Academic literature on the topic 'Optogénétique'

En complément aux méthodes traditionnelles d’observation et de stimulation en neuroscience, l’optogénétique, combinant l’expression ciblée de protéines photosensibles dans les neurones et l’utilisation de nouvelles techniques de microscopies, a connu un essor important ces dernières années. Ce nouveau procédé permet d’enregistrer de manière non invasive les signaux fonctionnels de circuits intacts tels que les changements de potentiel de membrane ou de concentration intracellulaire de calcium mais également de moduler l’excitabilité des neurones. Pour illuminer ces protéines photosensibles, de nouvelles méthodes de microscopie ont été développées. En particulier, afin d’obtenir une résolution spatiale optimale au sein d’un tissu biologique, il devient nécessaire d’utiliser l’illumination bi-photonique et d’utiliser des techniques permettant la mise en forme du faisceau lumineux pour s’adapter à la morphologie des circuits ou même des neurones étudiés.Au cours de ma thèse, j’ai développé une combinaison de méthodes optiques (associant le contraste de phase généralisé avec la focalisation temporelle) afin d’activer le canal cationique channelrhodopsin-2 en excitation bi-photonique. Ce travail a démontré, pour la première fois, l’activation simultanée de potentiels d’action dans plusieurs cellules tout en conservant une résolution axiale à l’échelle cellulaire (~10 μm).La mise en forme du faisceau lumineux semble très avantageuse pour améliorer la spécificité de l’activation. Il restait à démontrer que les faisceaux ainsi modulés conservaient leur intégrité spatiale en se propageant à l’intérieur de tissus biologiques diffusants. J’ai donc étudié la propagation de faisceaux lasers modulés par les techniques du contraste de phase généralisé et de l’holographie numérique en combinaison avec la focalisation temporelle. L’utilisation de la focalisation temporelle permet aux volumes d’excitation de rester confinés sur l’axe de propagation comme observé précédemment, mais aussi de reconstruire un profil d’excitation en profondeur dans le tissu, qui correspond au profile généré sans milieu diffusant. Cet effet est plus important pour le contraste de phase généralisé que pour l’holographie numérique et se dégrade en fonction de la profondeur à laquelle l’activation a lieu. J’ai démontré pour la première fois, l’activation en profondeur (&gt; 200 μm) de neurones grâces à ces méthodes.Enfin, j’ai testé les mêmes techniques d’illumination sur d’autres protéines photosensibles, telles que la C1V1 et l’halorhodopsin. Après avoir établi les spectres d’activation afin de trouver la longueur d’onde optimale pour l’activation bi-photonique, j’ai exprimé ces protéines dans des tranches de cerveaux. Les deux protéines requièrent une activation à 1040 nm à la limite du laser Ti:Sapphire utilisé dans de nombreux laboratoires biologiques. La C1V1 a généré des courants similaires à la ChR2 en terme d’amplitude tout en conservant la lente cinétique de fermeture caractéristique de ce canal. L’halorhodopsin, quant à elle, reste difficile à activer avec de faibles courants et ne permet pas une inhibition sélective de trains de potentiels d’action. Ce problème est probablement dû à un faible taux d’expression observé dans les neurones étudiés et serait peut-être résolu en changeant de construction virale<br>Optogenetics relies on the genetically targeted expression of light sensitive proteins in specific cell populations. This novel field has had a large impact in neuroscience, allowing both monitoring and stimulating the activity of specific neuronal populations, in intact brain preparations. Optogenetic tools have been used to record functional signals, such as changes in membrane potential or intracellular calcium concentration, as well as to modulate the excitability of neurons. To fully exploit the potentiality of optogenetics, new microscopy techniques have been developed to optimize illumination of photo-active compounds in situ. In particular, an important effort has been directed towards improving the spatial and temporal resolution of light stimulation, in order to match the dynamics of physiological processes. In this frame, the use of two-photon excitation becomes necessary to ensure penetration of light in scattering biological tissues, as well as confining the excitation volume and improve the specificity of illumination. My thesis was dedicated to the development and use of advanced optical methods for two-photon excitation of optogenetic tools. In a first project, we combined optical approaches (generalized phase contrast and temporal focusing) to perform two-photon activation of neurons expressing the light-sensitive cationic channel channelrhodopsin-2 (ChR2). Our work demonstrated for the first time the simultaneous generation of action potentials in multiple neurons, while maintaining a micrometric axial and lateral resolution. These results pointed out the advantages of light sculpting to increase both the specificity and the flexibility of photo-stimulation.In order to investigate the potential of this technique for efficient in-depth stimulation, we therefore studied the propagation through scattering biological media of laser beams generated by two different light patterning techniques, generalized phase contrast and digital holography in combination with temporal focusing. We demonstrated that temporal focusing enabled the excitation volumes to maintain micrometric axial confinement, as well as to maintain well defined patterns deep inside tissues. We also demonstrated for the first time the activation of ChR2 at depth over 200 μm.Finally, the last part of my PhD was focused on testing light patterning methods for the activation of two other photosensitive proteins, the excitatory channel C1V1 and the inhibitory pump, halorhodopsin

