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Dissertations / Theses on the topic 'Parasitology (biology)'
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Hayward, Rhian Elizabeth. "The biology of Plasmodium falciparum gametocytes." Thesis, University of Oxford, 1997. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.360296.
Full text
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Ahari, Esmaeil Ebrahimzadeh. "Studies on the biology of Schistosoma margrebowiei." Thesis, Bangor University, 1992. https://research.bangor.ac.uk/portal/en/theses/studies-on-the-biology-of-schistosoma-margrebowiei(6450c229-e685-4746-bb42-2735e73ca54e).html.
Full textAbstract:
Studies on the biology of Schistosoma margrebowiei include, a simple means of culturing and infecting Bulinus natalensis snails; the morphology and ultrastructure of various stages in the life-cycle; pathology; cercarial longevity and infectivity; cross-reactivity with S. mansoni rabbit anti-sera and the possible use of S. margrebowiei egg homogenate in the serodiagnosis of S. haematobium patients. A simple method of maintenance and infection of B. natalensis snails en masse, was found to yield a rapid and continuous supply of material. The results indicate that the size of snails at the time of exposure is an important factor in successful infection. A wide range of morphological and ultrastructural similarities were found between S. margrebowiei larval stages and those of other species of the genus. Whereas the adult worms are among the largest, the eggs, miracidia and cercariae of S. margrebowiei, are among the smallest in the genus. The pathology associated with S. margrebowiei, is due to deposition of large numbers of eggs in various organs of the infected animal. Eggs were not only recovered from the liver and intestine but following 50 days post-infection, from the spleen. A large number (10-15%) of the total eggs recovered from mice 45 to 65 days post-infection were deposited in the spleen. The cercariae of S. margrebowiei by utilizing their glycogen reserves, can live for up to 70 hours in fresh water at temperatures of 26-28°C. This observed life-span can be prolonged when water temperatures were decreased to 8-12 °C. Cercariae kept in cold water although physically active and still infective, were found to be attenuated as measured by a reduced percentage of recovered worms compared with controls. The potential for immunizing mice with the hepatopancreas from infected and uninfected snails against schistosomiasis has been evaluated using S. mansoni. Although a reduction in the number of worms and eggs was observed in mice immunized with infected hepatopancreas when compared to the controls, this decrease was not significant. Sera from 53 patients infected with schistosomiasis were studied by ELISA using S. margrebowiei crude soluble egg antigen (SEA), S. mansoni SEA and cationic S. mansoni egg antigen (CEF6). It was found that S. margrebowiei SEA was more specific for the identification of S. haematobium infections.
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Tallin, Michelle. "The biology of Mesocestoides corti infection in laboratory rodents." Thesis, University of Portsmouth, 1994. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.241075.
Full text
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Stewart, Alexander Thomas. "Eco-immunology : thermal variation and parasitology of the three-spined stickleback." Thesis, Cardiff University, 2016. http://orca.cf.ac.uk/95911/.
Full textAbstract:
Global warming and temperature variation are likely to have profound impacts on fish as ectotherms that are heavily reliant on environmental temperature for growth, development, metabolism and immunity. This study addresses the impact of climate change on the development of infection and immunity in three-spined sticklebacks (Gasterosteus aculeatus) and their common parasites. In addition to thermal consequences on host parasite interactions, the study also addressed the effects of co-infection on parasite intensities and pathology on host swimming ability. Experiments were designed to mimic global warming, temperature variability and stochasticity (Chapters 3-5). Temperature during exposure to Saprolegnia parasitica was the major determinant of high infection prevalence and intensity with historical temperature exposure having little impact (Chapters 3-5). A further contributor to infection risk was higher host body condition (Chapter 3 and 5), attributed to a trade-off between host immunity and condition, higher condition individuals investing less in immunity supported by a decline in β-def expression in high condition fish (Chapter 5). Peak infection intensities in Gyrodactylus gasterostei were dependent on temperature variability and the host’s immune response. In variable conditions, an established G. gasterostei was better able to adapt to a changing environment than the host’s response causing higher peak infection intensities (Chapter 3 and 4). Temperature, and not photoperiod, was the major cause of circannual rhythm in host immunity (Chapter 6). Co-infection between G. gasterostei and A. foliaceus, revealed higher gyrodactylid infection peaks compared to hosts infected with G. gasterostei alone suggesting that immunomodulation by A. foliaceus. Lastly, pathology, rather than drag, reduced burst and long-term swimming performance of sticklebacks infected with A. foliaceus. Many of the factors highlighted have implications for aquaculture. High aquaculture feeding regimens, resulting in higher body condition, co-infection and temperature, all could severely increase morbidity and mortality of fish in a parasite species dependant manner.
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Pilar, Ana Victoria. "Biochemical and molecular characterization of the glycosomal PTS2 import receptor peroxin 7 in «Leishmania donovani»." Thesis, McGill University, 2009. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=32255.
Full textAbstract:
The Leishmania peroxin 7 (LmPEX7 or LdPEX7) is the receptor that translocates PTS2 signal-containing proteins into the glycosome. This microbody is unique to and crucial for the survival of trypanosomatids which include Leishmania and Trypanosoma, the causative agents of leishmaniasis and African sleeping sickness, respectively. Proteins are imported into the glycosome via two pathways, PTS1 and PTS2, which involves the formation of a PTS-receptor complex in the cytosol, docking of the complex on a translocation apparatus on the glycosomal membrane, and subsequent release of the cargo protein into the lumen. However, the precise steps in glycosome protein trafficking are not well-defined and to understand the function of these organelles and prove their potential as chemotherapeutic targets, the mechanism of glycosome biogenesis needs to be fully elucidated. Not much is known about the mechanism of PTS2 import pathway in glycosomes as studies on PEX7 have been hampered by the difficulty in expressing a soluble recombinant form of this receptor. To dissect the PTS2 import pathway and to determine the role of PEX7 in Leishmania, this protein was cloned and characterized. LmPEX7 is a ~41 kDa protein containing six conserved WD40 motifs that displays limited sequence similarity to PEX7 homologues involved in the biogenesis of evolutionarily-related peroxisomes found in other eukaryotes. LmPEX7 interacts with PTS2 proteins, the PTS1 receptor LdPEX5, and the membrane-associated docking protein LdPEX14. These interactions, characterized through various biochemical techniques, were mediated by specific binding domains, formation of stable protein-protein complexes, and conformLa péroxine Leishmania 7 (LmPEX7 ou LdPEX7) est un récepteur qui transloque les protéines qui contiennent le signal PTS2 dans le glycosome. Ce glycosome est unique et critique aux trypanosomes, tels que Leishmania et Trypanosoma, les agents causant la leishmaniose et la maladie Africaine du sommeil. Les protéines sont importées vers le glycosome par deux voies, PTS1 et PTS2, qui nécessitent la formation d'un complexe PTS dans le cytosol, l'amarrage du complexe sur un appareil de translocation sur la membrane du glycosome, et permet la liberation de la charge protéique dans le lumen. Par contre, les étapes précises dans l'acheminement de protéines glycosomales ne sont pas bien définies et pour comprendre les fonctions de ces organelles et prouver qu'elles être des cibles chimiothérapiques, les mécanismes impliqués dans la biogenèse doivent être très bien élucidés. Pour disséquer le mécanisme d'importation et pour déterminer le rôle de PEX7 chez Leishmania, cette protéine a été clonée à partir de l'ADN génomique de L. major et a été caractérisée. LmPEX7 est une protéine d'environ 41 kDa qui démontre une homologie limitée aux PEX7 impliqués dans la biogenèse des peroxysomes chez autres eucaryotes. LmPEX7 interagit avec les protéines PTS2, le récepteur PTS1 LdPEX5, ainsi que la protéine LdPEX14 qui est associée à la membrane du glycosome. Ces intéractions, décrites en utilisant des techniques biochimiques variées, sont arbitrés par des domaines d'interactions situés sur LdPEX5 et LdPEX14, la formation de complexes protéiques stables, et associée à divers changements conformationnels. Des études de localisation subcellula
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Geukers, Karen. "Characterization of CFF in the sera of plasmodium-infected mice." Thesis, McGill University, 2011. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=104816.
Full textAbstract:
The objective of this study was to further characterize the inhibitory serum protein crisis form factor, or CFF, and identify candidate proteins responsible for CFF activity. Four models for serum CFF induction were tested: C57BL/6 mice infected with P. chabaudi adami AS, C57BL/6 mice inoculated with BCG + LPS, and BALB/c mice infected with P. chabaudi adami DS or DK. C57BL/6 mice infected with P. chabaudi adami AS produced sera with the most pronounced level of inhibitory activity and were used for CFF analysis. Heat inactivation did not affect CFF activity, indicating the observed effect was not due to complement proteins, function was lost after heating serum to 100°C. Gel filtration determined that CFF may be in the range of 20 kDa – 80 kDa. Serum depletion by IgY retained CFF activity in the low abundance protein fraction (LAP), which was analyzed by MALDI and LC-QToF mass spectrometry and compared to the LAP from naïve mice. A total of 68 proteins were identified as either up-regulated or unique to the CFF serum, and qualitative analysis revealed one potential CFF candidate: neutrophil gelatinase-associated lipocalin. In conclusion, we have established a model for inducing serum CFF, characterized some of its physical properties, and through proteomic analysis identified a potential CFF candidate.L'objectif de cette étude visait d'une part à approfondir la caractérisation du facteur de la forme de crise (CFF; « crisis form factor »), un facteur protéique inhibiteur présent dans le sérum, et d'autre part à identifier des protéines candidates responsable de l'activité de CFF. Quatre modèles murins d'induction sérique du CFF ont été testés: des souris C57BL/6 infectées par la souche de P. chabaudi adami AS, des souris C57BL/6 inoculées avec BCG + LPS, et des souris BALB/c infectées respectivement avec les souches de P. chabaudi adami DS ou DK. L'activité inhibitrice la plus prononcée a été observé à partir du sérum prélevé chez les souris C57BL/6 infectées par la souche de P. chabaudi adami AS. Le sérum issu de ce modèle a donc été utilisé pour la suite des analyses de CFF. Nous avons déterminé que l'activité de CFF ne provient pas des protéines du complément et que CFF est inactivé lorsque le sérum est bouilli à 100oC. Le fractionnement du sérum par chromatographie d'exclusion nous a permis de déterminer que CFF est éluée dans les fractions protéiques allant de 20 kDa à 80 kDa. Le sérum a ensuite été soumis à une colonne d'affinité IgY afin d'y dépléter les protéines majoritaires. Suite à cette déplétion, nous avons déterminé que l'activité de CFF est préservée uniquement dans la fraction contenant les protéines sériques de faible abondance (LAP; « low abundance protein »). Nous avons donc analysé la fraction LAP du sérum induit pour CFF par spectrométrie de masse de type MALDI et LC-QToF, puis comparé son profil protéique à celui de la fraction LAP de sérum issu de souris naïves. Ces profils protéiques révèlent qu'un total de 68 protéines sont soit surexprimées, soit exclusives au sérum démontrant une activité CFF. De plus, l'analyse qualitative nous a permis d'identifier une protéine candidate potentiel pour CFF : la gélatinase de neutrophile associée à la lipocaline (NGLA; « neutrophil gelatinase-associated lipocalin »). En concluant, nous avons établi un modèle d'induction sérique de CFF, avons caractérisé certaines de ses propriétés physiques et avons identifié, par l'entremise de la protéomique, NGLA en tant que candidate potentielle de CFF.
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El-Shehabi, Fouad. "Characterization of novel biogenic amine receptors in the human bloodfluke «Schistosoma mansoni»." Thesis, McGill University, 2010. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=86610.
Full textAbstract:
The genome of the human bloodfluke Schistosoma mansoni encodes 18 putative biogenic amine-like G-protein-coupled receptors (GPCRs). These receptors are potential targets for the development of antischistosomal drugs. One of these sequences, SmGPR-1 (formerly SmGPCR), was previously cloned and was identified as a histamine receptor. In this study, we expanded the functional analysis of SmGPR-1 by studying its expression and tissue distribution both at the RNA and protein levels in different developmental stages of the parasite. In the second part of the study, we cloned and characterized two structurally related receptors, named SmGPR-2 and SmGPR-3. Bioinformatics analyses showed that the three receptors are members of a new clade of biogenic amine GPCRs and are characterized in part by the absence of a highly conserved aspartate (Asp3.32) of the third transmembrane domain. Like SmGPR-1, our first cloned receptor, SmGPR-2, was activated by histamine and its developmental expression at the mRNA level was similar to that of SmGPR-1, both receptors being upregulated in young schistosomula. However, their tissue localization was different. SmGPR-1 was enriched in the tegument, subtegumental musculature and the suckers, whereas SmGPR-2 was associated with neurons of the subtegumental plexuses. The distribution of these receptors correlated with that of histaminergic neurons, which were also detected in the subtegumental neuronal plexuses, the innervation of the suckers, elements of the central nervous system and transverse commissures. These studies suggest that histamine is an important neurotransmitter system in schistosomes. The third receptor investigated in this study, SmGPR-3, was not responsive to histamine but rather was found to have broad specificity for catecholamines, particularly dopamine and related metabolites. In vitro assays of cultured schistosomula revealed that many of the ligands that interact with SmGPR-3 also have strong effects on larval motilitAu génome de Schistosoma mansoni, un parasite sanguin de l'homme, on retrouve 18 récepteurs putatifs à amine biogène couplés aux protéines G (RCPG). Ces récepteurs ont un potentiel thérapeutique contre les infections aux schistosomes. La séquence SmGPR-1 (anciennement SmGPCR) a déjà été clonée et identifiée comme un récepteur à l'histamine. Une analyse fonctionnelle plus poussée de SmGPR-1 est l'objet de cette thèse. L'analyse de taux d'ARNm et de protéines à différents stades de développement du parasite a servi à l'étude de l'expression et la répartition tissulaire de SmGPR-1. Deux récepteurs similaires, de par leur structure, le SmGPR-2 et le SmGPR-3 ont été identifiés, clonés et caractérisés lors de cette étude. Suite à des analyses bioinformatiques, ces trois récepteurs ont révélé leur appartenance à une nouvelle variante de récepteurs à amine biogène couplés aux protéines G caractérisés par l'absence d'aspartate conservé (Asp3.32) dans le troisième domaine transmembranaire. Tout comme SmGPR-1, le récepteur SmGPR-2 est activé par l'histamine, et l'expression de l'ARNm est similaire à celle de SmGPR-1, les deux récepteurs étant régulés à la hausse chez les jeunes schistosomes. Toutefois, ils sont localisés à différents endroits, SmGPR-1 se retrouve dans le tégument, la musculature subtégumentaire et les ventouses, tandis que SmGPR-2 est associé aux plexus nerveux subtégumentaires. La localisation de ces récepteurs est similaire à celle des neurones histaminergiques que l'on retrouve dans les plexus nerveux subtégumentaires, l'innervation des ventouses, dans certains éléments du système nerveux central et les commissures transversales. Il semblerait que l'histamine soit un important système neurotransmetteur du schistosome. Le troisième récepteur identifié, SmGPR-3, n'est pas activé par l'histamine, mais semble démontrer une spécificité étendue aux catécholamines et tout particuli
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Sen, Rajashree. "Structure-function analysis of RNA editing ligases and their interacting protein partners in the editosome complex of «Trypanosoma brucei»." Thesis, McGill University, 2010. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=95053.
Full textAbstract:
Trypanosoma brucei is a parasite that causes the vector-borne disease African sleeping sickness. The mitochondrial mRNAs of T. brucei undergo post-transcriptional RNA editing to make mature, functional mRNAs. The final step of this process is catalyzed by the essential ligase, Kinetoplastid RNA Editing Ligase 1(KREL1) and closely related KREL2. This study is an in vitro characterization of interaction of KREL1 and KREL2 with binding partners KREPA2 and KREPA1, respectively, using full-length, truncated and point-mutated ligases. We have shown a strong, specific stimulatory effect of the interacting partners on catalytic activity of the ligases. We have narrowed the region of contact to fifty-nine C-terminal residues for KREL1 and forty-five for KREL2. Finally we have identified the N-terminal residues F206, T264 and Y275 and C-terminal K405 on KREL1 as critical for catalytic activity as well as interaction with KREPA2. K424 and the KWKE (441-444) stretch possibly co-ordinate KREPA2 interaction during adenylylation.Trypanosoma brucei est un parasite responsable en Afrique de la maladie du sommeil, une maladie à transmission vectorielle. Les ARNm mitochondriaux de T. Brucei subissent l'édition de l'ARN au niveau post-transcriptionnel pour produire des ARNm matures et fonctionnels. L'étape finale de ce processus est catalysée par la ligase essentielle KREL1 (Kinetoplastid RNA Editing Ligase 1) et celle étroitement liée, KREL2. Cette étude est une caractérisation in vitro de l'interaction de KREL1 et de KREL2 avec les partenaires de liaison KREPA2 et KREPA1 respectivement, en utilisant les séquences complètes, tronquées et mutées des ligases. Nous avons montré un effet stimulateur spécifique prononcé des partenaires interagissant, sur l'activité catalytique des ligases. Nous avons rétréci la région de contact à cinquante neuf acides aminés à l'extrémité C-terminale pour KREL1 et quarante cinq pour KREL2. Finalement, nous avons identifié les acides aminés F206, T264 et Y275 à l'extrémité N-terminale et K405 à l'extrémité C-terminale de KREL1 comme crucial pour l'activité catalytique aussi bien que pour l'interaction avec KREPA2. Les acides aminés K424 et KWKE (441-444) s'étendent éventuellement pour coordonner l'interaction de KREPA2 au cours de l'adénylation.
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Rao, Vijayaraghava. "Characterization of novel ligand-gated chloride channel subunits from «Haemonchus contortus»." Thesis, McGill University, 2010. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=95130.
Full textAbstract:
Ligand-gated chloride channels (LGCCs) are key components that form the inhibitory neurotransmission system in animals. Nematodes possess LGCCs that are gated by unique ligands such glutamate, serotonin and acetylcholine. Higher living forms such as mammals are not known to possess similar receptors. Hence nematodes can be deemed to comprise a phylum with a divergent inhibitory neurotransmission system. Based on this premise, the current project aimed to better understand the inhibitory nervous system of the parasitic nematode, Haemonchus contortus through the characterization of novel LGCC subunits and the localization of relevant ligands believed to function as inhibitory neurotransmitters. The first novel LGCC subunit gene to be isolated was named Hco-GGR-3 (previously named as HcGGR3). Electrophysiological analyses of this subunit in Xenopus laevis oocytes revealed the homomeric assembly of the channel which was predominately gated by dopamine (DA). Immuno-staining of H. contortus adult worms using antibodies raised against a peptide exclusive to Hco-GGR-3 showed that this subunit localized to deirid (cervical papilla) socket and sheath cells. Gender specific differences in localization of this subunit were also observed. In addition, a single nucleotide polymorphism located in the 3' untranslated region (UTR) of Hco-ggr-3 was found to be associated with the selection for resistance towards macrocyclic lactones (MLs) moxidectin (MOF) and ivermectin (IVM) in H. contortus. A second amine-gated chloride channel gene called Hco-lgc-55 was also isolated. Electrophysiology of this subunit revealed that this channel was gated mainly by tyramine (TA) [EC50 5.8 ± 1.0 μM (n=5)] and a lesser extent by dopamine (DA) and octopamine (OA). Semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (SqRT-PCR) showed the presence of mRNA for Hco-lgc-55 in all the life-cycle stages of the parasite. A detailed examination of the localization and characterization oLes canaux chlorures ligand-dépendants (CCLDs) sont la composante clef du système d'inhibition de la neurotransmission chez les animaux. Les nématodes possèdent des CCLDs qui sont activés par des ligands uniques tels que le glutamate, la sérotonine et l'acétylcholine. Les mammifères ne possèdent pas ce type de récepteurs. Il est possible d'émettre l'hypothèse que le phylum des nématodes a un système d'inhibition de la neurotransmission divergent. Basé sur cette caractéristique, le projet a pour objectif de mieux comprendre le système nerveux inhibiteur chez le nématode parasite, Haemonchus contortus, en caractérisant de nouvelles sous-unités de CCLD, et en localisant des ligands valables, connus pour fonctionner comme neurotransmetteur inhibiteur. La première nouvelle sous-unité du gène de CCLD à avoir été isolée, a été appelé Hco-GGR-3 (précédemment nommé HcGGR3). Les analyses électrophysiologiques de cette sous-unité, réalisées dans les ovocytes de Xenopus laevis, ont permis d'identifier un assemblage homomérique de ce canal qui est majoritairement dépendant de la dopamine (DA). L'immunocoloration de vers adultes d'H. contortus, faite à partir d'anticorps spécifiques à un peptide exclusif à Hco-GGR3, a permis de montrer que cette sous-unité était localisée au niveau des ports des deirids (papille cervicale) et des cellules de gaines. Il a été aussi observé qu'il y avait une différence de localisation de cette sous-unité en fonction du genre des vers. De plus, un polymorphisme mononucléotidique au niveau de la région 3' non transduite (UTR) de Hco-ggr3 s'est avéré être associé à une sélection pour la résistance aux lactones macrocycliques (LM) - la moxidectine (MOF) et l'ivermectine (IVM) - chez H. contortus. Un second gène d'un canal chlorure dépendant d'un acide aminé appelé Hco-lgc-55 a aussi été isolé. L'électrophysiologie de cette sous-unité a permis de montrer que ce canal était maj
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Rioux, Marie-Claire. "A study of the proteomics of fasciolosis." Thesis, McGill University, 2012. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=106286.
