Academic literature on the topic 'Photoblanchiment'

La découverte des Protéines Fluorescentes Phototransformables (PTFPs) issuesd’espèces anthozoaires a ouvert, grâce à leurs propriétés photophysiques particulières, unvaste champ d’investigation pour l'imagerie biologique de fluorescence. L'un des sousgroupesdes PTFPs est formé des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables(RSFPs), qui peuvent être commutées réversiblement entre des états non-fluorescent etfluorescent. Le photoblanchiment est la perte définitive d’émission de fluorescence sousexcitation et est un phénomène commun à toutes les molécules fluorescentes. Lephotoblanchiment a un impact important sur la qualité des images de microscopie, notammenten imagerie de super-résolution. Les RSFPs ont tendance à perdre de leur performance àchaque cycle de commutation, un processus dénommé “photofatigue”. Notre intérêt est centrésur l'étude des mécanismes de photofatigue des RSFPs.Nous avons rapporté les structures cristallographiques d’IrisFP photoblanchie par uneforte et une basse intensité d’illumination à température ambiante ainsi que les modificationsspectroscopiques associées. Nos résultats démontrent que différentes intensités d'excitationpeuvent donner lieu à différentes voies de photoblanchiment. Sous faible intensité d'excitation,une voie de photoblanchiment dépendante de l'oxygène a été mise en évidence. Lesmodifications structurales induites par la production d'oxygène singulet à l'intérieur de lapoche du chromophore ont révélé l'oxydation de deux résidus soufrés, Met159 et Cys171,piégeant le chromophore dans un état protoné non-fluorescent. Sous haute intensitéd'excitation, une voie de photoblanchiment oxygène-indépendante totalement différente a ététrouvée. Le Glu212, strictement conservé, subit une décarboxylation associée à un importantréarrangement du réseau de liaisons hydrogènes autour du chromophore, et un changementd’hybridation sp2 vers sp3 du carbone reliant les cycles du chromophore est observé. En tantque résidu clé impliqué dans le photoblanchiment induit par faible intensité d'excitation, nousavons muté Met159 en alanine afin d'éviter une sulfoxydation. Nous avons trouvé que lemutant IrisFP-M159A démontre une photostabilité améliorée en solution, en gel PVA et dansdes cellules E. coli
The discovery of phototransformable FPs (PTFPs) from Anthozoa species, thanks totheir photophysical properties, has opened a large field in biological fluorescence imaging.One of the PTFPs’ sub-groups consists of Reversible Photoswitchable Fluorescent Proteins(RSFPs), which can be reversibly switched between nonfluorescent and fluorescent states.Photobleaching is the permanent loss of the fluorescence-emitting capacity under excitation,which is a common phenomenon among all the fluorescent molecules. Photobleaching has alarge impact on the microscopy image quality, notably on super-resolution imaging.Photoswitchable fluorescent proteins have a tendency to lose performance within everyswitching cycle, a process referred to as “photofatigue”. Our interest of study is focused onthe photobleaching mechanisms of RSFPs.We have reported the crystallographic structure of photobleached IrisFP under highand low illumination intensity at room temperature as well as its spectroscopic modifications.We found that different illumination intensities can result in different photobleachingpathways. Under low illumination intensity, an oxygen-dependent photobleaching pathwaywas evidenced. Structural modifications induced by singlet-oxygen production within thechromophore pocket revealed the oxidation of two sulfur-containing residues, Met159 andCys171, locking the chromophore in a nonfluorescent protonated state. Under highillumination intensity, a completely different, oxygen-independent photobleaching pathwaywas found. The conserved Glu212 underwent decarboxylation concomitantly with anextensive rearrangement of the H-bond network around the chromophore, and an sp2-to-sp3hybridization change of the carbon atom bridging the chromophore cyclic moieties wasobserved. As Met159 is the key residue involved in low-intensity illumination photobleaching,we have then mutated Met159 into Alanine in order to avoid sulfoxidation. We found that theIrisFP-M159A mutant display an enhanced photostability in solution, in PVA gel and inE.coli cells

