Dissertations / Theses on the topic 'Núcleos celulares'

A assinatura digital é um histograma representativo de conjuntos de características de textura da cromatina do núcleo celular observado por microscopia óptica convencional. A assinatura digital é obtida através de análise de imagem computadorizada. Tal método permite o estudo do núcleo celular em material citológico e tecidos histológicos normais ou que apresentem alterações morfológicas relacionadas a processos patológicos. O objetivo principal deste trabalho foi caracterizar núcleos celulares de forma específica desenvolvendo um método de visualização de parâmetros de textura de cromatina (assinatura nuclear digital) que permitisse ainda avaliar alterações teciduais através do grau de desvio da normalidade apresentado por seus núcleos. Foram estudadas 93 características descritivas da distribuição espacial e estatísitca da textura de cromatina de imagens digitais de alta resolução de 5.045 núcleos celulares provenientes de 32 espécimes de tecido prostático. A próstata foi utilizada por ser o protótipo de desenvolvimento do laboratório de imagens biomédicas do Centro de Ciências Ópticas da Universidade do Arizona, nos Estados Unidos. Foram desenvolvidos e padronizados métodos para visualização de características de textura nuclear (assinaturas digitais) e de áreas de tecido (assinaturas de padrão histológico) e para quantificação do grau de desvio de células e áreas de tecido de interesse em relação à população notmal de referência (distância padronizada da população celular normal). Tal método, que pode ser utilizado sem restrições em qualquer material colhido e preparado por técnicas convencionais para estudo citológico ou histológico demonstrou sensibilidade para detectar alterações subvisuais na textura da cromatina de células aparentemente normais, próximas de lesões pré-neoplásicas e neoplasias malignas. Tais potencialidades podem aumentar a sensibilidade diagnóstica dos métodos de investigação baseados nesse tipo de material.
The digital signature is a histogram representing a set of nuclear chromatin texture features under conventional microscopy. It is obtained by computerized image analysis procedures and allows the study of cytologic and histologic material. The main goal of this project was to characterize nuclei in a specific manner by developing a chromatin texture signature and to characterize histologic tissue by means of their composition of nuclei with di verse degrees of deviation from normal. A set of 93 features descriptive of the spatial and statistical distribution of nuclear chromatin was computed for each of 5,045 nuclei from 32 specimens of prostatic tissue ranging from normal appeating tissue to intraepithelial lesions and adenocarcinoma. The prostate is the organ used as prototype to develop the digital signature technology at the Arizona Optical Sciences Center, USA. Standardized methods to visually inspect nuclear chromatin texture features (digital signatures) and tissue areas (histologic pattem signature) were developed. And a standardized distance from normal numerical profile was developed. The digital signature can be applied without any restriction to ali cytologic and histologic material sampled by biopsy, exfoliative and aspirative techniques. The digital signatures are also capable of detecting subtle changes of the chromatin pattern of normal appearing cells at the vicinity of precursor lesions and carcinomas. Such potentíal may have a positive impact on the sensitivity of methods based on citologic and histologic studies.

O câncer colorretal é um tumor maligno freqüente no mundo ocidental. É o terceiro em freqüência e o segundo em mortalidade nos países desenvolvidos. No Brasil está entre as seis neoplasias malignas mais encontradas e a quinta em mortalidade. Dos tumores colorretais, aproximadamente 40% estão localizados no reto. A sobrevida, em cinco anos, dos pacientes operados por câncer do reto varia entre 40% e 50%, estando os principais fatores prognósticos, utilizados na prática clínica corrente, baseados em critérios de avaliação clínico-patológicos. A avaliação das alterações morfométricas e densimétricas nas neoplasias malignas tem, recentemente, sido estudadas e avaliadas através da análise de imagem digital e demonstrado possibilidades de utilização diagnóstica e prognóstica. A assinatura digital é um histograma representativo de conjuntos de características de textura da cromatina do núcleo celular obtida através da imagem computadorizada. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos núcleos celulares neoplásicos no adenocarcinoma primário de reto pelo método da assinatura digital e verificar o valor prognóstico das alterações nucleares da textura da cromatina nuclear para esta doença. Foram avaliados, pelo método de análise de imagem digital, 51 casos de pacientes operados no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) entre 1988 e 1996 e submetidos à ressecção eletiva do adenocarcinoma primário de reto, com seguimento de cinco anos pós-operatório, ou até o óbito antes deste período determinado pela doença, e 22 casos de biópsias normais de reto obtidas de pacientes submetidos a procedimentos endoscópicos, para controle do método da assinatura digital. A partir dos blocos de parafina dos espécimes estocados no Serviço de Patologia do HCPA, foram realizadas lâminas coradas com hematoxilina e eosina das quais foram selecionados 3.635 núcleos dos adenocarcinomas de reto e 2.366 núcleos dos controles da assinatura digital, totalizando 6.001 núcleos estudados por análise de imagem digital. De cada um destes núcleos foram verificadas 93 características, sendo identificadas 11 características cariométricas com maior poder de discriminação entre as células normais e neoplásicas. Desta forma, através da verificação da textura da cromatina nuclear, foram obtidos os histogramas representativos de cada núcleo ou conjunto de núcleos dos grupos ou subgrupos estudados, também no estadiamento modificado de Dukes, dando origem às assinaturas digitais correspondentes. Foram verificadas as assinaturas nucleares, assinaturas de padrão histológico ou de lesões e a distribuição da Densidade Óptica Total. Houve diferença significativa das características entre o grupo normal e o grupo com câncer, com maior significância para três delas, a Área, a Densidade Óptica Total e a Granularidade nuclear. Os valores das assinaturas médias nucleares foram: no grupo normal 0,0009 e nos estadiamentos; 0,9681 no A, 4,6185 no B, 2,3957 no C e 2,1025 no D e diferiram com significância estatística (P=0,001). A maior diferença do normal ocorreu no subgrupo B de Dukes-Turnbull. As assinaturas nucleares e de padrão histológico mostraram-se distintas no grupo normal e adenocarcinoma, assim como a distribuição da Densidade Óptica Total a qual mostra um afastamento progressivo da normalidade no grupo com câncer. Foi possível a caracterização do adenocarcinoma de reto, que apresentou assinaturas digitais específicas. Em relação ao prognóstico, a Densidade Óptica Total representou a variável que obteve o melhor desempenho, além do estadiamento, como preditor do desfecho.
Colorectal cancer is a frequent malignancy in the western world, being the third cancer in frequency and the second in mortality in developed countries. In Brazil, it is among the six more frequently found neoplasias, being the fifth tumor as cause of death. Of all colorectal tumors, approximately 40% are located in the rectum. The 5-year survival rate for patients with rectal cancer is 40% to 50%. Currently, the main prognostic factors in clinical practice are based on clinicopathologic criteria. Recently, the study of pathologic changes in malignant nuclei, through analysis of digital images, was introduced showing potential use as a diagnostic tool and a prognostic predictor. It is visualized as a “digital signature”, which is displayed as a histogram descriptive of the nuclear chromatin texture obtained through computerized image. The aim of this study was to characterize the nuclear signature in a large series of rectal carcinomas, assessing the prognostic value of nuclear chromatin texture patterns in these type of tumors. Samples were obtained from 51 patients operated on for rectal adenocarcinoma and from endoscopic biopsies of 22 health subjects at the University Training Hospital (Hospital de Clínicas de Porto Alegre, HCPA), Porto Alegre, RS, Brazil, between 1988 and 1996. The sample consisted of 2.366 nuclei from normal controls and 3.635 nuclei from rectal cancer specimens paraffin-embedded, obtained at the Pathology Unit, HCPA. Therefore, a total of 6.001 HE-stained nuclei were included in the study. Ninety-three nuclear features were investigated to each nucleus. Eleven karyometric XVI features were identified as distinctive for rectal tissue. Three of them presented statistically significant differences: nuclear area, total optical density (OD) and clumpness.Likewise, comparison between average nuclear signature values also presented statistical significance, with a higher difference between patients classified as Dukes’ stage B and normal controls. Average values were 0,0009; 0,9681; 4,6185; 2,3957; 2,1025 for controls and Dukes A through D, respectively (p=0,001). Digital signatures and OD showed distinct patterns between cancer and controls, with a progressive deviation from normal values. It was possible to characterize the rectal adenocacinoma, which showed specific digital signatures. Along with cancer staging, OD was the karyometric feature with the highest prognostic value.

Nas últimas décadas os Esteroides Anabólicos Androgênicos (EAAs) vêm sendo utilizados por atletas de elite, em maior parte, aqueles envolvidos em esportes de força e velocidade, para melhora do desempenho físico nas competições. Porém, o abuso destes produtos passou a ser feito por frequentadores de academias, mais interessados nas alterações provocadas na composição corporal, observados com o aumento da massa magra e na redução da gordura subcutânea. Pouco se sabe sobre a atuação dos EAA no cérebro humano, havendo alterações no comportamento agressivo, ansiedade e depressão. Resolvemos então estudar a perda neuronal pelo uso e abuso de Esteróides Anabolizantes em camundongos. Para isso utilizamos 60 camundongos da linhagem Swiss, sendo 30 machos e 30 fêmeas, vindos do Biotério Central da Universidade Federal de Alfenas. Um grupo de 20 animais foi tratado com Deposteron® (Cipionato de Testosterona); outro grupo de 20 animais foi tratado com Winstrol Depot® (stanozolol); e um último grupo de 20 animais foi tratado com salina para o grupo controle. Todos foram submetidos à natação por 15 minutos. Após a fase de tratamento, os animais foram submetidos a três testes comportamentais: análise de ansiedade, memória e reconhecimento de objetos e atividade motora em campo aberto. Finalizado o tratamento e os testes, os animais foram sacrificados através do método de inalação de Alotano®. Retiramos os encéfalos e estes foram armazenados em solução de formaldeído a 4% por 24 horas. De cada encéfalo foram retiradas amostras homotípicas da região média do cérebro em cortes frontais para que possamos avaliar as áreas então estabelecidas para este estudo. Os resultados das análises da estimativa dos perfis celulares de corpos de neurônios mostraram que houve uma diminuição do número de perfis no núcleo pálido dos animais tratados com Wintrol Depot®. As análises dos testes comportamentais mostraram que a administração de EAAs nos animais gerou um quadro de ansiedade e apatia, e também uma diminuição da capacidade de reconhecimento de objetos. Por outro lado, não alterou a capacidade motora e nem a memória recente desses animais tratados. Em conjunto, esses resultados nos permite inferir que o uso inadequado e sem orientação médica de EAAs pode levar a degenerações celulares, perda das atividades cerebrais e alterações comportamentais graves ao usuário de tal fármaco.
In the last decades, Anabolic-Androgenic Steroids (AAS) or Anabolic Steroids have been used mostly by elite athletes involved in sports that require strength and speed in order to improve their physical performance in competitions. Nevertheless, the abuse of these drugs has been also expanded to gym customers interested in body composition alterations seen by means of lean body mass increase and subcutaneous fat reduction. Few are known about AAS action in human brain, but there are evidences of changes in aggressive behavior, anxiety and depression. Thus, we aimed to study the neuronal loss by the use and abuse of AAS in mice. For doing so, we used 60 Swiss mice, 30 males and 30 females, proceeding from the Central Biotery of the Alfenas Federal University. A group of 20 animals was treated with testosterone cypionate (Deposteron®); another group of other 20 animals was treated with stanozolol (Winstrol Depot®); and a control group involving other 20 animals was treated with saline solution. All animals of the three groups were put under daily 15-minute swimming exercise during 30 days of treatment in an attempt to generate the same stress conditions that a physical exercise. After treatment, all animals were submitted to three behavioral tests: anxiety analysis, memory and recognition of objects and motor activity in the open field. Ending treatment and tests, the specimens were euthanized by halothane inhalation. Their brains were withdrawn and stored in 4% formaldehyde solution for three weeks. From each brain we took homotypic transverse section samples from its middle area to evaluate the areas proposed for our study. The results of estimated profile analyses of neuron cell bodies showed that there was a decrease of their number in pallidum of animals treated with Wintrol Depot®. Besides that, behavioral tests analyses confirmed that AAS administration in these animals caused anxiety and apathy and a decrease in the ability of recognizing objects; on the other hand, we do not observed change in motor ability nor in recent memory of animals so treated. Such results allowed to conclude that the abuse of AAS, without medical orientation, can lead us to cell degeneration, cerebral and cognitive activity loss and severe behavioral changes.

The connection between DNA folding and chromatin conformation has been much studied but the relation between the modulation of chromatin conformation and biological processes such as DNA damage, cell differentiation and DNA replication, still remains unclear. To better understand these mechanisms, an interdisciplinary study combining several technologies is required to provide an integrative view of what happens from the level of nucleosome interactions up to whole genome organisation. In this thesis, we aimed to set up chromatin conformation methodologies such as Hi-C and Micro-C to analyse the effect of DNA damage and cell differentiation on 3D chromatin structure. Chromatin structure is affected by DNA damage caused by UV irradiation or oxidative stress. In our study, the effects of UV irradiation and oxidative stress on 3D genome structure were analysed from nucleosome positioning to chromatin conformation. Molecular Dynamics simulation and Coarse grained modelling provided a 3D model of the whole genome of Saccharomyces cerevisiae in normal and stressed conditions. The conditions of UV irradiation that was applied created a decrease of chromatin interactions increasing chromatin flexibility. In addition, oxidative stress induced chromatin changes with an increase of inter-chromosomal interactions and a reduction of intra-chromosomal interactions. These effects were associated with a decrease in the number of chromatin interaction domains (CID) as well as the insulation score. The reduction of CID is correlated with a reduction of cohesin loading factor complex (SCC2/SCC4) bound to the chromatin upon oxidative stress. In addition, nucleosome contacts were globally reduced, especially in upregulated genes and DNA damaged regions. Concerning nucleosome positioning, a general increase of the fuzziness score was observed both in upregulated and downregulated genes, and in regions of DNA damage in response to oxidative stress. Overall, our results showed a decrease in the number of nucleosomes and a tendency of the chromatin to be more open at short-range distances while, at long-range distances, the genome seems to be more compact in response to oxidative stress. One hypothesis could be that chromatin decondensation can contribute to facilitate DNA repair. MD simulations were used to build two models: one at the scale of the chromatin fibre and the other one for the whole genome. Finally, high resolution microscopy combined with Capture-MNase-Seq, Capture-Hi-C and coarse grain models were used to study the conformational changes occurring during cell reprograming from fibroblast to hiPSC. A specific region containing NANOG and STELLA loci as well as GADPH and IFFO1 as control genes was selected. Capture- MNase-Seq and Capture-Hi-C revealed that nucleosomes tend to be fuzzier in the pluripotent hiPSC cells and that the TADs were reorganized during cell differentiation.

This work is focused on Barrier-to-Autointegration Factor (BAF) protein. BAF is a nuclear envelope (NE) component that binds chromatin and is required for NE reassembly (NER) at mitosis exit. Previous work in our group showed that, in Drosophila, a small fraction of BAF (cenBAF) associates with the centromere. BAF function is regulated by cycles of phosphorylation and dephosphorylation. At the entry of mitosis, BAF is phosphorylated by VRK1/NHK1 kinase and is released from chromatin and the NE. At mitosis exit, protein phosphatase 2A (PP2A) dephosphorylates BAF, which resumes binding to chromatin and promotes NER. Here, we find that cenBAF remains bound to the centromere during mitosis by the action of protein phosphatase 4 (PP4), which is recruited to the centromere by the constitutive centromere component CenpC. At the same time, BAF stabilizes CenpC and PP4 at the centromere forming a functional centromeric network essential for faithful chromosome segregation. Disrupting centromeric localization of PP4 destabilizes cenBAF at centromeres and induces ectopic PP2A-mediated dephosphorylation of free phosphoBAF (pBAF) in mitosis, which results in the accumulation of BAF in a perichromosomal layer surrounding the chromosomes. Concomitantly, NE disassembly/reassembly during mitosis is altered resulting in micronuclei formation and cells with altered NE morphology. This suggests that CenpC, PP4 and cenBAF form a centromeric network that signals pBAF dephosphorylation at mitosis exit by regulating PP2A activity. We also identify T4 and S5 as the main BAF phosphosites in Drosophila and study the actual contribution of PP4 and PP2A to pBAF dephosphorylation.
El present treball se centra en l'estudi de la proteïna Barrier-to-Autointegration Factor (BAF). BAF és una proteïna de la membrana nuclear (MN) que s'uneix a la cromatina i té un paper essencial en el reassemblatge de la MN al final de la mitosi. BAF ha estat descrit per primer cop en el nostre grup com una nova proteïna centromèrica (cenBAF) a Drosophila. La localització de BAF durant el cicle cel·lular està regulada per cicles de fosforilació i defosforilació. A l'entrada de mitosi BAF és fosforilat per la kinasa VRK1/NHK1 perdent la seva afinitat per unit cromatina i la MN. Aquesta situació es manté fins que PP2A desfosforila BAF al final de la mitosi, retornant al seu estat inicial. En el present treball es mostra que BAF es manté al centrómer durant la mitosi degut a l'acció de PP4 que és reclutada al centrómer per CenpC. Al seu torn cenBAF estabilitza la localització de CenpC i PP4 al centrómer formant un entramat centromèric responsable de garantir la correcta segregació dels cromosomes. L'alteració d'aquest entramat centromèric desemboca en la desregulació de l'activitat de PP2A sobre phosphoBAF (pBAF) soluble, observant-se com a resultat una acumulació de BAF desfosforilat envoltant els cromosomes a metafase i com a conseqüència, provocant la formació de micronuclis i alteracions en la morfologia nuclear. També hem indentificat T4 i S5 com els principals residus implicats en la fosforegulació de BAF a Drosophila i hem estudiat la contribució de PP4 i PP2A sobre la desfosforilació de BAF.

Introdução. O complexo amigdalianohumano é formado por diversos núcleos. Pouco se sabe sobre núcleo cortical da amigdala, o qual faz parte da denominada amígdala vomeronasal. Pouco é conhecido de seus componentes celulares, suas conexões e funções em seres humanos até o momento. Objetivos. Descrever os componentes neuronais presentes no núcleo cortical da amígdala humana, buscando obter dados sobre sua morfologia, caracterizando-os pelo formato do soma, número de dentritos primários e padrão de ramificação, além da presença, distribuição, densidade e forma dos espinhos dendríticos locais. Materiais e métodos. Foram estudadas peças anatômicas do lobo temporal de muitos hemisférios cerebrais obtidas de homens adultos post-mortem (N= 8, 47-68 anos) e submetidas à técnica de tionina, à técnica de imunohistoquimica para a proteína ácida fibrilar glial e à técnica de Golgi adaptada para o tecido humano fixado em formol a 10% por longa data. A obtenção de imagens foi realizada empregando-se microscópio de luz acoplada a computador com programa de análise de imagem (image-Pro Plus 7.0). Para a elaboração das imagens dos neurônios e sua forma geral bidimensional foi utilizado o programa Adobe Photoshop CS3 (EUA). Para a reconstrução tridimensional dos espinhos dendríticos foi desenvolvido algorítmo de processamento de imagens. Resultados Foram observados astrócitos protoplasmáticos e identificadas 10 formas neuronais diferentes no núcleo cortical da amigdala humana, a saber: neurônios piramidal modificado (pyramidal-like), fusiforme, angular-esférico, triangular, retangular, poligonal-estrelado, redondo-cônico, pear shaped, fork-like e "pequeno". Espinhos com formato fino (thin), achatado (stubby), espesso (wide), de tipo cogumelo (mushroom), ramificado (ramified), atípico ou de transição (atypical or trasitional) foram observados em todos os neurônios estudados, guardadas particularidades de ramificação dedrítica de cada um deles. Conclusão. O núcleo cortical da amígdala humana apresenta neurônios tipo piramidal-like. Isso lhe confere características de área de transição para o alocórtex e de área de surgimento evolutivo de tais neurônios no continuum subcortical-alocórtex-neocórtex. Muito importante toda a diversificada celularidade encontrada neste núcleo pode significar que esta região desempenhe múltiplas funções de integração e processamento de informações em seres humanos.

