Academic literature on the topic 'Oncobiologia'

Neste estudo, procurou-se identificar as rádios localizadas no Rio de Janeiro que são mais ouvidas entre as diferentes faixas etárias da sociedade. Posteriormente, analisaram-se 177 reportagens sobre câncer veiculadas em uma rádio de notícias 24 horas. Diante dos resultados encontrados, procurou-se traçar um panorama sobre o tema nesta rádio que, além de ter um dos maiores índices de credibilidade, também é líder de audiência durante vários horários ao longo de um dia. Este estudo vem se somar a outros, produzidos pelo Núcleo de Divulgação do Programa de Oncobiologia, da Universidade Federal do Rio de Janeiro, acerca do que a população sabe em relação a uma das doenças que mais vítimas faz em nosso país: o câncer, segunda causa de mortalidade nas estatísticas brasileiras, e como se configura a comunicação em saúde na mídia brasileira (jornais e revistas), especialmente sobre a temática câncer.

Cervical cancer is one of the most common types of carcinomas causing morbidity and mortality in women in all countries of the world. At the moment, the oncology, oncobiology, and oncomorphology of cervical cancer are characterized by the accumulation of new information; various molecular biological, genetic, and immunohistochemical methods of investigation of the mechanisms of cervical carcinogenesis are tested and applied; targeted antitumour drugs and diagnostic, prognostic, and predictive biomarkers are being searched for. Many issues of the etiopathogenesis of cervical cancer have not been sufficiently studied, and the role of many biomarkers characterizing various stages of cervical carcinogenesis remains unclear. Therefore, the target of this review is to systematize and understand several problems in the pathogenesis of cervical cancer and to evaluate the significance and role of biomarkers in cervical carcinogenesis.

To define the growing significance of cellular targets and/or effectors of cancer drugs, we examined the fitness dependency of cellular targets and effectors of cancer drug targets across human cancer cells from 19 cancer types. We observed that the deletion of 35 out of 47 cellular effectors and/or targets of oncology drugs did not result in the expected loss of cell fitness in appropriate cancer types for which drugs targeting or utilizing these molecules for their actions were approved. Additionally, our analysis recognized 43 cellular molecules as fitness genes in several cancer types in which these drugs were not approved, and thus, providing clues for repurposing certain approved oncology drugs in such cancer types. For example, we found a widespread upregulation and fitness dependency of several components of the mevalonate and purine biosynthesis pathways (currently targeted by bisphosphonates, statins, and pemetrexed in certain cancers) and an association between the overexpression of these molecules and reduction in the overall survival duration of patients with breast and other hard-to-treat cancers, for which such drugs are not approved. In brief, the present analysis raised cautions about off-target and undesirable effects of certain oncology drugs in a subset of cancers where the intended cellular effectors of drug might not be good fitness genes and that this study offers a potential rationale for repurposing certain approved oncology drugs for targeted therapeutics in additional cancer types.

Chemotherapy is one of the fundamental methods of cancer treatment. However, drug resistance remains the main cause of clinical treatment failure. We comprehensively review the newly identified roles of long noncoding RNAs (lncRNAs) in oncobiology that are associated with drug resistance. The expression of lncRNAs is tissue-specific and often dysregulated in human cancers. Accumulating evidence suggests that lncRNAs are involved in chemoresistance of cancer cells. The main lncRNA-driven mechanisms of chemoresistance include regulation of drug efflux, DNA damage repair, cell cycle, apoptosis, epithelial-mesenchymal transition (EMT), induction of signaling pathways, and angiogenesis. LncRNA-driven mechanisms of resistance to various antineoplastic agents have been studied extensively. There are unique mechanisms of resistance against different types of drugs, and each mechanism may have more than one contributing factor. We summarize the emerging strategies that can be used to overcome the technical challenges in studying and addressing lncRNA-mediated drug resistance.

BACKGROUND. Study of oncobiological aspects of such a phenomenon as multiplicity of primary colorectal tumors, as well as improvement of methods of their treatment is relevant nowadays. The aim of the study was to reveal the potential of minimally invasive surgery for multiple primary colorectal cancer. MATERIAL AND METHODS. Data on 51 patients with synchronous multiple primary colorectal cancer were studied. Clinical, biological and morphological characteristics ofsynchronous colorectal tumors were analyzed. 12 of 51 patients underwent minimally invasive surgeries of the colon and rectum - laparoscopy and transanal endoscopic resection of the rectum. RESULTS showed that synchronous colorectal cancer prevailed in patients with multiple primary colorectal cancer (63,8 %), with tumors localized mainly in the sigmoid (62,75 %) and the rectum (56,86%). Minimally invasive approach allowed reduction of the number of postoperative complications by 2,5 times and improvement of rehabilitation of patients. CONCLUSION. Application of modern technologies in treatment for synchronous multiple primary colorectal cancer contributes to improvement of the treatment outcomes.

Exosomes are emerging as essential vehicles mediated cross-talk between different types of cells in tumor microenvironment. The extensive exploration of exosomes in hepatocellular carcinoma (HCC) enhances our comprehension of cancer biology referring to tumor growth, metastasis, immune evasion, and chemoresistance. Besides, the versatile roles of exosomes provide reasonable explanations for the propensity for liver metastasis of gastric cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma, breast cancer, and colorectal cancer. The selective-enriched components, especially some specific proteins and noncoding RNAs in exosomes, have great potential as noninvasive biomarkers of HCC with high sensitivity and specificity. The characteristics of exosomes further inspire frontier research to interrupt intercellular malignant signals by controlling the biogenesis, release, or contents of exosomes.

