Dissertations / Theses on the topic 'Plásmidos'

Acinetobacter baumannii es un cocobacilo aeróbico, Gram negativo y considerado un patógeno nosocomial emergente, que ha desarrollado resistencia a múltiples fármacos. El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la resistencia antimicrobiana de cepas de Acinetobacter baumannii aisladas de pacientes internados en el Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen y relacionarlo con la presencia de plásmidos, así como determinar la prevalencia de esta especie en dicho nosocomio según el servicio de hospitalización, tipo de muestra, edad, sexo y factores de comorbilidad, mortalidad y estacionalidad. Se identificaron 40 cepas de A. baumannii de origen clínico aisladas de muestras de pacientes hospitalizados del nosocomio Guillermo Almenara Irigoyen durante enero-diciembre del 2012. Las cepas fueron identificadas mediante el sistema automatizado Micro Scan y el método convencional. Se utilizo Agar MacConkey y Agar Leeds Acinetobacter, incubándose a 37 y 44°C respectivamente, en la coloración Gram se observaron cocobacilos Gram negativas, se hicieron pruebas bioquímicas como TSI, citrato y gelatina además de la pruebas de oxidasa y catalasa. Se realizó la sensibilidad antimicrobiana a través del sistema automatizado Micro Scan y el método de difusión en disco. El 100% de las cepas mostraron resistencia a cefalosporina de tercera generación, meropenem, imipenem, ciprofloxacino, ticar/Ac. clavulánico. El 93.5% fueron resistentes a cefepime y sulfametoxazol-trimetoprim, el 95 % a levofloxacino, el 90% a amikacina, el 45% a gentamicina, el 37.5% a tobramicina y el 30% a tetraciclina. Se registraron 12 antibiotipos de resistencia, con una mayor frecuencia en el servicio de Unidad de cuidados Intensivos. Se determinó el perfil plasmídico de las cepas estudiadas, obteniendo 31 perfiles según el número y tamaño de las bandas, que oscila entre 1,240 - 55,459 pb aproximadamente; luego se relacionó con los patrones de resistencia y el origen de aislamiento de la cepa. Además se realizó la curación de las cepas con bromuro de etidio a una concentración del 300 µg/ml. Las cepas que perdieron la resistencia fueron interpretadas como portadoras de resistencia plasmídica a los determinados antibióticos. Además se determinó una prevalencia del 7.42% de total de bacterias gram negativas aisladas, presentando un mayor número de casos en los meses de verano e invierno, con una misma proporción para ambos sexos, la edad promedio de los pacientes infectados fue 62.314±19.745. A.baumannii se aisló principalmente de muestras respiratorias, seguida de hemocultivos y líquidos biológicos provenientes del servicio de UCI, Medicina Interna 1 y Cirugía General 5. Las infecciones se asociaron a pacientes con estados de inmunosupresión debido a procesos quirúrgicos y enfermedades base como cáncer, insuficiencia hepática crónica, insuficiencia renal y EPOC. La tasa de mortalidad asociada a la infección fue del 56.4%.
---- Acinetobacter baumannii is an aerobic, Gram-negative coccobacillus and is considered an emerging nosocomial pathogen that has developed resistance to multiple drugs. The present study aimed to determine the antimicrobial resistance in Acinetobacter baumannii strains isolated from patients hospitalized in the Guillermo Almenara Irigoyen National Hospital and its relationship with the presence of plasmids, and determine the prevalence of this species in that hospital according to the inpatient service , sample type, age, sex and comorbidity, mortality and seasonality factors. 40 A. baumannii strains of clinical origin, isolated from samples of hospitalized patients at the Guillermo Almenara Irigoyen hospital during January and December 2012, were identified. Strains were identified by the MicroScan Automated System and by the conventional method. MacConkey Agar and Leeds Acinetobacter Agar were used, incubating at 37 and 44ºC, respectively. Gram-negative coccobacillus were observed in the Gram stain. Biochemical test including TSI, citrate and gelatin were performed, in addition to the oxidase and catalase tests. Antimicrobial susceptibility testing was performed using the Micro Scan automated system and the disk diffusion method. 100% of the strains showed resistance to third-generation cephalosporin, meropenem, imipenem, ciprofloxacin, ticar / clavulanic acid. 93.5% were resistant to cefepime and trimethoprim-sulfamethoxazole, 95% to levofloxacin, 90% to amikacin, 45% to gentamicin, 37.5% to tobramycin and 30% to tetracycline. 12 resistance antibiotypes were recorded, with more frequency in the intensive care unit service. The plasmid profile of the studied strains was determined, obtaining 31 profiles according to the number and size of the bands, which ranged from about 1,240– 55,459 bp; these were then associated with the resistance patterns and the isolation origin of the strain. Furthermore, strain curing was performed with ethidium bromide at a concentration of 300 µg/ml. Strains that lost resistance were interpreted as strains carrying plasmidic resistance to certain antibiotics. Moreover, a prevalence of 7.42% of total isolated Gram-negative bacteria was determined, presenting a larger number of cases in the summer and winter, with the same proportion for both sexes; the average age of infected patients was 62.314 ± 19.745. A. baumannii was mainly isolated from respiratory samples, followed by blood cultures and biological fluids samples from the UCI service, Internal Medicine 1 and General Surgery 5. The infections were associated to patients with immunosuppression state caused by surgical procedures and underlying diseases such as cancer, chronic liver failure, kidney failure and EPOC. The mortality rate associated with infection was 56.4%. Keywords: Acinetobacter baumannii, nosocomial infection, antimicrobial resistance plasmids, plasmids healing, hospital prevalence.
Tesis

El género Enterococcus es conocido por ser de origen fecal o intestinal, pero tiene una amplia distribución en la naturaleza y se le puede encontrar en suelos, aguas, plantas y en productos alimenticios, siendo capaz de sobrevivir en medios poco enriquecidos. Los estudios reportados sobre estos microorganismos generalmente inciden en su aspecto clínico y su resistencia a antibióticos, y algunos se ubican en un contexto ambiental evaluando métodos para su detección o enumeración para uso en aguas recreacionales. Está aumentando la importancia de este microorganismo como agente causal de infecciones adquiridas en hospitales, pero el interés de estudio en este género radica en su alta resistencia natural a múltiples antimicrobianos y a su capacidad de adquirir y transferir dicha resistencia. Se sabe que Enterococcus es un microorganismo introducido al ecosistema marino debido a la contaminación de éste ambiente con desechos orgánicos, pero son pocos los reportes sobre estudios de resistencia antimicrobiana de éste género provenientes de muestras de agua de mar, siendo necesario este tipo de investigación que nos permita conocer la importancia de estos microorganismos en estos ambientes
The genus Enterococcus is recognized as being of fecal origin but have a wide distribution in nature, they can be found in soil, water, plants and food products, being able to survive in low-enriched media. Studies on these microorganisms usually affect their appearance and clinical resistance to antibiotics, and there are some who are placed in an environmental context, evaluating methods of detection or enumeration in waters for recreational use. It is increasing the importance of this microorganism as a causative agent of infections acquired in hospitals, but the interest in this kind of study lies in its high natural resistance to multiple antimicrobials and their ability to acquire and transfer the resistance. Despite that Enterococcus is a microorganism introduced to the marine ecosystem by contamination with organic wastes, there are few reports on studies of antimicrobial resistance of the Enterococcus genus water samples from the sea, being necessary to this type of research that allows us to know the importance of these microorganisms in these environments

Los plásmidos en cepas de Acidithiobacillus sp. aislados de aguas ácidas de mina son recursos genéticos que aún no han sido reportado en nuestro país, que podrían usarse en la construcción de vectores y el mejoramiento de cepas bacterianas para su aplicación en biorremediación y biolixiviación. Por ello, el objetivo de esta tesis fue determinar la presencia de plásmidos de Acidithiobacillus aislados de aguas ácidas de zonas mineras, y analizar in sílico genes putativos identificados a partir del secuenciamiento y anotación de dos plásmidos de la cepa At. ferrivorans PQ33. Para la extracción de plásmidos se utilizó el protocolo de PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen ™). Los plásmidos de At. ferrivorans PQ33 fueron secuenciados por síntesis química en sistema HiSeq 200 de Illumina. El software Velveth, versión 1.1, fue empleado para el ensamblamiento de novo de las secuencias. Los plásmidos circularizados fueron anotados usando las herramientas Prokka y ORFfinder, las búsquedas de similaridad se realizaron empleando BlastX contra la base de datos del GenBank. Blastn y el software Artemis fueron usados para identificar los orígenes de replicación. De 24 cepas de Acidithiobacillus (10 de Puno, 6 de Huancavelica y 8 de Cerro de Pasco), 17 (70.83%) presentaron plásmidos. El análisis in silico reveló la presencia de genes implicados en la conjugación (TraD, MobA, proteínas de exclusión de entrada y XerD), sistemas toxina-anti toxina (HicA y HicB), proteínas de replicación (RepA y proteínas de union a DNA), reguladores de transcripción y post traducción (CopG y la chaperona DnaJ), así como la destacable presencia de una proteína de virulencia (VapD), además de dos proteínas (Porina fosfato selectiva O y diguanilato ciclasa), implicadas en la resistencia a la falta de nutrientes y producción de biofilm, respectivamente. Es la primera vez que se reporta plásmidos caracterizados de un cepa psicrotolerante de Acidithiobacillus ferrivorans, con capacidad de transferencia horizontal y sistemas de regulación implicados tanto en el mantenimiento del plásmido como en la adherencia a sustratos, característica importante de esta especie para su aplicación en biominería.
Tesis

El género Enterococcus es conocido por ser de origen fecal o intestinal, pero tiene una amplia distribución en la naturaleza y se le puede encontrar en suelos, aguas, plantas y en productos alimenticios, siendo capaz de sobrevivir en medios poco enriquecidos. Los estudios reportados sobre estos microorganismos generalmente inciden en su aspecto clínico y su resistencia a antibióticos, y algunos se ubican en un contexto ambiental evaluando métodos para su detección o enumeración para uso en aguas recreacionales. Está aumentando la importancia de este microorganismo como agente causal de infecciones adquiridas en hospitales, pero el interés de estudio en este género radica en su alta resistencia natural a múltiples antimicrobianos y a su capacidad de adquirir y transferir dicha resistencia. Se sabe que Enterococcus es un microorganismo introducido al ecosistema marino debido a la contaminación de éste ambiente con desechos orgánicos, pero son pocos los reportes sobre estudios de resistencia antimicrobiana de éste género provenientes de muestras de agua de mar, siendo necesario este tipo de investigación que nos permita conocer la importancia de estos microorganismos en estos ambientes.
The genus Enterococcus is recognized as being of fecal origin but have a wide distribution in nature, they can be found in soil, water, plants and food products, being able to survive in low-enriched media. Studies on these microorganisms usually affect their appearance and clinical resistance to antibiotics, and there are some who are placed in an environmental context, evaluating methods of detection or enumeration in waters for recreational use. It is increasing the importance of this microorganism as a causative agent of infections acquired in hospitals, but the interest in this kind of study lies in its high natural resistance to multiple antimicrobials and their ability to acquire and transfer the resistance. Despite that Enterococcus is a microorganism introduced to the marine ecosystem by contamination with organic wastes, there are few reports on studies of antimicrobial resistance of the Enterococcus genus water samples from the sea, being necessary to this type of research that allows us to know the importance of these microorganisms in these environments.
Tesis

