour étudier en temps réel des hélicases à l’échelle de la molécule unique. Contrairement à UPF1, l’hélicase IGHMBP2 de la famille UPF1-like n’est pas processive ; la processivité n’est donc pas un trait conservé au sein de la famille. Grâce à une étude fine de la structure 3D des deux hélicases, nous avons conçu divers mutants que nous avons utilisés pour identifier les éléments structuraux qui modulent la processivité. Notre approche révèle qu’UPF1 a une prise très ferme sur les acides nucléiques, garantissant de longs temps de résidence et d’action qui dictent sa haute processivité. Grâce à la variété de comportements des mutants, nous avons construit un modèle mécanistique expliquant le lien entre énergie d’interaction et processivité. Nous démontrons aussi que la processivité d’UPF1 est requise pour un processus de NMD efficace in vivo. Nous avons utilisé les mêmes outils biochimiques et biophysiques pour étudier une isoforme naturelle d’UPF1 humaine se déplaçant plus vite que l’isoforme majeure, et pour comparer la régulation d’UPF1 humaine et de levure par leurs domaines flanquants. Nous avons également caractérisé l'interaction d’UPF1 de levure avec de nouveaux partenaires. Nos travaux montrent comment la combinaison d'outils biochimiques, biophysiques, structuraux etin vivo offre des aperçus inattendus quant au mode de fonctionnement des moteurs moléculaires
UPF1 (Up-Frameshift 1) is a multifunctional helicase that unwinds nucleic acids and is conserved throughout the eukaryote kingdom. UPF1 is required for the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) surveillance pathway, which degrades mRNAs carrying premature termination codons, among other substrates. UPF1 is the archetype of a family of 11 helicases sharing similar cores but involved in various cellular pathways. However, the structure-function relationship and intrinsic biophysical properties of these molecular engines remain poorly described. In vitro, the UPF1 helicase core is highly processive, it travels along thousands of RNA or DNA bases and unwinds double-strands. In this work, we looked for key factors governing this remarkable processivity. We combined biochemical and biophysical techniques. In particular, we used magnetic tweezers to study helicases in real time at a single molecule scale. In contrast to UPF1, the related IGHMBP2 is not processive, thus processivity is not a shared family trait. Based on the 3D structures of both proteins, we designed various mutants and used them to identify structural elements that modulate processivity. Our approach reveals that UPF1 has a very firm grip on nucleic acids, guaranteeing long binding lifetimes and action times that dictate its high processivity. Thanks to the variety in mutant behaviors, we built a novel mechanistic model linking binding energy to processivity. Furthermore, we show that UPF1 processivity is required for an efficient NMD in vivo. In addition, we used the same biochemical and biophysical tools to investigate a natural human UPF1 isoform moving faster than the major isoform, and to compare the regulation of human andyeast UPF1 by their flanking domains. We also characterized the interaction of yeast UPF1 with new NMD partners. Our work shows how a combination of biochemical, biophysical, structural and in vivo tools can offer unexpected insights into the operating mode of molecular motors

Le processus de recombinaison V(D)J des gènes d’immunoglobulines (Ig) est caractérisé par une grande imprécision des jonctions entre les segments variables (V), de diversité (D) et de jonction (J). Deux fois sur trois, un décalage du cadre de lecture apparaît, aboutissant à une jonction non productive dite « hors phase ». Plusieurs études ont démontré que les deux allèles productifs et non-productifs sont activement transcrits. Les transcrits matures issus des allèles non-productifs sont pris en charge par un mécanisme de surveillance des ARNm appelé NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay ». En dégradant efficacement les ARNm d’Ig contenant des codons non-sens, ce mécanisme prévient l’apparition des Ig tronquées au cours de l’ontogénie B. Néanmoins, aucune étude n’a jusqu’ici analysé l’impact de l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs. Ce phénomène appelé NAS « Nonsense-associated Altered Splicing » peut conduire à une production d’Ig tronquées présentant des délétions internes du domaine variable (V).Les projets développés lors de cette thèse ont montré