Dissertations / Theses on the topic 'Peau – Cultures et milieux de culture'

Le psoriasis se caractérise par la présence d’infiltrats leucocytaires inflammatoires au niveau du derme et de l’épiderme cutané humain, menant à des désordres cutanés considérables : hyperprolifération des cellules épidermiques basales, différenciation altérée des kératinocytes et sécrétion accrue de médiateurs pro-inflammatoires dans le microenvironnement local. Cette dysfonction immuno-épithéliale menant au développement de lésions blanchâtres, agit tel un cercle vicieux incontrôlable, stimulant réciproquement les kératinocytes et les cellules immunitaires. Dans cette optique, mes travaux de doctorat ont visé à : (1) générer un microenvironnement immunocompétent par l’intégration de cellules T pré-activées dans un modèle de peau saine, non-lésionnelle et lésionnelle, produit selon la méthode d’auto-assemblage afin (2) d’étudier le rôle de cette composante importante sur les caractéristiques-clés associées au psoriasis. De surcroit, nous avions pour autre objectif (3) d’analyser l’impact de macrophages dérivés de monocytes dans un modèle tridimensionnel de peau saine afin (4) de déterminer l’influence de ces cellules sur le remodelage matriciel et la différenciation épidermique à l’état d’équilibre pour, finalement, (5) analyser l’empreinte du microenvironnement sur leur polarisation in vitro. Nos données mettent en lumière le caractère déterminant de la composante immunitaire, lorsqu’associée aux cellules cutanées pathologiques, dans le développement des lésions psoriasiques, puisque la présence de cellules T, dans un modèle de peau saine, n’induit pas l’ensemble des caractéristiques histopathologiques associées à cette dermatose. D’autre part, ces modèles de peau immunocompétente répondent à un traitement de choix pour le psoriasis, le méthotrexate, qui inhibe la prolifération cellulaire et atténue l’inflammation. Ces nouveaux modèles organotypiques serviront d’outils précliniques performants pour le criblage d’actifs visant à traiter certaines pathologies d’origine auto-immune inflammatoire chronique, dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle crucial, à l’exemple du psoriasis. Par ailleurs, l’intégration de macrophages dérivés de monocytes dans un modèle de peau normale, affecte l’état de différenciation des kératinocytes épidermiques tout en réduisant l’état inflammatoire basal. Ces macrophages induisent, en outre, un remodelage matriciel tissulaire important modifiant de ce fait le microenvironnement avoisinant. Finalement, ce nouveau modèle tridimensionnel nous a permis, d’une part, de mimer davantage la structure cutanée physiologique et, d’autre part, de mieux comprendre l’influence de ces cellules sur le phénotype cutané à l’état d’équilibre. Bien que d’autres études soient nécessaires avant l’utilisation de ces modèles en phase préclinique, ces travaux constituent une avancée majeure dans le développement de modèles produits par génie tissulaire, plus complexes et plus pertinents d’un point de vue physiologique.
Le psoriasis se caractérise par la présence d’infiltrats leucocytaires inflammatoires au niveau du derme et de l’épiderme cutané humain, menant à des désordres cutanés considérables : hyperprolifération des cellules épidermiques basales, différenciation altérée des kératinocytes et sécrétion accrue de médiateurs pro-inflammatoires dans le microenvironnement local. Cette dysfonction immuno-épithéliale menant au développement de lésions blanchâtres, agit tel un cercle vicieux incontrôlable, stimulant réciproquement les kératinocytes et les cellules immunitaires. Dans cette optique, mes travaux de doctorat ont visé à : (1) générer un microenvironnement immunocompétent par l’intégration de cellules T pré-activées dans un modèle de peau saine, non-lésionnelle et lésionnelle, produit selon la méthode d’auto-assemblage afin (2) d’étudier le rôle de cette composante importante sur les caractéristiques-clés associées au psoriasis. De surcroit, nous avions pour autre objectif (3) d’analyser l’impact de macrophages dérivés de monocytes dans un modèle tridimensionnel de peau saine afin (4) de déterminer l’influence de ces cellules sur le remodelage matriciel et la différenciation épidermique à l’état d’équilibre pour, finalement, (5) analyser l’empreinte du microenvironnement sur leur polarisation in vitro. Nos données mettent en lumière le caractère déterminant de la composante immunitaire, lorsqu’associée aux cellules cutanées pathologiques, dans le développement des lésions psoriasiques, puisque la présence de cellules T, dans un modèle de peau saine, n’induit pas l’ensemble des caractéristiques histopathologiques associées à cette dermatose. D’autre part, ces modèles de peau immunocompétente répondent à un traitement de choix pour le psoriasis, le méthotrexate, qui inhibe la prolifération cellulaire et atténue l’inflammation. Ces nouveaux modèles organotypiques serviront d’outils précliniques performants pour le criblage d’actifs visant à traiter certaines pathologies d’origine auto-immune inflammatoire chronique, dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle crucial, à l’exemple du psoriasis. Par ailleurs, l’intégration de macrophages dérivés de monocytes dans un modèle de peau normale, affecte l’état de différenciation des kératinocytes épidermiques tout en réduisant l’état inflammatoire basal. Ces macrophages induisent, en outre, un remodelage matriciel tissulaire important modifiant de ce fait le microenvironnement avoisinant. Finalement, ce nouveau modèle tridimensionnel nous a permis, d’une part, de mimer davantage la structure cutanée physiologique et, d’autre part, de mieux comprendre l’influence de ces cellules sur le phénotype cutané à l’état d’équilibre. Bien que d’autres études soient nécessaires avant l’utilisation de ces modèles en phase préclinique, ces travaux constituent une avancée majeure dans le développement de modèles produits par génie tissulaire, plus complexes et plus pertinents d’un point de vue physiologique.
Psoriasis is characterized by the presence of inflammatory leukocyte infiltrates in the human skin dermis and epidermis, leading to important skin disorders: hyperproliferation of basal epidermal cells, altered differentiation of keratinocytes, and increased secretion of proinflammatory mediators in the local microenvironment. This immuno-epithelial dysfunction leading to the development of whitish lesions acts as an uncontrollable vicious circle, stimulating the keratinocytes and the immune cells. With this in mind, my thesis work aimed to: (1) generate an immunocompetent microenvironment by integrating pre-activated T cells into a healthy, non-lesional and lesional skin model, produced using the self-assembly method (2) to study the role of this essential component on key features associated with psoriasis. In addition, our other objective was (3) to analyze the impact of monocyte-derived macrophages in a three-dimensional model of healthy skin (4) to determine the influence of these cells on tissue remodeling and epidermal differentiation at steady state, (5) in order to finally analyze the microenvironment effect on their in vitro polarization. Our data highlight the essential feature of the immune component, when associated with pathological skin cells, in the development of psoriatic lesions, since the presence of T cells, in a healthy skin model, does not induce all of the histopathological key features, associated with the dermatosis. On the other hand, these models of immunocompetent skin respond to a treatment of choice for psoriasis, methotrexate, which inhibits cell proliferation and reduces inflammation. These new organotypic models will serve as powerful preclinical tools for the screening of active agents to treat some chronic inflammatory pathologies of autoimmune origin, in which the immune system plays a crucial role, like psoriasis. Moreover, the integration of monocytederived macrophages into a normal skin model affects the differentiation state of epidermal keratinocytes while reducing the basal inflammatory state. These macrophages induce, in addition, a significant matrix remodeling thereby modifying the surrounding microenvironment. Finally, this new three-dimensional model allowed us, on the one hand, to further mimic the physiological cutaneous structure and, on the other hand, to better understand the influence of these cells on the skin phenotype at steady state. Although further studies are needed prior to the use of these preclinical models, this work represents a major breakthrough in the development of more complex tissue-engineered models that are physiologically relevant.
Psoriasis is characterized by the presence of inflammatory leukocyte infiltrates in the human skin dermis and epidermis, leading to important skin disorders: hyperproliferation of basal epidermal cells, altered differentiation of keratinocytes, and increased secretion of proinflammatory mediators in the local microenvironment. This immuno-epithelial dysfunction leading to the development of whitish lesions acts as an uncontrollable vicious circle, stimulating the keratinocytes and the immune cells. With this in mind, my thesis work aimed to: (1) generate an immunocompetent microenvironment by integrating pre-activated T cells into a healthy, non-lesional and lesional skin model, produced using the self-assembly method (2) to study the role of this essential component on key features associated with psoriasis. In addition, our other objective was (3) to analyze the impact of monocyte-derived macrophages in a three-dimensional model of healthy skin (4) to determine the influence of these cells on tissue remodeling and epidermal differentiation at steady state, (5) in order to finally analyze the microenvironment effect on their in vitro polarization. Our data highlight the essential feature of the immune component, when associated with pathological skin cells, in the development of psoriatic lesions, since the presence of T cells, in a healthy skin model, does not induce all of the histopathological key features, associated with the dermatosis. On the other hand, these models of immunocompetent skin respond to a treatment of choice for psoriasis, methotrexate, which inhibits cell proliferation and reduces inflammation. These new organotypic models will serve as powerful preclinical tools for the screening of active agents to treat some chronic inflammatory pathologies of autoimmune origin, in which the immune system plays a crucial role, like psoriasis. Moreover, the integration of monocytederived macrophages into a normal skin model affects the differentiation state of epidermal keratinocytes while reducing the basal inflammatory state. These macrophages induce, in addition, a significant matrix remodeling thereby modifying the surrounding microenvironment. Finally, this new three-dimensional model allowed us, on the one hand, to further mimic the physiological cutaneous structure and, on the other hand, to better understand the influence of these cells on the skin phenotype at steady state. Although further studies are needed prior to the use of these preclinical models, this work represents a major breakthrough in the development of more complex tissue-engineered models that are physiologically relevant.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011
La méthode d'auto-assemblage permet la production de substituts cutanés sans matériel exogène. L'objectif principal de notre travail a été de modifier cette méthode originale afin de produire un nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques fabriqués à partir de cellules psoriasiques. Dans un premier temps, des substituts sains ont été cultivés en présence et en absence de sérum de veau foetal dans le but d'optimiser les conditions de culture. Puis, des analyses histologiques, immunohistochimiques, de perméabilité et des propriétés physico-chimiques ont été réalisées. Les résultats obtenus ont permis de conclure que le retrait du sérum à partir de la culture à l'interface air-liquide ne cause aucun problème majeur au niveau de la différenciation épidermique, de la jonction dermo-épidermique, du derme et de la perméabilité des substituts. De plus, des analyses par spectroscopic infrarouge à transformée de Fourier ont permis d'observer que le retrait du sérum améliore même l'organisation lipidique pour trois des cinq populations cellulaires testées. Parallèlement à cette étude, des substituts psoriasiques ont été produits à partir de cellules psoriasiques dans le but de vérifier si ces derniers allaient permettre la conservation de ce phénotype en culture. Des analyses histologiques et immunohistochimiques ont été effectuées et ont permis d'observer que le phénotype psoriasique (hyperprolifération et différenciation anormale des kératinocytes) est en partie conservé dans les substituts pathologiques. De plus, lors d'un traitement à l'acide rétinoïque, ceux-ci réagissent de façon similaire à ce qui est observé dans les peaux psoriasiques in vivo. Finalement, des substituts produits à partir de cellules non lésionnelles ont été reconstruits pour vérifier s'il existait une différence entre les cellules lésionnelles et non lésionnelles d'un même patient. Les résultats ont permis d'observer que les cellules non lésionnelles ne sont pas totalement «normales» et qu'elles conservent en partie les caractéristiques du psoriasis. En conclusion, ce nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques pourrait devenir un puissant outil dermopharmaceutique permettant de tester de nouveaux traitements pour vaincre le psoriasis.