La resistencia bacteriana a los antimicrobianos, y en particular la producción de ß- lactamasas plasmídicas de espectro extendido (BLEE), es un grave problema descrito principalmente en cepas de origen clínico. Sin embargo, no existen muchos datos sobre la prevalencia y la capacidad de difusión de estas resistencias en otros ambientes. Por ello, los objetivos de esta Tesis se enmarcan en un amplio proyecto coordinado cuya finalidad ha sido el estudio de la prevalencia de BLEE, cefamicinasas y carbapenemasas en diversos ambientes, determinar la transmisibilidad de estas resistencias y, finalmente, identificar y caracterizar los plásmidos que las codifican.
En este trabajo, en primer lugar se han estudiado 107 cepas procedentes de granjas de aves, de cerdos y de conejos, siendo todas ellas Escherichia coli, a excepción de una cepa de Enterobacter cloacae. No se ha encontrado ninguna cepa portadora de la resistencia a carbapenémicos, aunque si se describe la presencia de la ß-lactamasa plasmídica CMY-2 y de una gran diversidad de enzimas BLEE. Además, el 93% de las cepas fueron resistentes a dos o más de los antibióticos no ß-lactámicos probados. En las granjas de aves, la enzima CTX-M-14 y la cefamicinasa CMY-2 han sido las más frecuentes. Por el contrario, en las de cerdos la enzima CTX-M-1 ha sido la más prevalente. Se describe, por primera vez, la presencia de las enzimas TEM-52 y SHV-2 en las granjas de aves, la enzima SHV-5 en las de cerdos y la enzima CMY-2 en las de conejos. Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que las granjas de animales actúan como un reservorio de genes de BLEE y CMY-2. Asimismo, se ha determinado el grupo filogenético y el estatus ExPEC de las 106 cepas de E. coli aisladas de granjas de animales. La mayoría de las cepas han sido definidas como comensales al pertenecer a los filogrupos A y B1. Aunque una proporción significativa de cepas procedentes de granjas de aves pertenece a los filogrupos B2 y D, ambos vinculados a cepas patógenas. Por el contrario, en granjas de cerdos las cepas mayoritarias han sido las pertenecientes al filogrupo A. Del total de las cepas estudiadas, sólo 10 se han caracterizado como ExPEC, presentando éstas una media de nueve factores implicados en la virulencia. La gran mayoría de estas cepas proceden de granjas de aves, pertenecen al filogrupo D y codifican la enzima CMY-2. Además, cabe enfatizar el hecho no descrito hasta el
momento, de que dos de las tres cepas aisladas de conejos han sido caracterizadas como
ExPEC.
En segundo lugar, se han seleccionado 111 cepas de enterobacterias, aisladas de granjas de animales, de alimentos, de muestras clínicas, de muestras fecales de portadores sanos, de brotes alimentarios y de aguas residuales y se ha estudiado la transmisibilidad de las BLEE y CMY-2. Más del 70% de dichas cepas transfirieron por conjugación estas resistencias. Además, un 29,2% de las cepas transconjugantes obtenidas presentaron resistencias a los antibióticos no ß-lactámicos. Por otra parte, las enzimas CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, familia SHV y CMY-2 fueron las que se transfirieron con una mayor frecuencia.
Finalmente, se han caracterizado los plásmidos conjugativos, presentes en las 111 cepas que codificaban BLEE y CMY-2. Para ello, se ha determinado su peso molecular mediante electroforesis en campo pulsante, y se ha identificado el grupo de incompatibilidad al cual pertenecen. Esta identificación se ha llevado a cabo mediante hibridación con sondas frías por dot blot y Southern blot y por PCR y secuenciación. Los resultados obtenidos indican que hay una clara concordancia entre los plásmidos que, aún procediendo de diversos ambientes, presentan características muy similares como son la enzima que codifican, el grupo de incompatibilidad al que pertenecen y, en ciertos casos su tamaño. Así, la extensa mayoría de los plásmidos que codifican de la enzima CTX-M-14a, pertenece al grupo IncK. De igual forma, las enzimas del grupo CTX-M-1 se han localizado en plásmidos IncN. La enzima CMY-2 se ha transferido en plásmidos de alto peso molecular portadores de dos replicones, IncQ e IncA/C2. En cambio, la enzima CTX-M-9 se ha vehiculizado en plásmidos con grupos Inc muy variados, aunque cabe destacar el hecho de que tres de ellos pertenecen al IncHI2.
Bacterial resistance mediated by extended spectrum ß-lactamases (ESBL) is a great concern that has been described mainly in clinical strains. However, there is no so much data about the prevalence and capacity of diffusion of this type of resistances in other environments.
Therefore, the objectives of the present Thesis have been to study the prevalence of ESBL, plasmidic class C ß-lactamase and carbapenemases in diverse environments, to determine the transmissibility of these resistances and, finally, to identify and characterize the plasmid that codify these resistances.
First of all, in this work it have been studied 107 strains from poultry, pig and rabbit farms, being all of them Escherichia coli but one Enterobacter cloacae strain. None strains have carried resistance to carbapenemics, although it have been described the CMY-2 enzyme and a great variety of ESBL. Moreover, the 93% of the strains showed resistance to two o more non-ß-lactam antibiotics tested. In poultry farms, the enzymes CTX-M-14 and CMY-2 were the most frequent. By the contrary, in pig farms, the enzyme CTX-M-1 was the most prevalent. To the best of our knowledge, this is the first time that it is described the enzymes TEM-52 and SHV-2 in poultry farms, the enzyme SHV-5 in pig farms and the CMY-2 in rabbit farms. The results obtained here; show that animal farms act as a reservoir or ESBL and CMY-2 genes. Moreover, it have been determined the phylogenetic group and the ExPEC status of the 106 E. coli strains. The majority of the strains have been identified like commensal even though they belong to the groups A and B1. However, a high percentage of the strains coming from poultry farms belong to the phylogenetic groups B2 and D, being both groups associated to pathogenic strains. By the contrary, in pig farms the majority of the strains derive from the phylogenetic group A. Only, ten strains have been characterized as ExPEC, carrying these strains nine virulence markers of average. The majority of the ExPEC strains derived form poultry farms been associated to the phylogenetic group D and codifying the enzyme CMY-2. It is important to denote that two of the three strains isolated from rabbit farms are ExPEC.
Secondly, it has been selected 111 strains from Enterobacteriaceae, isolated from several environments: animal farms, food, food-borne outbreaks, community, clinical patients and human sewage and it has been studied the transmissibility of the ESBL and CMY-2. More than 70% of these strains transferred by conjugation these resistances. Moreover, a 29.2% of the transconjugant strains showed resistance to non-ß-lactam antibiotics. The enzymes CTX-M-1, CTX-M-32, CTX-M-14a, the family SHV and CMY-2 were the most transferable.
Finally, it have been characterized the conjugative plasmids carrying ESBL of CMY-2 of the 111 strains. To do that, it have been determined the molecular weight of the plasmids by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and their incompatibility group have been identified. The identification of the incompatibility group have been done by dot blot, Southern blot, PCR and sequencing. The results obtained show that there are a high degree of correlation among the Inc group to which the plasmids belong, the enzyme that they encode, and their size. So, the majority of plasmids that codify the enzyme CTX-M-14a belong to IncK group. Similarly, the enzymes of the group CTX- M-1 have been located in IncN plasmids. The plasmidic class C ß-lactamase, CMY-2, have been transferred in plasmids with high molecular weigh carrying the replicons IncQ and IncA/C2. By contrast, conjugative plasmids codifying of the enzyme CTX-M- 9 belong to different Inc groups, although three of them pertain to IncHI2.

Las salmonelas no-tifoideas que causan actualmente infecciones en seres humanos son frecuentemente epidémicas y resistentes a los antimicrobianos (R), además de virulentas (V). La evolución de las bacterias en cuanto a la adquisición de determinantes-V y/o -R se debe,fundamentalmente, a la incorporación, a menudo secuencial, de piezas de ADN, cuya combinación origina nuevos elementos genéticos, que quedan inmediatamente sometidos a la selección natural en un ambiente cambiante.Los genes-V y -R pueden estar aislados, formando pequeñas agrupaciones (islotes) y/o en agrupaciones mayores (islas genómicas o de patogenicidad) y pueden ser de localización cromosómica o plasmídica. Los genes-R, una vez seleccionados, pueden mantenerse en las bacterias originarias y su descendencia o bien diseminarse entre bacterias más o menos relacionadas a través de los elementos genéticos móviles (EGMs) entre los que destacan el sistema integrón-casete génica, los transposones, los plásmidos y las islas gen.En la presente tesis se llevaron a cabo estudios de epidemiología molecular en 176 aislamientos de Salmonella enterica pertenecientes a tres serotipos no prevalentes, aunque causantes de alertas epidemiológicas: Hadar, Brandenburg y Ohio. Se determinó el impacto epidemiológico de los mismos, identificando los tipos endémicos y prevalentes en el Principado de Asturias y su posible presencia en otras áreas geográficas. Los subtipos fueron trazados mediante análisis de macrorrestricción genómica-PFGE y genotipos-R y -V. Como ejemplo tenemos que los subtipos prevalentes de Hadar se pueden considerar endémicos en España y uno de ellos causó un brote nacional asociado a la salsa de pollos asados comerciales en 2005. Los estudios de resistencia revelaron un amplio porcentaje de cepas con resistencia múltiple (RM) y una correlación entre ésta y la presencia de EGMs. En los tres serotipos se identificaron plásmidos-R, de tamaño variable (9-300 Kb) y diferentes genotipos-R, la mayoría de los cuales resultaron conjugativos. En aislamientos con RM de Brandenburg y Ohio, pero no de Hadar, se detectó un integrón de clase 1 (1600/dfrA1-aadA1), asociado a transposones de tipo Tn21 y estos, a su vez, a Tn9. En aquellos resistentes a tetraciclina se encontraron transposones de tipo Tn1721 y Tn10, portadores de los genes tet(A) y tet(B), respectivamente. Esta es la primera vez que se estudian los perfiles de genes-R en los plásmidos del serotipo Hadar y la organización de los EGMs implicados en la RM en los serotipos Brandenburg y Ohio. La determinación de los perfiles-V reveló pequeñas diferencias intra-serotipo en el caso de Hadar y Brandenburg (presencia/ausencia de sopE). Las variaciones inter-serotipo eran mayores: Hadar carecía de los genes agfA, sugR y rhuM, presentes en los otros dos serotipos, mientras que todos los aislamientos de Ohio presentaron un gen sugR delecionado y fueron negativos para sopE. Todos los aislamientos poseían las cinco islas de patogenicidad (SPI1-5) identificadas en la cepa tipo S. Typhimurium LT2.

