Dissertations / Theses on the topic 'Plantes – Immunologie'

Un extrait mycélien provenant de Phytophthora capsici induit une protection des cotylédons de piment vis-à-vis de ce pathogène. Un extraction par les solvants organiques suivie d'un fractionnement des composés liposolubles par chromatographie d'adsorption ont conduit à l'isolement d'une fraction phospholipidique conservant toute l'activité initiale. Cette fraction analysée par chromatograpie bidimensionnelle sur couche mince (HPTLC) dans plusieurs solvants, donne une tâche unique disticte des phospholipides témoins. L'étude structurale de ce composé aété réalisée par les méthodes chimiques, méthanolyse, hydrolyses acides totales, alcalines partielle, analyses qualitatives par chromatographie sur couche mince, analyses quantitatives colorimétriques et par chromatographie en phase gazeuse. L'analyse des acides gras a été effectuér par chromatographie en phase gazeurse des esters méthyliques, l'analyse du dérivé sphingoi͏̈de a été effectuée par chromatographie gazeuse du dérivé N-acétylé et O-triméthylsilylé. L'ensemble de nos résultats, confirmés par spectrométrie de masse, nous a permis d'identifier ce phospholipide à un sphingophospholipide à inositol de masse moléculaire 849 d. [. . . ]

Au cours de l’évolution, les plantes ont développé des mécanismes de défense sophistiqués contre les pathogènes. L’une des premières lignes de défense se base sur la reconnaissance par la plante de motifs moléculaires très conservés associés aux pathogènes (PAMP/MAMP). Cette reconnaissance active divers mécanismes de défense, en particulier le dépôt de callose au niveau de la zone infectée. Malgré l’abondance des interactions racine-microbes, la réponse aux MAMPs dans cette partie de la plante reste largement inexplorée. Nous avons développé un système de culture hydroponique qui nous a permis d’étudier cette réponse chez Arabidopsis thaliana en se basant sur l’étude de lignées promoteur:GUS ainsi que sur le dépôt de callose Nous avons trouvé que les racines répondent fortement aux MAMPs dans des régions bien spécifiques, en particulier dans la zone d’élongation. Cette réponse dépend de la voie de signalisation de l’éthylène, du facteur de transcription MYB51, du cytochrome P450 CYP81F2 ainsi que de la myrosinase PEN2. En outres, nous montrons que Pseudomonas syringae et Pseudomonas fluorescens sont capables de bloquer ce mécanisme de défense. En particulier, dans le cas de P. Syringae, cette suppression s’effectue grâce à la production de coronatine (COR). L’action de la COR est dépendante de l’E3 ligase COI1 et du facteur de transcription JIN1/MYC2. Un screen génétique m’a permis d’isoler de nouveaux mutants incapables de bloquer la réponse aux MAMPs, dans le but d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans la réponse à la COR. Enfin, ma thèse a porté sur l’étude du cytochrome P450 CYP76C2, fortement induit par les pathogènes. CYP76C2 est activé localement lors d’une infection par P. Syringae ou Botrytis cinerea ainsi que lors des mécanismes de mort cellulaire. Je démontre que l'activation de CYP76C2 est partiellement dépendante de la voie de signalisation de l’acide salicylique et que ce gène est potentiellement impliqué dans le contrôle du stress oxydatif
Over the course of evolution, plants developed sophisticated defense mechanisms against bacterial and fungal pathogens. One of the first layers of plant defense is called PAMP triggered immunity (PTI) and is based on the recognition of conserved epitopes of pathogen-derived molecules called PAMPs/MAMPs (Pathogen/Microbe Associated Molecular Patterns). This recognition activates defense responses including the deposition of callose at the site of pathogen attack. Despite the fact that roots are the organs most subject to microbial interactions, MAMP signaling in roots remains largely unexplored. I developed an Arabidopsis thaliana seedling assay to study PTI in roots based on the detection of callose and the activation of promoter:GUS reporters of MAMP-responsive genes. I found that MAMPs trigger a strong response in roots dependent on ethylene signaling, the MYB51 transcription factor, the cytochrome P450 CYP81F2, and the PEN2 myrosinase, but independent of salicylic acid signaling. In addition, I show that the bacteria Pseudomonas syringae and Pseudomonas fluorescens suppress this response and that P. Syringae is doing so by producing the phytotoxi coronatine. I found that coronatine acts via the E3 ligase COI1 and the transcription factor JIN1/MYC2. I performed a forward genetic screen to isolate mutants impaired in COR-mediated suppression in an attempt to identify new players involved in COR signaling. In this thesis, I also present data concerning CYP76C2, a gene encoding a cytochrome P450 that is highly induced by MAMPs and pathogens in Arabidopsis leaves. I confirmed that CYP76C2 is activated during pathogen infection and various cell death elicited scenarios. Furthermore, I demonstrate that CYP76C2 is partially dependent on SA signaling and may be involved in controlling oxidative damage during infection

La défense de la plante est complexe et constamment mise à l'épreuve par les pathogènes. Les corps du réticulum endoplasmique, appelés aussi ER bodies, sont des organites issus du réticulum endoplasmique, riches en β-glucosidases, participant activement à cette défense chez les Brassicales. Les études menées sur cet organite ont été essentiellement conduites sur les parties aériennes et peu d'informations sont disponibles sur les ER bodies des racines. Dans cette thèse, nous avons tenté de remédier à ce point en étudiant, dans un premier temps, la distribution de ces organites au sein des tissus racinaires d'Arabidopsis thaliana et du radis, Raphanus sativus, en combinant des techniques de microscopie, de biochimie et de biologie moléculaire. Nous avons ainsi révélé leur très grande abondance dans tous les tissus périphériques de l'ensemble de la racine. Puis, nous avons souhaité évaluer l'implication de ces ER bodies dans la défense. Nous avons alors mis en évidence qu'un traitement au méthyl jasmonate (MeJA), une hormone impliquée dans la mise en place de réaction de défense, induisait une augmentation importante du nombre de ER bodies et la fusion de plusieurs ER bodies entre eux dans les tissus racinaires du radis ainsi qu'une augmentation de l'activité β-glucosidique d'une fraction enrichie en ER bodies. Cette fusion conduit à la formation de ER bodies en moyenne 3 fois plus longs que les ER bodies normaux. Puis nous avons étudié les régulations de 5 gènes impliqués dans la formation des ER bodies dans 4 zones de l'apex de la racine primaire d'Arabidopsis, disséquées au microdissecteur laser : la zone de la coiffe, la zone méristématique, la zone d'élongation et la zone de différenciation. Nous avons pu révéler que ces gènes sont finement contrôlés dans chaque zone. Cela fût observé en condition standard et après traitement au MeJA, traduisant une modulation de la production des ER bodies spécifique dans chaque zone de la racine, en lien avec les caractéristiques de ces zones. Ces ER bodies semblent donc être soumis à une régulation fine et jouent probablement le rôle crucial de réserves de défenses de la racine, prêts à libérer leur contenu à la moindre attaque
Plants are continuously challenged by pathogens. Endoplasmic reticulum (ER) bodies are particular organelles, containing β-glucosidases, that form from the ER and play a major role in defense of the Brassicales. So far, most of the studies were conducted on the ER bodies from the shoots and a few information is available on ER bodies of the roots. In the present thesis work, we have focused on root cells of two brassicacea species, namely Arabidopsis thaliana and Raphanus sativus by using microscopical, biochemical and molecular biology techniques. First, we have investigated the occurrence and distribution of ER bodies in various cell types and found them abundantly present in all peripheral tissues. We have also found that the morphology and number of ER bodies differ from one cell type to another. Second, we have investigated the role of these organelles in root defense by studying the response of ER bodies to methyl jasmonate (MeJA), a phytohormone involved in plant defense signaling. The data show that MeJA induces a marked increase in the number of ER bodies along with an increase in β-glucosidase activity. Remarkably, MeJA also induces fusion of several ER bodies together resulting on the formation of very long organelles reaching 3-4 times the size of the normal ones. Third, we have studied the expression of 5 genes involved in ER body formation in the different root zones treated with MeJA and isolated by Laser Assisted Microdissection technique. The isolated root regions are the root cap zone, the meristematic zone, the elongation zone and the differentiation zone. Our findings show that the expression of the genes is fine-tuned in the different zones, under MeJA treated and standard conditions. This suggests that the formation of ER bodies is specifically regulated in different root tissues possibly in relation with the functional properties of each cell type in root development and defense

Les plantes de grandes cultures, dont le lin fait partie, sont constamment confrontées à de nombreux pathogènes dont l’impact sur la production peut s’avérer dramatique, impliquant inéluctablement des intrants chimiques. Pour lutter contre ces microorganismes, les plantes utilisent l'immunité innée appelée M/PTI (Microbe/Pathogen-Associated Molecular Patterns Triggered Immunity). La perception des agents pathogènes se met en place lors de la reconnaissance des motifs conservés à la surface des micro-organismes (M/PAMPs), par des protéines membranaires de la cellule végétale appelées PRRs (Pattern Recognition Receptors). L’utilisation d’éliciteurs capables de mimer les M/PAMPs et d’améliorer la résistance des plantes lors d’un stress représente une méthode de lutte alternative à l’utilisation de pesticides. Ainsi, le criblage d’une chimiothèque de 1600 molécules a permis d’identifier cinq composés capables d’activer la mise en place des mécanismes de défense chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous avons testé la capacité de ces cinq potentiels stimulateurs de défense des plantes (SDP) à améliorer la résistance du lin face au champignon pathogène Fusarium oxysporum (Fo) f. Sp. Lini, responsable de la fusariose vasculaire. Les résultats ont révélé que parmi ces cinq, deux composés, un naturel holaphyllamine (HPA) et un synthétique M4, n’affectent ni la croissance des plantules de lin aux concentrations inférieures à 10 μM, ni le développement et la germination des spores de F. Oxysporum. Les analyses microscopiques ont montré que HPA et M4 à 1 μM sont capables d’induire un stress oxydatif et la production de dépôts de callose. Par ailleurs, des analyses transcriptomiques ont révélé que ces deux molécules induisaient l’expression de deux gènes de défense (Pathogenesis-Related) : PR-2 et PR-3 codant une β-(1,3)-glucanase et une endo-chitinase, respectivement pouvant être impliquées dans la dégradation de la paroi du champignon. Finalement, les plantes de lin prétraitées avec HPA ou M4 présentent une diminution dans l’intensité des symptômes foliaires de plus de 50 et 70 %, respectivement. L’ensemble de ces résultats montre que l’HPA et M4 sont des SDP car ils sont capables d’activer les mécanismes de défense du lin et d’améliorer sa résistance face à F. Oxysporum
Plants are surrounded by a diverse range of microorganisms that can cause serious crop losses and requires the use of pesticides. Flax is a major crop in Normandy and is regularly challenged by the pathogenic fungus Fusarium oxysporum (Fo) f. Sp. Lini. In order to protect themselves, plants use “innate immunity” called M/PTI (Microbe/Pathogen-Associated Molecular Patterns Triggered Immunity) as a first defense line against pathogens. Plants are able to perceive pathogens by the recognition of conserved motifs on the surface of the pathogens (M/PAMPs), by transmembrane protein receptors (PRRs, Pattern Recognition Receptors). The use of elicitors able to mimic M/PAMPs and activate plant defense may be an alternative for plant protection that could minimize the use of pesticides. Based on this, previous work was conducted by screening a chemical library of 1600 compounds and has allowed the identification of five compounds able to activate defense responses in Arabidopsis thaliana. During my PhD thesis, we tested those five compounds on their abilities to improve resistance of two commercially available flax varieties used for their fibers against F. Oxysporum, responsible of the vascular wilt. The data show that two of them, holaphyllamine (HPA) a natural compound and M4 a synthetic one, did not affect flax growth up to 10 μM. In addition, they did not have any negative effects on F. Oxysporum development and spores germination at the tested concentrations (up to 10 μM). Cell imaging analyses showed that HPA and M4 at 1 μM can induce oxidative burst as well as callose deposition in flax, a well-known marker of PAMP-elicited defense mechanisms. Furthermore, transcriptomic analyses showed that HPA and M4 induced changes in the expression patterns of two pathogenesisrelated (PR) genes (PR-2 and PR-3) coding for a β-(1,3)-glucanase and an endo-chitinase, respectively. These enzymes can degrade the fungal cell wall and stop its growth. Finally, flax plants pre-treated with HPA and M4 before infection with Fo f. Sp. Lini exhibited a decrease in the foliar disease symptoms by more than 50 % and 70 %, respectively. Together, these findings demonstrate that HPA and M4 are elicitors as they are able to activate defense responses in flax plants that lead to improving its resistance against Fo infection

La libération d’acides gras à partir de lipides membranaires est régulée en réponse à différents stress. Elle est catalysée par des enzymes appelées lipide acyl-hydrolases (LAH) dont le rôle supposé est d’être impliquées dans la résistance antimicrobienne et de fournir des précurseurs de dérivés d’acides gras, les oxylipines. L’exploration du génome de la plante Arabidopsis thaliana nous a permis de mettre en évidence plusieurs groupes structuraux de gènes codant pour des LAH putatives et de montrer que plusieurs membres sont induits en réponse à différents microbes. Nous avons donné la priorité à l’étude fonctionnelle des patatines. Cette famille comprend 9 gènes, dont deux (AtPLP2 et AtPLP7) sont induits dans les feuilles infectées. L’accumulation de AtPLP2 en réponse à Botrytis cinerea et Pseudomonas syringae est dépendante des signaux de défense, éthylène et acide jasmonique. L’expression d’une fusion AtPLP2-GFP et l’analyse des propriétés biochimiques indiquent que cette protéine est une LAH cytoplasmique. Des plantes transgéniques modifiées dans l’expression de AtPLP2 ont été testées pour leurs niveaux de résistance. De façon inattendue, AtPLP2 favorise la progression du champignon Botrytis et la susceptibilité vis-à-vis de bactéries avirulentes, alors que les plantes réprimées sont plus résistantes. Ces données indiquent que l’activité lipolytique dépendante de AtPLP2 est recrutée par certains pathogènes pour faciliter la colonisation de la plante hôte. AtPLP2 semble également potentialiser la mort cellulaire lors de l’infection par B. Cinerea et réduire la capacité de la réaction d’hypersensibilité à restreindre la multiplication de bactéries avirulentes. L’étude systématique des LAH chez Arabidopsis a permis d’identifier des candidats prometteurs pour une analyse fonctionnelle détaillée. Les outils générés, dont les mutants knock-out, seront au centre des études futures des phénomènes de mobilisation d’acides gras dans les mécanismes de défense des plantes
Membrane lipid catabolism is regulated in response to several stresses. Enzymes responsible for lipid hydrolysis are named lipid acyl hydrolases (LAH). An important role anticipated for such enzymes is to be involved in antimicrobial resistance and to provide precursors for the biosynthesis of oxylipins that are regulatory fatty acid derivatives. Exploration of the Arabidopsis thaliana genome has revealed the existence of numerous structural families of potential LAH genes, with members being upregulated in response to biotic stress. We have given priority to the functional study of Arabidopsis LAH related to patatin. This family comprises 9 members, two of which (AtPLP2 and AtPLP7) being strongly upregulated in leaves challenged with pathogens. AtPLP2 protein accumulation in response to the fungus Botrytis cinerea or Pseudomonas syringae bacteria is dependent on jasmonic acid and ethylene signaling. Expression of a AtPLP2-GFP fusion and biochemical analysis of recombinant AtPLP2 indicates that AtPLP2 encodes a cytoplasmic LAH. Transgenic plants with altered levels of AtPLP2 protein were generated and assayed for pathogen resistance. Unexpectedly, AtPLP2 expression increases B. Cinerea colonization and susceptibility to avirulent bacteria whereas silenced plants displayed enhanced resistance. Collectively, the data indicate that AtPLP2-encoded lipolytic activity is recruited by pathogens with different lifestyles to facilitate host colonization. Particularly, AtPLP2 potentiates plant cell death upon infection by B. Cinerea and reduces the efficiency of the hypersensitive response known to normally restrict avirulent bacteria multiplication. This global Arabidopsis LAH study opened some perspectives in identifying several candidates genes for detailed functional studies. Tools like numerous LAH knock-out mutants obtained will be the basis of our future work to decipher fatty acid mobilisation processes during plant defense responses