A presente tese é dividida em dois capítulos: o primeiro capítulo descreve a síntese de nanopartículas (NPs) de Ta2O5 a partir de líquidos iônicos (LIs) hexaclorotantalato de 1-n-alquil-3-metilimidazólio (alquil = butil: BMI.TaCl6, decil: DMI.TaCl6) e sua aplicação na fotogeração de gás hidrogênio a partir da decomposição da molécula de água (processo water splitting). Esta rota visa utilizar as propriedades intrínsicas dos LIs para atuarem como agentes precursores e estabilizantes na formação de espécies nanométricas de Ta2O5. Por MET verificou-se que as NPs preparadas através da hidrólise dos adutos BMI.TaCl6 e DMI.TaCl6 apresentaram diâmetro médio de 8 e 2 nm, respectivamente, indicando uma influência significativa do cátion do LI na formação e estabilização das NPs. A análise de MET no modo difração de elétrons revelou que as NPs de Ta2O5 como preparadas são cristalinas, embora as análises de DRX indiquem a presença de um material amorfo. A otimização dos parâmetros de síntese e fotocatálise (agente de sacrifício, quantidade de catalisador) gerou uma maximização na fotoprodução de H2. A amostra DMI 1:0,5 apresentou uma excelente atividade fotocatalítica na geração de H2 utilizando etanol como agente de sacrifício (eficiência quântica aparente de 17% e taxa de fotogeração de H2 de 7,2 mmol H2.h-1.g-1). As atividades fotocatalíticas das NPs de Ta2O5 como preparadas foram superiores quando comparadas às amostras calcinadas. Estes resultados podem estar relacionados à presença de LI remanescente nas amostras, o qual gera regiões hidrofílicas facilitando a aproximação das moléculas de água nos sítios ativos do catalisador e favorecendo a reação fotocatalítica, enquanto que nas amostras calcinadas ocorre a perda do LI após o tratamento térmico. Na tentativa de aumentar a produção de H2 foi realizado uma deposição de nanopartículas de Pt pela técnica de sputtering sobre a superfície das NPs de Ta2O5. A amostra DMI 1:0,5 Pt foi capaz de aumentar a taxa de produção de H2 em 30% (9,2 mmol H2.h-1.g-1) durante o processo de water splitting. O segundo capítulo apresenta a síntese, caracterização e estudo fotofísico de novos derivados do núcleo 2,1,3-benzotiadiazola (BTD) fluorescentes com pontencial aplicação como marcadores celulares. Para isso, foram sintetizados quatros corantes que contém em sua estrutura anéis de imidazólio ligados a um núcleo BTD que é responsável pela fluorescência destes compostos. A obtenção do 4,7-bis-(imidazólio-3-il)-2,1,3-benzotiadiazol (BTDIm) foi realizada a partir da reação de acoplamento entre BTD e o imidazólio em presença de uma base, com rendimento de 82%. Os demais compostos foram sintetizados a partir da 4,7-bis-imidazol-2,1,3-benzotiadiazola e reações de alquilação com iodeto de metila, ácido clorídrico ou ácido cloro-acético, produzindo respectivamente os sais: iodeto de 4,7-bis-metilimidazólio-2,1,3-benzotiadiazola (BTDImMe), cloreto de 4,7-bis-(imidazólio-3-il)-2,1,3-benzotiadiazol (BTDImH), cloreto de 4,7-bis-ácidoacéticoimidazólio-2,1,3-benzotiadiazola (BTDImAc) em rendimentos de 87%, 70% e 38%, respectivamente. Os corantes foram caracterizados por IV, RMN 1H e 13C, ESI-MS e análise fotofísica por UV-Vis e emissão de fluorescência. Os compostos sintetizados foram testados como marcadores celulares. O melhor resultado foi obtido com o composto BTDIm, o qual se mostrou um marcador altamente seletivo para lisossomos com excelente sinal de fluorescência.
The present Thesis is divided in two chapters: the first one describes the synthesis of Ta2O5 nanoparticles (NPs) from 1-n-alkyl-3-methylimidazolium hexachlorotantalate (alkyl = butyl: BMI.TaCl6, decyl: DMI.TaCl6) ionic liquids (ILs) and their application in the photogeneration of hydrogen gas from the decomposition of water molecule (water splitting process). By this route it is desired the use of intrinsic properties of ILs to act as precursors and stabilizing agents in the formation of nanosized Ta2O5 particles. TEM analyses showed that NPs prepared from the hydrolysis of BMI.TaCl6 and DMI.TaCl6 have mean diameters of 8 and 2 nm, respectively, indicating a significant role of the IL cation on the formation and stabilization of the NPs. In the electron diffraction mode, TEM revealed that the as-prepared Ta2O5 NPs are crystalline, although the XRD suggested the presence of amorphous material. The optimization of the synthesis parameters and photocatalysis (sacrificial agent, catalyst amount) gives maximization in the hydrogen photoproduction. The sample DMI 1:0,5 showed an excellent photoactivity in the hydrogen generation using ethanol as sacrificial agent (apparent quantum efficiency of 17% and hydrogen production of 7,2 mmol H2.h-1.g-1). The photoactivities of the as-prepared Ta2O5 NPs were superior to those obtained for the thermal treated samples. These results can be related to the presence of remained IL in the samples, which provides hydrophilic regions helping in the water molecule approach to the catalyst active sites favoring the photocatalytic reaction, while in thermal treated samples there is a loss of IL after the treatment. In order to improve the hydrogen production, Pt NPs were deposited by sputtering technique onto the surface of Ta2O5 NPs. The sample DMI 1:0,5 Pt was capable to increase the hydrogen production up to 30% (9,2 mmol H2.h-1.g-1) during the water splitting process. The second chapters presents the synthesis, characterization and photophysics study of new fluorescent compounds derived from the 2,1,3-benzotiadiazole (BTD) moiety with potential application as cell marker. For this purpose, it was synthesized four dyes that contain imidazolium rings attached to the BTD moiety, which is responsible for the fluorescence of these compounds. 4,7-bis-imidazole-2,1,3 -benzotiadiazole (BTDIm) was obtained from the coupling reaction between BTD and imidazole in the presence of a base, giving 82% in yield. The other compounds were synthesized from the 4,7-bis-imidazole-2,1,3-benzotiadiazole and alkylation with iodomethane, chloridric acid and chloroacetic acid, giving the salts: 4,7-bis-methylimidazolium-2,1,3-benzotiadiazole iodide (BTDImMe), 4,7-bis-imidazolium-2,1,3-benzotiadiazole chloride (BTDImH) e 4,7-bis-aceticacidimidazolium-2,1,3-benzotiadiazole chloride (BTDImAc) in yields of 87%, 70% and 38%, respectively. The dyes were characterized by IR, NMR 1H and 13C, ESI-MS and photophysics analysis by UV-Vis and fluorescence emission. The compounds were tested as cell biosensors. The best result was obtained with the compound BTDIm, which was highly selective for the lisossomes and showed excellent fluorescence signal.

Diversos tipos celulares nas mais variadas condições têm sido usados como doadores de núcleo para a TN. Ainda não está claro se o estado fisiológico destas células afeta o posterior desenvolvimento dos embriões. Neste trabalho, testou-se a hipóese que fibroblastos bovinos em processo de MCP podem ser reprogramados na transferência nuclear. Fibroblastos foram cultivados até atingirem 60% de confluência, sincronizados por restrição de soro durante 24h e em seguida a MCP foi analisada por citometria de fluxo com a ténica da Anexina V/Iodeto de propídeo. Células Anexina positivas (MCP) e Anexinanegativas (Vivas) foram separadas por citometria de fluxo e utilizadas para a TNS. Céulas não coradas e não separadas no citômetro serviram como controle (Controle). Os embriões reconstruídos foram avaliados quanto à fusão, clivagem (2º dia de cultivo), blastocisto (7º dia) e prenhez (D30, D60 e nascimento). O índice de MCP dos blastocistos obtidos foi determinado. Os resultados foram analisados pela ANOVA ou teste de X2 com nível de significância de 5%. Não houve efeito nas taxas de fusão (p>0,05). Embriões reconstruídos com células MCP tiveram menor taxa de clivagem e formação de blastocistos (72,7% e 18,8%, respectivamente) em comparação ao grupo reconstruído com células Vivas (83,4% e 34,7%, respectivamente; p<0,05), não diferindo dos embriões Controle (77,3% e 27,3%, respectivamente; p>0,05). O índice de MCP do grupo de embriões MCP foi similar aos índices dos embriões clonados a partir de células Vivas e Controle (p>0,05). Após a transferência para receptoras, os grupos MCP, Vivas e Controle não diferiram com relação à taxa de prenhez aos 30d (18,1%, 13,3% e 27,5%, respectivamente; p>0,05). Entretanto aos 60d, a perda gestacional no grupo MCP (25%) foi inferior a do grupo Vivas (100%) e Controle (62,5%). Somente um nascimento, do grupo MCP (4,5% dos embriões transferidos), foi obtido no experimento. Conclui-se que células em processo de MCP, podem ser reprogramadas quando utilizadas como doadoras de núcleo na técnica de transferência nuclear, podendo estabelecer gestações e nascimentos, entretanto houve um efeito prejudicial nas taxas de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto assim como houve aumento do índice de MCP nos embriões reconstruídos.
It is not clear if the physiological status of the cells can affect further embryonic development in NT. We hypothesized that adult bovine fibroblasts in PCD can be reprogrammed when used as nuclear donors for cloning. Fibroblasts were cultivated until 60% confluency, synchronized by serum starvation for 24 h and stained with Annexin V and Propidium iodide (PI) by flow citometry. Annexin positive cells (PCD cells) and Annexin negative cells (Live cells) were sorted and used for NT. Unsorted, unstained cells were used as control (Control cells). After reconstruction, fusion, cleavage (day 2 of culture), blastocyst (day 7) and pregnancy rates (day 30, 60 and birth) were recorded. Apoptotic index of the embryos was determined by TUNEL. Data were analyzed with ANOVA and Chi-square test with 5% of significance level. There was no effect on fusion rates (p>0.05). Embryos reconstructed with PCD cells had lower cleavage and blastocyst rates (72.7 and 18.8%, respectively) compared with embryos reconstructed with Live cells (83.4 and 34.7%, respectively; p<0.05). Apoptotic index in embryos produced from cells in PCD was similar compared to embryos produced from Live and Control cells (p>0.05). Pregnancy rates were similar between cloned groups on day 30 after embryo transfer (p>0.05). However it was observed a reduced pregnancy loss in PCD group on day 60 (25%) compared with Control (62.5%) and Live (100%) groups. Only one calf, from PCD cells (4.5% of the transferred embryos), has been obtained in this experiment. In conclusion, it was showed that cells in PCD process can be reprogrammed when used as nuclear donors after NT producing even live animals. However, a negative effect on embryonic development and an increase in the apoptotic index of these embryos was observed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2010.
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Este trabalho descreve a síntese, caracterização e aplicação de novos sistemas fluorescentes utilizando compostos do tipo 2-(2’-hidroxifenil) benzazóis acoplados com o núcleo 2,1,3-benzotiadiazola. Os novos sistemas fluorescentes foram sintetizados utilizando um acoplamento do tipo Buchwald-Hartwig e foram plenamente caracterizados. Suas características físico-físicas, com ênfase na foto-física, foram investigadas e suas propriedades como sondas fluorescentes foram determinadas. Para isso foram realizadas titulações espectrofotométricas e espectrofluorimétricas utilizando dsDNA e a proteína BSA. Além disso, estudos de variação de pH e de voltametria cíclica foram realizados para testar sua estabilidade em diferentes condições. Por fim, os sistemas foram aplicados em estudos de live-cell imaging, comprovando sua eficácia como marcadores seletivos de dsDNA nuclear em sistemas biológicos utilizando células-tronco humanas. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT
The present work describes the synthesis, characterization and application of new systems using fluorescent compounds such as 2 - (2'-hydroxyphenyl) benzazoles coupled with 2,1,3-benzothiadiazole core. The new fluorescent systems were synthesized using Buchwald-Hartwig cross coupling reaction and were fully characterized. Physical chemical properties, especially photophysical properties, were investigated and the applications as fluorescent probes were investigated. To achieve this goal, it was performed spectrophotometric and spectrofluorimetric titrations using dsDNA and BSA protein. Moreover, studies of pH-dependence and cyclic voltammetry were conducted to test the stability under different conditions. Finally, the systems were applied in live-cell imaging experiments, proving the effectiveness and selectivity as nuclear dsDNA staining dyes for biological systems using human stem-cells.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Despite the investments in the search for more effective cancer therapies, the high incidence and mortality produced by this disease continue to increase, which has provoked public health problems to the population. In parallel to the progress of this situation, it has been found a breakthrough in the medicinal chemistry allowing synthesis of a variety of compounds, encouraging researchers into new structures with rich therapeutic potential. The synthesis of compounds derived from tetrahydropyran nucleus (DNT) has been receiving attention, considering the broad of biological activity from these structures. Therefore, the aim of this study was to analyze the cytotoxic activity of 31 DNT compounds. Cell viability was determined by MTT reduction and neutral red stain (CVN) assays. From such 31 compounds studied, only 42a-c and 43a - c showed potent cytotoxic effect on human cancer lines (K562, HL-60, HT-29 and MCF- 7) and a less significant cytotoxic effect on non-cancerous cells (L929 and PBMC cells) were shown. The leukemic cell lines K562 and HL-60 were the most sensitive ones. Compounds 42b and 43c, with IC50 values which range from 8.97 ± 4.1 to 35.35 ± 5.2 for the lines HL-60 and K562, were considered the most promising molecules in terms of their cytotoxic effect and they also demonstrated in primary cultures of peripheral blood and bone marrow from patients with chronic myeloid leukemia. The ability of 42b and 43c compounds to induce molecular changes related to the type of cell death was assessed by flow cytometry. In K562 cells, the compounds 42b and 43c showed similar effect causing an increase in the concentration of hipodiploide DNA and they arrested in the G1 phase of the cell cycle. From double labeling annexin/IP assay, the compound 43c increased about 20% of PI fluorescence. For HL-60 cell line, the compounds 42b and 43c augmented the concentration of hipodiploide DNA and and depolarization of mitochondrial membrane. The compound 43c stimulated ROS production and double staining to annexina/IP. Compounds 42b and 43c showed a potent cytotoxic effect and antileukemic activity, inducing apoptosis and cell cycle. However, there is a need for structural modifications that increase the selectivity of these compounds for cancer cells.
Apesar dos investimentos na busca de terapias mais eficazes contra o câncer, as elevadas taxas de incidência e mortalidade provocadas por esta doença, continuam a crescer, consistindo assim, um dos principais problemas de saúde pública. Em paralelo ao avanço dessa patologia, houve um avanço na química medicinal que permite a síntese de uma variedade de compostos, favorecendo a investigação de novas estruturas com excelentes perspectivas terapêuticas. A síntese de compostos derivados do núcleo tetraidropiranos (DNT) vem recebendo atenção, considerando a ampla atividade biológica dessas estruturas. Sendo assim, o objetivo desse estudo foi analisar a atividade citotóxica de compostos DNT. A viabilidade celular foi determinada pelos ensaios de redução do sal de MTT e CVN. Dos 31 compostos DNT estudados, 42a-c e 43a-c demonstraram potente efeito citotóxico em linhagens cancerígenas (K562, HL-60, HT- 29, MCF-7), e um efeito citotóxico menos expressivo em células não cancerígenas (L929, PBMC), as linhagens leucêmicas humanas K562 e HL-60 foram as mais sensíveis. Os compostos 42b e 43c, com valores de CI50 que variam de 8,97 ± 4,1 a 35,35 ± 5,2 para as linhagens HL-60 e K562, foram considerados os mais promissores, demonstrando também um efeito citotóxico similar em cultura primária de sangue periférico e de medula óssea de pacientes com leucemia mieloide crônica. A capacidade destes compostos provocarem alterações moleculares associadas ao tipo de morte celular foi avaliada por citometria de fluxo. Na linhagem K562, os compostos 42b e 43c tiveram efeito semelhante, provocando um aumento na concentração do DNA hipodiploide e parada na fase G1 do ciclo celular. No ensaio com dupla marcação anexina/iodeto de propídeo (IP) o composto 43c aumentou 20% de fluorescência para o IP. Para a linhagem HL-60, os compostos 42b e 43c induziram aumento da concentração de DNA hipodiploide, nas maiores concentrações, além de induzir despolarização na membrana mitocondrial. Apenas o composto 43c estimulou produção de EROs, e 42b e 43c aumentaram a dupla marcação para anexina/IP. Desta forma, observa-se que os compostos 42b e 43c apresentaram um potente efeito citotóxico e atividade antileucêmica, sendo capazes de induz apoptose e parada no ciclo celular, porém há ainda necessidade de modificações estruturais que aumentem a seletividade destes compostos para células cancerígenas.

O núcleo é uma estrutura organizada e possui verdadeiras organelas nucleares. Entre elas, estão os nucléolos e os corpúsculos de Cajal (CBs). Estes compartimentos nucleares são estruturas dinâmicas, mantidos pela associação de macromoléculas envolvidas na expressão gênica que interagem entre si delimitando-as. A principal proteína encontrada nos CBs é a p-80-coilin e, portanto, o principal epítopo capaz de marcar essas estruturas. Suas funções específicas ainda tem sido alvo de estudo. Existe uma proteína em comum a ambas as estruturas, a fibrilarina que participa no processamento de rRNA. Estes corpúsculos já foram descritos na periferia dos nucléolos ou mesmo fisicamente ligados a ele. Acredita-se que os corpúsculos de Cajal participem da síntese de rRNA, maturação, transporte e associação das subunidades ribossômicas.Diante esta relação, este trabalho visa estudar a inter-relação entre estas estruturas em células normais e as respectivas linhagens de células tumorais em cultura antes e após tratamentos com actinomicina D. Esta droga se usada em baixas concentrações, bloqueia a transcrição dos genes que foram decodificados pela RNA polimerase I e II, e -amanitin, por sua vez bloqueia a transcrição de genes decodificado pela RNA polimerase II . Além disso, também visa investigar uma relação entre a proliferação das linhagens estudadas e freqüência dos corpúsculos de Cajal nas células controle e tratadas. O microscópio confocal de varredura a laser permitiu o estudo dessas estruturas em preparações imunofluorescência fornecendo uma análise tridimensional destas estruturas quando utilizados anticorpos específicos. Linhagens de células que apresentaram um crescimento mais lento foram aquelas que tinham uma maior freqüência de corpúsculos por núcleo. Por outro lado, aquelas que apresentaram um crescimento mais intenso, foram aquelas que apresentaram maior variação no número de corpúsculos por núcleo. Após o tratamento com inibidores de síntese de RNA, tanto os corpúsculos de Cajal quanto os nucléolos, apresentaram alterações morfológicas, às vezes apresentando um grande acúmulo na região dos corpúsculos ou desorganizando os nucléolos. Mudanças no tamanho e forma também puderam ser destacadas.
The nucleus is a structure that has sub-compartments which can be called nuclear organelles. Among them, may be cited the nucleoli and the Cajal bodies (CBs). These nuclear compartments are dynamic structures, maintained by association and stock of macromolecules involved in gene expression. The main protein found in the CB is a p-80-coilin and therefore the main epitope able to label these structures. Their functions are still to be clarified. There is a protein in common to the nucleolus and Cajal bodies, the fibrillarin that takes part in the processing of rRNA. The CBs can be found at the periphery of the nucleoli or even physically connected to them. It is believed that the CBs may have role in the synthesis of rRNA and maturation, transport and association of ribosome subunits. In view of this relationship between Cajal bodies and nucleoli, this work aims to study the interrelationship between these structures in normal cells and their respective tumor cell line in culture before and after treatments with actinomycin D, which in low concentrations, blocks the transcription of genes that were decoded by the RNA polymerase I and II and -amanitin, which is responsible for blocking the transcription of genes decoded by the RNA polymerase II and find out a relationship between cell proliferation and Cajal bodies frequencies in control and treated cells. The confocal microscope of laser scanning enabled the study of these structures in preparations immunofluorescent providing a three-dimensional analysis of these structures when used specific antibodies before and after treatment. Cell lines that shown low cell grow, appears to have lass CB/ nucleus in the other hand, cell lines that have fastest grow shown nuclei with more Cajal bodies frequencies and more variation in the number of Cajal/nucleus After treatment with inhibitors, both Cajal bodies as nucleoli, made quite clear morphological changes, sometimes giving large accumulation of proteins in organelles and sometimes appeared disorganized in the nucleoplasm. Changes in the size and shape were also highlighted. The tumor cell lines also showed changes compared to their normal cell type.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-04-01T20:14:11Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Aline Andrade Mourão - 2015.pdf: 2000857 bytes, checksum: 1da1abfc4f16d1970615dc3393d09323 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5)
Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-04T14:50:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Aline Andrade Mourão - 2015.pdf: 2000857 bytes, checksum: 1da1abfc4f16d1970615dc3393d09323 (MD5) license_rdf: 19874 bytes, checksum: 38cb62ef53e6f513db2fb7e337df6485 (MD5)
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Studies have demonstrated that neurons in the median pre-optic nucleus (MnPO) play a key role in the organization of cardiovascular responses induced by changes in circulating volume mostly through their projections to the paraventricular nucleus (PVN) of the hypothalamus. PVN in turn, projects to the rostroventrolateral medulla (RVLM) one of the main generators nucleus of vascular sympathetic, renal and cardiac activity. However, the autonomic response of blocked of the MnPO and central pathways and / or mechanisms involved in these responses remains unknown. The present study sought to determine the involvement of the MnPO in cardiovascular and autonomic regulation in Wistar (WT) and spontaneously hypertensive rats (SHR). For these, rats of the lineages WT (n = 6) and SHR (n = 6), weighing between 250 and 300g were anesthetized with urethane (1.2 g / kg, iv.) after induction with halothane (2% in O2 100%). The right femoral artery and vein were cannulated for recording of mean arterial pressure (MAP), and infusion of drugs, respectively. Heart rate (HR) was calculated as instantaneous frequency signal electrocardiogram (ECG). The animals were positioned in a stereotaxic apparatus, and instrumented for recording renal sympathetic nerve activity (RSNA). The nanoinjections of saline (NaCl; 150 mM), kynurenic acid (glutamate receptor antagonist; 50 mM) and muscimol (GABA agonist; 4 mM) were also performed. As expected, saline nanoinjections did not change the values of MAP (WT: 0.4 ± 0.2 mmHg; SHR: 0.2 ± 0.4 mmHg), HR (WT: 0.7 ± 0.9 bpm; SHR, 1.1 ± 1.4 bpm) and RSNA (WT: 0.4 ± 0.2%; SHR: 0.2 ± 1.3%). In WT (n=6) rats, the blockade of the MnPO with muscimol promoted fall in MAP (-17.0 ± 1.2 mmHg), bradycardia (-55,4 ± 12,3 bpm) and reduces in RSNA (-37.5 ± 3.9 %). The muscimol nanoinjections into the MnPO in SHR (n=6) promoted hypotension (-31.6 ± 5.0 mmHg), bradycardia (-18.3 ± 7.2 bpm), and renal sympathoinhibition (-54.4 ± 6.2 %). The changes in cardiovascular and autonomic parameters were evaluated in WT and SH rats submitted to sinoartic denervation. In normotensive rats, the inhibition of the MnPO by muscimol promoted decrease of MAP in innervated rats (n=6) and denervated (-19.4 ± 1.9 vs. 20.9 ± 4.3 mmHg, respectively; 3min; n=6), which was maintained throughout the experimental period (13.5 ± 2.0 vs. 22.5 ± 4.3 mmHg, 30 min). Also did not evidenced differences in RSNA in WT innervated (-23.0 ± 1.5%; 3min) and denervated (-21.0 ± 4.9%; 3min) rats. In denervated hypertensive rats (n=5), the blocked of MnPO resulted in progressive decrease in MAP (-31.1 ± 6.7, ± 9.7 and -38.7 ± 7.1 -44.7 mmHg, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade). The changes observed in the HR (-1.3 ± 3.3; -21.5 ± 12.6 and -24.9 ± 12.2 bpm, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade) and RSNA (-16.4 ± 8.8; -37.3 ± 10.1 and -45.1 ± 8.7%, respectively 3, 15 and 30 min after MnPO blockade) also followed this pattern of response. Finally to identify the involvement of glutamatergic neurotransmission in the MnPO on the cardiovascular and autonomic control, nanoinjections of kynurenic acid were performed in this nucleus. The glutamatergic blockade promoted decrease in MAP (WT: -18.2 ± 4.1 mmHg; SHR: -21.0 ± 2.5 mmHg), bradycardia (WT: -7.1 ± 1, 9 bpm; SHR: -9.0 ± 6.0 bpm) and renal simpathoinhibition (WT: -19.7 ± 2.4%; SHR: -24.7 ± 2.4%) in normotensive and hypertensive rats. In summary, the results obtained on this study demonstrated that acute blockade of MnPO reduces blood pressure (BP), confirming recent data that indicate that this nucleus participates of tonic control on BP. Our data suggest the involvement of MnPO the tonic regulation of sympathetic activity in WT and SHR. In addition, suggest the participation of this nucleus in increased sympathetic activity and consequent arterial blood pressure in SHR. The results demonstrated that aortic and carotid afferent participates in the modulation of autonomic and cardiovascular responses induced by blockade the MnPO in SHR. Furthermore, our data suggest that glutamatergic neurotransmission in the MnPO is important for the tonic regulation of BP, HR and RSNA thus, bringing new evidence that this nucleus participates of the autonomic and cardiovascular control.
Estudos têm demonstrado que os neurônios do núcleo pré-óptico mediano (MnPO) desempenham um importante papel na regulação cardiovascular e hidromineral, principalmente, por meio de suas projeções para o núcleo paraventricular (PVN) do hipotálamo. O PVN, por sua vez projeta-se para a região rostroventrolateral do bulbo (RVLM) um dos principais núcleos geradores da atividade simpática vascular, renal e cardíaca. Todavia, as respostas autonômicas frente a inibição do MnPO, bem como vias centrais e/ou mecanismos envolvidos nessas respostas permanecem desconhecidos. O presente estudo buscou determinar a participação do MnPO na regulação autonômica e cardiovascular em ratos wistar (WT) e espontaneamente hipertensos (SHR). Para tanto, ratos das linhagens WT e SHR, pesando entre 250 e 350g foram anestesiados com uretano (1,2 g/kg, iv.) após a indução com halotano (2% em O2 100%). A artéria e veia femorais direitas foram canuladas para o registro da pressão arterial média (PAM), e a infusão de drogas, respectivamente. A frequência cardíaca (FC) foi calculada como frequência instantânea do sinal de eletrocardiograma (ECG). Os animais foram posicionados em um aparelho estereotáxico e instrumentalizados para registro da atividade nervosa simpática renal (ANSR), e nanoinjeções (100nl) de soro fisiológico (NaCl; 150mM); ácido quinurênico (antagonista glutamatérgico; 50mM) e muscimol (agonista gabaérgico; 4mM) no MnPO. Como esperado, as nanoinjeções de soro não alteraram os valores da PAM (WT: 0,4 ± 0,2 mmHg; SHR: 0,2 ± 0,4 mmHg), FC (WT: 0,7 ± 0,9 bpm; SHR; 1,1 ± 1,4 bpm) e da ANSR (WT: 0,4 ± 0,2 %; SHR: -0,2 ± 1,3 %).Em ratos WT (n=6), o bloqueio farmacológico do MnPO com muscimol promoveu queda na PAM (-17,0 ± 1,2 mmHg), bradicardia (-55,4 ± 12,3 bpm) e redução na ANSR (-37,5 ± 3,9 %). As nanoinjeções de muscimol no MnPO dos SHR (n=6) promoveram hipotensão (-31,6 ± 5,0 mmHg), bradicardia (-18,3 ± 7,2 bpm), e simpatoinibição renal (-54,4 ± 6,2 %). As variações dos parâmetros autonômicos e cardiovasculares induzidas pela inibição do MnPO também foram avaliadas em ratos WT e SHR submetidos à desnervação dos aferentes sinoaórticos. Nos ratos normotensos, a inibição do MnPO com muscimol promoveu queda na PAM nos ratos inervados (n=6) e desnervados (-19,4 ± 1,9 vs. -20,9 ± 4,3 mmHg, respectivamente; 3min; n=6), sendo esta mantida por todo período experimental (-13,5 ± 2,0 vs. -22,5 ± 4,3 mmHg; 30min). Também não foram evidenciadas diferenças na redução da ANSR nos ratos WT inervados (-23,0 ± 1,5 %; 3min) e desnervados (-21,0 ± 4,9 %; 3min). Nos ratos hipertensos desnervados (n=5), o bloqueio do MnPO promoveu uma progressiva redução na PAM (-31,1 ± 6,7; -38,7 ± 9,7 e -44,7 ± 7,1 mmHg; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do MNPO). As alterações promovidas na FC (-1,3 ± 3,3; -21,5 ± 12,6 e -24,9 ± 12,2 bpm; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do MNPO) e ANSR (-16,4 ± 8,8; -37,3 ± 10,1 e -45,1 ± 8,7 %; respectivamente 3, 15 e 30 min após o bloqueio do MNPO) também seguiram esse padrão de resposta. Por fim para identificarmos a participação da neurotransmissão glutamatérgica no MnPO sobre o controle cardiovascular e autonômico, nanoinjeções de ácido quinurênico foram realizadas neste núcleo. O bloqueio glutamatérgico no MnPO promoveu queda na PAM (WT: -18,2 ± 4,1 mmHg vs. SHR: -21,0 ± 2,5 mmHg), bradicardia (WT: -7,1 ± 1,9 bpm vs. SHR: -9,0 ± 6,0 bpm e simpatoinibição renal (WT: -19,7 ± 2,4 % vs. SHR: -24,7 ± 2,4 %). Em conjunto, os resultados obtidos nesse estudo demonstraram que o bloqueio agudo do MnPO reduz a pressão arterial (PA), corroborando com dados recentes que indicam que esse núcleo participa do controle tônico da PA. Nossos dados sugerem o envolvimento do MnPO na regulação tônica da atividade simpática em WT e SHR. Ademais, sugerem a participação desse núcleo no aumento da atividade simpática e consequente hipertensão arterial observada em SHR. Os resultados evidenciaram ainda, que os aferentes aórticos e carotídeos participam na modulação das respostas autonômicas e cardiovasculares induzidas pelo bloqueio do MnPO em SHR. Além disso, nossos dados sugerem que a neurotransmissão glutamatérgica no MnPO é importante para a regulação tônica da PA, FC e ANSR trazendo assim novas evidências de que esse núcleo participa do controle autonômico e cardiovascular.