Fire blight is considered the most serious disease affecting pome fruit and ornamental and wild rosaceae. The causal agent is the bacterium Erwinia amylovora, considered a quarantine organism in the EU. This species has been extensively studied, but at the genomic level there is still much to know, as there are currently only two genomes published and another thirteen were assembled in scaffolds. Its pangenoma is considered open, although with a core with a high sequence identity. There is very little intraspecific variability, which is manifested in a low genotypic diversity, being noticed that the plasmids are the major source of genetic variability. This could explain the differences in virulence in strains, as well as their better adaptation to the different environmental conditions. The plasmid pEA29 described in the majority of the strains of E. amylovora, and with a quantitative effect in virulence, was not found in some Spanish isolates of the bacterium. The study of these strains gave way to the discovery of another plasmid, pEI70, which is present in strains of several European countries. After pEA29, pEI70 is the one with the highest presence. The function, distribution and genetic content of this plasmid, as well as the effect of pEA29 and pEI70 on the expression of the chromosomal genes in strain bearing them, have been studied. The inoculation experiments on fruit with the strains to which the plasmid pEI70 or pEA29 had been introduced compared to that same strain without plasmids showed an increase in virulence, which was manifested in a reduction in the time of the emergence of symptoms and in which they appeared more aggressively. An experiment was carried out using a microarray, in order to study if the presence of each one of these plasmids could affect the expression on certain chromosomal genes that would explain that variation in virulence of the carrier strain, using a microarray. The results demonstrated the role of both plasmids to affect gene expression, between 120 and 180 chromosomal genes according to the plasmid carrying the strain, in each case enriching different functional categories, although 28 of them were coincident in the two cases. E. piriflorinigrans is a newly described pathogenic species that produces necrosis only in pear blossoms but does not appear to affect other organs. Both species share phenotypic and molecular characteristics, making their distinction difficult. Its detection and correct identification was a challenge because the symptoms it causes are practically indistinguishable from those caused by E. amylovora. In this work new plasmid pEPIR37 found in this new species was studied also. This is present in all analyzed strains. When this plasmid was introduced into strains of the species E. amylovora cured of plasmids, they showed an increase in virulence comparable to that observed with pEA29, suggesting that pEPIR37 produces a similar effect. Two specific and sensitive real-time and conventional PCR protocols have also been developed to identify, detect and differentiate E. piriflorinigrans from E. amylovora and other species of this genus using primers designed from specific sequences, annoted in this same work, from plasmid pEPIR37. This has allowed to identify this new species in other hosts as Pyracantha sp., besides pear tree and in other regions where previously it had not been detected. Likewise, these results have allowed to know biological and epidemiological aspects of E. piriflorinigrans that contribute to have new key scientific information to establish strategies for its control in pome fruit trees. The study of the plasmids and their functions in these two phylogenetically related species and their role in the adaptation to the environment in which these species live, as well as in the virulence of the strains that carry them, could give new clues about the origin of both pathogens, their evolution, their biological cycle and interaction with the host plant
El fuego bacteriano está considerada la enfermedad más grave que afecta a frutales de pepita y rosáceas ornamentales y silvestres. El agente causal es la bacteria Erwinia amylovora, perteneciente a la familia Erwiniaceae, organismo de cuarentena en la UE. Esta especie ha sido ampliamente estudiada, pero a nivel genómico todavía queda mucho por conocer, ya que en la actualidad existen únicamente dos genomas completamente secuenciados y anotados, y otros trece en scaffolds, de cepas de E. amylovora de diferentes orígenes geográficos y huéspedes. Su pangenoma se considera abierto, aunque con un core con una alta identidad de secuencia en estas cepas. Existe muy poca variabilidad intraespecífica, lo que se manifiesta en una escasa diversidad genotípica, advirtiéndose que los plásmidos son la mayor fuente de variabilidad genética que podría explicar las diferencias en virulencia en cepas portadoras de plásmidos, así como su mejor adaptación a diferentes condiciones ambientales. El plásmido pEA29 descrito en la mayoría de las cepas de E. amylovora, y con un efecto cuantitativo en virulencia. El estudio de estas cepas sin plásmido dio paso al descubrimiento de otro plásmido que se ha denominado pEI70, presente en cepas de varios países europeos. Se ha estudiado su función, distribución y contenido genético, así como el efecto del pEA29 y del pEI70 sobre la expresión de los genes cromosómicos de la cepa que los porta, tras la infección en fruto inmaduro. Los experimentos de inoculación con las cepas a las que se les había introducido el plásmido pEI70 o el pEA29, en comparación con esa misma cepa sin plásmidos, mostraron un aumento de la virulencia. Por todo ello, con el fin de estudiar si la presencia de cada uno de estos dos plásmidos podría producir efectos sobre determinados genes cromosómicos que explicarían esa variación en virulencia, se realizó un experimento de expresión génica diferencial usando un microarray. Los resultados demostraron el papel de ambos plásmidos al afectar a la expresión de entre 120 y 180 genes cromosómicos según el plásmido que porte la cepa, enriqueciéndose en cada caso categorías funcionales diferentes. Por otro lado, E. piriflorinigrans es una especie patógena descrita recientemente que produce necrosis sólo en las flores de peral, pero no parece afectar a otros órganos. Además, ambas especies comparten características fenotípicas y moleculares. Su detección y correcta identificación era un reto debido a que los síntomas que provoca en flores son prácticamente indistinguibles a los causados por E. amylovora. Se ha estudiado el contenido genético de un plásmido de 37 Kb, pEPIR37 presente en todas las cepas analizadas de la especie. Además, se ha observado que cuando este plásmido es introducido en cepas de la especie E. amylovora curadas de plásmidos, mostraron un nivel de virulencia mayor, comparable a la observada en las cepas portadoras del plásmido pEA29, lo que parece indicar que este plásmido produce un efecto similar. En este trabajo también se han desarrollado dos protocolos específicos y sensibles de PCR en tiempo real y convencional para identificar, detectar y diferenciar E. piriflorinigrans de E. amylovora y de otras especies de este género, usando secuencias específicas del plásmido pEPIR37. Ello ha permitido identificar esta nueva especie en otros huéspedes como en otras regiones en donde no se había detectado. Asimismo, estos resultados han permitido conocer aspectos biológicos y epidemiológicos de E. piriflorinigrans que aportan nueva información científica que resultaría para establecer estrategias para su control. El estudio de los plásmidos y sus funciones en estas dos especies tan relacionadas filogenéticamente y su papel en la adaptación al medio en el que ambas habitan, así como en la virulencia de las cepas que los portan, podría dar nuevas pistas sobre el origen de estos patógenos, su evolución
El foc bacterià està considerada la malaltia més greu que afecta arbres fruiters de pinyol i rosàcies ornamentals i silvestres. L'agent causal d'aquesta malaltia és el bacteri Erwinia amylovora, organisme de quarantena a la UE. Aquesta espècie ha estat àmpliament estudiada, però a nivell genòmic encara queda molt per conèixer, ja que en l'actualitat únicament existeixen dos genomes publicats, i altres tretze assemblades scaffolds. El seu pangenoma es considera obert, tot i que aquests soques posseeixen un core amb una alta identitat de seqüència. Hi ha molt poca variabilitat intraespecífica, el que es manifesta en una escassa diversitat genotípica, advertint-se que els plasmidis són la major font de variabilitat genètica que podria explicar les diferències en virulència a les soques, així com la seua millor adaptació a les condicions ambientals. El plasmidi pEA29 descrit en la majoria de les soques d'E. amylovora, i amb un efecte quantitatiu en virulència, no es va trobar en alguns aïllats espanyols del bacteri, donant pas al descobriment d'un altre plasmidi, pEI70. Per això, després del pEA29, el plasmidi pEI70 és el de major. S'ha estudiat la funció, distribució i contingut genètic d'aquest plasmidi, així com l'efecte del pEA29 i del pEI70 sobre l'expressió dels gens cromosòmics. Els experiments d'inoculació en fruit amb les soques amb els plasmidis van mostrar un augment de la virulència, que es manifestava en una reducció en el temps de l'aparició de símptomes i en què aquests es presentaven de forma més agressiva. Per tal d'estudiar si la presència de cada plasmidi podria produir efectes sobre determinats gens cromosòmics que explicarien aquesta variació en virulència de la soca portadora, es va realitzar un experiment d'expressió genètica diferencial mitjançant un microarray. Els resultats obtinguts van demostrar el paper dels dos plasmidis en afectar l'expressió d'entre 120 i 180 gens cromosòmics segons el plasmidi que porta la soca, enriquint-se en cada cas categories funcinals diferents, tot i que 28 d'ells van ser coincidents en els dos casos. E. piriflorinigrans és una espècie patògena descrita recentment que produeix necrosi només en les flors de perera. Les dues espècies comparteixen característiques fenotípiques i moleculars, fent difícil la seua distinció. La seua detecció i correcta identificació era un repte. En aquest treball també s'ha avaluat el contingut genètic d'un plasmidi de 37 Kb, anomenat pEPIR37, present en totes les soques analitzades de l'espècie E. piriflorinigrans, i a més s'ha observat que quan aquest plasmidi era introduït en soques de l'espècie E. amylovora curades de plasmidis, que per això tenen una virulència reduïda, van mostrar una virulència major, comparable amb l'observada en les soques portadores del plasmidi pEA29, el que indicaria que aquest plasmidi produeix un efecte similar.Per tot això en aquest treball també s'han desenvolupat dos protocols específics i sensibles de PCR en temps real i convencional per identificar, detectar i diferenciar E. piriflorinigrans d'E. amylovora i d'altres espècies d'aquest gènere, usant iniciadors dissenyats a partir de seqüències específiques, anotades en aquest mateix treball, del plasmidi pEPIR37. Això ha permès identificar aquesta nova espècie a altres hostes com Pyracantha sp., a més de perera i en altres regions on anteriorment no s'havia detectat. Així mateix, aquests resultats han permès conèixer aspectes biològics i epidemiològics d'E. piriflorinigrans que aporten nova informació científica clau per establir estratègies per al seu control en arbres fruiters de pinyol. L'estudi dels plasmidis i les seues funcions en aquestes dues espècies tan relacionades filogenèticament i el seu paper en l'adaptació al medi on habiten, així com en la virulència de les soques que els porten, podria donar noves pistes sobre l'origen dels dos patògens, la seua evolu
Barbé Martínez, S. (2017). Función y origen de los plásmidos en especies de Erwinia patógenas y epífitas de frutales de pepita [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/86146
TESIS

Investiga la resistencia bacteriana al ión mercurio (Hg2+) en 55 cepas de Escherichia coli aisladas de diferentes ambientes marinos de la costa limeña: Bahía de Pucusana, Bahía de Miraflores y Bahía del Callao (Lima-Perú). Se determinan los diferentes serogrupos de las cepas, utilizando sueros polivalentes EPEC, EIEC y EHEC; la resistencia al mercurio es evaluada realizando pruebas de MIC a cloruro de mercurio: 30, 50, 80, 100, 200, 300 y 400 µM/mL disuelto en caldo LB. Se evalúa las cepas mercurio-resistentes frente a antibióticos clínicos por la técnica de difusión en placa usando los siguientes antibióticos en discos: Cloramfenicol (C), 30 µg; Norfloxacina (Nor),10 µg; Amikacina (Ak), 30 µg; Kanamicina (K), 30 µg; Ampicilina (A), 10 µg; Sulfaperazone (Sfp), 30 µg; Tetraciclina (Te), 30 µg; Aztreonam (Az), 30 µg; Ceftazidima (Caz), 30 µg; Gentamicina (Ge), 10 µg; Amoxicilina (Amx), 25 µg; Sulfametoxazol-trimetoprim (Sxt), 25 µg; Ácido Nalidíxico (W), 30 µg; Ciprofloxacina (Cip), 5 µg. El origen de la resistencia al mercurio mediada por plásmidos se comprueba mediante la técnica de curación con SDS (10 % p/v); se realiza la técnica de conjugación de plásmidos tomando la cepa receptora E. coli DH5α. Para la visualización de los plásmidos conjugativos se realiza la técnica de extracción de plásmidos con el método de Lisis Alcalina con SDS en las cepas receptoras mercurio-resistentes. Así mismo se evalúa la presencia del gen merA, que se encuentra en el operón mer, por el método del PCR tomando como DNA molde los plásmidos aislados. Del total de las cepas de E. coli (n=55) estudiadas, el 29,1 % (n=16) resultan ser positivas para los serogrupos EPEC, de éstas: 31,25 % EPEC poliA, 50 % EPEC poliB, 18,75 % EPEC poliC. El 74,54 % (n=41) son resistentes al mercurio en distintas concentraciones, de éstas el 34,15 % son resistentes a antibióticos; se observa la resistencia al mercurio mediada por plásmidos en el 80,5 %. De las cepas mercurio resistentes, el 14,63 % (n=6) muestran ser portadores de plásmidos conjugativos, observándose la presencia de estos en las cepas receptoras mercurio resistentes. Se observa la presencia truncada o aberrante del gen merA en los plásmidos aislados, confirmando la frecuencia del operón mer en el 14,63 % de las cepas mercurio resistentes.
Tesis

Ingeniero Civil Químico. Ingeniero Civil en Biotecnología
Cuando se habla de ciencia e ingeniería, los métodos y herramientas utilizados son bastante distintos entre ellos. Bajo esta diferencia aparece la biología sintética, disciplina que busca diseñar y modificar organismos vivos para producir nuevas funciones y/o mejorar las ya existentes. Para ello hace uso de herramientas básicas de la ingeniería, tales como los conceptos de modularidad, estandarización, abstracción, modelamiento y diseño. Para poder estandarizar las unidades básicas de esta disciplina, los biobricks, se pueden utilizar pruebas en matraces, pero no es usual hacerlo en biorreactores. La concepción, diseño implementación y operación de uno de estos equipos constituye el objetivo principal de este proyecto. Como parte de los resultados del mismo, se estimó que el mejor modo de operar para lograr estas mediciones se compone de una cascada de CSTRs, la que fue implementada en escala de laboratorio. Para las pruebas de medición se construyeron cinco plásmidos, de los cuales cuatro fueron elaborados con técnicas usadas en biología sintética. De estos últimos, se obtuvo dos vectores con alta producción basal en LB, otro que no sintetizó la proteína esperada y sólo el último presentó un comportamiento apropiado, vale decir, producción basal baja y un aumento significativo en presencia de inductor. Para analizar el comportamiento del reactor en operación, se realizó una experiencia de distribución de tiempos de residencia. Los resultados indicaron que la diferencia entre el biorreactor, compuesto por 7 minirreactores CSTR en serie, y el modelo matemático, fue aproximadamente un 1%. En las pruebas de operación del biorreactor con bacterias, se obtuvo que la cepa con el promotor que responde a arabinosa posee un crecimiento más alto que la cepa con promotor sensible a aTc. En cambio, en términos de producción de proteína, el promotor sensible a aTc posee una inducción más fuerte. Específicamente, usando un flujo de 0,794 [mL/min], este promotor mostró una mayor productividad de proteína por biomasa, lo que lo caracteriza como un promotor fuerte.