Les brûlures profondes et étendues sont, de loin, le traumatisme le plus grave auquel un être humain peut faire face. La rapidité de couverture de ces plaies avec des pansements, surtout de nature biologique (p. ex. peau de cadavre), d’abord temporaire, et ensuite impérativement permanente, aura une influence déterminante sur le taux de survie des patients. À date, de nombreuses technologies ont été utilisées telles que les greffes pleines épaisseurs de peau provenant d’un site donneur sain, la culture d’épiderme autologue (CEA) et les substituts synthétiques. Cependant, ces technologies ont pour principale limite, respectivement, leur biodisponibilité, leur manque de propriété mécanique et leur manque d’activité biologique. Ces éléments ont ainsi mené au développement de substituts biologiquement actifs parmi lesquels les plus prometteurs possèderont une base autologue, l’épiderme, reposant sur une matrice, allogénique, xénogénique ou biosynthétique. Toutefois, la majorité de ces substituts ne pourra être utilisée que temporairement à cause de leur potentiel immunogénique résultant de la présence d’antigènes étrangers. Les technologies de production de substituts cutanés peuvent être divisées en deux approches distinctes, soit de type « Top-down », soit de type « Bottom-up ». La technologie la plus courante ainsi que la plus utilisée aujourd’hui est celle de type « Top-down ». Les substituts produits par cette approche se basent sur des matrices artificielles structurées élaborées via deux classes majeures de biomatériaux incluant (1) les biopolymères du sang comme la fibrine, et du tissu mou comme le collagène et la fibronectine ; (2) les polysaccharides, comme l’alginate, le chitosan et les glycosaminoglycanes, incluant le hyaluronan. L’approche de type « Bottom-up », quant à elle, se base sur la capacité des cellules à synthétiser et assembler leur propre matrice extracellulaire. Dans ce domaine, le laboratoire d’organogénèse expérimentale (LOEX) se positionne en tant que pionnier dans une méthode de production de substitut dite « d’auto-assemblage ». Cette méthode repose sur la capacité de l’acide ascorbique à promouvoir l’assemblage matriciel sécrété par les fibroblastes dermiques. Toutefois, les substituts obtenus par cette méthode présenteront (1) un temps de production long, car l’assemblage matriciel représentera à lui seul les 2/3 de la technique d’un total d’environ 8 à 9 semaines, (2) un manque de photoprotection de par l’absence de pigmentation, c’est à-dire sans ajout de cellules pigmentogènes (mélanocytes), et (3) peu ou pas de réseau de fibres élastiques, essentiel aux propriétés mécaniques cutanées. Afin de répondre aux problématiques identifiées, nous avons entrepris de concevoir plus rapidement des substituts cutanés pigmentés, intégrant un réseau de fibres élastiques selon la méthode d’autoassemblage. Pour ce faire, nous avons investigué la possibilité d’utiliser un derme reconstruit par « auto-assemblage » de type allogénique combiné à un épiderme syngénique. Cette modification au protocole qui implique initialement une reconstruction dermique et épidermique autologue à 100 % permettra d’éliminer l’étape de production dermique et ainsi réduire le temps global de production des substituts cutanés bilamellaires. L’esthétisme et la fonctionnalité des substituts ont été évalués par l’ajout de différentes densités de mélanocytes lors de la reconstruction de l’épiderme. Enfin, parallèlement à cette étude, nous avons investigué sur la faible présence du réseau de fibres élastiques dans nos substituts cutanés afin de proposer une technique de production modifiée permettant d’induire l’élastogenèse, le processus de formation de ce réseau. Plus spécifiquement, de l’aldostérone, une hormone minéralocorticoïde, et son inhibiteur compétitif, la spironolactone, ont été ajoutés dans le milieu de culture cellulaire en tout temps lors de la production des substituts cutanés afin de stimuler la voie de l’ « insulin-like growth factor I » (IGF-I) et ainsi l’élastogenèse. En résumé, mon projet de doctorat a permis de mettre en évidence : (1) la survie des fibroblastes allogéniques dermiques pour au moins huit semaines après greffes sur un modèle murin immunocompétent ; (2) qu’un seuil minimal de 200 mélanocytes par mm2 à la reconstruction de l’épiderme avait la capacité d’induire une pigmentation homogène après greffe, ainsi qu’une photoprotection comparable à une densité de 1500 mélanocytes par mm2 ; (3) que l’ajout d’aldostérone et de spironolactone augmente le nombre de fibres élastiques dans nos substituts cutanés et améliore les propriétés mécaniques par la diminution de la rétraction et l’augmentation de l’élasticité. De plus, l’ajout de mélanocytes a aussi permis d’améliorer les propriétés mécaniques des peaux reconstruites par leur effet positif encore mal compris sur l’élastogenèse.
Vast deep burns injuries are, by far, the worst trauma that a human being can experience. The time necessary for the coverage of thermal wounds with bandages, especially of a biological nature (e.g. cadaveric skin), at first temporary, and then permanently, influences the survival rate of patients. Over the years, numerous technologies were used to cover the skin wounds. Among them, we note split- and full-thickness skin grafts from a spared donor site, as well as cultured epithelial autografts (CEAs) and synthetic substitutes. However, these technologies showed some issues as the bioavailability of donor tissue or mechanical properties or biological activities. Indeed, it is the cellular and the extracellular matrix component that have a direct impact on the wound healing and on the longterm graft survival rate. In this way, new biologically active skin substitutes were developed. The most promising reconstructed skins to date are composed of an autologous epidermis associated with an extracellular matrix either allogeneic or xenogeneic or biosynthetic. However, the majority of these substitutes could only be used as temporary because of their immune inflammatory risk resulting from the presence of allogeneic or xenogeneic cells. Tissue-engineered technologies can be split in two approaches, either "Top-Down" or "Bottom-up". The most current as well as the most represented technology today is the "Top-Down" approach. Substitutes produced by this approach are based on structured artificial matrices developed via the major classes of biomaterials including (1) blood’s biopolymers such as fibrin, and components of the soft tissue such as collagen or fibronectin and (2) polysaccharides, as alginates, chitosan and glycosaminoglycan, including the hyaluronan. Alternatively, the "bottom-up" approach is based on the fibroblast’s capacity to synthesize and assemble their own extracellular matrix. In this field, the Laboratory of Organogenesis Experimental (LOEX) is a pioneer in a method of production of skin substitute called the "self-assembly" method. This method is based on the capacity of ascorbic acid to promote the extracellular matrix assembly secreted by fibroblasts. However, the histology and mechanical properties of these tissue-engineered skin substitutes, which are similar to native skin, (1) are quite long to produce, essentially because of the extracellular matrix assembly which takes twothird of the time of the whole production (2) lack of photoprotection, since pigment-producing cells called melanocytes are not added in the standard production and (3) the elastic fiber network, essential to insure their mechanical properties, is rudimentary. To address the identified problems, we designed a faster way to produce pigmented skin substitutes, integrating an elastic fiber network by tissue engineering according to the “self-assembly” method. To do so, we investigated the possibility of using an allogeneic reconstructed dermis associated with a syngeneic epidermis. This new method would allow eliminating two-third of the production time of the dermal part initially requested in the “on demand” production that was initially 100 % autologous. Estheticism and its functionality were evaluated by the addition of various densities of melanocytes during the epidermis reconstruction. Finally, at the same time, we addressed the weak presence of the elastic fiber network in our reconstructed skin. Indeed, we modified our production method to stimulate the elastogenesis process. More specifically, aldosterone, a mineralocorticoid hormone, and its competitive inhibitor, spironolactone, were added in the culture media during the skin substitute production in order to stimulate the insulin-like growth factor I (IGF-I) pathway and so the elastogenesis process. To conclude, my PhD project allowed to highlight: (1) the immunological tolerance of the allogeneic dermis with a long-term survival of their cellular components over the eight-week period, investigated in an immunocompetent murine model ; (2) that a minimal threshold of 200 melanocytes per mm2 in the epidermis reconstruction had the capacity to lead a homogeneous pigmentation after the transplant, as well as a photoprotection comparable to a 1500 melanocytes per mm2 density ; (3) that the addition of aldosterone and spironolactone increased the number of elastic fibers in our skin substitutes and improved the mechanical properties by the decrease of the shrinkage and the increase of the elasticity. Furthermore, the addition of melanocyte also increased the mechanical properties of the skin substitute. This positive impact on elastogenesis by melanocytes is poorly understood.