La photodégradation de l'hématoporphyrine dérivée (HpD) est caractérisée par une modification du spectre d'absorption, une diminution de l'intensité de fluorescence, ainsi qu'une altération du pouvoir de photoinactivation cellulaire. A partir de ces trois critères, seront évaluées les constantes de photodégradation de l'HpD dans deux environnements biologiques différents. In vitro : sur solutions d'HpD supplémentées de sérum (2%). Le taux de photodégradation le plus important est obtenu à partir des essais de cytotoxicité cellulaire (test au MIT) suggérant que le système biologique d'estimation du photoblanchiment est le plus sensible. In vivo : sur tumeurs HT29 greffées sur souris et exposées à différentes fluences en lumière bleue ou en lumière rouge. Malgré sa faible profondeur de pénétration dans les tissus, la lumière bleue induit un taux de photodégradation supérieur à celui de la lumière rouge et elle semble par ailleurs réagir selon un processus radicalaire qui gagnerait tout le volume tumorale. L'HpD étant proposée en thérapie photodynamique (PDT) pour le diagnostic et le traitement des néoplasies, notre second objectif est de démontrer in vitro et in vivo si l'illumination de l'HpD à visée de diagnostic (λ<415 nm) peut altérer l'efficacité de l'étape thérapeutique successive (λ=630 nm). In vitro : les essais sur culture de cellules ont démontré que l'exposition séquentielle aux deux lumières diminuait la cytotoxicité. Cette interaction négative peut être modifiée par la production de photoproduits avec une faible activité photodynamique dont l'existence a été confirmée par la détection de nouveaux pics d'absorption et de fluorescence. In vivo : l'évolution du volume tumoral après exposition séquentielle aux deux lumières est plus rapide que celle des témoins exposés à une seule photoirradiation. Aucune relation directe ne permet de lier l'altération de l'activité photodynamique aux résultats obtenus par les autres méthodes d'évaluation du photoblanchiment. Seule l'évaluation des conséquences biologiques peut fournir une réponse objective.

La photodégradation de l'hématoporphyrine dérivée (HpD) est caractérisée par une modification du spectre d'absorption, une diminution de l'intensité de fluorescence, ainsi qu'une altération du pouvoir de photoinactivation cellulaire. A partir de ces trois critères, seront évaluées les constantes de photodégradation de l'HpD dans deux environnements biologiques différents. In vitro : sur solutions d'HpD supplémentées de sérum (2%). Le taux de photodégradation le plus important est obtenu à partir des essais de cytotoxicité cellulaire (test au MIT) suggérant que le système biologique d'estimation du photoblanchiment est le plus sensible. In vivo : sur tumeurs HT29 greffées sur souris et exposées à différentes fluences en lumière bleue ou en lumière rouge. Malgré sa faible profondeur de pénétration dans les tissus, la lumière bleue induit un taux de photodégradation supérieur à celui de la lumière rouge et elle semble par ailleurs réagir selon un processus radicalaire qui gagnerait tout le volume tumorale. L'HpD étant proposée en thérapie photodynamique (PDT) pour le diagnostic et le traitement des néoplasies, notre second objectif est de démontrer in vitro et in vivo si l'illumination de l'HpD à visée de diagnostic (λ<415 nm) peut altérer l'efficacité de l'étape thérapeutique successive (λ=630 nm). In vitro : les essais sur culture de cellules ont démontré que l'exposition séquentielle aux deux lumières diminuait la cytotoxicité. Cette interaction négative peut être modifiée par la production de photoproduits avec une faible activité photodynamique dont l'existence a été confirmée par la détection de nouveaux pics d'absorption et de fluorescence. In vivo : l'évolution du volume tumoral après exposition séquentielle aux deux lumières est plus rapide que celle des témoins exposés à une seule photoirradiation. Aucune relation directe ne permet de lier l'altération de l'activité photodynamique aux résultats obtenus par les autres méthodes d'évaluation du photoblanchiment. Seule l'évaluation des conséquences biologiques peut fournir une réponse objective.