La réaction d’hypersensibilité (HR) est l’un des mécanismes de défense les plus efficaces dont dispose la plante pour lutter contre l’attaque par des agents pathogènes. Phénotypiquement, la HR correspond à la mort programmée des cellules percevant l’infection. Dans les cellules adjacentes, on observe une forte induction de réponses de défense. Cette zone correspond à la part vivante de la HR, que nous appelons résistance locale acquise ou LAR en références aux travaux de Ross au début des années 1960. HR et LAR participent ensembles au confinement de l’infection au site d’attaque. Alors que la HR est induite par des signaux exogènes issus de l’agent pathogène, la LAR est induite par des signaux endogènes libérés par les cellules en état de HR. Ainsi, les gènes inducteurs du phénomène LAR, dont aucun n’était connu, présentent un patron d’expression spécifique de la HR. Le premier objectif de ma thèse a été de mettre en œuvre une stratégie permettant de selectionner des gènes potentiellement impliqués dans l’induction du phénomène LAR. Un criblage par Differential Display Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction a permis de sélectionner 24 ESTs (expressed sequence tag), parmi 5000 à 10000 transcripts analysés, présentant une expression spécifique au cours de la HR induite par infiltration d’élicitine dans les feuilles de tabac. Le deuxième objectif de ma thèse a été de mettre en œuvre une analyse fonctionnelle de gain et de perte de fonction pour tester le rôle potentiel dans la mise en place du phénomène LAR de trois gènes parmi les vingt quatre issus du crible. J’ai pu montrer que, parmi les 3 gènes, l’extinction par Virus-Induced Gene Silencing du gène NtRING1, codant une E3 ligase putative à domaine RING, retarde la mise en place de la HR et l’induction de gènes de défense. Parmi les cinq gènes issus du crible et analysés fonctionnellement jusqu’à présent, NtRING1 et NtLRP1 semblent impliqués dans l’exécution de la HR
The hypersensitive response (HR) is one of the most efficient plant defense mechanisms against pathogens. Phenotypically, the HR corresponds to the lesions developing at the infection sites. In the narrow zone surrounding the cells undergoing the HR cell death, a strong activation of defense responses occurs contributing to a local, highly inhospitable environment for the invading pathogen. This latter phenomenon was called localized acquired resistance (LAR). It corresponds to the living component of the HR. Whereas the HR is induced by exogenous signals issuing from the pathogen, LAR is triggerred by endogenous signals issuing from the plant cells undergoing the HR. Consequently, the genes inducing LAR, whose none are known yet, should be characterized by a HR-specific expression profile. The first part of this work consisted in the set-up of a strategy aimed to isolated such latter genes. A screening by Differential Display Reverse Transcript Polymerase Chain Reaction allowed to isolate 24 ESTs (expressed sequence tag) with such an expression profile. A second part of the work consisted in the functional characterization, by loss- and gain-of-function experiements, of 3 genes issuing from that screen. Among the three genes, silencing by Virus-Induced Gene Silencing of NtRING1, encoding a putative E3 ligase with a RING-finger motive delays the HR in tobacco induced by ß-megaspemin, a well as the expression of different defense-related genes. Among the 5 genes issuing from the screen and so far analyzed at the fonctional level, NtRING1 and NtLRP1 appeared involved in the execution of the HR

En conditions de carence azotée, les légumineuses peuvent établir une symbiose avec des bactéries fixatrices d'azote du sol (rhizobia) dans un nouvel organe racinaire, la nodosité, où les rhizobia fixent l'azote atmosphérique pour la plante. Une symbiose efficace nécessite des densités spectaculaires de bactéries différenciées fixatrices d'azote dans les cellules symbiotiques des nodosités. Malgré une colonisation bactérienne massive, les cellules symbiotiques ne présentent pas de réactions de défense apparentes, ce qui indique que l'état d'immunité du nodule est finement contrôlé pour permettre l'établissement et le maintien du partenaire symbiotique. Parmi les gènes de légumineuses identifiés impliqués dans ce processus, MtSymbiotic CYSTEINE-RICH RECEPTOR-LIKE KINASE (MtSymCRK) contribue à la répression de l'immunité du nodule. MtSymCRK code un récepteur kinase riche en cystéines, non arginine-aspartate (non-RD), appartenant à la famille des récepteurs riches en cystéines impliqués dans l'immunité des plantes. MtSymCRK est spécifiquement exprimé dans les cellules infectées des nodosités après l'internalisation des rhizobia et supprime les réactions de défense. Cependant, la voie de signalisation par laquelle MtSymCRK module l'immunité dans la nodosité pendant la symbiose n'est pas connue. Le projet de thèse a pour objectif d'étudier comment l'immunité des plantes est contrôlée dans les nodosités symbiotiques en décryptant les partenaires protéiques en aval de MtSymCRK impliqués dans la voie de signalisation lors d'une infection chronique chez Medicago littoralis. Nous avons identifié un partenaire interagissant avec MtSymCRK par une approche originale combinant un crible double hybride à haut débit en levure (Y2H) d'une banque d'ORFs d'Arabidopsis thaliana (A. thaliana) à de la génétique translationnelle vers Medicago truncatula (M. truncatula). Parmi les sept protéines identifiées chez A. thaliana interagissant avec le domaine kinase de MtSymCRK, AtGRF8 (GENERAL REGULATORY FACTOR 8) appartenant à la famille des 14-3-3, a été sélectionné comme étant le candidat le plus prometteur. Nous avons recherché l'homologue le plus proche chez M. truncatula, à savoir MtGRF8, et confirmé l'interaction entre le domaine kinase de MtSymCRK et MtGRF8.Afin de déterminer le rôle de MtGRF8 dans la symbiose, nous avons caractérisé Mtgrf8, un mutant d'insertion Tnt1 de Medicago littoralis. Nous avons montré que Mtgrf8 présente un dysfonctionnement symbiotique caractérisé par des réponses de défense et de sénescence qui compromettent la survie intracellulaire des rhizobia dans les nodosités. Enfin, basé sur l'hypothèse que certaines 14-3-3 et MtSymCRK régulent l'immunité et la production d'éthylène, nous avons également initié la recherche de protéines interagissant avec MtGRF8 par une approche Y2H.Dans son ensemble, ce travail contribue à déchiffrer la voie de signalisation de MtSymCRK au cours de l'infection chronique
In nitrogen-deficient conditions, legumes can establish a symbiosis with soil nitrogen-fixing bacteria (rhizobia) inside a new root organ, the nodule, where the rhizobia fix atmospheric nitrogen for the plant. Efficient symbiosis requires symbiotic nodule cells that host spectacular densities of nitrogen-fixing differentiated bacteria. Despite massive bacterial colonization, the symbiotic cells do not show apparent defense reactions, indicating that the nodule immune status is tightly controlled to allow the establishment and maintenance of the symbiotic partner. Among the identified legume genes involved in this process, MtSymbiotic CYSTEINE-RICH RECEPTOR-LIKE KINASE (MtSymCRK) contributes to the repression of the nodule immunity. MtSymCRK encodes a non-arginine-aspartate (non-RD) cysteine-rich receptor-like kinase belonging to the cysteine-rich kinase family of receptors involved in plant immunity. MtSymCRK is specifically expressed in nodule-infected cells after rhizobia internalization and prevents defense reactions. However, the signaling pathway by which MtSymCRK modulates the nodule immune response during symbiosis is not known. The PhD project aims to address how plant immunity is controlled in symbiotic nodules by deciphering the downstream MtSymCRK protein partners involved in the signaling pathway during chronic infection in Medicago littoralis. We identified an interacting partner of MtSymCRK using an original approach combining a high-throughput Yeast Two-Hybrid (Y2H) screen of an Arabidopsis thaliana (A. thaliana) open reading frames (ORFs) library and translational genetics towards Medicago truncatula (M. truncatula). Among seven A. thaliana identified proteins interacting with the kinase domain of MtSymCRK, AtGRF8 (GENERAL REGULATORY FACTOR 8) belonging to the 14-3-3 protein family has been selected as the most promising candidate. We searched for the closest homolog in M. truncatula, namely MtGRF8, and confirmed the interaction between the kinase domain of MtSymCRK and MtGRF8.To determine the role of MtGRF8 during symbiosis, we characterized Mtgrf8, a Medicago littoralis Tnt1 insertion mutant line. We showed that Mtgrf8 exhibits a symbiotic dysfunctioning characterized by defense and senescence responses that compromises the intracellular survival of the rhizobia in nodules. Finally, based on the hypothesis that some 14-3-3 and MtSymCRK regulate immunity and ethylene production. we also initiated the search for MtGRF8-interacting proteins by using a Y2H assay. Taken together, this work contributes to decipher the MtSymCRK signalling pathway during chronic infection

Arabidopsis thaliana perçoit au travers de “pathogen- or microbe- associated molecular patterns” (PAMPs/MAMPs) l’attaque d’organismes pathogènes. De nombreuses études ont révélé des éléments communs dans les réponses de défense induites par les éliciteurs, mais les similarités et différences entre les voies de signalisation qu’ils induisent restent encore mal connues. Les oligogalacturonates (OGs) sont des éliciteurs dérivant de la paroi des plantes qui induisent une large variété de réponse de défenses. Le transcriptome de plantules traitées par les OGs révèle une réponse transitoire de nombreux gènes, notamment une réponse transitoire et précoce de deux cytochromes P450 codant pour CYP81F2 et CYP82C3, Une analyse de l’expression de ces gènes dans divers mutants de défense suggère que leur réponse rapide à cet éliciteur est indépendante des voies de signalisation du salicylate (SA), du jasmonate (JA) ou de l’éthylène (Et). Ces gènes utilisés comme rapporteurs de la réponse au OGs, sont aussi induits par d’autre MAMPs, notamment les lipopolysaccharides, la flagelline (Flg22), et la chitine. Une analyse additionnelle du transcriptome a été menée avec des plantules traitées par deux éliciteurs très différents, les OGs, polysaccharides provenant de l’hôte, et Flg22, un peptide de synthèse dérivé de la flagelline bactérienne. Ces deux éliciteurs déclanchent des réponses similaires, rapides et transitoires. Elles sont caractérisées par l’activation précoce de voies de signalisation multiples, associées au JA en particulier. Cependant l’activation par Flg22 est plus forte, il induit un plus grand nombre de gènes. L’amplitude de l’activation est dose-dépendante dans les deux cas, mais, même aux plus fortes concentrations, les OGs n’induisent pas autant de gènes que Flg22. De plus, une activation des processus de sénescence, des voies de sécrétion SA-dépendante et de l’expression la protéine PR1 ne sont observés qu’en réponse à Flg22. CYP81F2 participe à la réponse induite précoce aux eliciteurs (OGs and Flg22). Son expression est indépendante de SA, de JA et de l’éthylène. CYP81F2 semble coder pour une indole glucosinolate 4-hydroxylase requises pour la formation de callose en réponse à Flg22
Pathogen attacks are perceived in Arabidopsis thaliana through recognition of pathogen- or microbe- associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs). Although the study of various elicitors has revealed significant overlaps in defense response, the degrees of similarity/difference between MAMPs are not well defined. Oligogalacturonides (OGs), plant cell wall-derived elicitors, induce a wide range of defenses responses. Transcript profiling of Arabidopsis seedlings treated with OGs indicates that the response to OGs involves a transient response in the regulation of many genes. Among the genes, two cytochrome P450s, CYP81F2 and CYP82C3, are significantly induced shortly after OGs treatment. Monitoring the expression of these genes in a variety of defense-related mutants suggests that their rapid induction, mediated by OGs is independent of SA, JA, or Et signaling pathways. These reporter genes are also highly expressed in response to other MAMPs, including lipopolysaccharide (LPS), flagellin (Flg22), or chitin. Additional transcriptional analysis was carried out with OGs and pathogensynthesized flagellin (Flg22), two very different elicitors. Both triggered a fast and transient response that are similar. This response is characterized by activation of the early stages of multiple defense signaling pathways, particularly JA-associated processes. However, the response to Flg22 is stronger in the number of genes differentially expressed and the amplitude of change. The magnitude of genes induction was in both cases dose-dependent, but, even at very high concentrations, OGs did not induce as many genes as Flg22. Moreover, activation of senescence processes, SA-dependent secretory pathway genes, and PR1 expression was only observed with Flg22 elicitation. These results suggest a lower threshold for activation of early responses than for sustained late innate immune defenses. Induction of the Arabidopsis CYP81F2 gene is part of the early induced response to elicitors (OGs and Flg22). CYP81F2 gene expression is independent of the SA-, JAand Et-signaling pathways. CYP81F2 seems to catalyze the 4 methoxylation of indolic glucosinolates, which is required for callose formation in response to Flg22

Myxococcus xanthus, bactérie à gram négatif, secrète dans le milieu de culture une activité anticoagulante de faible masse moléculaire, thermostable. Cette production n’est pas régulée par les gènes qui contrôlent la sécrétion des autres composés exocellulaires comme les protéines et les polysaccharides. L’activité anticoagulante est purifiée par chromatographie de pseudo affinité sur hystidil-sépharose 4B et apparaît comme étant hétérogène par analyse électrophorétique. Par une approche immunologique, à l’aide d’anticorps polyclonaux, il est montré que différentes fractions cellulaires réagissent avec l’antisérum, en particulier avec la fraction membranaire. En outre il est démontré que les fractions purifiées de l’activité anticoagulante, comportent une composante lipopolysaccharide
Myxococcus xanthus, a gram negative bacterium, secretes in culture media a thermostable low-molecular-weight blood anticoagulant activity during vegetative growth. Other strains of myxobacteria also produce a thermostable blood anticoagulant activity. This production is not co-regulated by genes that control secretion of other extracellular components such as proteins and polysaccharides. The blood anticoagulant activity is purified by pseudoaffinity chromatography on histidyl-sepharose 4B, and appeared heterogeneous by electrophoretic analysis. By an immunological approach, with polyclonal antibodies it was demonstrated that different cellular fractions, in particular membranous fraction, react with antiserum. In addition it was shown that purified fractions of blood anticoagulant activity contain a part of lipopolysaccharide