Tese de doutoramento em Ciências Farmacêuticas, na especialidade de Biologia Celular e Molecular, apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra
Glioblastoma is the most common and the most aggressive malignant primary brain tumor. The survival rate for this tumor is extremely low because of its aggressiveness, ranging from about 3-4 months without treatment to up to a median survival of about 12-15 months following current medical therapy. Despite very important progresses in the understanding of the molecular pathogenesis of glioblastoma and technological advances in diagnostic and treatment strategies, glioblastomas almost invariably recur near their initial sites rapidly leading to death. A number of survival signalling pathways can be activated constitutively in glioma cells, rendering these cells resistant to conventional chemotherapies and proapoptotic insults.The unfavorable prognosis for glioblastoma patients is also strongly correlated to the intrinsic apoptosis resistance of glioblastoma cells.On these grounds, induction of alternative types of cell death could be an option for the treatment of glioblastoma. Autophagic cell death has been recently considered as an alternative and emerging concept to trigger glioma cell death and to exploit caspase-independent programmed cell death pathways for the development of novel therapies. Edelfosine (ET-18-OCH3) is the prototype molecule of a family of unnatural lipids, collectively known as synthetic alkylphospholipid analogs, which promotes apoptosis in a variety of tumor cells. Edelfosine has been shown to be an effective in vitro and in vivo antitumor drug, acting through the reorganization of membrane domains, termed lipid rafts, as well as through an endoplasmic reticulum stress response, leading to caspase- and mitochondria-mediated apoptosis in different hematological and solid tumor cells. On the first part of this study, we report that edelfosine induces mainly necroptosis in the U118 (U-118 MG) glioblastoma cell line, used as a brain tumor cell line model, whereas apoptosis and autophagy are relatively minor responses. Edelfosine-induced necroptototic response is very rapid and potent, suggesting a putative therapeutic role for necroptosis in brain tumor therapy. On the second part, we describe that inhibition of MEK1/2-ERK1/2 signalling pathway highly potentiates edelfosine-induced apoptosis in glioblastoma U118 cells and switches the type of edelfosine-induced cell death from necrosis to apoptosis. The MEK1/2 inhibitor U0126 alone reduced ERK1/2 phosphorylation, but its effect was further potentiated when used in combination with edelfosine, leading to: RIPK1 degradation, likely underlying inhibition of necroptosis; RelA/NF-κB p65 degradation, thus inhibiting survival signaling; and caspase activation, leading to caspase-dependent apoptosis. The fact that ERK1/2 inhibition dramatically potentiates edelfosine-induced apoptosis in U118 cells, and turns either the survival or necrotic responses into potent apoptosis, suggests that edelfosine is a potent inducer of apoptotic signalling, and that this apoptotic response is highly modulated by ERK1/2 phosphorylation. Next, we explored the impact of the chosen cell death modality in overall survival, and its implications for the development of resistance. When incubated with edelfosine alone, ~20% of the cells remained intact regarding mitochondrial membrane potential (∆Ψm), and did not die through apoptosis or necrosis. These surviving cells expressed Bcl-xL and incubation with the BH3 mimetic inhibitor ABT-737 after edelfosine treatment induced ∆Ψm loss and increased cell death. U0126 preincubation resulted in Bcl-xL degradation with practically all the cells undergoing total ∆Ψm loss and strong caspase-9 activation and apoptosis. Inhibition of ERK phosphorylation changed the type of cell death following edelfosine treatment and favored cell demise. ERK and Bcl-xL inhibition resulted in increased apoptotic rates and decreased survival of resistant cells.Through repeated exposure to edelfosine, we generated a resistant cell line from the sensitive U118 cell line, U118-R, and then performed a comparative analysis of some characteristics in order to gain insight into possible mechanisms of resistance. In the last part of this work, we screened for different types of cell death induced by edelfosine in other glioblastoma cell lines and explored possible ways to increase cell death execution and/or abolish survival signalling, aiming to identify commonly altered pathways where to interfere in order to maximize cell death and avoid drug resistance.This study, with several limitations, brought some contributions to the understanding of decisions in cell death commitment and its implications to cell death resistance, and reinforce the need to further explore the repertoire of antiapoptotic mechanisms in cancer and how survival signalling and cell death blockage contribute to tumor progression, deregulated cell proliferation and resistance to therapies. U118 cells can constitute a useful cell model to elucidate the mechanisms that dictate the cellular decision to undergo alternative cell death pathways, such as apoptosis or necroptosis, as well as the processes mediating the triggering and execution of necroptosis. Unveiling the molecular and regulatory features of the early/primary cell death triggers and initiators, as well as of the switches leading to the different types of cell death, will be of major importance in delineating new approaches to trigger and modulate cell death processes of critical importance in the treatment of tumors, including GBM.
Glioblastoma (GBM) é o tipo de tumor cerebral primário maligno mais comum e também o mais agressivo. O tempo médio de sobrevida dos doentes portadores deste tumor é extremamente baixo devido à agressividade do mesmo, variando entre 3-4 meses sem tratamento e 12-15 meses cumprindo a actual terapêutica de referência. Apesar dos importantes progressos no conhecimento sobre a patogénese molecular do GBM e em tecnologias de diagnóstico e tratamento, os glioblastomas quase invariavelmente recidivam em zonas próximas da localização inicial, conduzindo rapidamente à morte. Várias vias de sobrevivência encontram-se constitutivamente activadas em células de glioblastoma, tornando estas células resistentes à quimioterapia convencional e a estímulos pró-apoptóticos. O prognóstico desfavorável em doentes com GBM está também fortemente correlacionado com a resistência intrínseca das células do tumor à apoptose. Neste campo, a indução de tipos de morte celular alternativos poderia constituir uma opção para o tratamento do GBM. A morte celular autofágica foi recentemente considerada como uma forma alternativa para a indução de morte celular em glioblastoma, tendo este conceito vindo a ser explorado de forma a tirar partido de mecanismos de morte celular programada independente de caspases para o desenvolvimento de novas terapêuticas. A edelfosina (ET-18- OCH3), é a molécula protótipo de uma família de lípidos artificiais conhecidos colectivamente como análogos alquilfosfolípidos sintéticos, que promove apoptose em células de distintos tumores. A edelfosina demonstrou ser um fármaco antitumoral eficaz in vitro e in vivo, actuando através da reorganização de domínios da membrana plasmática denominados lipid rafts, bem como através da resposta de stress do retículo endoplasmático, induzindo apoptose mediada por caspases e mitocôndria em diferentes células de tumores hematológicos e tumores sólidos. Na primeira parte deste estudo, mostramos que a edelfosina induz principalmente necroptose na linha celular de glioblastoma U118 (U118-MG), utilizada como modelo de GBM, enquanto que a apoptose e a autofagia constituem respostas menos significativas para a execução da morte celular. A resposta necroptótica induzida por edelfosina é muito rápida e potente, sugerindo um possível papel terapêutico para a necroptose no tratamento de tumores cerebrais. Numa segunda parte, descrevemos que a inibição da via de sinalização de MEK1/2- ERK1/2 potencia fortemente a apoptose induzida por edelfosina nas células U118 e muda o tipo de morte celular de necrose para apoptose. Isoladamente, o inibidor de MEK1/2 UO126 reduz a fosforilação de ERK1/2 mas os seus efeitos são potenciados quando usado simultaneamente com edelfosina, conduzindo a uma série de eventos: degradação de RIPK1, provavelmente responsável pela inibição da necroptose; degradação de RelA/NF-κB p65, inibindo assim a sinalização de sobrevivência; activação de caspases, conduzindo à execução de apoptose dependente de caspases. O facto de que a inibição de ERK1/2 potencia dramaticamente a apoptose induzida por edelfosina nas células U118 e altera as respostas de sobrevivência ou necroptose para uma potente activação da apoptose, sugere que a edelfosina é um indutor potente de sinalização apoptótica e que a sua regulação é altamente modulada através da fosforilação de ERK1/2. Em seguida, avaliámos o impacto da modalidade de morte executada na sobrevivência celular e as suas implicações para o desenvolvimento de resistência. Quando incubadas com edelfosina, ~20% das células permaneceram intactas no que diz respeito ao potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm), e não morreram nem por apoptose nem por necrose. Estas células sobreviventes expressam Bcl-xL e a sua incubação com o inibidor mimético de BH3 ABT-737 após tratamento com edelfosina resultou na perda de ∆Ψm e no aumento da morte celular. A pré-incubação com U0126 resultou na degradação de Bcl-xL com praticamente todas as células a perderem ∆Ψm e em forte activação de caspase-9 e apoptose. A inibição da fosforilação de ERK alterou o tipo de morte após tratamento com edelfosina, favorecendo a morte celular. A inibição de ERK e de Bcl-xL conduziu a taxas mais altas de apoptose e à diminuição da sobrevivência de células resistentes. Através de exposição repetida à edelfosina gerámos a partir da linha U118 originalmente sensível uma linha celular resistente, U118-R, e fizémos uma análise comparativa de algumas características de forma a tentar compreender melhor possíveis mecanismos de resitência ao fármaco. Na última parte deste trabalho, procuramos caracterizar diferentes tipos de morte celular induzidos pela edelfosina noutras linhas de glioblastoma e explorámos formas de aumentar a execução da morte celular e/ou abolir a sinalização de sobrevivência, tentando identificar vias de sinalização que se encontram mais frequentemente alteradas em GBM, onde interferir de forma a maximizar a morte celular e evitar o desenvolvimento de resistência ao fármaco. Este estudo, apesar das limitações, traz algumas contribuições para a compreensão da “decisão de opção” entre distintos tipos de morte e possíveis implicações dessa decisão para o desenvolvimento de resistência à morte, e reforça a necessidade urgente de explorar detalhadamente o repertório de mecanismos antiapoptóticos no cancro e a forma como a sinalização de sobrevivência e o bloqueio da execução de morte celular contribuem para a progressão tumoral, desregulação da proliferação celular e resistência a terapias. A linha celular U118 pode constituir um modelo útil para ajudar a esclarecer quais os mecanismos que ditam a decisão para a execução de um ou de outro mecanismo de morte, como a apoptose ou a necroptose, e quais os processos que medeiam as fases de triggering e de execução da necroptose. Conhecer as características moleculares de iniciadores e reguladores de morte celular bem como dos “interruptores” que conduzem à execução de distintos tipos de morte será de extrema importância para o estabelecimento de novas formas de activação e modulação de mecanismos de morte essenciais para o tratamento mais eficaz de tumores, incluindo GBM.