La thérapie photodynamique (PDT) est une modalité de traitement des petites tumeurs localisées accessibles à la lumière. Son principe repose sur l'action conjuguée d'un photosensibilisant, de la lumière et de l'oxygène.
Une dosimétrie correcte est nécessaire pour assurer le traitement complet et des résultats reproductibles. Un élément clé de la dosimétrie à prendre en compte est le photoblanchiment, étant donné qu'il diminue la concentration du photosensibilisant au cours du traitement. Il est donc indispensable d'appréhender les mécanismes du photoblanchiment pour maîtriser au mieux le traitement.
Le rendement quantique de photoblanchiment de la m-THPBC en solution avec des protéines est de 5.7 x 10-4, les formes agrégées de photosensibilisants photoblanchissent plus lentement que les formes monomérisées. La m-THPBC se transforme sous l'effet de la lumière en m-THPC, ce rendement de phototransformation est influencé par l'état d'agrégation de la molécule. D'autres photoproduits tels que la m-THPBC di-hydroxylée et la m-THPC dihydroxylée ainsi que des dérivés dipyrines ont été observés. L'espèce responsable du photoblanchiment a été identifiée comme étant l'oxygène singulet. In vitro, la LD50 de la m-THPBC est 0.7 J cm-2. Le photoblanchiment est 3 à 5 fois plus sensible que celui de la m-THPC. L'étude de la localisation intra-cellulaire des photosensibilisants a montré une différence, la m-THPC s'accumulant dans le réticulum endoplasmique alors que la m-THPBC se localise dans les mitochondries. In vivo, la m-THPBC possède un photoblanchiment 4 à 10 fois plus élevé que la m-THPC, ainsi qu'une bonne accumulation tumorale. Ces résultats in vitro et in vivo sont particulièrement intéressants en terme de ratio thérapeutique, de sélectivité du traitement et de photosensibilité cutanée.

Nous avons developpe une methode de mesure des mouvements des vesicules endocytiques par le recouvrement de fluorescence apres photoblanchiment (frap). Notre etude a porte sur des fibroblastes de souris, clone 1d, ayant endocyte du dextrane de masse 40000 marque a la rhodamine b (rd). Nous avons trouve qu'il existe trois groupes de vesicules endocytiques, a tous les stades de l'endocytose que nous avons etudie: une classe de vesicules mobiles rapides ayant une vitesse comprise entre 7 et 11 m s##1 a 17c, une classe de vesicules mobiles lentes dont la vitesse est comprise entre 0,3 et 0,8 m s##1 a 17c et une classe de vesicules immobiles a l'echelle de temps que nous utilisons. Les vesicules immobiles sont situees en majorite dans les zones d'accumulation du rd alors que les vesicules mobiles rapides sont majoritaires dans la zone de faible concentration en rd. La vitesse lente que nous mesurons correspond assez bien aux vitesses des endosomes qui sont donnees dans la litterature. Nous attribuons le mouvement rapide a de petites vesicules de diametre inferieur a la resolution optique des microscopes. L'action d'inhibiteurs metaboliques montre que ces mouvements sont energie-dependants. Nos resultats sont en accord avec certaines observations de microscopie electronique (marsh et al. , 1986). Les petites vesicules pourraient contribuer au transfert du materiel d'un compartiment endocytique a un autre, comme palade en a emis l'hypothese (1975)

Depuis la découverte de la protéine fluorescente verte (GFP) en 1962, de nombreux développements ont permis d'améliorer l'utilisation de cette protéine naturellement luminescente en tant que puissant outil permettant de suivre des protéines ou des organelles d'intérêt dans les cellules ou organismes vivants. Au début du 21ème siècle, la découverte des protéines fluorescentes photoactivables (PAFPs), notamment chez les anthozoaires, a initié une révolution dans le domaine de la technologie des FP. Certaines PAFPs sont capables d'être irréversiblement photoconverties d'une forme fluorescente verte à une forme fluorescente rouge alors que d'autres peuvent être réversiblement commutées entre des formes allumées ou éteintes, selon des longueurs d'onde d'excitation spécifiques.Ces protéines sont intensivement employées pour les techniques de microscopie optique, particulièrement en “nanoscopie”, qui permet d'atteindre une résolution optique 10 fois meilleure que la limite théorique d'Abbe. Afin