Introduction: Le Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) utilise une technique de production de substituts cutanés bilamellaires autologues auto-assemblés (SASS) unique. Cette méthode permet la génération d’équivalents cutanés permanents avec une structure et une fonction similaire à la peau normale humaine. Problématique et objectifs: Cette thèse présente d’abord les premiers résultats d’essais cliniques pour le traitement de plaies chroniques complexes traitées avec SASS. Ces résultats démontrent une efficacité et une sécurité d’utilisation de ces SASS. Toutefois, il y a un intérêt de développer une méthode de production plus rapide de ces substituts cutanés afin d’améliorer l’accessibilité clinique et le pronostic des patients grands brûlés, lors de leur utilisation en phase aiguë. En effet, le délai de couverture cutanée définitive essentielle à la thermorégulation et à l’effet de barrière est directement en lien avec les pronostics vital et morbide de cette population. Le délai actuel de 8 semaines pour la production des greffons aurait avantage à être réduit pour améliorer leur utilité quant aux soins des patients. Méthode: Dans un premier temps, le développement et la mise au point d’une méthode de production plus rapide de SASS à partir de matrices dermiques décellularisées (SASS-DM), générant des peaux reconstruites en seulement 4 semaines et demie est présenté. Par la suite, l’équivalence de la méthode de production rapide de ces peaux est d’abord vérifiée in vitro et comparée à la méthode standard quant à ses caractéristiques histologiques, de différenciation cellulaire et la présence d’une membrane basale fonctionnelle. La méthode rapide est finalement comparée in vivo à la méthode standard quant à l’évolution de ces peaux greffées sur les vivants, de façon à compléter le développement préclinique de cette nouvelle méthode innovatrice. Résultats: La méthode rapide de production des peaux bilamellaires autologues auto-assemblées s’est montrée équivalente à la méthode de production standard et ce, autant in vitro qu’in vivo. Conclusion: Ce travail présente d’abord l’utilisation clinique des peaux reconstruites bilamellaires pour le traitement de plaies variqueuses chronique, qui s’avère efficace et sécuritaire. Puis, le développement préclinique d’une méthode plus rapide de production de peaux reconstruites bilamellaires autologues est présenté, permettant de générer des greffons en 4 semaines et demie plutôt que 8 semaines, et ce avec une qualité équivalente à la méthode standard. Cette innovation représente un ajout majeur aux modes de traitement des grands brûlés puisqu’elle a le potentiel de changer la planification chirurgicale et leur pronostic de survie.
Introduction: The Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) has developed a unique production technique of self-assembled autologous skin substitute (SASS). This method allows the generation of permanent skin equivalents that display a structure and a function similar to normal human skin. Problematic and objectives: This thesis presents the first results of SASS clinical use in the treatment of chronic complex wounds to demonstrate the clinical efficacy and safety. The need to develop a faster production method in order to improve burn patient prognosis is also outlined. Indeed, the delay before definitive skin coverage to insure proper thermoregulation and protection from the external environment is directly associated to the vital and morbid prognosis of this population of severely traumatised patients. The current eight weeks SASS production delay must be reduced in order to further improve burn patients quality of care and survival. Method: This work describes the development and refinement of a faster production method for SASS using decellularized dermal matrices (SASS-DM) that generated skin substitutes produced in only 4 weeks and a half. These faster produced skin substitutes where compared in vitro to the standard SASS in regard to the histological characteristics, cellular differentiation and the presence of a functional basement membrane. The faster produced SASS-DM were then compared in vivo to standard SASS by following the evolution of grafted mice in order to complete a preclinical trial of this innovative technique. Results: The faster production method for the autologous self-assembled bilayered skin substitutes was shown to be equivalent to the standard production method in vitro and in vivo. Conclusion: This work presents the clinical use of bilayered skin substitutes for the treatment of chronic venous ulcers, which was shown to be efficient as well as safe. Afterwards, the preclinical development of a new faster production method of autologous bilayered self-assembled skin substitutes is presented, allowing the culture of skin grafts in four weeks and a half instead of the previous 8 weeks long protocol, with equivalent quality and characteristics as the standard cultured skins. This innovation represents a major adjunct to severely burned patients treatments and could possibly change their surgical planning and their survival.

La translation vers la clinique de nouveaux médicaments anti-cancéreux peut échouer à différentes étapes, notamment lors du passage des modèles animaux à l'humain. Pour améliorer la prédictibilité des tests précliniques, de nouveaux modèles in vitro humains recréant le microenvironnement tumoral sont nécessaires. Dans le cadre du mélanome cutané, les vaisseaux sanguins et lymphatiques dermiques sont des composantes essentielles à la progression tumorale, tout comme les cellules immunitaires. Nous avons émis l'hypothèse qu'il est possible de microvasculariser des substituts cutanés avec des capillaires sanguins et lymphatiques, puis d'appliquer ce contexte tissulaire à la modélisation du mélanome. Notre modèle, basé sur la méthode d'auto-assemblage, est constitué, dans un premier temps, de fibroblastes, de cellules endothéliales microvasculaires humaines et de kératinocytes. Deux types de réseaux ont été observés dans les substituts cutanés en coupe et sur tissu entier. Ils présentent des morphologies distinctes et sont caractérisés par des marquages CD31 (pan-endothéliale) et podoplanine (spécifique aux cellules lymphatiques). La capacité des cellules endothéliales à former des réseaux en fonction de leur origine, cellules de nouveau-né ou d'adulte, a été évaluée. Il a également été confirmé que la présence d'un épiderme formé de kératinocytes influe sur la formation des réseaux de capillaires sanguins et lymphatiques. Les peaux doublement microvascularisées ont permis l'étude du mélanome dans un microenvironnement humain in vitro. Ce modèle a été formé en ajoutant des sphéroïdes de mélanome aux substituts cutanés (6 lignées). Une fois incorporées dans le microenvironnement cutané, les tumeurs répondent à un traitement chronique (12 jours) au vemurafenib de façon dose-dépendante (diminution de la prolifération des cellules de mélanome et augmentation significative de l'apoptose). Par la suite, des cellules immunitaires humaines primaires (dérivées du sang périphérique) ont été incorporées dans la tumeur ainsi que dans le tissu environnant, résultant notamment en la présence de monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), lymphocytes CD8+ et cellules HLA-DR+. Ces tissus avec ou sans cellules immunitaires ont été stimulés avec du lipopolysaccharide (LPS), menant à une modification de la proportion des sous-populations immunes présentes dans le modèle. Ce modèle humain répondant à des thérapies anti-cancéreuses et pouvant contenir une composante immunitaire est un outil prometteur pour l'étude du mélanome ainsi que pour l'évaluation de futures molécules en oncologie, incluant des immunothérapies.
Clinical translation of new oncology compounds can fail at different stages, including the translation from animal to human studies. To improve the predictability of preclinical testing, new in vitro human models mimicking the tumor microenvironment are needed. In skin melanoma, blood and lymphatic capillaries are key features of tumor progression, as well as immune cells. We hypothesize that it is possible to microvascularize skin substitutes with both blood and lymphatic capillaries in order to use these tissues to model and study melanoma in vitro. Our self-assembled model was produced using primary human fibroblasts, microvascular endothelial cells and keratinocytes. Two subtypes of capillary networks were present in the reconstructed skin as observed after labeling on cryosections and whole mount samples. Their morphology differs, and they were characterized by immunostaining against CD31 (pan-endothelial) and podoplanin (lymphatic endothelial cells). The ability of endothelial cells from newborn or adult to form networks was assessed. It was also confirmed that the keratinocytes can affect the capillary networks, formed by blood and lymphatic endothelial cells. The microvascularized reconstructed skin allowed to study melanoma in a human microenvironment in vitro. The melanoma model was produced by adding melanoma spheroids to the skin substitutes (with 6 melanoma cell lines). After tumor incorporation in the 3D model, it was treated chronically (12 days) with vemurafenib and displayed a dose-dependent response (significant decrease of proliferation and increase of apoptosis). The last step was to incorporate human primary blood-derived immune cells in the tumor and in the surrounding skin, leading to the presence for example monocytes/macrophages (CD14+, CD163+), CD8+ lymphocytes and HLA-DR+ cells. The different tissues were stimulated with LPS, leading to a modification of immune cell subpopulations in the model (with 4 different donors and 2 melanoma cell lines). This human melanoma model which responds to a known therapy and can include an immune component is a promising tool to study melanoma and to test new therapeutic compounds, including immunotherapies.