FCT - SFRH/BD/46330/2008

Um dos problemas da oncologia médica é o desenvolvimento de resistência natural ou adquirida, das células neoplásicas aos fármacos anticancerígenos. Os mecanismos envolvidos na sindrome de resistência a múltiplos fármacos (MDR) estão ainda mal esclarecidos. O objectivo deste trabalho é avaliar a contribuição da persistência do stresse oxidativo, da mitocôndria, das alterações membranares e da expressão das proteinas envolvidas na regulação da morte celular por apoptose, na patogenia, e no desenvolvimento de recidiva e de resistência à quimioterapia na leucemia. Observámos uma diminuição das defesas antioxidantes, particularmente das defesas de natureza enzimática, superóxido dismutase e peroxidase do glutatião, nos doentes com leucemia aguda, e das defesas de natureza não enzimática, glutatião reduzido e vitamina E, nos doentes com leucemia crónica. Encontrámos também um aumento da produção de peróxidos intracelulares, diminuição da actividade da cadeia respiratória mitocondrial, nomeadamente do complexo IV, diminuição da desidrogenase do lactato e ainda um aumento da expressão de Bcl-2 e diminuição da expressão de Bax e de Fas. Estes dados poderão relacionar-se com a elevada capacidade proliferativa das células, na leucemia linfoblástica aguda, e/ou com a resistência à morte celular, na leucemia linfocítica crónica. Por outro lado, os doentes com leucemia linfoblástica aguda em recidiva apresentam aumento da expressão de glicoproteína P de superfície, da razão fosfolípido/proteína e fosfolípido/colesterol, e do conteúdo em triacilglicerídeos. Os doentes com leucemia linfoblástica aguda, de sobrevida mais curta e recidiva mais precoce, são os que apresentam níveis de expressão de Bcl-2 mais elevados e/ou de Bax mais baixos, ou níveis mais elevados de GSH, o que poderá contribuir para essa recidiva e, provavelmente, para a resistência à quimioterapia. Verificou-se também que a citotoxicidade induzida por fármacos anticancerígenos em células de leucemia humana em cultura é mediada por morte celular apoptótica, para a qual pode contribuir o aumento da expressão de Bax e de Fas, bem como o aumento da produção de peróxidos, e a alteração da actividade da cadeia respiratória mitocondrial. Nas células resistentes aos fármacos anticancerígenos, observámos, além do aumento da expressão de glicoproteina P, de Bcl-2 e da razão Bcl-2/Bax, uma diminuição da expressão de Bax e de Fas e um aumento dos níveis de glutatião reduzido, o que pode contribuir para a resistência à quimioterapia, podendo a disfunção mitocondrial ter um papel determinante nos mecanismos de resistência. Um conhecimento mais aprofundado sobre a participação do stresse oxidativo, do envolvimento da mitocôndria e das proteínas reguladoras da apoptose nos mecanismos de resistência à morte celular, pode permitir uma avaliação prognóstica e melhor abordagem terapêutica do doente com leucemia.

Dissertação de mestrado, Oncobiologia,(Mecanismos Moleculares do Cancro), Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015
Cancer can be defined as an unbalance between cell proliferation and apoptosis. The PI3K/AKT signalling pathway is one of the most mutated pathways in cancer and is involved in cell growth and survival. The transcription factor FOXO3a is a critical effector of this pathway and its inactivation by AKT prevents the expression of genes involved in cell cycle arrest and apoptosis. The TRIB2 protein was found to be a repressor of FOXO3a, and over expressed in many types of cancer. Importantly, TRIB2confers resistance to PI3K inhibitors which are being tested in clinical trials. This work shows that following PI3K inhibitor treatment, there is an increase of the TRIB2 protein levels by reducing proteasomal degradation. Furthermore, the TRIB2 COP1 binding domain is critical for AKT activation and subsequent FOXO repression. Altogether, our results provide insight into the mechanism underlying TRIB2 mediated tumorigenesis and drug resistance implicating the binding and activation of AKT and suggests a role of TRIB2 in acquired resistance against PI3K inhibitors.