de développer plus en avant ces techniques, notamment en terme de résolution temporelle, la nécessité d'obtenir des sondes fluorescentes plus lumineuses pouvant se photoconvertir ou se photocommuter efficacement est cruciale. Dans un même temps, les marqueurs fluorescents doivent généralement être monomériques et photostables. Afin de mieux comprendre les mécanismes des phototransformations des PAFPs, trois membres de la famille ont été étudiés : EosFP, Dendra2 et IrisFP. Le phénomène de photoconversion du vert au rouge, de photocommutation réversible et de photoblanchiment irréversible ont été étudiés grâce à une combinaison de cristallographie des rayons X et de microspectrophotométrie, en utilisant le laboratoire Cryobench de l'ESRF/IBS. Pris ensemble, les résultats nous ont permis de proposer un mécanisme de photoconversion pour EosFP et Dendra2 et de découvrir et caractériser IrisFP, première PAFP combinant à la fois les propriétés de photoconversion et de photocommutation. Les modifications structurales du chromophore associées à la formation d'un état radicalaire induit par les rayons X, probablement impliqué dans la voie de photoblanchiment des PAFPs, ont aussi été caracterisées.

Rigidité ou raideur des tissus affecte de nombreux processus biologiques dans le développement embryonnaire et la physiologie des adultes et sont impliqués dans de nombreuses maladies. Rigidité de détection par les cellules et comment les cellules répondent à elle , sont donc des aspects essentiels de la biologie et de la médecine. Cellules souches mésenchymateuses présentent des propriétés uniques que leur sort est régi par la rigidité de la matrice extra-cellulaire (ECM ). Les adhésions focales ( AF ) sont les éléments mécano qui relient la cellule à son environnement mécanique. Parce aperçu apparaît que les processus dynamiques intrinsèques à AF et du cytosquelette serait décisif dans la transduction des stimuli mécaniques en signaux biochimiques , nous abordons la relation entre la diffusion et propriétés de liaison des protéines AF et de la rigidité de détection dans les cellules souches mésenchymateuses humaines ( hMSC ). Nous avons mis en culture primaire hMSC dérivées de moelle osseuse , sur gels de polyacrylamide' revêtus de collagène de raideur définie et contrôlée. Adhérences et / ou adhésions naissantes à la pointe de monter et démonter ou deviennent des plus grandes autorités fédérales afin de soutenir des forces contractiles plus élevés qui ont lieu à plus de rigidité de l'ECM. Pour déterminer si le chiffre d'affaires et la croissance des AF dans hMSC dépend de la rigidité de l' ECM , et de déchiffrer le rôle de la dynamique et des interactions de la signalisation des protéines d'échafaudage dans ces processus , nous avons suivi la diffusion et propriétés de liaison de FAK , paxillin , talin et vinculine dans les cellules NCSM. Nos études basées sur la microscopie de fluorescence des approches différentes FRAP ( Fluorescence Recovery après photoblanchiment ) , F ( C ) CS ( Fluorescence ( Cross) Correlation Spectroscopy ) et FRET ( de Fluorescence Resonance Energy Transfer ) par FLIM ( Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) , tous ensemble ont révélé ce que le temps de séjour de ces protéines au sein de structures FA augmente en même temps que la rigidité du substrat. Cette propriété est en corrélation avec la dynamique et l'instabilité de la composition complexe FA elle-même , ainsi que avec le comportement cellulaire dynamique , propriétés qui sont donc régis par la rigidité du substrat. En outre, nos données montrent l'existence d' embrayage moléculaire intracellulaire à plusieurs niveaux à l'échafaud FA , y compris plusieurs liaisons moléculaires rigidité dépendante avec des cinétiques différentes (ce qui signifie lien moléculaire probable avec force différente ). Surtout , nous avons montré que les monomères de Talin et vinculine se lient à l'échafaud avec plusieurs taux de dissociation rigidité dépendante et interagissent entre eux seulement quand elle est immobilisée. La proportion des espèces en interaction talin - vinculine immobilisés (pour le type sauvage vinculine ainsi que mutant constitutivement active ) était faiblement dépendante de la rigidité de l'ECM , mettant l'accent