Les modèles de peau in vitro en trois dimensions sont des outils pour étudier des processus biologiques ou pathologiques. La majorité des modèles in vitro actuellement disponibles ne comporte pas de système immunitaire et de réseau vasculaire, tous deux présents dans la peau humaine. Nous avons développé un modèle de peau entièrement composé de cellules d'un même donneur (autologue) et contenant des cellules immunitaires et endothéliales. En nous basant sur le modèle d'auto-assemblage du LOEX, nous avons mis en culture durant quatre semaines des fibroblastes dermiques dans un milieu favorisant le dépôt de matrice extracellulaire. La résultante est un feuillet manipulable composé de cellules entourées de matrice. Un isolat dermique préalablement extrait du derme humain est ensemencé sur un premier feuillet de fibroblastes et les kératinocytes sur un second. L'isolat dermique contient l'ensemble des cellules présentes dans le derme du donneur. Les deux feuillets sont ensuite superposés et mis en culture pendant deux semaines à l'interface air-liquide pour stimuler la différenciation de l'épithélium. Une analyse histologique a mis en évidence un épithélium stratifié sur un derme composé de matrice et de cellules. Des immunomarquages ont également montré la présence de cellules immunitaires CD45+ viables et d'un réseau vasculaire CD31+ au niveau du derme. Une plaie a ensuite été créée au centre de ce modèle de peau et une analyse histologique a montré une migration des cellules épidermiques et dermiques dans la plaie. La création de ce modèle permettra d'avoir une meilleure compréhension de l'homéostasie de la peau et du phénomène de cicatrisation cutanée.
In vitro three-dimensional human skin models provide a tool to investigate biological or pathological processes and to test drug effect or toxicity. In vitro models usually lack an immune system and vasculature, both characteristics of the human skin. We developed a skin model composed of cells from the same donor (autologous) and containing immune cells and endothelial cells. Based on the self-assembly method developed at the LOEX, dermal fibroblasts were first cultured during four weeks in a medium stimulating the production of an extracellular matrix. The result of this culture is a fibroblast sheet used for the development of our model. A dermal fraction enzymatically extracted from a human dermis was seeded onto a first sheet while the keratinocytes were seeded on a second one. The dermal fraction contained all the dermal cells from a donor. The two sheets were then superimposed and raised at the air-liquid interface during two weeks to stimulate epidermis differentiation. Histological studies of the 3D skin model highlighted a stratified epidermis on a dermis composed of matrix and cells. Immunofluorescence staining showed viable CD45+ immune cells and a CD31+ capillary network in the dermis. A wound was then produced at the center of the model and histological studies highlighted the migration of the epidermal and dermal cells into the wound. The creation of this first autologous 3D model containing immune cells paves the way to increase knowledge about skin homeostasis and the role of immune cells in the wound healing process.

"Thèse en cotutelle, Université Laval Québec, Canada Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Université de Strasbourg Strasbourg, France"
Les réactions immunitaires de la peau sont initiées par les cellules dendritiques cutanées (dendritic cells, DCs). L'effet potentiellement sensibilisateur d'un composé peut être prédit in vitro en utilisant des monocytes humains différenciés en DCs (MonoDCs). Cependant, ces modèles simplistes restent imprécis car l'activation des DCs cutanés par les sensibilisateurs peut être déclenchée ou modulée par des interactions microenvironnementales avec de multiples types de cellules non immunitaires. Notre objectif est de développer une peau immunocompétente qui combinera des MonoDCs avec tous les éléments structurels et fonctionnels de la peau, c'est-à-dire une barrière épidermique posée sur un derme contenant une pseudo-vascularisation et des neurones nociceptifs. Une matrice de collagène a été ensemencée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales, puis avec des précurseurs de fibres nerveuses dérivées soit de l'iPSC humaine, soit de la DRG embryonnaire murins. Enfin, nous avons introduit les MonoDC et les kératinocytes. Nous avons observé que les neurones différenciés in situ innervent l'épiderme comme observé habituellement dans la peau humaine normale. De plus, les neurones dérivées d’iPSCs, expriment neuropeptides et canaux calcique spécifiques des fibres nociceptives. Enfin, les Mono-DC intégrés au modèle restent stable pendant toute la durée nécessaire à la formation de l’épiderme et peuvent être stimulé. Le modèle sera utilisé pour prédire le potentiel irritant des composés chimiques et l'impact de l’innervation nociceptive sur l'activation des DCs.
Immune reactions in the skin are initiated by the cutaneous dendritic cells (DCs). The potential sensitizing effect of a compound can be predicted in vitro using human monocytes differentiated into DCs (Mono-DCs). However, these simplistic models remain inaccurate because the activation of cutaneous DCs by sensitizers may be triggered or modulated by microenvironmental interactions with multiple types of nonimmune cells. Our goal is to develop an immunocompetent human tissue-engineered skin that will combine DCs with all structural and functional element of the skin, i.e. an epidermal barrier laid upon a dermis containing a pseudo-vascularization and nociceptive neurons. Collagen matrix was seeded with fibroblasts and endothelial cells, then with precursors of nerve fibers derived from either human iPSC or murine embryonic DRG. Finally, we introduced Mono-DCs and keratinocytes. We observed that in situ differentiated neurons grow axons towards the epidermis as usually observed in normal human skin. What's more, the neurons derive from iPSC, express neuropeptides and calcium channel as normal nociceptive fibers. Moreover, Mono-DCs settled as expected beneath the epidermis and remained sessile to stimulation for several weeks. The model will be used to predict the irritant potential of chemical compounds, and the impact of nerves on DC activation.

Le vieillissement cutané se caractérise principalement par l'altération de la texture cutanée et la formation des rides. Dans ce travail, grâce à l'utilisation d'échelles descriptives, photographiques et de la projection de franges, nos résultats ont montré que les rides qui apparaissent le plus tôt et sont les plus marquées sont celles de la patte d'oie (en raison notamment des mouvements musculaires), de la population caucasienne / chinoise, ou d'une population vivant au Sud / Nord (effet des UV). De plus, l'utilisation de colorations immuno-histologiques, de culture fibroblastique en monocouche et sous forme de lattices de collagène nous a permis d'étudier la structure dermique, la prolifération et le métabolisme des fibroblastes de la ride (étude de l'élastine et des collagènes de type I, III, de la capacité de rétraction). Ces connaissances des mécanismes du vieillissement cutané permettent d'envisager de meilleures stratégies dans les traitements dermato-cosmétologiques
Skin ageing is mainly characterized by the deterioration of the cutaneous texture and the formation of wrinkles. Ln this work, the evolution of the microrelief and the wrinkles have been studied using methods of descriptive, photographic scales and projection of fringes. The results show that the earliest and most marked wrinkles are those of the crow's feet as a result of the local muscles repeated movements. They are more marked in the Caucasian population compared with the Chinese population, and in the population of the South compared with the North (effect of UV). Besides, the dermal structure, the proliferation and the metabolism of the fibroblasts of the wrinkle (elastin, collagens I/III, capacity of retraction) were studied by immuno-histological colorings, the technique of monolayer and tri-dimensional culture modal. These investigations in the mechanisms of cutaneous ageing help to design better strategies in dermato-cosmetology treatments

Le psoriasis est une maladie cutanée grave pour laquelle il n’existe encore aucun traitement curatif. Des modèles de peau psoriasique in vitro sont alors nécessaires afin de tester de nouveaux traitements. Cette étude visait, en premier lieu, à optimiser la production de substituts cutanés psoriasiques par la méthode d’auto-assemblage, pour ensuite les utiliser afin d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule potentiellement antipsoriasique, la tBEU. Dans un premier temps, des substituts sains et psoriasiques ont été produits par la méthode d’auto-assemblage partiellement modifiée en utilisant des plaques 6 puits et 12 puits. Ces expériences ont permis de démontrer que les plaques 6 puits étaient plus efficaces pour la production de substituts reproductibles et représentatifs d’une peau psoriasique in vivo. Ensuite, ces substituts ont été traités avec la tBEU, démontrant que cette molécule diminue la prolifération des kératinocytes et améliore leur différenciation. Ainsi, la tBEU pourrait éventuellement être utilisée comme un traitement efficace du psoriasis.
Psoriasis is a serious cutaneous disease for which there is currently no cure. In vitro psoriatic skin models could become new tools to assess the potency of new drugs during the development of new therapies. First, this study aimed to optimize the production of psoriatic skin substitutes by the self-assembly method, and then use them to assess the effectiveness of a new potentially antipsoriatic molecule, tBEU. Initially, healthy and psoriatic substitutes have been produced by the self-assembly method partially modified, using 6-well and 12-well plates. These experiments demonstrated that the 6-well plates were more effective for the production of reproducible substitutes and representative of psoriatic skin in vivo than the 12-well plates. Then, these substitutes were treated with tBEU, showing that this molecule decreases significantly keratinocytes proliferation and improves their differentiation. Thus, tBEU may eventually be used as an effective topical treatment for psoriasis.