O Cancro é caracterizado por uma proliferação celular descontrolada oriunda de danos e/ou mutações no ADN. Estas alterações surgem na grande maioria de erros durante o processo de replicação, falhas nos mecanismos de reparação, exposição a fatores ambientais ou a agentes cancerígenas. Existem seis alterações essências que uma célula normal submete-se na transformação em célula tumoral: evasão a supressores externos de crescimento celular, sinalização constitutiva de proliferação, evasão à apoptose (morte celular programada), capacidade própria de induzir angiogênese (produção de novos vasos sanguíneos), potencial replicativo ilimitado que torna a célula “imortal” e capacidade metastática de invadir outro tecidos. Recentemente, mais quatro características foram adicionadas, sendo elas: evasão ao sistema imunitário, instabilidade genómica, desregulação do balanço energético celular e capacidade de inflamação indutora de tumores. O Cancro é uma das maiores ameaças á saúde humana a nível mundial. Dentro dos tipos de cancro mais preocupantes está o cancro de pele, mais especificamente o Melanoma. Esta forma agressiva de cancro de pele desenvolve-se a partir de melanócitos, células especializadas na produção de melanina. Embora este tipo de cancro de pele seja uma minoria (menos de 5% dos casos totais), é um dos mais letais, sendo responsável por aproximadamente 80% de todas as mortes devido a cancro de pele. Com a sua incidência dentro da faixa etária dos 30 aos 60 anos, em particular em pessoas de pele mais clara. O facto de cada vez mais surgirem casos de jovens entre os 25-29 anos é alarmante. O aumento anual da sua incidência têm-se refletido numa subida na taxa de mortalidade associada a este tipo de cancro. Esta doença oncológica é extremamente agressiva e heterogénea, com vários subtipos histológicos e perfis mutacionais. Adere-se o problema que os tratamentos convencionais são pouco eficazes e as drogas mais recentes que conseguem ter resultados tornam-se ineficazes devido aos tumores adquirirem resistência num espaço de meses. A totalidade destes factos confere aos pacientes um prognóstico pessimista. Devido a estes factos, a investigação científica têm-se empenhado em perceber os mecanismos moleculares afetados por esta patologia e em como esse conhecimento pode auxiliar na produção de tratamentos mais eficazes. É o caso da via de sinalização de PI3K, que se verificou ser desregulada em Melanoma, que levou ao desenvolvimento de inibidores capazes de reverter esta alteração, como BEZ235. A via de sinalização de PI3K/AKT é importante na regulação de diversos processos biológicos, tais como proliferação celular, metabolismo, crescimento celular e apoptose. Esta via é ativada pela ligação de fatores de crescimento ao recetor de tirosina quinase na membrana celular. Este recetor, através de fosforilação, ativa PI3K que converte fosfatidil inositol 4,5-difosfato (PIP2) em fosfatidil inositol 3,4,5-trifosfato (PIP3). Este processo é regulado negativamente por PTEN, uma fosfatase que tem como substrato PIP3. O aumento de PIP3 recruta AKT para a membrana, fazendo com que seja ativado por outras quinases através de fosforilação dos seus resíduos Treonina 308 e Serina 473. Após esta ativação, AKT fosforila várias moléculas alvo no citoplasma e no núcleo, como por exemplo p27, BAD, GSK3, MDM2 e FOXO. Os fatores FOXO são uma família de fatores de transcrição que funcionam como ativadores ou repressores, dependendo dos seus cofatores a quando da sua ligação ao ADN. Esta família é fundamental em processos como apoptose, metabolismo, diferenciação celular, inflamação, proliferação e resposta ao stress oxidativo. O fator de transcrição p53 é responsável pela regulação de vários genes envolvidos em apoptose, paragem do ciclo celular, senescência, metabolismo e autofagia. Devido a estas funções, é considerado o “guardião do genoma” e o seu papel contra o desenvolvimento tumoral é bem conhecido. O p53 é regulado por MDM2, uma ubiquitina ligase responsável pela sua ubiquitinação e consequente degradação proteossómica. Na verdade, p53 e MDM2 exercem um feedback loop, sendo que o gene de MDM2 é um dos alvos de p53, mantendo assim os níveis de p53 constantes dentro da célula. O TRIB2 é um gene que tem sido associado ao desenvolvimento de cancro e foi recentemente considerado um biomarcador para o prognóstico e para a progressão de Melanoma. A sua sobre expressão proteica afeta negativamente os tratamentos convencionais a este tipo de cancro. Também está implicado na regulação negativa de FOXO. Dado que este fator de transcrição é uma das vias que as drogas usadas nas terapias utilizam para exercer efeitos citotóxicos e/ou citostáticos sobre as células tumorais, a regulação que TRIB2 exerce sobre FOXO evidencia o seu papel na resistência a quimioterapêuticos (como o clássico DTIC ou o inibidor BEZ235). Pesquisas antecedentes feitas pelo nosso grupo laboratorial demonstraram que o uso de inibidores de PI3K estabilizam os níveis proteicos de TRIB2 e que existe uma interação entre TRIB2 e AKT. Neste trabalho, procuramos perceber como TRIB2 é regulado dentro da célula e como interage com a via de sinalização PI3K/AKT. Durante a nossa investigação constatámos que os níveis proteicos de TRIB2 eram estabilizados na presença de inibidores de PI3K devido a um decréscimo da sua degradação proteossómica. Isto implica que a via de sinalização de PI3K está envolvida na modificação translacional de TRIB2 necessária para a sua degradação. Os mecanismos envolvidos nesta degradação e os seus participantes permanecem desconhecidos. No entanto, estes resultados conseguem demonstrar como TRIB2 influencia a resistência a drogas, como verificado nos casos de Melanoma. Também observámos que a interação entre AKT e TRIB2 é feita através do domínio de ligação a COP1 existente na zona C-terminal de TRIB2. Verificámos que esta interação implica um decréscimo na expressão de genes envolvidos em apoptose e em paragem do ciclo celular como FasLG e p27, respetivamente. Estes resultados evidenciam que a interação entre AKT e TRIB2 está relacionada com a regulação negativa de FOXO. Como confirmação, avaliámos os níveis proteicos de p27 e BIM, genes regulados por os fatores FOXO. Estes resultados implicam que TRIB2 funciona como uma proteína scaffold ou adaptadora, que permite a ativação de AKT no resíduo Serina 473. Em conjunto, estes resultados demonstram como a regulação de TRIB2 e a sua interação com AKT auxiliam as células tumorais a adquirirem resistência a quimioterapêuticos, não só no tratamento de Melanoma mas em outras patologias oncológicas onde a via de sinalização de PI3K/AKT esteja alterada.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2018
Introdução: Atualmente sabe-se que as células tumorais adotam o metabolismo que melhor satisfaz as suas necessidades energéticas, contrariamente ao previamente estabelecido pelo “efeito Warburg”. As células cancro de mama triplo negativo, em particular, obtêm elevados níveis de ATP através da ß-oxidação. Segundo o trabalho previamente desenvolvido no Sérgio Dias lab, a exposição a LDL favorece a proliferação, migração e perda de adesão de células de cancro de mama triplo negativo (MDA-MD-231) in vitro. Estas células apresentam um aumento da massa mitocondrial, maior produção de ATP e menor produção de lactato, sugerindo a adoção preferencial da respiração mitocondrial. Objetivo: 1) Caracterizar as alterações metabólicas induzidas pela hipercolesterolemia e 2) determinar a sua implicância no fenótipo agressivo das células MDA-MD-231 expostas a LDL-colesterol in vitro. Resultados: As células MDA-MD-231 expostas a LDL apresentam um aumento de gotículas lipídicas (avaliado por marcação com Bodipy) e um incremento da massa mitocondrial (avaliado por Microscopia Eletrónica de Transmissão e marcação com MitoTracker Deep Red). A análise de expressão génica por qPCR revelou um aumento da expressão de genes de complexos da cadeia respiratória (COX5b, ATP5q1 e NDUFB5) e da ß-oxidação (CTP1a), uma diminuição da expressão de genes da síntese lípica (FASN e HMGCOA) e ausência de alterações na expressão de genes da biogénese mitocondrial (PGC-1α, PGC-1β, NRF1 e TFAM). A utilização do inibidor de CPT1a Etomoxir não interfere com a proliferação das células MDA-MB-231 expostas a LDL, mas impacta a sua capacidade migratória. Conclusão: As células MDA-MB-231 expostas ao LDL têm mais mitocôndrias, maior conteúdo de lípidos e a sua alta capacidade migratória encontra-se dependente da ß-oxidação.