A técnica de transferência nuclear é uma ferramenta que possibilita a produção de embriões clones que podem ser utilizados tanto na clonagem reprodutiva, proporcionando o nascimento de produtos, como modelo para o estudo de diversos mecanismos fisiológicos durante o desenvolvimento embrionário. Este trabalho teve como objetivos a otimização da técnica de clonagem no Laboratório de Embriologia e Biotécnicas de Reprodução (FAVET, UFRGS), avaliar a taxa de sucesso da clonagem interespécie, e testar e eficiência da utilização de oócitos vitrificados como citoplasmas receptores para a reconstrução dos embriões clones, sendo realizado em três etapas. A primeira teve por objetivo o estabelecimento da técnica de clonagem, bem como sua otimização nas nossas condições, dando condições para que os experimentos subseqüentes pudessem ser realizados. Para isto foram realizados experimentos in vitro comparando diferentes meios de manipulação, sistemas de ativação química, meios de cultivo e fontes protéicas no cultivo dos embriões, e células oriundas de diferentes origens e animais como doadores de núcleo. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos. Os resultados obtidos in vitro alcançaram taxas de 64,7% de clivagem e de 19,5% de blastocistos. Um grupo de embriões foi transferido para receptoras (n=24), e foram observadas 54,2% de prenhezes aos 35 dias, 8,3% de prenhezes aos 260 dias e 4,2% de nascimentos.A segunda parte dos experimentos teve por objetivo a produção de clones interespécies utilizando o citoplasma bovino como receptor para células ovinas, caprinas e suínas. As taxas de clivagem nos grupos NTSCi ovino (60,3%), caprino (68,4%) e suína (57,1%) não diferiram dos grupos controles NTSC bovino. A taxa de blastocisto observada nos embriões NTSCi ovinos (10,3%) foram semelhantes às taxas observadas no grupo NTSC bovino (12,7%). No grupo NTSCi caprino, 5,3% dos embriões chegaram ao estádio de blastocisto, enquanto que no grupo NTSCi suíno não houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Na terceira parte do trabalho, experimentos visando a utilização de oócitos vitrificados imaturos com citoplasma receptor foram realizados. Foram submetidos a maturação 764 complexos cumuli-oócitos vitrificados, e 73,0% destes foram recuperados após o desnudamento e 46,8% apresentavam corpúsculo polar, taxas significativamente inferiores às observadas nos oócitos não vitrificados (91,4% e 65,8%, respectivamente). As taxas de sobrevivência após a micromanipulação (77,8%), taxa de fusão (82,1%) e de sobrevivência após a ativação (79,9%) do grupo vitrificado não apresentaram diferença significativa com o grupo controle não vitrificado. As taxas de blastocistos também não apresentaram diferença entre os grupos vitrificado e não vitrificado (16,7% e 23,4%) respectivamente. Em resumo, os resultados deste trabalho demonstraram que oócitos bovinos frescos ou vitrificados, nas nossas condições estabelecidas, foram capazes de suportar o desenvolvimento de embriões clones bovinos até o estádio de blastocisto ou a termo, e proporcionam citoplasmas compatíveis para o desenvolvimento de embriões clones interespécie até o estádio de blastócito.
Somatic cell nuclear transfer (NTCS) procedures is a valuable tool for the production of clone embryos for use in reproductive cloning, by providing the birth of live animals, and for use as a research model, allowing the study of physiologic mechanisms during the embryonic development. This work aimed to optimize cloning procedures at the Embryology and Reproductive Technology Laboratory (FAVET, UFRGS), to evaluate the success rate of interspecies cloning, and to test the effectiveness of vitrified oocytes as recipient cytoplasm for embryo reconstruction, being carried out in three stages. The first stage was focused on the establishment of the cloning technique and the optimization of procedures and conditions in the lab so that the subsequent experiments could be accomplished. Thus, in vitro experiments were performed to compare different manipulation media, chemical activation systems, manipulating media, source of protein supplementation to the embryo culture media, and distinct cell types and genotypes. The mean cleavage and blastocyst rates obtained after conditions were optimized were 64.7% and 9.5%, respectively. Pregnancy rates on Days 35 and 260 of gestation and calving rate at term following the transfer of a group of embryos to synchronous recipient cows (n=24) were 54.2%, 8.3% and 4.2%, respectively. The second stage of the study evaluated the success rate of the production of interspecies clones (NTSCi) using the bovine oocyte as recipient cytoplasm for transferred nuclei from ovine, caprine or porcine cells. Cleavage rates using ovine (60.3%), caprine (68.4%) and porcine (57.1%) nuclei did not differ from controls (bovine nuclei). Blastocyst rates observed for NTSCi embryos using ovine nuclei (10.3%) were similar to those observed in the bovine NTSC group (12.7%). The NTSCi-caprine group reached a 5.3% blastocyst rate, whereas no development to the blastocyst stage was observed when using porcine cells as nucleus donor. In the third stage of this work, experiments evaluated the efficiency of vitrified bovine oocytes as recipient cytoplasms for cloning by TNCS. Following vitrification and warming, 764 cumulus-oocyte complexes were in vitro-matured. A total of 73.0% was recovered after cumulus removal, with 46.8% presenting visible polar bodies, which were significantly lower than rates observed in non-vitrified oocytes (91.4% and 65.8%, respectively). However, survival rates following micromanipulation (77.8%), fusion rates (82.1%) and survival after activation (79.9%) of oocytes were not different from the control group (non-vitrified oocytes). In addition, blastocyst rates did not differ between vitrified and non-vitrified groups (16.7% and 23.4%, respectively). In summary, results from this study demonstrated that fresh or vitrified bovine oocytes, under our optimized conditions, were able to support development of bovine clone embryos to the blastocyst stage or to term, and provided a compatible cytoplasm for the development of interspecies clone embryos to the blastocyst stage.

Ocitocina (OT) é um nonapeptídeo neurosecretório sintetizado nas células hipotalâmicas que se projetam para a neurohipófise e para locais extensamente distribuídos no sistema nervoso central. As microinjeções centrais de OT induzem uma variedade de comportamentos em animais no âmbito cognitivo, sexual, reprodutivo, de autolimpeza e afiliativo. O transtorno obsessivo-compulsivo (TOC) inclui uma escala dos sintomas cognitivos e comportamentais que tem alguma relação com dimensões de comportamento associadas com a OT. A administração de OT no núcleo central da amígdala (CeA) induz autolimpeza exacerbada, considerada um sintoma de TOC. Neste trabalho, nós estudamos os substratos neuroanatômicos e celulares deste comportamento. Nossos dados sugerem uma ligação entre o CeA e a “área hipotalâmica de grooming” (HGA). A HGA inclui parte do núcleo paraventricular do hipotálamo e a área hipotalâmica dorsal. Nossos dados mostrando co-localização de OT (imunohistoquímica para peptídeo), receptor para OT (ensaio de binding) e marcação de células retrogradamente depois da injeção de Fluoro-Gold no CeA sugerem que o CeA e conexões são substratos importantes nos circuitos subjacentes de comportamento normal e de quadro patológico tal como o TOC dependente de OT descrito neste trabalho.
Oxytocin (OT) is a neurosecretory nonapeptide synthesized in hypothalamic cells that project to the neurohypophysis as well as to widely distributed sites in the central nervous system. Central OT microinjections induce a variety of cognitive, sexual, reproductive, grooming and affiliative behaviors in animals. Obsessive-compulsive disorder (OCD) includes a range of cognitive and behavioral symptoms that bear some relationship to dimensions of behavior associated with OT. The administration of OT into central nucleus of amygdala (CeA) induces hypergrooming, considered a symptom of OCD. Here, we study the neuroanatomical and cellular substrates of this behavior. Our data suggest a link between the CeA and the “hypothalamic grooming area” (HGA). The HGA includes parts of the paraventricular hypothalamic nucleus and the dorsal hypothalamic area. Our data on co-localization of OT (immunohistochemistry for peptide), OT receptor (binding assay) and retrogradely labeled cells after Fluoro Gold injection in CeA suggest that CeA and connections are an important substrate of the circuit underlying this OCD-like OT-dependent behavior.

Morphine withdrawal increases the HPA axis activity, which is dependent on a hyperactivity of noradrenergic pathways (NTS-A2) innervating the PVN. In this Thesis we found that morphine withdrawal resulted in an increase in ACTH and corticosterone secretion and a neuronal activation in the PVN. Additionally, we found robust increases in CRF and AVP hnRNAs in the PVN, concomitantly with an increase in c-Fos expression. Morphine withdrawal activated ERK1/2 in PVN and NTS, which could be involved in the c-Fos expression. Morphine withdrawal induced an increase in TH mRNA levels in the NTS-A2, total TH protein in the NTS and TH phosphorylation at Ser31 in PVN and NTS-A2, which resulted in an augmentation of TH activity in the PVN. The enhancement in TH phosphorylated at Ser31 was blocked by SL327 in both nuclei. Finally, we have found that adrenalectomy eliminated the hyperactivity of noradrenergic pathways innervating the PVN during morphine withdrawal.
La abstinencia a morfina aumenta la actividad del eje HHA, que depende de la hiperactivación de las vías noradrenérgicas (NTS-A2) que inervan al PVN. En esta Tesis encontramos que la abstinencia a morfina induce la liberación de ACTH y corticosterona y la activación neuronal del PVN. Además, observamos un aumento en los niveles de hnRNA para CRF y AVP en el PVN, concomitantemente con un incremento en la expresión de c-Fos. El síndrome de abstinencia a morfina activó a ERK1/2 en PVN y NTS. También indujo un incremento en el mRNA para TH en el NTS-A2, proteína TH total y fosforilación de TH en su Ser31 en PVN y NTS-A2, que se tradujo en un aumento en su actividad enzimática. El aumento de TH fosforilada en Ser31 fue bloqueado por SL327. Finalmente, la adrenalectomía eliminó la hiperactividad de las vías noradrenérgicas que inervan al PVN durante la abstinencia a morfina.

O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade in vitro e in vivo de embriões bovinos reconstruídos com oócitos enucleados em Metáfase II e núcleos de células somáticas (fibroblastos) fetais e adultas. Para tanto, oócitos de ovários colhidos em matadouro foram maturados in vitro por 17 horas e enucleados pela remoção do primeiro corpúsculo polar (CP) e da região do oolema contendo a placa metafásica. Como núcleo doador, foram utilizados fibroblastos de orelha de vaca da raça Nelore e de feto colhido em abatedouro. Para a reconstrução dos embriões, cada célula doadora de núcleo, após indução à G0, foi inserida sob a zona pelúcida de cada oócito enucleado e o complexo citoplasma receptor - núcleo doador (CCN) fundido e ativado por eletrofusão (2 pulsos de 4 KV/cm durante 20µs). Após ativação elétrica, cada CCN foi incubado em solução de ciclohexemide (10µg/ml) e citocalasina D (2,5µg/ml) por 1 hora e, em seguida, em solução de ciclohexemide (10µg/ml) por mais 4 horas. Os embriões reconstruídos e ativados, assim como os fecundados in vitro (controle), foram co-cultivados em monocamada de células da granulosa e TCM 199 acrescido de 10% de SFB por 7-9 dias. Após o co-cultivo por 7-9 dias, parte dos embriões (controle e reconstruídos) foi fixada e corada para determinação do número de células e parte transferida para receptoras. Um total de 668 embriões foram reconstruídos com célula fetal e 569 com fibroblasto adulto. Após eletrofusão, 212 embriões reconstruídos com célula fetal e 181 com célula adulta fundiram e 32 (15,1%) e 30 (16,6%) atingiram o estádio de blastocisto, respectivamente. O número médio de células dos blastocistos foi 129,3, 101,3 e 114,3, respectivamente, para célula fetal, adulta e embriões FIV (controle), não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). Após a transferência de 18 blastocistos de célula fetal e 21 de célula adulta, as taxas de prenhez aos 90 dias foram 16,7% (3) e 19% (4), respectivamente, não havendo diferença estatística significante entre os grupos (P<0,05). A primeira prenhez com célula fetal deu origem a um bezerro saudável, aos 290 dias, pesando 34kg. Uma das receptoras morreu aos 229 dias de gestação em conseqüência de hidroalantóide e outra abortou aos 252 dias. As prenhezes de embriões reconstruídos com célula adulta ainda estão em andamento. Estes resultados indicam que fibroblastos fetal e adulto podem ser usados como doadores de núcleo com semelhantes taxas de desenvolvimento in vitro e in vivo.
The aim of this study was to evaluate the in vitro and in vivo viability of bovine nuclear transferred embryos from metaphase II oocytes and fetal and adult fibroblasts. Oocytes from ovaries collected at slaughterhouse were matured in vitro for 17 hours and enucleated after aspiration of first polar body (PB) and small volume of cytoplasm containing metaphase plate. Fibroblasts from Nelore cow and foetus collected at slaughterhouse were used as nuclei donor. In Nuclear Transfer, each nuclei donor cell, after serum starvation, was inserted under the zona pellucida of the each enucleated oocyte and the enucleated oocyte- nuclei donor cell complexes were electrofused and activated (2 pulses of 4KV/cm for 20µs). After electrical activation, the couplets were incubated in TCM199 plus 10% FCS supplemented with cycloheximide (10µg/ml) and cytochalasin D (2.5µgml) for 1 hour and cycloheximide alone for further 4 hours. The activated reconstructed embryos, as well as IVF embryos (control group), were co-cultured with granulosa cells in TCM 199 + 10% FCS for 7–9 days. After co-cultured, part of embryos (control and reconstructed) was fixed and the number of cells counted and part was transferred into recipients. A total of 668 couplets were reconstructed from fetal and 569 from adult fibroblasts. After electrofusion, 212 (fetal cells) and 181 (adult cells) embryos got fused and 32 (15.1%) and 30 (16.6%) reached blastocyst stage, respectively. The blastocyst cell number means were 129.3, 101.3 and 114.3, respectively, for fetal, adult and IVF (control) embryos. There was no significant difference (P<0.05) in the number of cells of blastocysts among the groups. After transferring 18 (fetal cells) and 21 (adult cells) blastocysts, pregnancy rates at day 90 were 16.7% (3) and 19% (4), respectively. There was no significant difference (P<0.05) between pregnancy rates. The first pregnancy from fetal cells delivered a healthy male calf at day 290, weighting 34kg. One of the remaining recipients died with hydrallantois at day 229 and the other aborted at day 252. The pregnancies of adult cells reconstructed embryos are still in course. These results indicated that fetal and adult fibroblasts could be used as nuclei donor, with similar rates of in vitro and in vivo developments.

As fosfodiesterases do tipo 2A (PDE2A) hidrolisam os nucleotídeos cíclicos cAMP e cGMP e por isso desempenham papel importante na sinalização intracelular. PDE2A é composta por uma região N-terminal, que ao contrário de outras famílias de PDEs, não possui função conhecida, dois domínios regulatórios, GAF A e GAF B, e um domínio catalítico localizado na porção C-terminal. Sabe-se que a hidrólise dos nucleotídeos cíclicos, pela PDE2A, é ativada pela ligação de cGMP ao domínio regulatório GAF B. Em uma triagem dois híbridos, identificamos XAP2 como a principal proteína interatora de PDE2A. XAP2 é um componente crucial do complexo multiprotéico do receptor Aril hidrocarboneto (Ahr), o principal fator de transcrição que controla a expressão de múltiplos genes envolvidos em detoxificação. Neste trabalho, foi determinado que XAP2 liga o domínio GAF B da enzima PDE2A. Ensaios de atividade fosfodiesterásica, utilizando proteínas purificadas, mostram que a ligação de XAP2 não interfere na atividade enzimática de PDE2A. Para analisar se PDE2A afeta a função de XAP2, foi investigado o deslocamento de Ahr para o núcleo. Sabe-se que a regulação da expressão dos genes alvos de Ah é iniciada pela ligação de tetraclorodibenzodioxina (TCDD) e por uma via, ainda pouco entendida, dependente de cAMP. Verificamos que a ligação de PDE2A à XAP2 inibe o deslocamento de Ahr para o núcleo, induzido por TCDD e por cAMP em células hepáticas Hepa1c1c7 em cultura. Em conclusão, mostramos neste trabalho que XAP2 recruta PDE2A para o complexo Ahr, causando a inibição da mobilidade de Ahr, possivelmente pela redução local da concentração de cAMP. Esses dados suportam o papel de cAMP no controle da função de Ahr.
Phosphodiesterase type 2A (PDE2A) hydrolyzes cyclic nucleotides cAMP and cGMP thus efficiently controlling cNMP-dependent signaling pathways. PDE2A is composed of an N-terminal region, two regulatory GAF domains and a catalytic domain. Cyclic nucleotide hydrolysis is known to be activated by cGMP binding to GAF-B, however, other mechanisms may operate to fine-tune local cyclic nucleotide levels. In a yeast-two-hybrid screening we identified XAP2, a crucial component of the aryl hydrocarbon receptor (AhR) complex, as a major PDE2A-interacting protein. We mapped the XAP2 binding site to the GAF-B domain of PDE2A. PDE assays with purified proteins showed that XAP2 binding does not change the enzymatic activity of PDE2A. To analyze if PDE2A could affect the function of XAP2 we studied nuclear translocation of AhR, i.e. the master transcription factor controlling the expression of multiple detoxification genes. Notably, regulation of AhR target gene expression is initiated by tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) binding to AhR and by a poorly understood cAMP-dependent pathway, followed by the translocation of AhR from the cytosol into the nucleus. Binding of PDE2A to XAP2 inhibited TCDD- and cAMP-induced nuclear translocation of AhR in Hepa1c1c7 hepatocytes. We conclude that XAP2 targets PDE2A to the AhR complex thereby restricting AhR mobility, possibly by a local reduction of cAMP levels. Our results provide first insights into the elusive cAMP-dependent regulation of AhR.