Gliotransmitters dérivés de l'astrocyte glutamate et l'ATP modulent l'activité neuronale. Cependant, il reste à savoir comment les astrocytes contrôlent la libération et coordonnent les actions de ces gliotransmetteurs. Dans la première partie de ma thèse, en utilisant l'expression transgénique de la canalrhodopsine 2 (ChR2) sensible à la lumière dans les astrocytes, nous avons observé que la photostimulation augmentait de manière fiable le potentiel d'action des neurones pyramidaux de l'hippocampe. Cette excitation repose principalement sur une libération de glutamate dépendant du Ca2+ par les astrocytes qui active les NMDR neuronaux extrasynaptiques. Remarquablement, nos résultats montrent que l'augmentation de Ca2+ induite par ChR2 et la libération ultérieure de glutamate sont amplifiées par l'activation autocrine induite par l'ATP/ADP des récepteurs P2Y1 sur les astrocytes. Ainsi, l'excitation neuronale est favorisée par une action synergique de la signalisation glutamatergique et purinergique autocrine dans les astrocytes. Ce nouveau mécanisme peut être particulièrement pertinent pour les conditions pathologiques dans lesquelles la concentration extracellulaire d'ATP est augmentée et agit comme un signal de danger majeur. Dans la seconde partie de ma thèse, nous rapportons que la photostimulation sélective des astrocytes ChR2 dans le gyrus denté facilite la transmission synaptique excitatrice sur les cellules granulaires via l'activation des NMDR pré-synaptiques contenant GluN2B. De plus, nous avons découvert que l'élévation intracellulaire du Ca2+ induite par l'ATP et dérivée de l'ATP contrôlait étroitement la libération du glutamate par les astrocytes au cours de la photostimulation des astrocytes. Nos résultats fournissent des preuves d'une relation étroite entre l'ATP dérivé d'astrocyte et le glutamate<br>Astrocyte-derived gliotransmitters glutamate and ATP modulate neuronal activity. It remains unclear, however, how astrocytes control the release and coordinate the actions of these gliotransmitters. In the first part of my thesis, using transgenic expression of the light-sensitive channelrhodopsin 2 (ChR2) in astrocytes, we observed that photostimulation reliably increases action potential firing of hippocampal pyramidal neurons. This excitation relies primarily on a Ca2+-dependent glutamate release by astrocytes that activates neuronal extra-synaptic NMDRs. Remarkably, our results show that ChR2-induced Ca2+ increase and subsequent glutamate release are amplified by ATP/ADP-mediated autocrine activation of P2Y1 receptors on astrocytes. Thus, neuronal excitation is promoted by a synergistic action of glutamatergic and autocrine purinergic signaling in astrocytes. This new mechanism may be particularly relevant for pathological conditions in which ATP extracellular concentration is increased and acts as a major danger signal. In the second part of my thesis, we report that selective photostimulation ChR2 positive astrocytes in dentate gyrus facilitates excitatory synaptic transmission onto granule cells via the activation of pre-synaptic GluN2B-containing NMDRs. Moreover, we discovered that astrocyte-derived ATP-mediated intracellular Ca2+ elevation tightly controls glutamate release from astrocytes during astrocyte photostimulation. Our results provide evidence for a close relationship between astrocytic-derived ATP and glutamate

Dans cette thèse, nous avons concentré notre étude sur les mécanismes qui génèrent la polarité cellulaire, en particulier dans le cas de la migration cellulaire. Malgré les derniers développements concernant l’observation de l’activité des RhoGTPases, les principes qui dictent la capacité des cellules à coordonner plusieurs modules de signalisation en parallèle ne sont toujours pas compris. L’optogénétique est un outil d’intérêt pour disséquer ces réseaux de signalisation à partir de la création d’une perturbation dont les caractéristiques spatiotemporelles sont contrôlées. Tout d’abord, à partir de la caractérisation des différents processus biophysiques en jeu, nous avons établi les relations quantitatives entre l’illumination et les gradients moléculaires que l’on induit. Nous avons déterminé qu’il est possible de créer des gradients subcellulaires avec une résolution spatiale de l’ordre de 5 μm et temporelle d’environ 3 minutes Ensuite, nous avons utilisé cette approche optogénétique pour contrôler l’activité de Cdc42, Rac1 et RhoA. Nous avons caractérisé les effets subcellulaires de l’activation de ces RhoGTPases en utilisant l’activité de membrane, les changements de forme cellulaire et leurs déplacements comme rapporteurs de la polarisation et de la migration. Nous avons ainsi montré qu’une activation locale de RhoGTPase permet la réorganisation interne des cellules jusqu’à générer un phénotype de migration.Enfin, nous avons caractérisé les effets d’une activation locale de RhoA sur différents acteurs moléculaires comme les points focaux d’adhésion, l’actine et les moteurs moléculaires myosines. Nous avons mesuré alors la dynamique de l’intégration des points focaux dans le cytosquelette et analysé la réponse du réseau d’acto-myosine au cours d’évènements de rétraction.Notre approche optogénétique couple le contrôle d’une perturbation à la mesure de la réponse cellulaire simultanément de manière directe et reproductible. Elle apporte une méthode pour contrôler la polarité cellulaire et une manière de disséquer des réseaux de signalisation à l’échelle subcellulaire<br>In this thesis we focus on the mechanisms that establish cell polarization, particularly during