Publicación a texto completo no autorizada por el autor
Determina la susceptibilidad a los antimicrobianos utilizados en el tratamiento de la Coriza Infecciosa, se empleó el método de microdilución en caldo utilizando los siguientes antimicrobianos: ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina, sulfametoxazol-trimetoprim, tetraciclina, kanamicina y eritromicina. El método de microdilución en caldo resultó ser confiable y reproducible para Av. paragallinarum. El 73.7 % (14 aislados) de las cepas aisladas fueron resistente a la tetraciclina y estreptomicina. El grupo de resistencia más común (8 cepas aisladas, 42.1 %) fue a la tetraciclina y estreptomicina. Además, el 89.5 % (17 aislados) fueron resistentes por lo menos a un antibiótico. No obstante, todas las cepas estudiadas fueron sensibles a la ampicilina. Para detectar la presencia de plásmidos en todas las cepas del estudio, se utilizó el kit de extracción QIAprep Spin Miniprep, obteniéndose que el 63.2 % (12 aislados) presentaban plásmidos, l1 y 1 cepa presentaron un plásmido de 10 000 pb y 6 000 pb respectivamente. Con ello se pudo determinar que el grupo de resistencia a la tetraciclina y estreptomicina, denominado MIC –b (Tet –Str), fue recurrente para los serovares A, C y una cepa No Tipificable; el 87.5% (7 aislados) de este grupo de resistencia presentaron plásmidos. De igual forma, se logró determinar que los serogrupos B y B variante presentaron de forma más común el MIC –a (Tet) y el MIC – c (Kan-Tet-Str), pero sólo el 50 % (4 aislados) de ellos presentaron plásmidos. La determinación de plásmidos en cepas resistentes a las drogas mencionadas permitió conocer y establecer la distribución de las serovariedades resistentes en el país, así como establecer el posible mecanismo de adquisición de resistencia, ya que ésta podría facilitar la propagación de genes de resistencia entre bacterias.

Las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) descritas frecuentemente en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae confieren resistencia a cefalosporinas de espectro extendido y monobactámicos. En un inicio, la descripción de BLEE abarcaba en su mayoría brotes hospitalarios que frecuentemente implicaban K. pneumoniae y BLEE derivadas de SHV-1 o de TEM-1. En los últimos años se ha detectado el incremento de las BLEE de tipo CTX-M. Su difusión en bacterias de la misma o de diferente especie se ha asociado a ciertos elementos genéticos como las secuencias de inserción, transposones y plásmidos. En los últimos años, son muchos los hospitales españoles que han observado un cambio en la prevalencia de las diferentes enzimas detectadas. Por esto, en la “Red Española para la Investigación en Patología Infecciosa” (REIPI) se planteó un estudio multicéntrico que ha permitido conocer y actualizar la evolución y el tipo de BLEE en E. coli y K. pneumoniae en diferentes hospitales de España y descartar, mediante estudios moleculares, la posible expansión clonal de los microorganismos portadores de estas betalactamasas. El presente trabajo formó parte del proyecto Nº 3 (Estudio de la epidemiología clínica y molecular de enterobacterias productoras de BLEE) de la REIPI, en el cual participaron cuatro centros: el Hospital Ramón y Cajal, el Hospital Universitario Son Dureta, el Centro Nacional de Microbiología y el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Se estudiaron un total de 92 cepas de E. coli y 32 de K. pneumoniae aisladas en el primer trimestre del año 2004 en 11 hospitales españoles. La relación clonal entre las cepas se descartó mediante estudios de macrorestricción genómica con la enzima de restricción XbaI. Las BLEE se caracterizaron mediante isoelectroenfoque, PCR y secuenciación. En las cepas de E. coli se observó una gran diversidad clonal en los patrones de restricción obtenidos por PFGE, y un predominio de las betalactamasas CTX-M-14 (45,7%), CTX-M-9 (20,6%) y SHV-12 (21,7%); en cambio, en las cepas de K. pneumoniae se observó una menor diversidad clonal con un predominio de betalactamasas de tipo CTX-M (62,5%) que incluían CTX-M-1, CTX-M-9, CTX-M-14 y CTX-M-15. Se estudiaron los entornos genéticos y perfiles plasmídicos de 58 cepas de E. coli y K. pneumoniae y se determinó el grupo de incompatibilidad de los plásmidos mediante rep typing-PCR, digestión con la enzima S1, campo pulsado, Southern-blot e hibridación con sondas específicas. Se observó gran variabilidad de plásmidos que contienen genes blaBLEE asociados a diferentes entornos genéticos. Los genes bla asociados a una mayor variabilidad plasmídica fueron los blaCTX-M-9, encontrándose en plásmidos de los grupos Inc I1, HI2, FIB y K. Los genes blaSHV-12 se encontraron en plásmidos de los grupos Inc I1, FII, K y HI2. Por otro lado, blaCTX-M-14 se encontró sólo en plásmidos del grupo Inc K. Finalmente, se realizó el estudio epidemiológico mediante Multi Locus Sequence Typing (MLST) y la determinación de los grupos filogenéticos de las cepas de E. coli para determinar la posible asociación entre los diferentes ST, grupos filogenéticos y BLEE. Se observó una gran diversidad de ST, siendo los más comunes el patrón ST131 y los complejos ST10 y ST23; además, las cepas de E. coli pertenecientes al ST131 fueron portadoras de una gran variedad de betalactamasas (CTX-M-15, CTX-M-9, CTX-M-10, CTX-M-14, SHV-12 y CTX-M-1). Por lo tanto, en este estudio se observó una mayor diversidad de BLEE que en un estudio multicéntrico del año 2000, siendo estas BLEE vehiculadas por elementos genéticos como plásmidos y secuencias de inserción, ambos muy diversos dentro del grupo de cepas estudiadas. Por otro lado no se observó asociación entre los diferentes tipos de MLST, los grupos filogenéticos hallados y las BLEE que portaban las cepas de E. coli.
Extended-spectrum beta-lactamases (ESBL), described frequently in Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae confer resistance to extended spectrum cephalosporins and monobactams. ESBL are a heterogeneous group of enzymes that were initially described in hospital outbreaks of K. pneumoniae, and derivates of the SHV-1 and TEM-1 were the most common. In recent years, detection of the the CTX-M type has become more frequent. The spread of ESBL in bacteria of the same or different species has been associated with genetic elements such as insertion sequences, transposons and plasmids. The increase in the prevalence of ESBL-producing microorganisms has been reported by several authors, both in Spain and internationally. For this reason, the Spanish Network for Research on Infectious Pathology (REIPI) recognized the need for a multicenter study. Based on the findings, it was possible to identify and update the progress and the type of ESBL in E. coli and K. pneumoniae in several Spanish hospitals. Furthermore, molecular studies ruled out the possible clonal spread of ESBL-producing microorganisms. The present study was conducted as Project No. 3 (Clinical epidemiology and molecular characterization of ESBL-producing enterobacteria) of the REIPI. It involved four centers: Hospital Ramon y Cajal, Hospital Universitario Son Dureta, National Center for Microbiology and Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. A total of 92 strains of E. coli and 32 K. pneumoniae isolated from 11 Spanish hospitals in 2004 were analyzed. The clonal relationship between strains was ruled out by genomic studies comparing the XbaI-PFGE patterns. The ESBL were characterized by isoelectric focusing, PCR and sequencing. E. coli showed a high clonal diversity in the restriction patterns obtained by PFGE, and a predominance of the enzymes CTX-M-14 (45.7%), CTX-M-9 (20.6%) and SHV-12 (21.7%), whereas K. pneumoniae had a lower clonal diversity with a predominance of the enzymes CTX-M type (62.5%) involving CTX-M-1, CTX-M-9, CTXM- 14 and CTX-M-15. We then studied the genetic environments and plasmid profiles of 58 strains of E. coli and K. pneumoniae and determined the incompatibility group of plasmids by rep typing, S1 enzyme digestion, pulsed field gel electrophoresis, southern-blot and hybridization with specific probes for each incompatibility group. As a result there was a large variability of plasmids containing blaESBL genes associated with different genetic environments. The gene with the greatest plasmid variability was blaCTX-M-9, associated to Inc groups I1, HI2, FIB and K. The blaSHV-12 gene was found in plasmids of groups Inc I1, FII, K and HI2. However, blaCTX-M-14 was found only on IncK plasmids. In a third phase of the study, the National Microbiology Center in Spain performed the Multi Locus Sequence Typing (MLST) and determined the phylogenetic groups of strains of E. coli to determine the possible association between ST, phylogenetic groups and ESBL. A wide variety of MLST were detected, and the most common patterns were ST131 and ST10 and ST23 complexes. In addition, strains of E. coli ST131 carried a variety of betalactamase (CTX-M-15, CTX-M-9, CTX-M-10, CTX-M-14, SHV-12 and CTX-M-1). Regarding the phylogenetic groups, we found that ST10 and ST23 complexes were linked to phylogenetic group A, whereas the pattern ST131 was related to the virulent extraintestinal group B2. In conclusion, this study identified a greater variety of ESBL than observed in the multicenter study of 2000. These ESBL were transported by genetic elements such as plasmids and insertion sequences which were very diverse within the group of strains studied. We did not detect an association between the different types of MLST, the filogenetic groups and the ESBL-producing E. coli.

La transferencia horizontal de genes (HGT) ha sido uno de los temas más debatidos en biología evolutiva durante las últimas dos décadas debido a que esto ha desafiado considerablemente nuestra visión acerca de la historia evolutiva de los genomas. En el caso de organismos procariotas como las bacterias, la adquisición de genes de otros individuos alejados filogenéticamente les ha permitido producir genomas extraordinariamente heterogéneos y dinámicos cambiando por tanto, la ecología y la patogenicidad de las especies bacterianas (Maiden 1998; Gogarten et al., 2002; Ochman et al., 2000). En eucariotas también se ha registrado la ocurrencia de eventos de HGT, los cuales incluyen a un gran número de genes provenientes de varios donadores en los rotíferos de la clase Bdelloidea (Gladyshev et al., 2008) o la transferencia de genes de la bacteria intracelular Wolbachia dentro del genoma de sus hospederos artrópodos (Hotopp et al., 2007). En plantas, el modelo mejor conocido sigue siendo el del género Agrobacterium cuyo mecanismo de infección involucra la transferencia e integración de una región del plásmido Ti al genoma de la célula vegetal. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos de la biología vegetal, agricultura y biotecnología. Sin embargo, el descubrimiento de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ri de Agrobacterium rizhognenes en el genoma de especies del género Nicotiana (White et al., 1983; Furner et al., 1986), Daucus carota “zanahoria” (Spano et al., 1982) y Convulvus arvensis (Tepfer, 1982) han evidenciado que la ocurrencia de este tipo de eventos actúan como una fuerza significativa en la evolución de genomas eucariotas (Richardson y Palmer, 2007; Bock, 2010; Talianova y Janousek, 2011). La importancia de estos hallazgos incrementa la necesidad de realizar más investigaciones para entender el mecanismo de flujo horizontal de genes a través de bacterias en la evolución de plantas superiores, por lo que el presente trabajo de tesis pretende identificar y caracterizar la presencia de secuencias homólogas al T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium spp. en el genoma de Ipomoea batatas (L.) Lam “camote” y especies silvestres relacionadas, con el fin de evidenciar la ocurrencia de eventos de HGT en este género y el posible impacto de este hallazgo en su evolución.
Tesis

