Academic literature on the topic 'Pectate lyase'

This thesis investigates the structure and function of three enzymes of biotechnological and biomedical interest: telomerase from Caenorhabtidis elegans, pectate lyase from Bacillus subtilis and the methyltransferase CobJ from Rhodobacter capsulatus. Telomerase is a ribonucleoprotein found in all eukaryotes and its function is to maintain telomere length, sustain chromosome integrity and circumvent the end-replication problem. The protein requires two subunits to function, telomerase reverse transcriptase (TERT), the catalytic component, and an intrinsic RNA template (TR). The TR makes telomerase a unique reverse transcriptase using the template in the synthesis of short iterative sequences which cap the ends of telomeres. This work reports the successful cloning of a small and therefore potentially crystallisable TERT from C. elegans and expression trials of this catalytic component. Cobalamin (vitamin B12) is an intricate small molecule belonging to a group of compounds called cyclic tetrapyrroles. Its biosynthesis is achieved through a complex pathway encompassing over thirty different enzyme-mediated reactions. Within this pathway there are seven methyltransferases which add eight S-adenosyl-methionine (SAM) derived methyl groups to the macrocycle. CobJ catalyses the methylation of C17 and ring contraction at C20, this reaction which exudes C20 from the tetrapyrrole ring is unprecedented in nature. In this thesis I report the crystallisation of native CobJ and refinement and validation of a high resolution structure along side co-crystallisation and soaking experiments aimed at capturing an enzyme-tetrapyrrole complex. Pectate lyase (BsPel) is an enzyme secreted from the bacterium B. subtilis, it is one of many enzymes secreted by plant pathogens that is responsible for soft rot disease in plants and vegetables. The lyase utilises anti β-elimination chemistry to cleave an α-1,4- glycosidic link present in polygalacturonate the major component of the plant cell wall. 3 The structure of BsPel in complex with hexagalacturonate and a cobalt metal has been solved confirming the position and role of the putative catalytic base Arg 279 in the abstraction of a proton from C5 in galacturonate.

L'etude a porte sur l'optimisation en milieu minimum de la production d'une pectate lyase (ec 4. 2. 2. 2) de bacteroides thetaiotaomicron 217 clonee chez escherichia coli hb101 (pbt4). Cette etude nous a conduit, a partir de l'utilisation de deux types de plans d'experiences factoriels a deux niveaux inspires du modele de box-wilson (1951), a rechercher les facteurs pouvant influencer la production de l'enzyme. Nos resultats ont montre que l'extrait de caseine, le glucose et le magnesium sont les constituants du milieu les plus influants sur la production de pectate lyase. Ces deux plans ont ete completes par la methodologie de reponse de surface de doehlert (1970) qui nous a permis de determiner la bonne combinaison des concentrations de glucose et de magnesium pour une meilleure production de pectate lyase. Le plasmide pbt4 est plus stable a 30c qu'a 37c, meme en presence de tetracycline et d'ampicilline utilises comme pressions de selection. Un plan factoriel d'experiences de type 2#4 nous a permis de montrer que la presence simultanee de tetracycline, d'ampicilline et de glucose dans le milieu de culture contribue a une meilleure stabilite du pbt4 chez e. Coli hb101 et a une meilleure reproductibilite dans la production de la pectate lyase. Apres 8 heures de culture en fermenteur, les concentrations du glucose et des sels d'ammonium sont reduites de moitie. Le reajustement de leurs concentrations entraine une augmentation de la production de biomasse accompagnee d'une diminution importante de celle de pectate lyase. Sachant que la production d'acetate, que nous avons observee lors de la croissance de la cellule recombinee, est un des principaux facteurs limitant la production de biomasse et de pectate lyase en fermenteur, nous avons etudie l'influence de l'addition de l'extrait de levure a 1 g/l ou du 3-bromopyruvate a 50 m sur la production de l'acetate par e. Coli hb101 (pbt4). Bien que ces deux substances reduisent de facon importante la quantite d'acetate produite dans le milieu de culture suivant des mecanismes differents, seul l'extrait de levure a permis une production de 3,7 g/l de biomasse et de 670 unites de pectate lyase par millilitre de culture en fermenteur. Ainsi, par etapes successives, nous sommes parvenus a augmenter la production de pectate lyase par la cellule recombinee d'environ 21 fois en erlenmeyers puis ensuite de 3 fois en fermenteur.