Full textAbstract:
Fasciolosis is an economically important veterinary parasitic disease. Of the two causative agents, Fasciola hepatica and Fasciola gigantica, F. hepatica has a greater ability to effectively establish a primary infection and resist the host defences. Certain host species, such as cattle, are more resistant to reinfection than others, such as sheep. In order to gain a greater understanding of the host response to infection, proteomic analyses of sera from sheep and cattle infected with F. hepatica were undertaken. Twenty-six indicators of infection were validated by SELDI-TOF mass spectrometry (MS) in sheep with a single-dose F. hepatica infection. Two of these markers were identified and their increase in the chronic stage of infection was validated using Western blot analysis. SELDI-TOF MS profiling of sera from trickle-infected cattle did not provide descriptive information, but tandem MS analysis of immunodepleted sera provided a more descriptive view of the host-parasite interaction. This technique was sufficiently sensitive to detect markers of inflammation during the acute stage of infection and markers of liver fibrosis during the chronic stage of infection, but was not sufficiently sensitive to detect parasite proteins. Finally, the excretory-secretory products (ESP) of F. hepatica and F. gigantica were profiled. The similarities between the two species were greater than the similarities between newly excysted juveniles (NEJ) and adults. The most notable differences between NEJ and adults were the profile of proteases released and the specific isotypes released by the parasites. NEJ expressed relatively equal amounts of cathepsin L, B, and legumain, whereas adults expressed predominantly cathepsin L. NEJ- and adult-specific cathepsin L clades were identified as well as a potential F. gigantica NEJ-specific cathepsin L clade. Antioxidant defence enzyme levels were higher in adult ESP than NEJ ESP, with higher relative abundance in F. gigantica than F. hepatica. The analysis suggests that stage-specific expression and isotype diversity should be considered when developing a vaccine targeted to the early stage of infection and when studying broad-spectrum chemotherapeutic targets. These studies contribute to the understanding of the basic biology of the causative agents of fasciolosis and the use of proteomics in studying host-parasite interactions.La fasciolase est une infection vétérinaire importante. Entre les deux agents causals, Fasciola hepatica et Fasciola gigantica, f. hepatica a une meilleure capacité pour établir une infection primaire et pour résister aux défenses de l'hôte. Certaines espèces hôtes, tels que les bovins, résistent une seconde infection mieux que d'autres espèces, tels que les moutons. Afin de mieux comprendre la réaction de l'hôte pendant l'infection, des analyses protéomiques de sérums de moutons et de bovins affectés par f. hepatica ont été entreprises. Vint-six marqueurs d'infection ont été validés par spectrométrie de masse de temps de vol à désorption-ionisation laser potentialisée par surface (SM TDV-DILPS) chez les moutons avec une seule dose infectieuse de f. hepatica. Deux de ces marqueurs ont été identifiés et leur hausse dans la phase chronique de l'infection a été validée par buvardage de western. Le profil SM TDV-DILPS de bovins infectés à plusieurs reprises n'a pas fourni des détails descriptifs, mais une analyse SM en tandem de sérums immunodéplétés a fourni un portrait descriptif de l'interaction hôte-parasite. Cette technique était suffisamment sensible pour détecter des marqueurs d'inflammation pendant la phase aigüe de l'infection et des marqueurs de la fibrose hépatique pendant la phase chronique de l'infection, mais n'était pas suffisamment sensible pour détecter des protéines parasitaires. Enfin, les produits d'excrétion-sécrétion (PES) de f. hepatica et f. gigantica ont été profilées. Les deux espèces partageaient plus de similitudes que parmi les phases de juvéniles nouvellement excystés (JNV) et des adultes. Les différences les plus notables entre les JNV et les adultes étaient le profil des protéases et les isotypes de ces protéases retrouvés. Les montants de cathepsine L, B et de legumain chez les JNV étaient relativement égaux, tandis que la majorité des protéases chez les adultes étaient cathepsine L. Des clades de cathepsine L spécifiques aux JNV et aux adultes ont été identifiés ainsi qu'un clade potentiellement spécifique aux JNV de f. gigantica. Les niveaux d'enzymes antioxydants de défense dans les PES étaient plus élevés dans chez les adultes que les JNV, ainsi qu'une abondance plus élevées chez f. gigantica que f. hepatica. Ces analyses suggèrent que l'expression des protéines spécifique aux phases de développement et la diversité des isotypes devraient être considérées lors de l'élaboration d'un vaccin ciblé à un stade précoce de l'infection et lors du développement de cibles chimiothérapeutiques à large spectre. Ces études contribuent aux connaissances fondamentales des agents causals de fasciolase et l'usage d'outils protéomiques dans l'étude des interactions hôte-parasite.
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Gonzalez, Santana Bibiana. "Cysteine proteases: potential serodiagnostic reagents for human Schistosomiasis and Fasciolosis." Thesis, McGill University, 2012. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=110691.
Full textAbstract:
Schistosomiasis and fasciolosis are parasitic diseases that affect a great number of people, particularly in developing countries, and cause huge global morbidity. Diagnosis is essential for control, treatment and prognosis of the diseases and yet a simple, cheap, sensitive and specific assay is not readily available for either of them. In the current study, cathepsin B (SmCB) and cathepsin L1 (FhCL1) were investigated as potential diagnostic reagents to detect schistosomiasis and fasciolosis, respectively, in humans. The genes encoding SmCB and FhCL1 were expressed Pichia pastoris and the proteins isolated to homogeneity by affinity chromatography. The SmCB ELISA was optimized for antigen concentration, primary antibody dilution and secondary antibody dilution using a pool of sera obtained from patients that were coprologically-positive or negative for schistosomiasis. A clear distinctive was achieved between these two sera pools. However, when employed to screen a panel of patients from Senegal the test failed to provide satisfactory discrimination between schistosoma-infected and schistosoma-negative individuals. The FhCL1 ELISA was optimized using sera from Fasciola-infected individuals from Cuba, and samples from Cuban and Canadian non-infected patients. We determined the optimal dilution for the primary antibody and also assessed/compared the performance of anti-total IgG, IgG4, IgG1 and IgG2 secondary conjugated antibodies. Total IgG provided the best discrimination between Fasciola- infected and non-Fasciola infected individuals with a 99.99% sensitivity and specificity. Furthermore, by screening sera obtained from patients infected with various worm and protozoan diseases we showed that the FhCL1 ELISA does not cross-react with other diseases commonly found in similar geographical regions as fasciolosis. In conclusion, diagnosis of human schistosomiasis still remains uncertain and more studies need to be performed to improve our diagnostic test using SmCB. On the other hand, we have developed a simple, sensitive, specific and accurate test to detected human fasciolosis by using FhCL1, a major protease released by the parasite. The P. pastoris expression system allowed us to obtain up to 80 mg of FhCL1 enzyme per 4 L culture. Therefore, we not only have developed a standardized test that showed high specificity and sensitivity but we also have the methodology to obtain sufficent quantities of antigen needed future mass screening of human fasciolosis in affected regions.La schistosomiase et la fasciolose sont deux maladies parasitaires qui touchent un grand nombre de personnes, en particulier dans les pays en développement, causant une morbidité élevée. Le diagnostic est essentiel pour le contrôle, le traitement et le pronostic de ces maladies et pourtant aucun essai simple, abordable, sensible et spécifique n'est disponible à ce jour pour l'une d'entre elles. Dans le cadre de la présente étude, cathepsine B (SmCB) et cathepsine L1 (FhCL1) ont fait l'objet d'une investigation sur leur potentiel à être utiliser pour diagnostiquer la schistosomiase et fasciolose, respectivement, chez les humains. Dans la présente étude, les gènes encodant SmCB et FhCL1 ont été exprimés dans Pichia pastoris et les protéines isolées par chromatographie d'affinité. Le test ELISA pour SmCB a été optimisé pour une concentration en antigène et pour une dilution d'anticorps primaire et secondaire en utilisant un pool de sérums provenant de patients qui étaient positifs ou négatifs pour la schistosomiase suivant des examens coprologique. Une distinction claire entre ces deux bassins de sérums a été observée. Toutefois, lorsque le test a été utilisé pour dépister des patients du Sénégal, il a échoué à fournir une discrimination satisfaisante entre les individus infectés et non-infectés par la schistosomiase.Le test ELISA pour FhCL1 a été optimisé à l'aide de sérums provenant de personnes cubaines infectées par la fasciolose et de patients non-infectés de Cuba et du Canada. Nous avons déterminé la dilution optimale pour l'anticorps primaire et également évalué et comparé la performance des anticorps secondaires conjugués contre les IgG totaux, IgG4, IgG1 et IgG2. Les IgG totaux ont fourni la meilleure discrimination entre les personnes infectées et non-infectées par la fasciolose avec une sensibilité et une spécificité de 99.99 %. En plus, en appliquant le test de dépistage sur des patients infectés par d'autres variétés de vers et de protozoaires, nous avons démontré que le test ELISA pour FhCL1 ne réagit pas de façon croisée avec d'autres maladies retrouvées couramment dans les régions géographiques où se trouve la fasciolose.En conclusion, le diagnostic de la schistosomiase humaine reste encore incertain et d'autres études doivent être effectuées pour améliorer notre test de dépistage utilisant SmCB. D'autre part, nous avons développé un test simple, sensible, spécifique et précis pour le dépistage de la fasciolose humaine en utilisant FhCL1, une protéase majeure relâchée par le parasite. Le système d'expression de P. pastoris nous a permis d'obtenir jusqu'à 80 mg de FhCL1 par 4 litres de culture. Dans la présente étude, nous avons non seulement mis au point un test standardisé démontrant une spécificité et une sensibilité élevées, mais également développé une procédure pour produire de grandes quantités d'antigènes nécessaires au dépistage à grande échelle de la fasciolose humaine dans les régions touchées.
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Solomon, Jonathan. "The localization and «in vitro» detection of «Brugia malayi» secreted proteins." Thesis, McGill University, 2009. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=32546.
Full textAbstract:
Products excreted or secreted (ES) by parasitic nematodes may contribute to the processes of infection and tissue migration of the parasite, modulating the host immune response and host physiology. These ES products allow the parasite to persist and survive in conditions that would otherwise bar or destroy them. cDNAs encoding three known secreted proteins of Brugia malayi was cloned for expression in E. coli and subsequent protein purification. These proteins were chosen because they have been reported to be secreted and to play roles in immune evasion. These proteins include: macrophage inhibitory factor 1 (MIF-1), a tumor protein homologue (TPH-1) and a cysteine protease inhibitor (CPI-2). Antibodies were raised to all of these secreted proteins. The secreted protein CPI-2 was localized to a specific region of microfilariae of B. malayi and the basic anatomy of this parasitic stage was observed by means of confocal microscopy. The protein was found to be localized to the secretory pore, which appears to be regulated by musculature. Biotinylated Sandwich ELISAS were developed to detect these secreted proteins in cultures of two stages and both sexes of B. malayi.Les produits sécrétés ou excrétés de nématodes parasitiques pourraient contribuer aux processus d`infection et de migration dans les tissues, tout en modulant le système immunitoire et la physiologie de l`hôte. Ces produits permettent au parasite de survivre dans des conditions infavorables. Trois protéines sécrétées du nématode parasitique Brugia malayi ont été clonées et produites dans du E.coli. Celles-ci ont ensuite été purifiées. Ces protéines se trouvent à être: la macrophage inhibitory factor 1 (MIF-1), la tumor protein homologue (TPH-1) et la cysteine protease inhibitor (CPI-2). CPI-2 a été localisée dans une région délimitée de la microfilaria du B.malayi et l`anatomie de ce stage parasitaire a été observé à l`aide de la microscopie confocale. La région délimitée où cette protéine est sécrétée se trouve à être le pore sécrétoire. Le pouvoir sécrétoire de ce pore semble être contrôlé par la musculature du nématode. Des ELISAs Sandwich Biotinylés ont été développés pour détecter la présence de MIF-1, TPH-1 et CPI-2 dans les différents stages de développement du B.malayi et dans les deux sexes de ce nématode.
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Moreno, Yovany. "Characterization of secretory processes and the secretome of parasitic nematodes." Thesis, McGill University, 2012. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=106464.
Full textAbstract:
Relatively little is known about the molecular mechanisms displayed by parasitic nematodes to infect a host; however, it has been generally recognized that successful parasitic nematode infections rely on their ability to release a variety of products commonly named Excretory-Secretory Products (ESP). To gain a deeper understanding of the mechanisms that lead to the establishment of filarial nematode infections, we collected and analyzed through 1D-SDS PAGE and LC-MS/MS the ESP of Brugia malayi adult females, adult males and microfilariae, one of the etiological agents of human lymphatic filariasis. 228 proteins were identified through this approach, including several proteins with potential immunoregulatory properties. Subsequent work using an immunohistochemical approach allowed for the definition of 3 anatomical expression patterns in B. malayi microfilariae for a representative group of 5 ESP. All of these patterns involved localization in the microfilarial Excretory-Secretory apparatus, a specialized anatomical feature involved in protein release that in this life stage was found to be associated to a muscle structure. Glutamate-gated chloride channels (GluCls), the main target of the antiparasitic drug ivermectin (IVM), were also located at this structure, suggesting that protein release from the Excretory-Secretory apparatus is enhanced by neuromuscular activity regulated by GluCls. Consistent with these observations, a marked reduction in protein release by microfilariae upon in vitro IVM exposure was shown. It is proposed that under in vivo conditions, the rapid microfilarial clearance induced by IVM treatment is the result of the suppression of the parasite's ability to secrete proteins that enable evasion of the host immune system. Finally, it is anticipated that elucidation of specific features associated with each of the different parasitic nematode lifestyles would require the comparison of ESP composition from several nematode species. To overcome the limitations associated with the lack of sequence information in most nematode species required for the database searching strategy in MS-based proteomic analysis, the use of transcriptomic next-generation sequencing (RNA-seq) de novo assemblies is explored to identify the ESP composition of the mouse gastrointestinal (GI) parasitic nematode Heligmosomoides polygyrus. 209 proteins were identified using this strategy. The list also includes proteins with potential involvement in immunoregulation, modulation of signalling pathways and nutrient transport and/or uptake. The results presented here are useful to understand the roles of proteins released by filarial and GI nematodes in immune evasion events and other aspects of the host-parasite relationship.Les mécanismes moléculaires déployés par les parasites pour s'établir dans leur hôtes sont relativement méconnus; néanmoins, il est généralement accepté que le succès des infections par les nématodes parasitaires dépend de leur capacité à libérer une variété de produits dénommés produits d'excrétion-sécrétion (PES). Afin d'acquérir une meilleure connaissance des mécanismes qui conduisent à l'établissement d'infections de nématodes filaires, nous avons recueilli et analysé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (1D-SDS-PAGE) et par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de mases ( LC-MS/MS) les PES des adultes mâles et femelles et des microfilaires de Brugia malayi, l'un des agents étiologique de la filariose lymphatique humaine. Grâce à cette approche, 228 protéines ont été identifiées, incluant plusieurs protéines possédant potentiellement des propriétés immunorégulatrices. Des travaux ultérieurs utilisant une approche immunohistochimique ont permis de définir trois profils d'expression anatomique pour un groupe représentatif de 5 PES chez les microfilaires de B. malayi. Pour tous ces profils, les protéines ont été localisées au niveau de l'appareil d'excrétion-sécrétion des microfilaires. Cette structure anatomique spécialisée est impliquée dans la libération de protéines et, chez ce stade de développement du parasite, elle est associée à une structure musculaire. Nous avons aussi montré que les canaux chloriques glutamate-dépendants (GluCls), la cible principale du médicament antiparasitaire ivermectine (IVM), étaient également localisés dans cette structure, ce qui suggère que la libération de protéines par l'appareil d'excrétion-sécrétion est renforcée par l'activité neuromusculaire régulée par des GluCls. Ces résultats concordent avec l'observation in vitro d'une réduction marquée de la libération de protéines par les microfilaires exposés à l'IVM. Il est proposé que, dans des conditions in vivo, l'élimination rapide des microfilaires induite par traitement avec l'IVM est causée par la suppression de la capacité du parasite à sécréter des protéines lui permettant d'évader le système immunitaire de l'hôte. Finalement, il est prévu que l'élucidation des caractéristiques spécifiques associées à chacun des différents modes de vie des nématodes parasitaires requerrait la comparaison de la composition des PES de plusieurs espèces de nématodes. Ces comparaisons, qui requièrent l'emploi d'une stratégie de recherche des résultats des MS générés lors des analyses protéomiques sur des banques de données des protéines, sont fortement limitées par l'absence d'information sur les séquences pour la plupart des espèces de nématodes. Pour contourner ces limitations, nous avons essayé l'utilisation des assemblages de novo du séquençage transcriptomique de nouvelle génération (RNA-seq) afin d'identifier la composition des PES du nématode gastrointestinal (GI) chez la souris Heligmosomoides polygyrus. 209 protéines ont été identifiées en utilisant cette stratégie. La liste comprend aussi des protéines ayant une implication potentielle dans l'immunorégulation, la modulation des voies de signalisation et le transport et/ou l'absorption de nutriments. Les résultats présentés dans cette thèse permettent de mieux comprendre le rôle des protéines libérées par des nématodes filaires et GI dans les événements d'évasion immunitaire et dans d'autres aspects de la relation hôte-parasite.
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Diawara, Aïssatou. "Development of DNA assays for the detection of single nucleotide polymorphism associated with benzimidazole resistance, in human soil-transmitted helminths." Thesis, McGill University, 2008. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=19242.
Full textAbstract:
Soil-transmitted helminths are parasitic worms of humans, causing many disabilities in tropical parts of the developing world. Control programs such as "The Focussing Resources on Effective School Health” (FRESH) Partnership have been implemented to remove human soil transmitted nematodes through large-scale use of benzimidazole anthelmintic drugs for school-aged children in developing countries. The benzimidazole drugs, albendazole and mebendazole are used as a single annual dose in areas where the burden is high. Unfortunately, there is concern that increased use of anthelmintics in children could select for resistant populations of these human parasites. In filarial nematodes, a single amino acid substitution from phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr), known to be associated with benzimidazole resistance in other nematodes, has been found in parasite ß-tubulin at position 200. We have developed pyrosequencer assays for the codon 200 in Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, and the hookworm Necator americanus to screen for this single nucleotide polymorphism (SNP). Assays for this resistance-associated SNP could be useful for monitoring for anthelmintic resistance in control programs. These assays have been tested on adult worms from a benzimidazle-naïve population in Kenya. Following this, these assays have been applied on individual worms, pooled eggs and pooled larvae from people in East Africa, the Caribbean and Central America where mass drug anthelmintic programs have been implemented. The 200Tyr SNP was detected in T. trichiura from non-treated people and in T. trichiura and N. americanus from benzimidazole-treated people.Les géo-helminthes sont des vers parasitant l'Homme et causant de nombreux handicaps dans les régions tropicales des pays en voie de développement. Des programmes de contrôles tels que le partenariat FRESH : ''Focussing Resources on Effective School Health'' ont été mis en place afin d'éliminer les géo-helminthes en administrant massivement en milieu scolaire des pays en voie de développement des medicaments anthelmintiques. L'albendazole et le mébendazole appartiennent au groupe des benzimidazoles et sont distribués dans les régions grandement infestées. Cependant, cette attribution massive de médicaments, aux enfants, pourrait entraîner une sélection de parasites résistants aux anthelmintiques. La substitution de l'acide aminé phénylalanine (Phe) par la tyrosine (Tyr) connue pour être associée à la résistance aux benzimidazoles chez les nématodes a été identifiée chez les filaires à la position 200 du gène de la ß-tubuline. Nous avons développés des tests pour les parasites Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides et Necator americanus en utilisant la méthode du pyroséquençage afin de détecter le polymorphisme d'un unique nucleotide (SNP) au niveau du codon 200 du gène de la ß-tubuline. Ce test a été appliqué sur des vers adultes provenant d'individus du Kenya n'ayant jamais été traités par des anthelmintiques. Puis ce même test a été appliqué à des vers adultes individuels, à des pools d'œufs et de larves provenant d'individus d'Afrique de l'est, des Caraïbes et d'Amérique centrale, où les programmes de contrôles de masse sont implantés. Le SNP fût détecté chez T. trichiura provenant d'individus non-traités aux benzimidazoles ainsi que chez T. trichiura et N. ameri
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Gomez, Gonzalez Maria. "«Leishmania»-macrophage interactions: regulations of protein tyrosine phosphatases and its implication in the outcome of infection." Thesis, McGill University, 2009. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=40736.
Full textAbstract:
The outcome of Leishmania infection depends both on host and pathogen factors. Macrophages, the specialized host cell for uptake and intracellular development of Leishmania parasites, play a central role in the control of infection. Underlying their effector and accessory functions is the activation of signalling pathways, which in turn are largely controlled by events of protein phosphorylation. Consequently, the regulation of protein kinase and phosphatase activities results critical for the sequential progression of the signalling cascade, and therefore for the control of antimicrobial and inflammatory phagocyte functions. This doctoral thesis discusses novel mechanisms of protein tyrosine phosphatase (PTP) regulation in the context of Leishmania-macrophage interactions. Herein are presented two events in which, independently, host and pathogen factors orchestrate the differential regulation of macrophage PTP activity. Chapter 2 describes the role of NRAMP-1 on macrophage PTP activity modulation. These investigations led to discover that iron, a metal substrate of NRAMP-1, inhibits PTP activity, resulting in the upregulation of leishmanicidal macrophage functions, through the positive regulation of JAK/STAT and MAPK signalling. Furthering these observations, an in depth study of the mechanisms underlying iron-dependent PTP inhibition (presented as Chapter 3), identified mononuclear dicitrate iron citrate complexes as specific PTP inhibitors. Despite the role of macrophages as efficient accessory and effector immune cells, Leishmania has evolved strategies to downregulate host cell functions. This is largely mediated by the parasite-induced activation of macrophage PTPs. In Chapter 4 we identified PTP1B and TCPTP as two novel PTPs engaged upon Leishmania infection. More importantly, we unravel an intimate interaction between the Leishmania surface protease GP63 and host PTPs, revealing a novel mechanism of PTP cleavage-dependent activation. Collectively,L’issue d’une infection avec Leishmania dépend de la réponse de l’hôte ainsi que des facteurs pathogéniques. Le macrophage, la cellule hôte, est spécialisée dans l’internalisation et le développement intracellulaire du parasite Leishmania et joue un rôle clé dans le contrôle de l’infection. Les fonctions effectrices et accessoires du macrophage proviennent de l’activation des voies signalétiques, qui à leur tour sont largement contrôlées par des événements de phosphorylation de protéines. Donc, la régulation de l’activité des protéines kinases et phosphatases devient essentielle dans la progression séquentielle d’une cascade signalétique et, par conséquent, dans le contrôle des fonctions inflammatoires et antimicrobiales du phagocyte. Cette thèse doctorale propose de nouveaux mécanismes de régulation des protéines tyrosine phosphatases (PTPs) dans le cadre des interactions entre le macrophage et Leishmania. Dans cette étude, nous présentons deux événements dans lesquels des facteurs de l’hôte ainsi que du parasite influencent, de façon indépendante, la régulation différentielle de l’activité PTP du macrophage. Le Chapitre 2 décrit le rôle du NRAMP-1 dans la modulation de l’activité PTP du macrophage. Ces recherches nous ont conduits à découvrir que le fer, un métal substrat du NRAMP-1, inhibe l’activité PTP, ayant comme effet l’augmentation des fonctions leishmanicides du macrophage en régulant de façon positive les voies signalétiques JAK/STAT et MAPK. En plus de ces observations, dans une étude plus approfondi des mécanismes responsables de l’inhibition des PTPs dépendents du fer (présentées dans le Chapitre 3), nous avons identifié les complexes mononucléaires dicitrate fer citrate comme des inhibiteurs spécifiques des PTPs.Malgré le rôle central du macrophage comme cellule accessoire et effectrice du système immunitaire, Leishmania a développé des stratégies afin de ré
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Odiere, Maurice. "Energetic, morphologic and physiologic responses during «Heligmosomoides bakeri» (Nematoda) infection and protein deficiency in pregnant and lactating mice." Thesis, McGill University, 2010. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=95137.
