Academic literature on the topic 'Original genetic toggle switch'

Les progrès récents de la microfluidique, la biologie synthétique, la microscopie automatisée rendent aujourd'hui possible le contrôle externe de l'expression des gènes en temps réel. Parmi les défis que devra relever le domaine du contrôle externe et temps-réel de l'expression des gènes, se trouve la possibilité de contrôler des réseaux de régulation génique aux dynamiques complexes et multi-stables et le contrôle de multiples gènes en parallèle. Pour faire avancer le domaine dans cette direction nous avons étudié la contrôlabilité d'un réseau bistable composé de deux gènes, appelé genetic toggle switch, ou bascule génétique, autour de son point d'équilibre instable sur de longues périodes. Dans ce document, nous présentons la mise en place d'une plateforme de contrôle externe de l'expression des gènes en cellule unique, ainsi que le développement d'un châssis cellulaire bactérien et d'une librairie de circuits de bascules génétiques à contrôler. Nous utilisons la plateforme pour diriger et maintenir notre système génétique dans sa région d'instabilité avec des techniques de stabilisation à la fois en boucle ouverte et en boucle fermée. Nous démontrons non seulement que les plateformes de contrôle in silico peuvent être utilisées pour contrôler un système génétique dans un état hors-équilibre, nous démontrons aussi la possibilité de maintenir une population de cellules dans leur région d'instabilité à l'aide de stimulations périodiques en boucle ouverte. Ces résultats suggèrent l'émergence de régimes de stabilité différents dans des réseaux de régulation génique lorsqu'ils sont soumis à des environnements fluctuants, et peuvent fournir de nouvelles perspectives dans l'étude de la prise de décision cellulaire. Nous présentons aussi une nouvelle approche pour l'analyse d'images de microscopie qui exploite l'information cachée dans plusieurs plans focaux autour du spécimen au lieu d'utiliser seulement un seul plan focal. L'objectif de cette méthode est d'identifier automatiquement les différentes parties d'une image à l'aide de techniques d'apprentissage-machine inspirées de l'imagerie hyperspectrale. La méthode facilite la segmentation de l'image et peut être facilement adaptée à différents organismes<br>Recent progresses in microfluidics, synthetic biology and microscopy automation now make it possible to control gene expression externally and in real time. Among the challenges facing the field of external real-time control of gene expression is the control of intricate, multistable gene regulation networks as well as the control of several target genes at the same time. To advance the domain in this direction we studied the controllability of a simple bistable two-genes network, the so-called genetic toggle switch, in the vicinity of its unstable equilibrium point for extended periods of time. Throughout this document, we present the development of a custom control platform for external control of gene expression at the single-cell level as well as a bacterial cellular chassis and a library of toggle switch genetic circuits for us to control. We use the platform to drive and maintain our genetic system in its region of unstability with both closed-loop and open-loop strategies. Not only do we demonstrate that in silico control platforms can control genetic systems in out-of-equilibrium states, we also notably maintain a population of cells in their unstable area with open-loop periodic stimulations. These results suggest the possible emergence of different regimes of stability in gene regulation networks submitted to fluctuating environments, and can potential insights in the study of cellular decision making. We also introduce a new approach for microscopy image analysis which exploits information hidden in several focal planes around the specimen instead of using only a single-plane image. The objective of this method is to automatically label different parts of an image with machine learning techniques inspired by hyperspectral imaging. The method is then shown to facilitate segmentation and be easily adaptable to various different organisms

Research on bacteria in their biofilm form is limited by the ability to artificially culture bacterial biofilms in a system that permits the visualization of individual cells. The experiments comprising this thesis research are on-going investigations of bacterial culture systems engineered to provide an environment that mimics biofilms while enabling real-time microscopy. Specifically, the microfluidic systems developed and assessed as part of this thesis permit the visualization of individual bacteria cells within consortia growing within a narrow space provided by a microfluidic device. This research demonstrates the versatility of these microfluidic systems across potentially high-throughput microbiological experiments utilizing genetically engineered Escherichia coli. Before demonstrating the efficacy of these systems, the development of the field of synthetic biology over the past half century is reviewed, focusing on synthetic genetic circuits and their applications (Chapter 2). The first and main microfluidic device explored in this research was developed to mimic the nutrient-deficient conditions within biofilms by forcing media to enter the culture area through a narrow, torturous channel. The microfluidic channel was thin enough (0.97 μm) to prevent the motility of 1-μm-wide E. coli cells, enabling visualization of individual cells. The bacteria cultured in the device contained either a simple Plux-driven quorum sensing receiver (Chapters 3 and 5) or a LacI- and TetR-driven genetic toggle switch (Chapter 4). Under the culture conditions, the quorum sensing reporter signal was detected even without addition of the signaling molecule (Chapter 3). The genetic toggle switch was stable when the system began in the high-LacI expression state, but after 5 days of culture, >5% of high-TetR expression cells began to consistently express the high-LacI state (Chapter 4). This system was also employed to track lineages of cells using real-time microscopy, which successfully characterized the inheritance of aberrant, enlarged cell phenotypes under stress (Chapter 5). Another microfluidic device, a droplet bioreactor, was also developed to culture small numbers of cells in an aqueous bubble suspended in oil (Chapter 6). Quorum sensing receiver cells were cultured in this device, demonstrating that it is well suited for testing the effects of compounds on biofilms within water-in-oil droplets.<br>Ph. D.