Le présent travail a confirmé le fait que les fibroblastes cutanés sont pourvus d'un système adénylate cyclase sensible à la parathormone. Ainsi, la PTH stimule la production d'AMPc dans ces cellules de la même façon que dans les cellules osseuses et rénales, tissus cibles classiques de la PTH. L'utilisation de la PTH radio-iodée nous a permis de détecter un site liant spécifiquement la PTH. Ce site de faible affinité parait au moins en partie non lié à la stimulation de l'adénylate cyclase. Nous avons trouvé également que le glucagon entre en compétition avec la PTH pour la liaison au niveau des fibroblastes cutanés et que, le glucagon radio-iodé se lie également à ces cellules. Nos études de la sensibilité de fibroblastes de sujets avec pseudohypoparathyroidie confirment que la résistance exprimée in vivo est exprimée in vitro dans 6 des 9 cas étudiés. Cette résistance est spécifique à la PTH, puisque ces cellules avaient une sensibilité normale à la forskoline et à la prostaglandine E1. Ceci indique que la cause de la résistance est située au niveau du récepteur ou au niveau du couplage du récepteur avec la protéine Gs. Nos études de la liaison ne nous ont pas permis de montrer une anomalie au niveau du récepteur de la PTH. Cependant le fait que la résistance de 5 des 6 souches est supprimée après traitement avec la dexamethasone, suggère que la cause de cette résistance est plutôt due à une anomalie de régulation du couplage du récepteur à la protéine Gs qu'à une déficience "anatomique" du récepteur. La dexamethasone modifie la sensibilité de ces cellules sans modifier la liaison de la PTH radio-iodée. Ceci confirme le fait que la liaison observée est en grande partie non liée à la stimulation de l'adénylate cyclase. Cette liaison peut être liée à une autre voie de communication cellulaire comme l'activation de la phospholipase C par exemple. Dans 3 souches, la résistance n'est pas exprimée in vitro. Ceci indique que la résistance retrouvée in vivo est soit isolée au rein, soit est due à un antagoniste circulant de la PTH.

Le développement d'une peau humaine vivante in vitro aboutit à un modèle d'étude original de la biologie cellulaire au niveau d'un tissu ou d'un organe dont les associations cellules-cellules, ou cellules-matrice sont définies. De plus, la reconstruction d'une peau humaine est d'un intérêt primordial pour la couverture des grands brûlés. La peau équivalente, réalisée avec des cellules humaines normales ou pathologiques, est reconstruite en deux temps: le premier conduit à un derme équivalent, le second consiste à recouvrir ce derme équivalent par un épiderme. Cette peau permet non seulement l'étude de chacun de ces deux tissus, mais aussi l'étude des interactions dermo-épidermiques. Le derme équivalent est déjà par lui-même un modèle d'étude original. En effet, les fibroblastes cultivés en trois dimensions dans une matrice de collagène ont une différenciation proche de celle qu'ils ont in vivo. De plus, il est possible d'évaluer quantitativement des fonctions cellulaires qui ne peuvent pas être abordées dans d'autres systèmes de culture (telle que la contraction des fibroblastes), et de moduler ces fonctions par des agents pharmacologiques. L'utilisation de petites biopsies cutanées comme source d'épidermisation des dermes équivalents permet d'obtenir un épiderme proche de celui existant in vivo, et d'évaluer quantitativement la croissance et la différenciation épidermique. Mais l'intérêt majeur de cette peau vivante reconstruite est d'être modulable, tant au niveau des constituants du derme et de l'épiderme, qu'au niveau des associations dermo-épidermiques qu'elle autorise. Ainsi nous avons pu identifier différentes fonctions des fibroblastes normaux qui conduisent à favoriser l'épidermisation, et démontrer que des fibroblastes psoriasiques sont capables de stimuler de façon excessive la croissance de kératinocytes normaux. Ce modèle permettant l'étude des interactions dermo-épidermiques est un outil important pour la pharmacologie, car il permet d'identifier l'influence d'un agent pharmacologique sur chacun des deux tissus. Cette peau équivalente vivante est greffable chez l'homme. Son principal avantage est d'apporter, en même temps qu'une couverture épidermique, un tissu conjonctif dont la présence semble indispensable pour les qualités de la greffe à long terme.

L’objectif du présent projet était d’optimiser le modèle de peau reconstruite par génie tissulaire déjà mis au point par notre équipe afin qu’il stimule le processus de régénération nerveuse après greffe pour améliorer la récupération tactile des grands brûlés. Nous avons utilisé des follicules pileux murins et des neurones sensoriels extraits des ganglions de la racine dorsale de fœtus de souris et avons posé comme hypothèse que les poils avaient une influence positive sur la migration axonale. Une élongation vigoureuse des neurites a été détectée à l’intérieur du derme reconstruit. En présence de cellules épithéliales, il y a eu une migration préférentielle des axones vers les follicules pileux immatures implantés dans le modèle, migration qui a été suivie d’une association étroite des axones et des follicules pileux. Nous avons donc développé avec succès un modèle nous permettant d’étudier les effets de l’épiderme et des follicules pileux sur la croissance des nerfs.

L'essor des biomatériaux et leur utilisation dans le domaine médical ainsi que le développement des méthodes alternatives aux tests in vivo sont à l’origine des techniques permettant de mesurer la cytocompatibilité et la cytotoxicité des matériaux. Un modèle base sur la culture organotypique, permet d'évaluer la cytocompatibilité et la cytotoxicité des matériaux au contact des tissus. Il repose sur la mesure de trois propriétés : la multiplication cellulaire, la migration cellulaire et l'adhésion des cellules au substrat. Ce travail a eu pour objet l'optimisation et la validation du modèle. L'optimisation a porté sur le développement d'une technique automatisée de la mesure de la viabilité cellulaire, utilisant un analyseur de particules multicanaux et qui a permis d'intégrer la viabilité comme quatrième paramètre de mesure au sein du modèle. La viabilité cellulaire est un facteur déterminant de la mesure de la toxicité. Puis dans le but d'appliquer la technique à d'autres tissus, nous avons réalisé la culture organotypique de peau humaine en étudiant différentes caractéristiques : la multiplication, la migration, l'adhésion, la viabilité cellulaires et la synthèse de matrice extracellulaire. La validation du modèle a été réalisée par deux analyses. La sensibilité du modèle a été prouvée en étudiant le comportement du tissu cutané embryonnaire, adulte et transforme prélevé sur la souris. Dans le cadre de l'étude de la biocompatibilité de matériaux destines à être placés au contact de la peau humaine, nous avons réalisé en parallèle une étude la cytocompatibilité et de la cytotoxicité en culture organotypique et en culture cellulaire. Les deux techniques de culture répondent avec la même sensibilité.

Ce travail visait à exploiter le potentiel des protéines de soya afin de concevoir et de développer des biomatériaux sous forme de biofilms aux propriétés physico-chimiques, et surtout biologiques, contrôlées. Pour ce faire, des films à base d'isolats de protéines de soya (IPS) ont été préparés à l'aide de plastifiant, le glycérol, et de différentes concentrations d'agent de réticulation, le formaldéhyde, afin d'obtenir un biomatériau favorable pour la culture de cellules cutanées (fibroblastes et kératinocytes) humaines. La toxicité des films a été testée en évaluant l'adhésion, la croissance, la prolifération et la formation d'une structure cutanée bien organisée. La biocompatibilité et l'immunogénicité des biofilms ont été étudiées grâce aux analyses de cytokines produites par les fibroblastes et les kératinocytes. Les diverses observations microscopiques ont démontré l'innocuité de tous les biofilms vis-à-vis des kératinocytes qui ont adhères. Ces biofilms n'ont aucun effet nocif sur la viabilité cellulaire. Il est intéressant de noter que ces cellules ont une prolifération croissante malgré l'augmentation de la concentration en réticulant. La prolifération des cellules cutanées est, cependant, réduite à fort pourcentage de formaldéhyde. En effet, celles-ci prolifèrent mieux sur les biofilms contenant 0 %, 1 % et 2 % de formaldéhyde comparativement à ceux contenant 3 % d'agent de réticulation. En conclusion, les biofilms à base de protéines de soya offrent un environnement favorable à l'adhésion et la croissance des kératinocytes. Les biofilms ayant le meilleur potentiel sont ceux contenant une concentration de 1 % de formaldéhyde.