Les plantes induisent des réponses de défense après la perception de pathogènes. Des protéines appelées mitogen-activated protein kinases (MAPKS) sont impliquées dans le réseau complexe de signalisation établi pendant cette défense. Cependant, la connaissance actuelle de leur fonction est encore limitée. L'objectif de ma thèse était de contribuer à une meilleure compréhension de leur rôle et régulation pendant la défense. Premièrement, j'ai participé au décryptage des contributions spécifiques et coopératives de trois MAPKS impliquées dans l'immunité, à savoir MPK3, MPK4 et MPK6. Nous avons montré que ces MAPKS sont d'importants régulateurs de la reprogrammation transcriptionnelle induite pendant la défense. Deuxièmement, nous avons réalisé des approches de phosphoprotéomique et nous avons développé un protocole permettant d'enrichir des protéines associés à la chromatine, ce qui a permis d'identifier de nouveaux phosphosites ainsi que des protéines différemment phosphorylées pendant la défense, notamment de probables substrats des MAPKS. Troisièmement, nous avons identifiés plusieurs dizaines de protéines interagissant potentiellement avec le module MEKKI-MKK2-MPK4. Globalement, ce travail a révélé de nouvelles fonctions des MAPKS dans l'immunité des plantes. Ce travail a aussi permis d'identifier de nouveaux substrats potentiels des MAPKS et suggère que le module MEKK1-MKK2-MPK4 est soumis à une régulation hautement complexe via de multiples interacteurs proétiques et PTMS
Plants induce defense responses after perception of invading pathogens. Proteins called mitogen-activated protein kinases (MAPKS) are implicated in the complex signaling network occuring in plant immunity. However, the current knowledge of their function is still limited. The objective of my PHD was to contribute to a better understanding of their role and regulation in plant defense. First, i was involved in the deciphering of the specific and cooperative contributions of three MAPKS involved in plant immunity, namely MPK3, MPK4 and MPK6. We charcacterized several hallmarks of defense in WT and MAPK mutant plants. We showed notably that immune MAPKS are important regulators of the transcriptional reprogramming occuring during defense. Second, we applied phosphoproteomic approaches and we developed a protocol to enrich for chromatin-associated proteins which allowed identifying new phosphosites as well as proteins differentially phosphorylated during defense, notably some probable MAPKS substrates. Third, we identified several tens proteins potentially interacting with the immune MEKK1-MKK2-MPK4 module via the purification of protein complexes in vivo. Fourth, we identified diverse post-translational modification (PTMS) on each component of the MEKK1-MKK2-MPK4 module. Overall, this work revealed new functions for MAPKS in plant immunity. This work also provided new candidate MAPK substrates and suggests that the MEKK1-MKK2-MPK4 module is subjected to a highly complex regulation via multiple interacting proteins and PTMS

Les bactéries phytopathogènes injectent des facteurs de virulence (appelés effecteurs) dans leurs cellules hôtes pour interférer avec de nombreuses voies de signalisation immunitaires. La bactérie Gram négative Ralstonia solanacearum est l'agent causal du flétrissement bactérien. Parmi ses nombreux effecteurs de type III figure PopP2 dont les fonctions de virulence et d'avirulence ont été largement étudiées précédemment. PopP2 cible les facteurs de transcription de défense WRKY et les acétyles pour inhiber la résistance basale (PTI). Au cours de ce travail, nous montrons que la phosphorylation de PopP2 in planta au niveau de trois motifs SP nécessite la présence d'un domaine de type " MAPK-docking domain " situé dans son extrémité N-terminale. Bien que la phosphorylation de PopP2 n'affecte pas sa reconnaissance chez Arabidopsis par le complexe d'immuno-récepteurs RPS4/RRS1-R, ses fonctions de virulence dépendent strictement de cette modification. De façon surprenante, les phosphomutants PopP2, incapables d'être phosphorylés in planta, ont un comportement de protéine avirulente chez un grand nombre d'accessions, indépendamment de la paire RPS4/RRS1-R. Par le biais de différentes approches biochimiques et de microscopie confocale, nous montrons que PopP2 est un substrat de différentes MAPKs associées à la réponse immunitaire et notamment d'AtMPK3 avec qui l'effecteur interagit physiquement au sein du noyau. De façon intéressante, l'activation des activités des MAPKs au cours de la PTI coïncide avec la stimulation du niveau de phosphorylation du PopP2. Une analyse RNA-seq indique que la phosphorylation de PopP2 participe à la dérégulation de nombreux gènes liés aux réponses de défense. Des hypothèses concernant la façon dont le niveau de phosphorylation de PopP2 modulerait ses activités in planta sont présentées. Globalement, ce travail révèle une stratégie de virulence utilisée par un effecteur bactérien qui exploite les MAPKs associées à l'immunité pour (i) potentialiser ses fonctions de virulence et (ii) limiter sa détection chez l'hôte
Microbial pathogens infect host cells by delivering virulence factors (effectors) that interfere with defense. The Gram-negative Ralstonia solanacearum is the causal agent of bacterial wilt. The well-characterized PopP2 effector form R. solanacearum binds to and acetylate WRKY defensive transcription factors to dampen basal defense responses. In this work, we show that PopP2 phosphorylation on three SP motifs involves a MAPK-docking like domain located in its N-terminus. Although PopP2 phosphorylation does not affect its avirulence activity in Arabidopsis expressing the RPS4/RRS1-R immune receptor complex, its virulence functions strictly depend on this modification. Through different biochemical and confocal microscopy approaches, we show that PopP2 is a substrate of different MAPKs associated with the immune response and in particular, AtMPK3 with which the effector physically interacts in the plant nucleus. Interestingly, activation of MAPK activities during establishment of PTI coincides with the stimulation of the phosphorylation level of PopP2. An RNA-seq analysis indicates that the phosphorylation of PopP2 contributes to the deregulation of many genes related to defense responses. Hypotheses about how PopP2's phosphorylation level would modulate its activities in planta are presented. Overall, this work reveals a virulence strategy used by a bacterial effector that exploits MAPKs associated with immunity to (i) potentiate its virulence functions and (ii) limit its detection in the host

L'azote est un élément essentiel au développement des êtres vivants. Bien qu'il soit présent en grande quantité dans l'air, sous la forme de diazote, il n'est pas directement assimilable par la plupart des êtres vivants. Les légumineuses, par exemple, n'ont pas la capacité de l'assimiler sous cette forme. Cependant, dans un environnement carencé en azote, les plantes sont capables d'interagir avec des bactéries du sol, les rhizobia, qui sont des microorganismes fixateur d'azote atmosphérique grâce à un complexe enzymatique, la nitrogénase. En effet, ces bactéries vont réduire le diazote en ammonium, qui est assimilable par la plante. Les plantes hébergent ces bactéries dans des organes particuliers au niveau de leurs racines, les nodosités, où elles vont leurs fournir des nutriments. La plante tolère au sein de ses propres cellules une quantité importante d'organismes étrangers, environ un milliard par nodosité. La colonisation bactérienne massive des nodosités est permise grâce à la suppression des réponses immunes de la plante. Les racines sont en contact avec l'abondante flore microbienne du sol, ce qui soulève la question des conséquences liées à la potentielle vulnérabilité des organes symbiotiques ainsi que les plantes nodulées. L'objectif du projet de thèse était d'évaluer la vulnérabilité des organes symbiotiques. Pour cela, nous avons mis en place deux systèmes tripartites impliquant la légumineuse-modèle, Medicago truncatula, son symbionte, Sinorhizobium medicae et séparément deux microorganismes phytopathogènes, une bactérie Ralstonia solancearum et un champignon Sclerotinia sclerotiorum. Nous avons aussi caractérisé les réponses des nodosités face à ces deux pathogènes et cela en prenant les racines comme référence. Enfin, nous avons estimé l'influence de la nodulation et de la fixation d'azote sur la vulnérabilité des plantes face à l'agent pathogène bactérien. Les travaux effectués durant les trois ans de thèse indiquent que les nodosités sont des sites d'infection pour les agents pathogènes et qu'elles sont capables de répondre à la présence de pathogènes, néanmoins de manière différente et plus faiblement que les racines. Les résultats obtenus en utilisant l'un de nos systèmes tripartites suggèrent que la nodulation et la fixation d'azote peuvent conférer une plus grande sensibilité face aux agents pathogènes
Nitrogen is essential element for the development of all living beings. Although it is found in large quantity in the air, in the form of dinitrogen, it is not directly assimilable by most organisms. For example, plants are not able to assimilate this form. However, in a nitrogen deficient environment, legumes are able to interact with soil borne bacteria, rhizobia, which fix nitrogen thanks to an enzymatic complex, the nitrogenase. Indeed, bacteria reduce dinitrogen in ammonium; plants can assimilate this form. Plants host these bacteria in particular organs at the root level, the nodules, where they provide nutrients to bacteria. Plant tolerates in its own cells a tremendous quantity of foreign organisms, estimated to one billion of rhizobia per nodule. The massive bacterial colonization of nodules is allowed thanks to the repression of plant immunity. Roots are in contact with the abundant soil microbiota, which raises the question of the potential vulnerability of the symbiotic organs and nodulated plants. The phD project aimed to evaluate the nodules vulnerability. To achieve this, we set up two tripartite systems involving the model legume, Medicago truncatula, its symbiont, Sinorhizobium medicae and separately two phytopathogenic microorganisms, a bacterium, Ralstonia solancearum and the fungus, Sclerotinia sclerotiorum. We also characterized nodules responses to both pathogens using roots as reference. Finally, we estimated the influence of nodulation and nitrogen fixation on the plant vulnerability to pathogens. Work performed during these three years indicates that nodules are infection sites for pathogens. Those nodules are able to perceive the pathogen however, their response is different and less intense than that of roots. Results obtained with one of our tripartite system suggest that nodulation and nitrogen fixation give a greater sensitivity to pathogens

La réponse immunitaire des plantes dépend entièrement du système immunitaire inné. La perception extracellulaire de motifs moléculaires conservés associés aux pathogènes/microbes (P/MAMP) par des récepteurs de reconnaissance de motifs moléculaires (PRR) induit un type de réponse immunitaire dénommé PTI (pattern-triggered immunity). Certains pathogènes interceptent cette réponse en injectant, dans les cellules hôtes, des protéines appelées effecteurs, qui peuvent être détectés par des récepteurs immunitaires intracellulaires de la famille des NLR (nucleotide-binding domain leucine-rich repeat containing). En cas de détection, les NLRs induisent une réponse immunitaire rapide, appelée ETI (effector-triggered immunity), souvent associée à la mort des cellules hôtes. Un des NLRs présents chez l’orge, MLA, confère une ETI protectrice contre Blumeria graminis f. sp. hordei. Bien que MLA n’ait d’homologues qu’au sein de la famille monocotylédone des Triticeae, MLA est fonctionnel dans une lignée transgénique chez l’espèce dicotylédone A. thaliana. Ceci indique que le mécanisme de résistance a été conservé chez les plantes dicotylédones et monocotylédones. Chez la plante dicotylédone Nicotiana benthamiana, l’expression transitoire du domaine coiled-coil (MLACC) qui correspond aux 160 premiers acides aminés en N-terminus de MLA, suffit à induire la mort cellulaire. MLA pourrait ainsi initier un mécanisme de signalisation conservé, via son domaine MLACC. Le but de cette thèse a été de décrire le(s) mécanisme(s) de signalisation en aval de MLACC dans des lignées transgéniques d’A. thaliana. L’expression conditionnelle de MLACC induit une réponse similaire à la réponse immunitaire, et caractérisée par l’initiation d’une reprogrammation transcriptionnelle massive à ~2 h post-induction (hpi) suivie par la mort des cellules à ~4 hpi. Cette réponse est aussi induite par MLACC chez une lignée transgénique d’A. thaliana qui est simultanément dépourvue de trois composants (PEN2, PAD4 et SAG101) et des trois principales phytohormones (éthylène, acide jasmonique et acide salicylique) impliqués dans la régulation immunitaire. La comparaison des profils d’expression au cours du temps chez des plantes exprimant MLACC, avec ceux induits au cours de l’ETI et de la PTI chez A. thaliana, a révélé de larges similitudes lors de la réponse précoce. Ainsi, la signalisation initiée par MLACC, l’ETI et la PTI pourrait converger rapidement vers une machinerie de transcription commune qui active les gènes de la réponse immunitaire. De plus, ces données indiquent que le domaine MLACC de l’orge suffit à induire la réponse immunitaire normalement associée à l’ETI chez A. thaliana, et que l’activation des gènes de la réponse immunitaire peut se produire indépendamment de la PTI. La plupart (> 74.7%) des 562 gènes significativement induits à 2 hpi sont caractéristiques des gènes de type « immediate early response » puisqu’ils sont induits rapidement sans nécessiter la synthèse de novo de protéine, vraisemblablement par élimination d’un répresseur à courte durée de vie. Les régions 5’-UTR de ces gènes contiennent des motifs fortement enrichis associés à des facteurs de transcription sensibles au Ca2+, tels que le calmodulin-binding transcription activator 3 (CAMTA3) qui est rapidement dégradé au cours de l’ETI. Ceci pourrait expliquer l’inhibition totale de la réponse médiée par MLACC en présence de LaCl3, un inhibiteur des canaux calciques, inhibition qui a aussi été décrite par le passé concernant durant l’ETI et la PTI. J’ai effectué un crible génétique de mutants obtenus par mutagénèse chimique et ainsi identifié trois candidats suppresseurs de la réponse médiée par MLACC. La purification des complexes protéiques associés à MLACC, ainsi qu’un crible en double-hybride chez la levure ont permis d’identifier plusieurs candidats interagissant avec MLACC. Ces approches ont révélé de nouveaux candidats impliqués dans la signalisation médiée par MLACC
Plants rely entirely on innate immunity to fight pathogens. Extracellular perception of evolutionarily conserved pathogen/microbe-associated molecular patterns (P/MAMP) by membrane-resident pattern recognition receptors (PRRs) leads to pattern-triggered immunity (PTI). Host-adapted pathogens intercept PRR-mediated immunity by delivering effectors into host cells. These polymorphic effectors can be recognized by intracellular immune receptors of the nucleotide-binding domain leucine-rich repeat (NLR) family. Upon effector recognition, NLRs trigger a rapid immune response, termed effector-triggered immunity (ETI), which is typically associated with a host cell death response. In barley, the NLR MLA confers ETI against the pathogenic powdery mildew fungus, Blumeria graminis f sp hordei. Although MLA orthologues are found only in the Triticeae family of monocotyledonous plants, barley MLA is functional in transgenic dicotyledonous A. thaliana, indicating that the underlying disease resistance mechanism has been evolutionarily conserved for at least 150 Mya in monocot and dicot plants. In dicotyledonous Nicotiana benthamiana, transient gene expression of the coiled-coil (MLACC) domain, consisting of the N-terminal 160 amino acids of the receptor, was sufficient to activate a cell death response, raising the possibility that MLA initiates a conserved signalling mechanism through the MLACC domain. This thesis aimed at identifying signalling mechanism(s) acting downstream of the MLACC module in transgenic A. thaliana. Conditional MLACC expression triggered immune-related responses, characterized by a rapid onset of massive changes in gene expression at ~2 h post induction (hpi), followed by cell death at ~4 hpi. These MLACC–triggered responses are retained in A. thaliana plants simultaneously lacking the immune components PAD4, SAG101, PEN2, and all major defence phytohormones, i.e. ethylene, jasmonic acid, and salicylic acid. A comparison of time-resolved and genome-wide transcript profiles in MLACC-expressing plants with expression profiles induced during ETI and PTI by endogenous A. thaliana NLRs or PRRs revealed at early time points highly similar patterns. This suggests that early signalling mediated by MLACC, ETI, and PTI converges on a common transcriptional machinery that activates immune response genes, indicating that the barley MLACC domain is sufficient to stimulate an ETI response in A. thaliana. This also shows that activation of these immune response genes can occur independently of PTI. Most (> 74.7%) of the 562 genes that were significantly upregulated at 2 hpi in MLACC-expressing plants are immediate early response genes since their induction does not depend on de novo protein synthesis, suggesting that these genes are activated by the removal of short-lived repressors. In the 5’ regulatory regions of the early induced genes, I found a striking enrichment of cis-acting motifs that serve as binding sites for Ca2+-responsive transcription factors, including the calmodulin-binding transcription activator 3 (CAMTA3), which is known to be rapidly degraded during ETI. This might explain complete inhibition of MLACC–mediated responses by the Ca2+ channel inhibitor LaCl3, which was previously also reported for several NLR-mediated and P/MAMP-triggered responses. Using chemical mutagenesis, I identified three candidate suppressor mutants of MLACC-mediated responses. Affinity purification of MLACC complexes and a yeast two-hybrid screen identified several MLACC candidate interacting proteins. Together this has revealed novel candidate components engaged in MLACC signalling

