Academic literature on the topic 'Ovocito bovino'

Obtener ovocitos madurados in vitro, que sean competentes para fertilizarse y originar un porcentaje superior al 50 % de blastocitos viables, es una de las principales metas que existen en el desarrollo in vitro de embriones bovinos. Es por ello necesario entender los procesos celulares, que desembocan en la maduración del ovocito durante la foliculogénesis y su subsecuente transición al embrión. La transición del ovocito al embrión es un proceso complejo que involucra la inactivación genómica del ovocito y la activación del genoma embrionario. Este proceso se da en bovinos en la etapa de 8 a 16 células y presenta una degradación selectiva de RNAm maternos, que fueron almacenados durante la ovogénesis y son la fuente para la codificación de proteínas en las etapas iníciales del desarrollo embrionario. La acción de los RNAm maternos es clave para que la activación del genoma embrionario se realice en tiempo y forma adecuados. Entender la participación de estos transcritos en la activación del genoma embrionario, es esencial para esclarecer los procesos celulares que fallan en los protocolos de maduración de ovocitos in vitro. Es por esto que el objetivo de esta revisión fue recopilar la información de los principales RNAm maternos que han sido identificados tanto en el modelo murino como el bovino, esto con el fin de integrar el conocimiento relacionado con los procesos genómicos que permiten el desarrollo del embrión en el bovino, y diseñar nuevas estrategias que permitan mejorar los protocolos de fertilización in vitro.

Se evaluó el efecto antioxidante y metabólico de la L-Carnitina (L-C) durante la maduración in vitro de ovocitos bovinos sobre parámetros asociados a la calidad: cantidad relativa de lípidos, generación de especies reactivas de oxígeno (EROs), niveles de glutatión reducido (GSH), actividad mitocondrial y la competencia para el desarrollo embrionario posterior a la fertilización. Los complejos cúmulo ovocito fueron madurados por 24 h con y sin L-C (3.8 mM), e incubados con el fluoróforo específico para cada parámetro, Rojo Nilo (lípidos), Diclorofluoresceina diacetato (EROs), Monoclorobimane (GSH), Mitotracker Green (mitocondria). La intensidad de la fluorescencia fue analizada con el software ImageJ y normalizada al grupo control de ovocitos madurados sin LCarnitina. Para determinar la competencia del ovocito para el desarrollo embrionario, los ovocitos madurados fueron fertilizados y cultivados por 8 días. En los ovocitos madurados con L-C se encontró una disminución del 8.1% de la cantidad relativa de lípidos y en la generación de EROs del 41.6%; mientras que la actividad mitocondrial aumentó en 160% con respecto al control, y mejoró la cinética y el porcentaje de blastocistos. Sin embargo, los niveles de GSH no se afectaron con la L-C. Los resultados soportan el efecto benéfico de la L-C durante la maduración in vitro del ovocito bovino para mejorar parámetros antioxidantes y metabólicos que se reflejan en la producción in vitro de embriones bovinos.

La ganadería bovina no se encuentra exenta de sufrir las consecuencias ambientales y en específico del fenómeno de cambio climático. Existe evidencia que en los últimos años las temperaturas están aumentando a nivel global. El bovino es un animal que tiene la capacidad de regular su temperatura corporal, sin embargo, cuando se encuentra en un ambiente fuera de su zona de confort comienza a experimentar retos metabólicos que generan consecuencias negativas a nivel productivo y reproductivo. En el caso de la reproducción de la hembra bovina, es claro que existen múltiples factores que se pueden ver afectados por estrés calórico, las cuales, en conjunto, conllevan a disminución de la fertilidad. Bajo condiciones de estrés calórico, la intensidad y duración del estro disminuye, a nivel ovárico se han encontrado consecuencias en la dinámica de ondas foliculares y alteración en la concentración de hormonas como estrógenos y progesterona. Esto afecta la competencia del ovocito y por tanto la tasa de concepción. A nivel embrionario los primeros estadios son vulnerables al estrés calórico y conforme se va desarrollando el embrión va adquiriendo tolerancia a dichas condiciones, sin embargo, la señal de reconocimiento materno fetal por parte del trofoblasto embrionario es débil. En general, el estrés calórico afecta la calidad del ovocito y produce pérdidas embrionarias tempranas que disminuyen la fertilidad de la vaca. Esta revisión describe las interrelaciones de los principales factores involucrados en la reproducción de la hembra bovina que son afectados por el estrés calórico.

El objetivo del presente estudio fue valorar la prueba del azul brillante de cresilo (BCB) como método indirecto para seleccionar ovocitos competentes para la producción in vitro de embriones (PIV). Los complejos cúmulos-ovocitos (COC) fueron obtenidos de dos vaquillas criollas sometidas a dos tratamientos: T1 = COC recuperados por OPU (ovum pick-up) previa estimulación con FSH-LH; T2 = COC recuperados sin previa estimulación de la donante (testigo). Las dos vaquillas fueron alternadas en los dos tratamientos y se hicieron cinco repeticiones. Los COC recuperados fueron clasificados en tipos A, B, C y D. Luego se aplicó la prueba del BCB a cada uno de los tipos de COC para determinar si son BCB+ o BCB-. T1 permitió recuperar 5.2 más COC que T2 (p<0.05). Al aplicar la prueba del BCB se determinó que todos los ovocitos tipo A de T1 y T2 fueron BCB+; es decir, terminaron su crecimiento y se encontraban listos para iniciar el proceso de maduración in vitro; sin embargo, solo alrededor del 50% de los COC tipo B, C y D de T1 y T2 fueron BCB+. Se concluye que la selección de COC basado en las características morfológica es un método confiable únicamente para los de tipo A, y tiene un 50% de error para los COC de tipo B, C y D y, por lo tanto, la aplicación de la prueba del BCB permite mejorar esta selección de forma no invasiva.

Se evaluó el efecto de la adición de melatonina (Mt) en el medio de maduración y/o de vitrificación de ovocitos bovinos sobre clivaje y posterior desarrollo embrionario. Los complejos ovocito-células del cúmulo (COCs) fueron obtenidos de vacas criollas mediante la técnica de aspiración transvaginal guiada por ultrasonografía (OPU) y de ovarios de matadero (OM). Del pool de ovocitos obtenidos de ambas fuentes se seleccionaron los que tenían citoplasma homogéneo y tres o más capas compactas de células del cúmulo. Los COCs seleccionados fueron asignados aleatoriamente a cinco tratamientos: T1, madurados con Mt y vitrificados sin Mt; T2, madurados y vitrificados con Mt; T3, madurados sin Mt y vitrificados con Mt; T4 (control) madurados y vitrificados sin Mt; T5, madurados sin Mt y no vitrificados. La concentración de Mt en los medios de maduración y vitrificación fue de 0.01 μM (10-9 M). Los ovocitos fueron madurados, vitrificados, fecundados y los presuntos cigotos cultivados hasta el día 7 pos-fecundación in vitro. Los datos fueron analizados por regresión logística. Independientemente del origen de los ovocitos, el porcentaje de clivaje (PC) y de producción de embriones (PIV) fue similar entre tratamientos. El PC en los ovocitos de OPU fue mayor en T4, y la PIV fue similar entre tratamientos. En los de OM, los resultados no variaron entre tratamiento en PC y PIV. En conclusión, la Mt redujo el PC en ovocitos colectados por OPU, mientras que no afectó la PIV. En los colectados de OM la adición de Mt no afectó el PC ni la PIV