Les bactéries sont en permanence confrontées à des changements d'environnements. La régulation transcriptionnelle joue alors un rôle majeur dans l'adaptation des bactéries. En particulier, la bactérie phytopathogène D. dadantii s'est récemment adaptée à l'hôte végétal. Elle produit en particulier des pectate lyases (Pel) qui dégradent la pectine, ciment des parois végétales, et jouent un rôle majeur dans le développement de la maladie. Les gènes pelD et pelE, malgré la forte divergence dans leur expression, sont issus d'un transfert horizontal suivi d'une duplication récente. La question de l'intégration de ces gènes avec les régulations préexistantes s'est alors posée.Dans un premier temps, les mécanismes moléculaires détaillés de la régulation de pelD ont été étudiés. Il a été montré que cette régulation s'appuie sur un promoteur divergent de forte affinité pour l'ARN polymérase mais de faible efficacité pour la transcription et sur un arrangement stratégique de quatre sites de fixation de répresseur FIS et deux sites de l'activateur CRP. Tous ces éléments interagissent entre eux pour produire une régulation fine de l'expression de pelD. L'origine de la divergence régulatrice entre les paralogues pelD et pelE a par la suite été explorée. De manière surprenante, la divergence entre ces deux gènes et leur sélection s'appuie presque exclusivement sur un décalage de la position du promoteur de pelE (« TSS turnover ») qui l'a transformé en initiateur de la dégradation de la pectine. Ce mécanisme très fréquent chez les eucaryotes pluricellulaires (homme, drosophile, souris…) n'avait jamais encore été décrit chez les bactéries.A travers l'étude des promoteurs pelD et pelE de D. dadantii, de nouveaux mécanismes renforçant l'importance de la régulation transcriptionnelle dans les processus adaptatifs ont ainsi été découverts<br>Bacteria face frequent environmental changes. Transcriptional regulation plays a major role in the adaptation to these changes. In particular, the phytopathogen bacteria Dickeya have recently adapted to vegetal hosts. They produce Pecate lyases (Pel), among others, to degrade pectin in plant cell walls, which is necessary for disease development. The pelD and pelE genes, despite the strong divergence in their expression, originate from a horizontal gene transfer followed by a recent duplication. This raises the question of their integration into the preexisting regulatory networks.Detailed molecular mechanisms of the transcriptional regulation of pelD were studied first. It was shown that this regulation relies on a high-affinity but low transcription efficiency divergent promoter and a strategic arrangement of four FIS repressor binding sites and two CRP activator binding sites. These elements interact together to fine-tune the expression of pelD. Next, the origin of the regulatory divergence between the paralogous genes pelD and pelE was explored. Surprisingly, their divergence and selection relies mostly on a TSS turnover which happened on the pelE regulatory region and transformed pelE into an initiator of pectin degradation. This widespread phenomenon in multicellular eukaryotes (human, fly, mouse…) had not yet been seen in bacteria. To conclude, through the study of D. dadantii pelD and pelE promoters, new mechanisms highlighting the relevance of transcriptional regulation in adaptation were discovered in this work

Cell wall loosening and degradation are important processes in major stages of plant development including fruit ripening. Three main mechanisms have been proposed to contribute towards cell wall polysaccharide degradation in vivo: enzymic hydrolysis by endopolygalacturonase (EPG), enzymic elimination by pectate lyase (PL), and non-enzymic scission by hydroxyl radicals (•OH). However, little idea as to which of these three mechanisms predominates in homogalacturonan degradation especially during fruit ripening. This study presents an attempt to discover the respective contribution of those three mechanisms of attack. The strategy used to achieve the objective of this study was to identify and measure homogalacturonan molecules that exhibit symptoms of each mechanism of attack. A method that was developed in this study is a fluorescent labelling method mainly to study the •OH attack on pectic polysaccharides. This labelling method is based on the ability of 2-aminoacridone (2-AMAC) to reductively aminate oxo groups of sugar moieties followed by exhaustive digestion with Driselase. In a model in-vitro experiment, the developed novel fluorescent labelling method, when applied to homogalacturonan, that had been attacked by •OH (Fenton reagent), produced at least three fluorescent ‘fingerprint’ compounds, separable by high-voltage paper electrophoresis (HVPE) based on their charge/mass properties at pH 6.5 and also by high pressure liquid chromatography (HPLC) on a C18 column with a fluorescence detector at λem= 520 nm. These fingerprint compounds include: a monomer, 1A*; a dimer, 2A*; and an unidentified compound, X*. In-vivo application with alcoholinsoluble residue (AIR) of seven species of fruit (pear, mango, banana, apple, avocado, strawberry and strawberry tree fruit) at three stages of softening produced at least two fluorescent fingerprint compounds: a monomer, 1AF and a dimer, 2AF. XF, an interesting compound found in a few samples in in-vivo experiments, showed electrophoretic mobility similar to X*; however, the retention time of this compound on HPLC did not agree with that of X*. 2AF was suggested to be exclusive evidence for •OH attack in vivo while 1AF was suggested to be a useful evidence not only to reveal •OH attack but also to reveal EPG and PL attack on pectic polysaccharides during fruit softening. HVPE and HPLC results showed an increasing pattern of 2AF in mango, banana, avocado and strawberry tree fruit, which indicated progressive •OH attack on pectic polysaccharides during the softening process. There was no clear evidence of 2AF at any stage of softening in apple and strawberry, which may suggest that fruit softening in apple and strawberry was not associated with •OH attack. On the other hand, HVPE analysis of 1AF showed and increasing pattern in pear, mango, banana, avocado and strawberry tree fruit, which may indicate EPG, PL and/or •OH attack during fruit softening. Production of these fluorescent fingerprint compounds provides good evidence for •OH attack on pectic polysaccharides, and has the potential to give useful information for EPG and PL attack in vivo.