La capacité des plantes à répondre aux stress de l'environnement, qu'ils soient de nature biotique ou abiotique, tient au fait qu'elles sont capables d'intégrer les signaux perçus grâce à des mécanismes de transduction du signal rapides et efficaces. La perception, le décodage et la mise en place de réponses biologiques adaptées font appel à de nombreux acteurs moléculaires tels que le calcium (Ca2+), second messager majeur de la signalisation Eucaryote. Parmi les "senseurs de calcium", la calmoduline (CaM) est la protéine la plus connue. Il existe des protéines apparentées à la CaM, spécifiques aux plantes, les Calmodulin-like (CMLs). Les CMLs sont très peu étudiées et la caractérisation de leurs rôles ouvre de larges perspectives sur l'identification des réseaux de régulation. L'objectif de ce travail de thèse a concerné un partenaire nucléaire d'une de ces CMLs, AtCML9, le Pseudo-Response Regulator 2 (PRR2), une protéine atypique contenant un domaine de liaison à l'ADN de type GARP et de fonction inconnue. Au cours de ce travail, des analyses moléculaires et biochimiques ont permis de caractériser le rôle de PRR2 dans l'immunité végétale, et en particulier en réponse à Pseudomonas syringae. L'étude de lignées perte ou gain de fonction a permis de mettre en évidence que PRR2 agit comme un régulateur positif des défenses lors de l'infection par la bactérie pathogène hémibiotrophe Pst DC3000 à travers la modulation de l'acide salicylique, de composés de défense tels que la protéine PR1 et la camalexine. Les analyses phénotypiques réalisées en réponse à différentes souches de Pseudomonas ont permis de préciser que PRR2 contribue à la mise en place des défenses à travers la signalisation dépendante de l'acide salicylique et de l'injection des effecteurs bactériens. Dans une deuxième partie, l'interaction entre PRR2 et des facteurs de transcription spécifiques aux plantes, les TCPs (Teosinte Branched 1, Cycloidea and PCF), a été étudié. Ces analyses ont montré une spécificité d'interaction entre PRR2 et TCP19 ou TCP20. Ces interactions stabilisent et relocalisent PRR2 dans des domaines nucléaires spécifiques. Ces données suggèrent une forte régulation post-traductionnelle de la protéine PRR2 qui pourrait s'avérer nécessaire à sa fonction biologique
Plants are able to perceive and respond to diverse biotic or abiotic environmental cues. This ability relies on efficient signalling pathways that are ultimately associated with genetic reprograming. These responses involve various actors of the signalling pathways such as calcium (Ca2+) transients which act as a second messenger in eukaryotic cells. The variations in intracellular Ca2+ concentrations are perceived by calcium sensors. The calmodulin (CaM) is an ubiquitous Ca2+ sensor well studied both in animal and plant cells. Comparatively, plants also possess CaM-related proteins called Calmodulin-like (CMLs) which are less studied and their role in plant physiology are emerging. The objective of this PhD work was to perform the functional analysis of PRR2 (Pseudo-Response Regulator 2), a plant specific transcription factor (with a GARP DNA binding domain) previously identified as an AtCML9-interacting partner. Using diverse genetic tools, we were able to study the role of PRR2 in plant immunity using the model plant Arabidopsis thaliana and a phytopathogenic bacteria, Pseudomonas syringae. Our study has shown that PRR2 acts as a positive regulator of plant defenses upon bacterial infection. We show that PRR2 could act by modulating the biosynthesis of the salicylic acid (SA), and the production of defense-associated compounds such as PR1 and camalexin. Collectively our data indicate that PRR2 acts as a positive regulator of plant defense associated with SA. In the aim to better understand how PRR2 could be involved in different physiological responses, we search for PRR2-interacting partners. We have more precisely worked on the interactions between PRR2 and the TCPs (Teosinte branched 1, Cycloidea and PCF) which are also plant specific transcriptions factors involved in different biological processes. We showed that PRR2 specifically interact with TCP19 or TCP20. As consequences, these interactions stabilize PRR2 and relocalize the complex in specific nuclear subdomains

Étude du dimorphisme de Fonsecaea pedrosoi, agent de la chromycose. Étude de la phase saprophytique du point de vue morphologique et physiologique par l'étude de la croissance, des protéines et des activités enzymatiques. Implication du dimorphisme dans le processus immunitaire. Caractérisation des antigènes des phases saprophytique et parasitaire.

Les légumineuses en milieu carencé en azote, établissent une relation symbiotique avec les bactéries du sol appelées rhizobia. Cette interaction conduit à la formation d’un nouvel organe racinaire, la nodosité. Au sein de celle-ci, les rhizobia se différencient en bactéroïdes fixant l’azote atmosphérique au profit de la plante. La colonisation massive et chronique des cellules symbiotiques de nodosités par les rhizobia ne déclenche aucune réaction de défense visible. Au laboratoire nous avons isolé deux mutants symbiotiques développant des réactions de défense dans les nodosités de Medicago truncatula indiquant qu’il existe un contrôle strict de l’immunité dans cet organe. L’objectif de cette thèse est de comprendre comment l’immunité symbiotique contrôle les voies de signalisation hormonales de défense afin d’héberger le partenaire symbiotique et de trouver de nouveaux outils pour mieux comprendre les mécanismes de défense. Pour cela, des approches moléculaires, pharmacologiques et génétiques sont utilisées. Les résultats obtenus dans cette thèse suggèrent que les mécanismes de défense adoptés par M. truncatula varient en fonction de l’écotype de la plante. L’écotype A17 exploite deux voies de résistance : la voie de la sénescence et la voie des réactions de défense. Cependant, l’écotype R108 n’exploite que la voie des réactions de défense. Ce travail suggère également que chez M. truncatula A17, la protéine SymCRK réprime la voie de signalisation de l’acide jasmonique qui conduit au déclenchement de la sénescence, tandis que la protéine DNF2 réprime principalement la voie de signalisation de l’acide salicylique qui conduit au déclenchement des réactions de défense et aussi réprime secondairement la voie acide jasmonique. Chez M. truncatula R108, les deux protéines SymCRK et DNF2 contrôlent les voies de signalisation de l’acide salicylique et de l’éthylène, avec DNF2 contrôlant préférentiellement la voie acide salicylique et SymCRK contrôlant préférentiellement la voie éthylène. Cette thèse suggère aussi l’implication des protéines R dans le contrôle de l’accommodation intracellulaire des rhizobia. Un gène CNL-5 semble être impliqué dans le contrôle de l’infection des cellules symbiotiques, et deux autres gènes CNL-4 et TNL-2 semblent être impliqués dans le contrôle de l’efficacité de l’infection. Finalement, cette thèse a permis d’isoler une souche bactérienne E. adhaerens, capable se comporter comme un symbiote ou comme un pathogène pour plusieurs espèces de Medicago
When grown under limited nitrogen resources, legumes establish a symbiotic relationship with soil bacteria called rhizobia. This interaction leads to the formation of a new root organ, the nodules. Within nodules, rhizobia differentiate into bacteroids and fix atmospheric nitrogen for the plant. The massive and chronic colonization of nodule symbiotic cells by the rhizobia does not trigger any visible defense reactions. In the laboratory, we previously isolated two symbiotic mutants developing defense reactions in Medicago truncatula nodules, indicating a strict control of the nodule immunity. The thesis project aimed first to understand the relationship between symbiotic genes and immunity mediated by defense hormones and second to find new tools to help to better understand nodules defense mechanisms. For this, molecular, pharmacological and genetic approaches were used. The results obtained in this thesis suggest that the defense mechanisms adopted by M. truncatula vary depending on the plant ecotypes. The A17 ecotype uses two resistance pathways; senescence and defense reactions. While, the R108 ecotype uses defense reactions pathway to fight against rhizobia. This work also suggests that in M. truncatula A17, the SymCRK protein represses jasmonic acid signalling. This work also suggests that in M. truncatula A17, the SymCRK protein represses the jasmonic acid signaling pathway involved in senescence triggering. In contrast, the DNF2 protein mainly represses the salicylic acid signaling pathway involved in defense reactions and also represses the JA pathway. In M. truncatula R108, the two proteins SymCRK and DNF2 control salicylic acid and ethylene signaling pathways involved in triggering defense reactions. DNF2 controls the salicylic acid pathway more than the ethylene signaling pathway, while, SymCRK controls more the ethylene pathway than the salicylic acid signaling pathway in nodules. This thesis also suggests the involvement of R proteins in the control of intracellular accommodation of rhizobia. The intracellular receptor CNL-5 appears to be involved in controlling the infection of symbiotic cells and the receptors CNL-4 and TNL-2 genes appear to be involved in controlling the infection efficacy of the symbiotic cells. Finally, this thesis allowed the identification of a new bacterial strain E. adhaerens, capable of behaving as a symbiont or as a pathogen for several Medicago species. This can be used as a tool to study the nodules defense induction and to understand the rhizobia intracellular accommodation in symbiotic cells

La protection intégrée, qui vise à réduire l’usage des pesticides, est un défi majeur pour l’agriculture du XXIème siècle. Le développement de nouvelles approches agronomiques qui concilient environnement et agriculture est une condition indispensable pour l’agriculture de demain. Dans ce contexte, l’utilisation d’éliciteurs capables de mimer une attaque pathogène et de promouvoir un état de résistance chez les plantes face à des maladies représente une alternative naturelle à la lutte chimique. Ces éliciteurs sont nommés les stimulateurs de défense des plantes (SDP). Ils peuvent provenir de différentes sources et être extraits à partir de macroalgues comme c’est le cas des SDP à base de polysaccharides d’algues tels que la laminarine utilisée pour stimuler l’immunité de plantes agronomiques. Toutefois, l’exploitation de ces ressources dans leur milieu naturel et les difficultés de production liées à leur cycle de développement constituent des freins à leur utilisation. La valorisation des microalgues comme source de SDP pourrait permettre de s’affranchir de ces contraintes. Cependant la recherche et de molécules SDP chez les microalgues est encore peu abordée. Au cours de ce travail, le potentiel d’une culture de microalgue, Phaeodactylum tricornutum, à induire des réactions de défense chez les plantes a été évalué. Un broyat cellulaire a été appliqué sur des plantules d’Arabidopsis thaliana. Le caractère éliciteur de ce broyat a été testé et caractérisé par des approches microscopiques, physiologiques et moléculaires. Les résultats ont montré que les plantes traitées présentaient des niveaux d’expression des gènes PR-1, PAD3, ACS6 et WRKY40 et un niveau de protection contre la bactérie Pseudomonas syringae DC3000 (Pst) plus élevés que les plantes non traitées. De plus, un effet bactéricide in vitro sur la bactérie Pst a été observé. Ces résultats offrent de nouvelles perspectives pour le développement de produits SDP d’origine naturelle capables de protéger les cultures
Integrated plant protection, which aims to reduce the use of pesticide, is a major challenge for the agriculture of the 21st century. The development and application of new agronomic approaches is a prerequisite for crop protection in a sustainable agriculture system. In this context, the use of elicitors capable of mimicking a pathogenic attack and promoting a plant resistance state against diseases is a natural alternative to the use of agro-chemicals. These elicitors are also called plant defense stimulators (PDS). These can be obtained from different sources including macroalgae as it the case for the polysaccharide-based PDS laminarin that is currently used for the protection of a number of crops. However, the exploitation of these natural resources and the difficulties of their production due to their development cycle do hamper their use at a large scale. One of the possibilities to overcome these difficulties is the use of microalgae as a source of PDS. But this possibility and the potential of microalgaederived PDS for crop protection are currently under investigated. In the present work, we have used a cell extract from the microalgae Phaeodactylum tricornutum and assessed its defense response-eliciting activities on Arabidopsis thaliana seedlings by using microscopic, physiological and molecular approaches. The results show that treated plants exhibit higher levels of expression of the PR-1, PAD3, ACS6 and WRKY40 genes and a higher level of protection against the pathogenic bacterium Pseudomonas syringae DC3000 (Pst) than nontreated plants. An In vitro antibacterial activity on the Pst bacteria was also observed. Our findings suggest that P. tricornutum cell extracts are able to activate plant immune responses and offer new perspectives for the development of novel plant defense stimulators