Full textAbstract:
This research investigated the concurrent effects of a gastrointestinal nematode infection Heligmosomoides bakeri, pregnancy, and protein deficiency (PD) during late pregnancy throughout lactation on energetic, morphologic and immunological responses in CD1 mice and their offspring. Our novel findings can be summarized broadly into three key themes: (i) energetics and resting metabolic rate, (ii) bone metabolism and (iii) immune development. This work highlights the largely independent ways in which the mouse responds to competing demands of pregnancy, infection, and PD. Pregnancy increased RMR while PD lowered RMR; a trickle infection was not associated with any change. During pregnancy, these additional energetic demands were met by increased food intake and fat utilization. During infection mice lowered their body temperature. Finally, the reduction in RMR during PD was associated with higher serum corticosterone and leptin concentrations. A second novel finding was that both infection and PD impacted on maternal and neonatal bone development. Infection lowered maternal femur bone area which was associated with elevated serum IFN-γ in heavily infected pregnant mice and reduced foetal crown-rump length consistent with higher amniotic fluid IL-1β. Lower bone mineralization in PD dams was associated with elevated serum corticosterone and leptin whereas it was associated with elevated serum IL-1β and IL-6 during infection. The elevated serum IL-1β, lower leptin and IGF-1 in pups of PD and infected dams were consistent with the shorter crown-rump length. Finally, we explored for the first time the impact of maternal PD and infection on neonatal immune development. Both maternal infection and PD reduced lymphoid organ mass in pups whereas the percentage of T cells and T:B cell ratio in the spleen was increased only by maternal PD. These changes were associated with elevated corticosterone and IL-6 concentration in milk, and lower pup serum leptin and IGF-1 iL'impact sur les réactions immunologiques, énergétiques et morphologiques a été étudié suite à une combinaison de facteurs tels une infection par Heligmosomoides bakeri, un nématode du système gastro-intestinal, la grossesse et la déficience protéique (DP) durant les derniers mois de grossesse et pendant la lactation chez les souris CD1 et leur descendance. Nos découvertes peuvent se résumer selon trois thèmes clés: (i) énergétique et métabolisme de base (MB), (ii) métabolisme osseux et (iii) développement immunitaire. Ce travail met en évidence les diverses voies indépendantes utilisées par la souris pour répondre à trois évènements: la grossesse, l'infection et la DP. La grossesse a augmenté le MB tandis que la DP l'a diminué. Une infection peu sévère n'a été associée à aucun changement. Durant la grossesse, les besoins énergétiques supplémentaires ont été comblés en augmentant l'apport nutritionnel et l'utilisation des graisses. Pendant la période d'infection, la température corporelle des souris a diminué. Enfin, la réduction du MB lors de la DP a corrélé avec une plus grande concentration de corticostérone et de leptine. Notre seconde découverte montre que l'infection et la DP ont un impact sur le développement osseux maternel et néonatal. L'infection a diminué l'os du fémur et a entraîné une forte concentration d'IFN-γ dans le sérum des souris gestantes fortement infectées. Elle a aussi diminué la distance vertex-coccyx tout en augmentant IL-1β dans le fluide amniotique. Une plus faible minéralisation osseuse chez les souris souffrant de DP coïncidait avec une forte concentration de corticostérone et de leptine dans le sérum bien qu'elle coïncidait avec une forte concentration d'IL-1β et d'IL-6 lors de l'infection. Une concentration élevée de IL-1β mais plus faible de leptine et de IGF-1 chez les souriceaux de mères infectées et souffrant de DP était compatible avec des distances$
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Abu, Dayyeh Issa. "Alteration of macrophage signalling and functions by the protozoan parasite «Leishmania»." Thesis, McGill University, 2009. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=66771.
Full textAbstract:
Parasites of the genus Leishmania are able to secure their survival and propagation within their host by altering key signalling pathways involved in the ability of macrophages (MØs) to directly kill pathogens or to activate cells of the adaptive immune system. One important step in this immune evasion process is the Leishmania-induced activation of host protein tyrosine phosphatase SHP-1. SHP-1 has been shown to directly inactivate JAK2 and Erk1/2, and to play a role in the negative regulation of several transcription factors involved in MØ activation such as: NF-B, STAT-1α, and AP-1. These signalling alterations contribute to the inactivation of critical MØ functions such as the production of IFN-γ-induced nitric oxide (NO), a free radical associated with parasite killing and clearance. In addition to interfering with IFN-γ receptor signalling, Leishmania is able to alter several LPS-mediated responses (e.g. IL-12, TNF-α, NO production) through mechanisms not yet fully understood. A main goal of this study was to better understand the mechanisms used by the parasite to block Toll-like receptor (TLR)-mediated functions. Experiments performed revealed a pivotal role for SHP-1 in the inhibition of TLR-induced MØ activation through binding to and inactivating IL-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK-1). We identified the binding site as an evolutionarily conserved ITIM-like motif, which we named kinase tyrosine-based inhibitory motif (KTIM). Further experiments and sequence analysis revealed that several cytosolic kinases other than IRAK-1 possess potential KTIMs, suggesting it could represent a regulatory mechanism widely used by kinases. The final experimental section aimed to explore the differential ability of the two different stages of Leishmania, promastigotes and amastigotes, to alter MØ signalling and function. In conclusion, this work uncovers a new mechanism whereby Leishmania is ableLes parasites du genre Leishmania assurent leur survie et leur propagation par l'altération de voies de signalisation impliquées dans la capacité des macrophages (MØs) à détruire directement les pathogènes ou à activer les cellules du système immunitaire acquis. Une étape critique de ce mécanisme d'inactivation est l'activation par Leishmania de la protéine phosphatase SHP-1 de la cellule hôte. Il a été démontré que la protéine SHP-1 peut inactiver directement JAK2 ainsi que Erk1/2 et joue un rôle dans la régulation négative de plusieurs facteurs de transcription, tels que NF-κB, STAT-1α et AP-1, impliqués dans l'activation des MØs. L'altération de ces voies de signalisation contribue à l'inactivation de fonctions critiques des MØs telle que la production d'oxyde nitrique (NO) induite par l'IFN-γ, un radical-libre impliqué dans l'anéantissement du parasite. En plus d'inhiber les fonctions engendrées par l'IFN-γ, Leishmania est capable d'inhiber de nombreuses fonctions induites par le LPS, incluant la production d'IL-12, de TNF-α et de NO, et cela par des mécanismes encore peu compris. Le but principal de cette étude était de mieux comprendre les stratégies employées par le parasite afin d'inhiber les fonctions induites par les Toll-like receptors (TLRs). Nos résultats révèlent le rôle critique de SHP-1 dans l'inhibition de l'activation des MØs induite par les TLRs, par l'interaction et l'inactivation de la kinase 1 associée au récepteur IL-1 (IRAK-1). Nous avons également identifié le site de liaison qui semble être un motif conservé lors de l'évolution ressemblant à un ITIM, que nous avons nommé motif de kinase à base de tyrosine inhibiteur (KTIM). Des expériences supplémentaires et l'analyse de séquences ont révélées que plusieurs autres kinases cytosoliques autres qu'IRAK-1 possèdent un motif potentiel KTIMs, suggérant que le KTIM pourrait$
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McLean, James. "Purification and characterization of the Leishmania PTS2 receptor, Peroxin 7, an essential receptor for glycosme biogenesis." Thesis, McGill University, 2012. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=110401.
Full textAbstract:
The trypanosomatid parasite Leishmania infects 12 million people in tropical countries. This neglected tropical disease causes debilitating and often fatal consequences in the absence of chemotherapeutic intervention. Consequently, there is a need to identify new drug targets to combat the increasing incidence of resistance to current treatments. An attractive drug target in these parasites is the glycosome, a unique microbody organelle that compartmentalizes several essential enzymatic pathways behind an impermeable membrane. The Leishmania major Peroxin 7 (LPEX7) is a receptor protein that recognizes glycosomal matrix proteins containing an N-terminal peroxisomal targeting signal 2 (PTS2) and facilitates the trafficking of these proteins across the glycosomal membrane. Genetic studies in the related trypanosomatid parasite, Trypanosoma brucei, have demonstrated that PEX7 is essential for parasite viability. LPEX7 is predicted to have a hydrophobic outer surface which has made production of this recombinant protein in the E. coli heterologous system challenging. LPEX7 was successfully purified in the presence of non-ionic detergents, however, this limited the usefulness of this protein in regards to downstream in vitro studies with glycosomal membranes. To investigate the biophysical role of LPEX7 in the trafficking and import of proteins into the glycosome, we have developed a strategy to reliably express and purify recombinant Leishmania PEX7 in the absence of detergents. Subsequent biochemical studies confirmed that the recombinant LPEX7 was functionally active and, like the native protein or detergent purified protein, binds LdPEX5 and PTS2 cargo proteins with nanomolar affinities. Initial investigations of the quaternary structure demonstrated that LPEX7 is in equilibrium between a dimer and tetramer in solution. Preliminary protein-protein interaction domain mapping studies have demonstrated that the C-terminal half LPEX7 was sufficient to bind both LdPEX14 and LdPEX5.Le parasite trypanosomatide Leishmania affecte plus de 12 millions d'individus dans les pays tropicaux. Cette maladie tropicale négligée a de graves conséquences, parfois fatales, en absence d'interventions thérapeutiques. Il y a, par conséquent, urgence d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour combattre ce fléau et restreindre l'incidence de résistance envers les médicaments présentement employés. Une cible thérapeutique de choix s'est révélée récemment dans cette famille de parasite. Il s'agit du glycosome, un organelle qui compartimente plusieurs voies métaboliques derrière une membrane imperméable. La Péroxine 7 de Leishmania major (LPEX7) est un récepteur cytosolique qui reconnaît certaines protéines destinées pour le glycosome contenant un signal peptidique de type 2 (PTS-2) à leur terminal N et qui facilite le transport vers la membrane du glycosome. Récemment, des études génétiques sur le parasite trypanosomatide Trypanosoma brucei ont démontré que PEX7 est essentiel pour la survie du parasite. Des prédictions bio-informatiques révèlent que LPEX7 contient une surface extérieure hydrophobe, ce qui explique le défi que représente la production de cette protéine de façon recombinante dans le système E. coli. LPEX7 fut purifiée avec succès en présence de détergents ioniques, ce qui a toutefois limité les possibilités d'études d'interactions avec des membranes. Dans le but d'étudier le rôle biophysique de LPEX7 dans le transport et l'importation de protéines vers le glycosome, nous avons développé une stratégie pour exprimer et purifier LPEX7 de façon recombinante en l'absence de détergents. Ensuite, nos études biochimiques ont confirmé que LPEX7 recombinante est active et, tout comme LPEX7 précédemment purifiée avec l'aide de détergents, est capable de lier les protéines contenant un signal PTS-2 et LdPEX5 à des concentrations nano-molaires. Une investigation de la structure quaternaire de LPEX7 a révélé que le récepteur s'assemble en dimères et tétramères en solution. Finalement, des études préliminaires d'interaction protéine-protéine ont illustré que LPEX7 contient un site d'attachement pour LdPEX5 et LdPEX14 sur la demie portion terminale C.
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Moncada, Darcy Marie. "Entamoeba histolytica cysteine proteinases facilitate parasite invasion of the colon by disrupting the colonic mucus barrier." Thesis, McGill University, 2005. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=85940.
Full textAbstract:
The protozoan parasite Entamoeba histolytica is the etiological agent of human amebiasis. Trophozoites colonize the colonic mucus layer and may invade the epithelium subsequent to overcoming the mucus barrier. MUC2 is the major gel-forming mucin secreted by goblet cells in the colon and serves to maintain epithelial barrier function as well as acting as a major host defense against invading pathogens. The polymerization of MUC2 monomers via the N- and C- terminal cysteine rich D-domains is essential for mucus gel formation and confers protection to the underlying mucosa. Amoebae secrete cysteine proteinases, glycosidases and an unidentified mucus secretagogue, which may play a role in overcoming the protective mucus barrier. We hypothesize that E. histolytica cysteine proteinases as well as glycosidases are involved in mucus degradation and weakening of the mucus barrier by disrupting mucin polymerization. Amoebae secreted cysteine proteinases were shown to degrade the cysteine rich regions of MUC2 involved in polymerization and abrogate its protective function. More importantly, the major E. histolytica surface proteinase, cysteine proteinase 5 (EhCP5) was shown to specifically degrade [35S]cysteine labeled colonic mucin as effectively as secreted components. Moreover, trophozoites genetically engineered to express low levels of CP activity were incapable of traversing a mucus barrier and destroying the underlying epithelium, indicating a strong dependence between amebic invasiveness and cysteine protease activity. In addition, we have demonstrated that EhCPs specifically target the MUC2 C-terminus resulting in destabilization of the mucin polymeric network. Parasite glycosidase activity was also shown to contribute to mucin oligosaccharide degradation. Taken together, these results indicate that E. histolytica can substantially weaken the colonic mucus barrier via proteolytic degradation and glycosidase activity to compromise the gel and
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Taman, Amira. "Characterization of novel glutamate and dopamine neurotransmitter receptors in the bloodfluke Schistosoma mansoni." Thesis, McGill University, 2011. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=97063.
Full textAbstract:
Schistosomes are among the most complex parasites affecting humans. They are dioecious parasites with an indirect life cycle that requires two hosts, a snail intermediate host and a human definitive host. The complexity of the life cycle is made possible, in part by the parasite's nervous system, which coordinates behavior and all major physiological activities of the worm. Neuronal signaling in schistosomes is mediated by a variety of neurotransmitters and associated receptors. Among these transmitters are dopamine and the neuroactive amino acid, glutamate. Both have been implicated in the control of neuromuscular function and movement but their mode of action is largely unknown. Here we provide the first molecular evidence for the existence of dopamine and glutamate receptors in Schistosoma mansoni. Two glutamate receptors were identified: One (SmGluR) is distantly related to heptahelical (metabotropic) glutamate receptors from other species and the other (SmGBP) is an unusual, truncated receptor that resembles the extracellular binding domain of glutamate receptors but lacks the remaining heptahelical transmembrane sequence. When expressed heterologously in vitro, SmGluR and SmGBP were both responsive to glutamate but did not recognize many classical (mammalian) glutamate agonists and antagonists, suggesting these are novel receptors with different pharmacological properties. Immunolocalization studies revealed that the two glutamate receptors have different tissue distributions. SmGluR is strongly expressed in neurons of the central and peripheral nervous system, including the peripheral innervation of the body wall muscles and the acetabulum, and it is also present in the female reproductive tract. In contrast, SmGBP is male-specific and was found only in the tegument, particularly the tubercles. The third receptor described in this thesis, SmD2, is structurally related to dopaminergic type 2 receptors and it is selectively activated by dopamine in vitro. SmD2 is localized entirely in the body wall musculature of both male and female worms and larvae. Together these results suggest that SmD2 and SmGluR could play important roles in the control of schistosome movement, SmD2 by targeting the musculature directly, whereas SmGluR works indirectly via the innervation of the musculature. The results also identify novel functions for glutamate receptors in the control of the acetabulum (SmGluR), egg production in females (SmGluR) and the tubercles of the male tegument (SmGBP). The widespread distribution of these receptors, combined with their unusual structures and pharmacological profiles, make them promising targets for discovery of new anti-schistosomal drugs.Schistosoma est une des espèces les plus complexes de parasites humains. Il est dioïque et requiert un cycle de vie indirect : un hôte intermédiaire, l'escargot, et un hôte définitif, l'homme. Le système nerveux du parasite contrôle le comportement et toutes les activités physiologiques importantes et est en grande partie responsable de la complexité du cycle de vie du parasite. La signalisation neuronale des schistosomes est médiée par une variété de neurotransmetteurs et récepteurs correspondants, dont la dopamine et le glutamate. Ces transmetteurs régissent en partie les fonctions neuromusculaires et le mouvement, mais leur mode d'action demeure inconnu. Cette étude divulgue l'existence de récepteurs de la dopamine et du glutamate chez Schistosoma mansoni. Deux récepteurs de la dopamine ont été identifiés : SmGluR est indirectement associé au domaine heptahélice (métabotropique) des récepteurs du glutamate chez d'autres espèces, et SmGBP est un récepteur tronqué qui ressemble au domaine de liaison extracellulaire des récepteurs du glutamate dont la séquence transmembranaire heptahélice est absente. SmGluR et SmGBP sont tout deux sensibles au glutamate lorsqu'exprimés in vitro de façon hétérologue, mais ne reconnaissent pas plusieurs agonistes et antagonistes classiques (mammaliens) du glutamate. Cela suggère que ce sont de nouveaux récepteurs ayant des propriétés pharmacologiques différentes. Ces deux récepteurs du glutamate ont une expression tissulaire différente : SmGluR est fortement exprimé dans les neurones du système nerveux central et périphérique, et l'innervation périphérique des muscles de la paroi corporelle et de l'acétabulum, ainsi que dans le système reproductif de la femelle. Par contre, SmGBP est spécifique aux mâles et ne s'exprime que dans le tégument, particulièrement les tubercules. Le troisième récepteur identifié, SmD2, est structurellement lié aux récepteurs dopaminergiques de type 2, et sélectivement activé in vitro par la dopamine. SmD2 est uniquement retrouvé dans la musculature de la paroi corporelle chez les vers adultes et les larves des deux sexes. SmD2 et SmGluR semblerait donc important quant à la mobilité des schistosomes. SmD2 ciblerait la musculature directement, et SmGluR agirait indirectement sur l'innervation musculaire. Ces résultats définissent aussi de nouvelles fonctions des récepteurs du glutamate : le contrôle de l'acétabulum (SmGluR), la production des œufs chez les femelles (SmGluR) et des tubercules du tégument chez les mâles (SmGBP). La grande distribution de ces récepteurs combinée à leurs structures et profils pharmacologiques inhabituels en font des cibles prometteuses quant au développement de nouvelles thérapies contre la bilharziose.
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Godoy, Rosas Pablo. "Functional analysis of «Haemonchus contortus» P-glycoprotein-A and interaction with macrocyclic lactones." Thesis, McGill University, 2011. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=97122.
Full textAbstract:
Macrocyclic lactone (ML) resistance has been described in the parasitic nematode, Haemonchus contortus. One of the mechanisms involved could be the over expression of P-glycoproteins (Pgps) which are ABC transporters. These proteins may influence the concentration of MLs that reach their target. In H. contortus one ABC transporter that is overexpressed in ML resistant parasites is Pgp-A (HcPgp-A). The goal of this project was the expression of HcPgp-A, in transfected LLC-PK1 cells, and to see the effect of ivermectin and moxidectin on inhibition of rhodamine 123 transport by the transfected cells. Rhodamine123 was actively transported by HcPgp-A. Ivermectin was four fold more potent at inhibiting rhodamine 123 transport by HcPgp-A than was moxidectin. The work provides the first information showing that MLs can inhibit the transport of Pgp substrates by a parasitic nematode ABC transporter and may indicate an active role for H. contortus Ppgs in ML resistance.La résistance aux lactones macrocycliques (LM) est bien connue chez le parasite nématode Haemonchus contortus. La surexpression de P-glycoprotéines (Pgp), qui sont des ABC transporteurs, pourrait être impliquée dans un des mécanismes de la résistance aux LM. Ces protéines peuvent influencer la concentration de LM qui atteint leur cible. Pgp-A (HcPgp-A) est un ABC transporteur d' H. contortus qui est surexprimé chez les parasites résistants aux LM. Le but de cette étude était d'exprimer la P-glycoprotéine-A d'H. contortus dans des cellules transfectées LLC-PK1 afin d'évaluer les effets de l'ivermectine et de la moxidectine sur l'inhibition du transport de la rhodamine 123. La rhodamine 123 s'est avérée être transportée activement par HcPgp-A. Les effets de l'ivermectine sur l'inhibition du transport de la rhodamine 123 par HcPgp-A étaient quatre fois plus importants que ceux de la moxidectine. L'étude a montré pour la première fois que les LM pouvaient inhiber le transport des substrats de la P-glycoprotéine grâce à un ABC transporteur d'un nématode parasite. Cette information pourrait indiquer un rôle actif des Pgps d'H. contortus dans la résistance aux LM.
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Janukavicius, Patrick. "dyf-7 is responsible for the low levels of ivermectin resistance in Caenorhabditis elegans strains IVR6 and IVR10." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=114329.
Full textAbstract:
Ivermectin has been a very useful drug for the control of diseases caused by helminths. However, the occurrence of drug resistant parasites is a major concern. In an attempt to mimic the conditions under which ivermectin resistance is selected for in the field, James and Davey (2009) generated the IVR6 and IVR10 Caenorhabditis elegans strains from a wild-type strain by growing them in the presence of sub-lethal doses of ivermectin for several generations. To better understand the mechanisms by which ivermectin resistance might arise, I have investigated the IVR6 and IVR10 strains. I found that the IVR6 and IVR10 strains are dye-filling defective (Dyf), a phenotype previously associated with ivermectin resistance. Our results indicate that IVR6 and IVR10 have the same level of ivermectin resistance. We discovered a frame shift mutation in the dyf-7 gene of both strains. The location of dyf-7 on the X-chromosome is consistent with the results of our resistance mapping experiment. IVR6 and IVR10's dye-filling phenotype is roughly 80% penetrant and we show that ivermectin can select for the phenotype. Only dye-filling defective worms can grow at 10 ng/ml ivermectin. We have tested four other dye-filling defective strains, including a strain carrying a mutant dyf-7 allele and all were ivermectin resistant. Preliminary results indicate that dyf-7 confers levamisole resistance, suggesting an alternate mechanism for multidrug resistance. Taken together, my results show that an allele of the dyf-7 gene is the cause of ivermectin resistance in the IVR6 and IVR10 strains and that the dendrite morphology phenotype of Dyf genes is essential for their ability to confer resistance.L'Ivermectine est un médicament qui a été très utile pour contrôler des maladies causées par les nématodes parasitiques. Cependant, le développement chez les parasites d'une résistance à ce médicament reste inquiétant. Ainsi, en reproduisant les conditions dans lesquelles les parasites développent une résistance à l'ivermectine, James et Davey (2009) ont généré deux souches de Caenorhabditis elegans, l'IVR6 et l'IVR10, en les cultivant sur une dose non-létale pour quelques générations. Afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de la résistance à l'ivermectine, j'ai étudié les souches d'IVR6 et d'IVR10. J'ai découvert que celles-ci sont déficientes en absorption de teinture, soit un phénotype associé à la résistance à l'ivermectine. Les résultats obtenus présentaient le même niveau de résistance pour les deux souches. De plus, nous avons découvert une mutation dans le gène dyf-7, aussi chez les deux souches. L'usage de la cartographie génétique qui utilise les polymorphismes pour un nucléotide (SNPs), m'a permis de déterminer que le locus de résistance est en accord avec le locus de dyf-7. Le phénotype de déficience d'absorption de teinture est pénétrant à 80% chez l'IVR6 et l'IVR10. Quant à l'ivermectine, celui-ci peut sélectionner pour ce phénotype. Seulement les vers déficients en absorption de teinture peuvent survivre sur 10 ng/ml d'ivermectine. J'ai examiné quatre autres souches qui sont déficientes en absorption de teinte, incluant une souche avec un allèle différent de dyf-7; elles démontrent toutes une résistance à l'ivermectine. Des expériences préliminaires indiquent que le dyf-7 induit une résistance à un autre médicament, lévamisole. Ce qui me suggère un nouveau moyen de développer la multirésistance. Pris dans leur ensemble, mes résultats montrent que l'allèle du gène dyf-7 est la cause de la résistance à l'ivermectine chez les souches d'IVR6 et d'IVR10 et que la malformation des dendrites chez les souches Dyf est essentielle au développement de la résistance.
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Patocka, Nicholas. "Identification of a serotonin transporter and serotonin receptor in «Schistosoma mansoni»: a step towards better understanding the serotonergic system." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=114120.
