Academic literature on the topic 'Ovocytes – Développement'

Les chromosomes sexuels déterminent le sexe des embryons chez les oiseaux comme chez tous les vertébrés supérieurs. Le sex-ratio de la descendance d’une population est donc, d’après la théorie mendélienne, équilibré, méiose oblige. On rencontre pourtant des contre-exemples à la fois dans les espèces d’oiseaux sauvages et domestiques. La femelle oiseau pourrait ainsi soit contrôler la répartition des chromosomes sexuels dans ses ovocytes, soit favoriser le développement des embryons d’un sexe donné. L’objet de cette revue est de préciser les conditions d’apparition de ce contrôle. Enfin, si ce déséquilibre est confirmé, la connaissance des mécanismes qui le régulent pourrait permettre à terme un contrôle du sexe des populations d’oiseaux. En production avicole, un tel contrôle fait l’objet d’un vieux rêve : orienter les lignées de poules pondeuses vers la production de femelles alors que les lignées de poulets de chairs ou les canards mulards seraient orientées vers la production de mâles.

Le contrôle de la reproduction caprine est intéressant pour des raisons techniques (synchronisation des mise bas, ajustements aux disponibilités fourragères ou aux contraintes économiques), et pour des raisons génétiques (identification et dissémination des génotypes améliorateurs). L’utilisation de rythmes photopériodiques accélérés conduit à une augmentation très importante des doses produites pour l’insémination artificielle (IA) et évite l’apparition d’une contre-saison sexuelle. L’identification récente d’une lipase bulbo-uréthrale dans le sperme de bouc offre de nouvelles perspectives pour la conservation de la semence. Chez la chèvre, les traitements " lumière + jours courts " permettent également l’induction de cycles oestriens et ovulatoires à contre-saison, ce qui conduit à une amélioration de la fertilité des troupeaux. En revanche, l’utilisation répétée de eCG (autrefois appelée PMSG) provoque l’apparition d’anticorps, retarde le moment de l’ovulation et induit une baisse de fertilité après IA, lorsqu’elle est réalisée après un délai fixe après la fin du traitement. Toutes les étapes de la production d’embryons, de leur congélation et de leur transfert sont maintenant maîtrisées et permettent d’atteindre des taux satisfaisants de chevreaux nés par femelle donneuse, qui sont compatibles avec le développement de la technique dans le but d’échanger du matériel génétique entre les pays. La production in vitro d’embryons permet des taux élevés de développement après maturation et fécondation in vitro des ovocytes et pourrait permettre l’obtention de populations synchrones de zygotes au stade unicellulaire, nécessaire à l’application des biotechnologies.

Les progrès récents de la biologie et notamment ceux réalisés dans le domaine des acides nucléiques et des protéines permettent d’envisager de nouvelles stratégies très prometteuses pour l’élevage des animaux domestiques. Des sondes d’acide nucléique permettent la détermination du sexe chez l’embryon bovin précoce. Plus généralement la multitude de sondes qui vont être progressivement disponibles et la cartographie des génomes vont donner une bien meilleure connaissance des animaux. Il en résultera de nouvelles stratégies de sélection beaucoup plus fines et beaucoup plus rapides. La préparation en masse de peptides recombinants (antigènes d’agents pathogènes, hormones, cytokines, anticorps monoclonaux...), laisse envisager des interventions sur les animaux jusqu’alors réservées à des cas très particuliers. Les nouvelles techniques liées à la reproduction des mammifères (maturation des ovocytes in vitro, fécondation in vitro, développement des embryons précoces in vitro, duplication des embryons par clivage et par clonage) vont progressivement se superposer aux techniques déjà existantes (insémination artificielle, transfert d’embryons) et contribuer à raccourcir les cycles de reproduction et la durée des programmes de sélection génétique. L’ingénierie génétique va permettre, dans les cas les plus favorables, de transmettre une protéine à un organisme entier sous la forme d’un gène actif. Des gènes peuvent être transférés dans les cellules somatiques des organismes entiers (thérapie génique) ou dans les embryons précoces (transgénèse). La thérapie génique peut permettre de ne plus devoir administrer un polypeptide de manière répétée à un animal et la transgénèse conduit à l’obtention de nouvelles lignées d’animaux présentant des caractères génétiques nouveaux définis par les transgènes. Ces interventions, qui sont les plus radicales et les plus prometteuses, ne pourront devenir une réalité significative dans les élevages qu’à la fin de ce siècle.

Cette revue présente l’état des connaissances sur la folliculogenèse et l’ovulation chez les mammifères. La folliculogenèse basale est une phase de croissance folliculaire lente, au cours de laquelle l’ovocyte acquiert la compétence méiotique. La folliculogenèse terminale est une phase de développement rapide, au cours de laquelle le follicule ovulatoire est sélectionné et termine sa maturation, tandis que l’ovocyte acquiert la compétence au développement. La revue décrit les différents changements fonctionnels qui s’opèrent dans le follicule et l’ovocyte au cours de ces deux phases, ainsi que les mécanismes qui les régulent et qui déterminent le quota ovulatoire caractéristique de chaque espèce ou race. Les facteurs-clés identifiés de la folliculogenèse sont les BMP, le KITLG et l’AMH pour le démarrage de croissance folliculaire, l’IGF et l’insuline pour la transition entre folliculogenèse basale et terminale, la FSH pour le début de la folliculogenèse terminale et la sélection des follicules ovulatoires, et la LH pour le développement folliculaire final, la maturation ovocytaire et l’ovulation. L’ovulation est déclenchée par une décharge préovulatoire de LH qui induit la maturation du complexe cumulus-ovocyte dans le follicule ovulatoire, suivie de la rupture de la paroi folliculaire et de la formation du corps jaune. La folliculogenèse ovarienne est contrôlée par des facteurs externes, tels que la photopériode et la nutrition, et c’est essentiellement le système hypothalamo-hypophysaire qui intègre les signaux endocriniens et environnementaux. Des modifications de l’apport alimentaire, relayées par des variations de signaux hormonaux et métaboliques, modulent l’activité de l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien à ses différents étages.