Malaria is the most prevalent vector-borne parasitic disease worldwide and a major cause of death from infections. There is a great need to develop a low cost vaccine for malaria to control transmission of infection and impact of disease, due to the emergence of anti-malarial resistance. Two leading blood stage malarial vaccine candidates are the apical membrane antigen-1 (AMA-1) and the merozoite surface protein-1 (MSP-1). The aim of this project is to express malarial antigens in tobacco plants via plastid transformation and deliver them by subcutaneous or oral gavage of minimally processed transplastomic tissue to evaluate their efficacy to elicit an immune response and protect against malarial infection. Transplastomic lines expressing the malarial antigens fused to the transmucosal carrier Cholera toxin B subunit (CTB-AMA-1) and CTB-MSP-1 were generated. CTB-AMA-1 and CTB-MSP-1 accumulated up to 9.5% and 2% of the total soluble protein, respectively. Chloroplast-derived CTB-AMA-1, CTB-MSP-1, or both antigens were administered to BALB/c mice orally or by subcutaneous injections. The immune response in the experimental animals compared to the control animals was found to be significant. Using an immunofluorescence assay (IFA) and immunoblot, anti-AMA-1 and anti-MSP-1 found in sera of immunized mice recognized the native parasite and the native parasite protein, respectively. Anti-malarial antibodies inhibited parasite invasion into erythrocytes by utilizing an in vitro parasite inhibition assay. Results of these investigations may lead to a cost-effective malarial vaccine, much needed in developing nations.
M.S.
Department of Molecular Biology and Microbiology
Burnett College of Biomedical Sciences
Molecular and Microbiology MS

Dans un contexte de réduction des intrants chimiques, l’utilisation des phytosanitaires naturels stimulant l’immunité végétale ouvre la porte vers une nouvelle approche de protection des plantes. Ces composés éliciteurs regroupés sous le terme de «Stimulateurs des Défenses naturelles des Plantes» (SDP) activent le système défensif de la plante la rendant plus résistante aux bio-agresseurs. Les SDP, de nature diverse, se présentent sous forme de composés uniques ou en mélange dans les extraits végétaux. Au cours de ma thèse, nous avons démontré l’activité SDP des extraits de marc de raisin. Les extraits issus de sous-produits de la vigne, marc de raisin rouge, marc de raisin blanc et pépins de raisin induisent diverses réactions de défense au sein de plantes modèles. Nous avons focalisé notre étude sur l’extrait de marc de raisin rouge (EMR) stimulant l’immunité chez le tabac. Infiltré sur feuilles, l’EMR induit la réponse de type HR caractérisée par l’apparition de lésions chlorotiques et accumulation de composés autofluorescents dans les tissus infiltrés. Ces réactions de défense locales ont été observées également chez l’arabette et la tomate. L’EMR déclenche les réponses LAR et SAR avec l’accumulation des transcrits des gènes de défense dans les feuilles de tabac et ce quelque soit son mode d’application (infiltration ou pulvérisation). Le mode d’action de l’EMR a été abordé sur cultures cellulaires de tabac BY-2. L’EMR induit une forte alcalinisation du milieu extracellulaire avec une mobilisation du calcium (Ca2+), l’expression des gènes de défense et la mort cellulaire. Une étude pharmacologique de la mort cellulaire suggère la mise en place de mort cellulaire programmée (PCD) dans les cellules de tabac. La caractérisation de la voie de signalisation activée par l’EMR a été étudiée avec le mutant NahG de tabac incapable d’accumuler l’acide salicylique (SA). Les réponses de défense (HR, LAR et SAR) sont faiblement induites par l’EMR chez le mutant nahG. L’EMR provoque une réponse de type HR fortement réduite avec une faible accumulation des composés autofluorescents et une diminution drastique de l’accumulation des transcrits des gènes PR suggérant l’intervention du SA dans l’induction des réactions de défense. Le degré de protection induit par l’EMR a été déterminé sur le pathosystème tabac/Phytophthora parasitica. Pulvérisé sur feuilles, l’EMR réduit de 45% les zones infectées par l’oomycète. Ce degré de protection semble être le résultat de l’activité antimicrobienne de l’EMR combinée à l’activité SDP. Aucune protection n’a été observée chez le mutant nahG confirmant l’implication de SA dans la résistance induite par l’EMR. Le fractionnement de l’EMR a permis de simplifier la formule active des extraits de raisin et d’identifier un mélange de molécules potentiellement capables d’induire l’activité SDP. Les composés actifs sont de nature polyphénolique et contiennent de la procyanidine B2 capable à elle seule d’induire la réponse de type HR et l’expression de l’antimicrobien PR1. Cependant, il semble que cette molécule agisse en association avec d’autres composés polyphénoliques pour stimuler le système défensif de la plante
In order to reduce chemical inputs, the use of natural phytosanitary products stimulating plant immunity are emerging approaches in phytoprotection. These elicitor compounds known as "Plant Defense Inducers" (PDI) activate the plant defense system and improve their resistance to pests attack. PDI are single molecule or mixture of compounds extracted from plant. In my thesis, we demonstrated the PDI activity of different grape marc extracts. The winery byproducts, red grape marc extract, white grape marc extract and grape seed extract all induced various defense reactions in several plant models. We focused our study on the red grape marc extract (GME) which stimulates the immunity system in tobacco plants. When infiltrated into tobacco leaves, GME induced HR-like response characterized by the appearance of chlorotic lesions and accumulation of autofluorescent compounds in infiltrated tissues. Similar local defense reactions have been observed in Arabidopsis thaliana and tomato. GME also triggered LAR and SAR responses and induced defense gene transcript accumulation in tobacco leaves after infiltration or spraying. The GME mode of action was studied using the suspension-cultured cells of tobacco BY-2. GME induced rapid alkalinization of extracellular medium with calcium mobilization, expression of defense genes and cell death. A pharmacological approach of this defensive phenomenon suggests the establishment of programmed cell death (PCD) in tobacco cells. The characterization of the signaling pathway activated by GME was studied using tobacco nahG mutant unable to accumulate salicylic acid (SA). Defense responses (HR, LAR and SAR) induced by GME were impaired in the nahG mutant. GME drastically reduced HR-like response symptoms and PR transcript accumulation. These data suggest the implication of SA in the GME-induced plant defense reactions. The GME-induced protection was evaluated in the model pathosystem of compatible interaction between Nicotiana tabacum and Phytophthora parasitica var. nicotianae (Ppn). GME could reduce by 45% the infected areas induced by the oomycete on tobacco leaves. This level of protection was the result of the combined antimicrobial and PDI actions of GME. GME had no protecting effect against Ppn on NahG leaves evidencing the involvement of SA in the GME-induced resistance. GME fractionation led to identification of a bioactive molecule mixture capable of inducing the PDI activity. The active compounds are polyphenolics and involve procyanidin B2 which is by itself able to induce the HR-like response and PR1 transcript accumulation. This compound should act in combination with other polyphenolic molecules to stimulate the full plant defense reactions

L'eutypiose est due au champignon Eutypa lata qui colonise le xylème. Le champignon induit des perturbations dans les flux hydriques de la plante mais émet également des toxines. La caractérisation de composés protéiques de haute masse moléculaire constitue l'objectif de ce travail développé selon deux axes: la mise au point d'un test immunologique de diagnostic et l'étude de l'implication éventuelle de ces composés dans le développement de la maladie. Les travaux ont permis d'obtenir des anticorps spécifiques pour développer une méthode de détection de l'infection par Eutypa lata par la technique des empreintes sur membrane et de détecter in-planta Eutypa lata par immunolocalisation. Des analyses physiologiques ont mis en évidence le caractère toxique des composés testés. Ils agissent sur de nombreux organites et dégradent les parois. Ces perturbations provoquent une baisse du potentiel énergétique de la cellule qui se manifeste par une inhibition de l'absorption des nutriments
Eutypa dieback is caused by Eutypa lata which colonises xylem by pruning wounds. The fungus triggers water fluxes modifications but toxins are also excreted and carried through the plant. Among these toxins, high molecular weight compounds of polypeptidic nature have been isolated. This work is focused on these proteins according to directions: development of an immunoassay diagnosis of Eutypa dieback and analysis of the involvement of these proteins in disease development. Specific antibodies were raised against theses proteins and used to reveal infection by the Dot-Blot method and detect in-situ Eutypa lata by immunolocalization. Physiological studies evidence a toxic effect of fungal proteins on plant cell leading to cell death by acting on various organelles and damaging plant cell wall. They act by modifications in ions fluxes, triggering a membrane depolarisation resulting in an impairment of energetic fueling in the cell, leading to an inhibition of nutriment absorption

Les réactions de défense végétales sont souvent associées au développement de la réponse hypersensible (HR), une forme de mort cellulaire programmée qui confine l'agent pathogène au niveau du site d'infection. La frontière nette de la HR suggère l'existence de mécanismes efficaces qui contrôlent la frontière entre mort cellulaire et survie. Le facteur de transcription d'Arabidopsis AtMYB30 régule positivement la HR et les réponses de défense de la plante en augmentant la synthèse des acides gras à très longue chaîne (VLCFA) après infection bactérienne. L'activité d’AtMYB30 est étroitement contrôlée à l'intérieur des cellules végétales par des interactions protéine-protéine et des modifications post-traductionnelles. Au cours de mes travaux de thèse, nous avons identifié une protéase de la famille des subtilases (AtSBT5.2) en tant que partenaire protéique d’AtMYB30. Chose intéressante, nous avons montré que le transcrit d’AtSBT5.2 est épissée de façon alternative, conduisant à la production de deux produits de gènes distincts codant soit pour une isoforme sécrétée [AtSBT5.2 (a)] soit une isoforme intracellulaire [AtSBT5.2 (b)]. L'interaction spécifique d’AtMYB30 avec AtSBT5.2(b), mais pas avec AtSBT5.2(a), conduit à une rétention d’AtMYB30 à l'extérieur du noyau au sein de petites vésicules intracellulaires. Des plantes d’Arabidopsis mutantes atsbt5.2, ne montrant ni expression d’AtSBT5.2(a) ni d’AtSBT5.2(b), présentent des réactions de défense et de HR accrues. Ce phénotype étant abolie dans un fond génétique mutant atmyb30, AtSBT5.2 est donc un régulateur négatif de la résistance aux maladies induites par AtMYB30. Fait important, la surexpression de l’isoforme AtSBT5.2(b), mais pas celle de l’isoforme AtSBT5.2(a), dans le fond mutant atsbt5.2 rétablit les phénotypes présentés par les plantes mutantes atsbt5.2, ce qui suggère qu’AtSBT5.2(b) réprime spécifiquement la réponse de défense induite par AtMYB30
Plants defence responses are often associated with the development of the so-called hypersensitive response (HR), a form of PCD that confines the pathogen to the infection site. The sharp boundary of the HR suggests the existence of efficient mechanisms that control cell death and survival. The Arabidopsis transcription factor AtMYB30 positively regulates plant defence and HR responses by enhancing the synthesis of sphingolipid-containing Very Long Chain Fatty Acids (VLCFA) after bacterial infection. The activity of AtMYB30 is tightly controlled inside plant cells through protein-protein interactions and post-translational modifications. During my PhD, we identified a protease of the subtilase family (AtSBT5.2) as a AtMYB30-interacting partner. Interestingly, we have shown that the AtSBT5.2 transcript is alternatively spliced, leading to the production of two distinct gene products that encode either a secreted [AtSBT5.2(a)] or an intracellular [AtSBT5.2(b)] protein. The specific interaction between AtMYB30 and AtSBT5.2(b), but not AtSBT5.2(a), leads to AtMYB30 specific retention outside of the nucleus in small intracellular vesicles. atsbt5.2 Arabidopsis mutant plants, in which both AtSBT5.2(a) and AtSBT5.2(b) expression was abolished, displayed enhanced HR and defence responses. The fact that this phenotype is abolished in an atmyb30 mutant background suggests that AtSBT5.2 is a negative regulator of AtMYB30-mediated disease resistance. Importantly, overexpression of the AtSBT5.2(b), but not the AtSBT5.2(a), isoform in the atsbt5.2 mutant background reverts the phenotypes displayed by atsbt5.2 mutant plants, suggesting that AtSBT5.2(b) specifically represses AtMYB30-mediated defence

L'ensemble des travaux rapportés concernent essentiellement les pseudomonas phytopathogènes, au travers des espèces p. Cichorii, p. Viridiflava, et p. Syringae, plus spécialement les pathovars aptata, helianthi, lacrymans, morsprunorum persicae, phaseolicola, pisi, porri, savastanoi, syringae, tabaci, et tomato. La notion de profil sérologique obtenu en immunodiffusion y est définie et présentée comme un mode de lecture de la structure des chaines latérales du lipopolysaccharide. Une vingtaine de sérogroupes sont mis en évidence à l'aide d'une batterie de 24 sérums différentiels parmi un ensemble de 1250 souches. Les résultats sérologiques confirment les liens sérologiques des nombreux pathovars de p. Syringae et avec l'espèce p. Viridiflava. Cependant, des groupes sérologiques sont clairement définis, qui sont spécifiques d'un ou d'un nombre réduit de pathovars. Le pathovar syringae est un cas à part. On y trouve à des fréquences variables, l'ensemble des profils définis pour les autres pathovars de p. Syringae. L'espèce p. Viridiflava offre un cas similaire. La méthode d'étude du profil d'assimilation en api150 est optimisée. La prise en compte des cinétiques de croissance et les traitements de ces données par des méthodes à fondement mathématique issues de l'analyse des données (distance euclidienne et agrégation selon la variance) permettent d'étudier précisément le profil d'assimilation des différents groupes de souches et de mettre en évidence précisément le profil d'assimilation des différents groupes de souches et de mettre en évidence des sous-groupes biochimiques résultant d'une analyse multidimensionnelle qui pourraient répondre à la notion de biovars. Les résultats biochimiques confirment l'isolement des espèces p. Cichorii, p. Viridiflava, et du pathovar syringae. La majorité des autres pathovars étudiés sont caractérisés par un profil d'assimilation spécifique. La synthèse des résultats montre que la plupart des pathovars étudiés de l'espèce p. Syringae (hormis pv syringae) tels qu'ils sont définis actuellement, se présentent comme des écotypes biochimiquement et sérologiquement caractérisés.