[ES] La mejora genética vegetal tiene como objetivo la obtención de plantas con rasgos mejorados o características novedosas que podrían ayudar a superar los objetivos de sostenibilidad. Para este fin, la biotecnología vegetal necesita incorporar nuevas herramientas de ingeniería genética que combinen una mayor precisión con una mayor capacidad de mejora. Las herramientas de edición genética recientemente descubiertas basadas en la tecnología CRISPR/Cas9 han abierto el camino para modificar los genomas de las plantas con una precisión sin precedentes. Por otro lado, los nuevos enfoques de biología sintética basados en la modularidad y la estandarización de los elementos genéticos han permitido la construcción de dispositivos genéticos cada vez más complejos y refinados aplicados a la mejora genética vegetal. Con el objetivo final de expandir la caja de herramientas biotecnológicas para la mejora vegetal, esta tesis describe el desarrollo y la adaptación de dos nuevas herramientas: una nueva endonucleasa específica de sitio (SSN) y un interruptor genético modular para la regulación de la expresión transgénica. En una primera parte, esta tesis describe la adaptación de CRISPR/Cas12a para la expresión en plantas y compara la eficiencia de las variantes de Acidaminococcus (As) y Lachnospiraceae (Lb) Cas12a con Streptococcus pyogens Cas9 (SpCas9) descritos anteriormente en ocho loci de Nicotiana benthamiana usando expresión transitoria. LbCas12a mostró la actividad de mutagénesis promedio más alta en los loci analizados. Esta actividad también se confirmó en experimentos de transformación estable realizados en tres plantas modelo diferentes, a saber, N. benthamiana, Solanum lycopersicum y Arabidopsis thaliana. Para este último, los efectos mutagénicos colaterales fueron analizados en líneas segregantes sin la endonucleasa Cas12a, mediante secuenciación del genoma descartándose efectos indiscriminados. En conjunto, los resultados muestran que LbCas12a es una alternativa viable a SpCas9 para la edición genética en plantas. En una segunda parte, este trabajo describe un interruptor genético reversible destinado a controlar la expresión génica en plantas con mayor precisión que los sistemas inducibles tradicionales. Este interruptor, basado en el sistema de recombinación del fago PhiC31, fue construido como un dispositivo modular hecho de partes de ADN estándar y diseñado para controlar el estado transcripcional (encendido o apagado) de dos genes de interés mediante la inversión alternativa de un elemento regulador central de ADN. El estado del interruptor puede ser operado externa y reversiblemente por la acción de los actuadores de recombinación y su cinética, memoria y reversibilidad fueron ampliamente caracterizados en experimentos de transformación transitoria y estable en N. benthamiana. En conjunto, esta tesis muestra el diseño y la caracterización funcional de herramientas para la ingeniería del genómica y biología sintética de plantas que ahora ha sido completada con el sistema de edición genética CRISPR/Cas12a y un interruptor genético reversible y biestable basado en el sistema de recombinación del fago PhiC31.<br>[CAT] La millora genètica vegetal té com a objectiu l'obtenció de plantes amb trets millorats o característiques noves que podrien ajudar a superar els objectius de sostenibilitat. Amb aquesta finalitat, la biotecnologia vegetal necessita incorporar noves eines d'enginyeria genètica que combinen una major precisió amb una major capacitat de millora. Les eines d'edició genètica recentment descobertes basades en la tecnologia CRISPR/Cas9 han obert el camí per modificar els genomes de les plantes amb una precisió sense precedents. D'altra banda, els nous enfocaments de biologia sintètica basats en la modularitat i l'estandardització dels elements genètics han permès la construcció de dispositius genètics cada vegada més complexos i sofisticats aplicats a la millora genètica vegetal. Amb l'objectiu final d'expandir la caixa d'eines biotecnològiques per a la millora vegetal, aquesta tesi descriu el desenvolupament i l'adaptació de dues noves eines: una nova endonucleasa específica de lloc (SSN) i un interruptor genètic modular per a la regulació de l'expressió transgènica . En una primera part, aquesta tesi descriu l'adaptació de CRISPR/Cas12a per a l'expressió en plantes i compara l'eficiència de les variants de Acidaminococcus (As) i Lachnospiraceae (Lb) Cas12a amb la ben establida Streptococcus pyogens Cas9 (SpCas9), en vuit loci de Nicotiana benthamiana usant expressió transitòria. LbCas12a va mostrar l'activitat de mutagènesi mitjana