El estudio analizó las características morfométricas y funcionales de ovocitos de 10 vacas nativas de los Andes ecuatorianos, colectados por aspiración folicular transvaginal (OPU) y de ovocitos colectados post mortem (PM) de ovarios de matadero. Para este propósito, 1157 complejos cúmulo-ovocito (CCOs) del grupo OPU (n=271) y PM (n=886) fueron recuperados en 10 repeticiones por grupo por aspiración folicular a 90 mm Hg de presión y clasificados en calidad A, B o C, de acuerdo con las características del citoplasma y células del cúmulo. Se determinó la actividad de la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (G6PD) como indicador de crecimiento folicular y maduración finalizado y la integridad de la membrana plasmática tiñendo los CCOs con azul brillante de cresilo (BCB+) y azul de tripán, respectivamente. Se evaluó el tamaño (diámetro y volumen) de los ovocitos usando un software CaptaVisionÒ (v. 5.1). Los datos se analizaron por regresión logística y por el modelo lineal general del SAS, y las medias se compararon por el método de los mínimos cuadrados. Los resultados mostraron que los ovocitos del grupo PM presentaron mayor diámetro (126.0±0.48 vs 122.7±0.79 µm; p<0.01) e integridad de la membrana plasmática (86.0 vs 76.8%; p<0.05) que el grupo OPU. Sin embargo, los ovocitos de calidad A y B no registraron diferencias significativas entre grupos con respecto a la integridad de la membrana plasmática y valores de BCB+. Los resultados sugieren que, a pesar de que el tamaño y la viabilidad fue más afectada en los ovocitos aspirados por OPU, los de calidad A y B provenientes de ambas fuentes mostraron valores similares con respecto a la integridad de la membrana plasmática y condición metabólica para proseguir la maduración.

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de células alimentadoras inactivadas (sistema feeder layer) provenientes de dos segmentos del oviducto bovino (istmo y ámpula) en el desarrollo in vitro de embriones bovinos. Se generaron líneas celulares de segmentos del istmo y ámpula para posteriormente ser inactivadas con mitomicina C (40 µg/ml) para inhibir su capacidad de división y eliminar la competencia por nutrientes con los embriones. Se maduraron in vitro ovocitos bovinos por 24 h y fueron fertilizados por 18 h en cultivo convencional con semen bovino Brangus. Los ovocitos supuestamente fertilizados fueron cultivados por siete días en el sistema feeder layer con células de istmo y ámpula separadamente a una concentración de 1.44 x 105 células/ml. Se obtuvo mejores resultados de producción de embriones bovinos in vitro con células ampulares (280/84; 30%) en comparación con las células del istmo (278/75; 26.9%) y el grupo control (275/73; 26.5%) realizado en un sistema convencional. Se concluye que las células del oviducto pueden cumplir funciones similares a las que cumple el oviducto en el proceso in vivo, mejorando la producción in vitro de embriones.

La interacción entre gametos es crucial para la fecundación. La zona pelúcida (ZP) se considera responsable de bloquear la polispermia, pero in vitro estas funciones no son totalmente eficientes. La polispermia es frecuente en fecundación in vitro (FIV) en porcino y bovino, mientras que la interacción heteróloga espermatozoide-ovocito ha sido demostrada. Los objetivos fueron estudiar el bloqueo de la polispermia para mejorar los resultados de FIV e investigar las interacciones heterólogas entre espermatozoide humano y ovocito porcino. Los resultados demuestran que se produce endurecimiento de la ZP de ovocitos bovinos y porcinos de forma previa a la fecundación, utilizando DTSP o fluido oviductal bovino. Cuando se utilizan estos ovocitos en FIV aumenta la monospermia y el rendimiento final. En las interacciones heterólogas los espermatozoides humanos pueden unirse a ZP porcina y sufren la reacción acrosómica, pero no penetran los ovocitos sin ZP. En ICSI activan el ovocito y forman pronúcleos.
The interaction between gametes is crucial to fertilization. The zona pellucida (ZP) is responsible to block of polyspermy, but in vitro these functions are not efficient. The polyspermy is frequently in bovine and porcine in vitro fecundation. Besides the heterologous interaction between spermatozoa-oocyte had been described. The aims were study the block of polyspermy to improve the output of IVF and research the heterologous interactions between human spermatozoa and porcine oocyte.The results show that there is hardening of bovine and porcine ZP previously at fertilization, in vivo and using DTSP or bovine oviductal fluid. When these oocytes are used in IVF improve the monospermy and the output. In heterologus interactions the human spermatozoa could bind to porcine ZP and it triggers the acrosome reaction, but not penetration in ZP-free oocyte was observed. In ICSI the oocyte activation and

La polispermia (entrada de más de un espermatozoide al ovocito) es una condición patológica en mamíferos ya que impide el desarrollo embrionario. En la especie porcina, la polispermia es un problema común y aún sin resolver en los sistemas de fecundación in vitro (FIV). Los gránulos corticales (GCs) de los ovocitos de mamíferos estan implicados en el bloqueo de la polispermia, sin embargo, poco se sabe acerca de la composición y función de estas organelas. Esta ampliamente descrito que las moléculas liberadas de los GCs durante la fecundación o activación ovocitaria mediante estimulación química o eléctrica producen importantes modificaciones, particularmente en la zona pelúcida (ZP), el espacio perivitelino y, probablemente, el oolema del ovocito. Estas modificaciones repercuten directamente en el bloqueo de la polispermia. El conocimiento del contenido de los GCs y proteínas del oolema así como su papel durante la fecundación en la especie porcina es escaso. La mayoría de la información que se tiene en la actualidad se ha obtenido del modelo murino. En la presente tesis doctoral, investigamos la presencia de posibles proteínas de los GCs en ovocitos porcinos así como la presencia de metaloproteasas ADAM-10 y ADAM-17 en ovocitos porcinos y bovinos. Para ello, este estudio se dividió en tres apartados:
Polyspermy (entering of more than a spermatozoon into the oocyte) is a pathological condition in mammals since it avoids the normal embryonic development. In the pig species, Polyspermy is a common problem still unsolved in the current systems of in vitro fertilization (IVF). The cortical granules (CGs) from mammal's oocytes are involved in the block to polyspermy. However, little is known about the composition and function of these organelles. It is widely described that the molecules released of the CGs during the fertilization or oocyte activation, by means of chemical or electrical stimulation, produce important modifications, particularly in the zona pelucida (ZP), the periviteline space and, probably, oolema of the oocyte. These modifications have a direct role in the block to polyspermy. The knowledge about the content of the CGs and the oolema proteins of as well as their role during fertilization in pigs is still scarce. The majority of the information that we currently have it has been obtained from the murine model. In the present Doctoral Thesis, we investigated the presence of possible proteins of the CGs in pig oocytes as well as the presence of metaloproteases ADAM-10 and ADAM-17 in pig and bovine oocytes. For that, this study was divided into three sections