Full textAbstract:
Among the top list of neglected tropical diseases sits schistosomiasis, a parasitic disease caused by the flatworm Schistosoma. The disease involves an intermediate snail host and the definitive human host with infection taking place through the skin in contaminated water, one of the reasons for its wide distribution. The diversity of the life cycle stages and the ability of the parasite to have adapted to quite different environments speak to the complexity of the organism. The underlying system that coordinates and controls all biological functions of the parasite is its nervous system. Signalling in the nervous system is accomplished by the release of neurotransmitters and signal transduction through specific receptors. Of the many neurotransmitters identified thus far in the parasite, serotonin (5-hydroxytryptamine: 5HT) is one of the most abundant. 5HT has been implicated in several biological functions in flatworms, including muscle contraction, motility and metabolism, but its mode of action is poorly understood. Here we provide molecular evidence for a serotonin-specific transporter (SERT) in Schistosoma mansoni as well as a serotonin specific receptor in the same organism. The transporter (SmSERT) was shown to share similar topology to SERTs from other organisms, namely 12 transmembrane regions with several predicted glycosylation sites. In a heterologous expression system, we show that it mediates the uptake of serotonin in a dose-dependent manner and is responsive to classical SERT inhibitors. The transporter is expressed in all life cycle stages tested (cercaria, schistosomulum, and adult) with upregulation occurring in the parasitic stages. Immunolocalization studies showed that the protein is expressed primarily in the nervous system of the parasite, both in central and peripheral neuronal structures. Using RNA interference (RNAi) to knockdown expression, we found strong increases in motility, suggesting that its primary function is in termination of serotonin signalling. The serotonin receptor (Sm5HTr) is the first as such cloned from parasitic flatworms. It shares homology with other 5HT receptors and most closely identifies with the 5HT7 class of receptors. Expression in mammalian cells found that it signals through upregulation of cAMP and not Ca2+. Immunolocalization in adults and larvae found that the receptor is enriched in the central and peripheral nervous system. Additional pharmacological assays using Sm5HTr agonists and antagonists suggest that the receptor may contribute to 5HT-induced stimulation of worm motility. Combined, these results show that there is a fully functional serotonergic system in the parasite S. mansoni and that these proteins play an important role in controlling signal transduction. The wide distribution of these proteins in the parasite nervous system and their apparent involvement in motor control makes them tempting targets for drug design.Parmi la liste du haut des maladies tropicales négligées est assis la schistosomiase, une maladie parasitaire causée par le Schistosoma. La maladie implique un mollusque intermédiaires et hôte définitif de l'homme avec une infection en cours à travers la peau dans l'eau contaminée, l'une des raisons de sa large diffusion. La diversité des étapes du cycle de vie et de la capacité du parasite à avoir adapté à des environnements très différents parlent de la complexité de l'organisme. Le système sous-jacent qui coordonne et contrôle toutes les fonctions biologiques du parasite est son système nerveux. Signalisation dans le système nerveux est accompli par la libération des neurotransmetteurs et transduction du signal par récepteurs spécifiques. Parmi des nombreux neurotransmetteurs identifiés jusqu'à présent dans le parasite, la sérotonine (5-hydroxytryptamine : 5-HT) est l'un des plus abondants. 5HT a été impliqué dans plusieurs fonctions biologiques dans les vers plats, notamment contraction musculaire, la motilité et le métabolisme, mais son mode d'action est mal comprise. Ici nous fournir preuve moléculaire d'une transporteur de la sérotonine spécifique (SERT) au Schistosoma mansoni ainsi qu'un récepteur de la sérotonine spécifique dans le même organisme. Le transporteur (SmSERT) a été montré à partager la même topologie à SERT provenant d'autres organismes, à savoir 12 régions transmembranaire avec plusieurs sites de glycosylation prédits. Dans une expression hétérologue système, nous montrons qu'il négocie l'absorption de la sérotonine de manière dose-dépendante et est sensible aux inhibiteurs de SERT classiques. Le transporteur est exprimé dans toutes les étapes du cycle de vie testé (cercaria, schistosomula et adulte) avec regulation à la hausse survenant dans les stades parasitaires. Études immunolocalisation ont montré que la protéine est exprimée principalement dans le système nerveux du parasite, à la fois central et périphérique dans les structures neuronales. L'interférence ARN (ARNi) de rabattement d'expression, nous avons trouvé une forte augmentation de la motilité, suggérant que sa fonction principale est en cessation de signalisation de la sérotonine. Le récepteur de la sérotonine (Sm5htr) est le premier en tant que telle cloné à partir de vers plats parasitaires. Il partage homologie avec d'autres récepteurs 5HT et plus étroitement s'identifie à la classe des récepteurs 5-HT7. Expression dans des cellules de mammifères a constaté qu'il signale une regulation positive de l'AMPc et non de Ca2+. Immunolocalisation chez les adultes et les larves découvert que le récepteur est enrichi dans le système nerveux central et périphérique. D'autres essais pharmacologiques utilisant des agonistes et antagonistes suggèrent que le récepteur peut contribuer à la stimulation de la motilité du ver induite par la 5HT. Ensemble, ces résultats montrent qu'il existe un système sérotoninergique pleinement fonctionnel dans le parasite S. mansoni et que ces protéines jouent un rôle important dans le contrôle transduction du signal. La large diffusion de ces protéines dans le parasite système nerveux et leur implication apparente de commande de moteur fait d'eux des cibles tentantes dans la conception des médicaments.
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Leroux, Louis-Philippe. "Subversion of MHC-II antigen presentation by «Toxoplasma gondii» involves parasite secretory organelles and the modulation of host immune effectors in the endocytic pathway." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=114251.
Full textAbstract:
The obligate intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is a highly ubiquitous pathogen that infects virtually any warm-blooded animal. Although the infection generally remains asymptomatic in healthy individuals, the parasite invariably encysts. It has been shown that T. gondii is able to achieve this goal at least by interfering with MHC-II antigen presentation to dampen the development of the CD4+ T helper cell response and gain a head start on the host adaptive immune system. Previous reports have shown that T. gondii inhibits transcription of MHC-II and several other related genes, but the causative inhibitory molecules have yet to be identified.In an attempt to identify these molecules, a forward genetic screening strategy was initially elaborated, with a genome-wide insertional mutagenesis carried out in order to disrupt the genes encoding for the inhibitory molecules followed. By specifically isolating mutants unable to inhibit MHC-II expression and antigen presentation by flow cytometry, isolation of the disrupted loci and database mining could have enabled the identification by of the encoded inhibitory molecules. However, the screen was not carried out due to experimental limitations.Biochemical analyses were employed to further characterize the MHC-II inhibitory activity, revealing that this activity segregated with the high-speed supernatant (HSS) prepared from sonicated parasites and was enriched with increasing centrifugal speeds. The inhibitory activity was protein dose-dependent and was completely abrogated when the HSS was treated with a broad-spectrum protease. Subcellular fractionation revealed that the inhibitory activity was found in fractions enriched with secretory organelles, specifically rhoptries (ROP) and/or dense granules (GRA). Furthermore, excreted-secreted antigens (ESA) from freshly egressed tachyzoites displayed inhibitory activity. Proteins from ESA preparations were separated by a two-step fractionation using ion exchange chromatography followed size-exclusion chromatography, and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). Database mining of the MS/MS results generated a list of possible candidates, the majority of which originated from secretory organelles.Although MHC-II expression was inhibited, low levels of MHC-II molecules were still detected in infected or lysate-treated cells. Experimental results argued that the first layer of transcriptional regulation has to be complemented by a post-translational layer of interference in the host cell endocytic pathway, involving the MHC-II associated invariant chain (Ii), and peptide editor H2-DM. Ii mRNA and protein levels were induced in T. gondii-infected cells, while MHC-II and H2-DM IFN-induced expression was down-regulated. Ii accumulated in infected cells from 20 hour post-infection until host cell lysis, mainly in the ER. In Ii KO cells, the absence of Ii restored the ability of infected bone marrow-derived dendritic cells to present a parasite antigen in the context of MHC-II, arguing that Ii acts as a dominant negative on MHC-II-restricted antigen presentation of endogenously acquired parasite antigens. Keys host proteases, namely legumain, and cathepsins L and S, and the acidification of endosomal compartments were modulated by the parasite, pointing toward a wider manipulation of the host endocytic pathway by T. gondii. Opposing expression patterns of Ii and H2-DM had a drastic effect in vivo not only on parasite dissemination towards lymphoid organs, CD4+ T cell activation, and IFNγ production during acute infection, but also on cyst numbers and survival at the chronic phase of the infection. Altogether, these findings reveal a broader manipulation of host cell processes by T. gondii, and shed new light on the intricate interactions between intracellular pathogens and host cells, and their ability to subvert immune functions to establish successful infections.Le parasite protozoaire intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii, l'agent causant la toxoplasmose, est un pathogène ubiquitaire capable d'infecter tout animal à sang chaud. En dépit du fait que l'infection reste généralement asymptomatique chez les individus en bonne santé, le parasite s'enkyste inévitablement. Il a été démontré que T. gondii est capable d'atteindre ce but en partie en interférant avec la présentation d'antigène par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH)-II pour diminuer le développement de la réponse des cellules T CD4+ et pour ainsi devancer la réponse adaptative du système immunitaire. Il a été démontré que T. gondii inhibe la transcription de CMH-II et autres gènes liés, mais les molécules inhibitrices causatives restent inconnues.Pour identifier ces molécules, une stratégie pour un criblage génétique avait été élaborée. Une mutagénèse insertionelle à travers le génome devait être conduite pour perturber les gènes codant pour ces molécules inhibitrices, suivie d'un tri par cytométrie en flux de cellules infectées avec des mutants. En isolant les mutants incapables d'inhiber l'expression de CMH-II, l'isolement des locus génétiques et l'exploration des bases de données auraient pu permettre l'identification des molécules codées. Cependant, ce criblage ne fut complété dû à des limitations expérimentales. Des analyses biochimiques ont démontré que l'activité inhibitrice se retrouvait dans le surnageant d'haute-vitesse (HSS) préparé à partir de parasites soniqués, et était enrichie avec des vitesses de centrifugation croissantes. L'activité inhibitrice était dose-dépendante de protéines et était complètement abrogée lorsque le SHV était préalablement traité avec une protéase. Un fractionnement subcellulaire révéla que l'activité se retrouvait dans les fractions enrichies d'organelles sécrétoires (rhoptries et granules denses). Aussi, des antigènes excrétés-sécrétés (ESA) obtenus de tachyzoïtes fraîchement lysés possédaient une activité inhibitrice. Les protéines d'ESA furent séparées par fractionnement en deux étapes, commençant par une chromatographie par échange d'ions, suivi par une chromatographie d'exclusion par taille et analysées par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Les résultats obtenus furent comparés aux bases de données, et une liste fut dressée avec de candidats potentiels, la majorité d'entre eux provenant d'organelles de sécrétion.Malgré l'expression réduite, quelques molécules de CMH-II étaient détectés dans les cellules infectées ou traitées. Nos résultats démontrent que la régulation transcriptionelle doit être complémentée par une interférence au niveau post-traductionel dans la voie endocytique de la cellule hôte qui implique la chaîne invariante associée au CMH-II (Ii) et l'éditeur de peptide H2-DM. Les niveaux d'ARNm et de protéines d'Ii étaient induits dans les cellules infectées, alors que ceux de CMH-II et d'H2-DM étaient inhibés. Ii s'accumulait dans les cellules infectées dès 20 heures post-infection, principalement dans le RE. Dans les cellules Ii KO, l'absence d'Ii rétablit la capacité de cellules dendritiques à présenter un antigène du parasite dans le contexte de CMH-II, proposant ainsi qu'Ii agit comme un dominant négatif sur la présentation d'antigènes endogènes provenant du parasite. Des protéases de l'hôte (légumaine, cathepsines L et S) et l'acidification des compartiments endosomaux étaient modulées par le parasite, révélant une manipulation plus étendue de la voie endocytique. Les modes d'expression opposés d'Ii et H2-DM avaient un effet in vivo sur la dissémination des parasites vers des organes lymphoïdes, l'activation des cellules T CD4+, la production d'IFN, le nombre de kystes et la survie. Collectivement, nos résultats montrent l'étendue des processus de manipulation par T. gondii, révélant de complexes interactions avec l'hôte et sa capacité de subvertir les fonctions immunitaires pour établir une infection chronique.
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Kala, Smriti. "Identification and characterization of RNA binding and protein interaction domains of the key editosome protein KREPA4." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=114349.
Full textAbstract:
Most mitochondrial mRNAs in trypanosomatid parasites require uridine insertion/deletion RNA editing, a process mediated by guide RNA (gRNA) and catalyzed by multi-protein complexes called editosomes. The research presented in this thesis began at a time when many of the proteins in the editosome complexes and some of their functions and interactions had been identified. However, little was known about how these proteins assemble and work together. Recent studies have established that the six oligonucleotide/ oligosaccharide binding (OB)-fold proteins (KREPA1-A6), are a part of the common core of editosomes where they form a network of interactions essential for the stability of the editosomes and some of them also bind the substrate RNA. This thesis explores the RNA and protein interactions of an OB-fold protein KREPA4 to gain better understanding of its role in the structural and functional organization of editosomes. KREPA4 is an RNA binding protein essential for the integrity of editosome complex and survival of Trypanosoma brucei. Recombinant KREPA4 binds to gRNA with a preference for the gRNA 3ʹ oligo(U) tail. The only other protein, with which KREPA4 is currently known to have a direct interaction, is another OB-fold protein, KREPA6. KREPA4 has two predicted low compositional complexity regions (LCRs) at its N-terminus, besides the predicted OB-fold domain at the C-terminal end. Different parts of one or both of these regions may be involved in the RNA and protein interactions of KREPA4 within the editosome complex, and these possibilities have been investigated in this thesis. In the first part of the thesis, I examined the gRNA binding properties of KREPA4. To map the RNA-binding domain, I created deletion mutants of KREPA4, and evaluated their gRNA-binding affinities as well as specificities by gel shift RNA binding and competition experiments. My results demonstrate that the predicted C-terminal OB-fold of KREPA4 is responsible for high-affinity binding of this protein to gRNA via interaction with the gRNA oligo(U) tail. I also show that the stem-loop structure of gRNA contributes to the affinity and specificity of KREPA4-RNA interaction by binding to the N-terminal LCRs of KREPA4. Furthermore, I tested KREPA4 for the presence of a possible RNA annealing activity and found the annealing function to be associated with the predicted OB-fold, representing the first report of such activity for a core component of the RNA editing complex. The second part of this thesis is devoted to a study characterizing the protein interaction interfaces of KREPA4 in the editosome complex. By screening a series of N- and C-terminally truncated KREPA4 fragments, I determined that a predicted α-helix of KREPA4 OB-fold is required for its interaction with KREPA6. An antibody against the KREPA4 α-helix or mutations of this region can eliminate association with KREPA6; while a peptide fragment corresponding to the α-helix can independently interact with KREPA6, thereby supporting the identification of KREPA4-KREPA6 interface. I also established that the predicted OB-fold of KREPA4; independent of its interaction with gRNA, is responsible for the stable integration of KREPA4 in the editosomes, and editing complexes co-purified with the tagged OB-fold can catalyze RNA editing. Therefore, while KREPA4 interacts with KREPA6 through the α-helix region of its OB-fold, the entire OB-fold is required for its integration in the functional editosome, possibly through additional protein-protein interactions. Overall, these studies have lead to the identification and characterization of RNA binding and protein interaction interfaces of KREPA4, and also revealed the RNA annealing function of this protein. Therefore, this work provides new insight into the possible molecular interactions of KREPA4 within the editosome, thus contributing significantly to the emerging picture of the structural and functional organization of the editosome complex.La plupart des ARN messager mitochondriaux dans les parasites de la famille des trypanosomatides nécessite l'édition de l'ARN par insertion ou délétion de l'uridine, un processus médié par l'ARN guide (ARNg) et catalyser par des complexes multi protéiques appelés éditosomes. De récentes études ont montré que les six protéines de liaison oligonucleotide/oligosaccharide (KREPA1-A6), font partie du même groupe d'éditosome où ils forment un réseau d'interactions essentiels pour la stabilité des éditosomes. Certains de ces éditosomes s'associent aussi à l'ARN. Cette thèse explore l'interaction ARN-protéine de la protéine de liaison OB, KREPA4, pour obtenir une meilleure compréhension de son rôle dans l'organisation structurelle et fonctionnelle des éditosomes. KREPA4 est une protéine de liaison à l'ARN, essentielle pour l'intégrité du complexe d'éditosome et pour la survie du parasite Trypanosoma brucei. La protéine recombinante KREPA4 se lie à l'ARNg avec une préférence pour la queue oligo (U) à l'extrémité 3' de l'ARNg. La seule autre protéine présentement connu comme ayant une interaction directe avec KREPA4, est une autre protéine de liaison OB, KREPA6. KREPA4 possède à son extrémité N-terminale, deux régions de basse complexité (LCRs) prédites en plus du domaine de liaison OB à son extrémité C-terminale. Différentes parties d'une ou de deux de ces régions pourraient être impliqué dans les interactions de KREPA4 à l'ARN et à la protéine au sein du complexe d'éditosome. Dans la première partie de cette thèse, Je présente une étude examinant les propriétés de liaison à l'ARNg de la protéine KREPA4. Afin de cartographier le domaine de liaison à l'ARN, nous avons créé des mutants de délétion de la protéine KREPA4 et évalué leur affinité de liaison à l'ARNg ainsi que leur spécificité par des expériences de compétitions ou de retard sur gel. Nos résultats ont montrés que le domaine prédit à l'extrémité C-terminale OB de la protéine KREPA4 est responsable de la forte affinité de liaison de cette protéine à l'ARNg via l'interaction avec la queue oligo (U) de l'ARNg. Nous avons aussi montré que la structure en tige-boucle de l'ARNg contribue à l'affinité et à la spécificité de l'interaction entre KREPA4 et l'ARN par la liaison aux LCRs de l'extrémité N-terminale de KREPA4. De plus, nous avons testé KREPA4 pour la présence d'une possible activité d'annelation et nous avons trouvé la fonction d'annelation qui est associe avec le domaine prédit OB, ce qui représente le premier rapport d'une telle activité pour un composant essentiel du complexe d'édition de l'ARN. La deuxième partie de cette thèse est consacrée à une étude caractérisant des interfaces d'interactions protéiques de KREPA4 dans le complexe d'éditosome. Nous avons déterminé qu'une α-hélice prédite du domaine prédit OB de KREPA4 est nécessaire pour son interaction avec KREPA6. Un anticorps ciblant l'α-hélice de KREPA4 ou les mutations de cette région peut éliminer son association avec KREPA6, alors qu'un fragment peptidique correspondant à l'α-hélice peut interagir indépendamment avec KREPA6, supportant ainsi l'identification de l'interface KREPA4-KREPA6. Nous avons également établi que le domaine OB prédit de KREPA4, indépendant de son interaction avec ARNg, est responsable de l'intégration stable de KREPA4 dans les éditosomes. Par conséquent, si KREPA4 interagit avec KREPA6 dans la région α-hélice de son domaine OB, l'ensemble du domaine OB est nécessaire pour son intégration dans un éditosome fonctionnelle, possiblement par le biais d'interactions protéine-protéine additionnelles. Dans l'ensemble, ces études ont conduit à l'identification et la caractérisation de la liaison des ARNs et des interfaces d'interactions protéiques de KREPA4, et a également révélé la fonction d'annelation d'ARN de cette protéine. Par conséquent, ce travail offre une nouvelle perspective sur les interactions moléculaires possibles de KREPA4 dans l'éditosome.
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Halpenny, Carli. "Interrelationships among gastrointestinal infections, stunting and their socio-ecological determinants in impoverished Panamanian preschool children: a spatio-temporal ecohealth approach." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=114379.
Full textAbstract:
Background: Although growth stunting, height for age Z score (HAZ) <-2SD, results from sustained poor diet and frequent infection both of which are influenced by social and biophysical factors, few studies have used a transdisciplinary ecohealth framework for a comprehensive analysis of this relationship. Objective: To examine the interrelationships between preschool child stunting and gastrointestinal infections within the biophysical, social and spatial context of extreme poverty among the Ngäbe in Western Panama where conditional food voucher (FV) and cash transfer (CT) programs occurred. Methods: A 16-mo longitudinal study of 356 preschool children involved two reinfection cycles following albendazole treatment. Data collection included repeated fecal samples, household socio-behavioural questionnaires, multiple dietary records and anthropometric measures, water samples, GPS and participatory workshops. An asset-based household wealth index (HW), an index of household dispersion (HD), index of chronicity of diarrhea (CDI) and protozoan infection (CPI), and dietary pattern scores were generated and incorporated into spatial cluster analysis and multiple regression models of anthropometric and infection outcomes. Influence diagrams created during small group workshops identified participant perceptions of health. Results: Households with higher HWI had a latrine, aqueduct access, cell phone, and/or stove and HD ranged from 5–113 households/km2. High prevalence clusters of hookworm and Trichuris (but not Ascaris) occurred in regions with lowest HWI and HD. Ascaris and hookworm reinfection was driven by individual susceptibility traits (stunting) whereas Trichuris reinfection was dependent on household (maternal education) and regional (high prevalence cluster) characteristics. The high frequency of diarrhea was consistent with community perceptions of health priorities and of the link between diarrhea and poor water quality. Both E. coli counts and CDI were higher in households without aqueduct access. Sixty percent of children were stunted and 22% were underweight. The detrimental effect of CPI on HAZ was driven by household density but moderated by household wealth. Diet also influenced growth. The basic diet (rice, beans, coffee, sugar) was supplemented with fruits and vegetables (FV region) or market snacks (CT region). A "Market" diet pattern was concentrated in the CT region close to the road. Meat was beneficial for linear growth but only in the FV region whereas carbohydrates (sweets in FV region and root vegetables in CT region) were detrimental, even after controlling for infection and socio-economic status. With regard to weight gain, fish and eggs were beneficial in the FV region whereas, in the CT region, milk products were beneficial, but chips and sweets were detrimental. Implications: This transdisciplinary research highlighted key public health messages necessary to improve growth and reduce infection in this vulnerable population.Contexte: Le retard de croissance, correspondant à une valeur centrée réduite (z-score) de la taille par rapport à l'âge (ZTA) inférieur à deux écarts type, découle d'une diète pauvre et d'infections fréquentes qui sont influencées par des facteurs sociaux et biophysiques. Seulement peu d'études ont utilisé une approche multidisciplinaire santé-écologie pour analyser la relation entre ces facteurs et la fréquence des arrêt de croissance. Objectif: Examiner les relations entre le retard de croissance chez les enfants en âge préscolaire et les infections gastro-intestinales avec le contexte social, biophysique et spatial dans des conditions de pauvreté extrêmes chez les peoples Ngabe de l'ouest du Panamá, où prennent place des programmes d'aide alimentaire (AA) et de transfert monétaire (TM). Méthodes: Dans le carde d'une étude de 16 mois, nous avons suivi 356 enfants d'âge préscolaire impliqués dans deux cycles de réinfections à la suite d'un traitement à l'albendazole. Les données recueillies inclues des échantillons répétés de matière fécale, questionnaires sur les comportements sociaux des ménages, journaux alimentaires et mesures anthropométriques, échantillons d'eau, données de système de localisation GPS et ateliers participatifs. Des indices de richesse des ménages (IRM) basé sur le patrimoine, de dispersion des ménages (IDM), de chronicité des la diarrhée (ICD) et de l'infection aux protozoaires (CIP), et une note sur les habitude alimentaires ont été calculés. Ces indices ont été inclus dans une analyse spatiale de regroupement et des analyses de régression linéaire multiple pour prédire les mesures anthropométriques et le résultat des infections. Les diagrammes d'influence créés durant les ateliers ont permis d'évaluer les perceptions des participants par rapport à la santé. Résultats Les ménages avec les IRM élevés avaient une toilette, l'accès à l'aqueduc, un téléphone cellulaire et/ou un poêle. Leur IDM variait de 5-113 ménages/km2. Des regroupements de prévalence d'ankylostome et de Trichuris (mais pas d'Ascaris) étaient présents dans les régions avec les IRM et les IDM les plus faibles. Les réinfections par Ascaris et par des ankylostomes étaient influencées par des traits de sensibilité personnelle (retard de croissance): la réinfection par Trichuris dépendait des caractéristiques du ménage (éducation maternelle) et de la région (regroupement de prévalence élevée). La fréquence élevé de diarrhée correspondait avec la perception de la communauté sur les priorité en matière de santé et avec la mauvaise qualité des eaux. Les dénombrements d'E. coli et le ICD étaient plus élevés dans les ménages qui n'avaient pas accès à l'aqueduc. Soixante-six pour cent des enfants étaient atteints d'arrêt de croissance et 22% souffraient d'insuffisance pondérale. L'effet nuisible de la CIP sur la ZTA était principalement influencé par la densité de ménage mais aussi par le patrimoine du ménage. Le régime alimentaire avait aussi un effet sur la croissance. Le régime de base (riz, haricots, café, sucre) était complété avec des fruits et des légumes (région AA) ou des friandises du marché (région TM). Un régime « du marché » était concentré dans la région TM proche de la route. La présence de viande avait un effet bénéfique sur la croissance linéaire seulement dans la région AA alors que les glucides (sucreries dans la région AA et légumes racines dans le région TM) avait un effet néfaste, même en tenant compte des infections et du statut socio-économique. Le poisson et les œufs avaient un effet bénéfique sur le gain de masse corporelle dans la région AA. Dans la région TM, les produits laitiers avait un effet bénéfique sur la prise de masse alors que les croustilles et les sucreries avaient un effet néfaste. Implications: Cette étude multidisciplinaire souligne des messages important en santé publique pour améliorer la croissance et diminuer les infections dans cette population vulnérable.