Introduction: Cancer cells are no longer thought to obtain all their energy from aerobic glycolysis (Warburg’s effect) and are able to adopt metabolic programs that better fit their needs. Recently, it was shown that metastatic triple negative breast cancer (TNBC) obtains high levels of ATP through fatty acid oxidation (FAO). In Sérgio Dias lab, it was previously shown that LDL-cholesterol exposure promotes TNBC cells (MDA-MB-231) proliferation, migration and loss of adhesion in vitro. LDL exposed cells have increased mitochondrial number, lower lactate production and higher ATP levels, suggesting a preferential adoption of mitochondrial respiration by more aggressive TNBC cells. Objectives: The aim of this study is 1) to characterize the metabolic alterations induced by hypercholesterolemia and 2) to elucidate their requirement for the acquisition of aggressiveness by LDL exposed MDA-MB-231 cells in vitro. Methods/Results: We confirmed the increase in lipid droplets content in LDL exposed MDA-MD-231 cells by Bodipy staining and the increase in mitochondrial mass by MitoTracker Deep Red staining and analysis of Transmission Electron Microscopy imaged sections. By qPCR analysis, we showed that LDL exposed cells have an increased expression of oxidative phosphorylation chain components (COX5b, ATP5q1 and NDUFB5) and the FAO component CPT1a; a decreased expression of lipid synthesis enzymes (FASN and HMGCOA) and no differences in the expression of mitochondrial biogenesis factors (PGC-1α, PGC-1β, NRF1 and TFAM). Additionally, the CPT1a inhibitor Etomoxir does not affect proliferation, but abolishes the increased migratory capacity of LDL exposed MDA-MB-231 cells. Conclusions: LDL exposed MDA-MB-231 cells have more mitochondria, increased lipid droplets content and rely on FAO for the increase migratory capability.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2018
Introdução: O cancro da mama é o cancro com maior incidência e maior mortalidade nas mulheres a nível mundial. Um dos subtipos de cancro da mama está associado a mutação BRCA1/2. Este representa 5% de todos os cancros da mama, e 20% dos cancros da mama familiares. A mutação destes genes está também associada a cancro do ovário, próstata e pâncreas. O advento de uma família de fármacos designada de inibidores da PARP originou uma mudança na abordagem terapêutica a estes cancros. No entanto, tem sido relatado que nem todos os doentes com cancros associados a mutações BRCA1/2 respondem a esta terapêutica. Por outro lado, existem doentes sem mutação que apresentam melhoria quando submetidos à mesma. Torna-se assim evidente a necessidade de um teste funcional que permita caracterizar, em tempo útil, a resposta de diferentes tumores ao tratamento com inibidores da PARP, independentemente do seu perfil genético ou molecular. Objectivo: Testar se o modelo de xenógrafos de peixe-zebra tem capacidade de diferenciar respostas funcionais de tumores com e sem mutação BRCA2 quando tratados com Olaparib, um inibidor da PARP, num curto período de tempo. Materiais e métodos: Larvas de peixe-zebra foram injectadas com células das linhas isogénicas VC8-B2 (WT) e VC8 (mutBRCA2). 24h pós-injecção, os xenógrafos foram distribuídos de forma aleatória pelas diferentes condições de tratamento – Controlo, Olaparib, radiação ionizante (25Gy) e radiação ionizante (25Gy) seguida de Olaparib. Os xenógrafos foram fixados em formaldeído 4dpi e 5dpi, e analisados por imunofluorescência de confocal. Resultados: Na ausência de tratamento (controlos) conseguimos detectar claras diferenças de comportamento das linhas isógenicas que apenas diferem na presença (VC8-B2) ou ausência (VC8) do gene BRCA2. Aos 4dpi, os tumores de VC8 (mutBRCA2) apresentaram uma menor capacidade de implantação, uma maior taxa de morte celular e um menor tamanho que os tumores de VC8-B2 (WT). No entanto, apresentaram uma maior expressão de Ki67. Para além disso, foi possível detectar que, na ausência da proteína BRCA2, os tumores apresentaram uma menor capacidade neo-angiogénica. Quando tratados com Olaparib, verificou-se um aumento significativo da morte celular dos xenógrafos de VC8 (mutBRCA2) (P<0,0001), mas o mesmo não se verifica nos xenógrafos de VC8-B2 (WT). O aumento de Caspase3 nos xenógrafos de VC8 (mutBRCA2) é também visível nos restantes regimes terapêuticos testados, existindo um efeito sinérgico aquando do tratamento com o regime combinatório de radiação ionizante e Olaparib. Discussão: O peixe-zebra apresenta-se como um modelo capaz de distinguir diferentes comportamentos basais de linhas celulares com diferentes status BRCA2 no que toca à sua capacidade de implantação, proliferação, apoptose e potencial angiogénico. De forma mais importante, este modelo é capaz de diferenciar o impacto do tratamento com Olaparib sobre a indução de apoptose celular em tumores com e sem mutação BRCA2, bem como a resposta destes a tratamento com radiação ionizante e com um regime terapêutico combinatório.
Introduction: Breast cancer is the cancer with the highest incidence and mortality in women worldwide. A particular subtype of breast cancer is the one associated with BRCA1/2 mutations – it represents 5% of all breast cancers and 20% of familial breast cancers. These mutations are also associated to some types of ovarian, prostate and pancreatic cancer. With the development of PARP inhibitors, the therapeutic approach of these cancers suffered a change. However, it has been reported that not all patients with a BRCA1/2 mutation respond to this treatment, and that some patients with a preserved BRCA function do. Therefore, the need for a functional test that allows a rapid characterization of the response of different tumors to the treatment with a PARP inhibitor, regardless of their genetic or molecular profile, becomes evident. Objective: To test if the zebrafish xenografts model has the ability to differentiate, over a short period of time, functional responses to PARP inhibitors in tumors with and without BRCA2 mutations. Materials and methods: Zebrafish larvae were injected with the isogenic cell lines VC8-B2 (WT) and VC8 (mutBRCA2). 24h post-injection, the xenografts were randomly distributed through different treatment conditions – Control, Olaparib, ionizing radiation (25Gy) and ionizing radiation (25Gy) followed by treatment with Olaparib. Xenografts were fixed in formaldehyde at 4dpi and 5dpi, and analysed by immunofluorescence confocal microscopy. Results: When no treatment was applied (Controls) it was possible to observe clear differences in the behaviour of the isogenic cell lines, which only differ between themselves in regards to the presence (VC8-B2) or absence (VC8) of a functional BRCA2 gene. At 4dpi, VC8 (mutBRCA2) xenografts presented a lower rate of engraftment, a higher rate of cell death and a smaller size of tumors than VC8-B2 (mutBRCA2) xenografts. However, they displayed a higher expression of Ki67. Besides, it was possible to observe that, in the absence of a functional BRCA2 protein, the tumors presented a lower angiogenic potential. When treated with Olaparib, VC8 (mutBRCA2) xenografts presented a significant increase in the expression of Caspase3 (P<0,0001). The same effect does not occur in VC8-B2 (mutBRCA2) xenografts. Capase3 expression in VC8 (mutBRCA2) xenografts is also significantly increased in every other treatment condition, and a synergistic effect is visible when xenografts were treated with the combinatorial regimen. Discussion: Zebrafish presents as a model with the ability to distinguish different basal behaviours of cell lines with different BRCA2 status in regards to their engraftment, proliferation, apoptosis and angiogenic potential. Besides, this model can differentiate the impact of Olaparib on Caspase3 fold induction in tumors with and without a BRCA2 mutation, as well as their response to treatment with ionizing radiation and a combinatorial regimen.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2019