Le virus de la maladie de Marek (MDV) est un alpha-herpesvirus responsable de lymphomes T mortels chez la poule. La peau et en particulier le follicule plumeux est considéré comme le seul site de production de particules virales extracellulaires et est à l'origine de la dissémination horizontale du virus et de la contamination de l'environnement. Cependant, aucun système cellulaire ne permet de reproduire ce qui se passe dans ce tissu. Le but de ma thèse a donc été de développer de nouveaux systèmes de culture permettant de reproduire la réplication, la morphogenèse et l’excrétion décrites in vivo. Pour cela, j’ai développé deux systèmes, des explants de peau d’embryons de poulet cultivés ex vivo et des kératinocytes obtenus par différenciation de cellules souches embryonnaires de poule. J’ai également montré la permissivité au MDV de ces deux modèles de peau puis y ai étudié la réplication et la morphogénèse virale. Ces modèles permettront la recherche des déterminants viraux et cellulaires impliqués dans la production de virions extracellulaires et leur dissémination
Marek's disease (MD) is a highly contagious virus-induced lymphoma in chicken, caused by an alphaherpesvirus named Marek’s disease virus (MDV). The skin and especially, the feather follicle is the only tissue known to produce infectious cell-free virions and is responsible for the shedding of MDV into the environment and transmission between birds. However, no cell culture system actually reproduces this process ex vivo. Herein my thesis aim was to develop new culture systems to reproduce the efficient MDV replication, morphogenesis and shedding from the feather follicle. For that, I developed two systems, skin explants derived from embryos cultivated ex vivo and keratinocytes obtained by differentiation of chicken embryonic stem cells. I also showed that these two models were permissive to MDV infection and I studied in each one MDV replication and morphogenesis. These models will allow the search of viral and cellular determinants involved in the production of extracellular virions and shedding

Les réactions immunitaires de la peau sont initiées par les cellules dendritiques cutanées (dendritic cells, DCs). L'effet potentiellement sensibilisateur d'un composé peut être prédit in vitro en utilisant des monocytes humains différenciés en DCs (MonoDCs). Cependant, ces modèles simplistes restent imprécis car l'activation des DCs cutanés par les sensibilisateurs peut être déclenchée ou modulée par des interactions microenvironnementales avec de multiples types de cellules non immunitaires. Notre objectif est de développer une peau immunocompétente qui combinera des MonoDCs avec tous les éléments structurels et fonctionnels de la peau, c'est-à-dire une barrière épidermique posée sur un derme contenant une pseudo-vascularisation et des neurones nociceptifs. Une matrice de collagène a été ensemencée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales, puis avec des précurseurs de fibres nerveuses dérivées soit de l'iPSC humaine, soit de la DRG embryonnaire murins. Enfin, nous avons introduit les MonoDC et les kératinocytes. Nous avons observé que les neurones différenciés in situ innervent l'épiderme comme observé habituellement dans la peau humaine normale. De plus, les neurones dérivées d’iPSCs, expriment neuropeptides et canaux calcique spécifiques des fibres nociceptives. Enfin, les Mono-DC intégrés au modèle restent stable pendant toute la durée nécessaire à la formation de l’épiderme et peuvent être stimulé. Le modèle sera utilisé pour prédire le potentiel irritant des composés chimiques et l'impact de l’innervation nociceptive sur l'activation des DCs
Immune reactions in the skin are initiated by the cutaneous dendritic cells (DCs). The potential sensitizing effect of a compound can be predicted in vitro using human monocytes differentiated into DCs (Mono-DCs). However, these simplistic models remain inaccurate because the activation of cutaneous DCs by sensitizers may be triggered or modulated by microenvironmental interactions with multiple types of non-immune cells. Our goal is to develop an immunocompetent human tissue-engineered skin that will combine DCs with all structural and functional element of the skin, i.e. an epidermal barrier laid upon a dermis containing a pseudo-vascularization and nociceptive neurons. Collagen matrix was seeded with fibroblasts and endothelial cells, then with precursors of nerve fibers derived from either human iPSC or murine embryonic DRG. Finally, we introduced Mono-DCs and keratinocytes. We observed that in situ differentiated neurons grow axons towards the epidermis as usually observed in normal human skin. What's more, the neurons derive from iPSC, express neuropeptides and calcium channel as normal nociceptive fibers. Moreover, Mono-DCs settled as expected beneath the epidermis and remained sessile to stimulation for several weeks. The model will be used to predict the irritant potential of chemical compounds, and the impact of nerves on DC activation

Ces travaux visent à déterminer l‘intérêt de deux types de nanosystèmes (NS) coeur-couronne dans des applications dermatologiques ou cosmétiques. Les nanocapsules lipidiques (LNC) sont obtenues par une méthode déjà décrite dans la littérature. Leur formule est modifiée pour incorporer un actif cosmétique d‘intérêt. Les nanocapsules d‘alginate (ANC) sont développées au moyen de plans d‘expériences. Elles sont composées d‘un coeur huileux et d‘une coque d‘alginate de calcium gélifiée obtenue par gélification ionique de surface d‘une nanoémulsion. Des méthodes basées sur le phénomène de fluorescence nous permettent de mettre en évidence l‘endocytose des ANC par les kératinocytes. Leur contenu est rapidement libéré dans le cytoplasme. Une étude sur différents modèles ex vivo montre que les deux nanosystèmes permettent aux molécules encapsulées d‘atteindre les couches vivantes de l‘épiderme. ANC et LNC sont stables plusieurs mois dispersées dans des formes galéniques semi-solides. Ces deux NS sont donc adaptés à la délivrance de molécules actives dans la peau
Two types of core-shell nanosystems have been evaluated for dermatological and cosmetic applications. Lipid nanocapsules (LNC) are obtained by a method that has already been described in the literature. Their composition is adapted for incorporation of a specific cosmetic ingredient. Alginate nanocapsules (ANC) are developed with the aid of experimental design. They consist of a triglyceride core with a rigid calcium alginate shell obtained by ionic gelation of the surface of a nanoemulsion. By incorporating fluorophores into these nanosystems, they can be studied by advanced spectral fluorescence imaging methods. We were thus able to show that ANC are first internalized into keratinocytes by endocytosis, and once inside the cells, their contents are rapidly released into the cytoplasm. A study of different ex vivo skin model systems has shown that both nanosystems enable active substances to reach the living epidermis. When incorporated into gels similar to those used as galenic forms for topical administration, LNC and ANC remain stable for months. They can thus be used as vectors for delivering active substances to the skin

Depuis plus d’une cinquantaine d’années, de formidables avancées ont été initiées dans le domaine de l’ingénierie tissulaire cutanée menant à la reconstruction in vitro de substituts de peau. La plupart sont des substituts dermiques destinés à être utilisés comme aide à la cicatrisation des plaies aigües et chroniques en complément des traitements de greffes conventionnels ainsi que pour l’augmentation des tissus mous. Bien qu’un nombre croissant de patients aient pu bénéficier de ces matrices dermiques, leur application clinique reste encore restreinte, en raison de leur coût élevé mais également à cause de résultats cicatriciels parfois peu satisfaisants. Par conséquent, il reste un défi de taille, celui de développer des substituts dermiques stimulant activement la cicatrisation, présentant un faible coût de production, sans propriétés antigéniques et possédant des propriétés mécaniques adaptées. Dans ce cadre, les hydrogels à base de fibrine constituent des candidats prometteurs, en particulier en raison du rôle central de cette protéine dans la cicatrisation. Le principal inconvénient est qu’à concentration physiologique, ces hydrogels sont faibles mécaniquement, ce qui les rend difficilement manipulables. L’objectif de cette thèse a été la mise au point ainsi que la caractérisation de différents hydrogels destinés à être utilisés comme substituts dermiques. Ces derniers présentent l’avantage d’associer les propriétés biologiques de la fibrine avec les propriétés mécaniques d’un polymère synthétique, le polyéthylène glycol dans une architecture de réseaux interpénétrés de polymères (RIP). Les résultats obtenus ont permis : - de confirmer les propriétés physico-chimiques des RIP développés initialement par nos collaborateurs de l’université de Cergy-Pontoise, - de valider en trois étapes (in vitro, ex vivo puis in vivo) la biocompatibilité de ces nouvelles matrices, destinées à être utilisées comme supports de culture 2D et pour l’augmentation des tissus mous, - d’élaborer et de caractériser des matrices macroporeuses, optimisées pour la culture 3D de fibroblastes de dermes humains
Over the past five decades, we assisted in extraordinary advances in the field of skin tissue engineering which led to the in vitro reconstruction of a wide range of skin substitutes. Most of them are dermal substitutes: Their clinical application ranges from treating acute and chronic wounds to soft tissue augmentation. Although increasing numbers of patients have been treated with dermal substitutes, their clinical application has been limited by their substantial cost and some poor healing outcomes. Hence, there is still a challenge to produce a dermal substitute which enhance sufficiently wound healing. To this end, the substitute should exhibit suitable properties for enabling the repair process. Other requirements such as excellent biocompatibility, minimal antigenicity, ease to handle and cost-effective production are also essential. In this context, fibrin hydrogels constitute promising candidates for skin tissue engineering since fibrin fibers form a physiological and provisional backbone during wound healing. However, the poor mechanical properties of fibrin-based hydrogels at physiological concentration are an obstacle to their use. In this study, our aim was to design and characterize mechanically reinforced fibrin-based hydrogels by combining the intrinsic properties of a fibrin network with the mechanical features of a polyethylene glycol network using an interpenetrating polymer network (IPN) architecture. They are intended to be used as dermal scaffolds. The results obtained in this thesis: - Confirmed the suitable physico-chemical properties of IPN, first developed by our partner of the University of Cergy-Pontoise. - Validated their biocompatibility using a three-step approach (in vitro, ex vivo and in vivo assays). - Led to the synthesis and characterization of a new type of fibrin-based macroporous matrices, optimized for 3D dermal fibroblast culture

Les cultures d'astrocytes et de neurones sont des modèles couramment utilisés pour l'étude des fonctions du système nerveux central. Le but du présent travail est la recherche de l'influence des conditions de culture sur les astrocytes et les neurones. L'étude ultrastructurale montre la présence de mitochondries difformes et de vésicules multilamellaires dans les cellules. Les antibiotiques utilisés en culture renforcent la présence des vésicules multilamellaires. L'utilisation de traceurs du système endolysosomal montre que ces vésicules sont d'origine lysosomale. Les antibiotiques modifient l'activité de plusieurs fonctions astrocytaires et altèrent l'intégrité membranaire. Par une étude de l'apoptose, nous observons que les antibiotiques ont un effet délétère sur les astrocytes et les neurones. Ces résultats montrent que la culture perturbe le système lysosomal des cellules étudiées. Les antibiotiques amplifient ces modifications et altèrent certaines fonctions cellulaires.