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McCall, Laura-Isobel. "Parasite and host determinants of visceral leishmaniasis." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=116947.
Full textAbstract:
Leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by Leishmania protozoa and transmitted by a sand fly vector. There are three main disease manifestations: self-healing but scarring cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis with destruction of the mucosal tissues in the nose, mouth and throat, and visceral leishmaniasis in which parasites disseminate to the bone marrow, liver and spleen, leading to high fever, hepatosplenomegaly, wasting, and death in the absence of treatment. Visceral leishmaniasis is the second most lethal tropical disease after malaria. A key question of leishmaniasis research is why some Leishmania species such as Leishmania major remain at the site of the sand fly bite in cutaneous leishmaniasis while other species such as Leishmania donovani metastasize to visceral organs. The overall goal of this thesis was to identify factors involved in visceral disease pathogenesis. We hypothesized that parasite factors play a determining role in visceral disease and that host characteristics are also involved. First, we examined the function of A2, a protein family already implicated in L. donovani visceralization. A2 is shown to protect against heat shock and oxidative stress, key host defences against visceral leishmaniasis. Second, we studied an atypical L. donovani clinical isolate from Sri Lanka that causes cutaneous rather than visceral leishmaniasis, comparing it to a clinical isolate from a Sri Lankan visceral leishmaniasis patient. Although both strains were equally infective to macrophages in vitro, they caused significantly different disease phenotypes in vivo in mice: only the cutaneous isolate caused footpad swelling while only the visceral isolate led to significant liver and spleen parasitemia. A2 expression was lower in the cutaneous isolate and ectopically expressing an additional A2 gene in the cutaneous isolate partially restored virulence in the visceral organs. Therefore, parasite factors are a key determinant of visceral disease. However, host characteristics and history can also influence the development of visceral leishmaniasis. In Sri Lanka, cutaneous leishmaniasis caused by L. donovani is frequent while visceral disease is rare. We show here that immunization with a cutaneous clinical isolate is associated with a mixed Th1/Th2 response and protects BALB/c mice from visceral leishmaniasis, providing a possible rationale for the low incidence of visceral leishmaniasis in Sri Lanka. Overall, these results represent significant progress into the determinants of visceral leishmaniasis and in particular on the role of the virulence factor A2. A novel candidate for a live-attenuated vaccine against visceral leishmaniasis is also presented here. Given the lack of a human vaccine for leishmaniasis and the limitations of the current treatment options, this work could have a significant impact on disease management in Sri Lanka and on vaccine development.Les leishmanioses sont un groupe de maladies tropicales causées par le protozoaire Leishmania et transmises par la piqûre de phlébotomes. Les leishmanioses peuvent être divisées en trois formes cliniques: leishmaniose cutanée qui guérit sans traitement mais laisse des cicatrices, leishmaniose mucocutanée avec destruction des muqueuses du nez, de la bouche et de la gorge, et leishmaniose viscérale où les parasites quittent le site de la piqûre et se propagent jusqu'à la moelle osseuse, le foie et la rate. Les symptômes de la leishmaniose viscérale sont une forte fièvre et une hepatosplénomégalie, et ceci peut être fatal en l'absence de traitement. La leishmaniose viscérale a le deuxième plus haut taux de mortalité parmi les maladies tropicales, après la malaria. Un des enjeux majeurs de la recherche sur les leishmanioses est de comprendre pourquoi certaines espèces de Leishmania comme Leishmania major restent au site de la piqûre des phlébotomes dans le cas des leishmanioses cutanées, tandis que Leishmania donovani se propage jusqu'aux organes viscéraux. Le but de cette thèse est d'identifier les facteurs impliqués dans la pathogénèse de la leishmaniose viscérale. L'hypothèse de recherche est que les caractéristiques du parasite jouent un rôle principal dans la leishmaniose viscérale et que les caractéristiques de l'hôte sont également importantes. Nous examinons la fonction de A2, une famille de protéines qui sont impliquées dans la viscéralisation de L. donovani. Nous montrons que A2 protège contre le choc thermique et contre les oxydants, deux défenses clé du système immunitaire contre la leishmaniose viscérale. Ensuite, nous étudions un isolat clinique atypique de L. donovani venu du Sri Lanka qui cause des leishmanioses cutanées au lieu de provoquer des leishmanioses viscérales. Nous comparons cet isolat à un isolat clinique provenant d'un patient sri lankais souffrant de leishmaniose viscérale. Quoique ces deux isolats soient tout aussi infectieux l'un que l'autre in vitro, ils causent des symptômes différents in vivo: seul l'isolat cutané cause l'enflure du coussinet plantaire après injection sous-cutanée chez les souris et seul l'isolat viscéral peut se multiplier dans le foie et la rate. Les niveaux de A2 sont plus bas dans l'isolat cutané et nous démontrons que cela constitue un facteur déterminant de son atténuation. Ces résultats prouvent donc que les caractéristiques du parasite ont une influence majeure dans la pathogénèse des leishmanioses viscérales. Cependant, les caractéristiques de l'hôte et son historique médical peuvent également influencer le développement de cette maladie. Les leishmanioses cutanées sont beaucoup plus fréquentes au Sri Lanka que les leishmanioses viscérales. Nous prouvons ici que la vaccination avec l'isolat cutané mène à une réponse du système immunitaire de type Th1/Th2 mixte et protège contre la leishmaniose viscérale dans un modèle in vivo d'infection de souris BALB/c. Ces résultats proposent un modèle pour expliquer la rareté de la leishmaniose viscérale au Sri Lanka. En conclusion, ces résultats éclaircissent plusieurs facteurs impliqués dans le développement de la leishmaniose viscérale et en particulier le rôle du facteur de virulence A2. Nous présentons également un nouveau candidat de vaccin atténué contre la leishmaniose viscérale. Etant donné l'absence de vaccin humain pour cette maladie et les limites des traitements actuels, cette étude pourrait avoir un impact majeur sur la santé publique au Sri Lanka et sur le développement de vaccins contre la leishmaniose viscérale.
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Dasanayake, Dayal. "Identification of candidate Toxoplasma gondii factors that are responsible for the inhibition of interferon gamma mediated up-regulation of major histocompatibility complex class-II." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=117163.
Full textAbstract:
The obligate intracellular pathogen Toxoplasma gondii is one of the most successful pathogens in the world, with an average worldwide infection rate of ~30 % in humans. The ability of the T. gondii to establish persistent infections in immunocompetent hosts is likely due to its immune evasion strategies that include interference with T cell activation, blocking of pro-inflammatory cytokine signaling while stimulating anti-inflammatory signaling and preventing the expression of major histocompatibility complex class II (MHC-II) molecules by immune cells. This blocking the production of MHC-II by professional antigen presenting cells dampens the CD4+ T cell response and delays the onset of cellular immunity, thereby allowing T. gondii to establish a lifelong chronic infection. Infection of professional antigen presenting cells with live parasites and exposure to parasite lysate both result in a blockage of IFN-gamma dependant MHC-II production and surface expression. However, the mechanisms of inhibition by live parasites differ from those observed with parasite lysates suggesting multiple and non-redundant mechanisms of MHC-II expression inhibition during a T. gondii infection. The active molecules from parasite lysates likely represent proteins secreted by the parasite that act on host cells even prior to their infection. The parasite molecule(s) responsible for this important immune evasion mechanism remain(s) unknown. In our studies, we used sub-cellular fractionation and chromatographic techniques to isolate and enrich for the protein(s) responsible for interfering with IFN-gamma dependant MHC-II production. Preliminary experiments demonstrated that the active component was a soluble protein. Sub-cellular fractionation experiments indicated that inhibition levels corresponded to the amount of dense granules, a specialized T. gondii secretory organelle, present in the fractions. We also demonstrated that extracellular parasites actively secrete proteins and that these excretory-secretory antigens (ESA) contain MHC-II expression inhibiting molecule(s). Size-exclusion chromatography of soluble parasite lysate and ESA indicated MHC-II expression inhibiting molecules were present in fractions representing a large size range of proteins. Most of these molecules were however confined to the fractions containing the largest proteins and/or protein complexes. To isolate the active molecules, a two-step fractionation process was devised. ESA proteins were first subjected to anion-exchange chromatography and the fraction presenting the greatest abundance of MHC-II expression inhibition was then further separated by size-exclusion chromatography for isolation and enrichment of active molecule(s). The latter separated the active molecule(s) into two fractions. LC-MS/MS analysis of these fractions identified 24 candidate Toxoplasma gondii proteins responsible for the inhibition of MHC-II expression in bone marrow derived macrophages.Le parasite protozoaire intracellulaire obligatoire Toxoplasma gondii est l'un des pathogènes les plus prolifiques, avec une incidence mondiale d'environ 30 % chez les humains. La capacité de T. gondii d'établir une infection persistante dans un hôte immunocompétent est accomplie grâce à son éventail de stratégies qui lui permet d'échapper au système immunitaire de l'hôte, incluant l'interférence de l'activation des cellules T, la dérégulation du signalement des cytokines pro-inflammatoires, la promotion du signalement des cytokines anti-inflammatoires et l'inhibition de l'expression des molécules complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMH-II) par les cellules immunitaires. En bloquant l'expression de CMH-II par les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles, la réponse des cellules T CD4+ est réduite et le déclanchement de l'immunité cellulaire est retardé, permettant à T. gondii d'établir une infection chronique qui persiste pour le reste de la vie de l'hôte. Une infection par des parasites vivants ou l'exposition à des lysats de parasites bloquent tous deux la synthèse de molécules de CMH-II induite par l'IFN-gamma et leur expression à la surface cellulaire par les cellules présentatrices d'antigènes professionnelles. Cependant, les mécanismes d'inhibition par des parasites vivants diffèrent de ceux observés avec les lysats de parasites, ce qui suggère qu'une multitude de mécanismes non-redondants soient sollicités pour inhiber l'expression de CMH-II lors d'une infection par T. gondii. Les molécules actives présentes dans les lysats de parasites sont probablement des protéines normalement sécrétées par le parasite qui agissent sur les cellules hôtes précédant l'invasion. Les molécules du parasite responsables de ce mécanisme important d'évasion du système immunitaire restent inconnues à ce jour. Pour nos recherches, nous utilisâmes un fractionnement subcellulaire et des techniques de chromatographie pour isoler et enrichir les protéines responsables de l'activité inhibitrice sur l'expression de CMH-II. Des résultats préliminaires démontrèrent que la composante active provient de protéines solubles. De plus, des fractionnements subcellulaires révélèrent que l'activité inhibitrice se retrouvait dans les fractions enrichies d'organelles sécrétoires, nommément les rhoptries (ROP) et les granules denses (GRA). Nous démontrâmes aussi que les parasites extracellulaires sécrètent activement des protéines et que ces antigènes excrétés-sécrétés (ESA) contiennent des molécules qui inhibent l'expression de CMH-II. Une séparation par chromatographie d'exclusion stérique de la fraction soluble des lysats de parasites et des ESA révéla que les molécules inhibitrices de CMH-II se retrouvaient dans des fractions de protéines de tailles variées. Toutefois, la plupart des ces molécules étaient confinées aux fractions contenant des protéines de larges tailles et/ou des complexes protéiques. Pour isoler davantage les molécules inhibitrices, un fractionnement à deux étapes fut élaboré. Les protéines provenant d'ESA furent séparées par chromatographie d'échange d'anions et la fraction obtenue qui affichait la plus grande activité inhibitrice fut séparée davantage par chromatographie d'exclusion stérique pour isoler et enrichir les molécules d'intérêt. Nous obtînmes deux fractions suivant cette méthodologie et les analysâmes par LC-MS/MS, ce qui généra une liste de 24 protéines de Toxoplasma gondii potentiellement responsables de l'inhibition de l'expression de CMH-II par des macrophages dérivés de la moelle osseuse.
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Renteria, Flores Axel. "Novel drugs against protozoan parasites." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=116979.
Full textAbstract:
Cryptosporidium parvum and Trypanosoma brucei are two protozoan parasites that can cause life-threatening illnesses in humans. Over 70 million people on the African continent are at risk of contracting T.brucei. In the case of C.parvum, infections are cosmopolitan, and a major problem is that it can be acquired very easily and requires only an infectious dose of 10 oocysts to cause the illness. If released in the public water supplies, C.parvum can endanger entire cities. This is one reason why C.parvum is categorized as a Class B bioterrorist weapon. Despite the threat C.parvum poses and the severe illness T.brucei causes, current treatments against these parasites are insufficient. These treatments fail to consistently eliminate the parasites and cause many adverse side effects. Furthermore, no significant improvements to the efficacy of these currently available treatments have been made. Given the need to find new drugs against these parasites and improve treatments, we tested the anti-parasitic activity of two compounds against T.brucei and C.parvum, respectively. First, we looked at the in vivo activity of TH-III-149, a cyclopropyl-indol, against T. brucei and then the in vitro and in vivo activity of oleyl-PC, a phosphocholine analog, against C. parvum. To begin, we looked at the effects of TH-III-149 against T.brucei by using a CD1 mouse model of infection. We demonstrated that an 8mg/kg treatment of TH-III-149 for three days resulted in a significant decrease in parasite replication rates compared to non-treated mice. By real-time PCR quantification of blood parasitemia, we showed that non-treated, T.brucei-infected mice had a thousand-fold increase in parasite burden between day 2 and 4 of infection. In comparison, only a 7.5-fold increase in parasite burden was observed in mice treated with TH-III-149. Results from blood smears and microscopy also confirmed this reduction in the replication rate of parasites. The treatment of infected mice with TH-III-149 delayed the patent period (appearance of parasites in the blood smear) by two days when compared to non-treated mice. In non-treated mice, parasite in the blood smears appeared at day 4 of the infection, while TH-III-149-treated mice only exhibited parasites in the blood smears at day 6. In addition, this compound showed minimal signs of toxicity, as non-infected mice treated with 8mg/kg of TH-III-149 for three days did not exhibit weight loss, hepatomegaly or splenomegaly. Therefore, our results support the development of TH-III-149 as a new treatment against T.brucei. In parallel, we also tested oleyl-PC against C.parvum. We showed that in vitro oleyl-PC has an IC50 of 22.9nM against C.parvum. Toxicity was evaluated using human ileocecal adenocarcinoma cells (HCT-8 cells) and was not significant at concentrations below 100µM (TC50=153.7 µM). The ratio between the TC50 and the IC50 allowed us to calculate a therapeutic index of 6.7x103. The in vivo animal study confirmed the activity of oleyl-PC previously seen in vitro. Treating C57BL/6 IFNγR-KO mice with 40mg/kg of oleyl-PC for ten days resulted in the cure (clearance of blood parasitemia) in 75% of the mice and a percent survival of 100% after 30 days (P < 0.001). In contrast, all of the non-treated mice succumbed to C. parvum infection and died by day 11. Using real-time PCR, oleyl-PC-treated mice showed no detectable levels of parasitic DNA in their intestines 30 days post infection, which indicates that these mice successfully cleared their parasitic infections. These results were confirmed by histological analysis of sections of the ileum which were clear of C.parvum oocysts. Furthermore, after ten days of treatment with 40mg/kg of oleyl-PC, no signs of toxicity were seen in treated mice; non-infected oleyl-PC-treated mice were monitored for visible behavioral changes and weight loss. Therefore, our results support the development of oleyl-PC as a new safe and effective treatment against C.parvum.Cryptosporidium parvum et Trypanosoma brucei sont deux parasites protozoaires qui peuvent causer des maladies mortelles chez les humains. Confinées au continent africain, les infections dues à T.brucei affectent plus de 70 millions d'habitants. Dans le cas de C.parvum, les infections qui sont cosmopolites causent un problème majeur puisque la dose infectieuse n'est que de 10 oocysts. De plus, ce parasite peut être obtenu facilement et peut mettre en danger plusieurs villes, s'il est relâché dans les eaux potables. C'est un des raisons pourquoi ce parasite a été catégorisé comme une arme bio-terroriste de classe B. Malgré les risques majeurs associés à C.parvum et la maladie sévère de T.brucei, aucun progrès n'a été fait pour améliorer les traitements actuels. Ceux-ci n'ont toujours pas réussi à démontrer leur efficacité en plus de causer des effets secondaires sérieux. Vu le besoin urgent de trouver de meilleurs traitements, nous avons testé l'activité de TH-III-149, un indole-cyclopropane, contre T.brucei dans une étude in vivo ainsi que le oleyl-PC, un analogue de la phosphocholine, contre C.parvum dans des études in vitro et in vivo. Pour commencer, nous avons observé les effets du TH-III-149 contre T.brucei dans un modèle de souris CD1. Les résultats in vivo ont démontré qu'un traitement de trois jours en utilisant 8 mg/kg cause une réduction significative dans le taux de réplication du parasite en comparaison aux souris non-traitées. En utilisant le PCR en temps réel comme méthode de quantification, nous avons démontré que la charge en parasite dans le sang des souris non-traitées a augmenté de mille fois entre les jours 2 et 4, tandis qu'elle n'a augmenté que de 7.5 fois dans les souris qui ont été traitées. Les résultats des frottis sanguins ont confirmé cette réduction dans le taux de réplication des parasites. En effet, l'apparition de parasites dans les frottis sanguins a été observée dès le jour 4 de l'infection dans les souris non-traitées, tandis qu'elle n'a pu être observée qu'à partir du jour 6 dans les souris traitées avec le TH-III-149. De plus, ce composé n'a pas révélé de signes de toxicité car les groupes de souris non-infectées traitées pendant trois jours avec 8 mg/kg n'ont pas démontré de splénomégalie, d'hépatomégalie ni de perte de poids. Donc, nos résultats supportent le développement de TH-III-149 en tant que nouveau traitement contre les infections de T.brucei. En parallèle, nous avons aussi testé l'oleyl-PC contre C.parvum. Nos résultats in vitro démontrent que la concentration nécessaire pour réduire de 50% le taux de réplication du parasite (IC50) est de 25nM. La toxicité a été évaluée en utilisant une culture entérique humaine en couche monocellulaire (HCT-8). Les résultats de celle-ci démontrent que les premiers signes de toxicité apparaissent à partir de 100µM (TC50=123µM). Le ratio entre le TC50 et le IC50 a permis de calculer un index thérapeutique de 5x103. Les résultats in vivo ont servis à confirmer l'activité in vitro de oleyl-PC. En effet, le traitement de dix jours des souris C57BL/6 IFNγR-KO avec 40mg/kg de oleyl-PC a réussi à guérir (absence de parasitémie sanguine) 75% des souris, tout en gardant un taux de survie de 100% après le jour 30 (P<0.001). En contraste, toutes les souris non-traitées ont succombées à l'infection à la fin du jour 11. En utilisant le PCR en temps réel, aucune trace d'ADN provenant de C.parvum n'a pu être détectée dans les intestins de ces souris 30 jours après l'infection. Ces résultats ont été confirmés par l'analyse des lamelles histologique de l'ilium de ces souris où l'absence d'oocyst de C.parvum a été observée. De plus, chez les souris non-infectées, un traitement de dix jours avec 40 mg/kg de oleyl-PC n'a pas causé d'effets secondaires visibles tels qu'une perte de poids. Donc, nos résultats supportent le développement de l'oleyl-PC en tant que nouveau traitement sécuritaire et efficace contre les infections de C.parvum.
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Baakdah, Fadi. "Identification of PfCRT interacting proteins." Thesis, McGill University, 2014. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=121534.
Full textAbstract:
The lethal form of human malaria is caused by the most prominent human protozoan parasite, Plasmodium falciparum, responsible for an estimated ~1 million deaths annually. Malaria treatment and, prevention heavily rely on antimalarial drugs. The synthetic substitute of quinine, chloroquine, was the most effective treatment for this disease. The rise of chloroquine resistant malaria in endemic areas has suppressed control efforts. Chloroquine resistance has been associated with mutations in a transmembrane protein on the digestive vacuole of the parasite, designated PfCRT. Moreover, the normal function(s) and natural substrate(s) of PfCRT remain a matter of speculation as direct evidence for the normal functions or substrates are yet to be determined. The objectives of this thesis are to develop and characterize two antisera to the N- and C termini of PfCRT as tools for the identification of PfCRT interacting proteins in P. falciparum. Although the molecular mass of PfCRT was estimated as 48.67 kDa, immunobiochemical characterizations using different antiserums raised against the N- and C-cytosolic domains of this protein throughout the published literature yielded varying molecular masses of PfCRT on SDS PAGE. In this thesis, we report the generation and biochemical characterization of two antisera raised against the N- and C-cytosolic domains of PfCRT. Our results show PfCRT-C antiserum to detect non-phosphorylated epitopes or sequences in PfCRT. Moreover, our high-resolution epitope mapping results confirm the specificity of PfCRT-C antiserum to a non-phosphorylated form of PfCRT and show that phosphorylation at two sites in PfCRT sequence, Ser411 and Thr416, prevent its binding to the full-length and phosphorylated protein. In addition, we have identified a novel truncated form of PfCRT that is both unphosphorylated, as it is recognized by PfCRT-C antiserum, and likely to represent a differentially spliced product of PfCRT, that is expressed in vivo on the parasite digestive vacuole. Furthermore, our findings confirm the molecular mass of the full-length and phosphorylated PfCRT as a 52 kDa protein band on SDS PAGE. Using PfCRT antisera together with three different methods of protein interactions, we provide the first evidence of proteins interacting with PfCRT. Identification of these proteins which ranges from ~20 kDa to 200 kDa is under active investigation.La forme létale du paludisme humain est causée par le plus important parasite protozoaire humain, Plasmodium falciparum, responsable d'environ ~1 million de mort annuellement. Le traitement et la prévention du paludisme dépend des médicaments antipaludiques. Le substitut synthétique de la quinine, la chloroquine, était le traitement le plus efficace pour cette maladie. La montée du paludisme résistant à la chloroquine dans les pays endémiques a supprimé les efforts de contrôle. La résistance à la chloroquine a été associée aux mutations dans la protéine transmembranaire présente sur la vacuole digestive du parasite, désigné PfCRT. De plus, la ou les fonctions normales et substrats naturels de la protéine PfCRT restent une affaire de spéculation étant donné qu'une évidence directe des fonctions normales et des substrats de cette protéine sont encore à déterminer. Les objectives de cette thèse sont de développer et de caractériser deux antisérums de l'extrémité N- et C-terminale de PfCRT comme outils d'identification des protéines interagissant avec la protéine PfCRT de P. falciparum. Bien que la masse moléculaire de la protéine PfCRT était estimée à 48.67 kDa, des caractérisations immunobiochimiques utilisant différents antisérums dirigés contre les domaines cytosoliques N- et C-terminal de cette protéine et publiés à travers la littérature ont abouti à des masses moléculaires variable de la protéine PfCRT sur le SDS PAGE. Dans cette thèse, nous reportons la génération et la caractérisation biochimique de deux antisérums dirigés contre les domaines cytosoliques N- et C de PfCRT. Nos résultats montrent que l'antisérum C de PfCRT détecte les épitopes non-phosphorylés ou des séquences dans la protéine PfCRT. En outre, nos résultats de la cartographie à haute résolution de l'épitope confirment la spécificité de l'antisérum C de PfCRT à la forme non-phosphorylé de PfCRT et montrent que la phosphorylation à deux sites au niveau de la séquence de la protéine, Ser411 et Thr416, qui empêche sa fixation à la protéine complète et phosphorylée. De plus, nous avons identifié une nouvelle forme tronquée de PfCRT qui est à la fois phosphorylée puisqu'elle est reconnue par l'antisérum C de PfCRT, et susceptible de représenter un produit différemment épissé de PfCRT, qui est exprimé in vivo sur la vacuole digestive du parasite. En outre, nos résultats confirment la masse moléculaire de la protéine complète et phosphorylée de PfCRT à 52 kDa sur un SDS PAGE. En utilisant les antisérums de PfCRT combiné à trois méthodes différentes d'interactions protéiques, nous fournissons la première preuve de protéines interagissant avec la protéine PfCRT. L'identification de ces protéines dont la masse varie entre ~20 kDa et 200 kDa est sous enquête active.