Erwinia chrysanthemi est une enterobacterie phytopathogene responsable de la pourriture molle de nombreux vegetaux. Son pouvoir pathogene est du essentiellement a la production de pectinases et cellulases parmi lesquelles 8 pectate lyases (pels) sont des determinants majeurs. La plupart des pels et la cellulase celz sont exportees dans le periplasme ou elles acquierent une structure repliee grace a des catalyseurs de repliement tels que les disulfure isomerases et, probablement, des peptidyl prolyl cis-trans isomerases. L'etude de la region adjacente au locus pelb-pelc, codant deux pels, nous a permis d'identifier deux genes convergents, pelz et rota. L'expression du gene pelz est soumise a de nombreuses regulations qui affectent aussi la transcription des autres genes pel d'e. Chrysanthemi. Unite transcriptionnelle independante en conditions non induites, le gene pelz est co-transcrit avec pelc en presence de derives pectiques ; la synthese d'un arnm polycistronique demontre l'existence du premier operon de genes de la pectinolyse d'e. Chrysanthemi. Pelz est une endo-pectate lyase secondaire appartenant a une nouvelle famille de pels. Bien que presentant des caracteristiques enzymologiques proches de celles des autres pels d'e. Chrysanthemi, et notamment pelb et pelc, elle est la seule pel utilisant l'ion manganese comme cofacteur. Une synergie d'action a ete mise en evidence entre pele et pelz. Cette derniere est un determinant mineur de la pathogenicite d'e. Chrysanthemi, qui semble implique dans une certaine specificite d'hote. Le gene rota code une peptidyl prolyl cis-trans isomerase periplasmique de la famille des cyclophilines. Son expression, independante de celle des genes pel, est peu regulee. Aucune fonction de la proteine rota n'a pu etre determinee in vivo. Contrairement aux disulfure isomerases, rota ne semble pas etre essentielle pour le repliement des pels et de celz.

Die Pektat-Lyasen gehören zu einer Proteinfamilie, die meistens von pflanzenpathogenen Mikroorganismen sekretiert werden. Die Enzyme katalysieren den Abbau von Polygalakturonsäure, einem Hauptbestandteil in <br /> pflanzlichen Mittellamellen und Primärzellwänden. Der Abbau der alpha-1,4-verbrückten Galakturonsäurereste erfogt durch eine beta-Eliminierungsreaktion, dabei entsteht ein Produkt mit einer ungesättigten C4-C5 Bindung am nicht reduzierenden Ende, das durch spektroskopische Messungen beobachtet werden kann. Für die enzymatische Reaktion der Pektat-Lyasen ist Calcium nötig und das pH-Optimum der Reaktion liegt bei pH 8.5. Alle bis jetzt bekannten Strukturen der Pektat- und Pektin-Lyasen haben das gleiche Strukturmotiv - eine rechtsgängige parallele beta-Helix. Die Struktur der Pektat-Lyase aus Bacillus subtilis (BsPel) ist im Komplex mit Calcium gelöst worden. BsPel ist ein monomeres Protein mit einer ungefähren Molekularmasse von 43 kDa, das keine Disulfidbrücken enthält. Dies erlaubte sowohl eine effiziente rekombinante Expression des Wildtypproteins, als auch von destabilisierten Mutanten im Cytoplasma von E. coli. Parallele beta-Helices sind relativ große, jedoch verhältnismäßig einfach aufgebaute Proteine. Um detailliertere Informationen über die kritischen Schritte bei der in vitro-Faltung von parallelen beta-Helices zu erhalten, sollte in der vorliegenden Arbeit versucht werden, den Faltungsmechanismus dieses Proteins näher zu charakterisieren. Dabei sollte vor allem die Frage geklärt werden, welche Wechselwirkungen für die Stabilität dieses Proteins einerseits und für die Stabilität von essentiellen Faltungsintermediaten andererseits besonders wichtig sind.<BR><br>Rückfaltung von BsPel, ausgehend vom guanidiniumchlorid-denaturierten Zustand, war bei kleinen Proteinkonzentrationen und niedrigen Temperaturen vollständig möglich. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge waren aber nicht reversibel und zeigten eine apparente Hysterese. Kinetische Messungen des Fluoreszenz- und CD-Signals im fernen UV ergaben eine extreme Denaturierungsmittelabhängigkeit der Rückfaltungsrate im Bereich des Übergangmittelpunktes. Der extreme Abfall der Rückfaltungsraten mit steigender Denaturierungsmittelkonzentration kann als kooperative <br /> Entfaltung eines essentiellen Faltungsintermediats verstanden werden. Dieses Faltungsintermediat ist temperaturlabil und kann durch den Zusatz Glycerin im Renaturierungspuffer stabilisiert werden, wobei sich die Hysterese verringert, jedoch nicht vollständig aufgehoben wird. Durch reverse Doppelsprungexperimente konnten zwei transiente Faltungsintermediate nachgewiesen werden, die auf zwei parallelen Faltungswegen liegen und beide zum nativen Zustand weiterreagieren können. Fluoreszenzemissionsspektren der beiden Intermediate zeigten, daß beide schon nativähnliche Struktur aufweisen. Kinetische Daten von Prolin-Doppelsprungexperimenten zeigten, daß Prolinisomerisierung den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Reaktivierung des denaturierten Enzyms darstellt. Desweiteren konnte durch Prolin-Doppelsprungexperimenten an Mutanten mit Substitutionen im Prolinrest 281 gezeigt werden, daß die langsame Renaturierung von BsPel nicht durch die Isomerisierung der einzigen cis-Peptidbindung an Prolin 281 verursacht wird, sondern durch die Isomerisierung mehrerer trans-Proline. Die beiden beobachteten transienten Faltungsintermediate sind somit wahrscheinlich zwei Populationen von Faltungsintermediaten mit nicht-nativen X-Pro-Peptidbindungen, wobei sich die Populationen durch mindestens eine nicht-native X-Pro-Peptidbindung unterscheiden.<BR><br>Der Austausch des Prolinrestes 281 gegen verschiedene Aminosäuren (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) führte zu einer starken Destabilisierung des nativen Proteins und daneben auch zu einer Reduktion in der Aktivität, da die Mutationsstelle in der Nähe der putativen Substratbindetasche liegt. Die Rückfaltungskinetiken der Prolinmutanten war bei 10&#176;C annähernd gleich zum Wildtyp und die geschwindigkeitsbestimmenden Schritte der Faltung waren durch die Mutation nicht verändert. Die durch die Mutation verursachte drastische Destabilisierung des nativen Zustands führte zu einem reversiblen Entfaltungsgleichgewicht bei pH 7 und 10&#176;C. GdmCl-induzierte Faltungsübergänge der Mutante P281A zeigten bei Messungen der Tryptophanfluoreszenzemission und der Aktivität einen kooperativen Phasenübergang mit einem Übergangsmittelpunkt bei 1.1 M GdmCl. Durch die Übereinstimmung der Faltungsübergänge bei beiden Messparametern konnten die Faltungsübergänge nach dem Zwei-Zustandsmodell ausgewertet werden. Dabei wurde eine freie Sabilisierungsenthalpie der Faltung für die Mutante von <nobr>-&nbsp;64.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.4&nbsp;kJ/mol</nobr> und eine Kooperativität des Übergangs <br /> von <nobr>-&nbsp;58.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.3&nbsp;kJ/(mol&#183;M)</nobr> bestimmt.<BR> <br /> <br>BsPel enthält, wie die meisten monomeren rechtsgängigen parallelen beta-Helix-Proteine, einen internen Stapel wasserstoffverbrückter Asparagin-Seitenketten. Die Mehrheit der erzeugten Mutanten mit Substitutionen im Zentrum der Asn-Leiter (N271X) waren als enzymatisch aktives Protein zugänglich. Die Auswirkung der Mutation auf die Stabilität und Rückfaltung wurde an den Proteinen BsPel-N271T und BsPel-N271A näher analysiert. Dabei führte die Unterbrechung des Asparaginstapels im Inneren der beta-Helix zu keiner drastischen Destabilisierung des nativen Proteins. Allerdings führten diese Mutationen zu einem temperatur-sensitiven Faltungsphänotyp und die Hysterese im Denaturierungsübergang wurde verstärkt. Offenbar wird durch die Unterbrechung des Asparaginstapel ein essentielles, thermolabiles Faltungsintermediat destabilisiert. Der Asparaginstapel wird somit bei der Faltung sehr früh ausgebildet und ist wahrscheinlich schon im Übergangszustand vorhanden.<br>Pectate lyases belong to a family of proteins secreted by plant pathogenic microbes. The enzymes cleave alpha-1,4 linked galacturonic acid by a beta-elimination that results in an unsaturated product, which can be quantified spectrophotometrically. Calcium is essential for the activity and the pH-optimum is near 8.5. All known structures of pectate and pectin lyases have the same structural motif - a right handed parallel beta-helix. The structure of pectate lyase from Bacillus subtilis (BsPel) has been solved in complex with calcium. It is a monomeric protein, with a molecular mass of about 43 kDa and without disulfide bonds. This allows its high-yield recombinant expression in the cytoplasm of Escherichia coli. Parallel beta-helices are relative large proteins, however with a simple folding topology. The objective of this work was to characterize the folding mechanism of BsPel. In particular we investigated the role of the interactions of certain residues in the parallel beta-helix for the stability of the native protein and the stability of essential folding intermediates.