La crioconservació de gàmetes s'ha convertit en una necessitat per a una producció eficient d'animals domèstics, permetent la modificació dels programes de cria d'animals i oferint un mitjà per a mantenir la diversitat genètica mitjançant l'emmagatzematge d'important germoplasma que podria revitalitzar les poblacions futures. Aconseguir un mètode robust de crioconservació garantiria la preservació del material genètic femení d'espècies en perill d'extinció i de gran importància econòmica. La vitificació és la tècnica més prometedora per a la crioconservació d'oòcits. Des dels primers intents de vitrificació d'oòcits bovins, el protocol de vitrificació i els dispositius de suport utilitzats han canviat considerablement. No obstant això, a causa de les peculiaritats de l'oòcit boví, la taxa de fecundació i la capacitat de desenvolupament dels oòcits crioconservats bovins encara han de millorar-se. Durant el procés de vitrificació, les cèl·lules sofreixen crio-dany i formació de gel, la qual cosa condueix a canvis ultraestructurals que provoquen fallades en la maduració i el desenvolupament. Per a aquest propòsit, en aquesta tesi hem investigat diferents estratègies per a millorar la capacitat de desenvolupament dels oòcits bovins després dels processos de vitrificació i escalfament. Les proteïnes de xoc tèrmic (HSPs) són proteïnes d'estrès cel·lular altament conservades que s'han identificat com un mecanisme de defensa cel·lular. La majoria d'elles s'expressen de forma constitutiva a nivells baixos, però algunes es poden regular positivament en resposta a factors estressants cel·lulars per a controlar el plegament de proteïnes i protegir contra l'agregació i desnaturalització de proteïnes. Entre les proteïnes induïbles, en aquesta tesi van ser analitzades la HSP70 (HSPA1A) i la HSP90 (HSP90AA1). En el capítol II, podem observar com un tractament de xoc tèrmic definit (1h, 41.5 °C) va augmentar la intensitat de la fluorescència per a la HSP70 quan es va aplicar a les 8h d'IVM. Quan aquest estrès per calor es va aplicar abans de la vitificació dels oòcits, no es van mitigar els efectes nocius de la crioconservació, com prèviament hi havia hipotetitzat. El líquid fol·licular és naturalment ric en factors de creixement i citocines. Se sap que la família de citocines interleuquina (IL) -6 té un paper predominant en la funció de reproducció. En el capítol III, avaluem com la IL-6, la IL-11 i el factor inhibidor de la leucèmia (LIF) induïen canvis en l'expressió de miR-21 i uns altres miRNAs claus en cèl·lules de cúmuls i oòcits bovins. No trobem dades prometedores per a IL-6 i IL-11, però LIF va augmentar l'expressió de miR-21tant en cèl·lules de cúmul com en oòcits. S'ha descrit el paper del LIF en l'activació de vies de senyalització clau per a la supervivència i el manteniment de les cèl·lules. En el capítol IV, avaluem com la suplementació amb LIF afectava el desenvolupament d'embrions i modulava l'expressió gènica en oòcits i embrions. LIF va augmentar l'expressió d'HSPA1A i HSP90AA1 en el moment de l'activació del genoma embrionari. En el moment en què es van desenvolupar els embrions, en l'etapa expandida i eclosionada, la HSPA1A es va reduir i també ho va fer el DNMT3A. LIF no va influir en la divisió i la taxa de blastocists. El major impacte exercit per LIF va ser durant la transició matern-embrionària. Imitant les condicions fisiològiques i guiats pels resultats obtinguts anteriorment, en el capítol V suplementaren els oòcits amb LIF durant la maduració per a millorar la vitrificació. La vitrificació va modificar clarament els nivells de ARNm i el LIF sembla precondicionar als oòcits perquè no sofreixin tant estrès, encara que no es van observar diferències en cap grup de tractament en termes de taxa de blastocists.
Gamete cryopreservation, as many other reproductive technologies, has become a necessity for an efficient production of domestic animals, allowing the modification of animal breeding programs and offering a mean to maintain genetic diversity by banking important germplasm that could reinvigorate future populations. Achieving a robust cryopreservation method would guarantee the preservation of feminine genetic material of endangered species and of those of a great economic importance. Vitification is the most promising technique for oocyte cryopreservation. From the first attempts of vitrifiying bovine oocytes the vitrification protocol and the support devices used have changed considerably. However, due to the peculiarities of the bovine oocyte, fertilization rate and developmental competence of bovine cryopreserved oocytes still need to be improved. During the vitrification process cells suffer cryodamage and ice formation, what leads to ultrastructural changes driving to maturation or development impairment. For this purpose, in this thesis we have investigated different strategies to ameliorate the developmental competence of bovine oocytes after vitrification and warming processes. Heat shock proteins (HSPs) are highly conserved cellular stress proteins that have been identified as a cell defense mechanism. Most of them are constitutively expressed at low levels but some can be upregulated in response to cellular stressors so to regulate protein folding, protect against protein aggregation and denaturation. Among the inducible ones, HSP70 (HSPA1A) and HSP90 (HSP90AA1) were those analyzed in this thesis. In chapter II, we can observe how a defined heat shock treatment (1h, 41.5ºC) increases fluorescence intensity for HSP70 when applied at 8h of IVM. When this heat stress was applied before oocyte vitification, it did not mitigate the harmful effects of cryopreservation how me hypothesized. Follicular fluid is naturally rich in growth factors and cytokines. Interleukin (IL)-6 family of cytokines is known to have a predominant role in reproduction function. In chapter III, we assessed how IL-6, IL-11 and leukemia inhibitory factor (LIF) induced changes in the expression of miR-21 and other key miRNAs in bovine cumulus cells and oocyte. We did not find promising data for IL-6 and IL-11, but LIF did enhance the expression of miR-21 in both cumulus cells and oocytes. LIF has been described to activate key signaling pathways for cell survival and maintenance. In chapter IV, we evaluated how LIF supplementation affected embryo development and modulated gene expression in oocytes and embryos. LIF increased expression of HSPA1A and HSP90AA1 at the time of embryonic genome activation. By the time embryos developed, at the expanded and hatched stage, HSPA1A was reduced and so did DNMT3A. LIF did not influence on cleavage and blastocyst rate. The greater impact exerted by LIF was during the maternal-to-embryonic transition. Mimicking physiological conditions, and guided for the results obtained previously, on chapter V we supplemented oocytes with LIF during maturation in order to improve vitrification. Vitrification modifies clearly mRNA levels and LIF seemed to precondition oocytes not to suffer so much stress, although no differences were observed in any treatment group in terms of blastocyst rate.