Le paludisme demeure la première préoccupation médicale de bien des pays africains dont la Guinée où la quasi-totalité de la population est exposée au risque d'infection avec une prévalence estimée à 15% chez les enfants de moins de 5 ans. En dehors de la médecine conventionnelle, la pharmacopée et la médecine traditionnelle guinéennes constituent des recours fréquents dans la gestion du paludisme par les familles. A cet égard, des enquêtes ethnobotaniques ont permis de recenser et de collecter de nombreuses plantes médicinales parmi lesquelles Terminalia albida, Desmodium velutinum et Rourea minor. Dans le cadre d'une validation des usages traditionnels, ces plantes ont été évaluées in vitro avec la souche chloroquino-résistante PfK1 et in vivo dans deux modèles murins à Plasmodium chabaudi chabaudi pour le paludisme simple, et à Plasmodium berghei ANKA pour le neuropaludisme. Les résultats obtenus ont permis de mettre en évidence le potentiel antipaludique de T.albida. En outre, la comparaison de deux extraits de T. albida issus de deux régions différentes de Guinée, a permis de mettre en évidence des efficacités in vitro et in vivo différentes selon la provenance de la plante. Afin de comprendre les mécanismes d'action de T. albida dans le modèle de neuropaludisme, les capacités anti-inflammatoires et anti-oxydantes de la plante ont été étudiées in vivo et in vitro dans des conditions inflammatoires. In vivo, l'administration de l'extrait de T.albida a permis de limiter le recrutement des lymphocytes T et l'expression des marqueurs pro-inflammatoires dans le cerveau des souris traitées. Ces propriétés ont été confirmées in vitro dans un modèle inflammatoire non palustre. In vitro, T.albida a également démontré une remarquable activité dose-dépendante de neutralisation des espèces réactives de l'oxygène. Ainsi, les propriétés anti-inflammatoires et anti-oxydantes de T.albida participent à la résolution du neuropaludisme dans le modèle d'infection à P. berghei ANKA. Des investigations phytochimiques ont permis d'identifier trente-huit composés dans l'écorce de la tige de T. albida. Parmi elles, plusieurs molécules déjà identifiées peuvent être responsables des différentes activités biologiques observées, notamment les tanins et les triterpénoïdes. Enfin, des investigations botaniques ont permis de fournir des éléments caractéristiques permettant de déterminer la provenance de T. albida et de mettre en évidence l'influence de l'écosystème sur la production des métabolites secondaires dans les espèces de Terminalia récoltées à différents endroits. Ces résultats confirment l'effet antipaludique de T. albida et valident son usage traditionnel. Cependant, des études complémentaires sont nécessaires pour identifier plus précisément les molécules actives. Les activités anti-inflammatoires et anti-oxydantes de T. albida démontrées dans ce travail présentent également un intérêt pour la prise en charge de nombreuses pathologies, autres que le paludisme
Malaria remains the primary medical concern in many African countries, including Guinea, where almost the entire population is at risk of infection with an estimated prevalence of 15% among children under 5 years of age. Apart from conventional medicine, Guinean pharmacopoeia and traditional medicine are frequent uses in the management of malaria by families. In this respect, previous ethnobotanical surveys have identified and collected many medicinal plants in Guinea, including Terminalia albida, Desmodium velutinum and Rourea minor. As part of a validation of traditional uses, these plants were evaluated in vitro with the chloroquine resistant strain PfK1 and in vivo in two murine models: Plasmodium chabaudi chabaudi for uncomplicated malaria, and Plasmodium berghei ANKA for cerebral malaria. The results obtained highlighted the antimalarial effect of T. albida. In addition, the comparison of two extracts of T. albida from two different regions of Guinea revealed different in vitro and in vivo efficacy depending on the origin of the plant. In order to understand the mechanisms of action of T. albida in the cerebral malaria model, the plant's anti-inflammatory and antioxidant capacities were studied in vivo and in vitro under inflammatory conditions. In vivo, the administration of T. albida extract limited T cell recruitment and expression of pro-inflammatory markers in the brains of treated mice. These properties were confirmed in vitro in a non-malarial inflammatory model. In vitro, T. albida also demonstrated a remarkable dose-dependent activity by neutralizing reactive oxygen species. Thus, the anti-inflammatory and antioxidant properties of T. albida contribute to the resolution of cerebral malaria in the P. berghei ANKA infection model. Phytochemical investigations have identified thirty-eight compounds in the bark of the stem of T. albida. Among them, several molecules already identified may be responsible for the different biological activities observed, including tannins and triterpenoids. Finally, botanical investigations provided characteristic elements to determine the origin of T. albida and to highlight the influence of the ecosystem on the production of secondary metabolites in Terminalia species collected at different locations. These results confirm the antimalarial effect of T. albida and validate its traditional use. However, further studies are needed to identify more precisely the active molecules. The anti-inflammatory and antioxidant activities of T. albida demonstrated in this work are also of interest for the management of many diseases, other than malaria

Las células dendríticas (DCs) están especializadas en la presentación de antígeno. Sin embargo, las DCs expuestas al virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) también son capaces de transmitir una potente infección citopática a los linfocitos T CD4+, un proceso que frecuentemente se ha relacionado con la capacidad que tiene el receptor DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) para unirse de forma específica a la glicoproteína de la envuelta viral.
La maduración de las DCs puede aumentar la eficiencia de transmisión del VIH a los linfocitos T CD4+ a través de la trans-infección. Nuestro objetivo en este trabajo ha sido comparar el efecto de la maduración en las células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) y en las células dendríticas mieloides derivadas de sangre durante el proceso de captura del VIH. Para analizar la captura y transmisión viral a las células diana competentes in vitro de un VIH pseudotipado con envuelta y el virus homólogo replicativo utilizamos las técnicas de detección de p24gag, actividad luciferasa y microscopía electrónica y confocal. Así, observamos que la maduración de las MDDCs o las DCs mieloides aumenta la captura activa del VIH de una forma independiente del receptor DC-SIGN o de la glicoproteína de la envuelta viral, incrementándose también el tiempo de retención del virus capturado. Además, verificamos que la mayor transmisión viral de las DCs maduras (mDCs) a los linfocitos T CD4+ es altamente dependiente de una captura viral activa, un proceso endocítico mediado a través de dominios de membrana enriquecidos en colesterol. Notablemente, mientras que las mDCs concentran el virus capturado en una única vesícula positiva para las tetraspaninas CD63 y CD81, las DCs inmaduras carecen de dichas estructuras, lo que sugiere un proceso de tráfico intracelular viral diferencial en cada tipo celular.
Los exosomas son vesículas celulares secretadas que pueden ser internalizadas por las DCs, contribuyendo a la activación específica de antígeno de los linfocitos naive T CD4+. En esta tesis demostramos que el VIH puede explotar esta ruta intrínseca a las mDCs que permite la diseminación de antígenos a través de los exosomas, permitiendo así la trans-infección de los linfocitos T CD4+. Tras la maduración de las DCs, la captura del VIH-1, las partículas pseudovirales VIH-1 Gag-eGFP (VLPs) y los exosomas aumenta significativamente, acumulándose dentro de un compartimento CD81+. La captura de estas partículas se inhibió preincubando las mDCs con las VLPs o los exosomas, lo que sugiere que la expresión de determinantes moleculares comunes en la superficie de las VLPs y los exosomas es necesaria para la internalización mediada por las mDCs. Así mismo, la captura mediada por las mDCs es insensible a un tratamiento proteolítico, pero puede bloquearse cuando los virus, las VLPs o los exosomas se producen en células tratadas con inhibidores de la biosíntesis de los esfingolípidos, que alteran la composición lipídica de las partículas que emergen.
Por último, las VLPs y los exosomas capturados por las mDCs se transmiten a los linfocitos T CD4+ de una forma independiente de la glicoproteína de la envuelta viral, resaltando la existencia de una nueva ruta de diseminación viral.
En general, estas observaciones ayudan a explicar la mayor capacidad de las mDCs para transmitir el VIH a los linfocitos T CD4+, un proceso que potencialmente puede contribuir a la diseminación viral en los nódulos linfáticos in vivo, donde la replicación viral tiene lugar de forma mayoritaria y hay una interacción continua entre las células T CD4+ susceptibles y las mDCs.
Dendritic cells (DCs) are specialized antigen-presenting cells. However, DCs exposed to human immunodeficiency virus (HIV) are also able to transmit a vigorous cytopathic infection to CD4+ T lymphocytes, a process that has been frequently related to the ability of DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin) to bind HIV-1 envelope glycoproteins. Maturation of DCs can increase the efficiency of HIV transmission through trans-infection. We aimed to comparatively study the effect of maturation in monocyte derived dendritic cells (MDDCs) and blood-derived myeloid DCs during HIV capture process. In vitro capture and transmission of envelope pseudotyped HIV-1 and its homologous replication competent virus to susceptible target cells was assessed by p24gag detection, luciferase activity, and both confocal and electron microscopy. Maturation of MDDCs or myeloid DCs enhanced active capture of HIV in a DC-SIGN and viral envelope glycoprotein independent manner, increasing the lifespan of trapped virus. Moreover, higher viral transmission of mature DCs (mDCs) to CD4+ T lymphocytes was highly dependent on active viral capture, a process mediated through cholesterol-enriched domains. Mature DCs concentrated captured virus in a single large vesicle staining for CD81 and CD63 tetraspanins, while immature DCs lacked these structures, suggesting different intracellular trafficking processes.
Exosomes are secreted cellular vesicles that can be internalized by DCs contributing to antigen specific naive CD4+ T lymphocyte activation. Here, we demonstrate that HIV can exploit this exosome antigen-dissemination pathway intrinsic to mDCs for mediating trans-infection of CD4+ T lymphocytes. Capture of HIV-1, HIV-1 Gag-eGFP viral like particles (VLPs) and exosomes by DCs was upregulated upon maturation, resulting in localization within a CD81+ compartment. Uptake of VLPs or exosomes could be inhibited by a challenge with either particle, suggesting that the expression of common determinant(s) on VLP or exosome surface is necessary for internalization by mDCs. Capture by mDCs was insensitive to proteolysis, but blocked when virus, VLPs, or exosomes were produced from cells treated with sphingolipid biosynthesis inhibitors that modulate the lipid composition of the budding particles. Finally, VLPs and exosomes captured by mDCs were transmitted to CD4+ T lymphocytes in an envelope glycoprotein-independent manner, underscoring a new potential viral dissemination pathway.
Overall, these observations help explaining the greater ability of mDCs transferring HIV to CD4+ T lymphocytes, a process that can potentially contribute to the viral dissemination at lymph nodes in vivo, where viral replication takes place and there is a continuous interaction between susceptible T-cells and mDCs.

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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
Os óleos essenciais (OEs) de plantas são compostos estudados como aditivo alimentar na produção animal há alguns anos, sendo descritos por diversos autores como promotores de crescimento, imunoestimulantes e antimicrobianos. No entanto, os efeitos de sua adição na dieta de organismos aquáticos ainda são pouco conhecidos. No presente estudo, diferentes estratégias de suplementação com diferentes OEs foram testadas. No primeiro estudo, os OEs de Mentha piperita e Melaleuca alternifolia foram incorporados à dieta para tilapia-do-Nilo Oreochromis niloticus por um longo período (2 meses), e os seus efeitos sobre a saúde (parâmetros hematológicos, bioquímicos e imunológicos) e sobre o intestino (morfologia e morfometria) foram avaliados. Em um segundo momento, M. piperita, M. alternifolia, Citrus aurantium, Cymbopogon nardus, Ocimum basilicum e Thymus vulgaris foram testados in vitro contra isolados intestinais (Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus e Edwardsiella tarda) da tilápia-do-Nilo para seleção daquele com maior capacidade de modular a microbiota dos peixes. O OE de Thymus vulgaris foi aquele que apresentou a maior atividade contra as bactérias testadas. Em um estudo final, o OE de Thymus vulgaris foi incorporado à dieta e fornecido por 15 dias à tilápia-do-Nilo e o efeito sobre a saúde, intestino, e também sobre a população de bactérias do gênero Bacillus no intestino foi avaliado. O primeiro experimento demonstrou que a M. piperita e a M. alternifolia foram capazes de imunoestimular componentes da resposta humoral dos peixes (ativando o sistema complemento) e a M. alternifolia ainda foi capaz de alterar a morfologia intestinal (ocasionando aumento de suas vilosidades). O OE de T. vulgaris apresentou maior atividade antibacteriana quando comparado aos outros cinco OEs testados in vitro, e quando adicionado à dieta foi capaz de imunoestimular componentes da resposta celular dos peixes (incrementando o número de leucócitos e linfócitos). Além disso, apesar de sua forte atividade antibacteriana, não foi capaz de alterar a população de bactérias benéficas do gênero Bacillus presentes no intestino. Em ambos experimentos in vivo as dietas suplementadas com OE não revelaram efeitos tóxicos aos peixes nas condições testadas. Baseado na revisão de literatura e nos resultados obtidos, conclui-se que, as suplementações com OEs foram seguras, apresentaram efeito imunoestimulante em diferentes componentes da resposta imune, puderam alterar em alguns casos a morfologia intestinal e parecem ter pouco impacto sobre a microbiota dos peixes.
Essential oils (EOs) of plants are compounds studied as food additive in animal production a few years ago. They have already been described by several authors, as growth promoter, immunostimulant and antimicrobial. However, the effects of its addition on the diet of aquatic organisms are still poorly understood. In the present study, different supplementation strategies with different EOs were tested. In the first study, the EOs of Mentha piperita and Melaleuca alternifolia were supplied for a long period (2 months) in the diet of Nile tilapia Oreochromis niloticus, and aspects of health (hematological, biochemical and immunological parameters) and intestine (morphology and morphometry) were evaluated. In a second moment, M. piperita, M. alternifolia, Citrus aurantium, Cymbopogon nardus, Ocimum basilicum and Thymus vulgaris were tested in vitro against the intestinal isolates (Aeromonas hydrophila, Staphylococcus aureus and Edwardsiella tarda) from Nile tilapia to select the one with the greatest capacity to modulate the microbiota of fish. Thymus vulgaris EO was the one that presented the highest activity against the bacteria tested. In a final study, the Thymus vulgaris EO was provided for 15 days in the diet of Nile tilapia where its effects on the health, intestine and on the population of bacteria of the genus Bacillus were evaluated. In the first experiment, it was shown that M. piperita and M. alternifolia were able to immunostimulate components of fish humoral response (activating the complement system) and M. alternifolia was still able to alter intestinal morphology (increasing their villi). The T. vulgaris EO presented higher antibacterial activity when compared to five other EOs, and when added to the diet it was able to immunostimulate components of the cellular response of fish (increasing the number of leukocytes and lymphocytes). In addition, despite its strong antibacterial activity, it was not able to alter the population of beneficial bacteria of the genus Bacillus present in the intestine. In both in vivo experiments, diets supplemented with EO showed no toxic effects on fish under the conditions tested. In conclusion, supplementation with EOs was safe, showed an immunostimulating effect on different components of the immune response, may in some cases alter the intestinal morphology and appear to have little impact on the fish microbiota.
FAPESP: 2014/14039-9
CNPq: 140487/2014-0

Le mildiou de la vigne est causé par l’oomycète Plasmopara viticola, qui s’attaque aux parties aériennes non-lignifiées affectant la production viticole. Une alternative à l’utilisation de pesticides est l’utilisation de variétés de vigne à la résistance durable, et un programme pour leur création par croisement entre espèces résistantes et la vigne cultivée, Vitis vinifera, est en cours. Ce programme nécessite l’identification de nouveaux gènes de résistance, ce que le projet vise à faire par (1) le criblage de vignes résistantes avec des effecteurs conservés chez P. viticola, (2) l’étude fonctionnelle d’effecteurs candidats. Le criblage de plantes résistantes n’a conduit à l’identification d’aucun nouveau facteur de résistance majeur. L’étude fonctionnelle d’effecteurs a permis la mise en évidence d’une nouvelle famille d’effecteurs chez P. viticola et a conduit à l’identification de deux effecteurs Pv33, nucléaire, et Pv47, associé au réticulum endoplasmique, qui induisent des défenses végétales
Grapevine downy mildew is caused by the oomycete Plasmopara viticola, which attacks the aerial non-lignified tissues affecting wine production. An alternative to the use of pesticides is the use of vine varieties with sustainable resistances. A programme aiming to create such varieties by crossing resistant species with the cultivated grapevine, Vitis vinifera, is ongoing. Within this program requiring the indentification of new resistance genes, which the project aims to do by (1) screening resistant vines with effectors stored in P. viticola, (2) performing a functional study of candidate effectors. The screening of resistant plants did not lead to the identification of any new major resistance factors. The functional study of effectors revealed a new family of effectors in P. viticola and led to the identification of two effectors Pv33, nuclear, and Pv47, associated with the endoplasmic reticulum, which induce plant defences