Ingeniero Civil Electricista
El objetivo del presente trabajo de título es construir dos modelos de planificación de la infraestructura de núcleo de redes de telefonía móvil en el caso chileno. Luego, analizar los resultados y determinar la dependencia de estos con la topología y demografía del país. El problema consiste en determinar la localización óptima de los MSC (Mobile Switching Center), en el caso centralizado. Y de los MGW (Media Gateway) y MGC (Media Gateway Controller) en el distribuido. Los objetivos del estudio consisten en: minimizar los costos de inversión y operación en un horizonte de planificación definido; se cumplan todas las restricciones técnicas y de calidad de servicio; y se satisfaga la demanda en dicho período. Se enmarca el trabajo definiendo los conjuntos, parámetros y variables necesarios. Luego, utilizando datos del caso chileno y estructuras de diseño de redes, se plantean los modelos de optimización y planificación conjunta. El modelo de minimización de costos da como resultado 7 MSC para el caso centralizado; y de 1 MGC en Santiago con 14 MGW en el distribuido, siendo este último el de menor costo. Al analizar la solución se desprende que el principal factor que determina la capacidad total de los equipos a utilizar es la relación que existe entre el precio de los enlaces y los costos marginales de conmutación. Estos son mucho más bajos en el modelo distribuido que en el centralizado, lo que explica la gran diferencia en la instalación de conmutadores en ambos problemas. En cuanto a la ubicación de los nodos el parámetro más incidente es el intercambio de tráfico que es generado y tiene por destino la mima zona. Este valor actúa como “centro de masa” y al verificar los pesos relativos de cada sector con los resultados se confirma su repercusión, especialmente en el sistema distribuido. Respecto a los efectos de las particularidades de la red chilena, se aprecia que la demografía provoca una gran concentración de equipos en Santiago. A su vez, la topología repercute en los modelos al preferir Chillán en desmedro de Concepción para ubicar conmutadores. Al forzar el uso de esta última zona se observa un gasto adicional en enlaces debido a su ubicación. Sin embargo, la diferencia de costos no es significativa. Se concluye que el caso distribuido es ampliamente superior al centralizado debido a que el costo es un 37% menor, y además, en el óptimo se dispone de una capacidad de conmutación extra de 963 E1 a la demandada, por lo tanto, existe holgura en cuanto a su uso futuro o en otras aplicaciones. Para trabajos posteriores, suponiendo que se disponga de mayor poder computacional, se propone extender el modelo a la capa de acceso. Además, se sugiere reestructurar el estudio para realizar la optimización utilizando distintas tecnologías o redes preexistentes.

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Sodium intake is induced by facilitatory signals, like angiotensin II and aldosterone Cell dehydration, a classical inhibitory signal for sodium intake, may also induce paradoxical sodium intake if the sodium intake inhibition by the ocitocinergic hypothalamic mechanism or by the lateral parabraquial nucleus (LPBN) is absent. Thus, the LPBN deactivation could modify the activity of hypothalamic oxytocinergic pathways or the gastric emptying control system, another inhibitory system, as well as facilitatory areas and the reward system. The aim of this study was to investigate the effect of LPBN injections of methysergide (4 μg/0.2 μl, serotonergic antagonist) in cell dehydrated animals on: activity of brain areas involved in ingestive behavior by measuring c-Fos protein immunoreactivity and tissue levels of dopamine, serotonin and metabolites or plasma hormone levels; pre-systemic satiety involving gastric emptying; selectivity of paradoxical sodium intake. The effect of disinhibition of the natriorexigenesis on the reward system was tested by repeated deactivations of the LPBN with muscimol (2 nmol/0.2 μl; GABAA agonist) and its effect on ingestive behavior sensitization and water deprivation with partial rehydration followed by sodium access (WD-PR protocol) on the lateral hypothalamus self-stimulation (LHSS). Holtzman or Sprague-Dawley rats (280-320 g), intacts or operated (femoral vein cannulation and/or guide cannulas implanted in direction to the LPBN or bipolar electrode implanted in the hypothalamus), were used in the experiments. Animals treated with methysergide and hyperosmotic by gavage of 2 M NaCl (2 ml) compared to the control treatment (vehicle) showed: (a) increase in ir-Fos in the area postrema and intermediate nucleus of the solitary tract, subfornical organ and non-oxytocinergic neurons of the ventral portion of the paraventricular nucleus of the hypothalamus; (b) increase in tissue levels of dopamine in the amygdala, but not in the accumbens; (c) unchanged activity of oxytocinergic system (ir-Fos in oxytocinergic neurons and oxytocin plasma levels similar to control group). Hyperosmotic rats (iv infusion of 2 ml of 2 M NaCl) treated with methysergide and a gavage of 0.3 M NaCl (3 ml) showed a hypertonic gastric and intestinal content similar to the control group (vehicle) after gavage. In hydrated animals with a history of two previous treatments of muscimol into the LPBN, the hypertonic NaCl intake induced by muscimol was higher than the control animals pretreated with vehicle. The LHSS was not altered at any stage of WD-PR protocol, as well as in cell dehydrated animals in comparison with hydrated control group. The results demonstrate that the deactivation of the LPBN enhances specifically the intake of solutions containing sodium and suggest the involvement of the brain stem and the amygdala during the appetitive phase of the paradoxical sodium intake, while the deactivation of other inhibitory mechanisms (oxytocin and gastric retention) seems not to be essential. Furthermore, the repetition of LPBN deactivation sensitizes hydrated animals for sodium intake. Removing the inhibition of sodium appetite by partial rehydration in WD-PR does not change the LHSS reward.
A ingestão de sódio é induzida por sinais facilitadores, como a angiotensina II e a aldosterona. Apesar de classicamente considerada antinatriorexigênica, a desidratação celular também se mostra facilitadora da ingestão paradoxal de sódio quando a inibição da ingestão de sódio pelo mecanismo ocitocinérgico do hipotálamo ou pelo núcleo parabraquial lateral (NPBL) está desativada. A desativação do NPBL poderia, então, atuar sobre o mecanismo ocitocinérgico ou de controle do esvaziamento gástrico, ambos inibidores, ou ainda modificar a atividade de áreas facilitadoras ou envolvidas na recompensa. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da injeção de metisergida (4 μg/0,2 μl, antagonista serotonérgico) no NPBL em animais com desidratação celular sobre a: atividade de áreas encefálicas envolvidas no comportamento ingestivo, medindo-se imunorreatividade para proteína c-Fos e dosagem tecidual de dopamina, serotonina e metabólitos em áreas de interesse ou dosagem hormonal; saciedade pré-sistêmica envolvendo esvaziamento gástrico; seletividade da ingestão paradoxal de sódio. Também foi avaliado o possível efeito da desinibição da natriorexigênese sobre o sistema de recompensa através da sensibilização por desativações repetidas do NPBL pelo muscimol (2 nmol/0,2 μl; agonista GABAA) e na privação hídrica com reidratação parcial e posterior acesso ao sódio (modelo PH-RP) sobre a autoestimulação elétrica do hipotálamo lateral (AEHL). Ratos (280-320 g) Holtzman ou Sprague-Dawley, intactos ou operados (canulação da veia femoral e/ou cânulas-guia direcionadas ao NPBL ou eletrodo bipolar no hipotálamo), foram utilizados nos experimentos. Animais tratados com metisergida e hiperosmóticos por gavagem de NaCl 2 M (2 ml) apresentaram, em relação ao tratamento controle (veículo): (a) aumento da ir-Fos na área postrema e núcleo do trato solitário intermediário, no órgão subfornical e em neurônios não ocitocinérgicos da porção ventral do núcleo paraventricular do hipotálamo; (b) aumento da concentração tecidual de dopamina na amígdala, mas não no accumbens; (c) atividade do sistema ocitocinérgico inalterada (ir-Fos em neurônios ocitocinérgicos e ocitocina plasmática semelhantes ao controle). Ratos tratados com metisergida e hiperosmóticos por infusão iv de NaCl 2 M (1,5 ml), que receberam uma gavagem de NaCl 0,3 M (3 ml) apresentaram conteúdo gástrico e intestinal hipertônico semelhantes ao controle (veículo) após a gavagem. Em animais hidratados com histórico de dois tratamentos prévios de muscimol no NPBL, a ingestão de NaCl hipertônico induzida por muscimol foi superior aos animais controle tratados previamente com veículo. A AEHL não foi alterada em nenhuma fase do protocolo PH-RP, assim como em animais com desidratação celular, em relação aos controles hidratados. Os resultados demonstram que a desativação do NPBL potencializa especificamente a ingestão de solução contendo sódio e sugerem a participação do tronco encefálico e da amígdala na fase apetitiva da ingestão paradoxal de sódio, enquanto a desativação de outros mecanismos inibidores (ocitocina e retenção gástrica) parece não ser essencial. Ainda, a repetição da desativação do NPBL sensibiliza a ingestão de sódio em animais hidratados. A remoção da inibição ao apetite ao sódio pela reidratação parcial na PHRP não altera a recompensa na AEHL.

A manipulação neonatal ocasiona alterações comportamentais frente a situações estressantes, mostrando animais hiporresponsivos ao estresse, exibindo uma menor reatividade emocional, uma menor taxa de defecação e maior exploração que os nãomanipulados quando colocados em um ambiente novo, mesmo que este inclua seu predador natural, como no caso do campo aberto com predador (Levine et al., 1967; Padoin et al., 2001; Severino et al., 2004). A manipulação neonatal prejudica ainda a função reprodutiva dos animais na idade adulta, seja na exibição do comportamento sexual em machos e em fêmeas, ou na redução ou bloqueio da ovulação e exibição de ciclos anovulatórios pelas fêmeas (Gomes et al., 1999). Outro efeito bastante marcante é observado na morfologia do encéfalo destes animais, dando suporte neural às alterações comportamentais e neuroendócrinas observadas nestes animais. O presente trabalho teve por objetivo verificar se a redução do número de neurônios em animais de 11 e 90 dias, constatada na área pré-óptica medial, no locus coeruleus e no núcleo paraventricular do hipotálamo dos animais manipulados quando comparados aos não-manipulados, deve-se a uma redução da proliferação celular nestes núcleos aos 11 dias de idade, e se o aumento do número de neurônios na região CA1 da formação hipocampal observado nos animais manipulados quando comparados aos nãomanipulados, se deve ao aumento da proliferação celular no animais manipulados também aos 11 dias de idade, logo após o término da manipulação neonatal. Foram utilizadas ratas Wistar prenhas do biotério central da UFRGS, sendo os filhotes divididos em dois grupos: Não-Manipulados e Manipulados, dos quais utilizamos os filhotes fêmeas. Para o estudo das regiões de interesse o encéfalo dos animais foi retirado após perfusão, incluído em parafina, fatiado em um micrótomo, submetido a imunoístoquímica para o BrdU, sendo o número de células contado com auxilio de um microscópio óptico. Os resultados do presente trabalho indicaram, através do uso do BrdU como marcador de proliferação celular, que a mesma encontra-se de fato alterada nas fêmeas manipuladas, sendo menor na área pré-óptica medial, núcleo paraventricular e locus coeruleus e maior na região CA1 da formação hipocampal. O registro de um menor número de células nestas estruturas não extingue a possibilidade de morte celular ocorrendo de forma concomitante a esta diminuição da proliferação celular observada neste trabalho. De maneira mais geral, a principal conclusão deste trabalho é a de que a manipulação neonatal, leva a alterações de longo prazo na morfologia do encéfalo destes filhotes, as quais são mantidas mesmo durante a idade adulta, mas que se iniciam durante a infância, nestes primeiros 10 dias de vida em que o animal recebe o estímulo da manipulação.

En los metazoarios el DNA se organiza en bucles hiperenrollados que se estabilizan por su asociación a un compartimento o subestructura nuclear conocida como matriz nuclear (MN). Las interacciones entre el DNA y la MN son más estables que las interacciones entre proteínas de la cromatina y el DNA, y definen una estructura de orden superior al interior del núcleo celular (NHOS por sus siglas en inglés: Nuclear Higher Order Structure). El establecimiento de anclajes entre el DNA y la MN es una condición necesaria y fundamental que preserva la integridad y coherencia del genoma al interior del núcleo. Existe evidencia de que esta estructura es necesaria para la viabilidad de la célula y que tiene implicaciones relevantes para la apropiada fisiología nuclear. La evidencia disponible indica que limitantes de tipo estructural y termodinámico dirigen la actualización de las interacciones entre el DNA y la MN. Sin embargo, no se sabe si hay factores biológicos que también determinan esta organización estructural. Para responder esta pregunta se propuso estudiar a la NHOS desde una perspectiva evolutiva. La eventual conservación de la NHOS durante la evolución indica que factores biológicos están implicados en su establecimiento, ya que cualquier carácter funcional determinante para la supervivencia y/o adaptación de la especie es blanco de la selección natural. Siendo así, se realizó un estudio comparativo de las relaciones topológicas entre el DNA y la MN en hepatocitos primarios de dos especies cercanas de mamífero: la rata y el ratón. Para ello se determinó la posición relativa con respecto a la MN de ocho secuencias blanco que corresponden a regiones del genoma muy conservadas en ambas especies y que representan una muestra de diferentes territorios cromosómicos al interior del núcleo en interfase. Nuestros resultados mostraron que el patrón de relaciones topológicas entre el DNA y la MN no está conservado entre especies cercanas y sugieren que la NHOS es especie-específica. Esto indica que los factores de tipo biológico no son determinantes directos de las interacciones entre el DNA y la MN.
ABSTRACT In metazoans, DNA is organized in supercoiled loops that are stabilized by their association with a nuclear compartment or substructure known as the nuclear matrix (NM). The interactions between DNA and the NM are more stable than those between DNA and chromatin proteins and define a nuclear higher order structure (NHOS). The establishment of anchorages between DNA and the NM is a necessary and fundamental condition in the organization of the genome, which preserves the integrity and coherence of such a massive genome within the nucleus. There is evidence that the NHOS is necessary for cell viability and that it has relevant implications for the appropriate nuclear physiology. Current evidence suggests that thermodynamic and structural constraints drive the actualization of the interactions between DNA and the 3 NM. To investigate whether functional factors may also determine the NHOS, we decided to study the NHOS from an evolutionary perspective, since in case that the NHOS is conserved during evolution, this would suggest that biological factors are involved in its establishment, since any functional factor that is determinant for the survival and/or adaptation of the species is a target of natural selection. We carried out a coarse-grained, comparative evaluation of the DNA-NM topological relationships in primary hepatocytes from two closely related mammals: rat and mouse, by determining the relative position to the NM of eight target sequences corresponding to highlyconserved genomic regions that also represent a sample of distinct chromosome territories within the interphase nucleus. Our results indicate that the pattern of topological relationships between DNA and NM is not conserved in two closely related species, suggesting that the NHOS is species-specific. This suggests that biological factors are not direct determinants of the interactions between DNA and the NM. In order to further investigate whether functional factors may participate in determining the NHOS, we compared the NHOS of neurons with that from hepatocytes and naïve B-lymphocytes in the rat. Neurons retain the capacity to replicate the genome under certain circumstances despite being postmitotic, and remain transcriptionally very active. Therefore, if the NHOS of neurons is similar to that of hepatocytes or naïve B-lymphocytes, this would suggest that functional factors (such as replication and/or transcription) have a role in determining this structure. Our results indicate that the NHOS of neurons is completely different from that one observed in hepatocytes or in naïve B-lymphocytes, suggesting that the NHOS is independent of functional factors. Therefore, now we know that NHOS is tissue-specific and species-specific, and that there is no obvious causal relationship between the functional processes of the nucleus (replication and transcription) and the NHOS; and this suggests that physical and thermodynamic factors are more important for establishing the NHOS. This structure represents a baseline level of organization on which the functional processes adapted to it unfold.
CONACYT-México proyecto CB-176794

Orientador: Ney Lemke
Resumo: Os sistemas de importação nuclear são responsáveis pelo intercâmbio entre o citoplasma e o núcleo da célula, permitindo que proteínas com função nuclear migrem através da membrana que separa essas duas regiões. A via de importação mais estudada é a via clássica de importação nuclear mediada pela Importina-α (Impα). A Impα é uma proteína solenóide, composta por repetições em tandem do motivo Armadillo (ARM) que formam uma estrutura longa e contorcida, com pequenos arcabouços ao longo do eixo da proteína. As sequências de localização nuclear clássicas (cNLSs) presentes nas proteínas-alvo de importação são compostas por resíduos carregados positivamente e estabelecem pontes salinas, ligações de hidrogênio e contatos hidrofóbicos com esses arcabouços da Impα. Esse reconhecimento pode ocorrer em um ou em dois sítios da Impα, caracterizando a cNLS como monopartida ou bipartida, respectivamente. A maioria das informações estruturais do complexo cNLS-Impα provém de dados de cristalografia e pouco se sabe sobre a dinâmica conformacional deste sistema. Uma abordagem para tratar da dinâmica de um sistema é o uso de técnicas de simulação de biomoléculas, tais como dinâmica molecular e análise de modos normais. Com base nessas técnicas de simulação, o presente estudo teve como objetivo compreender os mecanismos de interação e dinâmica conformacional envolvidos no reconhecimento de cNLSs pela Impα. Particularmente, este trabalho focou nas cNLSs das proteínas Nucleoplasmina e Ku70 complexa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: Nuclear import systems are responsible for the exchange between the cytoplasm and the nucleus of a cell, allowing nuclear proteins to migrate through the membrane that separates these two regions. The most studied import pathway is the classical nuclear import mediated by Importin-α (Impα). Impα is a solenoid protein consisting of tandem repeats of the Armadillo (ARM) motif, forming an extended and twisted structure with small grooves along the protein axis. The classical nuclear localization sequences (cNLSs) of cargo proteins are composed of positively charged residues and establish salt bridges, hydrogen bonds and hydrophobic contacts with the grooves of Impα. Such recognition can occur at one or two sites of Impα, thus characterizing the cNLS as monopartite or bipartite, respectively. Most structural information of the cNLS-Impα complex is from crystallographic data and little is known about the conformational dynamics of this system. One approach to address the dynamics of a system is the use of biomolecular simulation techniques such as molecular dynamics and normal modes analysis. Based on these techniques, this study aimed to understand the mechanisms of interaction and conformational dynamics involved in the recognition of cNLSs by Impα. In particular, this work focused on the cNLSs of Nucleoplasmin and Ku70 proteins complexed with Impα. The study of Nucleoplasmin determined two main motions of Impα that may be associated to the cNLS recognition: bending and twisting... (Complete abstract click electronic access below)
Doutor

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear e extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga. Uma série de estudos, porem, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Esta proposta teve como objetivo gerar células bovinas pluripotentes através da reprogramação direta e utilizá-las na transferência de núcleo para a produção animal visando o aumento da eficiência da reprogramação celular. Para tal, foi analisada a capacidade de indução e manutenção da pluripotência em células somáticas bovinas comparando-as com células humanas e equinas (células pluripotentes induzidas - iPSC), assim como a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos através da combinação das técnicas em bovinos. As células iPS derivadas neste estudo foram produzidas mediante transdução lentiviral de fatores de transcrição (OSKM) murinos, caracterizadas e utilizadas como doadoras de núcleo na clonagem. Resumidamente, oócitos bovinos obtidos de ovários provenientes de abatedouros foram maturados in vitro por 18h, enucleados e reconstruídos com células iPS (n=203 ou fibroblastos fetais bovinos (bFF, n=153), em cinco repetições. Após reconstrução os embriões foram ativados com ionomicina e 6-DMAP e cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Foram avaliadas as taxas de fusão, clivagem (48h após ativação) e desenvolvimento a blastocisto (192h após ativação) e os resultados foram submetidos ao teste de Qui-quadrado a 5% de significância. Foi possível a produção de embriões a partir de biPS, entretanto, este estudo evidenciou a necessidade de otimização da sincronização do ciclo celular em células iPS. Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à capacidade de produção a blastocisto ou clivagem, porém o grupo reconstruído com células iPS apresentou uma menor taxa de fusão. Com a finalidade de entender a influência de fatores de transcrição específicos na reprogramação nuclear, bFF expressando OCT4 humano (hOCT4) e hSOX2 combinados com as proteínas repórteres fluorescentes vexGFP e mCitrine, respectivamente, foram submetidas à separação celular por citometria de fluxo e utilizados como doadores de núcleo. Foram utilizados bFF expressando OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicata), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicata) ou células controle (não transduzidas, n=178 e n=149, em quadruplicata para grupos OCT4 e SOX2, respectivamente). Não foram encontradas diferenças entre os grupos nas características de capacidade de desenvolvimento in vitro estudadas. Em conclusão, este estudo relata a possibilidade de produção de células bovinas reprogramadas, além de também mostrar que a transferência de núcleo utilizando células expressando hSOX2 ou hOCT4, ou já reprogramadas, resulta em taxas similares de produção embrionária quando comparadas à utilização de células controle. O conhecimento da contribuição de cada fator utilizado na reprogramação induzida, aliado a estudos de comparação com a capacidade de desenvolvimento in vitro de organismos derivados de células reprogramadas deverá contribuir para o aumento da eficiência da clonagem e produção animal in vitro como para a medicina regenerativa.
Nuclear transfer and induced reprogramming are technologies usually used for the induction of somatic cells into an embryonic-like pluripotent status. The knowledgment of nuclear reprogramming process is highly desirable, leading to important contributions for both basic and applied sciences; for example, resulting in the increase in the efficiency of several animal biotechnologies, or else enabling autologous cellular therapy for medical purposes. However, basic studies are still needed in order to enable such applications, once the mechanisms controlling in vitro reprogramming are yet to be unraveled. This study aims to generate induced pluripotent bovine stem cells through direct reprogramming and its use in nuclear transfer in order to enhance the cellular reprogramming efficiency, For that, the potential of pluripotency induction and maintenance was analyzed in bovine somatic cells, comparing those with human and equine cells, as well as the potential of embryonic development after combining direct and nuclear reprogramming. iPS cells derived in this study were produced trought lentivirus transduction of mouse transcription factors (OSKM), further characterized and used as nuclei donors for cloning. In summary, bovine oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries, in vitro matured for 18h, enucleated and reconstructed with iPS cells (n=203) or fetal fibroblasts (bFF, n=153), in five replicates. Embryos were reconstructed, chemically activated with ionomycin and 6-DMAP and cultured in vitro until blastocyst stage. Fusion, cleavage (48h post activation) and blastocyst developmental rates (192h post activation) were analyzed and result submitted to Chi-square test at 5% significance. biPS enabled embryo production, however further optimization on cell cycle synchronization still needs to be accomplished. No difference was observed between groups regarding cleavage or blastocyst developmental rates, however iPS group presented a reduced fusion rate when compared to control. For a better understanding on how reprogramming associated transcription factors could influence on nuclear reprogramming, bFF expressing human OCT4 (hOCT4) or hSOX2 combined with the fluorescent protein reporters vexGFP and mCitrine, respectively, were submitted to flow citometry cell sorting and used as nuclei donors. bFF expressing OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicate), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicate) or control cells (non transduced, n=178 and n=149, in quadruplicate for OCT4 and SOX2, respectively) were used. No difference was observed between groups regarding the in vitro developmental potential rates. In conclusion, the present study reports the generation of reprogrammed bovine cells, and its use the nuclear transfer. Donor cells expressing hOCT4, hSOX2 or reprogrammed cells resulted in similar developmental in vitro rates when compared to controls. The knowledge of each reprogramming factor influence on in vitro reprogramming, together with comparison studies on in vitro developmental potential of organisms derived from reprogrammed cells should help enhancing not only the cloning efficiency and in vitro animal production, but also the regenerative medicine.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:40:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) carlota_belisario_ioc_mest_2006.pdf: 1121044 bytes, checksum: 25daf8af9a2ba2cbded57e0f1f900c58 (MD5) Previous issue date: 2014-10-07
Devido às suas grandes semelhanças morfológicas, Triatoma maculata e Triatoma pseudomaculata, que constituem para Carcavallo et al. (2000) o ´complexo maculata`, eram consideradas a mesma espécie até 1964 (Corrêa e Espínola, 1964). Essas espécies são alopátricas e, segundo Schofield (1988), T. maculata teria sido introduzida no Nordeste brasileiro por aves migratórias, com subseqüente especiação, e formação da espécie T. pseudomaculata. Estudos utilizando isoenzimas demonstraram grande distância genética entre as duas espécies e grande proximidade entre T. pseudomaculata e Triatoma wygodzinsky, com subseqüente proposta de reestruturação do ´complexo maculata`(Santos et al., 2003) Os estudos de cruzamentos entre em triatomíneos permitem a formulação de hipóteses acerca da origem e divergência de espécies e podem ajudar a entender a sistemática do grupo. O objetivo deste trabalho é determinar o grau de isolamento reprodutivo entre T. maculata e T. pseudomaculata, e caracterizar geneticamente as espécies e os híbridos obtidos pelos cruzamentos interespecíficos, permitindo o cotejamento de aspectos genéticos com características biológicas e comportamentais destes insetos. Os nossos resultados mostram que T. maculata e T. pseudomaculata não apresentam diferenças quanto à reprodução e são espécies que se cruzam produzindo híbridos inférteis. Os resultados dos cruzamentos intra e interespecíficos, da morfologia, da morfometria geométrica e da análise de RAPDs mostram T. maculata e T. pseudomaculata como espécies bem diferenciadas Os híbridos obtidos são mais semelhantes morfologicamente à T. maculata, entretanto, geneticamente estão mais próximos à T. pseudomaculata. T. wygodzinsky e os híbridos obtidos com estas espécies foram os que se apresentaram mais distantes dos demais grupos estudados. Os resultados indicam que independentemente de uma origem evolutiva comum entre essas três espécies, atualmente elas estão bastante diferenciadas geneticamente e não devem, portanto, constituir complexo entre elas
Due to its great morphological similarities, Triatoma maculata and Triatoma pseudomaculata , classified by Carcavallo et al. (2002) in the “maculata complex”, were considered the same species until 1964 (Corrêa e Espínola, 1964). These species are alopatric and, according to Schofield (1988), T. maculata would be introduced in the brazilian Northeastern by migratory birds, with subsequent speciation, forming the species T. pseudomaculata . Studies using isoenzymes showed great genetic distance among these two species and high affinity among T.pseudomaculata and Triatoma wygodzinsky , resulting in a new proposal of ́ maculata complex ` re-organization (Santos et al, 2003). Hybridization studies in Triatomines allo w the formulation of hypothesis about the origin and divergence of species and may help to understand the systematic of the group. Therefore, the objective of this work was to determine the level of reproductive isolation among T. maculata and T. pseudomaculata , and to characterize genetically the species an d hybrids obtained by the interspecific cross breeding, allowing the comparison of genetic aspects with other biological characteristics and behavior of these insects. T. maculata and T. pseudomaculata did not present difference in relation to the reproduction (eggs laid, time for eclosion and viability of the eggs) and are able to produce hybrids, but infertiles. The results obtained with the intra and interspecific cross breeding, morphological analysis, geometric morphometry and RAPDs showed T. maculata and T. pseudomaculata as well differentiated species. The hybrids obtained are morphologically more similar to T. maculata , but are genetically more close to T. pseudomaculata. T.wygodzinsky and the hybrids obtained with these species were the most distant from the other st udied groups. Our results indicate that, independent of the existence or not of a common evolutive origin among these species at present they are already genet ically well differentiated and would not constitute a complex

Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 12194499 bytes, checksum: cf6dad6e7629970dd8e06f4179a17141 (MD5) Previous issue date: 2014-09-18
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
The triazole nucleus and its derivatives have attracted considerable attention in recent decades for their chemotherapeutic potentials. Specifically, the interest in molecules containing the 1,2,3-triazole as chemotherapeutic agents for various diseases has increased, because they are known to exhibit a wide range of biological activities, such as anti-proliferative and anti-neoplastic. The aim of this study was to evaluate the potencial anti-cancer effect of new triazole derivatives from 1,4-naphthoquinone, elucidating their cytotoxicity and cell death mechanisms involved. From five cancer cell lines tested, leukemic cells (HL-60 and K562) were the most sensitive, and between the eight triazole compounds tested (called C1 to C8), compounds C2 and C3 showed the best IC50 of 14 μM and 41 μM for HL-60 cells and 24 μM and 81 μM for K562 cells, respectively. However, these two compounds showed very little cytotoxic effect towards PBMC normal cells with IC50 superior to 80 μM. Investigating the type of cell death induced by compounds C2 and C3, it was showed that compounds induced apoptosis in HL-60 cells and cell cycle arrest in the S-phase, and necrosis in K562 ones. Cell cycle arrest in S phase was related to the expression of the p21 gene in K562. Results revealed a reduced expression of Bcl-2 protein and an increased expression of BAX protein in HL-60 cells. Moreover, it was found cytochrome c release, suggesting involvement of the intrinsic pathway in apoptosis induction in these cells. Activation of this pathway may be through inhibition of ERK phosphorylation. Our results also showed that pre-treatment of HL-60 cells with N-acetyl cysteine (1 mM) for 1 hour reduced the cytotoxic effect of compounds C2 and C3 for 30,83% and 26,47% respectively; indicating that the induction of apoptosis in HL-60 is mediated by increased production of intracellular ROS. Thus, it can be concluded that C2 and C3 compounds showed cytotoxic effects on HL-60 and K562 cells, so, can be considered as prototype anti-leukemic molecules.
O núcleo triazol e seus derivados têm atraído uma atenção considerável nessas últimas décadas devido ao seu potencial quimioterápico. Mais especificamente, tem se verificado o interesse em moléculas que contêm o grupo 1,2,3-triazol, isto porque esta classe de heterocíclicos é conhecida por exibir uma vasta gama de atividades biológicas, tais como, anti-proliferativo e anti-neoplásico. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar o potencial anticancerígeno de novos triazóis derivados do 1,4-naftoquinona, elucidando as suas citotoxicidades e o mecanismo de morte envolvido. Os resultados obtidos revelaram que, das cinco linhagens cancerígenas testadas, as linhagens leucêmicas HL-60 e K562 foram as mais sensíveis, e dentre os oito compostos (denominados C1 a C8) testados, C2 e C3 foram os mais citotóxicos, apresentando CI50 de 14 μM e 41 μM, em HL-60 e de 24 μM e 81 μM em K562, respectivamente. Entretanto, os compostos foram menos citotóxicos nas células normais do sangue periférico humano com CI50 acima 80 μM. Investigando o tipo de morte induzido pelos compostos nas duas linhagens, foi demonstrado que os compostos C2 e C3 induziram apoptose em HL-60. Já nas células K562, este dois derivados provocaram a parada do ciclo celular na fase S e necrose. A parada do ciclo celular na fase S em K562 foi relacionada com a expressão do gene p21. Foi revelado a diminuição da expressão da proteína Bcl-2 e o aumento da expressão da proteína BAX nas células HL-60, e ainda verificou-se a liberação do citocromo c sugerindo a participação da via intrínseca na indução da apoptose em HL-60. A ativação dessa via pode ser via inibição da fosforilação da proteína ERK. Os resultados mostraram também que durante uma hora de pré-tratamento das células HL-60 com o N-acetil cisteina (1 mM), houve a redução da citotoxicidade dos compostos C2 e C3 de 30,83% e 26,47% respectivamente; indicando que a indução da apoptose em HL-60 é mediada pelo aumento da produção das espécies reativas de oxigênio intracelulares. Dessa forma, pode-se concluir que os compostos C2 e C3 apresentaram efeitos citotóxicos frente às linhagens HL-60 e K562, então, podem ser considerados como protótipo de moléculas anti-leucêmicas.

A asma é definida como uma doença inflamatória crônica de caráter multifatorial, caracterizada pela obstrução reversível das vias aéreas, denso infiltrado inflamatório e hiper-reatividade brônquica a estímulos externos. Clinicamente, a doença é marcada por sintomas episódicos de dispneia, sibilo, tosse seca e sensação de aperto no peito. A terapia convencional da asma compreende o uso de anti-inflamatórios e broncodilatadores. A budesonida é um glicocorticoide esteroide e é dos fármacos mais utilizados na terapêutica da asma. No entanto, a budesonida apresenta baixa biodisponibilidade oral e o uso prolongado pode levar a efeitos adversos graves como afinamento da pele e supressão adrenocortical. No desenvolvimento de novas formulações, a avaliação da toxicidade é de extrema importância. Por conseguinte, o uso de cultura celular é de grande valia no desenvolvimento de protocolos para avaliação da toxicidade de novas formulações. Adicionalmente, a nanotecnologia é uma ferramenta importante para resolver problemas de biodisponibilidade e para contornar efeitos adversos da terapêutica convencional. Desta forma, o objetivo desta tese foi desenvolver um novo sistema nanoestruturado na forma de pó seco para inalação (Dry powders inhalers – DPI), obtido por aspersão contendo budesonida encapsulada, visando o tratamento da asma aguda e crônica. Essa proposta foi baseada na obtenção de um sistema pulverulento nanoestruturado com tamanho reduzido e controlado, visando a entrega pulmonar da budesonida. Na etapa de pré-formulação foi realizado um estudo fatorial avaliando diferentes métodos de preparação das nanocápsulas e os adjuvantes de secagem utilizados. As análises de tamanho de partícula, da formulação selecionada (nanocápsulas contendo budesonida e secas por aspersão com leucina) mostraram um tamanho reduzido e adequado para a administração pulmonar (2,7 μm). A morfologia demonstrou que estas partículas possuem um tamanho reduzido, forma esférica e superfície irregular, características importantes para a administração pulmonar. Quando analisada a distribuição pulmonar in vitro, em Impactador de Andersen, a formulação apresentou uma fração de partículas finas (Fine Particle Fraction – FPF) de 28%. Analisando os resultados dos experimentos em modelos de asma aguda e crônica induzidos por ovalbumina, os resultados da mecânica respiratória e função pulmonar mostraram uma diminuição na resistência e na elastância pulmonar, quando a budesonida nanoencapsulada foi utilizada, quando comparada com uma formulação comercial de budesonida, nas duas doses utilizadas (0,5 e 1,0 mg/Kg). Esse tratamento com nanocápsulas também mostrou eficiência na redução da inflamação, pela redução do número de leucócitos totais no fluido de lavagem bronco alveolar (Broncho Alveolar Lavage Fluid – BALF) e, principalmente, redução significativa no número dos eosinófilos no infiltrado pulmonar. Corroborando esses resultados, a quantificação da eotaxina – 1 e das citocinas pró-inflamatórias foram reduzidas, quando comparadas ao tratamento comercial. A análise histopatológica mostrou que quando o tratamento com as nanocápsulas foi utilizado, a produção de muco foi reduzida, bem como a produção de fibrose sub-epitelial, sugerindo um possível efeito sobre o remodelamento tecidual. Os resultados de toxicidade utilizando linhagem celular epitelial pulmonar (H441) mostrou uma redução na toxicidade da budesonida, quando encapsulada nas nanopartículas, tanto na forma de suspensão como na forma pulverulenta. Essa redução da toxicidade foi de 75% e de 50%, na dose de 100 μg/mL, para a suspensão e para o DPI, respectivamente. O conjunto dos resultados obtidos mostrou a potencial aplicabilidade da budesonida nanoencapsulada para o tratamento da asma, utilizando esse novo sistema DPI.
Asthma is characterized as a chronic inflammatory disease developed by multifactorial aspects such as genetic predisposition and exposure to environmental factors such as pollution, smoke and microorganisms. The conventional asthma therapy comprises the use of bronchodilators and anti-inflammatory. Budesonide is a glucocorticoid and is the most frequently used therapy in the treatment of asthma. However, this drug has low oral bioavailability and long term use may lead to adverse effects such as skin thinning and adrenal suppression. The evaluation of the toxicity of new formulation has critical role in the pharmaceutical development. The use of cell culture experiments can help this aspect. Additionally, nanotechnology is an important tool to solve problems regarding bioavailability and to circumvent adverse effects of conventional therapy. The aim of this work was to develop a nanostructured system as dry powder inhaler (DPI) containing budesonide loaded, obtained by spray-drying, targeting the treatment of acute and chronic asthma. This proposal was based on obtaining a nanostructured powder system with reduced and controlled size, aiming an alternative to treatment of asthma. A factorial study comparing different methods to produce the nanocapsules as well as the type of drying adjuvants was performed. The particle size of the selected formulation was 2.7 μm, an adequate reduced size suitable for pulmonary administration. The morphology of these particles showed a small size, spherical shape and irregular surface. All these characteristics are important for pulmonary administration. When analyzed the in vitro pulmonary distribution of the DPI, using an Andersen Cascade Impactor, showed a fine particle fraction (FPF) of 28%. Analyzing the results of the biological experiments, the mechanical respiratory and pulmonary function showed a decrease in lung elastance and resistance when budesonide was used nanoencapsulated compared with a commercial formulation of budesonide in two doses (0.5 and 1.0 mg / kg). Both treatments also showed nanocapsules efficiency in reduction of inflammation by reducing the total of leukocytes in the bronchial alveolar lavage fluid (BALF) and especially significant reduction in eosinophil infiltration in the lung tissue. Corroborating with these results, the quantification of eotaxin - 1 and proinflammatory cytokines was reduced when compared to commercial budesonide treatment. Histopathological analysis showed that when treatment with the nanocapsules was used, mucus production was reduced and reversed the phenomena of airway remodeling. The cytotoxicity assay by Alamar blue using the bronchial epithelium cell line (H441) showed a reduction on the toxicity of budesonide when the nanocapsules were used even in suspension or in the DPI. The cytotoxicity reduction were 75 and 50%, at 100 μg/mL, for the suspension and the DPI, respectively. All these results show that budesonide-loaded nanocapsules in dry powder inhaler is a promising approach for the treatment of asthma.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAHFO.pdf: 1227037 bytes, checksum: 19cd43a17feb785ba19cbf4947c4fadc (MD5) Previous issue date: 2006-05-19
Universidade Federal de Minas Gerais
The involvement of the septal area in important regulatory mechanisms of water intake and cardiovascular adjustments has been shown by several studies. The aim of this work is to study the involvement of a subdivision of the lateral septal area on dipsogenic and cardiovascular adjustments. The effects of lateral septal intermediate nucleus lesions (LSI) on the water intake induced by different protocols, like angiotensin II and carbachol microinjected into the lateral ventricle, water deprivation by twenty four hours, intragastric hypertonic load and subcutaneous isoproterenol were investigated. We also studied the role of the LSI in cardiovascular changes induced by angiotensin II and carbachol microinjections into the lateral ventricle. Our results showed that the LSI rats did not alter body weight and did not alter the daily water intake when compared to the sham group. The LSI lesions affected the water intake induced by angiotensin II (7.6 ± 1.15 vs Sham: 17.01 ± 1.07 ml/60 min) and that induced by carbachol (9.58 ± 1.51 vs Sham: 13.62 ± 1.96 ml/60 min), as well as affected the pressor response produced by angiotensina II (∆ 21.3 ± 1.5 vs Sham: ∆ 30.1 ± 2.5 mmHg) or induced by carbachol (∆ 39.0 ± 2.6 mmHg vs Sham: ∆ 49.9 ± 3.2 mmHg) into the lateral ventricle. The LSI lesions decreased dipsogenic responses after water deprivation (18.18 ± 0.81 vs Sham: 21.78± 1.23 ml/120 min) and after subcutaneus isoproterenol (5.4 ± 0.4 vs Sham: 8.4 ± 0.6 ml/120 min), but they did not decrease the water intake after intragastric hypertonic NaCl load (10.5 ± 0.47 vs Sham: 11.56 ± 1.24 ml/120 min). Thus, our results suggest the involvement of LSI through cholinergic and angiotensinergic mechanisms, as well as the central osmoreceptors activation, which possibly act by modulating the hypothalamic nucleus activity in both water intake and cardiovascular adjustments.
Estudos têm mostrado a participação da área septal em mecanismos importantes de regulação da ingestão de água e também em mecanismos que interferem em alterações cardiovasculares. A fim de se estudar a participação de uma subdivisão da área septal lateral nos mecanismos dipsogênicos e de regulação cardiovascular, estudamos os efeitos da lesão eletrolítica bilateral do núcleo septal intermediário (ASLi) sobre a ingestão de água induzida pelos protocolos: injeção de angiotensina II ou de carbacol no ventrículo lateral; privação hídrica por vinte e quatro horas; gavagem de solução hipertônica de NaCl e injeção subcutânea de isoproterenol; e também sobre as alterações cardiovasculares induzidas pela injeção de angiotensina II ou de carbacol no ventrículo lateral . Nossos resultados mostraram que a lesão eletrolítica do núcleo septal intermediário não alterou o ganho de peso e também não alterou a ingestão diária de água quando comparados aos animais com lesão fictícia. A lesão da ASLi diminuiu os efeitos dipsogênicos da angiotensina II (7,6 ± 1,15 vs LF:17,01 ± 1,07 ml/60 min) e do carbacol (9,58 ± 1,51 vs LF: 13,62 ± 1,96 ml/60 min) injetados no ventrículo lateral, além de prejudicar o efeito pressor produzido pela ANG II (∆ 21,3 ± 1,5 vs LF: ∆ 30,1 ± 2,5 mmHg) ou pelo carbacol (∆ 39,0 ± 2,6 mmHg vs LF: ∆ 49,9 ± 3,2 mmHg) injetados no ventrículo lateral. Também, a lesão ASLi diminuiu as respostas dipsogênicas induzidas pela privação hídrica por 24 horas (18,18 ± 0,81 vs LF: 21,78± 1,23 ml/120 min) e pela injeção subcutânea de isoproterenol (5,4 ± 0,4 vs LF: 8,4 ± 0,6 ml/120 min), mas não diminuiu a ingestão de água induzida pela sobrecarga intragástrica de NaCl 2 M (10,5 ± 0,47 vs LF: 11,56 ± 1,24 ml/120 min). Com isso, nossos resultados sugerem a participação da ASLi, por meio de mecanismos colinérgicos e angiotensinérgicos, e a ativação de osmorreceptores centrais cuja atuação seria a de modular a atividade de núcleos hipotalâmicos, tanto para a ingestão de água, quanto para ajustes cardiovasculares.

The nuclear matrix (NM) its a compartment formed by proteins, DNA and RNA. This compartment is obtained by extracting the nucleus with high-ionic strength solutions, non ionic detergents and a treatment with nucleases. In the interphase the genome of metazoan cells is organized in supercoiled loops anchored to the NM by loop anchorage regions (LARs). The interaction between the NM and LARs resists extraction with high-ionic strength solutions. LARs are tissue specific but are not necessarily conserved between species even within the same cell type. Although LARs occur in large numbers in the nucleus, no consensus nucleotide sequence has been found for LARs and in vitro binding assays shows that virtually any DNA fragment shows a given affinity for NM proteins, so it might be that factors independent of the nucleotide sequence determine the DNA-NM interactions. Besides, it has been reported that the NM has affinity for supercoiled bacterial plasmids and they occupy sites different to those occupied by bound linearized DNA fragments. This suggests that the topology of DNA might determine its affinity for the NM. This topology is an emergent property that results from the the structural properties of DNA and the location of a given genomic region within the context of the chromosome. Therefore, the local topology of a DNA segment is altered when the segment is removed from its original context. The length at which the DNA adopts a linear topology in solution is called the persistence length and corresponds to ≈150 bp for DNA of random sequence. The DNA may acquire complex topologies when its length goes beyond the Kuhn length that corresponds to twice the persistence length (300 bp). Therefore, we propose that the affinity of a region of DNA for the NM is an emergent property linked to the local topology of DNA, which in turn is the result of the 3D organization of the corresponding genomic region. In order to test this hypothesis we identified two regions of ≈2kb that constitute LARs in situ at the albumin-family locus. These LARs, once isolated and devoid of their natural genomic context, had no affinity for the NM in vitro. However, subfragments of the LARs, whose length is close to the persistence length, bind to the NM in vitro and resist the extraction with high-ionic strength. DNA fragments unrelated to the LARs identified in situ, but close to the persistence length of DNA, also bind to the NM in vitro in a salt-resistant fashion. DNA length correlates with the topology displayed by such a DNA in solution, our results suggest that a linear topology is enough for supporting the binding of DNA to the NM. Given that the length of DNA modulates its affinity for NM, we propose a model in which any region of the genome that manifests a linear topology in situ has the potential for establishing an anchorage to the NM. The topology of DNA in vivo depends on several factors such as: the thermal agitation of the system, the structural stress and topological restrictions or constraints (supercoiling) of DNA. Such a topology together with the global dynamics within the cell nucleus may determine the actualization or cancelation of DNA-NM interactions. Our proposal is a starting point for understanding the process of structural organization of the genome in the cell nucleus of metazoans.
La matriz nuclear (MN) es un compartimento formado por proteínas, DNA y RNA, que resiste a la extracción con detergentes, altas concentraciones de sal y el tratamiento con nucleasas. En la interfase el genoma de las células de metazoarios se encuentra organizado en bucles hiperenrollados que se encuentran anclados a la MN mediante segmentos denominados regiones de anclaje del bucle (LARs por sus siglas en inglés). La unión o interacción entre LARs y MN resiste la extracción con alta fuerza iónica. Los LARs son tejido específico y no están necesariamente conservados entre especies aún en el mismo tipo celular. A pesar de que los LARs ocurren en gran número en el núcleo, no se ha encontrado una secuencia consenso que los determine, por el contrario, ensayos de afinidad in vitro demuestran que prácticamente cualquier fragmento de DNA presenta cierta afinidad por las proteínas de MN, por lo que podrían ser factores independientes a la secuencia de nucleótidos los que definan dichas interacciones. A este respecto se ha reportado que la MN tiene afinidad por plásmidos bacterianos hiperenrollados que ocupan sitios diferentes de los sitios a los que se unen fragmentos de DNA linearizados. Esto sugiere que puede ser la topología del DNA la que determine en forma primaria su afinidad por la MN. Esta topología es una propiedad emergente que resulta de la ubicación genómica de la región en el contexto del cromosoma y de las propiedades estructurales del DNA. Por lo tanto, la topología local de un segmento de DNA resulta alterada cuando es sacada de su contexto original. En solución, la longitud a la que el DNA adopta una topología lineal se denomina longitud de persistencia y se ha determinado que para el DNA de secuencia aleatoria esta corresponde a ≈150 pb. La longitud de Kuhn corresponde a dos veces la longitud de persistencia y es a partir de longitudes mayores a la de Kuhn que el DNA es capaz de adoptar topologías complejas. Por lo tanto, proponemos que la afinidad de una región del DNA por la MN es una propiedad emergente vinculada a la topología local del DNA, la cual a su vez es resultado de la organización en 3D de la región genómica correspondiente. Para probar esta hipótesis identificamos dos regiones de ≈2kb que in situ constituyen LARs en el locus de la familia albúmina. Estos LARs, una vez aislados y desprovistos del contexto genómico natural, no tuvieron afinidad por la MN en ensayos in vitro. Sin embargo, subfragmentos de los LARs cuya longitud es cercana a la longitud de persistencia, se unieron a la MN in vitro y son resistentes a la extracción con alta fuerza iónica. Fragmentos de DNA con longitud cercana a la longitud de persistencia pero ajenos a los LARs identificados in situ también se unieron a la MN, in vitro, en forma resistente a la extracción con sal. La longitud del DNA está estrechamente relacionada con la topología que despliega el DNA en solución, nuestros resultados sugieren que una topología lineal es suficiente para que el DNA se una a la MN. Dado que la longitud del DNA modula su afinidad por la MN, se puede proponer un modelo en el cual cualquier región del genoma que manifieste una topología lineal in situ tendrá la capacidad potencial de establecer un anclaje con la MN. Que una región o segmento del genoma manifieste topología lineal depende de varios factores como son: la agitación termal del sistema, el estrés estructural y las restricciones o limitantes topológicas del DNA (ejemplo: hiperenrollamiento). Lo anterior, asociado con la dinámica global del núcleo, puede resultar en la formación o desprendimiento de los anclajes DNA-MN y permite establecer un punto de partida para entender el proceso de organización estructural del genoma en el núcleo celular de los metazoarios.
CONACYT-México proyecto CB-176794 otorgado al Dr. Armando Aranda Anzaldo

A proteína de matriz do Virus Respiratório Sincicial humano foi o foco deste trabalho. Verificamos que o gene de matriz possui sítios internos de poliadenilação, sinais de instabilidade de RNA, baixo índice de adaptação de codons (CAI) e conteúdo GC, que podem impedir a expressão gênica vitro. Quando clonado sob controle do promotor de CMVie, o gene selvagem não apresenta expressão detectável, enquanto um gene sintético com a sequência do gene de matriz otimizada apresenta altos níveis de expressão em células transfectadas. Esse alto nível de expressão permitiu a confirmação da presença da proteína M no núcleo no início de sua expressão, por análise em microscopio confocal de varredura a laser, além de sua associação a membranas em regiões conhecidas como lipid rafts. Também foi observado que a proteína M é capaz de associar à proteína tropomiosina. Ainda foram analisados os possíveis domínios funcionais através de expressão de variantes da proteína M com deleções de trechos da proteína. Finalmente foi analisada a capacidade de indução de resposta imune.
The Human Respiratory Syncytial Vírus was the focus of this work. We found that matrix gene has internal polyadenilation sites, RNA instability motifs, low codon adaptation index (CAI) and GC content, that may impair its expression in vitro. When cloned under control of the ieCMV promoter, the wild-type M gene expression was not detectable, whereas a synthetic optimized matrix gene was highly expressed in transfected cells. This high level of expression made possible to follow M nuclear localization in the beginning of its expression by confocal laser scanning microscopy, and its association with membranes in regions known as lipid rafts. It has also been found that the matrix protein associates with tropomyosin. It was further analyzed the possible functional through expression of deviations of the M protein that lack portions of the protein. Finally it was analyzed its capacity to induce an immune response.