El objetivo de este trabajo consistió en describir el papel del sistema plasminógeno/plasmina (PLG/PLA) en la fecundación bovina y porcina. Mediante fecundación in vitro, demostramos que la presencia de PLG ó PLA en el medio de coincubación de los gametos disminuía la penetración de los espermatozoides en los ovocitos y su unión a la zona pelúcida (ZP). Esta disminución no se debía a alteraciones de la funcionalidad espermática ni a cambios en la resistencia de la ZP a la proteolisis, sino a que la PLA provocaba la liberación de los espermatozoides adheridos a la ZP. Mediante inmunofluorescencia indirecta detectamos la presencia de PLG y sus activadores en la ZP y en el oolema de los ovocitos antes de la fecundación. Tras la fecundación, dicha presencia disminuyó o desapareció por completo, por lo que proponemos que el sistema PLG/PLA se activa durante la interacción espermatozoide-ovocito y contribuye a regular la polispermia.
The aim of this study was to describe the role of the plasminogen/plasmin system (PLG/PLA) in bovine and porcine fertilization. Through in vitro fertilization, we demonstrated that the presence of PLG or PLA in the incubation medium of gametes decreased penetration of oocytes and sperm binding to the zona pellucida (ZP). This decrease was not due to alterations in sperm function or changes in the ZP resistance to proteolysis, but the PLA caused the release of sperm previously bound to the ZP. By indirect immunofluorescence we detected the presence of PLG and its activators in the ZP and oolema of the oocytes before fertilization. After fertilization, this presence diminished or disappeared completely, so we propose that the PLG/PLA system is activated during sperm-oocyte interaction and contributes to the regulation of polyspermy.

La gran quantitat de beneficis que ofereix la crioconservació d’oòcits bovins ha incrementat dràsticament la demanda d’oòcits bovins. En aquest context, la crioconservació exitosa d’oòcits bovins madurats in vitro resulta de vital importància per garantir l’abastiment d’oòcits bovins. No obstant això, encara no s’ha aconseguit un protocol de vitrificació d’oòcits bovins eficient i eficaç. L’objectiu d’aquesta tesis és, per tant, investigar la utilització d’elevades concentracions de NaCl o sucrosa abans de la vitrificació i escalfament, l’enriquiment de l’oolema amb colesterol abans de la vitrificació i l’addició d’un biopolímer sintetitzat per un bacteri de l’ Antàrctica durant la vitrificació i escalfament, com a estratègies per millorar els protocols de vitrificació d’oòcits. S’ha descrit que l’exposició dels oòcits a concentracions elevades de clorur sòdic, sucrosa i trehalosa abans de la manipulació millora la criotolerància a la vitrificació i la capacitat de desenvolupament en l’espècie porcina. En el capítol IV d’aquesta tesis vam observar que el tractament amb solucions de 375 mOsmol de NaCl o sucrosa durant una hora abans de la vitrificació, no tenia efectes perjudicials per l’estat del fus meiòtic dels oòcits bovins madurats in vitro. Concretament, el pretractament amb sucrosa abans de la vitrificació no va ser capaç de millorar el desenvolupament embrionari com s’havia observat en altres espècies. L’enriquiment de la membrana amb colesterol podria incrementar la fluïdesa i la permeabilitat de la membrana i augmentar la criotolerància dels oòcits a la crioconservació. En el capítol V d’aquesta tesis vam utilitzar bodipy-colesterol per visualitzar el transport del colesterol per microscòpia confocal en oòcits bovins madurats in vitro. Aquest mètode ens va permetre determinar el temps d’incubació necessari per una incorporació òptima del colesterol a la membrana i evitar la no desitjada penetració al citoplasma, utilitzant diferents concentracions de metil-β-cyclodextrines carregades amb colesterol. Tot i que no es va aconseguir millorar la criotolerància en termes de supervivència i capacitat de desenvolupament, l’addició de colesterol alterava l’expressió de gens relacionats amb el metabolisme lipídic, (CYP51), apoptosis (BAX) i metilació del DNA (DNMT3A) en mòrules bovines, sobretot quan els oòcits eren vitrificats a estadi de vesícula germinal. Pseudomonas sp. ID1, un bacteri aïllat del sediment marí de l’Antàrtica, produeix un polisacàrid com a mecanisme de tolerància al refredament (M1 EPS). Aquest exopolisacàrid també confereix crioprotecció per altres cèl·lules bacterianes, suggerint que pot ser utilitzat com a agent per la crioconservació cel·lular. En el capítol VI es va afegir M1 EPS a les solucions de vitrificació i escalfament com a agent bloquejant de la formació de gel, per limitar el dany dels oòcits bovins madurats in vitro i incrementar posteriorment la capacitat de desenvolupament. Es van analitzar els efectes de la suplementació amb diferents concentracions de M1 EPS en l’organització dels fusos meiòtics, la capacitat de desenvolupament en termes de percentatges de blastocists i l’expressió gènica en blastocists de dia 8. La suplementació amb M1 EPS durant la vitrificació i escalfament dels oòcits de vedella prepúber madurats in vitro protegia el fus meiòtic contra la descondensació de cromosomes i microtúbuls causada per la vitrificació. Tot i que després del suplement amb M1 EPS no es va observar millora en els percentatges de blastocists, es van registrar diferents canvis en l’expressió d’alguns gens relacionats amb epigenètica (DNMT3A i KAT2A) i qualitat embrionària (BAX, BCL2) entre blastocists obtinguts a partir d’oòcits vitrificats amb diferents concentracions de M1 EPS. En resum, basant-nos en els resultats d’aquesta tesis, podem concloure que la criotolerància dels oòcits bovins madurats in vitro no només depèn del dany que pateixin en l’organització del fus meiòtic. Sinó que també en els canvis en l’expressió gènica que condicionen el posterior desenvolupament embrionari.
La gran cantidad de beneficios que ofrece la crioconservación de ovocitos bovinos ha incrementado drásticamente la demanda de ovocitos. En este contexto, la crioconservación exitosa de ovocitos madurados in vitro resulta de vital importancia para garantizar el abastecimiento de ovocitos bovinos. Sin embargo, aún no se ha logrado un protocolo de vitrificación de ovocitos bovinos eficiente y eficaz. El objetivo de esta tesis es, por tanto, investigar la utilización de elevadas concentraciones de NaCl o sacarosa antes de la vitrificación y calentamiento, el enriquecimiento del oolema con colesterol antes de la vitrificación y la adición de un biopolímero sintetizado por una bacteria de la Antárctica durante la vitrificación y el calentamiento, como estrategias para mejorar los protocolos de vitrificación de ovocitos. Se ha descrito que la exposición de los ovocitos a concentraciones elevadas de cloruro sódico, sacarosa y trehalosa antes de la manipulación mejora la criotolerància a la vitrificación y la capacidad de desarrollo en la especie porcina. En el capítulo IV de esta tesis observamos que el tratamiento con soluciones de 375 mOsmol de NaCl o sucrosa durante una hora antes de la vitrificación, no tenía efectos perjudiciales para el huso meiótico de los ovocitos bovinos madurados in vitro. Concretamente, el pretratamiento con sacarosa antes de la vitrificación no fue capaz de mejorar el desarrollo embrionario como se había observado en otras especies. El enriquecimiento de la membrana con colesterol podría incrementar la fluidez y la permeabilidad de la membrana y aumentar la criotolerància de los ovocitos a la crioconservación. En el capítulo V de esta tesis utilizamos bodipy-colesterol para visualizar el transporte del colesterol por microscopía confocal en ovocitos bovinos madurados in vitro. Este método nos permitió determinar el tiempo de incubación necesario para una incorporación óptima del colesterol en la membrana y evitar la no deseada penetración en el citoplasma, utilizando diferentes concentraciones de metil-β-cyclodextrinas cargadas con colesterol. Aunque no se mejoró la criotoleráncia en términos de supervivencia y capacidad de desarrollo, la addición de colesterol alterava la expresión de genes relacionados con el metabolismo lipídico, (CYP51), apoptosis (BAX) y metilación del DNA (DNMT3A) en mórula bovinas, sobre todo en ovocitos vitrificados en estadio de vesícula germinal. Pseudomonas sp. ID1, una bacteria aislada del sedimento marino de la Antártica, produce un polisacárido como mecanismo de tolerancia al enfriamiento (M1 EPS). Este exopolisacárido también confiere crioprotección a otras células bacterianas, sugiriendo que puede ser utilizado como agente para la crioconservación celular. En el capítulo VI de esta tesis, se añadió M1 EPS a las soluciones de vitrificación y calentamiento como agente bloqueante de la formación de hielo, para limitar el daño de los ovocitos bovinos madurados in vitro e incrementar posteriormente la capacidad de desarrollo. La suplementación con M1 EPS durante la vitrificación y el calentamiento de los ovocitos de ternera prepúber madurados in vitro protegía el huso meiótico contra la descondensación de cromosomas y microtúbulos causada por la vitrificación. Aunque después del suplemento con M1 EPS no se observó mejora en los porcentajes de blastocistos, se registraron diferentes cambios en la expresión de algunos genes relacionados con epigenética (DNMT3A y KAT2) y calidad embrionaria (BAX, Bcl2) entre blastocistos obtenidos a partir de ovocitos vitrificados con diferentes concentraciones de M1 EPS. En resumen, basándonos en los resultados de esta tesis, podemos concluir que la criotoleráncia los ovocitos bovinos madurados in vitro no sólo depende del daño que sufran en la organización del huso meiótico. Sino que también en los cambios en la expresión génica que condicionan el posterior desarrollo embrionario.
The numerous benefits of bovine oocyte cryopreservation has dramatically increased the demand of bovine oocytes. In this context, successful preservation of in vitro matured bovine oocytes appears to be critical for guarantee the oocyte supply. In spite of that, an efficient and efficacious vitrification protocol for in vitro matued oocytes should be achieved soon. The purpose of this thesis is, therefore, to investigate the use of high concentrations of NaCl or sucrose prior to vitrification/warming, the oolema enrichment with cholesterol prior to vitrification and the addition of an ice bocking biopolymer synthetized by a bacteria from Antarctica during vitrification and warming, as strategies to improve bovine oocyte vitrification protocols. Exposure of oocytes to increased concentrations of sodium chloride, sucrose or trehalose prior to manipulation has been reported to improve both cryotolerance to vitrification and developmental competence in porcine specie. In the chapter IV of this thesis we observed that treatment with 375 mOsmol NaCl or sucrose solution for 1 h before vitrification had no detrimental effects on the meiotic spindle status of IVM bovine oocytes. In particular, sucrose pretreatment prior to vitrification was unable to improve embryo development as observed in other species. Membrane cholesterol enrichment could increase the fluidity and permeability of the membrane and increase the cryotolerance of oocytes to cryopreservation. In chapter V of this thesis we used bodipy-cholesterol to image the cholesterol transport in live in vitro matured bovine oocytes incubated with cholesterol-loaded methyl-β-cyclodextrin by confocal microscopy. This method allowed us to determine the incubation time required for optimal cholesterol incorporation into membrane avoiding the non-desired penetration into cytoplasm, using different cholesterol-loaded methyl-β-cyclodextrin concentrations in different supplemented media. However, cryotolerance in terms of survival and developmental competence was not improved, regardless of the application of the determined cholesterol-loaded methyl-β-cyclodextrin treatment or the holding medium used. However, the cholesterol addition before vitrification, altered the expression of genes related to lipid metabolism (CYP51), apoptosis (BAX) and DNA methylation (DNMT3A) in bovine morulae, mainly when oocytes were vitrified at germinal vesicle stage. Pseudomonas sp. ID1, a bacterium isolated from marine sediment from Antarctica, produces an exopolysaccharide as a cold adaptation mechanism (M1 EPS). This exopolysaccharide conferred cryoprotection for other bacteria cells, suggesting it can thus be applied as an agent for cell cryopreservation. In the Chapter VI the M1 EPS was added to vitrification and warming solutions as an ice blocking agent to limit the in vitro matured bovine oocyte damage and to increase further developmental competence. The effects of different concentrations of M1 EPS supplementation were examined on meiotic spindle organization, developmental competence in terms of blastocyst rates, and gene expression in day 8 bastocyts. M1 EPS supplementation during vitrification and warming of in vitro matured prepubertal heifer oocytes protected the meiotic spindle against chromosome and microtubule decondensation caused by vitrification. Although no improvement on blastocyst rates were observed after EPS supplementation, different changes in gene expression of some gens related with epigenetics (DNMT3A and KAT2A) and blastocyst quality (BAX, BCL2) were recorded between blastocysts derived from oocytes vitrified with different concentrations of M1 EPS. In summary, on the basis of the results of the present Thesis, we can conclude that in vitro matured oocyte cryotolerance does not only depend on the damage on the meiotic spindle organization, but also on the gene expression changes that determine further embryonic development.