sur le rôle des protéines dynamique au lieu de proportion d'immobilisation de la rigidité mécanisme de détection. Fait intéressant , la stabilisation de talin sur le site FA par un mutant constitutivement actif vinculine est beaucoup plus forte à faible rigidité que à haute rigidité de l'ECM , révélant une puissance élevée de signalisation réglementation à faible rigidité dans ce type de cellules. Plus précisément , notre étude a porté sur la dynamique et l'organisation des autorités fédérales , considérée comme capteurs mécaniques de ECM rigidité et donc susceptibles adaptée pour soutenir les premières étapes de processus de différenciation hMSC rigidité dépendante
Tissue rigidity or stiffness affects many biological processes in embryonic development and aduit physiology and are involved in numerous diseases. Rigidity sensing by cells and how cells respond to it, are thus crucial aspects in biology and medicine. Mesenchymal stem cells present unique properties as their fate is regulated by the stiffness of extra cellular matrix (ECM). Focal adhesions (FAs) are the mechanosensitive elements that connect the cell to its mechanical environment. Because insight emerges that the dynamic processes intrinsic to the FAs and cytoskeleton would be decisive in the transduction of mechanical stimuli into biochemical signais, we address the relationship between the diffusion and binding properties of FAs proteins and rigidity sensing in human mesenchymal stem cells (hMSC). We cultured primary hMSC derived from bone marrow, on collagen-coated polyacrylamide gels of defined and controlled stiffness. Nascent adhesions and/or adhesions at the leading edge assemble and disassemble or mature into bigger FAs to sustain higher contractile forces which take place at higher ECM rigidity. To determine whether the turnover and growth of FAs in hMSC depends on the stiffness of the ECM, and to decipher the role of the dynamics and interactions of signaling scaffolding proteins in these processes, we monitored the diffusion and binding properties of FAK, paxillin, talin and vinculin within hMCS cells. Our studies based on different fluorescence microscopy approaches as FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching), F(C)CS (Fluorescence (Cross) Correlation Spectroscopy) and FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) by FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy), ail together revealed that that the residence time of these proteins within FA structures increases along with the substrate rigidity. This property is correlated with the dynamics and instability of the FA complex membership itself, as well as with the dynamical cell behavior, properties that are therefore regulated by the substrate rigidity. In addition, our data show the existence of intracellular multitiered molecular clutch at the FA scaffold, including several rigidity-dependent molecular bindings with different kinetics (meaning likely molecular linkage with different strength). Especially, we showed that monomers of talin and vinculin bind to the scaffold with several rigidity-dependent dissociation rates and interact between each other only when immobilized. The proportion of immobilized talin-vinculin interacting species (for wild type vinculin as well as constitutively active mutant) was weakly dependent on the ECM rigidity, emphasizing the role of proteins dynamics instead of proportion of immobilization in rigidity sensing mechanism. Interestingly, the stabilization of talin at the FA site by a constitutively active vinculin mutant is much stronger at weak rigidity than at high rigidity of ECM, revealing a high potency of signaling regulation at weak rigidity in this type of cells. Specifically, our study focused on the dynamics and organization of FAs, seen as mechanical sensors of ECM rigidity and thus likely suited to support the initial steps of rigidity-dependant hMSC differentiation processes

Ce travail donne pour la premiere fois les mesures d'un coefficient de diffusion dans un gel de chromatographie, parametre intervenant de facon cruciale dans la resolution des pics d'elution et permettant une meilleure comprehension de la diffusion des molecules dans le cytoplasme et le nucleoplasme de cellules vivantes