The view on how protein kinases regulate gene expression have recently expanded to include not only transcription factors but also histones, chromatin remodelers or components of the basal transcription machinery, which are directly modified on genomic loci. For the shuttling kinase DYRK1A (dual-specificity tyrosine-regulated kinase), most of its nuclear-associated functions can be explained by DYRK1A cytosolic activities, questioning a role for DYRK1A within the nuclear compartment. In the present study, through an unbiased proteomic approach the first “DYRK1A nuclear interactome” have been generated. DYRK1A interacts with several components of the basal transcriptional machinery as well as with the pre-mRNA processing machinery. Moreover, evidences uncovering a new role for DYRK1A as a transcriptional regulator of specific target genes have been generated. Genome-wide DYRK1A-chromatin analysis shows that the kinase is recruited to RNA polymerase II proximal promoters, via a highly conserved palindromic sequence, and also to RNA polymerase III-dependent promoters. Growth-dependent induction of the expression of a subset of target genes (protein coding and tRNAs) depends on DYRK1A protein levels and/or activity. In addition, downregulation of DYRK1A leads to a reduction in cell size. DYRK1A could therefore work by sitting on promoters of specific genes and act on different components of the basal transcription and/or mRNA processing machinery to modulate gene expression.
Resultados recientes han puesto de manifiesto que la regulación de la expresión génica por proteína quinasas va mas allá de su modulación de la actividad de factores de transcripción, ya que tanto histonas como remodeladores de cromatina o componentes de la maquinaria basal de transcripción puedes ser sustratos de fosforilaciones directamente en regiones genómicas reguladoras. La proteína quinasa DYRK1A (dual-specificity tyrosine-regulated kinase) está presente tanto en el núcleo como en el citoplasma de células de mamífero, si bien la mayoría de sus actividades nucleares pueden ser explicadas por fosforilaciones que ocurren en el citosol, lo que ha planteado dudas sobre si esta quinasa posee funciones específicamente nucleares. En este trabajo, se ha definido el primer "interactoma" nuclear de DYRK1A mediante una aproximación proteómica no sesgada, que ha permitido mostrar que DYRK1A interacciona con componentes de la maquinaria basal de transcripción así como con complejos implicados en el procesamiento del pre-mRNA. Los resultados también han puesto de manifiesto un nuevo papel de DYRK1A como regulador de la transcripción de un grupo específico de genes relacionados con la traducción de proteínas. Análisis a nivel genómico de la presencia de DYRK1A en cromatina muestra que la quinasa es reclutada a regiones proximales de promotores dependientes de la RNA polimerasa II, mediante una secuencia palindrómica altamente conservada, así como a genes dependientes de la RNA polimerasa III. La inducción de la expresión de un grupo de estos genes diana (tanto codificantes como tRNAs) en respuesta a factores de crecimiento depende de DYRK1A. Además, la reducción en los niveles de DYRK1A provoca una reducción en el tamaño de las células. Los resultados permiten proponer un modelo por el que DYRK1A podría regular directamente la expresión de genes diana mediante la fosforilación, en regiones reguladoras promotoras, de diferentes componentes de la maquinaria basal de la transcripción y/o de los complejos proteicos implicados en el procesamiento del mRNA.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017
El núcleo es una organela altamente compleja y es considerado una de las estructuras más importantes de las células eucariotas. Su complejidad es un reflejo de dos funciones esenciales que cumple en la célula: una de ellas es la organización y replicación del genoma mientras que la otra es la distribución y regulación de la información genética. Diversas proteínas sufren modificaciones postraduccionales en el núcleo, modulando directa o indirectamente la expresión génica y la función celular. Entre algunas de las modificaciones que ocurren en las proteínas nucleares de mamíferos podemos mencionar la acetilación, la metilación, la fosforilación, la ubiquitinación y la glicosilación. La glicosilación es la modificación postraduccional (MPT) más frecuentemente encontrada en las proteínas. Luego de la N-glicosilación, la glicosilación tipo O-N-acetilgalactosamina (O-GalNAc glicosilación) de proteínas es el tipo principal de glicosilación en Eucariotas superiores. La biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc es un proceso complejo que típicamente comienza en Golgi. La familia de isoenzimas polipeptidil-GalNAc-Transferasas (ppGalNAc-T de 1 a la 20) catalizan la transferencia de GalNAc, aportado por el azúcar nucleótido UDP-GalNAc, a los residuos de serina (Ser) y treonina (Thr) en las proteínas sustrato, iniciando la glicosilación de tipo O-GalNAc. Luego diferentes glicosil transferasas extienden estos glicanos dando como resultado diversos tipos de glicoproteínas complejas. El presente trabajo de tesis doctoral está centrado en el estudio de la glicosilación de tipo O-GalNAc en el núcleo celular. Con este objetivo, el enfoque de este trabajo fue la descripción de la localización nuclear de todos los actores necesarios para el inicio de la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc: la enzima ppGalNAc-transferasa, el sustrato donante de azúcar UDP-GalNAc, la demostración de la actividad nuclear GalNAc-transferasa y la identificación de las proteínas O-GalNAc glicosiladas como los productos de biosíntesis nuclear. Para ello, se utilizaron líneas celulares humanas crecidas en cultivo, a las cuales se les extrajo el núcleo mediante fraccionamiento sub-celular. En particular se estudió la distribución de la enzima ppGalNAc-T3 mediante microscopía confocal y ensayos de western blot en las diferentes fracciones subcelulares. Además, a partir de los núcleos purificados se comprobó la disponibilidad de UDP-GalNAc en esta organela, la cual puede aumentarse suplementado con un exceso de UDP-GalNAc a los núcleos purificados. Este UDP-GalNAc en exceso es capaz de atravesar la membrana nuclear hacia el interior nuclear y, si estos núcleos son incubados a 37 °C, es posible apreciar la actividad GalNAc-Transferasa nuclear que aumenta en respuesta a la mayor disponibilidad de sustrato. Estos núcleos intactos sobreglicosilados mostraron actividad GalNAc-Transferasa en el interior nuclear, que fue estudiada mediante microscopía confocal y western blot. El nucleoplasma purificado demostró también una importante actividad de ppGalNAc-T. Finalmente las proteínas O-GalNAc glicosiladas en núcleo, purificadas por cromatografía de afinidad, fueron identificadas mediante espectrometría de masa. También se verificó la glicosilación de tipo O-GalNAc sobre una de las proteínas identificadas por el ensayo espectrometría de masa, mediante estudios de co-localización y FRET. Si bien es conocido que otros tipos de glicosilación, como la de tipo O-N-acetilglucosamina (O-GlcNAc glicosilación), ocurre en núcleo; este es el primer reporte de que la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc también puede iniciarse en el núcleo celular. En base a este novedoso hallazgo y a la relevancia funcional de las proteínas identificadas que pueden sufrir esta MPT en núcleo, se postula que la glicosilación de tipo O-GalNAc podría cumplir roles claves regulando la homeostasis nuclear.
Cejas, Romina B. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Nicotra, Viviana Estela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina.
Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Cabanillas, Ana María de Los Angeles. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina.
D´Alessio, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010
Centrosome reorientation is defined as the positioning of the centrosome in a region between the nucleus and the leading edge and is important for cell polarization and directional cell migration. Cdc42 is the key regulator on this process and two main pathways are involved in centrosome reorientation; on one side, centrosome centration by a mechanism dependent of Par complex and dynein/dynactin, and for other side, a rearward nuclear movement dependent on Cdc42-effector MRCK and actin-myosin retrograde flow. Recently, the LINC complex was found to be involved in the rearward nuclear movement pathway. This complex spans the nuclear envelope and involves a SUN domain-containing protein which interacts with a KASH domain-containing protein, localized in the inner and in the outer nuclear membrane, respectively. SUN proteins bind to lamins and KASH proteins to actin filaments; in this way, the LINC complex makes the connection between actin retrograde flow and the nucleus. In fibroblasts, Sun2 and Nesprin-2 co-localize with dorsal actin cables on TAN lines; actin dorsal cables move back by actin retrograde flow and the nucleus moves with them. Other proteins can be involved in the nuclear movement. In a siRNA screen for nuclear envelope proteins, a putative role for Tmem201 in nuclear movement was identified. In S.pombe, Tmem201 homolog connects the heterochromatin with the LINC complex. A connection with LINC complex in mammalians was never reported so far. Tmem201is a nuclear envelope protein and is localized in TAN lines in fibroblasts. The TMEM201depletion by RNA interference inhibited centrosome reorientation. Tmem201 is involved in nuclear movement, probably by the stabilization of the LINC complex in the nuclear membrane. However, Tmem201 might also be involved in centrosome positioning and could act as a key regulator of both pathways.
Durante muito tempo, o papel do invólucro nuclear foi desvalorizado, sendo visto como um mero compartimento de armazenamento de cromossomas. Hoje em dia, após a descoberta de uma nova categoria de proteínas que permitiram criar o elo entre os componentes nucleares e o citosqueleto, o seu papel como organizador essencial é lhe amplamente reconhecido. De facto, a dinâmica entre citosqueleto e invólucro nuclear é fundamental para um correcto posicionamento do núcleo, que depende, por sua vez, de uma correcta migração e ancoragem do núcleo. O posicionamento nuclear é importante em fenómenos tão diversificados como a fertilização, a formação de fibras musculares, a oogénese e a migração celular. A reorientação do centrossoma é um processo que ocorre em fibroblastos, células endoteliais, células epiteliais, astrócitos, células T e neurónios e que leva à polarização celular. Considera-se que o centrossoma está orientado quando este se encontra posicionado entre o núcleo e a frente condutora da célula na migração. Pensa-se que a polarização do centrossoma é um fenómeno prévio à migração celular, importante para a orientação do Golgi, possibilitando a secreção polarizada de precursores membranares e de factores importantes para a frente da célula, possibilitando a migração. Durante muito tempo, pensou-se que seria o centrossoma a mover-se para uma posição anterior ao núcleo. Hoje em dia, sabe-se que é o núcleo que se move, adquirindo uma posição posterior ao centrossoma. A proteína Cdc42 tem um papel fundamental neste processo, conduzindo à activação dos dois mecanismos necessários à reorientação do centrossoma: por um lado, o centrossoma é mantido no centro da célula. Este mecanismo é dependente do complexo Par (Par6, Par3 e aPKC), da dineína e de dinactina. Por outro lado, MRCK, um efector de Cdc42, activa o movimento retrógrado do núcleo. Este movimento aparece aliado ao movimento retrógrado da actina, dependendo da contracção da miosina. Recentemente, um complexo de proteínas transmembranares do invólucro nuclear foi identificado como fundamental para este movimento nuclear. Este complexo é constituído por duas proteínas, uma com um domínio SUN e a outra com um domínio KASH, ambos localizados na extremidade C-terminal da proteína. Este domínio C-terminal é altamente conservado em todos os Metazoa e em leveduras. A proteína com domínio SUN localiza-se na membrana interna e interage com a lamina nuclear pela sua extremidade N-terminal. A proteína com domínio KASH localiza-se na membrana externa; algumas proteínas que contêm este domínio podem atingir dimensões de mais de 800kDa e podem interagir com a actina pelo seu domínio N-terminal. A localização da proteína com o domínio KASH na membrana externa é absolutamente dependente da proteína com o domínio SUN. Uma grande especulação existe ainda em torno da retenção da proteína com o domínio SUN na membrana nuclear. Em mamíferos, por exemplo, a localização de Sun2 parece ser parcialmente dependente da lamina nuclear, enquanto que Sun1 não depende da lamina para se localizar na membrana nuclear interna. Este complexo atravessa assim todo a membrana nuclear e estabelece assim a ligação entre o núcleo e a actina. Este par proteico é assim chamado de Complexo “LINC” – LIgação entre o Núcleo e o Citosqueleto (LInkers of Nucleoskeleton and Cytoskeleton). Um estudo recente reporta a implicação directa do complexo “LINC” na reorientação do centrossoma em fibroblastos de ratinho. Neste caso, o par de proteínas que está envolvido no movimento nuclear é Sun2/Nesprin-2. Este estudo descreve pela primeira vez a existência de cabos actínicos, organizados numa posição dorsal em relação ao núcleo, que se movem retrogradamente ao mesmo tempo do que o núcleo. Estes cabos, e logo também o movimento retrógrado de actina a eles associados, parecem ser o motor para o movimento nuclear. O envolvimento de Sun2 e Nesprin-2 é reportado, quando se observa que ambas as proteínas se co-localizam com estes cabos de actina e que a depleção destas proteínas inibe o movimento nuclear. Esta associação das proteínas do complexo LINC com os cabos dorsais de actina define uma nova estrutura nuclear denominada de “linhas TAN” – linhas Nucleares Transmembranares associadas a Actina (Transmembrane Actin-associated Nuclear). A força gerada pelo movimento retrógrado de actina é assim transmitida ao núcleo através destas estruturas, conduzindo ao movimento. Sabe-se que Sun2 e Nesprin-2 interagem no espaço perinuclear, mas pouco ainda se sabe sobre esta interacção. Para além do mais, a localização de Sun2 no invólucro nuclear continua mal elucidada. Para além disso, as forças aplicadas sobre estas proteínas durante o movimento nuclear, sugerem o envolvimento de outras proteína na estabilização, organização e interacção deste complexo. Num screen de siRNA para proteínas do invólucro nuclear, algumas proteínas revelaram um potencial papel no movimento nuclear, entre estas a proteína Tmem201. Esta proteína é conservada evolutivamente, estando presente em todos os Metazoa e ainda em S.pombe. Pouco se sabe ainda sobre esta proteína, havendo apenas dois estudos realizados até ao momento, um em S.pombe e outro em células humanas. Em S.pombe, o homólogo de Tmem201, Ima1, participa na associação da heterocromatina com o complexo LINC. Ima1 é importante para a estabilização do complexo, e de facto, quando é eliminada do sistema, observam-se deformações do invólucro nuclear e quebras no complexo LINC. Ima1 funcionará assim como estabilizador do complexo LINC à membrana, função ainda não atribuída a nenhuma outra proteína em mamíferos. Em células humanas, a proteína homóloga Samp1 aparece associada com estruturas membranares que se sobrepõem ao fuso mitótico. É também sugerido um possível papel desta proteína na ligação entre centrossoma e núcleo. Este trabalho propõe-se elucidar o envolvimento da proteína Tmem201 no movimento nuclear e na reorientação do centrossoma. Infelizmente, um anticorpo eficaz para a marcação de Tmem201 não está disponível no mercado e assim, um dos passos fundamentais deste trabalho passou pela produção de um anticorpo capaz de reconhecer eficazmente as três isoformas da proteína. Tal foi conseguido com sucesso, sendo possível visualizar perfeitamente uma marcação nuclear da proteína. Uma marcação a nível dos centrossomas, provavelmente não específica, foi também observada. Esta proteína também foi observada em associação aos cabos dorsais de actina que fazem parte das linhas TAN. Este fenómeno é particularmente interessante, se considerarmos que Sun2 e Nesprin-2 são as duas únicas proteínas que foram identificadas até ao momento com localização nestas estruturas. Tendo em conta que as laminas não se encontram nas linhas TAN, Tmem201 poderia funcionar como estabilizador do complexo LINC a este nível, num papel evolutivamente conservado ao papel de Ima1 em S.pombe. O movimento nuclear e da reorientação do centrossoma pode ser estudado facilmente através de um ensaio experimental em fibroblastos em cultura. Neste ensaio, é efectuado uma lesão linear (através de uma ponta de pipeta) numa monocamda confluente de células aderentes (em meio desprovido de soro). A reorientação do centrossoma é depois estimulada por adição de um factor específico (LPA). Através deste ensaio, procurou-se estudar os efeitos da depleção da proteína, por siRNA, na reorientação do centrossoma. Verificou-se uma inibição da reorientação do centrossoma quando a proteína não está presente, o que corrobora o resultado inicial do screen efectuado. Analisando a posição do centrossoma e do núcleo, uma forte inibição do movimento nuclear é visualizada, enquanto que a posição do centrossoma não é afectada. Os efeitos de depleção podem ser parcialmente recuperados aquando da microinjecção de um plasmídeo que codifica para a mais pequena isoforma de Tmem201 (Tmem201 B-GFP). Os resultados obtidos implicam o envolvimento de Tmem201 no movimento nuclear. Contudo, um resultado inesperado foi obtido, aquando da microinjecção do primeiro domínio da proteína: uma deslocalização do centrossoma. Este resultado sugere um possível envolvimento também no posicionamento do centrossoma. Através dos ensaios de microinjecção, foi também possível concluir que o primeiro domínio da proteína parece estar envolvido na localização nuclear da proteína (visto que Tmem201 628-GFP tem uma localização nuclear), enquanto que o segundo domínio da proteína deverá ter um papel no movimento do núcleo (visto que apenas a Tmem201 B-GFP é capaz de recuperar a reorientação do centrossoma). A inibição do movimento nuclear pode dever-se a diversos factores: se Tmem201 for importante na localização nuclear de proteínas envolvidas no movimento do núcleo, ou se por acaso levar à inibição do movimento retrógrado de actina. Verificou-se que a depleção de Tmem201 não afecta a retenção de Sun2, Nesprin-2, lamin A/C, lamin B e Emerin. Quanto à actina, não parece haver uma alteração do citosqueleto actínico. Em suma, Tmem201 aparece implicada na reorientação do centrossoma, mais precisamente no movimento nuclear. Tendo em conta que não afecta a localização de outras proteínas na membrana nuclear e não altera o citosqueleto actínico, Tmem201 poderá ter um papel como estabilizador do complexo LINC na membrana nuclear, sendo importante para o movimento nuclear. Contudo, poderá também estar envolvida no posicionamento do centrossoma. Tmem201 poderá assim actuar como proteína reguladora das duas vias.

Dissertação de Mestrado em Química Farmacêutica Industrial apresentada à Faculdade de Farmácia
A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada, endémica em 98 países e afeta mais de 12 milhões de pessoas em todo o mundo. É causada por parasitas protozoários que são transmitidos ao Homem através da picada de flebótomos fêmea infetados e pode manifestar-se de três formas, cutânea, visceral e mucocutânea, dependendo da espécie de Leishmania.O tratamento disponível para a leishmaniose não variou significativamente desde o início do século XX, baseando-se no uso de metais pesados, como compostos antimoniais. O tratamento continua a ser um problema devido à elevada toxicidade, custo e efeitos secundários, que justifica a procura urgente de novas moléculas potencialmente ativas, mais eficientes e menos tóxicas. A investigação de novos compostos com atividade antileishmanicida tem vindo a ser realizada pelo mundo inteiro. Os triterpenos são um grupo de moléculas conhecidas pela larga versatilidade e atividade biológica e representam uma fonte na procura de substâncias bioativas. Estes compostos já demonstaram atividade contra Leishmania sp..No presente estudo, avaliou-se a atividade anti-Leishmania de 19 triterpenóides de núcleo ursano em Leishmania infantum. Sete compostos apresentaram atividade (IC50<200 M) e destes, três compostos, 45, 48 e 196 foram mais promissores com IC50< 50 M. O composto 48 foi o mais ativo e induziu efeito antiproliferativo em promastigotas e amastigotas intracelulares de Leishmania infantum, com redução na sobrevivência de promastigotas e amastigotas intracelulares em macrófagos.De forma a elucidar possíveis mecanismos responsáveis pela atividade anti-Leishmania foram realizados estudos morfológicos, avaliação da morte celular por apoptose/necrose, ciclo celular, e determinação dos níveis de Ca2+ e das espécies reativas de oxigénio. O composto 48 induziu alterações no ciclo celular do parasita, com retenção das células na fase G0/G1 sugerindo uma paragem no ciclo celular. A quantificação de cálcio e espécies reativas de oxigénio mostraram que o composto 48 induz desequilíbrio homeostático de cálcio e aumento do nível de ROS, sendo que estes resultados podem estar associados à morte celular por apoptose. O composto 48 também induziu alterações morfológicas nos parasitas com diminuição do volume celular.Em conclusão, este trabalho permitiu identificar o composto 48 como o derivado triterpenóide mais ativo e promissor em promastigotas e amastigotas intracelulares de Leishmania infantum que pode ser aplicado no desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para a leishmaniose.
Leishmaniasis is a neglected tropical disease, endemic in 98 countries affecting 12 million people worldwide. This disease is caused by the protozoan parasites which are transmitted to men by the bite of infected female phlebotomine sandflies. There are three main forms of leishmaniasis - cutaneous, visceral and mucocutaneous.Current treatments rely on heavy metals, like antimonial compounds, that are associated with adverse side effects due to significant off target toxicity and also with high production cost, making urgent the need for more efficient and less toxic new active molecules.Triterpenoids are a group of molecules known by their versatility and biological activity representing a source of new bioactive substances with anti-Leishmania activity.In this sudy, 19 triterpenoids with ursane nucleous were evaluated on Leishmania infantum. Seven of these compounds presented significant activity (IC50<200 M) and compounds 45, 48 and 196 were selected as promising molecules (IC50< 50 M) and were further studied.Compound 48 proved to be the most active molecule, inducing an antiproliferative effect in intracellular promastigotes and amastigotes of both Leishmania infantum and macrophages.Studies of morphology, cellular death mechanisms, cell cycle, and intracellular quantification of Ca2+ and levels of reactive oxygen species (ROS) were conducted in order to elucidate the mode of action of this compound.It is also shown that this molecule induces modification on the parasite cell cycle with arrest on G0/G1 phase. The quantification of Ca2+ and ROS showed a homeostatic imbalance of calcium and an increase on ROS levels, being these results associated with apoptotic cell death. It was also observed shrinkage on cell volume.This work allowed to identify a new triterpenoid derivative more active against intracellular promastigostes and amastigotes of Leishmania infantum which can be seen as promising new therapeutic alternative in the near future for the treatment Leishmaniasis.
Universidade de Coimbra - Fundo proveniente das propinas do aluno.