més alta en els loci analitzats. Aquesta activitat també es va confirmar en experiments de transformació estable realitzats en tres plantes model diferents, a saber, N. benthamiana, Solanum lycopersicum i Arabidopsis thaliana. Per a aquest últim, els efectes mutagènics col·laterals van ser analitzats en línies segregants sense l'endonucleasa Cas12a, mitjançant seqüenciació completa del genoma i descartant efectes indiscriminats. En conjunt, els resultats mostren que LbCas12a és una alternativa viable a SpCas9 per a l'edició genètica en plantes. En una segona part, aquest treball descriu un interruptor genètic reversible destinat a controlar l'expressió gènica en plantes amb major precisió que els sistemes induïbles tradicionals. Aquest interruptor, basat en el sistema de recombinació del bacteriòfag PhiC31, va ser construït com un dispositiu modular fet de parts d'ADN estàndard i dissenyat per controlar l'estat transcripcional (encès o apagat) de dos gens d'interès mitjançant la inversió alternativa d'un element regulador central d'ADN. L'estat de l'interruptor pot ser operat externa i reversiblement per acció dels actuadors de recombinació i la seva cinètica, memòria i reversibilitat van ser àmpliament caracteritzats en experiments de transformació transitòria i estable en N. benthamiana. En conjunt, aquesta tesi mostra el disseny i la caracterització funcional d'eines per a l'enginyeria del genòmica i biologia sintètica de plantes que ara ha sigut completat amb el sistema d'edició genètica CRISPR/Cas12a i un interruptor genètic biestable i reversible basat en el sistema de recombinació del bacteriòfag PhiC31.<br>[EN] Plant breeding aims to provide plants with improved traits or novel features that could help to overcome sustainability goals. To this end, plant biotechnology needs to incorporate new genetic engineering tools that combine increased precision with higher breeding power. The recently discovered genome editing tools based on CRISPR/Cas9 technology have opened the way to modify plant¿s genomes with unprecedented precision. On the other hand, new synthetic biology approaches based on modularity and standardization of genetic elements have enabled the construction of increasingly complex and refined genetic devices applied to plant breeding. With the ultimate goal of expanding the toolbox of plant breeding techniques, this thesis describes the development and adaptation to plant systems of two new breeding tools: a site-specific nuclease (SSNs), and a modular gene switch for the regulation of transgene expression. In a first part, this thesis describes the adoption of the SSN CRISPR/Cas12a for plant expression and compares the efficiency of Acidaminococcus (As) and Lachnospiraceae (Lb) Cas12a variants with the previously described Streptococcus pyogens Cas9 (SpCas9) in eight Nicotiana benthamiana loci using transient expression experiments. LbCas12a showed highest average mutagenesis activity in the loci assayed. This activity was also confirmed in stable genome editing experiments performed in three different model plants, namely N. benthamiana, Solanum lycopersicum and Arabidopsis thaliana. For the latter, off-target effects in Cas12a-free segregating lines were discarded at genomic level by deep sequencing. Collectively, the results show that LbCas12a is a viable alternative to SpCas9 for plant genome engineering. In a second part, this work describes the engineering of a new reversible genetic switch aimed at controlling gene expression in plants with higher precision than traditional inducible systems. This switch, based on the bacteriophage PhiC31 recombination system, was built as a modular device made of standard DNA parts and designed to control the transcriptional state (on or off) of two genes of interest by alternative inversion of a central DNA regulatory element. The state of the switch can be externally and reversibly operated by the action of the recombination actuators and its kinetics, memory, and reversibility were extensively characterized in N. benthamiana using both transient expression and stable transgenics. Altogether, this thesis shows the design and functional characterization of refined tools for genome engineering and synthetic biology in plants that now has been expanded with the CRISPR/Cas12a gene editing system and the phage PhiC31-based toggle switch.<br>Bernabé Orts, JM. (2019). Development and characterization of two new tools for plant genetic engineering: A CRISPR/Cas12a-based mutagenesis system and a PhiC31-based gene switch [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/133055<br>TESIS