Este estudio fue diseñado para evaluar los efectos de la criopreservación de los ovocitos obtenidos de terneras prepúberes o de vacas adultas en la organización de los cromosomas, la morfología de los microtúbulos y la estructura del citoesqueleto, y el posterior desarrollo embrionario, para esto se realizaron tres grupos experimentales. En el primer grupo experimental los ovocitos una vez madurados in vitro (IVM), fueron divididos en 3 grupos según si eran: 1) sin ningún tratamiento (control); 2) expuesto a los agentes crioprotectores (CPAs); o 3) criopreservados por el método del vitrification de la open pulled straw (OPS). Después de descongelar los ovocitos una muestra de estos eran fijadas en paraformaldehido para posteriormente realizar técnicas de inmunofluorescencia específicas y examinadas debajo de un microscopio confocal. Los ovocitos restantes fueron fecundados y el porcentaje de división celular y desarrollo embrionario fueron registradas a las 48 h y 7 días post inseminación, respectivamente. Después de la vitrification o de la exposición a los CPAs, un porcentaje significativamente elevado de ovocitos mostraron cambios en la morfología del huso comparado al grupo control. La estructura de la placa metafásica de ovocitos de vaca madurados in vitro fue significativamente más resistente al proceso del vitrificación por OPS. La vitrificación de ovocitos procedentes de terneras o vacas adultas mostraron un aumento significativo en el porcentaje de ovocitos que presentaban banda de actina discontinua o ausencia de ésta comparado con los controles no tratados.
Los ovocitos expuesto solamente a los CPAs mostraron un aspecto similar a los controles. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en los ovocitos tanto de vaca como de ternera, independientemente del tratamiento. La división embrionaria y el porcentaje de blastocistos fueron significativamente menores en aquellos ovocitos vitrificados comparado con los ovocitos control. Los ovocitos obtenido de vacas adultas fueron más sensibles a la exposición a los CPAs, mientras que el proceso de vitrificación parecía tener efectos más perjudiciales en los ovocitos de ternera.
En el segundo experimento la Roscovitina fue utilizado para mantener ovocitos de ternera en la etapa de vesícula germinal durante un período de 24 h. Los complejos cúmulus-ovocito fueron aspirados de ovarios de ternera y cultivados durante 24 h en TCM199 que contenía diversas concentraciones de Roscovitina (0, 12.5, 25, 50 y 100 m). Después de este período de premaduración, un grupo de ovocitos fueron fijados para lacmoide o para inmunohistoquímica y el resto fueron cultivados durante 24 h más en las condiciones permisivas de maduración. Los ovocitos cultivados con Roscovitina, en todas las concentraciones probadas, fueron bloqueados en estadio de vesícula germinal. El efecto inhibitorio varió según la dosis, siendo las concentraciones más altas las más eficientes, produciendo el bloqueo en estadio de Vesícula Germinal en más del 60.0% de los ovocitos. Sin embargo, este efecto inhibitorio de la Roscovitina fue completamente reversible. El porcentaje de división y desarrollo embrionario de aquellos ovocitos premadurados con 50 m de Roscovitina no fueron significativamente diferentes comparado a los ovocitos control. La morfología de la placa metafásica fue la típica del estadio de metafase II en el 75.8% de los ovocitos que alcanzaron el estadio de metafase II después del tratamiento previo con 50 m de Roscovitina no difiriendo significativamente del grupo control. Una distribución normal de los filamentos de actina fue observada en un 97.0% y 98.2% de ovocitos expuestos a 50 m Roscovitina comparada al control, respectivamente. Estos resultados demuestran la viabilidad de mantener los ovocitos de ternera en parada meiótica artificial sin comprometer su capacidad de desarrollo subsiguiente.
En el último grupo experimental, el estudio fue diseñado para establecer los efectos del estadio de maduración nuclear de los ovocitos de ternera y de un tratamiento de premaduración con Roscovitina (ROS) sobre la resistencia a la criopreservación. Los ovocitos de ternera fueron vitrificados mediante OPS en estadio de vesícula germinal rota (GVBD) o en metafase II (MII). En otro experimento, los ovocitos en vesícula germinal rota fueron premadurados con 50 M de ROS antes de la vitrificación. Después de la descongelación, los ovocitos en estadio de GVBD y aquellos premadurados con ROS y vitrificados en VGBD fueron madurados durante 18 h adicionales, mientras que aquellos vitrificados en estadio de MII fueron madurados durante 2 h más. Porcentajes significativamente más bajos de división embrionaria fueron obtenidos para el aquellos ovocitos vitrificados en estadio de GVBD y MII (9.9% y 12.6%, respectivamente) comparados con los ovocitos del grupo control (73.9%). Porcentajes de división embrionaria significativamente inferiores fueron obtenidos en aquellos ovocitos que fueron vitrificados en estadio de VGBD previa premaduración con ROS comparados con los ovocitos control o comparados con los ovocitos del grupo ROS-CONTROL. Independientemente del estadio de maduración nuclear en el que fueron vitrificados, no se obtuvo desarrollo embrionario. Un porcentaje significativamente inferior de ovocitos presentaban una placa metafásica normal después de ser expuestos a los crioprotectores y vitrificados (independientemente del estadio de maduración) comparado con los controles. Estos resultados indican que el protocolo del vitrification tiene un efecto negativo en la organización de la placa metafásica de los ovocitos de ternera vitrificados tanto en estadio de MI como de VGBD, lo cual afecta el posterior desarrollo embrionario. El tratamiento del premaduración con el ROS no tiene ningún efecto beneficioso en el resultado del vitrification por el método de OPS.
This study was designed to evaluate the effects of the cryopreservation of oocytes obtained from prepubertal calves or adult cows on chromosome organization, spindle morphology, cytoskeleton structures, and the ability of fertilized oocytes to develop to the blastocyst stage. Once in vitro matured (IVM), the oocytes were divided into 3 groups according to whether they were: 1) left untreated (control); 2) exposed to cryoprotectant agents (CPAs); or 3) cryopreserved by the open-pulled-straw (OPS) vitrification method. After thawing, oocyte samples were fixed, stained using specific fluorescent probes and examined under a confocal microscope. The remaining oocytes were fertilized, and cleavage and blastocyst rates recorded. After vitrification or CPA exposure, significantly higher proportions of oocytes showed changes in spindle morphology compared to the control group. The spindle structure of the adult cow IVM oocytes was significantly more resistant to the OPS vitrification process. Vitrification of oocytes from calves or adult cows led to significantly increased proportions of oocytes showing discontinuous or null actin staining of the cytoskeleton compared to non-treated controls. Oocytes only exposed to the cryoprotectants showed a similar appearance to controls. A normal distribution of actin microfilaments was observed in both calf and adult cow oocytes, irrespective of the treatment. Cleavage and blastocyst rates were significantly lower for vitrified versus non-treated oocytes. Oocytes obtained from adult cows were more sensitive to CPA exposure, while the vitrification procedure seemed to have more detrimental effects on the calf oocytes.
In the second experiment Roscovitine, was used to maintain calf oocytes at the germinal vesicle stage for a 24-h culture period. Cumulus-oocyte complexes were aspirated from slaughterhouse calf ovaries and cultured for 24 h in TCM199 containing different levels of roscovitine (12.5, 25, 50 and 100 M). After this culture period, the oocytes were either fixed immediately or cultured for a further 24 h in conditions permissive of maturation. After fixing a sample of these oocytes, the remaining oocytes were subsequently fertilized and cleavage and blastocyst rates were recorded. Oocytes cultured in the presence of roscovitine, at all the concentrations tested, were significantly blocked at the germinal vesicle stage. The inhibitory effect varied according to the dose, with 50 M and 100 M roscovitine being the most efficient concentrations, producing developmental arrest at the GV stage in over 60.0% of oocytes. However, this inhibitory effect of roscovitine was fully reversible since over 73% of the oocytes cultured for 24 h in the presence of 50 M roscovitine reached the metaphase II stage after a further 24 h of culture in a permissive medium. Cleavage rates and blastocyst yields were not significantly different for oocytes cultured under 50 M roscovitine inhibition compared to oocytes not subjected to prematuration culture (rates of 76.7% cleavage and 8.7% blastocysts for control oocytes compared to 69.8% and 6.3% respectively for oocytes pretreated with 50 M roscovitine). The morphology of the meiotic spindle was typical of metaphase II in 75.8% and 82.1% of the oocytes reaching the metaphase II stage after pretreatment with 50 M roscovitine compared to control, respectively. A normal distribution of actin filaments was observed in 97.0% and 98.2% of oocytes exposed to 50 M roscovitine compared to control, respectively. These results demonstrate the feasibility of maintaining calf oocytes in artificial meiotic arrest without compromising their subsequent developmental competence
The third experiment was designed to establish the effects of the meiotic stage of bovine oocytes and of a prematuration treatment with roscovitine (ROS) on their resistance to cryopreservation. Calf oocytes at the stages germinal vesicle breakdown (GVBD) and metaphase II (MII) were vitrified by the open pulled straw (OPS) method. In another experiment, GVBD oocytes were prematured with 50 M ROS before vitrification. After thawing, oocytes in the GVBD and ROS groups underwent an additional 18 h of maturation, while those in the MII group were only subjected to a further 2 h of maturation. After this post-thaw maturation period. Significantly lower cleavage rates were obtained for the vitrified GVBD and MII oocytes (9.9% and 12.6%, respectively) compared to control oocytes (73.9%). Significantly worse results in terms of cleavage rates were obtained when GVBD calf oocytes were exposed to cryoprotectant (CPA) (13.1%) or vitrified (1.6%) after a prematuration treatment with ROS, when compared to untreated control oocytes (68.7%) or ROS-control oocytes (56.6%). None of the vitrification procedures yielded blastocysts, irrespective of the initial meiotic stage or previous prematuration treatment. Significantly lower proportions of oocytes showing a normal spindle configuration were observed after CPA exposure or vitrification of either GVBD or MII calf oocytes, compared to controls. When GVBD oocytes were vitrified, high percentages of dispersed chromosomes were observed, whereas a prematuration treatment before vitrification increased the proportions of decondensed chromosomes. These results indicate that the vitrification protocol has a deleterious effect on the meiotic spindle organization of calf oocytes cryopreserved at both the GVBD and MII stage, which impairs the capacity for further development of the embryos derived from these vitrified oocytes. Prematuration treatment with ROS has no beneficial effect on the outcome of vitrification by the OPS method.