<br /> <br /> Refolding of BsPel was possible at low protein concentrations and low temperature. However, denaturation of BsPel was not freely reversible. De- and renaturation curves showed a large apparent hysteresis. Furthermore, the folding rate constant deduced from fluorescence and circulardichroism measurements showed a very strong dependence on denaturant concentrations near the midpoint of the renaturation transition. This can be explained with a cooperative unfolding of an essential folding intermediate. Upon stabilisation of the temperature-sensitive intermediate by addition of glycerol in the renaturation buffer, the hysteresis is reduced, but does not disappear. Reverse double mixing kinetic experiments have shown that two transient folding intermediates are on the folding pathway. These intermediates are on parallel pathways and both can fold to the native state. Fluorescence emission spectra have shown the native-like structure of both intermediates. Furthermore, data from proline double mixing kinetic experiments revealed that isomerization of peptidyl-prolyl bonds was responsible for the slow kinetics in the reactivation of the enzyme. However, the isomerization of the single cis-peptidyl-prolyl bond at Pro281 was not responsible for the slowest folding phase observed, but rather the isomerization of other trans-peptidyl-prolyl bonds. Thus, both transient folding intermediates observed probably represent two populations of folding intermediates with non-native X-Pro-peptide bonds. The difference of the two populations is at least one non-native X-Pro-peptide bond.<br /> <br /> Mutations of the proline 281 against various residues (Ala, Ile, Leu, Phe, Gly) resulted in a strong destabilization of the native protein. Also, the activity of the mutant proteins was strong reduced due to the position of the mutation site near the putative active center of the protein. At 10&#176;C the kinetic folding behavior of the proline mutants was not significant changed. However, the strong destabilization of the native state in the proline mutants resulted in a reversible folding equilibrium at pH 7 and 10&#176;C. The unfolding of the P281A mutant was reversible as determined by fluorescence emission and enzyme activity measurements. The coincidence of these detected transitions is consistent with a two-state equilibrium transition. At pH 7 and 10&#176;C the delta G&#176;(H₂O) for folding of P281A was <nobr>-&nbsp;64.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.4&nbsp;kJ/mol,</nobr> with a midpoint of the transition at 1.1 M GdmCl and a cooperativity of <nobr>-&nbsp;58.2&nbsp;&#177;&nbsp;0.3&nbsp;kJ/(mol&#183;M).</nobr><br /> <br /> BsPel has an asparagine ladder in turn 2 of the parallel beta-helix with extensive network of side-chain hydrogen bonds between the Asn residues. Such an Asn-ladder is a conserved feature of many monomeric beta-helices crystallized so far. The middle Asn residue (271) was selected and exchanged for various residues. Most of the mutants were expressed at 25&#176;C as soluble and active proteins but with a significant reduction in yield. Mutants N271T and N271A were selected to study the stability and refolding of these proteins in comparison with the wild-type protein. The substitution in the Asn-ladder did not drastically destabilize the native protein, but caused a temperature-sensitive-folding (tsf) phenotype with an increased hysteresis in the de- and renaturation transition curves. In addition, the disruption of the Asn-ladder resulted in destabilization of an essential, thermosensitive folding intermediate. Thus, the Asn-ladder is formed very early during the folding, probably well before the transition state of folding.