cell migration. Despite latest developments that enable visualization of RhoGTPases activity, the underlying principles dictating the cell’s ability to coordinates multiple signaling modules is still unclear. Optogenetic methods have been recognized as promising tools to dissect these intracellular signaling networks by allowing perturbations to be spatially and temporally controlled. We established the quantitative relationship between illumination patterns and the corresponding gradients of induced signaling activity through the characterization of the biophysical properties of CRY2/CIBN. We determined that it is possible to create subcellular gradients of recruited proteins of different shapes of choice up to spatial resolutions of 5μm and temporal ones of ca. 3 minutes.We applied the aforementioned optogenetic approach as a means to perturb the activity of cdc42, Rac1 and RhoA. We characterized the effects of subcellular activation of those RhoGTPases using membrane activity, cell shape changes and cell displacement as reporters of cell polarization and migration. We show that localized activation of RhoGTPases can trigger cellular organization and drive the cell into a migrating state.We also characterized the effects of local activation of RhoA on different cellular effectors as focal adhesion complexes, actin filaments and myosin molecular motors. We measured the dynamics of the newly formed focal adhesion complexes and the acto-myosin complex during retraction events.Altogether, our optogenetic methodology enables simultaneous measurement of the imposed perturbation and the cell response in a straightforward and reproducible way. It provides a quantitative way to control cell polarity and a step forward in the dissection of subcellular signaling networks

La réhabilitation sensorielle revêt un intérêt crucial en neurosciences. La recherche en audition fut pionnière dans ce domaine grâce à l'implant cochléaire. Cet appareil agit comme un substitut de la cochlée en mimant la transformation précoce de l'information auditive. Malgré cela, si la qualité de vie des patients augmente, l'audition n'est pas parfaitement restaurée. Ce manuscrit propose une nouvelle approche à la restauration auditive via la stimulation optogénétique corticale.Comme toute neuroprothèse, une prothèse auditive requiert le développement d'un système d'encodage de l'information, pour transformer les sons naturels en stimulations corticales pertinentes. Dans une étude préclinique, nous comparons deux modèles d'encodages : l'un s'appuyant sur des caractéristiques connues du cortex auditif et l'autre, plus abstrait, reposant sur les capacités de compression et de réduction de dimensions propres au deep learning. Cette approche d'encodage encore inexplorée permet d'inclure des contraintes à la fois techniques et biologiques.Nous avons entraîné des souris transgéniques exprimant le ChR2 dans les neurones excitateurs du cortex à discriminer des simulations générées par nos modèles d'encodage jouées sur le cerveau via un vidéoprojecteur. Nous montrons qu'elles peuvent utiliser les motifs extraits des deux modèles pour prendre une décision. Toutefois, en variant la similarité des stimulations, nous avons observé que les stimulations produites par l'autoencodeur étaient plus précises que celles du modèle tonotopique.L'entraînement des souris à cette tâche s'est révélé être difficile, c'est pourquoi nous avons développé une technique pour récompenser les souris pendant ces tâches perceptuelles sans restriction hydrique. Cette méthode de stimulation intracraniale apparaît comme plus efficace sur des tâches complexes, plus flexible pour l'expérimentateur et surtout moins stressante pour l'animal.Nous n'avons pas observé de transfert immédiat entre une stimulation artificielle et un son naturel. Nous avons comparé les représentations neuronales des sons et des réponses optogénétiques en utilisant des électrodes à haute densité chez la souris éveillée via une analyse populationnelle. Nous avons démontré que ces activités ne vivaient pas dans le même sous-espace et identifié plusieurs pistes d'améliorations. Enfin, nous avons proposé de résoudre certaines des limites identifiées via des injections virales néonatales afin d'augmenter la résolution spatiale et le caractère éparse de notre stimulation.Bien qu'un vidéoprojecteur soit utile pour le développement, il n'est pas transférable en clinique. En collaboration avec l'Université de Strathclyde, nous avons donc développé un implant µLED cortical pour des études précliniques. Cet implant flexible et biocompatible reste assez puissant pour la stimulation optogénétique sans augmentation de chaleur. Un algorithme permet l'ajustement instantané des intensités d'illumination pour assurer une reproduction fidèle de la stimulation optogénétique. Nous avons testé cet implant in vivo via enregistrement électrophysiologique et démontré son utilisation dans des tâches comportementales.En résumé, ce travail apporte des premières réponses au problème complexe de la restauration auditive corticale. Nous présentons une nouvelle façon d'encoder des stimuli sensoriels grâce à un modèle de deep learning, démontrons sa performance chez la souris en comportement et explorons ses similarités avec des sons naturels par enregistrements électrophysiologiques. En parallèle, nous avons publié une méthode d'apprentissage novatrice à haute efficacité avec un minimum d'impact sur le bien-être animal. Enfin, nous présentons un implant cortical µLED fonctionnel et évaluons sa capacité à créer des réponses optogénétiques. L'ensemble de ce travail constitue une première validation du concept de l'implant optogénétique cortical et ouvre de nouvelles perspectives