Las bacterias del género Acidithiobacillus son quimiolitotróficas que crecen en ambientes ácidos, especialmente en drenajes ácidos de minas con metales pesados. Aceleran la disolución oxidativa de minerales azufrados facilitando la recuperación de metales de importancia comercial mediante la biolixiviación. Son útiles en la biorremediación de ambientes contaminados con metales tóxicos, como por ejemplo el arsénico, por su capacidad para oxidar y reducir metales. Varias de estas características y otras necesarias para adaptarse a ambientes extremos están codificadas en plásmidos que están relativamente poco estudiados. El objetivo fue caracterizar comparativamente los genomas de los plásmidos de las cepas Acidithiobacillus ferrivorans PQ510 y Acidithiobacillus ferrooxidans PQ506 aisladas de aguas ácidas de zonas mineras de Cerro de Pasco, Perú. Los plásmidos fueron purificados y enviados para su secuenciamiento. Se hizo el ensamblaje, la anotación y el análisis comparativo de las secuencias plasmídicas de ambas cepas. En A. ferrivorans PQ510 se encontraron tres plásmidos, uno de 28369 pb (denominado pAfPQ510-1), otro de 16745 pb (denominado pAfPQ510- 2), y el tercero de 12365 pb (denominado pAfPQ510-3), los cuales presentan genes implicados en proteger a la célula del estrés oxidativo, en la supervivencia en ambientes extremos y en la replicación, mantenimiento y movilización del plásmido. En A. ferrooxidans PQ506 se encontró un plásmido de 14204 pb, denominado pAfPQ506-1, que porta genes de resistencia a arsénico conformando el operón arsADCRB y genes codificantes de otras proteínas, como disulfuro óxidorreductasa dependiente de FAD, proteína hipotética con dominio CBS, proteínas de replicación, de movilización y proteínas hipotéticas. Estos genes probablemente contribuyen a la resistencia al arsénico y a la replicación, mantenimiento y movilización del plásmido. Los genes del operón arsADCRB pueden haber sido adquiridos por transferencia genética horizontal en el ambiente extremo en el que habitan estas especies. El hallazgo de este operón en pAfPQ506-1 es el primer reporte de genes de resistencia a arsénico en plásmidos de A. ferrooxidans. El análisis comparativo del operón arsADCRB con diversos plásmidos y cromosomas de bacterias (publicados en bases de datos GenBank y servidor RAST), reveló que tenían una identidad elevada con genes ars de cepas de Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrivorans y Acidithiobacillus ferrooxidans. La generación de conocimientos a nivel molecular de estos plásmidos es importante para desarrollar métodos de biorremediación de ambientes contaminados con metales pesados y mejorar los procesos de biolixiviación, mediante próximas investigaciones.

Doctor en Ciencias mención Microbiología
Piscirickettsia salmonis es una bacteria patógena intracelular facultativa que causa la Septicemia Rickettsial de Salmónidos (SRS). Esta bacteria coloniza diversos tejidos y órganos, lo que culmina con la septicemia y muerte del animal. Es capaz de sobrevivir al interior de macrófagos, y se multiplica en ellos al interior de vacuolas replicativas unidas a la membrana celular. Esta forma de replicación es similar a la observada en bacterias relacionadas filogenéticamente, como las del género Francisella, Coxiella y Legionella. Los patógenos de estos géneros además comparten la presencia de plásmidos que se relacionan con la virulencia de la cepa que los posee, y codifican factores de virulencia (FdeV) como el sistema de secreción Dot/Icm, el cual ha sido descrito en P. salmonis. Mediante secuenciación, se han identificado de plásmidos en P. salmonis, cuya función no ha sido estudiada. En este trabajo se analizaron las secuencias codificantes contenidas en 4 plásmidos de P. salmonis LF-89, se identificaron genes de replicación y mantención, profagos, sistemas toxina-antitoxina, y FdeV. Estos probables FdeV tienen homólogos en todas las cepas secuenciadas de P. salmonis y se expresan en condiciones de infección en cultivos celulares SHK-1 y ASK derivados de Salmo salar y en cultivos primarios de riñón (CPR) de pez cebra (Danio rerio), utilizado como un modelo alternativo de infección. En todos ellos P. salmonis fue capaz de infectar, disminuyó la viabilidad celular y permaneció por al menos 12 días al interior de las líneas celulares, y 5 días en los CPR, según se observó por inmunofluorescencia. En las células de salmón, la bacteria causó un aumento en la expresión de il8, il10 e il12, y una disminución en los transcritos de ifn-γ, generando un ambiente antiinflamatorio. En los CPR infectados, generó un ambiente proinflamatorio producto de un aumento de la expresión de il6, ifn-γ y nos2a, aunque también se observó replicación de P. salmonis en ellos. Esto sugiere que los cultivos celulares responden de forma distinta a la infección por esta bacteria. En P. salmonis aumentó la expresión de genes relacionados sistemas de secreción (Dot/Icm y posiblemente la maquinaria del flagelo), toxinas y proteínas secretadas y genes plasmidiales, lo que indica que los plásmidos cumplen un rol en la infección bacteriana. Destacó la sobreexpresión de 3 copias pipB2, y la expresión diferencial de ficD, que aumentó significativamente sólo en células SHK-1, lo que se correlaciona con la formación de grandes vacuolas citoplasmáticas sólo en este tipo celular.
Piscirickettsia salmonis is a facultative intracellular pathogen, and the etiological agent of Salmonid Rickettsial Septicemia (SRS). This bacterium colonizes fish tissues and organs, causing septicemia and death of the animal. P. salmonis is able to survive inside the macrophages, and replicates in citoplasmic vacuoles attached to the cell membrane. This form of replication is similar to that observed in phylogenetically related bacteria, such as Francisella, Coxiella and Legionella. Pathogens of these genera also contains plasmids that are implicated in the virulence of the strain. These plasmids encode virulence factors (VF) such as the Dot / Icm secretion system, which has been also described in P. salmonis. After long read sequencing of P. salmonis genome, four distinct plasmid sequences were predicted in P. salmonis LF-89 strain, but their function is unknown. In this work, we analyzed the coding sequences of P. salmonis LF-89 plasmids and identified replication and maintenance genes, profagos, toxin-antitoxin systems, and VFs. Homologous genes were identified in all P. salmonis sequenced strains and the putative VFs were expressed in infected salmon cells (SHK-1 and ASK cultures), and in infected primary cell cultures derived from zebrafish kidney (ZFPCC), used as an alternative infection model. In those cultured cell types, P. salmonis was able to infect, decreased cell viability and remained inside the cells for at least 12 days for the cell lines, and 5 days for the ZFPCC, as observed by immunofluorescence assays. In salmon cells, the bacterium caused an increase expression of il8, il10 and il12, and a down-regulation of ifn-γ, generating an anti-inflammatory environment. Although bacterial replication occured in the infected ZFPCC, P. salmonis generated a proinflammatory environment, as a result of the up-regulation of il6, ifn-γ and nos2a. This suggests that cell cultures respond in different ways to P. salmonis infection. During infection, genes related to secretion systems (Dot / Icm and possibly the flagellum structure), toxins and secreted proteins and plasmid genes were overexpressed in the bacteria. These results suggests that P. salmonis plasmids have an important role in bacterial infection. In particular, the overexpression of three pipB2 gene copies, and the differential expression of ficD, which increased significantly only in SHK-1 cells, correlates with the formation of large cytoplasmic vacuoles that took place only in this cell type.
• Beca de Doctorado Nacional CONICYT año 2013, número 21130717, Becas complementarias Pasantía en el Extranjero, y beneficios adicionales de Gastos Operacionales y Extensión de Beca. • Proyecto Fondecyt 1120209 a cargo del Dr. Francisco P. Chávez. • Proyecto Fondecyt 1160802 a cargo de la Dra. Verónica Cambiazo. • FONDAP 15090007, Centro de Regulación del Genoma (CRG).
diciembre 2018

Identifica y determina la prevalencia de los genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like y blaOXA-58-like, que codifican las carbapenemasas de tipo OXA, las cuales son consideraras clínicamente relevantes en el Acinetobacter baumannii. Se analizaron 51 aislamientos de Acinetobacter baumannii con perfil de resistencia a carbapenémicos provenientes del Laboratorio Clínico de un Hospital Nacional de Referencia en Lima de diciembre 2017 – marzo 2018. Se determinó fenotípicamente la presencia de carbapenemasas por el método de inactivación de los carbapenémicos seguido de la identificación genotípica de los genes del tipo OXA de mayor importancia clínica la cual se realizó por PCR multiplex los genes blaOXA-23-like, blaOXA-24-like y blaOXA-58-like. Se obtuvieron fenotípicamente 51/51 (100%) pruebas positivas para la presencia de carbapenemasas en las cuales se identificaron genéticamente la presencia de 38/51 (74,5%) blaOXA-24- like y 5/51 (9,8%) blaOXA-58-like. Un solo gen en 33/51 (64,7%) cepas corresponden a blaOXA-24-like y 2 genes en 5/51 (9,8%) cepas corresponden a blaOXA-24-like y blaOXA-58-like; no se detectó la presencia de genes codificantes blaOXA-23-like. Se concluye que el 100% de las cepas recolectadas, evaluadas a través del método MIC*, son productoras de enzimas carbapenemasas; así mismo el 38/51 (74,5%) de estas cepas portaban genes codificantes de blaOXA- 24-like y blaOXA-58-like siendo el gen blaOXA-24-like el más prevalente. Finalmente en el presente estudio no se detectó la presencia de genes codificantes blaOXA-23-like.
Tesis

La presencia de genes plasmídicos juega un rol importante en la diseminación de mecanismos de resistencia bacteriana, poniendo en riesgo al tratamiento con antimicrobianos. El gen qnrB es un gen plasmídico que actúa a nivel de las topoisomerasas bacterianas, permitiendo que se seleccionen mecanismos de alto nivel de resistencia bacteriana a quinolonas. Este gen puede transferirse junto a genes responsables de las betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y otros mecanismos de resistencia bacteriana, por lo que estarían causando multirresistencia bacteriana y disminuyendo las opciones terapéuticas. El estudio es prospectivo, observacional, descriptivo y transversal. Se buscó determinar la frecuencia del gen qnrB y perfil de susceptibilidad a quinolonas en Escherichia coli productoras de BLEE aislados de urocultivos en el Hospital Nacional Docente Madre Niño “San Bartolomé”, 2018. Se estudiaron 82 aislados de Escherichia coli productoras de BLEE que fueron obtenidos de urocultivos del HONADOMANI “San Bartolomé” durante el periodo junio – agosto del 2018. A todos los aislados se les realizó la prueba de susceptibilidad a quinolonas y posteriormente se realizó la detección gen qnrB mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Encuentra que el gen qnrB fue encontrado en 9 de los 82 aislados (10,90%). El 66,67% de los aislados que presentaron el gen qnrB, fue resistente a almenos una quinolona. Todos los aislados que presentaron el gen qnrB fueron resistentes a cefotaxima en el 100%, sin embargo, fueron sensibles a aminoglucósidos y carbapenémicos. Concluye que el gen qnrB es frecuente en el 10,9% de los aislados de Escherichia coli productoras de BLEE y el perfil de susceptibilidad de estos fue resistente en el 77,78% para quinolonas de primera generación y levofloxacino; mientras que el 66,67% del total de aislados fueron resistentes a quinolonas de segunda y cuarta generación.