La production par une jument d’un poulain par an (et pourquoi pas de plusieurs) avec de la semence d’étalon conservée fraîche ou congelée est l’objectif appliqué actuel de toutes les équipes de recherche. Un point très détaillé en français dans les domaines couverts par notre équipe avait été fait en 1992 dans le Recueil de Médecine vétérinaire (volume 168, numéro 11-12). Depuis, de nouvelles connaissances ou de nouvelles technologies ont vu le jour et il était important de les mettre à disposition d’un large public. Le phénomène d’inactivité ovarienne en début de saison de monte limite le nombre de cycles disponibles pour une fécondation. Des études ont permis d’affiner les conditions des traitements lumineux. Des traitements longs à la mélatonine pourraient permettre de décaler le rythme annuel de reproduction de la jument. Le développement des follicules ovariens est sous le contrôle des hormones hypophysaires FSH et LH, et de facteurs intra-ovariens dont l’inhibine. La maîtrise du nombre d’ovulations permettrait (lors de transfert embryonnaire) de pouvoir produire plusieurs embryons par cycle. Des essais de superovulation sont en cours qui utilisent la FSH exogène ou l’effet anti-inhibine. La maîtrise du moment de l’ovulation peut se faire classiquement par injection d’hCG mais aussi par l’administration de GnRH sous forme d’implant. La croissance et la maturation du follicule dominant, ainsi que l’atrésie des follicules dominés, se caractérisent par l’évolution intrafolliculaire de nombreux paramètres biochimiques dont certains ont été étudiés dans l’espèce équine. Sous échographie transvaginale, le rythme de collecte d’ovocytes le plus rentable est de deux ponctions au cours du même cycle (l’une en fin de croissance folliculaire, l’autre en phase lutéale) : on obtient alors 9 ovocytes en moyenne. La maturation de l’ovocyte provient des maturations respectives du cumulus, du cytoplasme et du noyau. La fécondation in vitro (FIV) n’ayant donné que des résultats moyens, d’autres techniques de reproduction assistée sont utilisées actuellement avec plus de succès au laboratoire : 1) la mise en place de l’ovocyte d’une donneuse soit dans l’oviducte (GIFT), soit dans le follicule (TOIF) d’une receveuse, avec fécondation de la receveuse et 2) l’introduction d’un spermatozoïde directement dans le cytoplasme de l’ovocyte (ICSI). Le transfert d’embryon est utilisé sur le terrain en France principalement pour des juments de haute valeur génétique. Le transport d’embryons frais, mais surtout l’utilisation de la congélation des embryons, simplifieront la gestion entre donneuse et receveuse. La baisse de fertilité observée sur les étalons de plus de 15 ans est fréquemment associée à un profil hormonal caractéristique (niveau basal de FSH et de LH élevé, d’oestrogène diminué, niveau de testostérone non modifié après induction à l’hCG). Ceci pourrait être la conséquence d’une dégénérescence testiculaire primaire. L’évolution des travaux sur la conservation de la semence a abouti à la mise au point de deux grands types de techniques d’insémination : en semence fraîche et en semence congelée. Les résultats obtenus dans les Haras Nationaux montrent que la fertilité par cycle est proche pour les deux types de technique. L’effort doit porter en partie sur des améliorations techniques qui permettront d’avoir accès à toutes les techniques de conservation et d’insémination artificielle pour la grande majorité des étalons. Les critères d’évaluation de la qualité de la semence utilisés en routine (examen de la mobilité essentiellement) ne donnent pas entièrement satisfaction puisqu’ils ne permettent pas de "détecter" certains étalons dont la fertilité se révèle réduite. La plupart des fonctions cellulaires des spermatozoïdes peuvent être explorées : intégrité des membranes, de l’acrosome, stabilité de la chromatine, activité des mitochondries... Cependant les relations de ces fonctions entre elles et, surtout, les relations entre ces fonctions et la fertilité ne sont pas encore très claires.

Escalas de desenvolvimento gonadal de peixes são fundamentais para compreensão da biologia reprodutiva das espécies. No entanto, pouco foi estudado para as espécies de pequeno porte. Assim, elaboramos escalas de desenvolvimento gonadal para machos e fêmeas do cascudinho Pseudotothyris obtusa, baseadas em características macroscópicas e microscópicas. Foram registrados 7 estádios de desenvolvimento nos testículos e nos ovários. Os testículos de P. obtusa são alongados, em forma de fita, com as bordas irregulares e ondulados em vista lateral; variaram de incolores a brancos, e de 5% a 30% de ocupação na cavidade abdominal. Os ovários são saciformes, incolores nos estádios iniciais e amarelos nos estádios finais e a ocupação variou de 5% a 90% da cavidade abdominal. Os ovócitos maduros de P. obtusa são de grande tamanho, atingindo 2068,2 mm. O padrão geral de desenvolvimento das gônadas é semelhante ao de outros loricarídeos. A ocorrência dos estádios semi-desovado e semi-esgotado, e o tipo de desenvolvimento ovocitário sugerem que ocorra desova parcelada para a espécie estudada. ABSTRACT The study of gonadal development in fishes is important to understand the reproductive biology of species, however there just a few works with small fish. Then, males and females gonadal development scales were described for P. obtusa, based on macroscopic and microscopic features. Seven stages of development were registered in each sex. The testes of P. obtusa are elongated, ribbonlike, with irregular borders and wavy shape in a lateral view. They vary from colourless to white, and between 5% to 30% of body cavity occupation. The ovaries are sac-like and vary from colourless in the early stages to yellow in the last ones. The occupation varies between 5% to 90% of abdominal cavity. The ripe oocytes of P. obtusa have big size. The general pattern of gonadal development is similar to other loricariids. The occurrence of partial spent stages and the oocyte development type, suggest that P. obtusa presents partial spawn. RÉSUMÉ Les échelles de maturation gonadique des poissons sont fondamentales pour la compréhension de la biologie reproductive des espèces. Cependant, on en connait peu concernant les espèces de petite taille. Des échelles de maturation gonadique des duex sexes du “cascudinho” Pseudotothyris obtusa ont été établies. Elles sont fondées sur des observations et des caractéristiques macro et microscopiques. On a reconnu sept stades de maturation dans les deux glandes sexuelles. Les testicules de P. obtusa sont allongés; la couleur varie du translucide au blanc, et le volume relatif occupe 5% à 90% de la cavité abdominale. Les ovocytes mûrs de P. obtusa sont de grande taille. Le développement des gonades ressemble à celui d’autres Loricariidae. La fréquence des stades mi-ponte et mi-mûrs, ainsi que le mode de développement ovocytaire, suggèrent que la ponte est fractionée.