de recherche dans le domaine<br>Sensory rehabilitation is of broad and crucial interest in neuroscience. The auditory field quickly became prominent thanks to an early breakthrough: the cochlear implant. This electrical device mimics early auditory processing and acts as a substitute for the cochlea. However, if the quality of life can significantly improve for people responding to the device, it does not restore hearing perfectly for every patient. This manuscript proposes a novel approach to auditory restoration through cortical optogenetic stimulation.Similarly to any neuroprosthetic device, restoring hearing capabilities first requires finding a suitable encoding system to transform information from the environment to meaningful cortical stimulation. In a preclinical feasibility study, we compare two encoding models: one relying on known features of the auditory cortex and one, more abstract, leveraging the compression and dimensionality reduction capabilities of deep learning. This unexplored technique for encoding sensory stimulus allows for the integration of both biological and technical constraints.We trained transgenic mice expressing ChR2 in excitatory neurons of the cortex to discriminate stimulation patterns generated by our encoding models and applied them to the brain with a video projector. We show that mice can use patterns from both models to make behavioural decisions. However, with varying sound similarity, we observed that the artificial perception generated with the autoencoder model was more precise than the tonotopic model.As this training proved challenging for the mouse, we devised a unique paradigm for rewarding mice during these perceptual tasks without relying on any classical deprivation protocol. Based on intracranial stimulation of the medial forebrain bundle, this method was shown to be more efficient on complex tasks, more flexible for the experimenter, and less stressful for the animal.As we did not observe an immediate transfer between artificial and natural sound perception, we compared the neural representations of sounds and optogenetic stimulations using high-density electrophysiology in awake mice and population analysis tools. We demonstrated that optogenetic stimulations produce neural activities that do not live in the same sub-space as sounds and identified critical aspects for improvements. Ultimately, we tried to assess some limitations of our transgenic mice model by using neo-natal viral injections to increase our optogenetic stimulation's spatial resolution and sparseness.While a projector is helpful for proof of concept, it does not translate to actual applications. Therefore, in collaboration with the University of Strathclyde, we developed a µLED cortical implant for preclinical studies. This implant is flexible and biocompatible and provides sufficient illumination for optogenetic stimulation while remaining thermally safe. A computational model allows for online adjustment of the illumination intensity to ensure the best reproduction of the optical stimulation. We extensively tested the device in vivo with electrophysiological recordings in the awake mouse and demonstrated its usability for behavioural experimentations.Altogether, this work provides a rich approach to the complex problem of cortical auditory restoration. We present a novel deep-learning-based sensory encoding model, provide behavioural evidence of its performance in the mouse, and further probe its similarities with natural stimuli through electrophysiological recordings. In parallel, we published a new high-efficiency method for perceptual training of the mouse with a low impact on animal well-being. Finally, we present a fully working µLED cortical implant and assess its performance to elicit optogenetic responses. This work provides a first validation of the optogenetic cortical implant concept and opens new perspectives for future research in this field

Les canaux potassiques sensibles à l’ATP (KATP) sont des canaux omniprésents liant excitabilité et énergie cellulaire. Ils fonctionnent en captant le niveau relatif des nucléotides ATP et ADP à l’intérieur des cellules: Les premiers bloquant le canal et les derniers l’activant. De plus le phospholipide phosphatidylinositol4,5-bisphosphate (PIP2) est connu pour être un puissant régulateur des canaux KATP. Ceux-ci sont présents dans la plupart des tissus excitables et sont impliqués dans un grand nombre de fonctions physiologiques. L’objectif de ma thèse consiste à désigner un bloc dépendant de la lumière au niveau de ces KATP, afin de contrôler son activité optiquement tout en gardant ses propriétés natives. Cela a été accompli par la mutation de différents résidus en cystéine. Ce canal KATP complètement dépendant de la lumière, pourrait être utilisé pour réguler les actions de potentiels via la lumière afin de piloter différents aspects d’électrophysiologie cellulaire mais aussi de développer des applications de photo-traitements.J’ai également réalisé la cartographie fonctionnelle des résidus impliqués dans le gating du canal Kir6.2 sous le contrôle de protéines membranaires interagissant avec le domaine N-terminal. Cela a été réalisé par le design d’un canal artificiel Kir6.2 formé par la fusion du C-terminal d’un RCPG avec le N-terminal du canal. Des structures cristallographiques et des caractérisations fonctionnelles des canaux potassiques ont permis de mettre en évidence la présence de deux portes dans les domaines transmembranaires : le filtre de sélectivité et le « gate A » à l’interface cytoplasmique, et le troisième « gate » dans le domaine cytoplasmique du canal Kir connu sous le nom de « G loop gate ». Enfin j’ai caractérisé de mutations dans le