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Rashid, Mohammed. "Characterization of putative cation-selective nicotinic acetylcholine receptors of the parasitic blood fluke «Schistosoma mansoni»." Thesis, McGill University, 2014. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=123079.
Full textAbstract:
Schistosomiasis is one of the most socioeconomically important parasitic diseases, affecting over 200 million people worldwide. Praziquantel is the only drug treatment available in most parts of the world and there is an urgent need to find a viable alternative to this drug. Acetylcholine-gated ion channels of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) family have been shown to be effective drug targets for treatment of various helminth infections. Here, we describe a first investigation of putative nAChR subunits of the model parasite, Schistosoma mansoni. Four predicted subunits, smp_031680, smp_180570, smp_139330, and smp_012000, were cloned from S. mansoni by a combination of RT-PCR and RACE (rapid amplification of cDNA ends) procedures. All four full-length proteins contain prerequisite features of cation-selective nAChRs. Subsequent functional studies by RNA interference (RNAi) in parasite larvae (schistosomulae) and adult worms showed that the four nAChR subunits play an important role in the control of motor activity. RNAi targeting smp_031680 and smp_180570 caused hypoactivity, whereas knockdown of smp_139330 and smp_012000 caused hyperactivity, suggesting these subunits form channels that either stimulate or inhibit movement. Further confocal immunofluorescence studies of smp_031680 and smp_139330 showed that nAChRs are expressed extensively in both central and peripheral nervous systems of the parasite, musculature (smp_139330 only) and female reproductive system. Importantly, we observed distinct expression patterns of smp_031680 and smp_139330, which suggests that they are not part of the same channel. Our repeated efforts to heterologously express the four putative subunits in Xenopus oocytes were unsuccessful. We were unable to obtain functional channels from subunits expressed individually or in combination, in the presence and absence of S. mansoni orthologues of Caenorhabditis elegans ancillary proteins ric-3 and unc-50, which are known to improve heterologous expression of nAChRs. As an alternative strategy, we modified the subunits by inserting a fluorescent tag, sub-cloned the modified sequences into a mammalian expression vector, and tested for protein expression in transfected HEK293 cells by fluorescence microscopy. The results show that nAChRs can be expressed in the mammalian cells but additional experiments are needed to test for channel activity. All in all, this is a small yet significant first step in elucidating the parasite's cholinergic nervous system and identifying some of the receptors involved in cholinergic motor control in S. mansoni.La schistosomiase est une des maladies parasitaires les plus importantes sur le plan socioéconomique, affectant plus de 200 millions de personnes à travers le monde. Le praziquantel est le seul médicament disponible pour le traitement de la schistosomiase dans la plupart des régions du monde et il est urgent de trouver un traitement de rechange viable pour complémenter ce médicament. Il a été démontré que les canaux ioniques de type pentamériques sensibles à de l'acétylcholine appartenant à la famille des récepteurs nicotiniques (nicotinic acetylcholine receptor, nAChR) sont la cibles de plusieurs médicaments vermifuges utilisés pour le traitement de diverses infections causées par des helminthes. Dans ce mémoire, nous décrivons pour la première fois l'existence de sous-unités nAChR putatives chez le parasite modèle Schistosoma mansoni. Les séquences codantes complètes de quatre sous-unités putatives, smp_031680, smp_180570, smp_139330, et smp_012000, ont été déterminées et clonées chez S. mansoni en utilisant une combinaison de RT-PCR (transcription inverse et réaction en chaîne par la polymérase) et de RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc). Les quatre séquences protéiques obtenues possèdent les caractéristiques typiques des nAChRs perméables aux cations. Nous démontrons également grâce à des études fonctionnelles d'interférence de l'ARN (RNAi) réalisées dans des larves de parasites (schistosomules) et des vers adultes que les quatre sous-unités nAChR jouent un rôle important dans le contrôle de l'activité motrice. En effet, nous avons observé que l'RNAi ciblant smp_031680 et smp_180570 causait l'hypoactivité motrice, tandis que la diminution de l'expression génique de smp_139330 et smp_012000 causait l'hyperactivité motrice, suggérant par conséquent que ces sous-unités forment des canaux ioniques capable de stimuler ou d'inhiber l'activité motrice. Par ailleurs, des études d'immunolocalisation et de microscopie confocale ont montré que les sous-unités nAChRs smp_031680 et smp_139330 sont abondamment exprimées dans les systèmes nerveux central et périphérique du parasite, ainsi qu'au niveau de la musculature (smp_139330 seulement) et du système reproducteur féminin. Il est important de noter nous avons observé des profils d'expression distincts entre smp_031680 et smp_139330, ce qui suggère que ces sous-unités ne font pas partie du même récepteurs. Nos tentatives répétées pour exprimer de manière hétérologue ces quatre sous-unités putatives dans des ovocytes de Xenopus ont été infructueuses. Nous n'avons pas pu obtenir de récepteurs fonctionnels à partir de sous-unités exprimées individuellement ou en combinaison, en présence et en l'absence de protéines auxiliaires de S. mansoni orthologues aux protéines ric-3 et unc-50 de Caenorhabditis elegans, lesquelles sont connus pour améliorer l'expression hétérologue des nAChRs. Alternativement, nous avons modifié les sous-unités en y insérant un marqueur fluorescent et avons sous-cloné ces séquences dans un vecteur d'expression de mammifère. Nous avons ensuite visualisé par immunofluorescence l'expression des protéines d'intérêts transfectées dans des cellules HEK293. Les résultats montrent que les nAChRs sont exprimés dans les cellules de mammifères, mais d'autres expériences sont nécessaires afin de tester l'activité de ces récepteurs. Somme toute, bien que limités, nos résultats constituent un premier pas important dans la compréhension du système nerveux cholinergique du parasite et ont permis d'identifier quelques-uns des récepteurs impliqués dans le contrôle cholinergique des fonctions motrices chez S. mansoni.
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Sharma, Nidhi. "Developmental expression analysis and RNA interference (RNAi) screen of putative neuromuscular receptors of «Schistosoma mansoni»." Thesis, McGill University, 2014. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=123300.
Full textAbstract:
In parasitic platyhelminths, including Schistosoma mansoni the coordination of neuromuscular system is critical for continued propagation, development and successful completion of the lifecycle. Neuromuscular signaling in these parasites is mediated by a variety of neurotransmitters, both small molecules ("classical") transmitters and neuropeptides. Biogenic amines (BA) constitute the largest subset of classical neurotransmitters and play several key roles in the control of schistosome muscle function and movement. There are several putative BA receptors identified in the S. mansoni genome, the majority of which are Class A G protein coupled receptors (GPCRs). Here we report the functional role of these putative BA receptors in parasite development and motility by developmental expression analysis and RNAi screening. We performed an expression analysis of several putative BA receptors at the RNA level in different developmental stages of the parasite, using reverse-transcription coupled to quantitative PCR (RT-qPCR). One of these proteins is a previously described serotonin receptor of S. mansoni (named Sm5HTR) and the others are novel "orphan" BA-like receptors. The analysis showed that the BA receptors tested are expressed in all developmental stages, however the majority are preferentially expressed in cercaria and schistosomula, suggesting these receptors play particularly important roles in parasite larvae. Next we performed RNA interference (RNAi) targeting the same BA receptors by transfecting S.mansoni larvae with small interfering RNA (siRNA) and analyzed for effects on motor activity by comparing with the control groups. Given that BAs are known modulators of schistosome movement, we hypothesized that the RNAi would produce a motor phenotype in the larvae and this was confirmed by the data. The results identified strongly hypoactive phenotypes for three out of four receptors tested, including Sm5HTR (Smp_126730), Smp_150180 and Smp_120620), all showing significant reduction in movement compared to control larvae transfected with irrelevant (scrambled) siRNAs. The RNAi phenotype correlated with a significant and specific knockdown in transcript levels as determined by RT-qPCR. To elucidate the mode of action of Sm5HTR we also performed confocal immunolocalization analysis using a specific peptide antibody. The expression pattern suggests Sm5HTR is highly abundant in the central and peripheral nervous system of the parasite, including the peripheral innervation of the body wall muscles responsible for movement. Together the results suggest that Sm5HTR and other BA receptors play an important role in the control of schistosome motility, particularly the larvae, and could be potential targets for new drug discovery.En plathelminthes parasites, y compris Schistosoma mansoni la coordination de système neuromusculaire est essentiel pour continuer à se propager, le développement et la réussite du cycle de vie. Signalisation neuromusculaire chez ces parasites est médiée par une variété de neurotransmetteurs, les petites molécules (classique) des émetteurs et des neuropeptides. Les amines biogènes (BA) constituent le plus grand sous-ensemble de neurotransmetteurs classiques et jouent plusieurs rôles clés dans le contrôle de la fonction musculaire schistosome et le mouvement. Il RNA ya plusieurs récepteurs BA putatifs identifiés dans le génome de S. mansoni, dont la majorité sont des récepteurs couplés aux protéines de classe AG (GPCR). Nous rapportons ici le rôle fonctionnel de ces récepteurs putatifs de BA dans le développement du parasite et de la motilité par analyse de l'expression du développement et de dépistage RNAi. Nous avons effectué une analyse de l'expression de plusieurs récepteurs de BA putatifs au niveau de l' dans les différents stades de développement du parasite, en utilisant la transcription inverse couplée à une PCR quantitative (RT- qPCR). Une de ces protéines est un récepteur de la sérotonine décrit précédemment de S. mansoni (nommé Sm5HTR) et les autres sont de nouveaux récepteurs "orphelins" BA -like . L'analyse a montré que les récepteurs de la BA testés sont exprimés dans tous les stades de développement mais la majorité sont préférentiellement exprimé dans les cercaires et schistosomule, suggérant que ces récepteurs jouent un rôle particulièrement important dans les larves de parasite. Suivant nous avons effectué l'interférence RNA (RNAi) de cibler les mêmes récepteurs de BA par transfection larves S.mansoni avec petits RNA interférents (siRNA) et analysé les effets sur l'activité motrice par comparaison avec les groupes témoins. Étant donné que le BAs sont des modulateurs du mouvement schistosome connu, nous avons supposé que l' RNAi serait de produire un phénotype de moteur dans les larves et cela a été confirmé par les données. Les résultats identifiés phénotypes fortement hypoactif pour trois des quatre récepteurs testés, y compris Sm5HTR (Smp_126730), Smp_150180 et Smp_120620), tous montrant une réduction significative de mouvement par rapport à lutter contre les larves transfectées avec non pertinentes (brouillés) siRNA. Le phénotype RNAi corrélée avec un effet de choc important et spécifique dans les niveaux de transcription tel que déterminé par RT- qPCR. Pour élucider le mode d'action de Sm5HTR nous avons également effectué une analyse de immunolocalisation confocale en utilisant un anticorps anti- peptide spécifique. Le profil d'expression suggère Sm5HTR est très abondant dans le système nerveux central et périphérique du parasite, y compris l'innervation périphérique des muscles de la paroi du corps chargés de mouvement. Ensemble, les résultats suggèrent que Sm5HTR et d'autres récepteurs de la BA jouent un rôle important dans le contrôle de la motilité schistosome, en particulier les larves, et pourraient être des cibles potentielles pour la découverte de nouveaux médicaments.
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Dufour, Vanessa. "Molecular characterization of novel glutamate-gated chloride channel subunits from «Schistosoma mansoni»." Thesis, McGill University, 2014. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=123127.
Full textAbstract:
Flatworms of the genus Schistosoma are wide-spread and clinically significant parasites of humans in the tropics and sub-tropics. In evolutionary terms, they are representatives of the earliest metazoans to have evolved separate sexes, and to possess anatomically distinct central and peripheral nervous systems. Schistosome infections are currently controlled by a single drug, praziquantel (PZQ), but the emergence of schistosome strains resistant to PZQ is a growing concern.A deeper understanding of the basic biology of schistosomes is the first step towards target-based drug discovery. Neuronal receptors of schistosomes are attractive targets for drug development because all major physiological activities and behaviors in these parasites are coordinated by their nervous system. Neuronal signaling in schistosomes is mediated by a variety of neurotransmitters and associated receptors, including members of the pentameric ligand-gated ion channel (pLGIC) superfamily. The S. mansoni genome encodes 4 putative non-AChR-like inhibitory pLGIC subunits and 13 putative nAChR-like pLGIC subunits.The work presented in this thesis focuses on L-glutamate (L-glu) neuronal signaling in S. mansoni. L-glu is an important neurotransmitter in essentially all vertebrate and invertebrate phyla, but its functional roles in S. mansoni are poorly understood. Here, we further contribute to knowledge in this field by providing the first molecular evidence for the contribution of an inhibitory, glutamate-gated Cl channel (GluCl)-mediated component to glutamatergic neurotransmission in S. mansoni.First, we show that the 4 non-AChR-like inhibitory pLGIC subunit candidates encode GluCl subunits (SmGluCl-1-4) that are pharmacologically and evolutionarily distinct from insect, nematode and snail GluCls. Using an electrophysiology approach in Xenopus oocytes, we demonstrate that SmGluCl-1, -2 and -3 subunits exhibited low micromolar affinity for L-glu, are permeable to Cl , but are insensitive to ivermectin and meclonazepam. Phylogenetic analyses suggest that the SmGluCl subunits belong to a previously uncharacterized clade of flatworm GluCls that includes several GluCl candidates from related trematode and cestode species.Then, we provide evidence that the SmGluCl subunits are expressed in all human stages of the parasite. An analysis of SmGluCl stage-specific expression by RT-PCR amplification reveals that transcripts from all 4 SmGluCl subunits are expressed in S. mansoni cercaria, schistosomules, adults and eggs. Confocal immunolocalization reveals that all the SmGluCl subunits are widely expressed in the nervous system of male and female worms, and exhibit partially overlapping expression patterns in the central nervous system and in the peripheral nerve cords and plexuses supplying the body, attachment organs, reproductive tract and tubercles. The lack of apparent co-localization between SmGluCl subunits and phalloidin suggests that they are not expressed in the musculature. Together, these findings offer possible clues regarding the physiological functions they mediate, including interneuronal signaling, indirect regulation of motility, attachment and feeding, oogenesis and sensory signaling.Finally, we present initial data from prospective work aimed at developing a YFP assay for HTS of compound libraries against S. mansoni GluCls heterologously expressed in mammalian cells. We confirm by confocal immunofluorescence that heterologously expressed FLAG-tagged SmGluCl-2 is localized at the membrane surface of HEK-293. Further work is underway to demonstrate the feasibility of this assay for HTS against S. mansoni GluCls as a means of exploring the potential of new compounds as either therapeutic leads or pharmacological probes targeting S. mansoni GluCls to explore their physiological functions.Les vers plats (platyhelminthes) du genre Schistosoma sont des parasites de l'homme répandus dans plusieurs régions tropicales et sous-tropicales. Le seul médicament disponible pour traiter la schistosomiase est le praziquantel (PZQ). L'émergence de souches de schistosomes résistantes au PZQ est une préoccupation croissante. Le système nerveux des schistosome exerce un contrôle exclusif sur toutes les activités physiologiques de ces parasites, déterminant leurs particularités comportementales au sein de leur hôte. La signalisation neuronale chez les schistosomes est modulée par une variété de neurotransmetteurs et des récepteurs qui leur sont associés, incluant les membres de la superfamille des récepteurs ionotropes sensible à un ligand de type pentamérique (pLGIC). Le génome de S. mansoni encode 4 sous-unités putatives de pLGIC insensibles à l'acétylcholine (non-AChR) et 13 sous-unités putatives de pLGIC de type nAChR.Le L-glu est un neurotransmetteur important, retrouvé chez presque tous les vertébrés et les invertébrés, mais les fonctions neurologiques qu'il module chez S. mansoni sont mal comprises. Cette thèse fournit la toute première preuve que le L-glu peut générer des potentiels postsynaptiques inhibiteurs médiés par l'activation de pLGICs sensibles au L-glu (GluCl). Les 4 gènes candidats encodant des sous-unités pLGIC de type non-AChR sont des sous-unités GluCl (SmGluCl-1-4). Ces récepteurs SmGluCl diffèrent des récepteurs GluCl retrouvés chez les insectes, les nématodes et les gastropodes. Des expériences d'électrophysiologie montrent que les sous-unités SmGluCl-1, -2 et -3 forment des récepteurs perméables aux ions Cl et sensibles à des concentrations de L-glu de l'ordre du micromolaire (7-27 µM), mais sont insensibles à l'ivermectine et au meclonazepam. Les analyses phylogénétiques suggèrent que les sous-unités SmGluCl appartiennent à un nouveau groupe de sous-unités GluCl retrouvées exclusivement chez les vers plats parasitaires.Ensuite, nous démontrons par RT-PCR que les ARN messagers encodantque les sous-unités SmGluCl sont produites par tous les stades de développement du parasite interagissant avec l'humain. Des expériences d'immunolocalisation révèlent que ces sous-unités SmGluCl sont abondamment exprimées dans les vers mâles et femelles, au niveau du système nerveux central, ainsi que dans certains des cordons et plexus nerveux du système nerveux périphérique innervant l'enveloppe corporelle, les organes d'attachement, l'appareil reproducteur et les tubercules. Les récepteurs SmGluCl ne sont pas exprimés dans la musculature des schistosomes. En somme, la distribution des sous-unités SmGluCl dans le système nerveux suggère que ces récepteurs pourraient être impliqués dans la signalisation interneuronale et sensorielle et pourrait réguler de manière indirecte la mobilité, l'attachement et l'alimentation et l'ovogenèse.Enfin, nous présentons des données préliminaires obtenues dans le cadre d'un projet visant à développer une méthode analytique permettant le criblage à haut débit (high-throughput screening, HTS) de banques de composés d'intérêt pharmaceutique, afin de tester leur effet sur l'activité des récepteurs GluCl des schistosomes. Cette méthode analytique sera effectuée dans des cellules de mammifères exprimant les récepteurs SmGluCl de manière hétérologue et permettra de mesurer l'activité de ces récepteurs en fonction de la fluorescence émise par la protéine YFP. Nous avons confirmé par immunolocalisation que SmGluCl-2 exprimée de manière hétérologue dans des cellules HEK-293 est localisée au niveau de la surface membranaire. D'autres travaux sont en cours pour démontrer la faisabilité de ce test pour l'identification par HTS de molécules modulant l'activité des récepteurs GluCl de S. mansoni. Les composés identifié pourront être utilisés comme sondes pharmacologiques afin d'approfondir l'étude des fonctions physiologiques modulées par les récepteurs GluCl de S. mansoni.
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Strasser, Rona. "Protein-protein interactions of receptors LdPEX5 and LPEX7 with PTS1 and PTS2 cargo proteins, and with glycosomal docking protein LdPEX14 for protein import into «Leishmania donovani»." Thesis, McGill University, 2014. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=122960.