Les ovocytes bovins incubés in vitro reprennent la méiose alors que ceux incubés en présence de mono-couches de cellules de la thèque demeurent au stade de vésicule germinale (GV). Les présentes expériences ont été menées sur des ovocytes bovins afin de mieux comprendre les facteurs impliqués dans le contrôle de la maturation des ovocytes. Les objectives étaient 1) de déterminer si la morphologie du complexe ovocyte-cumulus (COCs) est corrélée avec les cinétiques de la reprise méiotique suivant une période d’arrêt méiotique induite. 2) Étudier la fonction des inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) spécifiques seuls ou en présence de une monocouche des cellules de la thèque sur l’arrêt méiotique des ovocytes bovins. 3) Étudier le rôle de la voie de signalisation de la protéine kinase A et de la protéine kinase C dans la modulation de la reprise méiotique des ovocytes bovins. 4) Faire une caractérisation plus poussée du facteur d’inhibition sécrété par les cellules de la thèque. Ces études démontrent que les COCs bovins reprennent la méiose plus rapidement après une courte période d’arrêt méiotique que les COCs non traités. Les ovocytes atrésiques ou dénudés sont donc moins nombreux au stage de GV au début de la maturation que les COCs sains ou légèrement atrésiques. Les inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) de type 3 ont maintenu les ovocytes bovins en arrêt méiotique alors que les inhibiteurs de type 4 n’ont eu aucun effet. De plus, la combinaison des inhibiteurs PDE et des cellules de la thèque montre un effet additif. Les COCs incubés avec des cellules de la thèque sont restés en arrêt méiotique alors que ceux incubés en présence de cellules de granulosa ont repris la méiose. Les cellules de la granulosa non traitées ont annulé l’effet inhibiteur des cellules de la thèque sur la maturation des COCs bovins. Par ailleurs, les COCs sont restés en arrêt méiotique lorsque des analogues d’AMPc ont été utilisés en conjonction avec des cellules de granulosa et de la thèque. Finalement, le facteur inhibiteur sécrété par les cellules de la thèque dans le milieu conditionné est (a) insensible à la chaleur, aux enzymes protéolytiques et à un traitement au charbon, (b) sensible à un traitement au chloroforme, (c) concentré dans la fraction plus petite que 1000 daltons du milieu conditionné et (d) les patrons de pics chromatographiques sont différents entre le milieu conditionné et le milieu frais. D’autres études seront nécessaires pour l’isolation complète du facteur(s) inhibiteur(s) sécrété(s) par les cellules de la thèque responsable du maintien de l’arrêt méiotique des ovocytes bovins.<br>Les ovocytes bovins incubés in vitro reprennent la méiose alors que ceux incubés en présence de mono-couches de cellules de la thèque demeurent au stade de vésicule germinale (GV). Les présentes expériences ont été menées sur des ovocytes bovins afin de mieux comprendre les facteurs impliqués dans le contrôle de la maturation des ovocytes. Les objectives étaient 1) de déterminer si la morphologie du complexe ovocyte-cumulus (COCs) est corrélée avec les cinétiques de la reprise méiotique suivant une période d’arrêt méiotique induite. 2) Étudier la fonction des inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) spécifiques seuls ou en présence de une monocouche des cellules de la thèque sur l’arrêt méiotique des ovocytes bovins. 3) Étudier le rôle de la voie de signalisation de la protéine kinase A et de la protéine kinase C dans la modulation de la reprise méiotique des ovocytes bovins. 4) Faire une caractérisation plus poussée du facteur d’inhibition sécrété par les cellules de la thèque. Ces études démontrent que les COCs bovins reprennent la méiose plus rapidement après une courte période d’arrêt méiotique que les COCs non traités. Les ovocytes atrésiques ou dénudés sont donc moins nombreux au stage de GV au début de la maturation que les COCs sains ou légèrement atrésiques. Les inhibiteurs de phosphodiesterase (PDE) de type 3 ont maintenu les ovocytes bovins en arrêt méiotique alors que les inhibiteurs de type 4 n’ont eu aucun effet. De plus, la combinaison des inhibiteurs PDE et des cellules de la thèque montre un effet additif. Les COCs incubés avec des cellules de la thèque sont restés en arrêt méiotique alors que ceux incubés en présence de cellules de granulosa ont repris la méiose. Les cellules de la granulosa non traitées ont annulé l’effet inhibiteur des cellules de la thèque sur la maturation des COCs bovins. Par ailleurs, les COCs sont restés en arrêt méiotique lorsque des analogues d’AMPc ont été utilisés en conjonction avec des cellules de granulosa et de la thèque. Finalement, le facteur inhibiteur sécrété par les cellules de la thèque dans le milieu conditionné est (a) insensible à la chaleur, aux enzymes protéolytiques et à un traitement au charbon, (b) sensible à un traitement au chloroforme, (c) concentré dans la fraction plus petite que 1000 daltons du milieu conditionné et (d) les patrons de pics chromatographiques sont différents entre le milieu conditionné et le milieu frais. D’autres études seront nécessaires pour l’isolation complète du facteur(s) inhibiteur(s) sécrété(s) par les cellules de la thèque responsable du maintien de l’arrêt méiotique des ovocytes bovins.