Étude du fonctionnement de la symbiose ectomycorhizienne au niveau moléculaire. Effet de la mycorhization sur la biosynthèse des protéines. Étude comparative des cartes polypeptidiques du mycelium libre, des racines non mycorhizées et des ectomycorhizes. Recherches de marqueurs biochimiques de la mycorhization

La défense pré-invasive ou stomatique est un mécanisme qui consiste en la fermeture des pores stomatiques présents sur les organes aériens des plantes lorsque celles-ci sont en contact avec certains agents pathogènes. Cette fermeture empêche ces derniers de pénétrer dans l’hôte et de le coloniser. Ce mécanisme s’active chez Arabidopsis inoculée par la bactérie Pseudomonas syringae pv tomato (Pst) DC3000. Des travaux préliminaires de notre groupe avaient montré que la carbonylation de protéines cibles par des espèces réactives électrophiles (EREs) représentait une étape cruciale de la signalisation cellulaire nécessaire à la mise en place de cette défense. Par des approches de marquage ciblé et de purifications couplées à des identifications par spectrométrie de masse en tandem (nanoLC-MS/MS), nous avons pu caractériser une sérine-thréonine protéine kinase qui joue un rôle déterminant dans ce mécanisme de défense. En effet, des plantes mutées sur le gène codant cette protéine ont perdu la capacité à induire la fermeture de leurs stomates et à déployer la défense stomatique vis-à-vis de la bactérie. De plus, l’introduction de la chimie click (cycloaddition alcyne-azide catalysée par le cuivre), dans nos approches de marquage, nous a permis d’identifier un ensemble de protéines très probablement carbonylées et susceptibles de jouer un rôle crucial dans ces évènements cellulaires qui contribuent à une part de l’immunité végétale. Enfin, les EREs étant capables d’induire la fermeture des stomates, nous avons cherché à savoir, dans le cadre de l’établissement d’une preuve de concept, si leur application sur des plantes permettrait la protection de ces dernières contre Pst
Pre-invasive or stomatal defense is a mechanism which consists of closing the stomata present at surface of aerial organs of plants when they are in contact with certain pathogens. This closure prevents them from entering and colonizing the host. This mechanism is activated in Arabidopsis inoculated by the bacterium Pseudomonas syringae pv tomato (Pst) DC3000. Preliminary work by our group had shown that carbonylation of target proteins by reactive electrophile species (RES) was a crucial step of the cell signaling required to set up this defense. Through targeted tagging and purifications approaches coupled with tandem mass spectrometry identifications (nanoLC-MS/MS), we have been able to characterize a serine-threonine protein kinase that plays a crucial role in this defense mechanism. Indeed, plants mutated on the gene encoding this protein have lost their ability to trigger stomatal closure and to deploy the stomatal defense against the bacteria. In addition, the use of the click chemistry and notably, the copper-catalyzed alkyne-azide cycloaddition, in our tagging approaches has enabled us to identify a set of proteins that are most likely carbonylated and likely to play a significant role in these cell events that contribute to part of plant immunity. Finally, since RES are able to induce stomatal closure we sought to find out, in the context of establishing a proof-of-concept, whether their application to plants would enable them to be protected against the Pst

Ce travail est consacré à l'étude phytochimique des feuilles, branches et des écorces de tronc d'Alphitonia xerocarpa et Alphitonia erubescens, ainsi que celle des fruits d'Alphitonia neocaledonica. Cette étude a permis d'isoler et d'identifier 48 composés dont 23 correspondent à de nouvelles molécules. Les composés isolés peuvent être classés en sept groupes : 2 stérols dont un glycosylés, 10 triterpènes, 19 saponosides, 12 flavonoïdes, un lignane glycosylé, trois glycosides phénoliques, et un nucléoside. La détermination structurale des composés isolés a été réalisée à l'aide des techniques spectroscopiques de RMN 1D & 2D et par la spectrométrie de masse ESI-MS.L'évaluation de l'activité anti-oxydante effectuée sur les différents extraits obtenus a montré une bonne activité des extraits hydro-alcooliques, seul l'extrait butanolique des fruits d'A. neocaledonica a donné une activité anti-tyrosinase intéressante dans le domaine dermato-cosmétique.Les tests biologiques menés en bactériologie et en toxicologie cellulaire a conduit à l'identification des composés ayant des activités importantes antibactérienne contre deux bactéries à Gram positif (CMI [4-32 µg/ml]) et antiproliférative contre les cellules KB (CI50 [2,6-7,9 µM/ml]).Ces plantes pourraient donc être une nouvelle source d'exploitation durable néo-calédonienne dans le secteur de l'industrie cosmétique ou/et pharmaceutique, car les composés actifs sont des produits majoritaires provenant des matières végétales régénérables (feuilles, branches et fruits)
A collaborative project between the institute of Molecular chemistry of Reims (ICMR, UMR CNRS 7312) and the laboratory of natural substances in New Caledonia was established with the purpose to improve the phytochemical and biological evaluation of New-Caledonia endemic plants.The purification of the extracts of the leaves, stem bark and branches of A. xerocarpa and these of the fruits of A. neocaledonica led to the isolation of 48 compounds, of which 23 are new ones. The structural elucidation by 1D and 2D NMR confirmed the presence of 2 phytosterols, 19 saponins, 10 triterpens, 12 flavonoids, three glycosylated phenols, an aurone derivative, a glycosylated lignan, and a nucleoside.All hydro-alcoholique extracts showed a good DPPH radical scavenging capacity, only the butanolic extract of the fruits of A. neocaledonica was found to have anti-tyrosinase potential.Other screening tests were performed to evaluate the antibacterial properties of isolated compounds; some of them showed a high antibacterial activity against Gram-positive bacteria with a range of MIC values between (4-32 µg/ml), and a good anti-proliferative activity against KB cells

Lilium grayi (Gray’s Lily), a southern Appalachian endemic species, is threatened by a Lilium-specific fungal pathogen, Pseudocercosporella inconspicua. The disease is characterized by tan lesions that can cause early senescence, while also lowering seed production and viability. This project tested for P. inconspicua conidia and accessed health at nine locations. The disease was present and ubiquitous across the range of L. grayi. Through identification of P. inconspicua conidia in the field, L. superbum (Turk’s Cap Lily) was identified as an additional host, while L. michauxii (Michaux’s Lily) was disease-free. However, infection was inducible in both species. With the disease widespread in L. superbum and this species represented by many large populations, L. superbum may act as disease reservoir, further complicating the outlook for L. grayi. The disease should be considered an epidemic because of its impact on individual plants, its commonness within populations, and its ubiquity across the geographical range.

Un déploiement optimal de variétés résistantes nécessite une excellente connaissance des relations entre la vigne et P. viticola. Ces connaissances fondamentales pourront ensuite alimenter les stratégies pour le développement de variétés durablement résistantes au vignoble. Bianca est une variété de vigne résistante au mildiou qui possède le gène résistance Rpv3. Cette variété est résistante à la plupart des souches de P. viticola. Cependant, une souche virulente capable de l’infecter a été isolée. Dans ce projet, un pathosystème original, fondé sur la variété Bianca confrontée à une souche avirulente et à une souche virulente de P. viticola, a été utilisé pour obtenir une image complète de l'impact sur la vigne de l'infection par P. viticola en situation compatible et incompatible, en combinant des études de physiopathologie avec des analyses métabolomiques par spectrométrie de masse à haute résolution et par résonance magnétique nucléaire. Parallèlement, l'identification de métabolites et de séquences géniques spécifiques de P. viticola a permis le développement de méthodes de suivi dynamique de l'infection, grâce à la PCR quantitative et à la quantification de lipides caractéristiques de l'agent pathogène
Optimal deployment of resistant varieties requires an excellent knowledge of the relationship between grapevine and P. viticola. This fundamental knowledge can then feed the strategies for the development of grapevine varieties with sustainable resistance. Bianca is a downy mildew-resistant grapevine variety, due its Rpv3 resistance gene. This variety is resistant to most strains of P. viticola. However, a virulent strain capable of infecting Bianca has recently been isolated. In this project, we use this original pathosystem to obtain a complete picture of the impact P. viticola infection on grapevine, by combining physiopathological studies with metabolomic analyses. In addition, the identification of specific metabolites and gene sequences from P. viticola has allowed the development of original methods for dynamic monitoring of the infection process, through quantitative PCR and quantification of specific lipids

Un dosage radioimmunologique specifique du zinniol a ete au point; les etapes de ce travail ont ete les suivantes: - synthese d'une molecule immunogene (conjugue zinniol-proteine porteuse). - obtention d'anticorps specifique (4 ci/mmole). - mise au point du dosage radioimmunologique valide du point de vue de sa specificite, de sa reproductibilite et de sa sensibilite (limite de detection 0,14 nn/essai). Cet outil a permis de realiser des dosages sur des plantes infectees. Ces resultats inedits montrent que la molecule est emise tres rapidement dans les tissus infectes (12 h apres inoculation).

by Kok Dick Shun, Louis.
Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 1993.
Includes bibliographical references.
Acknowledgements --- p.I
Table of Contents --- p.II
Abbreviations --- p.V
Aim and Scope of This Dissertation --- p.IX
Abstract --- p.X
Chapter Chapter One： --- General Introduction --- p.1
Chapter 1.1 --- An Overview of the Immune System --- p.2
Chapter 1.1.1 --- Innate Immunity --- p.2
Chapter 1.1.2 --- Adaptive Immunity --- p.3
Chapter 1.1.2.1 --- Humoral antibody immune response --- p.4
Chapter 1.1.2.2 --- Cell- mediated immune response --- p.5
Chapter 1.2 --- Immunomodulation --- p.6
Chapter 1.3 --- An overview of the Host-mediated response against tumours --- p.9
Chapter 1.3.1 --- T and B lymphocytes --- p.9
Chapter 1.3.2 --- M acrophages --- p.14
Chapter 1.3.3 --- Natural killer cells --- p.17
Chapter 1.3.4 --- Lymphokines-activated killer cells --- p.20
Chapter 1.3.5 --- Tumour infiltrating lymphocytes --- p.22
Chapter 1.3.6 --- Cytokines --- p.23
Chapter 1.4 --- Carbohydrates as Potential Immunostimulating agents --- p.33
Chapter 1.5 --- General Properties of Bupleuri radix (B.R.) --- p.35
Chapter Chapter Two： --- Materials and Methods --- p.36
Chapter 2.1 --- Materials --- p.37
Chapter 2.1.1 --- Animals --- p.37
Chapter 2.1.2 --- Bupleuri radix --- p.37
Chapter 2.1.3 --- "Buffers, culture media and chemicals" --- p.37
Chapter 2.1.4 --- Cell lines --- p.48
Chapter 2.2 --- Methods --- p.49
Chapter 2.2.1 --- Extraction and fractionation of Bupleuri radix --- p.49
Chapter 2.2.2 --- Purification of Bupleuri radix --- p.54
Chapter 2.2.3 --- Characterization of Bupleuri radix --- p.55
Chapter 2.2.4 --- In vivo Drug Treatment --- p.59
Chapter 2.2.5 --- Isolation and preparation of cells --- p.59
Chapter 2.2.6 --- Assays for the immunomodulatory activities of Bupleuri radix --- p.62
Chapter 2.2.7 --- Assays for the immunorestorative properties of Bupleuri radix --- p.74
Chapter 2.2.8 --- Assays for the anti-tumour activities of Bupleuri radix --- p.75
Chapter 2.2.9 --- Statistical analysis --- p.83
Chapter Chapter Three： --- "Fractionation, Purification and Characterization of Bioactive Compounds from Bupleuri radix" --- p.84
Chapter 3.1 --- Results
Chapter 3.1.1 --- Extraction and Fractionation of Bupleuri radix --- p.85
Chapter 3.1.2 --- Purification of Bupleuri radix --- p.85
Chapter 3.1.3 --- Carbohydrate and Protein Contents of B.R. Fractions --- p.87
Chapter 3.1.4 --- Lack of cytotoxicity of Bupleuri radix to Mouse Splenocytes --- p.91
Chapter 3.1.5 --- LC50 of B.R. Fractions determined by Brine Shrimp Bioassay --- p.91
Chapter 3.1.6 --- Heat stability of B.R. Fractions --- p.93
Chapter 3.1.7 --- "Uronic Acid Content of BRIai, BRIaii, BRIbi and BRIbii" --- p.93
Chapter 3.2 --- Discussion --- p.93
Chapter Chapter Four： --- The Immunomodulatory Activities of Bupleuri radix --- p.96
Chapter 4.1 --- Results
Chapter 4.1.1 --- Effect of Bupleuri radix on the Specific and Nonspecific Immunity --- p.97
Chapter 4.1.1.1 --- Mitogenic effect of B.R. Fractions on Murine Splenocytes in vitro --- p.97
Chapter 4.1.1.2 --- Mitogenic effect of B.R. Fractions on Murine Splenocytes ex vivo --- p.97
Chapter 4.1.1.3 --- In vitro Mitogenic effect of B.R. Fractions treated with Periodate --- p.103
Chapter 4.1.1.4 --- In vitro Mitogenic effect of B.R. Fractions treated with Acetic Acid --- p.103
Chapter 4.1.1.5 --- In vitro Co -mitogenic effect of B.R. Fractions with Polymyxin B Sulphate --- p.107
Chapter 4.1.1.6 --- Effect of B.R. Fractions on Lymphocyte sub-populations --- p.107
Chapter 4.1.1.7 --- Primary Humoral Immune Response to SRBC in B.R.-treated mice --- p.107
Chapter 4.1.1.8 --- Activity of cytotoxic T cells in B.R-treated mice --- p.111
Chapter 4.1.1.9 --- Effect of B.R. Fractions on Interleukin-1 - like Factors Production --- p.111
Chapter 4.1.1.10 --- Effect of B.R. Fractions on Interleukin-2 Production --- p.116
Chapter 4.1.1.11 --- Effect of B.R. Fractions on Interleukin-2 Receptor Expression on Murine Splenocytes --- p.116
Chapter 4.1.1.12 --- Effect of B.R. Fractions on GM-CSF Production --- p.119
Chapter 4.1.1.13 --- Immunopotentiating effects of B.R. Fractions on Macrophages: --- p.119
Chapter 4.1.1.13.1 --- In vivo Migration of Macrophages in B.R.-treated mice --- p.119
Chapter 4.1.1.13.2 --- Effect of B.R. Fractions on the Fc Receptor Expression on Murine Resident Peritoneal Exudate Cells --- p.123
Chapter 4.1.2 --- Immunorestorative Properties of Bupleuri radix --- p.123
Chapter 4.1.2.1 --- Effect of B.R. Fractions on Lymphocyte Blastogenesis in Aged Mice --- p.123
Chapter 4.1.2.2 --- Effect of B.R. Fractions on Lymphocyte Blastogenesis in Tumour-bearing Mice --- p.125
Chapter 4.2 --- Discussion --- p.125
Chapter Chapter Five： --- The Anti-tumour Activities of Bupleuri radix --- p.132
Chapter 5.1 --- Results
Chapter 5.1.1 --- Cytostatic Effect of B.R. Fractions on Murine Tumour Cell Lines in vitro --- p.133
Chapter 5.1.2 --- Effect of B.R. Fractions on the Growth of Tumour Ceils in vivo --- p.133
Chapter 5.1.3 --- Effect of B.R. Fractions on the Survival of EAT-bearing mice --- p.140
Chapter 5.1.4 --- Ex vivo Induction of Natural Killer Cell Activity by B.R. Fractions --- p.146
Chapter 5.1.5 --- In vitro Induction of Lymphokine-activated Killer Cell Activity by B.R Fractions --- p.149
Chapter 5.1.6 --- In vivo Induction of Tumour Infiltrating Lymphocytes by B.R. Fractions --- p.149
Chapter 5.1.7 --- In vitro Induction of Macrophage-mediated Cytostatic Effect on Tumour Cells by B.R. Fractions --- p.151
Chapter 5.1.8 --- In vitro Induction of Macrophage-mediated Cytostatic Eifect on Tumour Cells by B.R. Fractions --- p.153
Chapter 5.1.9 --- Effect of B.R. Fractions on γ-interferon Production in vitro --- p.156
Chapter 5.2 --- Discussion --- p.156
Chapter Chapter Six： --- "General Discussion, Conclusion and Future Prospects" --- p.164
Bibliography --- p.i