que la présence d’un codon non-sens, au niveau de l’exon variable (VJ) des transcrits Igκ, favorise le saut d’exon et la production de chaînes légères dépourvues de domaine variable (ΔV-κLCs). De façon intéressante, ces Ig tronquées provoquent un stress cellulaire et conduisent à l’apoptose des plasmocytes (Article 1). Ces observations ont permis d’identifier un nouveau point de contrôle agissant tardivement lors de la différenciation plasmocytaire : le TIE « Truncated-Ig Exclusion » checkpoint. Ce processus de contrôle provoque l’élimination des plasmocytes qui produisent des chaînes d’Ig tronquées. Nous avons également étudié l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs en l’absence de TIE-checkpoint (Article 2). Cette étude a révélé que l’hypertranscription des gènes d’Ig dans les plasmocytes favorise l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs. En utilisant un modèle d’expression forcée d’Ig tronquées, nous avons mis en évidence une coopération entre les mécanismes assurant la surveillance des ARNm (NMD) et la surveillance au niveau protéique (UPR : « Unfolded Protein Response », autophagie) (Article 3). Sur la base de ces résultats, nous avons mis au point une nouvelle approche thérapeutique qui consiste à forcer la production d’Ig tronquées en utilisant des oligonucléotides anti-sens (AON) capables de provoquer l’élimination de l’exon variable lors de l’épissage. Cette invention pourrait ouvrir des perspectives thérapeutiques pertinentes dans le traitement du Myélome Multiple et d’autres pathologies touchant les plasmocytes
The recombination process V(D)J of immunoglobulin (Ig) genes is characterized by random junctions between the variable (V), diversity (D) and joining (J) segments. A frameshift mutation appears in two-third of cases, generating a non-productive or « out of frame » junction. Several studies have shown that both productive and non-productive alleles are actively transcribed. The mature transcripts from nonproductive alleles are usually considered sterile and innocuous as a result of an mRNA surveillance mechanism called NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay ». By degrading aberrant mRNA, this mechanism prevents the appearance of truncated Ig during B cell ontogeny. However, less is known about the impact of alternative splicing on non-productive Ig transcripts. This mechanism, called NAS « Nonsense-associated Altered Splicing » can lead to the production of truncated Ig with internal deletions of variable domain (V). During my thesis, we have shown that the presence of a stop codon, within the variable exon (VJ) of Igκ transcripts, promotes exon skipping and synthesis of V domain-less κ light chains (ΔV-κLCs). Interestingly, such truncated Ig causes cellular stress and leads to plasma cells apoptosis (Article 1). These findings have identified a new checkpoint acting late during plasma cell differentiation: TIE « Truncated-Ig Exclusion » checkpoint. This process ensures counter-selection of plasma cells producing truncated-Ig. We also studied the alternative splicing of non-productive Ig transcripts in the absence of TIE-checkpoint (Article 2). We found that hypertranscription of Ig genes in plasma cells promote alternative splicing of non-productive Ig transcripts. Using a model forcing the expression of truncated Ig, we identified a cooperative action between mRNA surveillance mechanisms (NMD) and those of protein surveillance (UPR « Unfolded Protein Response », autophagy) (Article 3). Based on these results, we have developed a new therapeutic approach by increasing the production of truncated Ig using antisense oligonucleotides (AON) that leads to the elimination of the variable exon during splicing. This invention could open new avenues for the treatment of Multiple Myeloma patients and other pathologies affecting plasma cells

Diploma´s thesis “ A set of row attached low energy houses for living in Vážany nad Litavou ” is elaborated in form of project documentation which includes all requirements of given standards. The object is placed on plat number 1746 in cadastral community Vážany nad Litavou. The character of the object is brick building. The building is covered gabled roof. It is two-floor house with no cellar. There is living room, kitchen, bedroom with it´s own sanitary facility and technical room in the ground floor. There are bedrooms with sanitary facilities in the second floor. The thesis is worked up as a complete implementation building plan.