<br>Bovine oocytes incubated in vitro resume meiosis, whereas most of those incubated with theca cell monolayers remain at the germinal vesicle (GV) stage. Experiments were carried out using bovine oocytes to understand the factors involved in the control of oocyte maturation. The objectives were 1) to determine whether or not the morphology of cumulus oocyte complexes (COC) is correlated with the kinetics of meiotic resumption following a period of induced meiotic arrest. 2) To investigate the role of type-specific phosphodiesterase (PDE) inhibitors alone or in conjunction with theca cell monolayers on meiotic arrest of bovine oocytes. 3) To study the role of the protein kinase A and protein kinase C signaling pathways in the control of meiotic resumption of bovine oocytes incubated with granulosa cells, theca cell monolayers or both cell types. 4) To further characterize the inhibitory factor secreted by the theca cell monolayers. These studies show that bovine COCs resume meiosis faster following a short period of induced meiotic arrest than untreated COCs. Atretic or denuded oocytes have fewer oocytes at the GV stage at the onset of maturation compared to healthy or slightly atretic COCs. Type 3 phosphodiesterase (PDE) inhibitors maintained bovine oocytes in meiotic arrest, whereas type 4 PDE inhibitors did not have an effect. Furthermore, PDE inhibitors and the theca cell monolayers show an additive effect. COCs incubated with the theca cell monolayer remained in meiotic arrest, whereas those incubated with granulosa cells resumed meiosis. Untreated granulosa cell abrogate the inhibitory effect of the theca cell monolayers on the maturation of COCs. However, COCs remain in meiotic arrest when cAMP analogs are used in conjunction with both granulosa and theca cells. The inhibitory factor(s) secreted by the theca cell monolayers is (a) not sensitive to heat, proteolytic enzymes and charcoal treatment, (b) sensitive to chloroform treatment, (c) has a Mr less than 1000 daltons and (d) the patterns of chromatographic peaks are different in conditioned medium and fresh medium. Further work is needed to fully isolate and identify the factor produced by the theca cells responsible for maintaining bovine oocytes in meiotic arrest.<br>Bovine oocytes incubated in vitro resume meiosis, whereas most of those incubated with theca cell monolayers remain at the germinal vesicle (GV) stage. Experiments were carried out using bovine oocytes to understand the factors involved in the control of oocyte maturation. The objectives were 1) to determine whether or not the morphology of cumulus oocyte complexes (COC) is correlated with the kinetics of meiotic resumption following a period of induced meiotic arrest. 2) To investigate the role of type-specific phosphodiesterase (PDE) inhibitors alone or in conjunction with theca cell monolayers on meiotic arrest of bovine oocytes. 3) To study the role of the protein kinase A and protein kinase C signaling pathways in the control of meiotic resumption of bovine oocytes incubated with granulosa cells, theca cell monolayers or both cell types. 4) To further characterize the inhibitory factor secreted by the theca cell monolayers. These studies show that bovine COCs resume meiosis faster following a short period of induced meiotic arrest than untreated COCs. Atretic or denuded oocytes have fewer oocytes at the GV stage at the onset of maturation compared to healthy or slightly atretic COCs. Type 3 phosphodiesterase (PDE) inhibitors maintained bovine oocytes in meiotic arrest, whereas type 4 PDE inhibitors did not have an effect. Furthermore, PDE inhibitors and the theca cell monolayers show an additive effect. COCs incubated with the theca cell monolayer remained in meiotic arrest, whereas those incubated with granulosa cells resumed meiosis. Untreated granulosa cell abrogate the inhibitory effect of the theca cell monolayers on the maturation of COCs. However, COCs remain in meiotic arrest when cAMP analogs are used in conjunction with both granulosa and theca cells. The inhibitory factor(s) secreted by the theca cell monolayers is (a) not sensitive to heat, proteolytic enzymes and charcoal treatment, (b) sensitive to chloroform treatment, (c) has a Mr less than 1000 daltons and (d) the patterns of chromatographic peaks are different in conditioned medium and fresh medium. Further work is needed to fully isolate and identify the factor produced by the theca cells responsible for maintaining bovine oocytes in meiotic arrest.