En aquest treball s’ha caracteritzat una col·lecció de 150 soques de C. jejuni de diferents orígens: 50 aïllaments provinents d’humans, 50 aïllaments provinents de pollastres d’engreix i 50 aïllaments provinents de diferents espècies d’aus salvatges. L’objectiu general d’aquesta caracterització és proporcionar informació sobre els factors de virulència i l‘impacte de la transferència horitzontal en l’aparició de variants de C. jejuni amb capacitat patogènica en humans. Per la caracterització de la col·lecció s’han contemplat dos objectius principals dels que en deriven altres específics. 1. Determinar la prevalença de 10 gens relacionats amb la virulència de C. jejuni en la nostra col·lecció (cdtABC, cadF, ciaB, htrA, hcp, virB11, wlaN i cgtB) i determinar possibles diferències entre les poblacions. 1.1. Determinar les diferents variants presents als gens wlaN i cgtB, si existeix una regulació dependent de temperatura i si presenten alguna relació amb la capacitat d’invasió de C. jejuni. 1.2. Determinar si existeix una regulació dependent de temperatura en l’expressió del sistema de secreció de tipus VI mediada pel gen hcp. 2. Caracteritzar la presència d’ADN plasmídic en els aïllaments de C. jejuni de la nostra col·lecció. 2.1. Determinar si existeixen plasmidis altament distribuïts atenent a la similaritat en el perfil de restricció. 2.2. Determinar la localització del gen tet(O), responsable de la resistència a tetraciclina, en aquelles soques aïllades d’humans que presenten plasmidis. 2.3. Estudiar la mobilització del determinant de resistència tet(O) per conjugació, i si existeix una regulació dependent de temperatura en aquest procés.

M. pneumoniae is one of the smallest self-replicating organisms. Many organism wide studies have been performed on M. pneumoniae and provide a wealth of information on the bacteria. However, the genetic tools to manipulate and engineer this microorganism are currently insufficient. Therefore one focus of this project is to extend the genetic toolbox for M. pneumoniae. In parallel, we developed first a proof of concepts study for the use of M. pneumoniae as therapeutical vector. For this purpose the secretome of M. pneumoniae has been investigated to define all secretion signals in this bacterium. This knowledge was used to modify M. pneumoniae to secrete three proteins with therapeutical applications. Further we could show for two of the proteins that they are active after secretion and therefore that M. pneumoniae can be used to engineer therapeutic vectors for treating lungs diseases.
M. pneumoniae es uno de los microrganismos auto-replicativos más pequeños descritos hasta el momento. En nuestro grupo se ha empleado como modelo en Biología de Sistemas y se ha caracterizado a diferentes niveles (genoma, transcriptoma, proteoma...etc). Sin embargo, las herramientas genéticas para manipular y emplear este microorganismo como modelo en Bilogía Sintética, son insuficientes. Por lo tanto, uno de los objetivos de este proyecto es ampliar el repertorio de herramientas moleculares de M. pneumoniae. En paralelo, hemos desarrollado por primera vez una “prueba de concepto” para el uso de M. pneumoniae con finalidades terapéuticas. Con este propósito, primero hemos determinado el secretoma de M. pneumoniae que ha permitido identificar todas las señales de secreción de esta bacteria. Posteriormente, se ha aplicado este conocimiento para obtener cepas de M. pneumoniae capaces de secretar tres proteínas con aplicaciones terapéuticas. Hemos demostrado que dos de las tres proteínas son activas tras la secreción, abriendo nuevas perspectivas en el uso de M. pneumoniae para el tratamiento de enfermedades pulmonares.

Els plasmidis són molècules d’ADN circular extracromosòmiques amb capacitat de replicació autònoma i, són descrits com els principals promotors de la disseminació de gens de resistència a antimicrobians. Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae, són freqüents agents causals d’infeccions, importants pel seu caràcter multirresistent. En aquests bacteris, les betalactamases constitueixen un dels mecanismes de resistència més difosos mitjançant plasmidis. Mitjançant l’estudi i comparació del contingut plasmídic en bacteris d’individus sans i de pacients, l’objectiu va ser determinar les diferències o similituds d’aquests plasmidis entre les dues poblacions, per tal d’inferir en el seu origen i evolució en els soques causants d’infecció. Per a això, es van aïllar soques d’E. coli (n = 244) i K. pneumoniae (n = 115) de 150 mostres fecals d’individus sans i de 202 pacients amb bacterièmia. Es va realitzar un estudi de sensibilitat a antimicrobians mitjançant disc difusió, es van identificar les soques multirresistents i es van caracteritzar, per PCR i seqüenciació, els gens codificants de BLEE, AmpC i carbapenemases. L’estudi de plasmidis es va realitzar utilitzant la tècnica de PBRT i, es van subtipificar els plasmidis IncF, IncI1 i IncN mitjançant pMLST per a la seva diferenciació dins d’un mateix grup d’incompatibilitat. La localització dels gens de resistència i la definició de la fórmula FAB dels plasmidis IncF, es va realitzar mitjançant la tècnica de Southern-blot i hibridació. Un 29,2% de les soques de mostra clínica front d’un 10,8% en individus sans van resultar multirresistents. La prevalença de soques d’E. coli clíniques productores de BLEE va ser de 17,2% i 5% d’AmpC i, en K. pneumoniae, de 16,5% i 1%, respectivament, a més a més d’un 1,9% de carbapenemases . D’altra banda, es va observar una prevalença del 4,7% de portadors sans d’E. coli productores de BLEE i un 2,7% d’AmpC. Ambdues poblacions han sofert un augment en la detecció de soques productores d’aquests enzims sent també, en ambdós casos, la CTX-M-15 i la CMY-2 les betalactamases més freqüents. Els resultats del PBRT van mostrar com el contingut plasmídic de les dues poblacions seguia una mateixa tendència sense diferències significatives destacables. L’excepció es va observar en els replicons L, M, A/C i N, els quals només es van detectar en les soques de mostra clínica. A més, alguns d’aquests plasmidis amb replicó L o N van ser detectats en associació a gens blaBLEE. La subtipificació dels plasmidis, ens va permetre observar l’existència d’una gran diversitat de secuenciotips dins d’un mateix grup d’incompatibilitat. Dins dels plasmidis IncI1 es va observar una gran diferència entre els ST identificats en les soques d’individus sans i pacients. Només els ST12 i ST36 es van identificar en ambdues poblacions d’E. coli, i tots els ST12 en associació amb el gen blaCMY-2. Per contra, tot i que també es va detectar una gran diversitat de RST entre els plasmidis IncF, aquells detectats amb més freqüència, van estar presents en ambdues poblacions i, no es va identificar cap fórmula FAB destacable per la seva associació a gens bla. En conclusió, el contingut plasmídic en la població de soques clíniques és un reflex del contingut en soques d’individus sans però, certs plasmidis, només es detecten en soques causants d’infecció, suggerint una millor adaptació a ambients sotmesos a pressió selectiva. Secuenciotips IncI1 com el ST12, poden ser considerats plasmidis epidèmics per la seva alta prevalença i freqüència en associació amb gens blaCMY-2. En canvi, els plasmidis IncF semblen haver adquirit diferents gens de resistència a antimicrobians de forma aleatòria, suggerint que tota la família de plasmidis IncF és potencialment susceptible a adquirir i disseminar gens de resistència.
Los plásmidos son moléculas de ADN circular extracromosómicas con capacidad de replicación autónoma y, se describen como principales promotores de la diseminación de genes de resistencia a antimicrobianos. Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, son frecuentes agentes causales de infecciones, importantes por su carácter multirresistente. En estas bacterias, las betalactamasas constituyen uno de los mecanismos de resistencia más difundidos mediante plásmidos. Mediante el estudio y comparación del contenido plasmídico en bacterias de individuos sanos y de pacientes, el objetivo fue determinar las diferencias o similitudes de estos plásmidos entre ambas poblaciones, con el fin de inferir en su origen y evolución en las cepas causantes de infección. Para ello, se aislaron cepas de E. coli (n=244) y K. pneumoniae (n=115) de 150 muestras fecales de individuos sanos y de 202 pacientes con bacteriemia. Se realizó un estudio de sensibilidad a antimicrobianos mediante disco difusión, se identificaron las cepas multirresistentes y se caracterizó, por PCR y secuenciación, los genes codificantes de BLEE, AmpC y carbapenemasas. El estudio de plásmidos se realizó utilizando la técnica de PBRT y, se subtipificaron los plásmidos IncF, IncI1 e IncN mediante pMLST para su diferenciación dentro de un mismo grupo de incompatibilidad. La localización de los genes de resistencia y la definición de la fórmula FAB de los plásmidos IncF, se realizó mediante la técnica de Southern-blot e hibridación. Un 29,2% de las cepas de muestra clínica frente a un 10,8% en individuos sanos resultaron multirresistentes. La prevalencia de cepas de E. coli clínicas productoras de BLEE fue de 17,2% y 5% de AmpC y, en K. pneumoniae, de 16,5% y 1%, respectivamente, además de un 1,9% de carbapenemasas. Por otro lado, se observó una prevalencia del 4,7% de portadores sanos de E. coli productoras de BLEE y un 2,7% de AmpC. Ambas poblaciones han sufrido un aumento en la detección de cepas productoras de estas enzimas siendo también, en ambos casos, la CTX-M-15 y la CMY-2 las betalactamasas más frecuentes. Los resultados del PBRT mostraron como el contenido plasmídico de ambas poblaciones seguía una misma tendencia sin diferencias significativas destacables. La excepción se observó en los replicones L, M, A/C y N, los cuales solo se detectaron en las cepas de muestra clínica. Además, algunos de estos plásmidos con replicón L o N fueron detectados en asociación a genes blaBLEE. La subtipificación de los plásmidos, nos permitió observar cómo dentro de un mismo grupo de incompatibilidad existe una gran diversidad de secuenciotipos. Dentro de los plásmidos IncI1 se observó una gran diferencia entre los ST identificados en las cepas de individuos sanos y pacientes. Solo los ST12 y ST36 se identificaron en ambas poblaciones de E. coli, y todos los ST12 en asociación con el gen blaCMY-2. Por el contrario, a pesar de que también se detectó una gran diversidad de RST entre los plásmidos IncF, aquellos detectados con mayor frecuencia, estuvieron presentes en ambas poblaciones y, no se identificó ninguna fórmula FAB destacable por su asociación a genes bla. En conclusión, el contenido plasmídico en la población de cepas clínicas es un reflejo del contenido en cepas de individuos sanos, pero hay ciertos plásmidos, que solo se detectan en cepas causantes de infección, sugiriendo una mejor adaptación a ambientes sometidos a presión selectiva. Secuenciotipos IncI1 como el ST12 pueden ser considerados plásmidos epidémicos por su alta prevalencia y frecuencia en asociación con genes blaCMY-2. En cambio, los plásmidos IncF parecen haber adquirido distintos genes de resistencia a antimicrobianos de forma aleatoria, sin ningún RST destacable por ello; sugiriendo que toda la familia de plásmidos IncF es potencialmente susceptible a adquirir y diseminar genes de resistencia.
Plasmids are extracromosomal circular DNA molecules that can replicate autonomously. They are globally described as primary promoters for the dissemination of antimicrobial resistance genes. Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae have been described as critical propriety microorganisms due to their increasing detection as multiresistant bacteria. In these bacteria, beta-lactamases constitute one of the most disseminated resistance-providing mechanisms through plasmids. Through the study and comparison of the plasmid content in the commensal microbiota from healthy individuals and patients with bacteriemia, the aim was to determine the differences and similarities of the plasmid content between these two populations, with the purpose to shed light on the origin and evolution of bacteria-causing infection. To achieve that goal, E. coli (n=244) and K. pneumoniae (n=115) strains from 150 faecal samples from healthy individuals and 202 patients with bacteraemia where isolated. An antimicrobial susceptibility testing was performed through the disc diffusion technique, the multiresistant strains were identified and, the blaESBL, blaAmpC and blacarbapenemase genes were characterised by PCR and sequencing approaches. The plasmid study was performed by using the PBRT technique. Plasmids IncF, Incl1 and IncN plasmids, were subtyped by pMLST, to differentiate each of them within the same incompatibility group. The location of the resistance genes was performed by using the Southern blot and hybridisation techniques. The same methodology was used to generate the FAB formula of the IncF plasmids. From the clinical samples, 29.2% of the strains turned out to be multiresistant against 10.8% from healthy individuals. The prevalence of clinical ESBL-producing and AmpC-producing E. coli strains was 17.2% and 5%, respectively. The prevalence of clinical ESBL-producing, AmpC-producing and carbapenemase-producing K. pneumoniae strains was 16.5%, 1% and 1.9%, respectively. Furthermore, 4.7% of the healthy individuals were carriers of ESBL-producing E. coli and 2.7% were carriers of AmpC-producing E. coli. Both populations have suffered an increased detection of strains that produce those enzymes and, in both cases, the beta-lactamases CTX-M-15 and CMY-2 were the most frequent. The PBRT results showed how the plasmid content in both populations kept the same trend without significant differences. The exception was observed in the replicons L, M, A/C and N, which were only detected in strains from clinical samples. What is more, some of these plasmids with L or N repliclon were detected in association with blaESBL genes. The plasmid subtyping, allowed us to observe a great diversity of sequence types (ST) within the same group of incompatibility. Within the Incl1-plasmids, a huge difference between the identified ST in healthy individuals and patient strains was observed. Only ST12 and ST36 were identified in both populations of E. coli. Noticeably, all the ST12 were found in association with the blaCMY-2 gene. In contrast, even though a great diversity of RSTs was detected within the IncF plasmids, those detected at higher rates were present in both populations. Furthermore, no formula was distinguishable by its association with bla genes. In conclusion, the replicon content of clinical strains mirrored that of comensal strains. Nevertheless, there are certain plasmids only detected in infection-causing strains, suggesting a better adaptation to an enviroment subjected to selective presure. IncI1 sequencetypes such as ST12 can be considered epidemic plasmids due to their high prevalence and frequency in association with blaCMY-2. On the other hand, the IncF plasmids have acquired multiple antimicrobial resistace genes randomly, with no evidence that the persitance of a single IncF is responsible for their dissemination. Therfore, the entire IncF family of plasmids is potentially capable of acquiring and propagating resitance genes.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
El potencial de autorenovación y diferenciación multilinaje ha generado expectativas respecto del uso de células madres mesenquimales (CMM) para ingeniería tisular y medicina regenerativa. En este sentido es relevante evaluar el potencial de manipulación genética de las CMM. El objetivo del presente estudio fue determinar la eficiencia de transfección del plásmido pTracer/CMV/Bsd mediante la utilización de Lipofectamina LTX en CMM aisladas desde medula ósea bovina. CMM aisladas desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=3) mediante adherencia al plástico, fueron cultivadas en presencia de una combinación en concentraciones crecientes de pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) y de Lipofectamina LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μl/ml). Luego de 24 horas, el número de CMM positivas a la proteína de fluorescencia verde (GFP) fue determinado por conteo visual mediante microscopía de epifluorescencia y confirmado por citometría de flujo. Los niveles de mRNA de GFP en CMM fueron determinados mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La utilización de 750 ng/ml de pTracer/CMV/Bsd y 9 μl/ml de Lipofectamina LTX permitieron alcanzar una mayor proporción de células positivas a GFP (15,7%, P<0,05). La concentración mínima efectiva de blasticidina fue de 2 μg/ml. Cultivos de CMM transfectadas y seleccionadas con blasticidina por 21 días, generaron escasas colonias de CMM positivas a GFP. Estas células expresaron mRNA de GFP con un valor CT de 9,94. En conclusión, a pesar de presentar una baja eficiencia de transfección, es posible incorporar de manera estable el plásmido pTracer/CMV/Bsd utilizando Lipofectamina LTX en CMM bovinas fetales.
The self-renewal and multilineage differentiation potential has generated expectations for the potential use of mesenchymal stem cells (MSC) in tissue engineering and regenerative medicine. In this respect, it is relevant to evaluate the potential for genetic manipulation of MSC. The main objective of the present study was to determine the transfection efficiency of the plasmid pTracer/CMV/Bsd using Lipofectamine LTX in bovine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC). MSC were isolated from bone marrow collected from bovine fetuses (7-9 months of gestation, n=3), based on the capacity to adhere to plastic culture flasks. Thereafter, MSC were cultured in presence of a combination of increasing concentrations of pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) and Lipofectamine LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μL/mL). After 24 hours, the number of GFP-positive MSC was determined by visual counting using an epifluorescense microscope and corroborated by flow cytometry. The levels of GFP mRNA were determined by quantitative PCR (Q-PCR). The use of 750 ng/mL of pTracer/CMV/Bsd and 9 μL/mL of Lipofectamina LTX allowed to achieve the highest proportion of GFP-positive MSC (15.7%, P<0.05). The lowest effective blasticidin concentration was of 2 μg/mL. Culture of transfected MSC and selection for 21 days using blasticidin resulted in reduced number of isolated GFP-positive MSC colonies. These cells expressed a GFP mRNA with a CT value of 9.94. In conclusion, despite the low transfection efficiency, it is possible to incorporate a pTracer/CMV/Bsd plasmid using Lipofectamine LTX in MSC isolated from bovine fetuses.
Proyecto Fondecyt 11100205