Full textAbstract:
A unique subcellular structure found in Leishmania donovani is the glycosome. This organelle compartmentalizes the enzymatic machinery required for multiple metabolic pathways, including glycolysis. Correct targeting of glycosomal enzymes is essential for parasite viability. Proteins targeted to the glycosome have either a C-terminal PTS1 or N-terminal PTS2 topogenic signal sequence, which is recognized by cytosolic receptors LdPEX5 or LPEX7, respectively. These cargo-loaded receptors interact with the peroxin protein LdPEX14, located on the cytosolic face of the glycosomal membrane, an event required for import of the cargo proteins into the glycosomal lumen. However, the complete glycosomal protein import pathway has not been fully elucidated. This work has been undertaken to better understand the protein-protein interactions involved in the trafficking of cargo proteins across the glycosomal membrane.The cytosolic fraction from L. donovani parasites was used to determine protein-protein interactions of receptors LdPEX5 and LPEX7. Size exclusion chromatography, isoelectric focusing, and affinity pull-downs showed that in the cytosol these receptors form large heterologous PTS1-LdPEX5-LPEX7-PTS2 complexes. Purified glycosomes were used to evaluate the effects of receptor-cargo complexes on glycosomal LdPEX14 conformation. Limited trypsin proteolysis showed that interaction of receptor-cargo complexes with native LdPEX14 protected this protein from digestion, whereas native LdPEX14 alone was highly sensitive to proteolysis. Protection was not dependent on membrane integrity as disruption of the lipid bilayer did not alter the effect of trypsin on these proteins. Native gel electrophoresis showed that native LdPEX14 forms large ~800 kDa complexes; however, when associated with receptor-cargo complexes the molecular weight of LdPEX14 complexes increased to ~1200 kDa. Alkaline carbonate extractions showed that native LdPEX14 acts like a peripheral glycosomal membrane protein; however loading with receptor-cargo complexes caused LdPEX14 to behave like an integral membrane protein. Furthermore, membrane insertion of LdPEX14 drove insertion of LdPEX5 and LPEX7 into the glycosomal membrane. Receptor-cargo complex association causes LdPEX14 to undergo a conformational change resulting in deeper membrane insertion and increase in complex size.Purification of recombinant LPEX7 was hampered by its association with bacterial chaperone protein GroEL. A refolding technique was developed to purify LPEX7 from inclusion bodies free of bacterial proteins. Far Western and protein-protein affinity assays showed that refolded LPEX7 specifically bound PTS2 proteins as both a monomer and a dimer, the co-receptor LdPEX5, and LdPEX14. Mapping of the interaction domains on LPEX7 showed that LPEX7-PTS2 interaction required the entire receptor protein, while LdPEX5 and LdPEX14 interaction motifs were situated in the N-terminal region of LPEX7.There are metabolites in glycosomes that are not imported via the peroxin based glycosomal import pathway but by glycosomal membrane transporters. L-arginine is one such metabolite; it is the substrate for the PTS1 glycosomal enzyme arginase, which catalyses the first step in the polyamine biosynthetic pathway. L-arginine is scavenged from the extracellular milieu and by the L-arginine transporter, amino acid permease 3 (LdAAP3). Subcellular fractionation showed that LdAAP3 localized to both the plasma and glycosomal membranes. Furthermore, L. donovani promastigotes were capable of sensing the L-arginine levels in the media and upregulated LdAAP3 expression on the plasma and glycosome membrane in the absence of L-arginine. These studies provide evidence that metabolite specific transporters are present on the glycosomal membrane.Together these studies contribute to the elucidation of glycosomal function in Leishmania donovani, and a better understanding of some of the mechanisms required for glycosomal import.Le glycosome est une structure subcellulaire unique qui se trouve dans le parasite Leishmania donovani. Cette organelle compartimente la machinerie enzymatique requise pour de multiples voies métaboliques, y compris la glycolyse. Le bon ciblage des enzymes du glycosome est essentiel pour la viabilité du parasite. Les protéines ciblées pour le glycosome ont une séquence signal topogénique, un PTS1 C-terminale ou un PTS2 N-terminale, qui est reconnue par les récepteurs cytosoliques, le LdPEX5 ou le LPEX7, respectivement. Ces complexes de récepteurs chargés s'interagissent avec la protéine LdPEX14, située du côté cytosolique de la membrane glycosomale, un événement requis pour le transport des protéines à travers la membrane du glycosome. Cependant, la voie complète d'importation de protéines glycosomales n'a pas été totalement élucidée. Ce travail a été entrepris pour mieux comprendre ces interactions protéine-protéine.La fraction cytosolique des parasites L.donovani a été utilisée pour déterminer les interactions protéine-protéine des récepteurs LdPEX5 et LPEX7. La chromatographie d'exclusion de taille, la focalisation isoélectrique, et les interactions d'affinité proteine-proteine ont montré que, dans les cytosols, ces récepteurs forment des grands complexes hétérologues. Les glycosomes purifiés ont été utilisés pour évaluer l'effet des complexes récepteur sur la conformation du LdPEX14. Une protéolyse limitée a montré que l'interaction du LdPEX14 chargé avec les complexes récepteur l'à protèger de la digestion à la surface de la membrane. L'électrophorèse sur gel natif a montré que le LdPEX14 forme des grands complexes de ~ 800 kDa et que lorsqu'il est associé à des complexes récepteur, le poids moléculaire des complexes LdPEX14 passe à ~ 1200 kDa. Les extractions avec le carbonate alcalin a déterminé que le LdPEX14 seul s'agit comme une protéine périphérique; mais son chargement avec des complexes récepteur l'entrainer à s'agir comme une protéine membranaire intégrale. L'insertion de LdPEX14 dans la membrane du glycosome conduit à l'insertion du LdPEX5 et LPEX7 dans la membrane aussi. L'association des complexes récepteur à causer LdPEX14 à subir un changement de conformation causant l'insertion profonde dans la membrane et l'augmentation de la taille des complexes.La purification du récepteur LPEX7 recombinante été entravée par son association avec la protéine chaperonne bactérienne GroEL. Une technique de repliement a été développé pour purifier LPEX7 en évitant l'association de protéines bactériennes. Les techniques de Far Western et d'affinité protéine-protéine ont montré que ce LPEX7 replier est spécifiquement associé à des protéines PTS2, le co-récepteur LdPEX5, et le LdPEX14. La cartographie des domaines d'interaction de LPEX7 a montré que l'interaction LPEX7-PTS2 nécessit le LPEX7 entière, alors que les motifs d'interaction avec LdPEX5 et LdPEX14 étaient situés dans sa région N-terminale.Il y a des métabolites glycosomal qui ne sont pas importés par la voie de l'importation glycosomale, mais par des transporteurs membranaires du glycosome. L-arginine est un de ces métabolites, substrat de l'enzyme glycosomale PTS1 arginase. L-arginine est récupéré dans le milieu extracellulaire par son transporteur, LdAAP3. Un fractionnement subcellulaire a été utilisés pour séparer les membranes plasmiques des glycosomes, et LdAAP3 a été localisé sur les deux membranes. De plus, des promastigotes de L. donovani sont capable de detecter le niveau de L-arginine dans le millieu, ce qui provoque une régulation positive de l'expression de LdAAP3 à la fois dans la membrane plasmique et dans la membrane du glycosome. Ces études fournissent des preuves que des transporteurs de métabolites spécifique sont présent dans la membrane du glycosome.Ensemble, ces études contribuent à l'élucidation de la fonction glycosomale de Leishmania donovani, et une meilleure compréhension de certains mécanismes nécessaires pour l'importation glycosomale.
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Chehayeb, James. "Proteomic analysis of «Ascaris suum» fluid compartments and secretory products." Thesis, McGill University, 2014. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=123155.
Full textAbstract:
Ascaris lumbricoides infects at least 10% of the world's population and is a public health issue in most low-to-middle income countries. Survival of this parasite in its host is mediated at least in part by materials exported to the host in secretions. Although very little is known about the composition of these secretions, defining their contents and functions could shed light on the host-parasite interactions that lead to parasite establishment and persistence in the host. Ascaris suum, a parasite of pigs, was used as a model organism because its genome has been sequenced and it is closely related to the human parasite, A. lumbricoides. Excretory/secretory products (ESP), uterine fluid (UF) and perienteric fluid (PE) were collected from adult A. suum. Proteins isolated from these compartments were subjected to LC-MS/MS and analyzed using bioinformatic tools. The ESP fraction included many proteins also present in UF. Proteins found in ESP but not in UF had a considerably different categorical composition than PE or UF, which are similar to each other. We conclude from these data that proteins exported through the secretory apparatus have distinct patterns of biological function and that UF proteins are likely derived from PE. In addition, ESP from A. suum was compared to ESP from Brugia malayi and ESP from Heligmosomoides polygyrus in terms of protein composition. We concluded that A. suum secretome is conserved through both phylogeny and predilection site.Ascaris lumbricoides infecte au moins 10% de la population mondiale et est une problématique de santé publique dans les pays en voie de développement. La survie de ce parasite dans son hôte est médiée d'une part par des substances exportées à son hôte par voies de secrétions. Bien que peu d'informations soient connues sur la composition de ces substances, définir leur contenu ainsi que leurs fonctions pourraient aider à clarifier la relation entre le parasite et son hôte. Ascaris suum est un parasite du porc utilisé comme organisme-modèle en raison de son génome séquencé et de sa similarité morphologique avec le parasite de l'homme, A. lumbricoides. Les produits de secrétions/excrétions (PSE), le fluide perientérique (FPE) et le fluide utérin (FU) ont été obtenus des femelles adultes d'A. suum. Les protéines contenues dans ces fluides ont été isolées et soumises à LC-MS/MS et ont ensuite été soumises à des analyses bioinformatiques. Une fraction de PSE inclut plusieurs protéines qui se trouvent aussi dans FU. Les protéines trouvées dans les PSE, mais absentes du FU, avaient une composition catégorique différente comparée aux FPE et au FU, lesquels montraient une composition similaire. Nous concluons par ces résultats que les protéines exportées par l'appareil de sécrétion ont des motifs distincts en termes de fonctions biologiques et que les protéines du FU sont dérivées du FPE. De plus, le PSE d' A. suum a été comparé au PSE de Brugia malayi et au PSE de Heligmosomoides polygyrus. Nous avons conclu que le secretome d' A. suum est conservé à la fois par phylogénie et l'emplacement de l'infection dans l'hôte.
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Davidsen, Amanda. "Biophysical investigations of structural features and interactions of «Leishmania donovani» Peroxin 5." Thesis, McGill University, 2014. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=123260.
Full textAbstract:
Parasites of the genus Leishmania cause a broad array of diseases, collectively termed leishmaniasis. These diseases range in morbidity; the cutaneous form is typically self healing, while the mucocutaneous and visceral manifestations require chemotherapeutic intervention to avoid lethality. At present there is no vaccine, and current methods of chemotherapeutic intervention have severe drawbacks, together creating a dire need for new options to combat these destructive diseases. An organelle within the parasite, the glycosome, has been identified as an attractive drug target. The glycosome compartmentalizes several enzymes from important biosynthetic and metabolic pathways, which has been shown to be necessary for the viability of the parasite. Although the organelle is structurally and evolutionarily related to peroxisomes of higher eukaryotes, the import machinery of the organelles differs significantly. The majority of proteins entering the glycosome contain a C-terminal PTS1 tri-peptide sequence, which is readily recognized and bound by the soluble cytosolic receptor LPEX5. The receptor binds PTS1 cargo in the cytosol, shuttling it to the glycosomal membrane where the protein interacts with LPEX14, a peripherally membrane bound protein. The interaction with LPEX14 at the glycosomal membrane, facilitated by several other biogenesis proteins, initiates the formation of a transient import pore. In this thesis research project the role of Leishmania donovani PEX5 (LdPEX5) in formation of this crucial import pore was analyzed. Using biophysical techniques, it was found that interaction of the receptor with a PTS1 did not cause major changes in secondary structure, although did provoke a conformational change in the protein, preceding and possibly facilitating its interactions with LdPEX14 at a glycosomal membrane. Using large unilamellar vesicles mimicking the glycosomal lipid composition, the domain of LdPEX5 necessary to interact with LdPEX14 was then narrowed to 268-302. Furthermore, using serial carbonate-urea extractions, the domain identified to be necessary for interaction with LdPEX14 at a glycosomal mimetic was also found to insert into the liposomal membrane, implying that the insertion of LdPEX14 into the glycosomal membrane could be drawing LdPEX5 into the membrane as part of pore formation. In conclusion, this study has implicated LdPEX5 in having a central role in formation of the transient glycosomal import pore.Les parasites du genre Leishmania provoquent un large éventail de maladies, appelées collectivement leishmanioses. Ces maladies varient en termes de morbidité ; la forme cutanée se conclut généralement par une auto-guérison, alors que les manifestations cutanéo-muqueuses et viscérales nécessitent une intervention chimiothérapeutique pour éviter le décès. À l'heure actuelle, il n'existe aucun vaccin, et les méthodes actuelles d'intervention chimiothérapeutique présentent de graves conséquences. Il existe aujourd'hui un besoin urgent de trouver de nouvelles options pour lutter contre ces maladies destructrices. Un organite dans le parasite, le glycosome, a été identifié comme une cible thérapeutique intéressante. Le glycosome compartimente plusieurs enzymes de biosynthèses et voies métaboliques importantes; il a été prouvé que cet organite est nécessaire pour assurer la viabilité du parasite. Bien que l'organite soit structurellement et évolutivement lié aux peroxysomes des eucaryotes supérieurs, le mécanisme d'importation des organites diffère sensiblement. La majorité des protéines entrant dans le glycosome contient une séquence tri-peptide PTS1 C-terminal, qui est facilement reconnue et liée par le récepteur cytosolique soluble LPEX5. Le récepteur se lie au cargo PTS1 dans le cytosol, le conduisant vers la membrane glycosomale où la protéine interagit avec LPEX14, une protéine liée à la membrane périphérique. L'interaction avec LPEX14 au niveau de la membrane glycosomale, facilitée par plusieurs autres protéines de biogenèse, initie la formation d'un pore d'importation transitoire. Dans ce projet de thèse, le rôle de PEX5 dans la formation de ce pore d'importations essentiel a été analysé chez Leishmania donovani. En utilisant des techniques biophysiques, il a été constaté que l'interaction du récepteur avec un PTS1 n'a pas causé de changements majeurs dans la structure secondaire, bien qu'elle ait provoqué un changement de conformation de la protéine, précédant et éventuellement facilitant ses interactions avec LdPEX14 à une membrane glycosomale. Grâce à l'utilisation de grandes vésicules unilamellaires mimant la composition lipidique glycosomale, le domaine de LdPEX5 nécessaire pour interagir avec LdPEX14 fut ramené à 268-302. En outre, en utilisant des extractions carbonate-urée en série, il a été prouvé que le domaine identifié comme étant nécessaire pour l'interaction avec LdPEX14 au mimétique glycosomal, s'insère dans la membrane liposomale. De ce fait, l'insertion de LdPEX14 dans la membrane glycosomale pourrait tirer LdPEX5 dans la membrane dans le contexte de la formation de pores. En conclusion, cette étude a démontré que LdPEX5 possède un rôle central dans la formation du pore d'importation glycosomale transitoire.
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Kvasager, Danielle Kay. "Prevalence, Statistical Trends and Phylogenetics of Blood Parasites (Haemosporidia| Haemoproteus, Plasmodium and Leucocytozoon) in Songbird Passerines from Grasslands of northwest Minnesota." Thesis, The University of North Dakota, 2016. http://pqdtopen.proquest.com/#viewpdf?dispub=10003494.
Full textAbstract:
Passerine birds that primarily use grassland habitats are rarely the focus of a parasite study. With many rapidly declining bird populations that breed at even faster decreasing grassland habitat, it is important to know the potential risks to the birds posed by blood parasites. During the breeding seasons of 2009-2011, 150 samples from 148 individual birds (fourteen species) were collected from five grassland sites in northwest Minnesota, USA and surveyed for blood parasites using microscopy and molecular methods. Eighty-five (56.67%) of the 150 samples were infected with at least one of three haemosporidian genera: Haemoproteus, Plasmodium and Leucocytozoon. Seventy (46.67%) of the 150 samples were infected with either Haemoproteus or Plasmodium (fourteen infections were Haemoproteus, forty were Plasmodium and sixteen were undetermined due to dual infections or lack of sequences) and 41 samples (27.33%) were infected with Leucocytozoon, for a total of 111 infections. Plasmodium infections in two juvenile bobolinks provide evidence of active transmission within the study area. Haemoproteus/Plasmodium prevalence was significantly higher in May and June than in later collection months (July-Sept.) and dual infections were significantly higher in June compared with other sampling months. Of the three bird species that were sampled most, clay-colored sparrows (Spizella pallida) had significantly more Haemoproteus infections than savannah sparrows (Passerculus sandwichensis) and bobolinks (Dolichonyx oryzivorus). Only bobolinks were classified based on sex and/or age and adult males had significantly more Leucocytozoon and dual infections than adult females or juveniles. Parasite prevalence did not differ significantly between study sites or years. Phylogenetic reconstructions based on Maximum Likelihood and Bayesian analyses produced three major clades, corresponding to the three haemosporidian genera. Bird host species were well mixed within the trees, indicating infective vectors fed on bird species opportunistically rather than selectively and also shows that the Haemosporidia are generalists, being able to infect a wide range of the sampled bird species.
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Varrecchia, Melissa M. "Identification and Characterization of the Forkhead Box Family of Transcriptional Regulators in Parasitic Schistosomes." Case Western Reserve University School of Graduate Studies / OhioLINK, 2017. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=case149728975688442.
Full text
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Lim, Caeul. "Understanding the Determinants of Human Red Blood Cell Tropism of Understudied Plasmodium Species." Thesis, Harvard University, 2016. http://nrs.harvard.edu/urn-3:HUL.InstRepos:33493488.
Full textAbstract:
Malaria control programs in the past decade have been successful in decreasing the global burden of Plasmodium falciparum, the more virulent of the Plasmodium species causing malaria in humans. However, as the public health community gears towards elimination and eradication of malaria, there is need for an attention shift towards research of neglected Plasmodium species.
A central event in malaria pathogenesis is the invasion of host red blood cells (RBCs) mediated by specific interactions between parasite ligands and RBC receptors. These interactions, also called invasion pathways, can be major determinants of host tropism.
Restriction in invasion due to tropism is attributed to limiting disease severity, as it limits the proliferation of the parasite in vivo. In this dissertation, we determine the host cell tropism of Plasmodium knowlesi and Plasmodium vivax, two understudied Plasmodium species. The zoonotic P. knowlesi is now the major cause of malaria in parts of South East Asia, and P. vivax is the most widespread species worldwide causing substantial morbidity. After a review of the current literature on biological and clinical features of these species and their invasion pathways in Chapter 1, we determined the tropism of P. knowlesi in human RBCs in Chapter 2. We used density-based enrichment methods to test the invasion of P. knowlesi into human RBCs of varying age. Incorporating mathematical modeling and experimental adaptation, we demonstrated that an expansion of host cell niche is required for the parasite to reach densities observed clinically. We also obtained parasite lines adapted to efficient proliferation in human RBCs. In Chapter 3, we investigated the molecular basis of increased invasion of human RBCs through whole genome sequencing analysis of newly human-adapted lines, as well as historical strains we adapted to in vitro culture. We showed that different genetic changes in P. knowlesi can lead to the upregulation of PkDBPα-DARC pathway, and have provided evidence of major divergence in invasion ligands in recent field isolates.
Finally, in Chapter 4, we studied the variation in human RBC preference of patient isolates for P. knowlesi and P. vivax. We confirmed that recent human P knowlesi isolates also vary in the niche of susceptible RBCs, with a subset exhibiting a lack of restriction in invading human RBCs. We also evaluated ex vivo P. vivax patient isolates for their host RBC preference. We determined that P. vivax field isolates differ in their level of reticulocyte preference. We further found an association between increased reticulocyte preference and schizont maturation. This body of work aims to contribute to our overall understanding of human RBC tropism of Plasmodium species of public health importance and the implication this has for parasite adaptation to humans.Biological Sciences in Public Health
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Demas, Allison Ross. "Selection at Work in Plasmodium Falciparum: Lessons From the Expanded Acyl CoA Synthetase Gene Family and in Vitro Artemisinin Resistance." Thesis, Harvard University, 2016. http://nrs.harvard.edu/urn-3:HUL.InstRepos:33493610.
Full textAbstract:
Approximately one third of the world’s population is at risk of contracting malaria. The World Health Organization estimates there were over 200 million news cases of malaria in 2015, resulting in nearly 500,000 deaths from this preventable disease. The majority of fatalities occur in Sub-Saharan Africa, where Plasmodium falciparum malaria causes severe disease in children under the age of five and pregnant women. In the last decade, increased anti-malaria interventions have resulted in substantial decreases in cases and fatalities. However, the recent emergence of artemisinin drug resistance in Southeast Asia threatens these gains, and the loss of another first-line antimalarial therapy would be a devastating setback.
The first goal of this work was to identify genetic markers of artemisinin drug resistance. Identifying the genetic determinants and molecular mechanisms of artemisinin resistance is crucial for understanding the emergence of this phenomenon and tracking the spread of these drug resistant parasites. Over the course of four years, we used an in vitro drug resistance selection approach to generate three independent artemisinin-resistant lines. Here we characterize those lines, and present Pfcoronin, a kelch13-like protein, as a novel candidate marker for artemisinin resistance. This study identifies additional non-kelch13 molecular markers of artemisinin resistance, increases our understanding of how this resistance is acquired, and sheds light on the molecular mechanisms of artemisinin resistance in the parasite.
In contrast to in vitro selection, natural selection of parasites occurs during natural infection. Investigation of specific genes under selection in the parasite will increase our understanding of biological processes that provide a fitness advantage, and potentially identify novel pathways for therapeutic development.
Here, we focused on the acyl Co-A synthetase (ACS) gene family, previously shown to be under recent positive selection in P. falciparum. The signatures of recent positive selection identified in natural parasite populations suggest that particular ACS alleles may confer a selective advantage. Using molecular genetics approaches, we show distinct expression and localization patterns for individual ACS isoforms, and identify a growth defect in the ACS5 knockout line. Follow up studies characterize the fatty acid and metabolic profiles of individual ACS knockout lines, and point to a role for ACS5 in central carbon metabolism in P. falciparum.
Our investigation of the ACS gene family and their role in P. falciparum growth and metabolism led us to hypothesize a link between ACS activity and central carbon metabolism. In the final chapter, we explore the basic fatty acid and glucose requirements for P. falciparum growth in vitro, and present a metabolic profile for these starved parasites. Under starvation conditions, we were able to demonstrate fatty acid oxidation activity in the parasite. This is an unexpected finding, as this pathway was not previously annotated in the genome.
Taken together, these two projects tell a story of the selective pressures acting on P. falciparum parasites. Investigating in vitro selected artemisinin-resistant lines provides important insights into genetic markers and acquisition of resistance. Molecular and biochemical characterization of a gene family under natural selection in P. falciparum increases our understanding of important metabolic pathways that support parasite growth.Biological Sciences in Public Health
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Diawara, Aïssatou. "Molecular and epidemiological studies on human soil-transmitted helminths before and after albendazole treatment." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=119411.
Full textAbstract:
Soil transmitted helminths (STHs) are gastrointestinal nematodes of humans. Periodic deworming with albendazole (ABZ) and mebendazole (MBZ) is applied to control STHs. However, repeated treatment can cause selection of mutations in the β-tubulin gene at codons 167, 198 and 200 leading to resistance. To maintain an effective control strategy it is crucial to identify resistance, if any, at an early stage. Method: We have developed accurate molecular assays for STHs to detect β-tubulin genetic changes at codons 200, 167 and 198 associated with resistance. We also optimized the in vitro egg hatch assay (EHA) for canine hookworms and have applied it to human hookworms for assessing the response to BZs. Both assays have been tested on samples collected in endemic countries. Furthermore we carried out a 14-month longitudinal study in Haiti to investigate the response of STHs to two rounds of ABZ treatment in endemic communities naive for ABZ. Results: We validated genetic markers with control plasmids in hookworms, A. lumbricoides and T. trichiura for codons 167,198 and 200. We also identified at low frequency, before and after treatment, the resistance-associated SNP at codon position 200 in hookworms from Kenya, while the egg reduction rate (ERR) values indicated good drug efficacy. In A. lumbricoides, a SNP at position 167 was identified at high frequency before and after one drug treatment of subjects in Haiti, Kenya and Panama while ABZ efficacy remained high. In T. trichiura, the SNP at codon position 200 was detected and there was a significant increase in the homozygous resistance-type in Haiti and Kenya after one round of ABZ treatment. The associated drug efficacies, based on faecal egg counts (FEC), were low in Kenya and moderate in Haiti. From this result in Haiti, we classified subjects infected with T. trichiura into good, intermediate or poor ABZ responders. The frequency of SNPs 198 and 200 increased significantly after one round of ABZ treatment in the intermediate and poor response groups. Conclusion: This study has shown for the first time evidence of an association between genetic changes in the β-tubulin gene of T. trichiura and poor ABZ efficacy against this parasite.Contexte: Les géohelminthes sont des nématodes parasitant le système gastrointestinal de l'Homme. Pour lutter contre les géohelminthiases une des stratégies consiste à déparasiter périodiquement avec l'albendazole (ABZ) et le mébendazole (MBZ). Cependant, l'utilisation répétitive de BZ peut causer une sélection au niveau du gène de la β-tubuline aux codons 167, 198 et 200 et entraîner une résistance. Pour maintenir une stratégie de contrôle efficace, il est indispensable de détecter rapidement la résistance, si présente. Méthode : Dans ce contexte, nous avons développé pour les géohelminthes des tests moléculaires précis pour détecter les changements génétiques de la β-tubuline aux codons 167, 198 et 200, associés à la résistance. Nous avons aussi optimisé un test in vitro, le EHA, chez les ankylostomes infestant la race canine. Les deux tests (moléculaire et in vitro), ont été expérimentés sur des échantillons collectés dans des pays endémiques aux géohelminthes. De plus, nous avons mené, une étude longitudinale de 14 mois en Haiti afin d'investiguer la réponse des géohelminthes à deux traitements d'ABZ. Résultat: Dans cette étude, des marqueurs génétiques des codons 200 chez les ankylostomes, puis 167 et 198 chez les ankylostomes, A. lumbricoides et T. trichiura ont été validés par des plasmides de contrôles. Nous avons aussi identifié à faible fréquence avant et après traitement, le SNP 200 chez des ankylostomes collectés au Kenya. Cependant, l'efficacité de l'ABZ était élevée. Chez A. lumbricoides, le SNP 167 a été identifié à forte fréquence avant et après traitement en Haiti, au Kenya et au Panama alors que l'efficacité de l'ABZ était élevée. Chez T. trichiura, le SNP 200 a été détecté et il y a eu une augmentation significative de l'homozygote de type résistant chez les parasites collectés au Kenya et en Haiti. L'efficacité de l'ABZ estimée par le nombre d'œufs compté, était faible au Kenya et modérée en Haiti. A partir de ces résultats, en Haiti, nous avons classés les individus infestés par T. trichiura en trois groupes de réponse à l'ABZ : "bonne", "intermédiaire" et "faible" réponse au traitement. Après un traitement, les fréquences des SNPs 198 et 200 ont augmenté significativement dans les groupes de réponse intermédiaire et faible. Conclusion : Cette étude a montré pour la première fois, la preuve de l'existence d'une association entre les changements génétiques au niveau de la β-tubuline et la faible efficacité de l'ABZ chez T. trichiura.