Existen muchos factores que influyen en el éxito de la técnica de producción de embriones in vitro (PIV), muchos de los cuales aun son desconocidos o bien su efecto no ha sido totalmente esclarecido. El método de colección a elegir en condiciones de laboratorio y la óptima tensión de oxígeno para lograr un mejor desarrollo de los embriones siguen siendo materia de discusión entre los investigadores. Los métodos más usados para obtener ovocitos cultivables son la aspiración de folículos y la disección de la corteza ovárica, mientras que para el oxígeno las tensiones de 5% y 20% son las que se usan comúnmente en la producción de embriones. El objetivo de este estudio fue evaluar la influencia del método de colección y la tensión de oxígeno sobre los parámetros de PIV (porcentaje de divisiones a las 72 horas y porcentaje de blastocistos a los 7 y 9 días post fecundación). En el experimento 1, el efecto de dos métodos de colección, aspiración y disección, sobre la tasa de divisiones y desarrollo embrionario fue comparado. El porcentaje de divisiones a las 72 horas post inseminación obtenido con el método de aspiración (71.39%) fue significativamente mayor respecto al porcentaje obtenido con el método de disección (60.98%); en tanto que la tasa de blastocistos al día 7 y 9 post fecundación para el método de aspiración (17.63% y 11.4%, respectivamente) no mostró diferencia estadística con los resultados obtenidos con el método de disección (22.9% y 12.09%, respectivamente). Adicionalmente se observó que el número de ovocitos recuperados por ovario fue significativamente mayor con el método de disección. En el experimento 2 se compararon dos tensiones de oxígeno en la etapa de cultivo, 5% y 20 % de oxígeno, y se obtuvo mayor tasa de divisiones y mayor tasa de blastocistos al día 7 post fecundación con una tensión de oxígeno del 5% (69.71% y 29.79%, respectivamente) comparado con una tensión de oxígeno del 20% (59.69% y 19.26%, respectivamente), no se registró diferencia en cuanto a los blastocistos obtenidos al día 9 post fecundación. Los resultados obtenidos sugieren que el método de aspiración folicular y el cultivo con una tensión de oxígeno del 5% deberían ser considerados como factores adecuados para lograr las condiciones óptimas en el proceso de producción de embriones in vitro. Palabras clave: embrión, oxígeno, colección, bovino, PIV
--- There are many factors that influence the success of the technique of in vitro embryo production (IVP), many of which are still poorly understood or the influence mechanism has not yet been clarified. The collection method to choose in laboratory conditions and the optimal oxygen tension for better embryo development are still a matter of debate among researchers. The methods used to obtain cultivable oocytes are follicle aspiration and cortex dissection from the ovary, whereas two oxygen tension, 5% and 20%, are commonly used in the embryo production. The objective of this study was to evaluate the influence of the collection method and oxygen tension on PIV parameters (cleavage rate and blastocyst rate). In Experiment 1, the effect of two collection methods, aspiration and dissection, on embryonic development was compared. The highest percentage of cleavage at 48 hours post insemination was obtained with the aspiration method (71.39%), but no difference was observed in the percentage of blastocysts at 7 and 9 days post insemination, additionally it was noted that the number of oocytes recovered per ovary was significantly higher with the dissection method. In Experiment 2, it was compared two oxygen tensions in the culture stage, 5% and 20% oxygen, and it was obtained higher cleavage and blastocyst rate at day 7 post insemination with an 5% oxygen tension. Then, according to these results it can be concluded that follicular aspiration method and a 5% oxygen tension are included within the optimal conditions for the PIV. Keywords: embryo, oxygen, collection, bovine, IVP
Tesis