La colicine n, bacteriocine produite par e. Coli, est active sur des souches apparentees. Son mode d'action comprend trois etapes: (i) fixation sur la porine ompf a la surface bacterienne, (ii) utilisation de cette meme porine et des proteines tolaq pour traverser la membrane externe (iii) formation de pores voltage-dependant dans la membrane interne. La colicine n (42kda) est organisee en domaines structuraux, chacun etant associe a une etape du mode d'action. Le domaine central r (67-182) est responsable de la fixation sur ompf. Le domaine n-terminal t, est implique dans la translocation a travers la membrane externe ; il peut etre subdivise en deux sous-domaines t1 et t2. Le site recepteur de la colicine n est conserve sur le trimere ompf purifie. L'interaction colicine n-ompf depend de la presence du domaine r. Le trimere purifie est capable de proteger les cellules sensibles contre l'action des colicines a et n. Le niveau de protection depend de l'etat conformationnel de la porine. Cette association recepteur-ligand a la surface bacterienne est visualisee en microscopie electronique. La cinetique de fixation de la colicine n est tres rapide. L'etude de la translocation montre l'existence de deux populations de colicine n: une, correspondant aux colicines internalisees et une autre, accessible a la surface cellulaire, degradee par les differentes enzymes. 10(#1) secondes est le temps qui separe l'addition de la colicine n et de la formation du pore au niveau de la membrane interne. La vitesse maximale d'efflux de k#+ intracellulaire est obtenue a une multiplicite de 300-400: correspond aux colicines protegees

Notre etude se situe dans le cadre d'un programme de recherches mene en partenariat dans le but de mettre au point des cultures cellulaires chez les bivalves marins. Les travaux ont eu pour objectif l'etablissement de cultures primaires de cellules fonctionnelles de coquille st-jacques pecten maximus et d'huitre crassostrea gigas. Ils ont necessite la selection et l'optimisation d'un protocole de dissociation cellulaire et la mise en place d'un procede de decontamination microbienne de certains tissus pour eviter la presence de microorganismes parmi les suspensions cellulaires (branchies notamment). Les essais ont ete realises a partir de cur et de branchies de coquille st-jacques et a partir d'embryons d'huitre. La technique d'isolement des cellules a par la suite ete validee par les resultats des cultures realisees dans un milieu de base que nous avons defini. Certaines cellules adherent en effet systematiquement au support apres deux ou trois jours de culture. Deux types cellulaires sont differenciables, des cellules de type epithelial, peu nombreuses, et des cellules fibroblastiques, largement majoritaires. Les cellules fusiformes adherentes en culture, de type fibroblaste, ont ete caracterisees, dans le cas du cur, par microscopie electronique (presence de myofibrilles) et immunomarquage (reaction positive a l'anti-myosine et anti- tropomyosine) comme etant des myocytes. Cette conclusion est d'ailleurs corroboree par le fait qu'apres environ une semaine de culture, lorsque les cellules sont quasiment confluentes, elles reconstituent des formations plurinucleees de type myotubes qui se contractent spontanement in vitro. Les resultats des cultures, reproductibles dans le cas du cur de coquille st-jacques restent plus variables dans le cas des branchies et des cellules embryonnaires. Ces donnees nous ont donc conduit peu a peu a selectionner les cellules de cur pour les experimentations ulterieures. Diverses techniques analytiques (histoautoradiographie, comptage en scintillation, electrophorese et autoradiographie d'electrophorese, chromatographie sur couche mince et autoradiographie de chromatographie sur couche mince), mises en uvre a differents temps de culture, apres incubation des cellules en presence de precurseurs marques ont montre que les cellules de cur en culture dans le milieu de base neosynthetisent des proteines, de l'adn et des lipides pendant au moins 20 jours (c'est aussi le cas des branchies). Ces activites de biosynthese peuvent d'ailleurs etre stimulees par addition au milieu de base de certains facteurs d'origine marine notamment et des lipides en particulier ce qui prouve que le milieu de culture peut etre encore ameliore. Un protocole de cryopreservation des cellules de cur a pu etre mis au point, permettant d'obtenir des cultures a partir des cellules decongelees. L'activite de biosynthese de ces cellules en culture, evaluee apres sept jours, apparait equivalente, au moins, a celle des cellules temoins non congelees et le profil des proteines et des lipides neosynthetises par les cellules en culture apres congelation-decongelation est comparable a celui obtenu pour les cellules fraiches. De plus, comme pour les cellules non congelees, une differenciation terminale des myoblastes en myotubes est observee en culture. A titre preliminaire, pour une etude de faisabilite, ces modeles experimentaux ont aussi ete utilises comme bioessais pour des tests de cytotoxicite aigue (effet de sels de metaux lourds) et de genotoxicite (effet d'un produit mutagene de reference, l'aflatoxine b1), l'objectif etant de pouvoir proposer a terme, des biotests et biomarqueurs d'effets cytotoxique et genotoxique de xenobiotiques presents dans le milieu marin, completant ainsi la panoplie des tests deja disponibles pour la surveillance de la qualite de l'eau de mer (algues, bacteries, embryons). En conclusion, les donnees acquises au cours de ce travail et les techniques analytiques mises au point ont permis pour la premiere fois: - d'etablir des cultures primaires de cellules de cur de coquille st-jacques dont l'activite de biosynthese a ete verifiee avec rigueur au cours du temps par l'etude de certaines fonctions du metabolisme de base (en l'absence de biomarqueurs specifiques connus), - de congeler des cellules de cur de coquille st-jacques permettant, apres decongelation, d'obtenir des cultures dont l'activite de biosynthese in vitro est conservee. Ces resultats, qui ouvrent sur de larges perspectives vont, en outre, faciliter la mise en place de nouveaux modeles cellulaires chez des invertebres marins

Nous avons développé deux techniques de production d'anticorps monoclonaux par culture cellulaire : une technique de culture en supension en fermenteur et une technique de culture sur fibres creuses. L'étude de la production d'anticorps monoclonaux en fermenteur a conduit au développement d'un système ouvert faisant appel à la perfusion de milieu frais en continu grâce à un module de microfiltration en ligne permettant la séparation cellules - milieu de culture tout au long de la culture. Ce système autorise des productions de 1 à 2 grammes d'anticorps monoclonaux par mois sous des volumes de lot de 10 à 20 litres. La culture cellulaire sur fibres creuses repose sur une compartimentation entre les cellules et le milieu de culture circulant, simulant les conditions d'alimentation en nutriments et en gaz observés "in vivo". Le système, grâce à une double circulation de milieu de part et d'autre des fibres, permet des productions selon le clone, de 7 à 15 grammes d'anticorps par mois pour des volumes de récolte de 2 à 5 litres. Le développement de ces deux procédés de production a nécessité la mise au point de milieux de culture définis pour la croissnce et la sécrétion. Ces deux techniques permettent d'obtenir des immunoglobulines ayant les mêmes caractéristiques et au moins les mêmes potentialités que les anticorps produits sur animal