Tese de doutoramento em Biofísica (Biofísica), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Ciências, 2007
The nucleus is a complex cellular organelle, exhibiting a high degree of organization and also a highly dynamic nature. Live cell imaging using fluorescent proteins (FPs) as molecular tags and photobleaching techniques have been essential in revealing the dynamic nature of the cell nucleus. In this thesis, these tools were used to study molecular dynamics and interactions inside this cellular compartment. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) were used to analyze the kinetic behavior of spliceosome components SmE, U2AF65, U2AF35, SF1 and SC35 in the nucleus of living cells. The recruitment mechanism of splicing factors (SFs) to the sites of transcription is still poorly understood. Our results rule out the hypothesis that a transcription specific signal recruits SFs from the speckles. They also suggest the formation of multi-protein complexes distinct from the spliceosome. The existence of these complexes was confirmed by Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) techniques, which revealed that SFs could interact with each other even in the absence of active splicing. A novel U2AF65 self-interaction was also detected, suggesting altogether that levels of SFs in speckles are consistent with self-organization mechanisms. The intranuclear mobility of mRNPs was studied using two GFP-tagged mRNA-binding proteins, PABPN1 and TAP, as mRNA markers. A novel FLIP method was devised to quantify the mobility of the RNA-bound and unbound pools of molecules and used to test whether myosin motors were implicated in mRNP movement. We show that this is not the case and that myosin inhibition appears to affect transcription instead. A novel FLIP after Photoactivation method was developed to study the nucleocytoplasmic exchange dynamics of nuclear proteins, yielding the permanence times of molecules inside the nucleus. The method was used to study the role of the structural domains of TAP in its shuttling activity.
O núcleo celular é um organito complexo, dotado de um elevado grau de organização mas também uma natureza extremamente dinâmica. A utilização de proteínas fluorescentes como marcadores moleculares para visualização em células vivas, bem como as técnicas de photobleaching, têm sido essenciais na descoberta da natureza dinâmica do núcleo. Neste trabalho, estas ferramentas foram aplicadas no estudo da dinâmica e interacções moleculares dentro deste compartimento celular. As técnicas de Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) e Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) foram utilizadas na análise do comportamento cinético dos componentes do spliceosoma SmE, U2AF65, U2AF35, SF1 e SC35 no interior do núcleo de células vivas. O mecanismo de recrutamento dos factores de splicing (SFs) para os locais de transcrição é ainda pouco conhecido. Os nossos resultados excluem a hipótese de haver um sinal associado à transcrição que seja responsável por este recrutamento. Sugerem ainda a formação de complexos multi-proteicos distintos do spliceosoma. A existência destes complexos foi confirmada por técnicas de Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), que mostraram que os SFs podiam interagir uns com os outros mesmo na ausência de splicing activo. Foi ainda descoberta uma nova auto-interacção para o factor U2AF65, sugerindo os resultados no seu conjunto que a distribuição de SFs no núcleo é compatível com mecanismos de auto-organização. A mobilidade de mRNPs no núcleo foi estudada utilizando como marcadores moleculares duas proteínas que se ligam ao mRNA marcadas com GFP, PABPN1 e TAP. Foi desenvolvido um método de FLIP para quantificação da mobilidade das fracções ligadas e não ligadas ao mRNA e usado para testar a possibilidade de motores de miosina estarem envolvidos no movimento de mRNPs. Mostramos que tal não acontece e que a inibição de miosina parece antes afectar a transcrição. Um novo método de FLIP após foto-activação foi desenvolvido para estudar a dinâmica de trocas entre o núcleo e o citoplasma de proteínas nucleares, permitindo a estimação do tempo de permanência de moléculas dentro do núcleo. O método foi utilizado para investigar o papel dos diferentes domínios estruturais da proteína TAP na sua actividade de exportação nuclear.
Fundação para a Ciência e Tecnologia (BD/21518/99); European Commission (“RNOMICS” QLG2-CT-2001-01554 and “Integrated Technologies for in vivo Molecular Imaging” LSHG-CT-2003-503259)

Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas) apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2008
Como está o genoma organizado no núcleo e em que medida essa organização pode influenciar os processos nucleares e, em especial, a expressão genética? Muitos estudos abordaram já a questão da organização da cromatina no núcleo com o intuito de desvendar as complexas relações entre o papel estrutural e o carácter funcional da organização do genoma no núcleo. O estudo aqui apresentado conduziu à elaboração de um modelo capaz de explicar em grande parte a organização encontrada. A remodelação das hnRNPs é uma forma diferente de regulação da expressão genética. As nossas observações poderão ser integradas um modelo de interacções complexas entre splicing, exportação, controlo de qualidade e tradução do mRNA em que a remodelação dinâmica da composição das hnRNPs visa a regulação da expressão genética. A cromatina, quando condensada na preparação para a mitose, é detectada sob a forma de cromossomas discretos, de tamanhos diversos e com um padrão de bandas alternadas. Os limites e a localização das bandas variam com o método de detecção e com o avanço do estado de condensação da cromatina. Bandas detectadas com diferentes métodos não são completamente sobreponíveis e, para o mesmo método de coloração, o número de bandas diminui com o aumento da condensação da cromatina. A alternância de bandas claras e escuras correlaciona-se com características tanto físicas como funcionais, tais como o timing da replicação da cromatina durante a fase S do ciclo celular, com a densidade de elementos repetitivos do genoma, com o conteúdo em GCs, com a presença de genes, com a densidade de expressão genética e outras propriedades que podem alternar ao longo da fibra cromatínica. Uma forma de identificar o bandeamento dos cromossomas é por coloração química. Por exemplo, o bandeamento com corante de Giemsa após breve proteólise dos cromossomas com tripsina dá origem a um padrão de bandeamento muito reprodutível, chamado bandeamento G, o qual é muito usado na coloração de rotina para analisar o cariótipo. A coloração Giemsa foi essencialmente útil para identificar marcos nos cromossomas que servem como referência de localização de sequências específicas. Presentemente, com todo o genoma humano sequenciado, já foi possível fazer corresponder a localização de cada banda com a sequência nucleotídica, identificando com precisão os seus limites. Após a mitose dá-se a reformação do núcleo celular, a cromatina descondensa e distribui-se por todo o nucleoplasma. No núcleo pode observar-se tipos diferentes de condensação da cromatina: a mais condensada encontra-se essencialmente na periferia do núcleo e na periferia dos nucléolos e é denominada heterocromatina, a menos condensada, eucromatina, apresenta-se dispersa pelo nucleoplasma, sempre salpicada por regiões mais condensadas. A heterocromatina inclui a cromatina constitutiva, composta essencialmente pelas regiões de DNA repetitivo também denominado satélite, e a cromatina facultativa que contém poucas regiões codificantes e enriquecida em genes silenciados, por serem específicos de tecido. A heterocromatina constitutiva é constituída pelo DNA presente nas bandas C dos cromossomas, ou centroméricas, e a heterocromatina facultativa pelo DNA das bandas G. A eucromatina é rica em genes, inclui os genes de manutenção celular (housekeeping) e os genes específicos de tecido, e corresponde às bandas R dos cromossomas. A heterocromatina tem um papel silenciador da expressão genética. Este foi primeiro mostrado pelo efeito PEV, em células de Drosophila. Outros exemplos de inactivação da expressão genética, por localização tridimensional próxima de regiões de heterocromatina foram demonstrados em células de mamífero. Durante os processos de desenvolvimento embrionário e de diferenciação celular há alterações profundas dos padrões de expressão genética: são activados genes específicos e inactivados muitos outros; e observa-se, fundamentalmente, uma relocalização dos genes em relação às regiões heterocromáticas. Supõe-se, pois, que a localização subnuclear seja um factor importante na regulação da expressão genética. Estudos sobre a mobilidade da cromatina, em células vivas, mostraram que as regiões heterocromáticas são quase imóveis, enquanto as eucromáticas apresentam uma mobilidade com restrições, o que sugere um papel estruturante fundamental para a heterocromatina.Nós perguntámos quais seriam as leis que governam a localização das regiões heterocromáticas no núcleo celular. Para alcançar a resposta estudámos a relação de proximidade entre cada par de centrómeros e a periferia nuclear e/ou a periferia dos nucléolos. Uma vez que as regiões repetitivas que flanqueiam os centrómeros de cada cromossoma apresentam variações de sequência que as tornam únicas, foi possível usar sondas específicas para detectar as regiões satélite características da região centromérica de quase todos os pares cromossómicos, por FISH. A periferia do núcleo foi imunodetectada por anticorpos específicos da lâmina nuclear e os nucléolos foram detectados por FISH com uma sonda específica para o RNA ribossómico. Os nossos resultados mostram, primeiro, que existe uma diferença muito acentuada entre os padrões típicos de localização de cada par centromérico e, depois, que cada centrómero tem um comportamento independente do do seu par, o que sugere que a sua localização intranuclear é regida por propriedades que lhe são intrínsecas. Tendo testado uma gama abrangente de diferentes propriedades cromossómicas, encontrámos uma forte correlação entre a frequência de localização junto do invólucro nuclear e o teor de bandas G mais escuras na proximidade dos centrómeros. Como corolário do nosso trabalho sugerimos que a associação das regiões cromossómicas de heterocromatina facultativa, que são contrastadas como bandas G mais escuras em metafase, ao invólucro nuclear, tenha um efeito coesivo em relação às bandas C, de heterocromatina constitutiva, para que também estas se localizem na periferia do núcleo. Este modelo defende que não é uma característica do próprio centrómero que determina a sua disposição no núcleo mas sim as características da cromatina que o flanqueia, prevendo que numa translocação cromossómica o centrómero do cromossoma translocado passará a ter um padrão de localização diferente do do cromossoma normal, influenciado pelo novo contexto cromatínico em que se encontra. Fizemos a validação do nosso modelo estudando a translocação do cromossoma 11 com o cromossoma 14 (t(11;14) e os resultados confirmaram as nossas previsões. Está bem documentada na literatura a relocalização de centrómeros entre periferia nuclear e periferia nucleolar em processos de diferenciação celular e em estados patológicos, bem como a especificidade de tipo celular para o padrão de localização de centrómeros específicos e a espantosa constância de padrão em cada tipo celular quando se comparam espécies animais diferentes. Fazendo uma extrapolação dos nossos resultados, é possível que as grandes alterações na localização preferencial dos centrómeros estejam intimamente relacionadas com a extensa remodelação da cromatina que ocorre fisiologicamente nos processos de diferenciação celular e de forma coerciva em diversas patologias. Nas células eucariotas os genes são transcritos no núcleo originando RNAs precursores de RNAs mensageiros, ou pré-mRNAs. Ainda no local de transcrição, o RNA é processado de forma a tornar-se num mRNA maduro, pronto para ser exportado para o citoplasma. Enquanto é transcrito, vão-se-lhe associando proteínas específicas, formando uma partícula ribonucleoproteica. São as proteínas associadas que determinam o seu processamento de forma a tornar-se um mRNA maduro, e também a sua longevidade e a sua localização de destino no citoplasma, regulando ainda a sua taxa de tradução. É particularmente importante, neste contexto, um subconjunto específico de proteínas que forma o complexo de junção de exões (EJC), uma marca de localização da junção entre dois exões consecutivos, resultante da remoção do intrão que se interpunha entre eles. Esta marca proteica mantém no mRNA a memória de um processo de splicing bem resolvido. Proteínas identificadas como integrantes desta marca incluem SRm160, RNPS1, Y14, Mago, DEK, REF/Aly, e UAP56. Muitas destas proteínas terão sido anteriormente identificadas como componentes de processos tão diversos como a regulação da transcrição, do splicing, do processamento da extremidade 3' do RNA, ou ainda da sua degradação prematura por NMD, da sua localização no citoplasma e da sua tradução.A exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma envolve a interacção específica da partícula ribonucleoproteica que contém o mRNA com factores que facilitam a sua translocação através do poro nuclear. As proteínas TAP/NXF1, p15/NXT1 e Dbp5 foram identificadas por estarem envolvidas neste processo de translocação. Sugere-se que a exportação do mRNA seja potenciada pela associação entre as proteínas do EJC com as proteínas transportadoras. Será que esta associação se estabelece ainda no local de transcrição de uma forma que é simultânea com o processamento do RNA ou far-se-á apenas após a libertação do mRNA do local de transcrição, quiçá junto ao poro nuclear, justamente para o processo de translocação? Para abordar este problema usámos o modelo de infecção de células HeLa com adenovírus Tipo 2, Ad2. No início da fase tardia da infecção, após a grande taxa de replicação do DNA genómico viral resultar na acumulação de DNA genómico viral em estruturas com a forma de cálices, quase todo o genoma viral começa a ser expresso, o que
In the post-genomic era we are still far from understanding how the linear sequence of the DNA determines all aspects of life. Chromosome territories are non-randomly positioned in the cell nucleus. The relative arrangement between genome regions affects genome stability and regulation of gene expression. Centromeres of human chromosomes are frequently found at the nuclear periphery or close to nucleoli, with a non-random distribution, which rules remain elusive. We made a near exhaustive survey in localizing individual centromeres in nuclei of human lymphoid cells. Our results show that the centromeres of homologous chromosomes are independently localized in the interphase nucleus and there is a unique distribution for most pair of centromeres. Based on mathematical analysis we proposed a model that predicts the distribution of centromeric heterochromatin for each individual chromosome, in witch is the proximity of G-dark bands that preferentially locate centromeres at nuclear periphery. The study of a translocation validated our model. Gene expression can be silenced by proximity to heterochromatin and activated by remodelling of chromatin. Remodelling hnRNPs is another different way of expression regulation. Multiple evidences indicate an extensive coupling between nuclear export of mRNA and pre-mRNA processing. The Exon Junction Complex (EJC) is a mark apposed on correctly spliced transcripts. We visualized, for the first time, accumulation of the EJC proteins, REF/Aly, Y14, SRm160, UAP56, RNPS1, and Magoh at sites of abundant transcription, suggesting a stable co-transcriptional binding to pre-mRNA. The export factors NXF1/TAP, p15, and Dbp5 were not co-localized with nascent transcripts, suggesting an association shortly before, or only after, mRNA release from the sites of transcription. Our results can contribute to an integrated model linking mRNA transcription to splicing, export, surveillance and translation, based on a dynamic and tightly regulated process of remodelling hnRNPs composition to achieve gene expression regulation.
Parcialmente financiado pela JNICT, no âmbito do Programa CIENCIA, bolsa BD/2829/93 (Dezembro de 1993 a Setembro de 1994).

Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas) apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2008
Protein-encoding genes are transcribed in the nucleus by RNA polymerase II as precursor RNAs that undergo extensive processing before being translocated to the cytoplasm for translation by the ribosomes. This spatial and temporal separation between RNA and protein synthesis offers an immense opportunity for regulation and quality control.When this study was initiated it was known from biochemical studies that human ß-globin (HBB) transcripts with mutations that impaired splicing or 3' end formation were unable to be exported to the cytoplasm, a phenotype identical to that seen in ß-thalassemia patients harbouring similar mutations (Antoniou et al., 1998). This result was consistent with the retention in the nucleus of incorrectly processed transcripts. Based on this initial observation we hypothesised the existence of a quality control mechanism to retain the incorrectly processed transcripts in the nucleus and proposed to elucidate the mechanism responsible for the observed retention. The first goal of this work was to determine the intranuclear localisation of the retained transcripts. To address this we used as a model system murine erythroleukemia (MEL) cells stably transfected with either wild-type or processing mutant HBB genes. The experimental approach was based on the direct visualisation of both normal and defective HBB transcripts using fluorescence in situ hybridisation and confocal microscopy. Nuclear transcripts of both wild-type and mutant HBB genes were detected only as intranuclear foci co-localising with the template gene locus. To determine the kinetics of transcript release from the site of transcription the cells were treated with the transcriptional inhibitors actinomycin D, α-amanitin and DRB. These drugs induced the rapid disappearance of nuclear foci corresponding to wild-type HBB RNA. In contrast, pre-mRNA mutants defective in either splicing or 3' end formation and which fail to be transported to the cytoplasm were retained at the site of transcription. These results indicated that the quality control mechanism responsible for the nuclear retention of incorrectly processed transcripts operates at the site of transcription and suggest that splicing and 3' end processing are rate limiting for release of mRNA from the transcription site. The next goal of this work was to determine the molecular players involved in the quality control mechanism that operates at the transcription site. Studies over the past years have indicated that there is extensive coupling between transcription, pre-mRNA processing and nuclear export of mRNA (reviewed by Bentley, 2005). One hypothesis to explain the retention of the mutant transcripts could be the absence of recruitment of proteins essential for the release and/or transport of the transcripts from the gene locus. Alternatively, the retention could be mediated by proteins that are bound to the nascent transcripts and become stalled due to incomplete processing To test the first hypothesis we decided to study the recruitment of exon junction complex (EJC) proteins and mRNA export factors to the retention sites in the nucleus. To achieve this we visualised the distribution of EJC proteins and RNA export factors relative to the sites HBB transcription in the nucleus. Using in situ hybridisation and confocal microscopy, we observed accumulation of EJC proteins (REF/Aly, Y14, SRm160, UAP56, RNPS1 and Magoh) and core spliceosome components (U snRNPs) at sites of wild-type HBB transcription. This suggests that EJC proteins bind stably to pre-mRNA co-transcriptionally. No concentration of the export factors NXF1/TAP or p15 was detected on nascent transcripts, arguing that in mammalian cells these proteins bind the mRNA shortly before or after release from the sites of transcription. Contrasting with the results obtained in MEL cells expressing wild-type HBB transcripts, mutant pre-mRNA defective in splicing and 3' end processing do not co-localise with SRm160, REF, UAP56 or Sm proteins. These results suggest that the accumulation of EJC proteins at transcription sites requires efficient processing of the nascent pre-mRNA. Although the results obtained do not discard the hypothesis that efficient recruitment of EJC proteins and/or export factors may contribute to the release of the transcripts from the transcription site, further studies are required to conclusively show or discard the involvement of these proteins in transcription site release. In the second hypothesis the best candidate to mediate the retention is the carboxyl-terminal domain (CTD) of the largest subunit of RNA polymerase II (RNA Pol II LS). The mammalian CTD comprises 52 heptad repeats followed by a terminal 10 amino acid motif (Corden et al., 1985). Several reports in the last decade showed that both splicing and 3' end processing factors can associate with the CTD of RNA Pol II (reviewed by Bentley, 2005). Since the processing mutants analysed are able to assemble some processing machinery, the release of the transcripts could be blocked by the stalled or abnormal processing machinery associated with the CTD. In order to test this hypothesis we generated cell lines that express either the wild-type HBB gene or a mutant version defective in splicing and an α-amanitin resistant form of RNA Pol II LS with either 52 (wt), 31 (Δ31) or 5 (Δ5) repeats of the CTD. When these cells were treated with actinomycin D to stop transcription the results showed that a large proportion of the wild-type HBB transcripts made by RNA Pol II with only 31 CTD repearts were retained at the site of transcription. Despite this result we observed recruitment of several EJC proteins, includind Aly/REF, Y14 and SRm160 to the transcription sites and RNase protection assays showed that the HBB transcripts produced by RNA Pol II LS Δ31 are correctly spliced and 3' end cleaved. These results show that the form of RNA Pol II LS with only 31 repeats of the CTD is competent in transcription and processing but fails to allow the efficient release of the transcripts from the transcription site. These results provide evidence that mRNA release from the transcription site requires the heptad repeat structure of the CTD and we propose that the missing heptads in the truncated CTD mutant are required for binding of proteins implicated in a final co-transcriptional maturation of spliced and 3' end cleaved mRNAs into export-competent ribonucleoprotein particles. Eukaryotic RNA polymerase II is a complex enzyme composed of 12 distinct subunits that is present in cells in low abundance (reviewed by Shilatifard et al., 2003). Transcription of mRNA by RNA polymerase II involves a phosphorylation/ dephosphorylation cycle of the CTD of the enzyme's largest subunit. The hypophosphorylated form assembles into pre-initiation complexes and the CTD becomes first phosphorylated on Serine at position 5 of the heptad repeat and during elongation on Serine at position 2 (Komarnitsky et al., 2000; Lu et al., 1991). As mentioned before we have generated stable murine cell lines expressing an α-amanitin resistant form of RNA Pol II LS. The cell lines generated were screened for survival and transcription in the presence of α-amanitin ensuring the functionality of the exogenous subunit. To characterise these cell lines we studied the localisation of the exogenous subunit and observed that over-expressed RNA Pol II LS was predominantly hypophosphorylated, soluble and accumulated in the cytoplasm in a CRM1-dependent manner. Our results further showed that the transcriptionally active form of RNA Pol II LS containing phosphoserine in position 2 of the CTD repeats was restricted to the nucleus and its levels remained remarkably constant. These results suggest that the nuclear-cytoplasmic distribution of RNA Pol II LS may be regulated by shuttling and we propose that this may provide a mechanism to control the pool of RNA polymerase subunits that is accessible for assembly of a functional enzyme in the nucleus.
Nos eucariontes, a transcrição dos genes pela RNA Polimerase II (RNA Pol II) origina moléculas de RNA mensageiro precursoras (pré-mRNA), sendo necessárias várias etapas de processamento até à formação do mRNA funcional que é transportado para o citoplasma, onde serve de molde para a síntese proteica. Essas etapas de processamento consistem em três processos distintos: na adição de uma trifosfoguanosina metilada na extremidade 5' trifosfato, estrutura conhecida como cap; na remoção de sequências não codificantes presentes no pré-mRNA (intrões) e junção das sequências codificantes flanqueadores (exões), num processo designado por splicing; e finalmente na formação da extremidade 3' do mRNA que consiste na clivagem e na adição à extremidade 3'OH resultante, de múltiplos nucleótidos de adenina, num processo designado por poliadenilação. Cada uma destas etapas de processamento é levada a cabo por uma maquinaria própria. No caso da adição do cap são necessárias três enzimas: uma RNA 5' trifosfatase, uma guanililtransferase e uma metiltransferase. O mecanismo de splicing envolve a ligação sequencial ao pré-mRNA de várias partículas ribonucleoproteicas nucleares pequenas (snRNP) que, com o auxílio de vários factores proteicos, formam uma estrutura complexa denominada spliceossoma. A maquinaria de poliadenilação é constituída por vários complexos proteicos, pela polimerase de poly(A) (PAP) e pela proteína nuclear de ligação ao poli(A) (PABPN1, anteriormente designada PABP2) (revisto por Proudfoot et al., 2002). O correcto processamento das moléculas de pré-mRNA é um requisito fundamental para o transporte do mRNA para o citoplasma. Existem evidências de que moléculas de pré-mRNA com mutações nas regiões de consenso 5' e 3' dos seus intrões, que permitem a formação do spliceossoma mas que impedem a remoção dos intrões, são retidas no núcleo, enquanto que moléculas de pré-mRNA com mutações que não permitem a formação do spliceossoma são rapidamente exportadas para o citoplasma (Chang and Sharp, 1989; Hamm and Mattaj, 1990; Legrain and Rosbash, 1989). Do mesmo modo, mutações que interferem com a correcta poliadenilação do pré-mRNA também impedem a sua exportação para o citoplasma (Antoniou et al., 1998). Apesar destes resultados apontarem para a existência, no núcleo, de um mecanismo de controlo da qualidade do mRNA exportado, sabe-se muito pouco sobre o modo como esse controlo é efectuado. Com o objectivo de compreender o mecanismo de controlo de qualidade do mRNA exportado em células de mamífero iniciou-se o estudo da organização intranuclear do RNA da ß-globina humana. O gene da ß-globina humana foi escolhido para este estudo devido ao grande número de mutações pontuais que afectam o processamento do pré-mRNA e que estão na base de uma doença genética designada por ß-talassémia (Antonioiu, 1995). A expressão deste gene está limitada a células da linhagem eritróide, durante o processo de diferenciação (Tang et al., 2002). Assim, como modelo de estudo, utilizaram-se células de eritroleucemia murina (MEL, Murine ErythroLeukemia), que podem ser induzidas a diferenciar-se em cultura e expressar os genes específicos das células eritróides, onde se incluem os genes das globinas. Estas células foram transfectadas de forma estável com o gene da ß-globina humana (ßWT) e com mutantes do referido gene, nomeadamente com mutações que impedem o splicing do segundo intrão (ßSM) e uma mutação que impede a poliadenilação (ßIVSI). Quando este estudo foi iniciado sabia-se que os genes mutados eram transcritos e que o respectivo RNA não se acumulavam no citoplasma das células MEL, ao contrário do que acontecia com o mRNA da ß-globina humana normal (Antoniou et al., 1998). O primeiro objectivo deste estudo foi então determinar a localização nuclear dos transcritos mutados. Para alcançar este objectivo foi optimizada a técnica de hibridação in situ para detecção dos transcritos do gene da ß-globina humana nas células MEL. Esta experiência mostrou que os transcritos do gene normal eram detectados no núcleo, junto ao local de transcrição e acumulavam-se no citoplasma, enquanto que os transcritos dos genes mutados eram detectados apenas junto ao local de transcrição. Para avaliar a cinética de libertação do RNA do local de transcrição foram efectuadas experiências com o inibidor de transcrição actinomicina D. Este inibidor actua muito rapidamente após a sua adição ao meio de cultura (Darnell et al., 1971) e exerce o seu efeito através do bloqueio da elongação, uma vez que se intercala nas moléculas de DNA (Reich and Goldberg, 1964). Após 5 minutos de tratamento com actinomicina D os transcritos do gene da ß-globina humana normal deixaram de ser detectados no núcleo, o que sugeriu que o RNA previamente transcrito já tinha sido libertado do local de transcrição. Por outro lado, os transcritos que têm uma mutação na região de consenso 5' do segundo intrão (ßSM), que permite a formação do spliceossoma, mas inibe o splicing (Lamond et al., 1987) permaneceram junto ao local de transcrição após o tratamento com actinomicina D. Os transcritos que não possuem o segundo intrão (ßIVSI) e por isso não são poliadenilados (Collis et al., 1990) ficaram também retidos no núcleo, junto ao local de transcrição, após o tratamento com actinomicina D. Estes resultados mostraram que os transcritos do gene da ß-globina humana são rapidamente libertados do local de transcrição, enquanto que os transcritos que possuem mutações que impedem o splicing e a poliadenilação ficam retidos próximo do gene, sugerindo que o mecanismo de controlo de qualidade do mRNA exportado actua ao nível do local de transcrição (Custódio et al., 1999). O objectivo seguinte foi determinar qual o mecanismo molecular responsável pelo controlo de qualidade do mRNA ao nível do local de transcrição. Estudos efectuados na última década têm revelado a existência de inúmeras interacções entre a maquinaria de transcrição, de processamento do pré-mRNA e de exportação do mRNA para o citoplasma (ver Bentley, 2005). Uma das hipóteses colocadas para explicar a retenção dos transcritos com mutações junto ao local de transcrição foi a de que neste caso poderia não haver recrutamento de proteínas essenciais para a libertação e/ou transporte do mRNA a partir do respectivo gene. A outra hipótese colocada foi a de que a retenção poderia ocorrer por intermédio de proteínas que estão ligadas aos transcritos nascentes durante o processamento e que se libertam quando este se completa, mas que no caso dos mutantes ficam bloqueadas devido ao facto de o processamento do pré-mRNA não se completar. Para testar a primeira hipótese decidimos estudar o recrutamento, para o local de transcrição, de proteínas que se ligam ao mRNA. Assim testamos o recrutamento de proteínas que se ligam ao mRNA após o splicing, designadas de proteínas do complexo junção de splicing (EJC, exon junction complex), e de factores de exportação do mRNA. Para tal, conjugou-se a técnica de hibridação in situ para detecção dos transcritos com a localização das proteínas em questão (por imunomarcação com anticorpos específicos ou transfecção para expressão de proteína com marcador fluorescente). Assim, efectuou-se detecção de proteínas do EJC (REF/Aly, Y14, SRm160, UAP56, RNPS1 e Magoh), de componentes do spliceossoma (proteínas Sm e proteína B'' do snRNP U2) e dos factores de exportação do mRNA (NXF1/TAP e p15) simultaneamente com a detecção dos transcritos da ß-globina humana. Os resultados obtidos indicaram que as proteínas EJC e os componentes do spliceossoma são recrutados para os locais de transcrição do gene normal, no entanto, não se detectou acumulação dos factores de exportação junto ao local de transcrição. Estes resultados sugerem que as proteínas do EJC se ligam estavelmente ao pré-mRNA co-transcricionalmete, mas que os factores de exportação se ligam imediatamente antes da libertação dos transcritos do gene ou após estes se terem libertado. Quando se efectuou a mesma análise num mutante de processamento não se detectou recrutamento para o local de transcrição, nem das proteínas do EJC, nem dos componentes do spliceossoma. Estes resultados sugerem que o splicing dos transcritos da ß-globina é essencial para a acumulação das proteínas do EJC no local de transcrição e possivelmente para o posterior direccionamento para a via de exportação do mRNA para o citoplasma (Custódio et al., 2004). Embora os resultados obtidos não descartem a hipótese de que o recrutamento eficiente de proteínas do EJC e/ou de factores de exportação do mRNA possa contribuir para a libertação do mRNA do local de transcrição, são ainda necessários mais estudos para que se possa concluir se estas proteínas desempenham um papel essencial neste mecanismo. Sabe-se que a associação entre a maquinaria de transcrição e a maquinaria de processamento do pré-mRNA é mediada pela extremidade carboxílica da subunidade grande da RNA polimerase II (RNA Pol II LS), normalmente designada de CTD (Carboxyl-Terminal Domain) (revisto por Bentley, 1999). O CTD da RNA Pol II apresenta uma constituição invulgar, sendo formado por repetições em tandem de um heptapéptido com o consenso Tirosina-Serina-Prolina-Treonina-Serina-Prolina-Serina, seguido de um motivo C-terminal constituído por 10 aminoácidos (Corden et al., 1985). O número de heptapéptidos presentes varia entre os eucariontes, apresentando os mamíferos 52 unidades repetitivas (Corden et al., 1985) e as leveduras apenas 26 (Allison et al., 1985). As primeiras evidências para uma ligação entre o CTD e o processamento do pré-mRNA vieram de estudos que apontavam para a exi
Tendo em conta estes dados, a hipótese de que a retenção junto ao local de transcrição pode ocorrer por intermédio de proteínas que se ligam aos transcritos nascentes e não se libertam devido ao bloqueio no processamento do pré-mRNA ganhou um candidato preferencial, o CTD da RNA Pol II. Assim, a retenção poderá ocorrer por intermédio da maquinaria de processamento ineficaz ou inactiva que permanece associada ao CTD da RNA Pol II, pressupondo-se que a maquinaria de processamento se associa ao CTD durante a reacção e se desliga do CTD no final da mesma, permitindo a libertação do RNA para posterior transporte para o citoplasma. No caso dos mutantes, em que ocorre associação da maquinaria de processamento mas a reacção não se completa devido à mutação, o pré-mRNA poderá permanecer ligado ao CTD via essa mesma maquinaria, acabando por ser degradado. Para testar esta hipótese a abordagem experimental escolhida consistiu na construção de um modelo celular onde a transcrição dos genes é efectuada por uma RNA Pol II com delecção parcial do CTD. Esta abordagem é facilitada pela existência de formas da RNA Pol II LS resistentes ao inibidor de transcrição α-amanitina, o que permite anular a RNA Pol II endógena. Foram estabelecidas linhas celulares estavelmente transfectadas com o gene da RNA Pol II LS com 5 repetições no CTD (Δ5), com 31 repetições (Δ31) e com 52 repetições (controlo, wild-type). Foi efectuada uma primeira triagem a estas linhas para avaliar a sua capacidade de transcrever na presença de α-amanitina. Nenhuma das linhas Δ5 testadas apresentou capacidade de transcrever o gene da globina murina ß-major na presença de α-amanitina. Este resultado foi inesperado, uma vez que este mutante já tinha sido utilizado em estudos anteriores, onde foi mostrado que apresentava capacidade de transcrever o gene da ß-globina humana sob controlo do promotor SV40 (McCracken et al., 1997b). No entanto, estudos posteriores onde se analisou a capacidade transcricional da RNA Pol II Δ5 por run-on em mais de 500 genes, indicaram que a este mutante não é funcionalmente activo para a transcrição de genes endógenos (Meininghaus et al., 2000). Estes resultados impossibilitaram a utilização dos clones Δ5 nos estudos posteriores. Das linhas Δ31 e wild-type que apresentaram capacidade de transcrever na presença de α-amanitina foi seleccionada uma para transfecção com o gene da ß-globina humana. Cada uma das linhas foi transfectada quer com a versão normal do gene (ßWT), quer com uma versão que possui uma mutação de splicing (ßSM) para a qual se mostrou anteriormente que há retenção do respectivo RNA junto ao local de transcrição. Os transcritos da ß-globina humana foram detectados no núcleo das células transfectadas como um foco que corresponde ao RNA junto do local de transcrição. Quando se efectuou o tratamento com o inibidor de transcrição actinomicina D os resultados indicaram que uma grande proporção dos transcritos ßWT feitos pela RNA Pol II Δ31 ficavam retidos no local de transcrição. Apesar deste resultado, observou-se recrutamento de proteínas do EJC, incluindo Aly/REF, Y14 e SRm160 para os locais de transcrição. Uma análise bioquímica dos transcritos ßWT feitos pela RNA Pol II Δ31 indicou que sofriam splicing e processamento na extremidade 3' correctamente. Estes resultados indicam que a RNA Pol II LS com apenas 31 unidades repetitivas é capaz de transcrever mas não permite a libertação eficiente do mRNA do local de transcrição. Isto sugere que a estrutura do CTD é importante para a libertação do mRNA do local de transcrição, possivelmente porque assegura o recrutamento de proteínas importantes para uma maturação final do mRNA após o splicing e o processamento da extremidade 3', que o transforma numa partícula ribonucleoproteíca competente para ser exportada. Propomos assim que as unidades repetitivas em falta no mutante Δ31 da RNA Pol II poderão ser essenciais para o recrutamento destas proteínas (Custódio et al., 2007). A RNA Pol II eucariota é uma enzima complexa, composta por 12 sub-unidades distintas, que se encontra presente na célula em níveis relativamente baixos (revisto por Shilatifard et al., 2003). A transcrição do pré-mRNA pela RNA Pol II envolve ciclos de fosforilação e desfosforilação do CTD da sua maior subunidade. O CTD encontra-se hipofosforilado quando a RNA Pol II se liga ao complexo de pré-iniciação e assume uma forma hiperfosforilada quando o transcrito tem cerca de 25 bases (O'Brien et al., 1994). A primeira fosforilação ocorre na Serina que se encontra na posição 5 do heptapéptido e durante a elongação a Serina na posição 2 é fosforilada (Komarnitsky et al., 2000; Lu et al., 1991). Pelas razões já mencionadas, estabelecemos linhas celulares murinas que expressam uma forma da RNA Pol II LS resistente ao inibidor de transcrição α-amanitina. Foi efectuada uma primeira triagem a essas linhas celulares para seleccionar aquelas que apresentavam a capacidade de sobreviver e transcrever na presença da α-amanitina, assegurando que nessas linhas a RNA Pol II LS exógena é funcional. Com o objectivo de estudar a localização sub-celular da RNA Pol II LS seleccionaram-se duas linhas com níveis diferentes de expressão da subunidade exógena. Resultados de imunomarcação e western-blotting indicaram que a RNA Pol II LS sobre-expressa se encontra predominantemente hipofosforilada e se acumula sobretudo no citoplasma. A forma activa (fosforilada na Serina 2 do heptapéptido), pelo contrário, encontra-se exclusivamente no núcleo, em níveis constantes, independentemente do grau de sobre-expressão da proteína. A presença, no citoplasma, da RNA Pol II LS sobre-expressa foi descrita num outro estudo onde se procedeu à sobre-expressão de uma forma conjugada à proteína fluorescente EGFP (Sugaya et al., 2000). Este resultado pode ser explicado por uma importação ineficiente para o núcleo do excesso de proteína produzida no citoplasma, ou por o excesso de proteína que é importado para o núcleo ser posteriormente exportado para o citoplasma. Para investigar a possibilidade da RNA Pol II LS poder deslocar-se do núcleo para o citoplasma comparámos a distribuição sub-celular das formas endógena e exógena sobre-expressa, na presença de leptomicina B (LMB), um inibidor de exportação nuclear dependente do transportador CRM1 (Fornerod et al., 1997; Kudo et al., 1999). Os resultados indicaram que o LMB diminui a acumulação citoplasmática da proteína sobre-expressa e aumenta os níveis nucleares da proteína endógena. Estes resultados indicaram, pela primeira vez, que a RNA Pol II LS tem a capacidade de efectuar um mecanismo de vai-e-vem entre o núcleo e o citoplasma. Propomos que este mecanismo poderá ser um meio a que a célula recorre para regular o número do moléculas desta sub-unidade presentes no núcleo, de modo a manter uma relação equilibrada das várias sub-unidades e assim assegurar a formação de complexos de transcrição funcionalmente activos (Custódio et al., 2006). Em conclusão, o trabalho apresentado nesta dissertação foi pioneiro na identificação de um mecanismo de controlo de qualidade do mRNA, que actua ao nível do local de transcrição, no núcleo de células de mamífero (Custódio et al., 1999). Este mecanismo evita que moléculas de pré-mRNA com mutações que impedem o seu correcto processamento cheguem ao citoplasma, onde poderiam original proteínas defeituosas com consequências negativas quer para a célula quer para o organismo. O trabalho apresentado foi também o primeiro a mostrar a importância da libertação do mRNA do local de transcrição, actualmente considerada uma etapa importante da síntese do mRNA (ver Vasudevan and Peltz, 2003). Estudos efectuados em S. Cerevisiae vieram mostrar que um mecanismo de controlo de qualidade semelhante também funciona em levedura, onde transcritos com defeitos na poliadenilação ficam retidos no núcleo, ao nível do local de transcrição (Hilleren et al., 2001; Jensen et al., 2001b; Libri et al., 2002; Thomsen et al., 2003). O trabalho aqui apresentado contribuiu ainda para a compreensão do mecanismo responsável pela retenção dos transcritos com defeitos no processamento junto ao local de transcrição. Mostrámos que estes transcritos não são capazes de recrutar eficientemente proteínas do complexo junção de splicing (Custódio et al., 2004) e que o CTD da RNA Pol II desempenha um papel importante na etapa de libertação do mRNA do local de transcrição (Custódio et al., 2007).
Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), (Programa PRAXIS XXI, bolsa de doutoramento PRAXIS XXI/BD/9439/96)

El núcleo es una de las características distintivas que definen a las células eucariotas, permite una compartamentalización que es crítica para procesos que se desarrollan dentro del mismo, como la replicación, transcripción, splicing de pre-mRNA y ensamblado de ribosomas. Los Lípidos Neutros (LN) nucleares son fuentes alternativas de ácidos grasos (FA) y colesterol para membranas, vías de señalización y ligandos de factores de transcripción. Los objetivos de la presente tesis fueron: 1) Determinar la organización estructural y espacial de los lípidos nucleares. 2) Determinar el o los mecanismos de incorporación de los ácidos grasos (FA) exógenos en los lípidos nucleares. Como modelo experimental se trabajó con núcleos y matrices nucleares aislados de hígado de rata. La pureza de las fracciones aisladas se determinó mediante ensayos morfológicos y bioquímicos y se corroboró la alta pureza e integridad de cada fracción. Mediante análisis bioquímicos tradicionales se determinó la composición lipídica nuclear y se pudo concluir que los lípidos nucleares se ubican en dos localizaciones principales, la doble membrana nuclear compuesta de glicerofosfolípidos, esfingolípidos y colesterol; y dentro del núcleo, los lípidos endonucleares están enriquecidos en triacilglicéridos (TAG) y ésteres de colesterol (CE). En particular, los LN nucleares se organizan en la matríz nuclear como Gotas Lipídicas nucleares (nLD), que serían análogas a las gotas lípidicas citosólicas (cLD). Esta hipótesis fue corroborada al observar nLD en el interior de núcleos y matrices aislados de hígado de rata, en hepatocitos de rata y en células HepG2, mediante microscopía de campo claro y de fluorescencia en muestras tratadas con coloraciones específicas para lípidos. Las nLD se caracterizan por ser esferas, de número limitado por núcleo y estar separadas espacialmente de los dominios nucleares nucleolo, Speckles y Paraspeckles y lámina nucleas. Poseen además diámetros menores a los de las cLD. Se elaboró un protocolo para aislar nLD de los demás componentes nucleares y se corroboró la presencia de gotas de lípidos en la fracción aislada por microscopía de campo claro y electrónica con tinciones específicas. Las nLD son estructuras supramoleculares nucleares compuestas principalmente por CE, C, TAG y proteínas, con una baja proporción de lípidos polares. Las nLD constituyen un nuevo dominio nuclear donde los LN se almacenan y organizan y seguramente participan en la homeostasis lipídica nuclear. Las nLD podrían actuar como un sistema buffer endonuclear proveyendo o incorporando lípidos y proteínas involucrados en diferentes procesos. Se determinó que la membrana nuclear corresponde a una zona de fluidez mayor a la de la membrana plasmática y la matriz nuclear es más rígida, utilizando la sonda Laurdan y microscopía de 2 fotones. Para evaluar el mecanismo de incorporación FA exógenos en los lípidos nucleares se incubaron núcleos con distintos [14C]FA y se analizó la incorporación de la radiactividad en los lípidos. Los FA saturados y polinosaturados exógenos estudiados se incorporan como FA y se esterifican en los lípidos nucleares. Los FA no se esterifican directamente a los pooles lipídicos nucleares sino que primero deben ser convertidos en ésteres de CoA. Este proceso es llevado a cabo por acción de acil-CoA sintetasas. Los ácidos 16:0, 18:0, 18:1n-9, 18:2n-6 y 20:4n-6 se esterifican en los lípidos nucleares. Los FA ensayados se incorporan como FA libre tanto en núcleos, membranas nucleares aisladas, matrices nucleares como en las nLD y se esterifican en los lípidos de las mismas (LP y LN en los núcleos, matrices y nLD y LP en las membranas nucleares). Sin embargo, los FA no se esterifican en lípidos de nLD aisladas en las condiciones ensayadas, esto pude deberse a que se necesiten componentes nucleares que se pierden durante el aislamiento o que no haya remodelado de FA dentro de la gota. La L-FABP participa en la movilización y transporte de FA nucleares. Existe un transporte reverso de FA unidos a L-FABP desde los pooles lipídicos nucleares y endonucleares (matrices nucleares) hacia el citosol. La L-FABP moviliza al 20:4n-6, 18:0 y 18:1n-9 fuera del núcleo hacia otros compartimentos celulares. Estimula la movilización y redistribución de los mismos dentro del núcleo entre los diferentes pooles lipídicos. En especial, determina un incremento de 20:4n-6 esterificado en PI. El PI de la matriz nuclear forma parte del activo sistema de transducción de señales del núcleo, y la L-FABP estaría favoreciendo la adecuada composición de este fosfolípido. El 20:4n-6 movilizado por la L-FABP de los pooles endonucleares, podría ser el ligando de factores de transcripción, en particular del PPARα, dado que existe colocalización entre PPARα y L-FABP.
Los resultados obtenidos de esta tesis fueron premiados en las Jornadas de Lípidos 2012 de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad de Buenos Aires (UBA).

Tesis (Doctor)--Universidad Nacional de Córdoba. Facutlad de Ciencias Médicas, 2009
INTRODUCCION: Los tumores estromales gastrintestinales (GISTs) constituyen la categoría más amplia de neoplasias no epiteliales primarias del tracto gastrointestinal. Son más frecuentes en estómago y en intestino delgado, pero también pueden comprometer esófago, colon, recto y ano. Han sido encontrados, además, en mesenterio, retroperitoneo, omento y tejidos blandos (EGIST-Tumor estromal extragastrointestinal). Martín los reconoció como entidad clínico -patológica y Stout los denominó Leinomioblastomas. Mazur y Clark acuñaron el término tumor estromal gastrointesitnal y sugierieron que podían originarse del sistema nervioso mioentérico. Hubo, además, algunos casos con evidencias de diferenciación neural, y fue introducido el término 'Tumor autonómico gastrointestinal' (GANT). Kindblom y col., sugirieron que esta neoplasias presentan un inmunofenotipo similar a células inte5rsticiales de Cajal (Células marcapsos del tracto gastrointestinal). OBJETIVOS: -Correlacionar tamaño tumoral, patrón microscopico e inmunofenotipo con el comportamiento biológico. - Determinar formas macro y microscopicas y analizar la forma de preesentación clínica. - Relacionar topografía, tamaño y grado con la agresividad tumoral. - Confirmar el valor del protooncogen (CD-117) como marcador de CIC y de GISTs(AU)
Ismael Bernardo Fonseca, Luis Santos Spitale.