O cancro da mama é o mais frequente entre mulheres em todo o mundo e é responsável pela maioria da mortalidade associada a cancro, no sexo feminino. As metástases são a principal causa de mortalidade, representando até 90% das mortes por cancro da mama. O cancro da mama metastático tem mau prognóstico, embora haja diferenças significativas consoante o subtipo considerado. O cancro da mama triplo negativo metastático tem um tempo médio de sobrevida extraordinariamente inferior aos restantes, devido à ausência de receptores moleculares e terapêuticas dirigidas, à heterogeneidade molecular e à tendência para metastizar ou recidivar. A metastização ocorre segundo a cascata de invasão-metástase, que tem várias etapas: invasão local, intravasão, sobrevivência em circulação, extravasão, sobrevivência no microambiente secundário e proliferação para formar metástases. É imperativo compreender os mecanismos alterados na base da metastização do cancro de mama triplo negativo, isolar potenciais alvos terapêuticos e marcadores de prognóstico. O LDL é uma lipoproteína de baixa densidade que transporta triglicéridos e colesterol esterificado do fígado para os tecidos periféricos. Níveis plasmáticos elevados de LDL estão associados a menor tempo livre de doença e maior progressão tumoral, em cancro de mama. A molécula de LDL tem impacto em várias etapas da cascata invasão-metástase. Destaca-se a promoção da perda de adesão à matriz, o aumento da invasão e migração, a estimulação de mecanismos que facilitam a intravasão e extravasão, bem como o aumento do número e tamanho de metástases pulmonares, em ratos hipercolesterolémicos, e nódulos linfáticos metastáticos, em pacientes com níveis plasmáticos de LDL aumentados. Nos carcinomas, a transição epitélio-mesenquimatosa está associada a facilidade em progredir na cascata metastática e o LDL induz a expressão de factores de transcrição que promovem este processo. O metabolismo lipídico, em particular, altera-se substancialmente em tumores em progressão, como o triplo negativo. As células de cancro de mama triplo negativo têm alterações a vários níveis de regulação lipídica, aumentando o uptake de lípidos, facilitando o transporte intracelular de ácidos gordos e a activação necessária para armazenar lípidos em lipid droplets ou encaminhá-los para membranas lipídicas e para a oxidação de ácidos gordos. Além disso, apesar de serem globalmente mais glicolíticas, subsets de células triplo negativo têm demonstrado ser capazes de recorrer à utilização de oxidação de ácidos gordos e têm vários genes associados a esta via alterados. A elevada quantidade de energia providenciada por esta oxidação é vantajosa para a sobrevivência em ambientes com nutrientes mais limitados, como em perda de adesão. De facto, a desregulação de alguns destes genes está associada a progressão metastática e a pior prognóstico em cancro triplo negativo. O microambiente tumoral no cancro da mama promove a progressão tumoral, contribuindo para a inflamação tumoral crónica (particularmente no caso da obesidade e dislipidemia), participa em permuta de metabolitos e fornece lípidos, que são transferidos para as células cancerígenas. São conhecidas várias alterações mitocondriais, em células invasivas e metastáticas de cancro da mama, como a expressão e activação de proteínas associadas a fissão e biogénese mitocondrial. Como consequência, estas células têm uma rede mitocondrial com maior massa, mais fragmentada, e as mitocôndrias são transportadas para regiões distantes do núcleo, incluindo protusões citoplasmáticas, onde promovem a migração. Em circulação, estas células têm menor acesso a nutrientes, menor necessidade de captar substratos para metabolismo anabólico e maior necessidade energética, portanto o metabolismo energético é mais dependente da respiração mitocondrial e os genes associados à glicólise são sub-expressos. Apesar de evidência recente sugerir que a exposição a LDL induz a agressividade de células TNBC ao modular a morfologia mitocondrial e o metabolismo, o mecanismo exacto destas alterações e as implicações para a progressão do cancro da mama, permanecem desconhecidos. Nesta dissertação, propusemo-nos estudar 1) se células de cancro da mama triplo-negativo após exposição a LDL têm um comportamento mais agressivo num organismo vivo, 2) se há invasão diferencial em órgãos secundários e 3) se as adaptações mitocondriais estariam correlacionadas com comportamento invasivo e tropismo diferencial. Para abordar estas questões, a linha celular humana de cancro da mama triplo negativo MDA-MB-231 foi cultivada em meio suplementado com LDL ou meio de crescimento normal. As células foram transfectadas com o marcador de mitocôndrias Mito-YFP, marcadas com DiI (MDA-MB-231controlo) ou com Cy5 (MDA-MB-231LDL), e xenotransplantadas em zebrafish com 2 dias pós-fertilização. Aos 4 dias pós-injecção(6 dias pós-fertilização)a capacidade de células MDA-MB-231LDL e MDA-MB-231controlmigrarem para locais distantes em zebrafish foi analisada usando um microscópio widefield. De acordo com nossos resultados, células MDA-MB-231LDL têm migração diferencial estatisticamente significativa em geral (Qui-quadrado p=0.0347) e particularmente para locais distantes, como barbata dorsal (teste de Fisher, p=0.042), músculo dorsal (p=0.05), notocorda (p=0.023) e barbatana anal (p=0.008). Contudo, como o sistema wide field apresenta algumas limitações, quantificámos a capacidade de invasão e colonização de células TNBC em zebrafish com um sistema confocal spinning disk. Analogamente à análise anterior, os resultados revelaram uma tendência para migração diferencial em geral das células MDA-MB-231LDL (Qui-quadrado, p=0.06, n=11). Estes resultados mostram ainda que células 1) MDA-MB-231LDL são capazes de migrar para todos os órgãos analisados, ao contrário das MDA-MB-231control; 2) órgãos mais vascularizados foram invadidos por células de ambas as condições, com as células MDA-MB-231controla infiltrarem mais frequentemente zonas muito vascularizadas, especialmente CHT (teste de Fisher, p=0,02); 3) órgãos menos vascularizados foram invadidos preferencialmente pelas células MDA-MB-231LDL. Entre estes, determinados órgãos são vascularizados apenas por uma artéria (olho, teste de Fisher, p=0,0075) ou eram justamente ventrais relativamente a CHT (barbatana anal) e foram invadidos pelo controle MDA-MB-231; mas outros (notocorda, barbatana ventral, barbatana dorsal, barbatana caudal) não têm vasos nos estudos angiográficos e nas nossas larvas Tg (fli1: efe) a 6dpf e foram exclusivamente infiltrados por células MDA-MB-231LDL. Estes resultados sugerem que as células de ambas as condições são capazes de realizar os três primeiros passos da cascata invasão-metástase (invasão, intravasão, sobrevivência em circulação) mas a exposição a LDL acelera uma ou mais etapas da cascata metastática, facilitando a migração para áreas periféricas e não vascularizadas. Interrogámo-nos porque é que as células MDA-MB-231LDLtêm propriedades migratórias aceleradas, mais invasivas ou menos dependentes da vascularização. Para compreender o panorama geral de migrações