gène ABCC9 codant pour SUR2A et associé au syndrome de Cantu (CS). Ces mutations sont localisées dans le domaine transmembranaire 0 (TMD0) de SUR2A, un domaine essentiel dans l’interaction entre Kir6.2 et SUR dans le complexe KATP. Les résultats suggèrent que les deux mutations cause une hyperactivité du canal via 2 mécanismes distincts : (1) Une diminution de la sensibilité de l’ATP affectant la modulation du PIP2, mais qui n’affecte pas l’activation par le Mg-ADP ou (2) aucun effets en réponse à l’ATP ou Mg-ADP, mais une sensibilité accrue au PIP2. Ces découvertes soulignent le rôle essentiel du TMD0 dans la modulation du « gating » de Kir6.2. En particulier, cela démontre qu’il y a un contrôle de la réponse du canal par des effecteurs intracellulaires qui se fixent sur Kir6.2, impliquant des interactions très liées entre Kir6.2 et la région TMD0<br>ATP-sensitive K+ (KATP) channels are ubiquitous channels designed to couple excitability to cellular energy. They perform this function by sensing the relative levels of the intracellular nucleotides ATP and ADP; with ATP blocking the channel and ADP activating it. Additionally, the phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) is known to be a strong regulator of KATP channels. These channels are present in many excitable tissues and involved in many physiological functions. The aim of this thesis is to design a light dependent block of the KATP channel, in order to control its activity and have it under optical control while at the same time retaining its native properties. This was accomplished by mutating specific residues to cysteines. This light dependent blocked KATP channel, could be used to regulate action potentials with light to tune diverse aspects of cellular electrophysiology and potentially photo-pharmacology treatment. We also performed a functional mapping of the Kir6.2 channel gate(s) under the control of membrane proteins interacting with the N-terminal domain. This was performed by using a unique artificial gate Kir6.2 channel formed by fusing a GPCR C-terminus to the Kir6.2 N terminus. Crystallographic structures and functional characterizations of potassium channels demonstrated the presence of two gates in the transmembrane domains: the selectivity filter and the "A" gate at the cytoplasmic interface, and a third gate in the cytoplasmic domain of Kir channels known as the G loop gate. Unexpectedly, our results demonstrated that several gates could be involved suggesting a concerted mechanism. Finally, we characterized two single-point mutations in the ABCC9 gene encoding SUR2, that are associated with Cantu syndrome (CS). These mutations are localized in transmembrane domain 0 (TMD0) of SUR2A, an essential domain which mediates the interaction between Kir6.2 and SUR within the K-ATP channel complex. Results suggest that the two mutations cause KATP channel hyperactivity through two divergent mechanisms: (1) a decreased sensitivity to ATP inhibition and affecting the modulation by PIP2, and that does not affect activation by Mg-ADP or (2) any effect on the response to ATP and Mg-ADP, but more sensitive to activation by PIP2. These discoveries underline the essential role of TMD0 in the gating modulation of Kir6.2. They demonstrate in particular that it can control the response of the channel to intracellular effectors that bind to Kir6.2, implying tight interactions between Kir6.2 and the TMD0 region

Les ganglions de la base (GB) forment un réseau de structures sous-corticales impliquées dans la motricité volontaire, mais aussi dans des aspects plus cognitifs et motivationnels du comportement moteur. La dopamine est un neuromodulateur essentiel au bon fonctionnement de ce réseau. La synapse cortico-sous-thalamique (cortico-NST) est une synapse glutamatergique (excitatrice) transmettant les informations corticales au noyau sous-thalamique (NST), ce qui forme la première partie d’une des trois voies des GB : la voie hyperdirecte. La voie cortico-NST est impliquée dans des tâches de type « go-no-go » (arrêt d’un acte moteur débuté) et dans les effets bénéfiques de la stimulation cérébrale profonde du NST sur les symptômes de la maladie de Parkinson. Cependant, les propriétés des synapses cortico-NST ne sont pas connues. Ce manque d’informations provient, en partie, de l’anatomie particulière de cette voie, qui rend l’étude in vitro de la synapse cortico-NST difficile. L’utilisation de l’optogénétique nous a permis de contourner ce problème. En associant cette technique à l’électrophysiologie sur tranches de cerveaux de rongeur, nous avons mis en évidence un effet inhibiteur des récepteurs dopaminergiques D5 sur la transmission cortico-NST. Nous montrons également que les propriétés de plasticité à court terme de cette synapse lui permettent de réduire l’influence des messages corticaux à haute fréquence sur le NST. Les résultats obtenus au cours de cette thèse montrent que l’optogénétique est un bon moyen d’étudier la synapse cortico-NST in vitro et contribuent à améliorer la compréhension des propriétés de la cette synapse<br>Basal ganglia (BG) are a group of subcortical nuclei involved in action selection and in cognitive and motivational aspects of motor behavior. Dopamine is essential for proper functioning of BG. The cortico-subthalamic (cortico-STN) synapse is a glutamatergic (excitatory) synapse involved in signal transmission from cortex to subthalamic nucleus (STN). The cortico-STN synapse is the first synapse in the hyperdirect pathway, one of the three pathways of BG. Even if the cortico-STN pathway is involved in “go-no-go” tasks (stopping of an already started motor act) and in the beneficial effects of the high frequency stimulation of the STN on Parkinsonian symptoms, properties of the cortico-STN synapse are not well described. The lack of data is due, at least in part, to the specific anatomy of the cortico-STN pathway which does not allow the use of standard methods in vitro. The use of optogenetics allowed us to circumvent this issue. By coupling this approach with electrophysiology on brain slices in rodents, we show that dopaminergic D5 receptors stimulation reduces glutamatergic transmission at cortico-STN synapses. We also show that short-term plasticity properties of this synapse reduce the influence of high frequency cortical inputs on the STN. Our findings indicate that optogenetics enables studying the cortico-STN synapse in vitro and contributes to improving our knowledge of the properties of the synapse