En raison de la pénurie mondiale de cornées de donneurs utilisées pour traiter les pathologies cornéennes, des alternatives visant à restaurer les déficiences visuelles, comme la production de tissus cornéens humains par génie tissulaire, sont envisagées. Pour traiter les dommages affectant plus précisément l'épithélium cornéen, comme la déficience en cellules souches limbiques (DCSL), l'équivalent cornéen doit avoir un épithélium capable d'auto-renouvellement permettant la bonne cicatrisation de la cornée après la greffe. Pour cultiver des cellules épithéliales de cornées humaines (CECH) in vitro, l'utilisation d'une couche nourricière est nécessaire afin de maintenir la sous-population de cellules souches cornéennes essentielle à la bonne prolifération de ces cellules. Les conditions de culture doivent donc permettre le maintien du phénotype souche de ces cellules, tout en favorisant leur prolifération et en évitant leur différenciation terminale. Cependant, d'autres paramètres comme l'intervalle post-mortem du tissu cornéen à partir duquel sont extraites les CECH cultivées, peuvent influencer la réussite de la culture. La caractérisation des cultures de CECH est importante afin d'optimiser la réussite de la greffe. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de démontrer que la co-culture de CECH avec une couche nourricière murine a entraîné une augmentation significative de l'expression et de la liaison à l'ADN de NFI. Cela est causé par une forte expression de l'isoformes NFI-B présentant une stabilité accrue engendrée par une hyper-glycosylation. Le maintien de l'isoforme NFI-B au cours des passages a été corrélé avec une entrée en différenciation plus rapide des CECH en culture. Ces travaux ont également montré que l'effet de cette couche nourricière murine sur les niveaux d'expression et la capacité de liaison à l'ADN des facteurs de transcription Sp1 et NFI a pu être confirmé dans un autre type cellulaire. En effet, la co-culture de cellules endothéliales cornéennes humaines avec la couche nourricière murine a également causé une augmentation significative de l'expression et de la liaison à l'ADN de NFI. Dans cette étude, cela était associé à une amélioration de la morphologie des cellules endothéliales cornéennes humaines. Ces travaux ont aussi montré que l'intervalle post-mortem influençait de manière négative la prolifération des CECH et le maintien des cellules souches lors des cultures en monocouche. De même, lorsque les mêmes populations cellulaires ont été utilisées pour reconstruire une cornée humaine par génie tissulaire, la capacité de cicatrisation des épithéliums cornéens reconstruits a diminué avec l'augmentation de l'intervalle post mortem. L'étude du transcriptome de ces populations cellulaires par biopuce à ADN, a également révélé que l'intervalle post-mortem avait un impact sur le profil transcriptomique pour les cellules cultivées en monocouche. Il a aussi été montré qu'un greffon reconstruit à partir des CECH co-cultivées avec une couche nourricière humaine a permis de cicatriser la surface cornéenne d'un œil atteint de DCSL. Ces différents résultats mettent en lumière que l'utilisation d'une couche nourricière humaine pour la culture des CECH, associée à un intervalle post-mortem court des tissus dont elles sont issues, est à privilégier pour favoriser une bonne prolifération in vitro des CECH cultivées en monocouche.
Because of the worldwide shortage of graftable corneas used to treat corneal pathlogies, alternatives to restore visual impairments, such as the production of a human cornea tissues by tissue engineering, have been considered. To treat injuries affecting the corneal epithelium, such as limbal stem cell deficiency (LSCD), the corneal equivalent must have an epithelium able to self-renewal allowing healing of the patient's corneal epithelium after the transplantation. To culture human corneal epithelial cells (HCECs) in vitro, the use of a feeder layer is necessary so as to maintain the subpopulation of corneal stem cells, which is essential for the proper proliferation of these cells. Therefore, the culture conditions must allow the maintenance of the stem phenotype of these cells, while promoting their proliferation and delaying their terminal differentiation. Other parameters, such as the post-mortem interval of the corneal tissue from which the cultured HCECs are derived, can influence the success of the culture. It is therefore important to characterize the cultures of HCECs in order to optimize the success of a transplant, namely, when these cells are transplanted in order to regenerate the injured corneal epithelium of a patient. The work presented in this thesis demonstrates that the co-culture of HCECs with a murine feeder layer resulted in a significant increase in the expression and the binding to DNA of NFI. This was shown to be caused by strong expression of the NFI-B isoform with increased stability due to hyper-glycosylation. The preservation of the NFI-B isoform with cellular passages was correlated with a faster differentiation of the HCECs in culture. This work also shows that the effect of this murine feeder layer on the expression levels and the DNA binding capacity of the transcription factors Sp1 and NFI was confirmed in another cell type. Indeed, the co-culture of human corneal endothelial cells with the murine feeder layer also caused a significant increase in the expression and binding to DNA of NFI. In this study, this was associated with an improvement in the morphology of human corneal endothelial cells. This work also showed that post-mortem interval could have a negative influence on the proliferation of HCECs and on the maintenance of stem cells during monolayer cultures. When the same cell populations were used to reconstruct a human cornea with tissue engineering, the healing capacity of the reconstructed corneal epithelia was decreased by the increase in post-mortem interval. This was notably validated by a study of the transcriptome of these cell populations by DNA microarray. It has also been shown that a graft reconstructed with HCECs co-cultivated with human feeder layer has enabled to heal the corneal surface an eye with LSCD. These different results highlight that the use of a human feeder layer for culture, associated with a short post-mortem interval of the donor tissues, is to be favoured in order to promote a good in vitro proliferation of HCECs cultivated in monolayer.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2017-2018
La choroïde est une couche richement vascularisée assurant la nutrition des photorécepteurs. Les échanges avec ces derniers sont contrôlés par l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), la couche externe de la rétine reposant sur la choroïde. La perte de l’intégrité de l’étroite interaction entre l’EPR et la choroïde est à l’origine de la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), l’une des principales causes de cécité dans le monde. C’est une maladie complexe qui implique autant des facteurs de risque génétiques qu’environnementaux. Dans cette étude, nous avons reconstruit un stroma choroïdien par génie tissulaire qui servirait à étudier les interactions cellules choroïdiennes - cellules choroïdiennes et/ou cellules choroïdiennes - cellules de l’EPR. Il pourrait aussi servir comme tissu de remplacement lors d’une greffe, un traitement prometteur pour la DMLA. Nous avons d’abord isolé l’EPR et les cellules choroïdiennes à partir de globes de donneurs décédés. Puis, en utilisant la méthode d’auto-assemblage du génie tissulaire, les fibroblastes de la choroïde ont déposé des fibrilles de collagène pour former un feuillet de matrice extracellulaire dont la composition et les propriétés biomécaniques ont ensuite été caractérisées. Les analyses par spectrométrie de masse, immunomarquages, microscopie électronique à balayage et colorations histologiques ont démontré que la composition matricielle des stromas choroïdiens reconstruits (SCR) était semblable au tissu natif. Leurs propriétés biomécaniques ressemblaient également à celles de la choroïde native selon les mesures comparatives d’élasticité, de déformation et de résistance à la traction. Nous avons finalement ensemencé de l’EPR, des cellules endothéliales et des mélanocytes choroïdiens sur/dans les SCR. Ces cellules se sont bien intégrées sur ces derniers et ont adopté une morphologie et un aspect histologique retrouvés in vivo. Nos substituts choroïdiens miment donc les propriétés structurales du microenvironnement dans lequel résident les cellules choroïdiennes de même que plusieurs de ses caractéristiques fonctionnelles.
The choroid is a richly vascularized layer supplying oxygen and nutrients to the photoreceptors. The exchanges are regulated by the retinal pigment epithelium (RPE), the outermost layer of the retina that lies between the neural retina and the choroid. The loss of the normal interaction between the RPE and the choroid is central to the development of age-related macular degeneration (AMD), one of the leading causes of blindness worldwide. AMD is a complex disease involving both genetic and environmental risk factors. In this study, we have engineered a choroidal substitute which could be used in order to study choroidal cells - choroidal cells and/or choroidal cells - RPE interactions as well as serve as replacement tissues in a graft, a promising treatment for AMD. We first isolated RPE and choroidal cells from deceased donor eyes. Then, using the self-assembly approach of tissue engineering, choroidal fibroblasts accumulated collagen fibrils that produced sheets of extracellular matrix whose composition and biomechanical properties were characterized next. Several analyses, such as mass spectrometry, immunostainings, scanning electron microscopy and histological stainings, revealed that the extracellular matrix composition of the tissue-engineered (TE) choroidal stromas was similar to the native tissue. Furthermore, their biomechanical properties were akin to those of the native choroid according to the comparative measurements of elasticity, strain and ultimate tensile strength. Finally, RPE, endothelial cells and choroidal melanocytes were seeded onto the TE choroidal stromas. The cells repopulated the stroma and adopted a morphology and a histological appearance similar to in vivo. Our choroidal substitutes thus recaptured the structural properties of the microenvironment in which choroidal cells reside as well as several of its functional characteristics.

En milieu industriel, la rentabilité d'un procédé fermentaire rend indispensable la maitrise rigoureuse du procédé, laquelle passe par la connaissance de la souche en fermentation, d'ou l'intérêt de développer des capteurs d'information cellulaire et/ou fermentaire. Ainsi nous avons, d'une part utilisé ces techniques fluorimétriques pour suivre la fermentation acétonobutylique et nous avons pu caractériser la phase acide de cette fermentation par la fluorescence du nadh contenu dans les bactéries et la phase solvant par l'anisotropie de fluorescence du Dph incubé dans les membranes bactériennes et, d'autre part développé des montages expérimentaux originaux destinés à mesurer l'impact des forces de cisaillement auxquelles sont soumises les cellules en fermentation, par mesure de l'anisotropie de fluorescence de sondes susceptibles de rendre compte de leur environnement moléculaire

L’utilisation de la dispase pour détacher les feuillets épidermiques est une étape pouvant être améliorée pour faciliter leurs transferts sur les plaies des grands brûlés. La culture sur colle de fibrine élimine cette étape. Les analyses histologiques et immunohistochimiques n’ont révélé aucune différence importante entre ces deux types de feuillets épidermiques. Le gel de fibrine est donc un substrat adéquat pour la production de feuillets épidermiques greffables. Les équivalents cutanés complets complèteraient le traitement des grands brûlés. Toutefois, la production de feuillets dermiques est limitée par leur temps de production. Étant donné que le RGTA accélère la réparation de plusieurs tissus in vivo, l’effet du RGTA sur la production de feuillets dermiques fut testé. Des examens physiques et histologiques ont montré que le RGTA26 rendait les feuillets fragiles. Les ELISAs et les zymogrammes ont montré une modulation de la production collagénique et des MMPs. L’utilisation du RGTA pour produire les feuillets dermiques n’apparaît pas justifié.