contámos as massas tumorais (clusters > 20 células) e as células disseminadas dentro do zebrafish, excluindo células em massas tumorais. Encontrámos uma maior proporção de células MDA-MB-231LDLque células controlo no intestino (qui-quadrado, p<0,0001) e órgãos menos vascularizados: olho (Qui-quadrado, p<0,0001), músculo dorsal (Qui-quadrado, p=0,0336), notocorda (Qui-quadrado, p=0,0058), barbatana ventral (Qui-quadrado, p=0,0002) e barbata anal (Qui-quadrado, p=0,0236). As células MDA-MB-231 control acumulam-se de forma abundante em órgãos extremamente vascularizados-como vesícula óptica (Qui-quadrado, p=0,0073), coração (Qui-quadrado, p=0,0126), guelras (Qui-quadrado, p=0,0003) e CHT (Qui-quadrado, p<0,0001) e outras regiões que não atingiram significância estatística (PVS, fígado). Contudo, não foram detectadas células MDA-MB-231 control em regiões adjacentes não vascularizadas. Este fenótipo diverge do comportamento das células MDA-MB-231LDLque apesar de serem encontradas em menor número e proporção nas regiões vascularizadas, conseguem migrar para as regiões sem vasos, como barbatana ventral, anal, dorsal, caudal e notocorda. A extravasão ou sobrevivência no microambiente distante parecem ser processos limitantes. Duas hipóteses podem explicar estes resultados: 1) quimio atracção das células MDA-MB-231 control especificamente para áreas vascularizadas; 2) aumento da agressividade das células MDA-MB-231LDL dotadas de maior capacidade de extravasamento ou sobrevivência fora do trânsito hematogénico ou ambos. Como as células partilham o mesmo microambiente, este quadro sugere que a extravasão e a sobrevivência à distância terão sido promovidas por transformações nas próprias células cancerígenas, induzidas pela exposição prévia a LDL. Colocamos como hipótese dois mecanismos adaptativos nas próprias células para explicar a alteração de comportamento após exposição a LDL: o desenvolvimento de invadopodia (protusões citoplasmáticas que promovem a extravasão) e utilização de oxidação de ácidos gordos (que aumenta a sobrevivência à distância). De facto, no início da experiência verificámos que a exposição a LDL nas células expostas aumentou o conteúdo de lipid droplets e pode ter sido utilizado para estes fins. Estudos futuros serão necessários para confirmar o aumento da FAO e de invapodia à distância nas células MDA-MB-231LDL. Massas de células tumorais (> 20 células) foram detectadas dentro dos órgãos previamente analisados e quantificadas. Os resultados mostram que MDA-MB-231LDL foram capazes de crescer oito massas celulares tumorais e MDA-MB-231 control foram capazes de crescer sete. De entre estes, contabilizaram-se cinco massas de células tumorais distantes para ambas as condições. Não houve diferença no número de massas distantes ou diferença relevante no número de massas globais. Como a massa mitocondrial, a biogénese e a dinâmica foram previamente implicadas na aquisição de maior capacidade migratória, decidimos estudar o impacto do LDL na distribuição da rede mitocondrial, usando o sinal de Mito-YFP como marcação mitocondrial e recorrendo a microscopia confocal point scanning. A análise qualitativa de distribuição de rede mitocondrial mostrou que 54.7% das células MDA-MB-231LDL adquirem uma distribuição filamentosa diferindo das células MDA-MB-231 control que maioritariamente têm uma distribuição perinuclear (Fisher Test, p=0.0429) Esta diferença advém das células MDA-MB-231LDL que migraram (intestine, cérebro, swim bladder), é estatisticamente significativa no cérebro (p=0.0152), que revelou aumentou de tropismo e maior número de células MDA-MB-231LDL. De acordo com a literatura, o transporte de mitocôndrias para a periferia do citoplasma é uma das alterações das células transformadas que confere propriedades invasivas e migratórias. Os resultados mostram que o LDL promove a aquisição de uma rede filamentosa, que é compatível com maior distribuição de mitocôndrias às periferias incluindo protusões citoplasmáticas. Para estudar quantitativamente a rede mitocondrial, as imagens obtidas com o sistema confocal point scanning foram convertidas em projecções de máxima intensidade e os canais de Mito-YFP e DiI ou Cy5 foram processados como imagens binárias. Quantificámos o número de partículas Mito-YFP, que representa a massa mitocondrial. Os resultados mostram um aumento generalizado do número de partículas Mito-YFP nas células MDA-MB-231 expostas a LDL em relação às controlo (Student T-test, p<0.0001), que foi estatisticamente significativo no PVS (p=0.0304), intestino (p=0.0022)e cérebro (p=0.0456), podendo assim concluir que a exposição a LDL induz um aumento de massa mitocondrial. Também quantificámos a área média de Mito-YFP por célula, uma medida de área de distribuição de rede mitocondrial na célula, que mostra um tendência para estar aumentada em células MDA-MB-231LDL (Student T-test, p=0.0723), atingindo significância estatística no cérebro (p=0.0237) e na swim bladder(p=0.0283), o que sugere que a exposição a LDL promove o aumento da área de distribuição da rede mitocondrial. Por fim, quantificámos a área de Mito-YFP por partícula, que é uma medida indirecta do tamanho de cada mitocôndria. Os nossos resultados mostraram uma tendência para redução de área de Mito-YFP por partícula que apenas alcançou significância estatística no intestino (Student T-test, p=0.0237). Estes resultados sugerem que globalmente, o LDL parece induzir um aumento do número de mitocôndrias, embora com menor tamanho e uma maior área de distribuição da rede mitocondrial na célula. A literatura sugere que células tumorais em migração apresentam aumento de biogénese mitocondrial e fissão da rede e a exposição a LDL parece aumentar este fenótipo. O transporte de mitocôndrias para as protusões citoplasmáticas também aumenta as capacidades invasivas e migratórias. Curiosamente, a exposição a LDL aumentou da área de distribuição mitocondrial, o que se pode reflectir uma maior distribuição de mitocôndrias à periferia contribuindo para as características migratórias e invasivas das células MDA-MB-231.Em suma, as células de cancro de mama triplo negativo estimuladas com LDL têm aumento de propriedades invasivas emigratórias em zebrafish xenotransplantados, que parecem estar associadas a transformações nas próprias células cancerígenas, que as terão dotado de maior capacidade de extravasão e sobrevivência à distância. O LDL induziu adaptações mitocondriais, nomeadamente disposição de rede filamentosa, aumento da massa mitocondrial, mas menor massa por mitocôndria. Estas transformações mitocondriais parecem ser um dos mecanismos pelos quais o LDL induz aumento de invasão, migração ou sobrevivência à distância nas células MDA-MB-231. Estudos futuros são necessários para confirmar estas hipóteses, nomeadamente o uso de larvas Tg (fli1:eGFP) xenotransplantadas separadamente com células MDA-MB-231LDL ou MDA-MB-231 control com término da experiência a time-points posteriores (como 6 dpf) para avaliar o desenvolvimento de massas tumorais mais consideráveis, o tropismo, sobrevivência celular, rede mitocondrial e interacção das células com o endotélio. Ensaios que quantifiquem a utilização de oxidação de ácidos gordos pelas células TNBC e que clarifiquem a relação das mitocôndrias com as protusões citoplasmáticas irão também ajudar a esclarecer o papel do metabolismo lipídico na agressividade das células TNBC. Elucidar estas questões será determinante para identificar alvos terapêuticos eficazes em cancro TNBC metastático, a fim de melhorar o outcome destas doentes.