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Evalúa los tres tiempos de co-incubación entre gametos bovinos durante la fecundación In vitro, para luego determinar las tazas de división y desarrollo embrionario al día 7 post fecundación. Ovocitos bovinos fueron obtenidos mediante aspiración folicular, fueron madurados In vitro y luego se inseminaron con una concentración de 1,5x106 esp/ml en medio TL-STOCK a 38,5º C, 5% de CO2 y atmósfera saturada de humedad. Luego de 6 horas (T1=245), 12 horas (T2=278) y 18 horas (T3=287) de co-incubación, los Complejos Cumulus-Ovocito (CCOs) con los espermatozoides adheridos al cumulus, se retiraron de las gotas de fecundación y fueron lavados y transferidos a gotas con medio de incubación. Los presuntos cigotos se cultivaron In vitro, en un primer cultivo en medio KSOM y posteriormente en medio de cultivo SOF hasta el término de la evaluación del desarrollo embrionario. La evaluación del efecto tiempos de cocultivo sobre las tasa de división y de blastocistos se realizó mediante la prueba paramétrica de análisis de varianza A las 72 horas de fecundación se obtuvieron tasas de división, ≥ 2 células de: 38.3%, 63.3% y 73.4% para los grupos T1, T2 y T3 respectivamente. Al comparar las tasas de división, sólo se encontró diferencia estadística significativa entre los grupos T1 y T2 y T1 y T3, (p<0.05). Al día 7 de cultivo, la tasa de desarrollo de blastocistos fue de 24.4%; 21.6% y 24.6% para los grupos T1, T2 y T3 respectivamente, no encontrándose diferencia estadística significativa entre los grupos. Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que no existe diferencia estadística entre los tres grupos evaluados respecto al desarrollo embrionario al estadio de blastocisto, lo cual sugiere que al co-incubar gametos bovinos por 6,12 ó 18 horas se pueden obtener embriones de las mismas características que los obtenidos con los protocolos tradicionales.
Tesis