Les circuits neuronaux des noyaux de la base sont impliqués dans la planification et la sélection des mouvements, dans des processus motivationnels et de renforcement, mais aussi dans des fonctions plus cognitives telles que les processus d’apprentissages instrumentaux. Le dysfonctionnement de ces noyaux entraîne des troubles moteurs graves, telles les maladies de Parkinson et Huntington, et des pathologies plus psychiatriques, comme les phénomènes de dépendances aux drogues, le syndrome Gilles de la Tourette ou encore les troubles déficitaires de l’attention avec hyperactivité. Le striatum, structure d’entrée du système des noyaux de la base, est composé en large majorité de neurones de projections GABAergiques épineux de taille moyenne (medium spiny neuron, MSN), qui sont subdivisés en deux populations: les neurones striatonigraux et les neurones striatopallidaux. Ces neurones forment des voies fonctionnelles parallèles et distinctes :celles ci prennent naissance au niveau du striatum après réception de l’information émanant du cortex, puis traversent les autres ganglions de la base (Globus Pallidus, Noyau sous-thalamique, Substance noire), qui ensuite aboutissent sur le thalamus qui retourne l’information traitée aux différentes aires corticales concernées. Ces neurones de projections sont morphologiquement identiques et distribués de manière homogène dans l’ensemble du striatum, rendant difficile leur étude spécifique sans outils génétiques.Dans ce travail, nous avons étudié les rôles respectifs de ces deux populations neuronales dans l’apprentissage instrumental séquentiel par une approche optogénétique. Cette technique permet de contrôler optiquement, à une échelle de temps physiologique et de façon réversible, l’activité d’une population de neurones génétiquement ciblée pendant un comportement. Dans un premier temps, nous avons développé des modèles de souris dans lesquelles chacune de ces deux populations est spécifiquement ciblée au moyen du système Cre/LoxP et à l’aide d’injection stéréotaxique de vecteurs viraux permettant l’expression de canaux photosensibles, comme la Channelrhodopsine-2 (ChR2). Une validation de la fonctionnalité de cette protéine dans ces modèles a d’abord été établie ex vivo par des moyens électrophysiologiques (enregistrement de l’activité des neurones sur tranche de cerveau en survie), puis in vivo, par induction d’un comportement rotatoire caractéristique de l’activation unilatérale de ces populations neuronales.Dans un second temps, ces souris ont été étudiées dans un paradigme comportemental lié au striatum dorsal :l’apprentissage instrumental séquentiel. En effet, l’exécution d’une séquence d’actions dans un ordre bien déterminé est fondamentale pour adopter un comportement adapté. Au cours de l’acquisition d’une nouvelle séquence, chacune de ces deux populations de neurones est activée par optogénétique afin de déterminer leur effet dans cet apprentissage. Nous nous sommes particulièrement intéressés à ces neurones dans le striatum dorsolatéral (DLS), car cette région joue un rôle fondamental dans la formation d’une habitude, et plus particulièrement lors d’un apprentissage séquentiel. Ce travail a pu mettre en évidence l’importante implication respective de ces neurones du DLS lors de l’acquisition d’une séquence puisque nous avons montré que l’activation des neurones striatonigraux facilitait l’apprentissage d’une nouvelle séquence, alors que l’activation des neurones striatopallidaux perturbe cet apprentissage. De plus, nos résultats indiquent que la stimulation optogénétique des neurones striatopallidaux entraîne un déficit à différencier et à associer des actions pour former une unité performante, tandis que l’activation des neurones striatonigraux semble fondamentale pour initier et terminer correctement une séquence. Ces résultats contribuent ainsi à la compréhension du rôle des deux voies principales du striatum dorsolatéral lors d’un apprentissage instrumental séquentiel.<br>Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)<br>info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’addiction se caractérise par une recherche et une consommation pathologiques de la drogue, maintenues malgré leurs conséquences néfastes. C’est une pathologie chronique car, le plus souvent, les tentatives de sevrage se soldent par une rechute. L’addiction à la cocaïne se développe chez 15 à 20 % des usagers, après un usage plus ou moins prolongé. Les solutions thérapeutiques font gravement défaut et c’est un enjeu que de comprendre les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent cette addiction. Les études cliniques et précliniques proposent que l’addiction résulte d’un déséquilibre entre les circuits cortico-subcorticaux qui gèrent la valeur motivationnelle de la drogue et ceux qui sont impliqués dans le contrôle cognitif inhibiteur. Des changements séquentiels dans des circuits interconnectés qui incluent notamment le noyau basolatéral de l’amygdale, le noyau accumbens et le cortex préfrontal seraient au cœur de processus motivationnels pathologiques et d’une difficulté à inhiber le craving et la consommation. L’étude de l’addiction, à l’échelle des circuits neuronaux, fait face à plusieurs défis. Techniquement limitée chez l’homme, elle peut bénéficier des modèles animaux, mais seulement s’ils capturent des dimensions de la pathologie. Au cours des dix dernières années, de tels modèles ont été mis en œuvre, mais exclusivement chez le rat. Or, les outils pour l’exploration fonctionnelle fine des circuits neuronaux ont été majoritairement développés chez la souris. Un autre défi consiste à pouvoir questionner la fonctionnalité des circuits, en temps réel, sur l’individu se comportant. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif : 1. L’étude de marqueurs de connectivité fonctionnelle chez des rats Addict et des rats Non-addict à la cocaïne. Notre modèle d’addiction à la cocaïne permet d’identifier 15 à 20 % de rats qui, après une période prolongée d’autoadministration intraveineuse de cocaïne, et bien qu’ils aient consommé la même quantité de cocaïne que les autres, montrent une très forte motivation pour la substance, une difficulté à limiter la recherche de drogue, et maintiennent la prise de cocaïne malgré ses conséquences néfastes. L’électrophysiologie in vivo, multi-site, au moyen d’enregistrements unitaires ou de potentiels de champs locaux est un outil de choix pour l’exploration de la connectivité fonctionnelle chez le rongeur. Un défi technique a été de l’adapter pour la coupler à notre modèle d’addiction à la cocaïne chez le rat. Nous avons montré des différences significatives de connectivité fonctionnelle entre rats Addict et Non-addict, suggérant un défaut de fonctionnalité du cortex préfrontal médian (PFM) chez les Addict. 2. L’étude du rôle du cortex prélimbique (PL) dans le contrôle du comportement d’autoadministration de cocaïne chez le rat. Des données récentes de la littérature remettent en cause le dogme selon lequel le PL exerce exclusivement un rôle facilitateur sur les propriétés motivationnelles de la cocaïne. Nous avons cherché à clarifier le rôle du PL dans le comportement d’autoadministration de cocaïne avant que ne se développe une addiction : comprendre son rôle dans l’usage précoce de cocaïne pour, à terme, étudier l’évolution de son implication selon que l’individu développe ou non une addiction. Nous avons montré que l’inactivation du PL peut s’accompagner, chez le même individu, d’une diminution ou d’une exacerbation du comportement de recherche de cocaïne selon les contingences expérimentales. Les neurones du PL émettent des projections vers plusieurs structures. Pour étudier leur rôle dans les effets comportementaux observés, nous avons travaillé à la mise au point d’outils optogénétiques pour la manipulation de l’activité de voies neuronales spécifiques, chez le rat, pour lequel ils sont encore très peu développés. Mes travaux de thèse contribuent tant sur le plan théorique que technique à la compréhension des mécanismes psychobiologiques de l’addiction à la cocaïne<br>Drug addiction is characterized by pathological drug seeking and taking, maintained despite their negative consequences. This is a chronic pathology, withdrawal attempts being unsuccessful in most cases. Cocaine addiction develops in about 15 to 20 % of habitual users. For cocaine, therapeutic options are lacking, which could be explained by the relatively poor understanding of the neurobiological mechanisms underlying cocaine addiction to date. Clinical and preclinical studies propose that addiction results from an imbalance between the cortical-subcortical circuits that process motivational value of drug-related stimuli versus those involved in cognitive inhibitory control. Hierarchical sequential changes in distinct, but interconnected circuits, including the basolateral amygdala, the nucleus accumbens and the prefrontal cortex could be at the core of pathological incentive processes and difficulty to control craving and drug taking. Studying addiction at the neuronal circuit level faces many challenges. Technically limited in humans, it can benefit from animal models, but only if they properly capture dimensions of the pathology. Over the last ten years, such models have been developed, but exclusively in rats. However, tools for a refined functional exploration of neuronal circuits have been established mostly in mice, and until recently they have begun to be explored in rats. In addition, another main challenge is the ability to investigate functional connectivity in real time in behaving animals. My thesis work had two objectives: 1. Studying markers of functional connectivity in rats showing a cocaine addiction-like behavior (Addict) or not (Non-addict). Our model of cocaine addiction allows identifying 15-20% of rats that show a high motivation for cocaine, a difficulty to limit drug seeking and that maintain drug taking despite negative consequences. These extreme behaviors occur after prolonged cocaine self-administration and despite that these rats have used a comparable amount of cocaine as compared to the others. In vivo, multi-site electrophysiology recordings, applied to single units or local field potentials, is a tool of choice for studying functional connectivity in rodents. A technical challenge has been to adapt and couple it to our model of cocaine addiction in the rat. We have evidenced significant differences in connectivity between Addict and Non-addict rats, which suggest a default of functionality of the medial prefrontal cortex in the Addict rats. 2. Studying the role of the prelimbic cortex (PL) in cocaine self-administration