"Durant le développement embryonnaire préimplantatoire, le glucose apparaît plutôt inhibiteur. Chez la femme, les transcrits codant pour la glucose- 6-phosphate isomérase (GPI), la phosphofructokinase (PFK) et l'hexokinase II (HKII) sont exprimés aux stades VG et MII. Chez la souris, tous les transcrits (sauf HKII) sont également détectés. La "toxicité du glucose" apparaît liée à des régulations post-transcriptionnelles (HKII et PFK) ou à des inhibitions stoechiométriques (PFK). Une augmentation des radicaux libres oxygénés (RLOs) y serait par ailleurs associée. Aussi les systèmes protecteurs contre les RLOs ont été étudiés. Chez les deux espèces étudiées, les transcrits codant pour la superoxyde dismutase (Cu-Zn-SOD et Mn-SOD), la glutamyl-cystéine synthétase (GCS) et la glutathion peroxydase (GPX) sont exprimés au stade MI!. Dans l'ovocyte de souris au stade VG, tous les transcrits sont exprimés, sauf la catalase. Les transcrits de GPX et Mn-SOD sont soumis, dans l'ovocyte humain, à une (ré)adénylation maternelle spécifique, initiée au stade MI!. Ils représentent donc de véritables marqueurs de maturation cytoplasmique chez la femme. La catalase n'est exprimée qu'après la mise en route du génome embryonnaire. Les différences observées dans ces protections expliquent, pour partie, les différences observées quant au maintien de la viabilité embryonnaire en culture in vitro. Chez la femme, seuls les transcrits GPX, Cu-Zn-SOD et catalase sont exprimés dans l'oviducte. Les transcrits GCS et Mn-SOD n'y sont jamais détectés, à l'inverse de la souris qui présente les transcrits codant pour toutes les enzymes testées. L'embryon des mammifères est donc protégé contre le stress oxydatif par des systèmes endogènes et exogènes redondants. "<br>The low involvement of glucose metabolism in early preimplantation embryos has suggested the presence of metabolic locks in the glycolysis pathway. In human transcripts encoding for glucose-6-phosphate isomerase (GPI), phosphofructokinase (PFK) and hexokinase II (HKII) are expressed at germinal vesicle (GV) and metaphase II (Mil) stages. In the mouse all transcripts (except HKII) are also detected. The toxicity of glucose is more than probably related to problems at the HKII and PFK posttranscriptionallevel or to stoechiometrie inhibition of PFK. An increased level of ROS may also be involved. In this study, gene tic expression of five antioxidant enzymes was studied in human and mouse oocytes: catalase, Cu-Zn-superoxide dismutase (Cu-ZnSOD), Mn-superoxide dismutase (Mn-SOD), glutathione peroxidase (GPX), and gammaglutamylcysteine synthetase (GCS). For both species, except for catalase, all transcripts encoding for antioxidant enzymes were expressed at Mil stage. In the mouse, no qualitative differences were detected between GV and Mil oocytes. In human, transcripts corresponding to GPX and Mn-SOD were not detected at GV stage but only at MIL The presence of a maturation-specific polyadenylation of GPX and Mn-SOD transcripts suggest that these enzymes can be considered as markers of cytoplasmic maturation in human. Catalase transcripts are neither detected neither in mouse nor in human oocytes whatever the stage of maturation but at a low level in the mouse blastocyst. This confirms that catalase transcripts are rather detected in embryos after genomic activation. The variations observed in this protection process against ROS explain, in part, the differential developmental capacity and viability of mo use and human preimplantation embryos in vitro. In human, only GPX, Cu-Zn-SOD and catalase are expressed in oviduct. GCS and Mn-SOD transcripts were never detected. At the opposite, mouse oviduct express ail the antioxidant enzymes tested. These results suggest that mammalian embryos can be protected against oxidative stress by endogen and exogenous redundant systems and ought to lead us to reinforce the protection systems in “in vitro” culture conditions for human Assisted Reproductive Technology

La méthode de sélection de l'ovocyte pour l'insémination, dans le cadre de l'assistance médicale à la procréation chez l'homme, ne garantie pas un taux de réussite satisfaisant. Plusieurs études académiques ont été menées dans le but de compéter cette méthode par d'autres plus objectives. Nous nous sommes intéressés à la caractérisation mécanique qui exige un dispositif approprié. Dans ce contexte, nous avons effectué des travaux de conception et de fabrication pour développer une plateforme permettant la caractérisation mécanique des ovocytes humains. Le composant principal de cette plateforme est le capteur de nano-force. Ce dernier, qui emploie un principe de ressorts magnétiques passifs, est constitué d'un indenteur venant solliciter l'ovocyte. Dans cette configuration, l'indenteur est stable suivant deux directions. La troisième direction, initialement instable, est stabilisée par la réaction de l'ovocyte à caractériser. L'originalité de ce capteur réside dans l'exploitation de la direction instable pour la mesure de force. En parallèle, un travail de modélisation du comportement mécanique des ovocytes a été réalisé dans le but d'identifier d'éventuels paramètres mécaniques pertinents pour la qualification des ovocytes. Ce travail a permis, d'une part, d'effectuer une étude critique sur les modèles existants dans la littérature et d'autre part, de développer un modèle basé sur une approche plus physique qui prend en compte la structuration tridimensionnelle complexe de l'ovocyte<br>The oocyte selection method for insemination, in the context of medically assisted procreation for humans, does not guarantee a good rate of success. Several academic studies have been conducted in order to complete this method by other more objective. We are interested in the mechanical characterization which requires an appropriate device. In this context, we carried out a design and a manufacturing work to develop a platform for the mechanical characterization of human oocytes. The main component of this platform is the nano-force sensor. This sensor, which uses a principle of passive magnetic springs, is composed of an indenter which compresses the oocyte. In this configuration, the indenter is stable along two directions. The third direction, initially unstable is stabilized by the reaction of the oocyte that has to be characterized. The originality of this sensor is the exploitation of the unstable direction for the force measurment. In parallel, a modeling work of the oocytes mechanical behavior was performed in order to identify some relevant mechanical parameters for their qualification. This work allowed us, first, to make a critical study of existing models in the literature, and secondly, to develop a model, based on a physical approach, which takes into account the oocyte complex three-dimensional structure