Dans le but d'une meilleure comprehension des mecanismes gouvernant la maturation ovocytaire, nous avons etudie l'effet du pic de lh in vivo sur la synthese proteique des cellules de follicules preovulatoires bovins. Le pic de lh stimule la synthese proteique globale dans les cellules de granulosa mais pas dans les cellules du cumulus provenant des memes follicules. Toutefois, les quantites de proteines nouvellement secretees par les cellules de granulosa sont fortement correlees a celles neosynthetisees par les cellules du cumulus. Dans le but de verifier l'existence d'une interaction cellulaire, nous avons compare l'effet des secretions des cellules preovulatoires de granulosa et du fluide folliculaire (ff) provenant des memes follicules, sur l'activite metabolique de complexes cumulus-ovocytes (cco) matures in vitro. Le ff stimule le niveau general de synthese proteique et diminue une bande majeure de 28 kda dans les cellules du cumulus. Les secretions des cellules de granulosa reproduisent l'action du ff sur la synthese de la 28 kda a une concentration 5 fois plus faible. Enfin, l'addition de ff preovulatoire au milieu de culture pendant la maturation in vitro double le taux de developpement embryonnaire apres fecondation in vitro. Ces resultats suggerent que dans le follicule preovulatoire bovin, la maturation du cco est soumise a une regulation paracrine exercee par les cellules de granulosa via leurs produits de secretion. Ces derniers pourraient influencer la maturation cytoplasmique de l'ovocyte, de la meme facon que le ff

El presente estudio se realizó para evaluar el efecto de cuatro suplementos de macromoléculas sobre la tasa de maduración nuclear, así como también determinar la tasa división de ovocitos y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas (7 días), respectivamente. Los ovarios fueron obtenidos de animales sacrificados, transportándose al laboratorio en un termo conteniendo solución salina al 0.09%, suplementada con antibiótico-antimicótico a 37 °C. Los CCO´s se obtuvieron de la aspiración de folículos de entre 2-6mm; luego de ser observados en un estéreomicroscopio, 692 ovocitos con dos o más capas de células fueron calificados como aptos para ser madurados en medio TCM-99 enriquecido con suplemento de macromolécula: PVP o PVA o BSA o SFB según sea el tratamiento; cultivados a 39°C bajo una atmósfera de 5% de CO2. Cumplido el tiempo de maduración (24 horas), los ovocitos fueron removidos del medio y lavados con PBS suplementado con SFB y 1 mg/ml de hialuronidasa, para ser fijados en una solución de etanol: ácido acético (3:1). Para la evaluación de la maduración nuclear, se colocaron los ovocitos en una lámina portaobjeto y teñidos con 1% de orceína; las mismas fueron observadas bajo un microscopio para ser evaluadas y clasificadas como Vesícula Germinal (VG), Metafase I (MI), Anafase-Telofase, Metafase II (MII) y degenerados. Para la fecundación se usaron 1680 ovocitos, madurados bajo las mismas condiciones y fecundados con espermatozoides obtenidos de pajillas. Para la obtención de los espermatozoides motiles se centrifugo a 300 gravedades durante 10 minutos bajo una gradiente de Percoll (45/90); el sobrenadante fue retirado y el pellet obtenido retirado para ser reconstituido con TL-STOCK. Los ovocitos maduros y espermatozoides fueron co-cultivados durante 18 horas a 39°C con 5% de CO2 en medio de cultivo KSOM-AA; luego de 48 horas las células cocultivadas fueron trasladadas al medio de cultivo SOF. En el experimento 1, en los ovocitos que alcanzaron la maduración nuclear (Metafase II) se encontró diferencia significativa solo entre los suplementos de macromolécula PVA y SFB con 19.3 + 1.8 y 16.3 + 0.8, respectivamente; mientras que en los grupos PVP, PVA, BSA y PVP, BSA, SFB, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. En el experimento 2, la tasa de división y desarrollo embrionario posterior a la fecundación a las 48 horas y 168 horas, respectivamente no se encontró diferencia estadística significativa. Estos resultados indican que los suplementos de macromoléculas proporcionan condiciones y requerimientos importantes para la progresión desde estadios de metafase I a metafase II. Palabras claves: Maduración In vitro, ovocitos bovinos, fecundación In vitro.
--- The present study was made to evaluate the effect of four macromolecule supplements on the rate of nuclear maturation, as well as to determine the rate division of oocytes and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours (7 days), respectively. The ovaries were obtained from sacrificed animals, being transported to the laboratory in a thermos flask containing saline solution to the 0,09%, with antibioticantimycotic at 37 °C. The CCO´s was obtained from the aspiration of follicles of between 2-6mm; after being observed in stereomicroscope, 692 oocytes with two or more layers of cells were described like apt being in the middle matured TCM-99 enriched with macro-molecule supplement: PVP or PVA or BSA or SFB according to are the treatment; cultivated at 39°C under an atmosphere of 5% of CO2. Turned the time of maturation (24 hours), the oocytes were removed of means and washings with PBS supplemented with SFB and 1 mg/ml of hyaluronidase, to be fixed to an ethanol solution: acetic acid (3: 1). For the evaluation of the nuclear maturation, the oocytes on the slide and dyeings with 1% of orceína were placed; the same ones were observed under a microscope to be evaluated and to be classified like germinal vesicle (VG), metaphase I (MI), anaphase-telophase, metaphase II (MII) and degenerated. For the fertilization 1680 oocytes, matured under the same conditions and fertilized were used with obtained spermatozoa of tubules contained it.. For the obtaining of the motile spermatozoa by centrifuge myself to 300 gravities during 10 minutes under a gradient of Percoll (45/90); the supernatant was retired and pellet obtained retired to be reconstituted with TL-STOCK. The mature oocytes and spermatozoa Co-were cultivated during 18 hours to 39°C with 5% of CO2 in the middle of culture KSOM-AA; after 48 hours the Co-cultivated cells were transferred to means of culture SOF. In experiment 1, in the oocytes that reached the nuclear maturation (Metaphase II) was single significant difference between the macromolecule supplements PVA and SFB with 19.3 + 1.8 and 16.3 + 0.8, respectively; whereas in groups PVP, PVA, BSA and PVP, BSA, SFB, respectively was not significant statistical difference. In experiment 2, the rate of division and embryonic development subsequent to the fertilization to the 48 hours and 168 hours, respectively was not significant statistical difference. These results indicate that the macromolecule supplements they provide conditions and important requirements for the progression from stages of metaphase I to metaphase II. Key words: In vitro Maturation, oocytes bovine, In vitro fertilization.
Tesis