Background: Breast cancer (BC) is the leading cause of cancer related death in women worldwide and metastasis account for the majority of mortality. Particularly, triple negative breast cancer (TNBC) has remarkably poor prognosis when metastasis develop. Dyslipidemia and mitochondrial adaptations have been implicated in metastatic progression. In this study, we explore the role of LDL and mitochondria in TNBC invasion-metastasis cascade, aiming at identifying new targets and prognostic markers that impact clinical management. Methods: MDA-MB-231 human TNBC cell line was cultured in normal growth medium or supplemented with LDL. DiI-labelled-MDA-MB-231 (control) or Cy5-labelled-MBA-231 (LDL) cells transfected with Mito-YFP were xenotransplanted into the perivitelline sac of 2 days-postfertilization (pdf) zebrafish larvae. After injection, larvae at 1, 4, 5 days pos-injection (dpi) were fixed, stained for GFP and mounted. Tropism was studied using widefield and spinning disk confocal acquisitions. Mitochondrial network quantification was analysed with point scanning confocal images. Fisher Test, and chi-square, chi-square only and student T-test were applied for statistical analysis and p-values<0.05 were considered statistically significant. Results: MDA-MB-231LDL cells showed differential invasion potential (widefield analysis, Chi-square, p=0.0347, n=25 larvae; spinning disk analysis, Chi-square p=0.06, n=11 larvae), with cells disseminating to all organs in both analyses, contrary to MDA-MB-231control cells. MDA-MB-231LDL cells diverged from control and migrated more to less vascularised organs as well as exclusively infiltrated organs where no vessels are found at 6dpf. Mitochondrial network of disseminated MDA-MB-231LDL cells had increased filamentous distribution across the cells, displaying more but smaller Mito-YFP particles, which according to literature is associated with migration and invasion. Conclusions: Our results show that LDL exposure promotes invasion and survival of TNBC cells at distant sites and induce mitochondrial adaptations, i.e., increased mass, along with widespread of network across the cell, a metabolic feature with potential therapeutic application for metastatic TNBC.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2019
Y box binding protein 1 (YBX1 ou YB-1) é um membro da família de factores de transcrição YBX, codificado pelo gene YBX1. Esta proteína está associada à carcinogénese, proliferação e progressão tumoral e, no caso específico do cancro da mama, está relacionada com um pior prognóstico. No entanto, a função da sua forma secretada (sYB-1) é ainda desconhecida. Num estudo anterior observámos existir uma correlação entre a detecção de sYB-1 no soro de doentes com cancro da mama em estadio avançado, o desenvolvimento de metástases extra-ósseas, e uma mais rápida progressão da doença óssea. Neste estudo caso-controlo pretendemos avaliar a associação entre a detecção de sYB-1 e os outcomes clínicos em cancro da mama em estadio inicial. A sYB-1 foi quantificada por ELISA num cohort de 80 amostras de soro de doentes incluídos no estudo AZURE, igualmente distribuídos em função da recorrência ou não nos primeiros cinco anos de follow-up após inclusão no estudo. Avaliámos a associação com os outcomes clínicos e características demográficas e clinico-patológicas dos doentes. A detecção de sYB1 foi mais frequente em doentes sem recorrência (p=0.0024), e em doentes com metástases viscerais no caso dos que recidivaram (p=0.0436). Desta forma a sYB-1 parece ser um indicador de bom prognóstico, estando associada a maior sobrevivência global (p=0,0129) e sobrevivência livre de doença (p=0,0099). Estes resultados sugerem que a sYB-1 pode reflectir uma resposta imune protectora nesta fase inicial da doença. É necessário validar estes resultados num cohort alargado de doentes e compreender o verdadeiro significado prognóstico de sYB-1 em cancro da mama.
Y box binding protein 1 (YBX1 or YB-1) is a member of the YBX family of transcription factors, encoded by the YBX1 gene. It has been associated with carcinogenesis, tumour proliferation and dissemination and in the specific case of breast cancer it is closely related with poor prognosis. However, the role of its secreted form (sYB-1) remains undetermined. In a previous study we have found a significant correlation between detectable sYB-1, development of extra-bone metastases and faster bone disease progression, in patients with advanced breast cancer. In this case-control study the aim was to assess the association between sYB-1 positivity and clinical outcomes in early breast cancer. sYB-1 was quantified by ELISA in serum samples from patients enrolled in the AZURE trial, equally divided between no recurrence and relapse within five years of enrolment. Association with clinical outcomes and patient demographics and clinicopathologic characteristics was evaluated. Positive sYB1 was associated with no recurrence (p=0.0024), and with visceral relapse in patients who recurred (p=0.0436). sYB-1 was an indicator of good prognosis, reflected in higher overall survival (OS) (p=0,0129) and relapse-free survival (RFS) (p=0,0099). These results suggest that sYB-1 might be involved in a protective immune response in early stage disease. Further investigation is needed to validate these results and to better understand of the prognostic role of sYB-1 in early and advanced disease.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2019
O cancro da mama é a neoplasia maligna mais prevalente e com maior mortalidade na mulher. O tratamento da doença metastática permanece um desafio no qual a terapêutica sistémica tem um papel fundamental. A hormonoterapia tem um impacto importante no tratamento de tumores com expressão de receptores hormonais, denominados de Luminais. Infelizmente, uma percentagem significativa de doentes adquire resistência à terapia com progressão da doença. Recentemente, demonstrou-se que a YB-1, uma oncoproteína associada a todos os hallmarks do cancro e à resistência à quimioterapia, está também envolvida na resistência à hormonoterapia. Neste estudo, tivemos como objetivo dar continuidade a um projeto anterior desenvolvido pelo nosso laboratório, cujo propósito foi determinar a associação entre a resistência inata e adquirida à hormonoterapia no cancro da mama luminal e a expressão de YB-1. Neste contexto, expusemos quatro linhas celulares humanas de cancro de mama a diferentes fármacos. Obtivemos clones pós-terapêutica (células released) e avaliámos possíveis alterações no padrão de expressão de YB-1, receptores hormonais e HER2, em células resistentes e released. Os nossos resultados demonstram um aumento na expressão da forma ativada da YB-1, p-YB-1, em células MCF-7 resistentes à hormonoterapia, que se acompanhou de uma maior expressão de HER2. As células released apresentaram um aumento na expressão de YB-1, p-YB-1 e HER2, ocorrendo diminuição da expressão de receptor de estrogénios e de ciclina D1 em células MCF-7 expostas a fulvestrano, sugerindo a emergência de clones mais agressivos, com maior resistência à terapêutica. Nas células HER2+ resistentes ao lapatinib, existe um aumento da expressão de YB-1 e p-YB-1 que é revertido nas células released, com um concomitante aumento de expressão de receptor de estrogénios, possivelmente representando uma sensibilização à hormonoterapia. Este estudo será complementado com ensaios de viabilidade, reavaliação da presença de resistência à hormonoterapia ou lapatinib, bem como a fármacos possivelmente usados numa segunda-linha terapêutica.
Breast cancer (BC) is the most frequent and lethal malignancy among women. Metastatic disease represents a challenge where systemic therapy is crucial. Hormone therapy (HT) has a major role in the treatment of BC with hormone receptor (HR) expression, denominated by luminal BC. Unfortunately, a percentage of patients will develop acquired resistance. Recently, YB-1, a recognized oncoprotein associated with all cancer hallmarks and chemotherapy resistance, was found to be involved in processes related to HT acquired resistance. In this study, we aimed to continue a previous project developed in our lab, which purpose was to determine the association between acquired HT resistance in luminal BC and YB-1 expression. In this context, four human BC cell lines were exposed to different therapies. We derived post-therapy clones (released cells) and assessed possible changes in YB-1, HR and HER2, in both resistant and released cells. Our results show an increase in YB-1’s activated form, p-YB-1, in MCF-7 HT- -resistant cells. When an increase in p-YB-1 was present, it was followed by a rise in HER2. Therapy interruption did not allow phenotype reversion, neither for HT or lapatinib. YB-1 and p-YB-1 expression was raised in released cells, as well as HER2, while ER and cyclin D1 expression decreased in MCF-7 cells exposed to fulvestrant, suggesting the emergence of more aggressive tumor cells, with possible enhanced resistance to therapy. In ER+/HER2+ cells resistant to lapatinib, expression of YB-1 and pYB-1 was increased; this was reversed in released cells, which also showed an increase in HR expression, possibly representing a sensitization to HT. This study must be complemented with cell viability assessments, re-evaluation of therapy resistance and trial of second-line therapies.