Dans cette étude, nous nous sommes intéressés aux modulations du transcriptome de l’ovocyte bovin en lien avec son potentiel à produire un embryon. Nous avons tout d’abord utilisé un modèle où la qualité des ovocytes a pu être modulée in vivo dans un contexte de stimulation ovarienne. Nous avons pu observer que la qualité des ovocytes acquise au cours de cette période avait une durée limitée et qu’un possible mécanisme de dégradation des ARN messagers pouvait être impliqué dans cette diminution de la qualité. Afin de mieux définir l’importance de la LH pour l’ovocyte lors de sa croissance finale dans le follicule, un antagoniste de la GnRH a été utilisé durant la période cruciale où la qualité des ovocytes est acquise. La suppression dela sécrétion de LH n’a pas eu d’impact significatif sur le potentiel de l’ovocyte à produire un embryon, bien que des fonctions cellulaires importantes, telles que la régulation de la traduction semble avoir été affectéedans l’ovocyte par le traitement. Le transcriptome des ovocytes récupérés à partir de follicules de taille spécifique nous a permis de mieux définir les changements qui surviennent de façon séquentielle au cours de la croissance normale du follicule. Une modulation importante et graduelle de plusieurs transcrits impliqués dans le remodelage de la chromatine a d’ailleurs été observée, ce qui illustre l’importance de cette modification au cours de l’acquisition graduelle de la compétence au développement. Compte tenu de l’importante des changements qui surviennent au cours de la croissance finale de l’ovocyte au niveau de la configuration de la chromatine de la vésicule germinale, nous avons analysé le transcriptome des ovocytes au cours des différents stades de condensation de la chromatine. Malgré la diminution importante de la transcription qui se produit en parallèle à la compaction de la chromatine, nous avons pu observer une augmentation de plusieurs ARN messagers d’histones au cours de cette période, ce qui suggère uneaccumulation en vue d’assurer les premiers cycles cellulaires. Ce projet nous a donc permis de mieux définir les changements qui surviennent dans l’ovocyte au cours de sa croissance finale, au moment où la qualité ovocytaire est significativement modulée. Nous avons également proposé certaines hypothèses afin d’expliquer cette diminution de la qualité.<br>In this study, we specifically looked at the mRNA modulations observed in the bovine oocyte in regard of its potential to produce an embryo. We first used a model where the oocyte quality could be modulated in vivo, using ovarian stimulation. We were able to show that the oocyte quality acquired during that period will not last and we proposed a possible mechanism of RNA degradation that could be implicated in the decrease of oocyte quality. In order to better understand the importance of the LH support for the oocyte at the end of follicle growth, a GnRH antagonist was used during the period where the oocyte quality is gained. Although the suppression of the LH secretion did not have a significant impact on the potential of the oocyte to produce an embryo, important cellular functions such as translation regulation were affected in the oocyte by the treatment. The transcriptome analysis of the oocyte collected from follicles of gradually increasing sizes has allowed us to better understand the sequential changes undergoing in the oocyte during the follicular growth. An important and gradual modulation of several transcripts involved in chromatin remodeling was also identified, illustrating the importance of this process in the gradual developmental potential acquisition. Considering the major chromatin remodeling of the germinal vesicle that is known to occur towards the end of oocyte growth, we decided to analyse the transcriptome of these oocytes, grouped according to their degree of chromatin compaction. Although an important decrease of the transcriptional activity will occur in parallel with the chromatin condensation, we were able to observe the accumulation of several histone mRNA over this period, suggesting a potential storage to fulfill the first few cell cycles. This project has allowed us to better define the molecular changes undergoing in the oocyte during its growth, where the oocyte quality is significantly modulated. It was also possible to propose different hypothesis in order to explain the underlying biological causes of this decrease quality.

L'objectif de mon travail de doctorat consistait à explorer l'expression génique du cumulus au regard de la compétence au développement de l'ovocyte bovin. Cette exploration tire son intérêt des nombreuses démonstrations du rôle crucial du cumulus auprès de l'ovocyte mammalien. En premier lieu, nous avons appliqué à des vaches de race laitière, un protocole de stimulation ovarienne permettant la modulation de la compétence ovocytaire, en agissant sur la différenciation folliculaire, via l'hormone folliculo-stimulante (FSH). Trois variantes de la compétence développementale de l'ovocyte ont ainsi pu être obtenues : acquisition de compétence en cours, compétence acquise et déclin de compétence. En dépit des différences modérées de compétence engendrées, le transcriptome des cellules du cumulus les reflète quand même. Ces variations bien que minimes, de l'expression génique du cumulus, appuient l'idée générale que la compétence ovocytaire serait le résultat non seulement de changements substantiels par l'environnement, mais aussi d'une régulation beaucoup plus fine des mécanismes folliculaires.Suite aux résultats de la première étude, nous avons voulu obtenir un portrait transcriptomique du cumulus plus contrasté. Pour ce faire, des biopsies de cumulus ont été réalisées sur des complexes ovocyte-cumulus (COC) d'abattoir suivis individuellement, de leur maturation à leur développement in vitro, et catégorisés selon que le développement ce soit arrêté à 2-8 cellules – i.e. avant l'activation du génome embryonnaire – ou qu'il se soit poursuivi jusqu'au stade de blastocyste. De cette manière, les cumuli associés à la formation d'un blastocyste, et donc à des ovocytes compétents, montrent une expression génique clairement différente de ceux dont le développement embryonnaire a échoué. Ces différences concernent des fonctions telles que : la modification post-traductionnelle, le repli