behavior in the rat. The canonical role of the PL in exclusively promoting drug seeking was recently questioned, with studies involving it also in inhibition of drug seeking. Our first goal was to clarify this role of the PL in early cocaine self-administration, i.e. before addiction-like behavior develops: understanding its early role to eventually compare it to its late role and whether an addiction-like behavior develops or not. We have shown that optogenetic PL inactivation can decrease or increase cocaine seeking in the same individual, according to experimental contingencies. PL neurons project to several remote structures. To study the role of these different neuronal pathways, we have worked in establishing optogenetic tools for the manipulation of specific neuronal pathways, in the rat, for which they are still poorly developed. My thesis work contribute, both theoretically and technically, to the understanding of the psychobiology of cocaine addiction

La façon dont les mutations permettent aux cellules d’adapter leur physiologie est complexe, dynamique et hétérogène. C’est un processus fondamental de l’évolution souvent étudié à l’échelle des populations longtemps après l’apparition des mutations. Les premières réponses suite à une modification génétique sont donc rarement observées. Je quantifie ici les effets immédiats suite à une altération génétique sur des cellules uniques de Saccharomyces cerevisiae. Pour ce faire, j’ai combiné deux technologies préexistantes, l’une biologique et l’autre physico-chimique. La première est une enzyme optogénétique appelée LiCre qui permet de recombiner des sites spécifiques d’ADN lorsqu’elle est activée par de la lumière bleue. La seconde est une puce microfluidique où des cellules uniques sont encapsulées dans des gouttelettes et observées au cours du temps. Cela permet de quantifier le taux de croissance et le rendement de plusieurs centaines de microcolonies provenant de cellules uniques<br>The way by which mutations allow living organisms to adapt their physiology is complex, dynamic and heterogeneous. It is also a fundamental process of natural evolution. Genetic studies are usually based on populations of mutants that are characterized several generations after the mutation of interest occurred. The early response of cells to genetic changes is therefore rarely known. Here I quantified the immediate effects of a de novo genetic alteration on individual yeast cells. To achieve this, I combined two pre-existing technologies, one from biology and one from physical-chemistry. The first one is an optogenetic enzyme called LiCre which is able to recombine specific DNA sites when activated by blue light. The second one is a digital microfluidics setup, where single yeast cells are encapsulated in droplets and monitored over time. With this technology, hundreds of single-cell seeded microcolonies can be tracked over time to quantify their growth and biomass yield.First, I contributed to the characterization of LiCre in terms of kinetics properties and in vivo applications. Then, to demonstrate the relevance of the LiCre/microfluidics association, I described the dynamics and heterogeneity of responses after a de novo deletion of an essential gene. After validation of this approach, I used it to tackle a fundamental question concerning the fate of mutator cells. With an elevated mutation rate, mutator cells are present in various contexts: stressful environments, cancer, and laboratory-evolution populations. Since many mutations are deleterious, these populations face a loss of fitness, sometimes called “mutational burdened”. Alongside, the mutator phenotype causes higher genomic heterogeneity, which raises adaptive potential of mutator cells. This trade-off between burden and potential to adapt is shaped by various factors: environment, population size, mutation rate, species… Using the approach I developed, I observed experimentally the fine-scale phenotypic properties of mutator populations facing mutational burden. These properties differ across environmental conditions

L'intégrateur oculomoteur dans le rhombencéphale transforme les signaux de mouvements oculaires horizontaux en signaux de position pour maintenir les yeux fixes après les saccades. Plusieurs études électrophysiologiques et pharmacologiques ont montré que les activités des neurones dans l’intégrateur oculomoteur peuvent persister dans un continu de niveaux, chaque niveau correspondant à une position oculaire. Ces résultats ont conduit à l'hypothèse selon laquelle l'intégrateur oculomoteur a un continu d’états stationnaires et stables, donnant lieu à un réseau à attracteur linéaire. À leur tour, les états du système en dehors de ce régime d’activités stables sont attirés vers celui-ci. Dans cette thèse, nous commençons par développer plusieurs modèles qui tiennent compte des résultats précédents, mais qui diffèrent dans leur comportement dynamique en dehors du régime stable. Donc, ces différents modèles ont des comportements distincts en réponse aux perturbations instantanées de l’intégrateur. Pour contraindre les modèles développés, des perturbations optogénétiques sont réalisées dans l’intégrateur oculomoteur du poisson zèbre transformé de manière à exprimer les pompes ioniques d’halorhodopsine ou channelrhodopsine. Les mouvements oculaires résultants de ces perturbations suggèrent que la dynamique de l’intégrateur oculomoteur est organisée autour d'un état attracteur central. Ces résultats posent de nouvelles contraintes dans la connectivité des circuits du système et mettent en évidence le potentiel de la combinaison de l’optogénétique avec des modèles théoriques pour dévoiler la dynamique des circuits neuronaux.