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Zanet, Phillip. "Characterization of two novel cysteine proteases in the free-living organism «Macrostomum ligano »." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=119584.
Full textAbstract:
The objective of this study was to explore Macrostomum lignano, a free-living organism, as a model organism for parasitic trematodes, such as Fasciola and Schistosoma, in order to better understand the role of their cysteine proteases (cathepsins). Using a bioinformatics approach, two novel cysteine proteases genes (mlcl1 and mlcb2) were identified and phylogenetically characterized. These genes were synthesized, cloned into the yeast secretory system Pichia pastoris (Invitrogen), and functionally-active recombinant proteins were expressed and purified. These recombinant peptidases were then characterized biochemically in terms of activity and stability in various conditions including temperature, salinity and pH. Antibodies specific for the recombinant proteins were generated through a peptide or whole-protein immunization, and tested against both the recombinant proteins and the worm extract proving that the proteins exist in the worm. These studies lay the foundation for further investigations on the biological function of the cysteine peptidases using RNAi and confocal microscopy. In conclusion, M. lignano is a tractable model organism for its parasitic counterparts.L'objectif de cette recherche était d'explorer l'organisme, vivant en liberté dans la nature, Macrostomum lignano en tant qu'organisme modèle pour ses cousins parasites, Fasciola et Schistosoma, et de mieux comprendre le rôle de leurs protéases cystéines (cathepsins). En utilisant une approche bioinformatique, deux nouveaux gènes de protéases cystéines (mlcl1 et mlcb2) ont été découverts et caractérisés phylogénétiquement. Ces gènes ont été synthétisés, clonés dans un système de sécrétion employant la levure Pichia pastoris (Invitrogen) et exprimés en tant que protéases recombinantes et actives. Ces protéases recombinantes ont alors été caractérisées biochimiquement en termes d'activité et de stabilité dans diverses conditions telles que la température, la salinité et le pH. Des anticorps spécifiques aux protéines recombinantes ont été générés en immunisant des mammifères avec des séquences de peptides ou la protéine recombinante entière, et ont été testés avec l'extrait du vers prouvant ainsi que les protéines sont bel et bien exprimées. Ces études jettent la base pour l'investigation sur la fonction biologique des protéases cystéines par l'emploi du RNAi et de la microscopie confocale. En conclusion, M. lignano est un organisme modèle tractable pour ses cousins parasites.
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Cyr, Normand. "Role of «Leishmania donovani» peroxin 14 in glycosomal import machinery." Thesis, McGill University, 2013. http://digitool.Library.McGill.CA:80/R/?func=dbin-jump-full&object_id=114123.
Full textAbstract:
Peroxisomes are organelles found in eukaryotic cells where several oxidative processes take place. Enzymes destined for the peroxisome generally contain either a C-terminal or a N-terminal peroxisomal targeting signal, named PTS1 and PTS2 respectively. These signals are cytosolically recognized by their correspondent receptors PEX5 and PEX7 prior to being recruited at the surface of the peroxisomal membrane where the complex docks onto PEX14. Then, enzymes are transported in a natively folded fashion inside the organelle where they are released. In trypanosomatids, other metabolic pathways, including glycolysis, are also segregated in the organelle, which has been renamed the glycosome to better reflect its purpose. To gain a better understanding about this transport and translocation machinery that exist in Leishmania donovani, we have first looked at the quaternary structure of the docking protein LdPEX14, and the implication of several domains on the protein using various biochemical and biophysical techniques. Using gel permeation chromatography, analytical ultracentrifugation and chemical cross-linking, we observed that LdPEX14 was forming large oligomeric structures of varying sized both in solution and within the parasite. By domain mapping studies, we identified three domains on LdPEX14, the LdPEX5 binding site, an hydrophobic region and a predicted leucine zipper, to all being implicated in the formation of such oligomer. Moreover, we investigated the structural changes that take place on LdPEX14 upon binding LdPEX5. Both isothermal titration calorimetry and fluorescence spectroscopy revealed that the hydrophobic region of LdPEX14 became more exposed to the solvent upon attachment to LdPEX5. Likewise, circular dichroism studies demonstrated that a portion of LdPEX14 was losing some secondary structure upon binding to LdPEX5, which was also linked to the formation of a more compact complex based on analytical ultracentrifugation experiments. We hypothesized that these structural features and conformational changes could be link to the formation of pore that will facilitate the translocation of proteins targeted to the glycosome. Such oligmeric structure was also confirmed by immunoelectron microscopy using parasite sections. LdPEX14 clusters adopted round, rosette-like shapes of about 30-40 nm in diameter and were found mainly at the surface of the glycosomal membrane. A lipidomic investigation of the glycosomal membrane from Leishmania donovani revealed the presence of very long chain polyunsaturated fatty acids, and of a relatively high proportion of the negatively charged phospholipids phosphatidyl glycerol and phosphatidyl inositol. These phospholipids appeared to be essential for a proper membrane attachment of LdPEX14. Domain mapping showed that the hydrophobic region of LdPEX14, comprised between the amino acids 149 and 179, was essential for proper binding to liposomes mimicking the glycosomal membrane phospholipid composition. Bioinformatics analysis revealed that this region also contains a important cluster of basic residues which we hypothesize could be involved in the initial membrane attachment. A further investigation using fluorescence spectroscopy showed that this region was sufficient for binding to liposomes mimicking the glycosomal and was penetrating the lipid bilayer. By performing a dye leakage assay from the liposomes, we observed that ldpex14 (120-200), a peptide comprising the hydrophobic region of LdPEX14, was capable of perforating the liposomes and cause a leakage of the encapsulated dye. Finally, using density flotation assays with liposomes, we demonstrated that not only LdPEX14 was recruting LdPEX5 at the surface of the bilayer, but that LdPEX5, upon attachment, was adopting a conformation similar to integral membrane proteins. This observation tends to suggest that LdPEX5 could also be implicated in the pore formation for the translocation of glycosomal enzymes.Le peroxysome est un organite où plusieurs procédés oxydatifs prennent place. Les enzymes destinés au peroxysome contiennent un signal peptidique soit à leur terminal C ou N, nommés PTS1 ou PTS2 respectivement. Ce signal est reconnu dans le cytoplasme par son récepteur correspondant (PEX5-PTS1, PEX7-PTS2) où le complexe PTS1-PEX5/PEX7-PTS2 s'arrime à PEX14. Ensuite, les enzymes sont transportés sous leur forme native à l'intérieur de l'organite où ils sont relâchés de leur récepteur. Chez les trypanosomatides, plusieurs voies métaboliques, incluant la glycolyse, sont ségrégées dans l'organite (renommé le glycosome pour refléter la présence d'enzymes glycolytiques). Afin d'obtenir une meilleure compréhension à propos du transport et de la machinerie de translocation existant chez Leishmania donovani, nous avons d'abord déterminé la structure quaternaire, en utilisant diverses techniques biochimiques et biophysiques. En faisant usage de la chromatographie d'exclusion stérique, de l'ultracentrifugation analytique et de la réticulation chimique, nous avons observé que LdPEX14 forme de larges structures oligomériques de taille variable en solution et dans le parasite. En excluant différents domaines sur LdPEX14, nous avons identifiés trois domaines impliqués dans la formation de ces oligomères: (i) le site d'attachement à LdPEX5, (ii) une région hydrophobe et (iii) une glissière à leucine. De plus, nous avons recherché quels étaient les changements structuraux prenant place sur LdPEX14 lors de l'attachement à LdPEX5. En utilisant la calorimétrie isotherme à titration et la spectroscopie de fluorescence, nous avons découvert que la région hydrophobe de LdPEX14 devenait exposée au solvant lorsque LdPEX5 s'y attachait. De plus, des études de dichroïsme circulaire ont démontré qu'une portion de LdPEX14 perdait une partie de sa structure secondaire lors de l'attachement à LdPEX5, ce qui fut aussi relié à la formation d'un complexe LdPEX14-LdPEX5 plus compact, tel qu'illustré par ultracentrifugation analytique. Nous avons donc supposé que ces propriétés structurelles et ces changements de conformation seraient liés à la formation d'un pore qui faciliterait la translocation des protéines dirigées vers le glycosome. La structure oligomérique de LdPEX14 fut aussi confirmée par microscopie immuno-électronique en utilisant des sections de parasite. La protéine LdPEX14 s'assemblait en grappes formant des rosettes d'environ 30 nm de diamètre, principalement à la surface extérieure de la membrane du glycosome. Une étude lipidomique de la membrane du glycosome a révélé une proportion importante de phosphatidyl glycérol et de phosphatidyl inositol, phospholipides chargés négativement. Ces derniers sembleraient essentiels pour l'attachement de LdPEX14 à la membrane du glycosome. Nous avons ensuite démontré que la région hydrophobe de LdPEX14, comprise entre les acides aminés 149 et 179, était essentielle pour l'attachement à des liposomes imitant la membrane du glycosome. Une investigation plus poussée, utilisant la spectroscopie de fluorescence, a montré que cette région était suffisante pour l'attachement à des liposomes imitant la membrane du glycosome, et était de plus capable de pénétrer cette membrane. En effectuant un test d'écoulement de colorant fluorescent encapsulé dans les liposomes, nous avons observé que ldpex14(120-200), un peptide comprenant la région hydrophobe de LdPEX14, était capable de perforer les liposomes et causer un écoulement du colorant fluorescent. Finalement, en utilisant des tests de flottaison par densité différentielle avec des liposomes, nous avons démontré que non seulement LdPEX14 est capable de recruter LdPEX5 à la surface des liposomes, mais que LdPEX5 finissaient par adopter une conformation semblable à une protéine membranaire intégrale. Cette observation tend à suggérer que LdPEX5 pour elle aussi être impliquée dans la formation d'un pore pour la translocation d'enzymes destinés pour le glycosome.
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Montoya-Lerma, James. "Biology of visceral leishmaniasis vectors in San Andres de Sotavento focus (Cordoba, Colombia)." Thesis, London School of Hygiene and Tropical Medicine (University of London), 1996. http://researchonline.lshtm.ac.uk/682292/.
Full textAbstract:
Throughout its range of South and Central America, visceral leishmaniasis due to Leishmania chagasi is transmitted by Lutzomyia longipalpis. Recently, a new vector, Lutzomyia evansi, has been discovered transmitting the parasite in the Caribbean Coast of Colombia. Field studies, using both experimental and observational methodologies were employed to elucidate the main ecological and behavioural factors affecting disease transmission in the focus of San Andres de Sotavento, northern Colombia. Nine species of Lutzomyia were present and Lu. evansi constituted 90% of all sandflies caught. Flies were most abundant in April, May June and September. Trapping in and around houses showed Lu. evansi to be endophilic but with exophagic behaviour, preferring houses near to forest edge as resting places. Host preference, measured using a newly designed trap in a rotational experimental design, showed that humans were preferred over dogs or opossums (reservoirs) during the peak abundance of Lu. evansi. This was supported by catches on tethered hosts and bloodmeal analysis although location of capture of resting flies was also a significant factor. Mark-release-recapture studies showed that Lu. evansi can move up to 800m after 5 days and that freshly fed flies move a few hundred metres to resting sites. Basic life history data on Lu. evansi was obtained from laboratory rearing. This species was bred under laboratory conditions though high mortalities were seen in first instars. In adults survival was associated with different types of sugar. Flagellate parasites resembling L. chagasi were found in 3 of 5326 wild caught Lu. evansi (0.05%) however, culturing and subsequent characterization of these isolates failed. Experimental infections with L. chagasi showed that at least one strain of the parasite grew more prolifically in Lu. longipalpis than in Lu. evansi. This, together with a limited vector range compared to the Old World L. infantum is suggested to be the result of a recent parasite-vector association. Morphologically no differences were seen between Colombian, Venezuelan and Costa Rican Lu. evansi populations. Some variation was seen however in one enzyme (6GPDH) of 18 isozymes tested. Mitochondrial DNA variation was seen between Central and South American populations.
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Koskella, Britt L. "An examination of host-parasite coevolution and negative frequency-dependent selection in a snail-trematode system." [Bloomington, Ind.] : Indiana University, 2008. http://gateway.proquest.com/openurl?url_ver=Z39.88-2004&rft_val_fmt=info:ofi/fmt:kev:mtx:dissertation&res_dat=xri:pqdiss&rft_dat=xri:pqdiss:3331252.
Full textAbstract:
Thesis (Ph.D.)--Indiana University, Dept. of Biology, 2008.Title from PDF t.p. (viewed on Jul 27, 2009). Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 69-11, Section: B, page: 6617. Adviser: Curt M. Lively.
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O'Leary, Patricia Anne. "The Development of Fiddler Crabs (Uca Spp.) as a Comparative Model System for the Parasitic Dinoflagellate, Hematodinium Perezi and its Natural Host the Blue Crab, Callinectes Sapidus." W&M ScholarWorks, 2018. https://scholarworks.wm.edu/etd/1550153657.
Full textAbstract:
Herein, I have completed several experiments which encompass developing fiddler crabs as a model system, as well as sentinel and temperature studies to investigate biotic and abiotic factors in parasite transmission. My studies show which factors prevent, delay, or accelerate transmission and progression of H. perezi. The fiddler crab experiments by chapter are as follows: Chapter 1. I screened adult and juvenile fiddler crab populations for naturally occurring H. perezi infections at endemic and non-endemic sites. No natural infections were found in the adult or juvenile populations (Chapter 1 and 3). I completed inoculation trials with U. minax, U. pugnax, and U. pugilator, demonstrating that the parasite can survive and replicate in these species. Fiddler crabs can live for several months with patent infections. For example, I successfully transferred H. perezi from blue crab to fiddler crab and back to blue crab. Through serial inoculations I was able to serially maintain the parasite in the lab year-round. Building on the above experiments, I completed minimum dose studies which showed that a minimum inoculum of 1,000 parasite cells was required for patent infections. Additionally, I evaluated parasite progression through studies using Uca minax. These studies which used an inoculum in the ameboid trophont and clump colony stages showed that H. perezi progresses through its life-history stages in fiddler crabs as it would in blue crabs, with the filamentous trophont stage first observed in the hemolymphs smears followed by the ameboid trophont stage. Chapter 2. Intertidal environments are well known as areas of environmental extremes, and accordingly the animals that reside there have adapted to those conditions out of necessity. One abiotic factor that can have large diel variation is temperature. to address the impact of temperature variation of the marsh and subtidal habitat on H. perezi, I developed laboratory temperature experiments with nascent infections (7 °C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C), with patent infections (10°C, 15°C, 20°C, 30°C), and a progression series over fine scale (15°C, 17°C, 19°C, 20°C) temperature increments. These studies demonstrated that growth of the parasite is limited at the higher and lower temperatures, and that H. perezi is eliminated from the host at 30°C. This was confirmed by hemolymph smears, histology, and PCR. Chapter 3. The successful laboratory inoculations and lack of infections in fiddler crabs from endemic areas led to additional field deployments. These experiments aimed to address the dissonance of the initial results. My sentinel studies included fiddler crabs deployed in a crab pot from a pier touching bottom, deployed from the pier approximately mid-tidal height, deployed mid-marsh in mesh cages without access to bury, and deployed mid-marsh with access to bury. Fiddler crabs can obtain H. perezi infections in the marsh when caged without access to bury or when fully or partially submerged from a pier. However, they do not obtain H. perezi infections when given access to bury. Natural behaviors, such as burying along with elevated marsh temperatures likely prevent the establishment of H. perezi in the natural fiddler crab population.
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Peterson, Jennifer Kate. "Life history consequences of infection with Chagas disease agent Trypansoma cruzi for its invertebrate host Rhodnius prolixus." Thesis, Princeton University, 2015. http://pqdtopen.proquest.com/#viewpdf?dispub=3686674.
Full textAbstract:
Every interaction between species occurs in a heterogeneous environment that presents countless contexts that shape the interaction over time and space. The consequences of these interactions can regulate populations, as they trickle down to influence the genes that an individual passes on to its offspring, and then, in turn, scale back up to influence the genetic and phenotypic composition of future populations. In this work, I sought to uncover how these principles play out in the interactions between an invertebrate vector of human disease and the disease agent it carries. Disease vectors are often considered in a context that is faithful to the word as it is used in physics, where the vector is viewed as public transportation that moves the pathogen between hosts, experiencing no consequences of parasite infection. However, vectors face the challenge of how to maximize individual fitness in a stochastic environment with limited resources just as all other species do, so why would they be exempt from the effects of being parasitized? As such, I investigated the triatomine bug species Rhodnius prolixus when infected with the parasite Trypanosoma cruzi (etiological agent of Chagas disease), and co-infected with T. cruzi and its sister species, T. rangeli. I asked, does T. cruzi affect R. prolixus fitness, and under what contexts does this effect vary? I found a large range of variation in R. prolixus fitness when infected with T. cruzi, with the outcome being influenced by parasite strain, co-infection with T. rangeli, parasite dose, and the timing and order of infection. These factors did not act alone, but seemed to be dependent on one another: it was better to have a co-infection at lower T. rangeli doses, but at high T. rangeli doses, it was better to be infected with T. cruzi first, suggesting an interaction between dose, order and timing. These results illustrate the interactions across scales of both biological and spatio-temporal complexity that can be revealed when studying infectious disease through an ecological lens. Moreover, this work emphasizes the importance of taking into account the ecology of vector-borne neglected tropical diseases such as Chagas disease.
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Dankwa, Selasi. "Sialic acid variation as a determinant of Plasmodium invasion of erythrocytes in malaria infection." Thesis, Harvard University, 2015. http://nrs.harvard.edu/urn-3:HUL.InstRepos:17467188.
Full textAbstract:
Sialic acids are acidic sugars that terminate glycan chains on proteins or lipids on vertebrate cell surfaces. They vary greatly in structure, presentation and amount, all of which are important physiologically, but can also impact the tissue and host tropism of diverse pathogens.
Parasites of the genus Plasmodium cause malaria, a disease characterized by a cyclical process of parasite invasion of host erythrocytes, growth and replication and fresh invasion of new erythrocytes. During erythrocyte invasion – an event central to malaria pathogenesis – proteins on the surface of the parasite, known as invasion ligands, bind to specific erythrocyte receptors, many of which are sialylated. In this dissertation, we determined how sialic acid variation impacts erythrocyte invasion by the zoonotic parasite, Plasmodium knowlesi and the most virulent human parasite, Plasmodium falciparum.
For studies on P. knowlesi, we determined if Neu5Gc, a sialic acid that is absent in humans but present in most other primates, is a major determinant of parasite tropism. We used the recently described ex vivo erythrocyte culture system to transgenically express the CMAH enzyme, responsible for production of Neu5Gc. P. knowlesi showed significantly increased invasion of Neu5Gc-expressing human erythrocytes, providing evidence that loss of Neu5Gc in humans restricts P. knowlesi invasion of human erythrocytes. We then biochemically characterized two P. knowlesi invasion ligands of the EBL family and found they specifically bind Neu5Gc. These ligands potentially mediate Neu5Gc-dependent invasion of human and macaque erythrocytes. We finally showed that in natural human infections, P. knowlesi can adapt to infect erythrocytes independently of sialic acid.
We also studied the use of sialic acid-containing erythrocyte receptors by P. falciparum using the ex vivo erythrocyte culture system. We determined the importance in invasion of glycophorin B (GPB), receptor for P. falciparum invasion ligand, EBL-1, and one of the highly sialylated receptors on the erythrocyte surface. We specifically knocked down gene expression of GPB as well as two well characterized receptors involved in P. falciparum invasion – GPA, the largest contributor to erythrocyte sialic acid and GPC, another sialylated receptor. Invasion assays using P. falciparum laboratory strains and field isolates revealed that GPB is a dominant receptor in P. falciparum invasion, of comparable importance to GPA.Biological Sciences in Public Health
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Goldowitz, Ilana Sarah. "Plasmodium's Crossroads: Deciphering the Molecular Pathway That Leads to Malaria Transmission." Thesis, Harvard University, 2015. http://nrs.harvard.edu/urn-3:HUL.InstRepos:17467311.
Full textAbstract:
Plasmodium falciparum is the causative agent of the most severe form of malaria. Transmission from humans to mosquito vectors is an essential step in this eukaryotic parasite‘s life cycle and in the spread of malaria disease, which killed nearly 600,000 people in 2013. I investigated the developmental switch parasites make to the transmission stage or gametocyte, with the goal of identifying molecular mechanisms and environmental triggers of gametocyte formation. In Chapter 2 of this dissertation, I discuss the completion of a genetic mutagenesis screen leading to the discovery of a putative E3 ubiquitin ligase enzyme which is likely a negative regulator of gametocyte formation. Chapter 3 presents findings on population-based regulation of gametocyte production and on parasite-derived microvesicles that transfer between cells and stimulate gametocyte production. In Chapter 4, I and coauthors present a protocol for measuring parasite growth and gametocyte production in response to drugs or other treatments.Chemical Biology
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Weirather, Jason Lee. "Computational approaches to the study of human trypanosomatid infections." Thesis, The University of Iowa, 2014. http://pqdtopen.proquest.com/#viewpdf?dispub=3609102.
Full textAbstract:
Trypanosomatids cause human diseases such as leishmaniasis and African trypanosomiasis. Trypanosomatids are protists from the order Trypanosomatida and include species of the genera Trypanosoma and Leishmania, which occupy a similar ecological niche. Both have digenic life-stages, alternating between an insect vector and a range of mammalian hosts. However, the strategies used to subvert the host immune system differ greatly as do the clinical outcome of infections between species. The genomes of both the host and the parasite instruct us about strategies the pathogens use to subvert the human immune system, and adaptations by the human host allowing us to better survive infections. We have applied unsupervised learning algorithms to aid visualization of amino acid sequence similarity and the potential for recombination events within Trypanosoma brucei 's large repertoire of variant surface glycoproteins (VSGs). Methods developed here reveal five groups of VSGs within a single sequenced genome of T. brucei, indicating many likely recombination events occurring between VSGs of the same type, but not between those of different types. These tools and methods can be broadly applied to identify groups of non-coding regulatory sequences within other Trypanosomatid genomes. To aid in the detection, quantification, and species identification of leishmania DNA isolated from environmental or clinical specimens, we developed a set of quantitative-PCR primers and probes targeting a taxonomically and geographically broad spectrum of Leishmania species. This assay has been applied to DNA extracted from both human and canine hosts as well as the sand fly vector, demonstrating its flexibility and utility in a variety of research applications. Within the host genomes, fine mapping SNP analysis was performed to detect polymorphisms in a family study of subjects in a region of Northeast Brazil that is endemic for Leishmania infantum chagasi, the parasite causing visceral leishmaniasis. These studies identified associations between genetic loci and the development of visceral leishmaniasis, with a single polymorphism associated with an asymptomatic outcome after infection. The methods and results presented here have capitalized on the large amount of genomics data becoming available that will improve our understanding of both parasite and host genetics and their role in human disease.