des protéines, le métabolisme des acides aminés, la dégradation des protéines ou encore l'épuration des radicaux libres qui se trouvent surexprimées dans les cumuli compétents. Dans un troisième temps, c'est l'implication de l'hormone lutéinisante (LH) dans l'expression génique du cumulus qui a été évaluée. Le même protocole que celui de la première étude a été appliqué, en rajoutant cette fois des injections de Cétrorelix afin de supprimer la sécrétion de LH en fin de croissance folliculaire – i.e. lors de l'acquisition de la compétence au développement. Bien que l'absence de LH n'ait pas eu d'impact significatif sur la compétence ovocytaire, le transcriptome du cumulus a lui été significativement affecté. Ainsi, l'expression de fonctions comme la survie, la prolifération ou la croissance du follicule est inhibée par l'absence de LH. Par ailleurs, des fonctions de maintenance cellulaire telles que la transcription, le métabolisme des acides aminés et des protéines, ainsi que la production d'énergie semblent également pâtir de cette absence. Le soutien de la LH serait donc important pour les fonctions du cumulus lors de la maturation finale du follicule. Finalement, la présence du récepteur à la LH (R-LH) dans le cumulus bovin étant controversée dans la littérature, nous avons cherché à suivre l'expression génique de ce R-LH dans les cellules de COC en cours de maturation in vitro. Nous avons également examiné l'expression de la mévalonate kinase (MVK), dont le transcrit est reconnu en tant que régulateur de l'expression du R-LH ; et aussi surveillé l'expression de différentes enzymes stéroïdogènes ainsi que celle du récepteur à la progestérone (PGR). Le suivi d'expression génique a été réalisé à intervalles de trois heures, de 0 à 24 h de maturation, et n'a pour autant pas permis de détecter la présence de transcrits du R-LH dans le cumulus, tandis que l'expression génique de la MVK augmente au cours de la maturation. Les transcrits des enzymes stéroïdogènes STAR et HSD3β, bien que faiblement exprimés, ont été retrouvés ; et l'expression de CYP11A1 et PGR quant à elle augmente pendant la maturation. Ainsi, d'une part, la supplémentation en LH des milieux de maturation ne semble pas pertinente chez le bovin ; d'autre part, le cumulus pourrait être capable d'utiliser le cholestérol pour la stéroïdogenèse et de répondre à une stimulation par la progestérone puisqu'il en exprime le récepteur. Ces travaux participent ainsi à accroître la connaissance du transcriptome spécifique au cumulus bovin et son lien avec la compétence ovocytaire au développement. Enfin, les données acquises ici offrent de nouvelles pistes à explorer afin d'améliorer la qualité ovocytaire, tant in vitro qu'in vivo.<br>In this thesis report, the cumulus cell gene expression regarding oocyte developmental competence was explored in bovine. This interest is based on the proven crucial role in the differentiation of the cumulus to the mammalian oocyte. First, we applied an ovarian stimulation protocol to dairy cows which allows modulation of oocyte competence using FSH to influence follicular differentiation. Then, three oocyte competency states were obtained: increasing competence, competence acquired and decreasing competence. In spite of moderated competency fluctuations, cumulus cell transcriptome still reflects them. The small variations in cumulus gene expression reinforce the general idea that oocyte competence is the result not only of substantial changes due to the environment, but also of a much finer regulation of follicular mechanisms. Following the results of the first study, we wanted to obtain a more contrasted transcriptomic picture of the cumulus. To do so, cumulus biopsies were performed on slaughterhouse cumulus-oocyte complexes (COC) monitored individually, from their maturation to their in vitro development, and categorized according to whether the development was stopped at 2-8 cells – i.e. the embryonic genome activation – or continued until the blastocyst stage. In this way, the cumuli associated with a blastocyst formation, and therefore with competent oocytes, show a clearly different gene expression from those whose embryonic development has failed. These differences concern functions such as: posttranslational modification, protein folding, amino acid metabolism, protein degradation or free radical scavenging that are over-expressed in competent cumuli. Thirdly, we evaluated the involvement of luteinizing hormone (LH) in cumulus gene expression. The same protocol as that of the first study was applied, with the addition of Cetrorelix injections in order to suppress the LH secretion at the end of follicular growth – i.e. during developmental competence acquisition. Although the absence of LH did not impacted significantly on oocyte competence, the cumulus cell transcriptome was significantly affected. Thus, the expression of functions such as survival, proliferation or follicular growth is inhibited in the absence of LH. In addition, cell maintenance functions such as transcription, amino acid and protein metabolism, and energy production also seem to suffer from this absence. LH support would therefore be important for cumulus functions during the final maturation of the follicle. Finally, because of the controversy found in literature concerning the presence of the LH receptor (LH-R) in bovine cumulus, we sought to follow the gene expression of this LH-R in in vitro maturing COC cells. Also, we examined the expression of mevalonate kinase (MVK), whose transcript is recognized as a regulator of R-LH expression; and monitored the expression of various steroidogenic enzymes as well as that of the progesterone receptor (PGR). Gene expression observation was performed every 3 hours, from 0 to 24 h of maturation, and did not allow the detection of any R-LH transcripts in the cumulus, while MVK gene expression increases during maturation. The transcripts of the STAR and HSD3β steroidogenic enzymes were found, although weakly expressed; and the expression of CYP11A1 and PGR increases during maturation. Thus, on the one hand, LH supplementation of maturation media does not seem relevant in cattle; on the other hand, cumulus may be able to use cholesterol for steroidogenesis and to respond to a progesterone stimulation since it expresses its receptor. This work thus contributes to increase knowledge of the bovine cumulus transcriptome and its link with oocyte developmental competence. Finally, the data acquired here offer new avenues to explore in order to improve oocyte quality, both in vitro and in vivo.