by Wong Chun-kwok.
Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 1993.
Includes bibliographical references (leaves 233-246).
ABSTRACT --- p.I
ACKNOWLEDGEMENTS --- p.V
ABBREVIATIONS --- p.VI
PUBLICATIONS --- p.IX
CHAPTER
Chapter 1. --- GENERAL INTRODUCTION --- p.1
Chapter 1.1 --- EFFECTOR CELLS MEDIATING ANTI一TUMOR IMMUNITY --- p.3
Chapter 1.1.1 --- CYTOTOXIC T LYMPHOCYTES --- p.4
Chapter 1.1.2 --- MACROPHAGES --- p.4
Chapter 1.1.3 --- NATURAL KILLER CELLS --- p.5
Chapter 1.1.4 --- LYMPHOKINE ACTIVATED KILLER CELLS --- p.7
Chapter 1.1.5 --- TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTES --- p.8
Chapter 1.2 --- BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS : THE NEW IMMUNOTHERAPY --- p.9
Chapter 1. 3 --- CYTOKINES AS BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS IN CANCER THERAPY --- p.12
Chapter 1.3.1 --- INTERFERONS --- p.12
Chapter 1.3.2 --- TUMOR NECROSIS FACTOR-ALPHA --- p.13
Chapter 1.3.3 --- INTERLEUKIN-1 --- p.15
Chapter 1.3.4 --- INTERLEUKIN-2 --- p.16
Chapter 1.3.5 --- GRANULOCYTES /MACROPHAGES COLONY-STIMULATING FACTORS --- p.16
Chapter 1.3.6 --- EPIDERMAL GROWTH FACTOR --- p.17
Chapter 1.3.7 --- TRANSFORMING GROWTH FACTOR-BETA --- p.17
Chapter 1.4 --- BIOACTIVE POLYSACCHARIDES FROM CHINESE MEDICINAL HERBS ACT AS BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERS --- p.18
Chapter 2. --- AIM AND SCOPE OF INVESTIGATION --- p.27
Chapter 3. --- MATERIALS AND METHODS --- p.30
Chapter 3.1 --- MATERIALS --- p.30
Chapter 3.2 --- METHODS --- p.39
Chapter (I) --- "EXTRACTION, FRACTIONATION AND CHARACTERIZATION OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA"
Chapter 3.2.1 --- Hot water extraction and stepwise alcohol precipitation --- p.39
Chapter 3.2.2 --- "Determination of carbohydrate, protein, uronic acid contents" --- p.41
Chapter 3.2.3 --- Gel filtration --- p.41
Chapter 3.2.4 --- Anion-exchange chromatography --- p.41
Chapter 3.2.5 --- Paper chromatography --- p.42
Chapter 3.2.6 --- Gas liquid chromatography --- p.43
Chapter 3.2.7 --- Determination of molecular weight by high performance liquid chromatography --- p.44
Chapter 3.2.8 --- SDS-polyacrylamide gel electrophoresis --- p.44
Chapter 3.2.9 --- Determination of the bio´ؤtoxicity of samples --- p.46
Chapter 3.2.10 --- Treatment of samples with sodium periodate or acetic acid --- p.46
Chapter (II) --- ASSAYS OF IMMUNOMODULATORY ACTIVITIES OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA ON LYMPHOCYTES
Chapter 3.2.11 --- Isolation and preparation of cells --- p.48
Chapter 3.2.12 --- In vitro lymphocyte transformation assay --- p.50
Chapter 3.2.13 --- Mixed lymphocyte culture --- p.50
Chapter 3.2.14 --- Depleting mouse T cells by anti-Thy-1.2 antibody plus complement treatment --- p.51
Chapter 3.2.15 --- Depleting mouse B cells by anti-mouse B cell antibody plus complement treatment --- p.51
Chapter 3.2.16 --- Haemolytic plaque assay --- p.52
Chapter 3.2.17 --- Delayed-type hypersensitivity --- p.53
Chapter 3.2.18 --- Immunofluorescent assay for interleukin-2 receptor expression --- p.54
Chapter 3.2.19 --- Assay of murine interleukin-2 --- p.55
Chapter (III) --- ASSAYS OF IMMUNOMODULATORY ACTIVITIES OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA ON MACROPHAGES
Chapter 3.2.20 --- Assay of murine interleukin-1 --- p.55
Chapter 3.2.21 --- In vivo migration of macrophages --- p.56
Chapter 3.2.22. --- Assay of phagocytic activity of peritoneal macrophages --- p.56
Chapter 3.2.23 --- Northern blotting of mRNA of β-actin gene extracted from peritoneal exudate cells --- p.57
Chapter (IV) --- ASSAYS OF ANTI-TUMOR ACTIVITIES OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA
Chapter 3.2.24 --- Assay of anti-tumor activity in vitro --- p.62
Chapter 3.2.25 --- Assay of anti-tumor activity in vivo --- p.63
Chapter 3.2.26 --- Priming effect of different fractions for the induction of TNF-α in mice --- p.63
Chapter 3 .2.27 --- In vitro stimulation of TNF-α release from resting peritoneal macrophages --- p.64
Chapter 3.2.28 --- Effects of P. heterophylla polysaccharides on TNF-α and IFN-gamma production as well as EAT growth in vivo --- p.64
Chapter 3.2.29 --- Macrophage-mediated cytostatic activity --- p.65
Chapter 3 2.30 --- Assay of lymphokine-activated killer cell activity --- p.66
Chapter 3 2.31 --- Assay of natural killer cell activity --- p.67
Chapter 3.2.32 --- Assay of tumor-infiltrating lymphocytes --- p.68
Chapter (V) --- ASSAYS FOR THE EFFECTS OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA ON THE PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF MURINE BONE MARROW CELLS AND MYELOID LEUKAEMIC Ml CELLS
Chapter 3.2.33 --- Assay of proliferation of murine bone marrow cells --- p.69
Chapter 3.2.34 --- Assay of differentiation of murine bone marrow cells --- p.70
Chapter 3.2.35 --- Assay of differentiation of Ml cells --- p.71
Chapter 3.2.36 --- Induction of GM-CSF from bone marrow cells and Ml cells --- p.71
Chapter (VI) --- ASSAYS OF THE IMMUNORESTORATIVE PROPERTIES OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA
Chapter 3.2.37 --- Immunorestoration in tumor-bearing mice --- p.72
Chapter 3.2.38 --- Immunorestoration in aged mice --- p.72
Chapter 3.2.39 --- Immunorestoration in cyclophosphamide- treated mice --- p.73
Chapter 3.2.40 --- Statistical analysis --- p.73
Chapter 4. --- "EXTRACTION, FRACTIONATION AND CHARACTERIZATION OF MITOGENIC FRACTIONS FROM PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA"
INTRODUCTION --- p.74
RESULTS --- p.76
Chapter 4.1 --- Extraction and fractionation of Pseudostellaria heterophylla --- p.76
Chapter 4.2 --- Gel filtration and anion-exchange chromatography --- p.76
Chapter 4.3 --- Characterization of bioactive fractions from Pseudostellaria heterophylla --- p.79
Chapter 4.4 --- Mitogenic activity of fraction PH-I on murine lymphocytes in vitro --- p.96
Chapter 4.5 --- Mitogenic effect of PH-I on murine lymphocytes in vivo --- p.102
Chapter 4.6 --- Effect of PH-I on polyclonal B cell activation --- p.102
Chapter 4.7 --- Adjuvant effect of PH-I on antibody response to SRBC in vivo --- p.106
Chapter 4.8 --- Evidences to support the mitogenic activity of PH-I is due to its polysaccharide rather than due to the contamination by LPS --- p.106
Chapter 4.9 --- The effects of PH-I on IL-2 production and IL-2 receptor expression on murine lymphocytes in vitro --- p.110
Chapter 4.10 --- The mitogenic activity of the purified fractions on murine lymphocytes in vitro --- p.110
Chapter 4.11 --- Adjuvant effect of PH-I Ab on antibody response to SRBC in vivo --- p.116
Chapter 4.12 --- Mitogenic effect of PH-I C on murine lymphocytes in vivo --- p.116
Chapter 4.13 --- Evidences to support the mitogenic activity of PH-I Ab is due to its polysaccharide rather than due to the contamination by LPS --- p.122
DISCUSSION --- p.122
Chapter 5. --- IMMUNOMODULATING AND ANTI-TUMOR ACTIVITIES OF ALCOHOL- INSOLUBLE FRACTION (PH-I) FROM THE HOT WATER EXTRACT OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA
INTRODUCTION --- p.133
RESULTS --- p.135
Chapter 5.1 --- Effect of PH-I on cytokine production --- p.135
Chapter 5.2 --- In vivo activation of macrophages by PH-I --- p.135
Chapter 5.3 --- Effect of PH-I on the activation of β-actin gene transcription in peritoneal macrophages --- p.142
Chapter 5.4 --- Effect of PH-I on the in vitro growth of various tumor cell lines --- p.142
Chapter 5.5 --- Immunorestoration of PH-I on the mitogenic response in EAT-bearing mice --- p.147
DISCUSSION --- p.147
Chapter 6. --- IMMUNOMODULATING AND ANTI-TUMOR ACTIVITIES OF PURIFIED FRACTIONS SEPARATED FROM PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA
INTRODUCTION --- p.154
RESULTS --- p.157
Chapter 6.1 --- In vitro anti-tumor activities of P. heterophylla --- p.157
Chapter 6.2 --- In vivo anti-tumor activities of P. heterophylla --- p.165
Chapter 6.3 --- Effect of P. heterophylla fractions on induction of delayed-type hypersensitivity --- p.165
Chapter 6.4 --- Effect of PH-I fraction on the cytotoxic alloreactive T lymphocytes in vitro --- p.165
Chapter 6.5 --- Effect of P. heterophylla on the production of TNF-α and IFN-gamma --- p.170
Chapter 6.6 --- Effect of P. heterophylla on the activation of macrophages --- p.176
Chapter 6.7 --- "Effect of P. heterophylla on the activation of NK, LAK and TIL" --- p.181
Chapter 6.8 --- The effect of combined treatment of EAT-bearing mice with P. heterophylla amd Mur-TNF-α on the growth of EAT cells in vivo --- p.181
Chapter 6 9 --- Immunorestorative activities of P. heterophylla in aged mice and cyclophosphamide-treated mice --- p.187
DISCUSSION --- p.187
Chapter 7. --- EFFECTS OF PSEUDOSTELLARIA HETEROPHYLLA ON PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF MURINE BONE MARROW CELLS AND MYELOID LEUKAEMIC Ml CELLS
INTRODUCTION --- p.200
RESULTS --- p.202
Chapter 7.1 --- Effect of P. het erophyl1a on the proliferation and differentiation of murine bone marrow cells --- p.202
Chapter 7 .2 --- Effects of P. heterophyl la on the proliferation and differentiation of murine myeloid leukaemia Ml cells --- p.205
Chapter 7 .3 --- Effects of P. heterophylla on GM-CSF production by bone marow cells and myeloid leukaemia Ml cells --- p.214
DISCUSSION --- p.218
Chapter 8. --- CONCLUSIONS AND FUTURE PERSPECTIVES --- p.223
BIBLIOGRAPHY --- p.233

by Liu Chi.
"July, 2003."
Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2003.
Includes bibliographical references (p. 270-283).
Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web.
Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web.
Mode of access: World Wide Web.
Abstracts in English and Chinese.

abstract: Influenza is a deadly disease that poses a major threat to global health. The surface proteins of influenza A, the type most often associated with epidemics and pandemics, mutate at a very high frequency from season to season, reducing the efficacy of seasonal influenza vaccines. However, certain regions of these proteins are conserved between strains of influenza A, making them attractive targets for the development of a ‘universal’ influenza vaccine. One of these highly conserved regions is the ectodomain of the influenza matrix 2 protein (M2e). Studies have shown that M2e is poorly immunogenic on its own, but when properly adjuvanted it can be used to induce protective immune responses against many strains of influenza A. In this thesis, M2e was fused to a pair experimental ‘vaccine platforms’: an antibody fusion protein designed to assemble into a recombinant immune complex (RIC) and the hepatitis B core antigen (HBc) that can assemble into virus-like particles (VLP). The two antigens were produced in Nicotiana benthamiana plants through the use of geminiviral vectors and were subsequently evaluated in mouse trials. Mice were administered three doses of either the VLP alone or a 1:1 combination of the VLP and the RIC, and recipients of both the VLP and RIC exhibited endpoint anti-M2e antibody titers that were 2 to 3 times higher than mice that received the VLP alone. While IgG2a:IgG1 ratios, which can suggest the type of immune response (TH1 vs TH2) an antigen will elicit, were higher in mice vaccinated solely with the VLP, the higher overall titers are encouraging and demonstrate a degree of interaction between the RIC and VLP vaccines. Further research is necessary to determine the optimal balance of VLP and RIC to maximize IgG2a:IGg1 ratios as well as whether such interaction would be observed through the use of a variety of diverse antigens, though the results of other studies conducted in this lab suggests that this is indeed the case. The results of this study demonstrate not only the successful development of a promising new universal influenza A vaccine, but also that co-delivering different types of recombinant vaccines could reduce the total number of vaccine doses needed to achieve a protective immune response.
Dissertation/Thesis
Masters Thesis Molecular and Cellular Biology 2019