Les jonctions communicantes (JCs) sont particulièrement importantes au sein du follicule ovarien puisque qu’elles vont participer à la régulation de la maturation ovocytaire. Les JCs vont contrôler le flux de molécules tels que l’AMPc et le GMPc qui passent entre les cellules du cumulus et l’ovocyte et qui inhibent la reprise de la méiose. La fermeture de ces canaux, tant in vivo qu’in vitro, va entrainer la reprise de la méiose en empêchant le passage de ces molécules. Dans les études que nous avons réalisées, nous avons tout d’abord développé une méthode d’analyse fonctionnelle des jonctions communicantes (le FRAP : Fluorescence Recovery After Photobleaching) dans la structure tridimensionnelle du complexe ovocyte-cumulus. Cette technique nous a permis de déterminer que les gonadotrophines et le liquide folliculaire présent dans le milieu de maturation pouvaient moduler la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus pendant les premières heures de maturation in vitro (MIV). Par la suite, nous avons étudié la régulation des connexines (Cx), qui sont les protéines composant la JC. Nous avons identifié les principales connexines présentes dans le COC porcin, la Cx43, la Cx45 et la Cx60. Nous avons déterminé que les gonadotrophines régulaient l’expression, la dégradation ainsi que la localisation de la connexine 43 (la principale connexine présente dans les cellules du cumulus porcin). Enfin, nous nous sommes intéressés à la régulation de la reprise de la méiose par le peptide natriurétique de type C (CNP). En effet, le CNP a été proposé pour inhiber la reprise de la méiose en se liant à son récepteur NPR-B sur les cellules du cumulus, ce qui stimule la production de GMPc. Il est ensuite transféré dans l’ovocyte, via les JCs, où il va inhiber la reprise de la méiose. Nous avons montré que le CNP et un analogue du GMPc avaient un impact différent sur la dynamique de transfert entre les cellules du cumulus. De plus, le CNP agirait sur un autre récepteur (le récepteur NPR-C) pour promouvoir l’arrêt méiotique. En conclusion, ces résultats ajoutent un niveau de compréhension supplémentaire des mécanismes régulant les JCs et la reprise de la méiose durant la MIV chez le porc.<br>Intercellular gap-junctional communication (GJC) plays an important role in ovarian cell physiology. Closure of GJC has been proposed to be involved in oocyte maturation, particularly in the resumption of meiosis, both in vivo and in vitro, by controlling the flow of meiosis inhibitors, such as cAMP and cGMP. In the present study, we have first developed an assay based on recovery of calcein fluorescence in photobleached cumulus cells (FRAP: Fluorescent Recovery After Photobleaching) in the three-dimensional cumulus-oocyte complex (COC), during the first hours of porcine in vitro maturation (IVM). Results obtained using FRAP technology provide evidence that the composition of the IVM medium in terms of hormones and follicular fluid clearly affects cumulus-cumulus cell GJC. We then turned our attention to the effect of gonadotropins on connexins regulation. Indeed, GJC are composed of connexins proteins. We indentified Cx43, Cx45 and Cx60 as the main connexins expressed in swine COC. We show that gonadotropins regulate Cx43 protein level, degradation and localisation in the COC during the first hours of IVM. We finally turned our attention on the effect of natriuretic peptide C (CNP) on GJC regulation and meiotic resumption during porcine IVM. Indeed, CNP has been proposed to bind to receptor natriuretic peptide receptor B (NPR-B) where it triggers the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP). The cGMP produced is then transferred to the oocyte through gap junctions where it promotes meiotic arrest. Here we show that CNP and a cGMP analogue have different effects on GJC and Cx43 regulation suggesting that cGMP signaling may not be the only signaling pathway involving CNP. Moreover, we found that CNP is likely to bind to receptor natriuretic peptide receptor C (NPR-C) to play a role in maintaining meiotic arrest during porcine IVM, when activated in addition to NPR-B. In conclusion, we describe new mechanisms involved in the complex regulation of dynamic changes in GJCs and meiotic resumption. A better understanding of GJC regulation during IVM may in turn provide a powerful tool to improve assisted reproduction technologies and their efficacy in mammals.

La première semaine du développement embryonnaire humain (de la fécondation au stade blastocyste) comporte une série d'événements qui transforme des cellules hautement spécialisées, les cellules germinales, en des cellules indifférenciées au potentiel développemental extraordinairement vaste, les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). La compréhension de ces évènements est essentielle pour les progrès de l'assistance médicale à la procréation (AMP) et de la médecine régénératrice, deux domaines majeurs de la médecine de demain. Utilisant la technologie innovante des puces à ADN, nous nous sommes intéressés à l'expression des gènes dans les extrêmes de cette première semaine de développement : les ovocytes et les CSEh. Grâce à l'optimisation récente des techniques d'analyse du transcriptome, permettant d'étudier de très petites quantités de matériel cellulaire, nous avons obtenu le profil transcriptionnel des ovocytes humains au cours de leur maturation. Ce travail a montré que la sécurine PTTG3 et la kinase AURKC sont préférentiellement exprimés dans les ovocytes durant la méiose. Des facteurs de croissance fortement exprimés dans les ovocytes ont été aussi identifiés, tels que TNFSF13, FGF9, FGF14 et IL4, ainsi que les facteurs de transcription : OTX2, SOX15 et SOX30. L'analyse des cellules du cumulus, qui entourent les ovocytes, a permis la caractérisation des facteurs de communication inter-cellulaire mis en jeu par l'ovocyte au cours de sa maturation. Ces informations sont essentielles pour mieux appréhender la biologie ovocytaire, identifier de nouveaux marqueurs de maturité et de qualité ovocytaire, et elles ouvrent la voie à une stratégie de sélection des meilleurs embryons candidats à l'implantation basée sur l'analyse moléculaire des cellules du cumulus, afin d'améliorer le taux de succès de l'AMP. En parallèle, nous nous sommes intéressés aux CSEh. Ces cellules sont issues de la masse cellulaire interne du blastocyste (MCI), ont des propriétés d'auto-renouvellement et de différenciation qui en font des candidats attractifs pour une utilisation en thérapie cellulaire. Nous avons réussi la dérivation de 3 nouvelles lignées françaises de CSEh et avons étudié leur transcriptome, ainsi que celui de plus de 20 CSEh internationales. Également, nous avons identifié de nouveaux marqueurs membranaires tels que CD24 et la sémaphorine SEMA6A. Ces données transcriptomes ont été intégrées dans un atlas internet d'expression que nous avons créé : Amazonia http://amazonia. Montp. Inserm. Fr. Nous avons enfin, comparé le transcriptome des ovocytes et celui des CSEh, afin de mieux comprendre les évènements moléculaires qui sous-tendent la première semaine du développement humain. Ces résultats révèlent en particulier que le protéasome reste fortement surexprimé dans ces deux types cellulaires, par rapport à plus de 200 échantillons de tissus somatiques, suggérant ainsi un rôle de cette voie de dégradation protéique dans le maintien de la pluripotence. L'ensemble de ce travail a mené directement à des propositions pour l'amélioration des conditions de culture des CSEh, en particulier la mise au point d'un milieu de culture dépourvu de protéines animales, et pour l'amélioration de la reprogrammation cellaire des cellules adultes en cellules souches pluripotentes induites (iPS).