La resistència a antibiòtics està considerada una de les principals amenaces a la salut pública del segle XXI per la OMS. A causa del seu consum excessiu i incorrecte, els bacteris han desenvolupat mecanismes per fer-les front y així, ser capaços de sobreviure a la seva presència. Quan un bacteri desenvolupa el gen que li dota de resistència, disposa de diversos mecanismes amb el que pot cedir aquesta resistència a bacteris veïns. Aquest procés és conegut com transferència horitzontal de gens, i és la principal causa de la propagació dels gens de resistència a antibiòtics. Podem distingir entre 3 subtipus, sent la conjugació la més comú. La conjugació és la transferència de material genètic des d’un bacteri donant a un altra receptor i requereix contacte directe entre cèl·lules. La seva característica principal és la presència d’un plasmidi conjugatiu. En aquest treball, s’ha estudiat el plasmidi conjugatiu pLS20, del bacteri Gram positiu Bacillus subtilis. És una elecció d’estudi interessant donant que B. subitlis pertany al filo Firmicutes, sent aquest el filo predominant al intestí humà. El intestí humà funciona com un reservori genètic de resistència a antibiòtics. A més, pLS20 té interès biotecnològic degut a la seva existència en B. sutiblis natto, el quin és important en producció alimentària. Entendre com es regula la conjugació i reunir informació sobre les proteïnes que participen al procés conjugatiu és molt important per poder acabar amb la propagació de la resistència a antibiòtics. Per tant, aquesta tesi està centrada en l’estudi estructural i molecular de diverses proteïnes de pLS20. En primer lloc, el circuit regulador que controla la expressió de gens del principal operon conjugatiu ha estat estudiat, en la quina participen Rco, Rap i Phr*. Hem caracteritzat estructuralment el domini de tetramerització de Rco i hem vist que comparteix similitud amb la família de proteïnes p53. A més, hem determinat que Rco té diferents estats de oligomerizació en funció del pH, probablement a causa de la interfície de tetramerització composta per residus carregats. Així mateix, la unió entre Rap i Rco a diferents estequiometries i l’efecte de Phr* en la formació del complex han sigut analitzats per cromatografia de exclusió molecular. Respecte a Rap, s’ha avaluat la possibilitat de regulació creuada amb altres sistemes de Rap per assajos de unió. En segon lloc, hem treballat amb Reg576, una proteïna reguladora que participa en la regulació de gens involucrats en el establiment del plasmidi una vegada transferit a la cèl·lula receptora. Hem identificat al seu lloc d’unió al ADN y hem mutat un residu conservat per concloure que la unió no es veu afectada. D’altra banda, hem obtingut diferents disposicions y grups espacials de la proteïna a més de la que ja està depositada, revelant que Reg576 cristal·litza amb relativa facilitat. Finalment, hem investigat P34, proteïna involucrada en adhesió cel·lular que té un paper igualment important que la regulació del procés conjugatiu. Hem determinat que és una proteïna TIE (tioèster, Isopeptídic, èster) ja que hem caracteritzat estructuralment el seu domini tioèster, denominat TED. Mitjançant la introducció de la mutació de la cisteïna que participa en el enllaç tioèster, no hem observat cap canvi significatiu en l’estructura de la proteïna, però hem mesurat canvis dràstics en la funcionalitat. En definitiva, aquests resultats suposan un important avanç en la comprensió sobre la regulació de la conjugació i el contacte entre cèl·lules per començar la transferència de gens del plasmidi pLS20. Donada la importància de las proteïnes estudiades, no descartem l’opció de utilitzar aquestes proteïnes com futures dianes de fàrmacs per detenir la propagació de la resistència a antibiòtics.
La resistencia a antibióticos está considerada una de las principales amenazas a la salud pública del siglo XXI por la OMS. Debido a su consumo excesivo e incorrecto, las bacterias desarrollan mecanismos para hacerles frente y así, ser capaces de sobrevivir en su presencia. Cuando una bacteria desarrolla el gen que le dota de resistencia, dispone de varios mecanismos para cederlo a las bacterias colindantes. Este proceso es conocido como transferencia horizontal de genes y es la principal causa de la propagación de los genes de resistencia a antibióticos. Podemos distinguir entre 3 subtipos, siendo la conjugación la más común. La conjugación es la transferencia activa de material genético desde una bacteria donante a otra receptora y requiere contacto directo entre células. La característica primordial es la presencia de un plásmido conjugativo. En este trabajo, se ha estudiado el plásmido conjugativo pLS20, de la bacteria Gram positiva Bacillus subtilis. Es una elección de estudio interesante ya que B. subtilis pertenece al filo Firmicutes, siendo este el filo predominante en el intestino humano. El intestino humano funciona como una reserva genética de resistencia a antibióticos. Además, pLS20 tiene interés biotecnológico debido a su existencia en B. subtilis natto, el cual es importante en producción alimentaria. Entender cómo se regula la conjugación y reunir información sobre las proteínas específicas que participan en el proceso conjugativo es muy importante para poder acabar con la propagación de la resistencia a antibióticos. Así, este trabajo está centrado en el estudio estructural y molecular de varias proteínas de pLS20. En primero lugar, se ha estudiado el circuito regulatorio que controla la expresión de genes del principal operon conjugativo, en el cual participan Rco, Rap y Phr*. Hemos caracterizado estructuralmente el dominio de tetramerización de Rco, descubriendo que comparte similitud con la familia de proteínas p53. Además, hemos determinado que Rco posee distintos estados de oligomerización en función al pH, probablemente debido a su interfaz de tetramerización compuesta de residuos cargados. Asimismo, la unión entre Rap y Rco a distintas estequiometrías y el efecto de Phr* en la formación del complejo han sido analizados por cromatografía de exclusión molecular. Respecto a Rap, se ha evaluado la posibilidad de regulación cruzada con otros sistemas de Rap mediante ensayos de unión. En segundo lugar, hemos trabajado con Reg576, una proteína que participa en la regulación de genes involucrados en el establecimiento del plásmido una vez transferido a la célula receptora. Hemos identificado su sitio de unión en el ADN y mutado un residuo conservado para concluir que la unión no se ve afectada. Hemos obtenido diferentes empaqueteamientos cristalinos y grupos espaciales de la proteína además de la que ya está depositada, lo cual revela que Reg576 es una proteína que cristaliza con relativa facilidad. Finalmente, hemos investigado P34, proteína involucrada en adhesión celular que juega un papel igualmente importante que la regulación en el proceso conjugativo. Hemos determinado que es una proteína TIE (tioéster, isopeptídico, éster) ya que hemos caracterizado estructuralmente su dominio tioéster, denominado TED. Mediante la introducción de la mutación de la cisteína que participa en el enlace tioéster, no hemos observado ningún cambio significativo en la estructura de la proteína, sin embargo, hemos medido cambios drásticos en la funcionalidad. En definitiva, estos resultados suponen un importante avance en la comprensión sobre la regulación de la conjugación y el contacto entre células para comenzar la transferencia de genes del plásmido pLS20. Dada la importancia de las proteínas estudiadas, no descartamos la opción de utilizar estas proteínas como futuras dianas de fármacos para detener la propagación de la resistencia a antibióticos.
Antibiotic Resistance is considered one of the most important public health threats of the 21st century by the WHO. Due to human overuse and misuse of antibiotics, bacteria develop new mechanisms to survive in the presence of antibiotics. Once one bacterium has evolved the gene that endows resistance to it, there are several ways by which this trait can pass to neighbouring bacteria. This process is known as horizontal gene transfer and it is the main reason for the spread of antibiotic resistance genes. We can distinguish between three subtypes, conjugation being the most common one. Conjugation is the active transfer of genetic material from a donor bacterium to a recipient bacterium, involving direct cell-to-cell contact. It is characterized by the presence of a conjugative plasmid. In this work, we have studied the pLS20 conjugative plasmid, from Gram positive bacteria Bacillus subtilis. It is an interesting choice of research as Bacillus subtilis belongs to the phylum Firmicutes, which is the predominant pylum in human gut. The human gut has favourable conditions for conjugative gene exchange and therefore is a pool of antibiotic resistance genes. Also, pLS20 has biotechnological interest because of its occurrence in B. subtilis natto, which is important in food production. Understanding how conjugation is regulated and gathering information of the specific proteins that take part in the conjugative process is of extreme importance in order to stop antibiotic resistance spread. Consequently, this work is focused on the structural and molecular study of various pLS20 proteins. Firstly, the regulatory circuit that controls the expression of the genes of the main conjugation operon has been studied, in which Rco, Rap and Phr* take part. We have structurally characterized the tetramerization domain of Rco and realized it shares high structural resemblance with p53 family proteins. Also, we have determined that Rco has different oligomerization states under distinct pHs, probably due to the charged tetramerization interface. Furthermore, binding between Rapp and Rco at different stoichiometries and the effect of Phr* in the complex formation has been analyzed by size exclusion chromatography. With regard to Rap, the possibility of cross-regulation with other Rap systems has been considered and evaluated by binding assays. Secondly, we have studied Reg576, which is also a transcriptional regulator that controls the transctiption of the genes involved in the establishment of the plasmid once it has been transferred to the recipient cell. We have identified its binding region in DNA and mutated a conserved residue of the protein and determined that binding is not affected. Moreover, we have obtained diverse crystal packings and space groups of the proteins, revealing that Reg576 is a protein that tends to crystallize with relative ease. Finally, we have investigated P34, a protein involved in cell adhesion, which plays an equally important part in the overall success of plasmid transfer as does gene regulation. We have determined it is a TIE (thioester, isopeptide, esther) type of protein as we have structurally characterized its TED domain. Also, from the structure of a mutant where the thioester bond-forming cysteine was mutated to a serine, we conclude that there are no significant structural changes. However, we have observed drastic functionality changes: conjugation is inhibited for the mutant. Together, these results bring new important insights into how conjugation in the pLS20 plasmid is regulated and how cells contact each other to start the transfer of the genes. Given the importance of the proteins characterized, we do not discard the option of using these proteins as future drug targets to stop antibiotic resistance spread.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina

Introducción Las primeras cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina (SARM) se detectaron en el Reino Unido en 1960. Posteriormente, se diseminaron por todo el mundo. Al principio, el SARM era un patógeno nosocomial; pero, progresivamente, se fue extendiendo a pacientes no ingresados, la mayoría de ellos relacionados con el sistema sanitario, como es el caso de los residentes geriátricos. A partir del año 2000, se detectaron cepas de SARM comunitario, con características clínicas y microbiológicas peculiares, como la presencia de genes codificantes de la leucocidina de Panton-Valentine (LPV). Uno de los antimicrobianos alternativos para tratar el SARM es la linezolida, pero se han detectado cepas de estafilococos resistentes a este antimicrobiano. Objetivos Estudiar la relación clonal de los aislados de SARM detectados en el Hospital Universitari Son Dureta-Son Espases, hospital de referencia de las Islas Baleares, durante cuatro períodos: 1999-2000, 2002-2004, 2008 y 2012-2013. Comparar la relación clonal de los aislados de SARM del hospital de referencia con los de otros hospitales de Mallorca. Determinar la frecuencia de LPV. Estudiar la prevalencia de la colonización por SARM en exudados nasales y de úlcera de los residentes en el mayor centro geriátrico de Mallorca. Determinar los factores de riesgo de colonización y evaluar su evolución temporal. Estudiar la epidemiología molecular y el mecanismo de resistencia a la linezolida en cepas de SARM, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus hominis, resistentes a este antimicrobiano detectadas en dos hospitales de Mallorca. Metodología Se documentaron todos los pacientes con SARM en muestras clínicas en los cuatro períodos de estudio. La relación clonal se determinó mediante electroforesis en campo pulsado y multilocus sequence typing. Se realizaron diversos ensayos de PCR para la detección de los genes de LPV, tipificación del casete cromosómico estafilocócico mec (SCCmec) y subtipificación del SCCmec tipo IV. En el estudio de prevalencia de SARM en geriátricos, se recogieron muestras de exudado nasal y de úlcera durante los meses de octubre y noviembre de 2005. Para determinar los factores de riesgo de colonización, se cumplimentó un formulario estandarizado con datos clínicos de cada participante. Se realizó seguimiento clínico y de la colonización a los 8, 12 y 18 meses, tanto en los pacientes colonizados por SARM (casos), como en un grupo de residentes no colonizados (controles). En los aislados de SARM, S. epidermidis y S. hominis resistentes a la linezolida, se realizaron diversos ensayos de PCR y de transferencia del plásmido. Se procedió a la caracterización del plásmido de multirresistencia (pERGB) tras la clonación de los distintos fragmentos en pUCP24. Resultados y conclusiones La situación epidemiológica de SARM en nuestro hospital se caracterizó por la presencia endémica de 3 clones mayoritarios en 1999-2004 (ST125-IVc, ST228-I y ST22-IVh). Los clones ST125-IVc y ST228-I predominaban también en muchos hospitales españoles, mientras que el ST22-IVh (EMRSA-15), prevalente en el Reino Unido, era prácticamente inexistente en el territorio peninsular español. Estos tres clones predominaban en otros hospitales de Mallorca. En 2008, un 7% de las cepas de SARM hospitalarias fueron productoras de LPV. La prevalencia de SARM en exudados nasales de los residentes geriátricos fue del 8%, relativamente baja y generalmente transitoria. Los factores de riesgo asociados con la colonización fueron el ingreso hospitalario previo, la enfermedad vascular, la diabetes, la presencia de úlceras de decúbito y el tratamiento antibiótico previo. La gran mayoría de residentes colonizados no desarrollaron una infección subsiguiente por SARM. Se detectó la presencia de dos clones distintos, también encontrados en el hospital de referencia. Por primera vez, se describe un plásmido de multirresistencia conjugativo portador de los genes cfr, ant(4’)-Ia, tet(L) y dfrK en S. aureus y S. epidermidis que determina la resistencia a la linezolida y a otros antibióticos. Todas las cepas de S. hominis resistentes a la linezolida pertenecían al mismo clon y presentaban la mutación G2576T en el gen ARNr 23S.
Introducció Les primeres soques de Staphylococcus aureus resistents a la meticil·lina (SARM) es detectaren al Regne Unit l’any 1960. Posteriorment, es disseminaren per tot el món. Al començament, el SARM era un patogen nosocomial; però, progressivament, es va estendre a malalts no ingressats, la majoria d’ells relacionats amb el sistema sanitari, com ara els residents geriàtrics. A partir de l’any 2000, es detectaren soques de SARM comunitari, amb característiques clíniques i microbiològiques peculiars, com la presència de gens codificants de la leucocidina de Panton-Valentine (LPV). Un dels antimicrobians alternatius per tractar el SARM és la linezolida, encara que també s’han detectat soques d’estafilococs resistents a aquest antimicrobià. Objectius Estudiar la relació clonal dels aïllats de SARM detectats a l’Hospital Universitari Son Dureta-Son Espases, hospital de referència de les Illes Balears, durant quatre períodes: 1999-2000, 2002-2004, 2008 i 2012-2013. Comparar la relació clonal dels aïllats de SARM de l’hospital de referència amb els d’altres hospitals de Mallorca. Determinar la freqüència de LPV. Estudiar la prevalença de la colonització per SARM en exsudats nasals i d’úlcera dels residents al centre geriàtric més gran de Mallorca. Determinar els factors de risc d’aquesta colonització i avaluar-ne l’evolució temporal. Estudiar l’epidemiologia molecular i el mecanisme de resistència a la linezolida en soques de SARM, Staphylococcus epidermidis i Staphylococcus hominis, resistents a aquest antimicrobià detectades a dos hospitals de Mallorca. Metodologia Es documentaren tots els malalts amb SARM detectat en mostres clíniques durant els quatre períodes d’estudi. La relació clonal es determinà mitjançant electroforesi en camp polsant i multilocus sequence typing. Es dugueren a terme diferents assajos de PCR per a la detecció dels gens de LPV, tipificació del casset cromosòmic estafilocòccic mec (SCCmec) i subtipificació de l’SCCmec tipus IV. A l’estudi de prevalença de SARM en geriàtrics, es recolliren exsudats nasals i d’úlcera durant els mesos d’octubre i novembre de 2005. Per determinar els factors de risc de colonització, s’emplenà un formulari estandarditzat amb les dades clíniques de cada participant. Es va fer el seguiment clínic i de la colonització als 8, 12 i 18 mesos, tant en els malalts colonitzats per SARM (casos), com en un grup de residents no colonitzats (controls). En els aïllats de SARM, S. epidermidis i S. hominis resistents a la linezolida, s’efectuaren diversos assajos de PCR i de transferència del plasmidi. Es procedí a la caracterització del plasmidi de multiresistència (pERGB) després de la clonació dels diferents fragments en pUCP24. Resultats i conclusions La situació epidemiològica de SARM al nostre hospital es caracteritza per la presència endèmica de 3 clons majoritaris en 1999-2004 (ST125-IVc, ST228-I i ST22-IVh). Els clons ST125-IVc i ST228-I predominaven també en molts hospitals espanyols mentre que el ST22-IVh (EMRSA-15), prevalent al Regne Unit, era pràcticament inexistent en el territori peninsular espanyol. Aquests tres clons van ser els més freqüents en els altres hospitals de Mallorca. L’any 2008, un 7% de les soques de SARM de l’hospital foren productores de LPV. La prevalença de SARM en exsudats nasals dels residents geriàtrics fou del 8%, relativament baixa i generalment transitòria. Els factors de risc associats amb la colonització foren l’ingrés hospitalari previ, la malaltia vascular, la diabetis, la presència d’úlceres de decúbit i el tractament antibiòtic previ. La gran majoria dels residents colonitzats no desenvoluparen una infecció subsegüent per SARM. Es detectà la presència dos clons diferents, trobats també a l’hospital de referència. Per primera vegada, es descriu un plasmidi de multiresistència conjugatiu portador dels gens cfr, ant(4’)-Ia, tet(L) i dfrK en S. aureus i S. epidermidis que determina la resistència a la linezolida i a altres antimicrobians. Totes les soques de S. hominis resistents a la linezolida pertanyien al mateix clon i presentaven la mutació G2576T al gen ARNr 23S.
Introduction Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains were first detected in the United Kingdom in the sixties of the past century, and then spread all over the world. At the beginning, MRSA behaved as nosocomial pathogen but progressively was detected outside the hospital, mostly in health-care associated patients. Since year 2000, community-acquired MRSA strains showing a particular clinical and microbiological profile emerged; most of these strains typically contain two genes encoding the Panton-Valentine leucocidin (PVL). Linezolid is a useful alternative for treating patients with staphylococcal infections but resistance to this antimicrobial has arisen. Objectives To study the clonal relatedness of MRSA isolates detected at the Hospital Universitari Son Dureta-Son Espases, along four periods: 1999-2000, 2002-2004, 2008, and 2012-2013; to compare the clonal relatedness of these MRSA isolates with those from other Majorcan hospitals; to determine the frequency of PVL gene detection in the MRSA strains. To study the prevalence of MRSA colonization (nasal and ulcer swabs) in the residents admitted at the major geriatric center of Majorca. To determine the risk factors for colonization, and to evaluate its evolution in over time. To study the molecular epidemiology and the mechanisms of resistance in linezolid-resistant MRSA, Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus hominis strains detected at two Majorcan hospitals. Methodology Clonal relatedness was determined by pulsed-field gel electrophoresis and multilocus sequence typing. Several PCR assays were carried out for detection of PVL genes, typing of staphylococcal chromosomal cassette mec (SCCmec), and subtyping of SCCmec type IV isolates. Regarding the prevalence of MRSA carriage in geriatric patients, nasal and ulcer swabs were collected from the study participants in October-November 2005. In order to determine the risk factors for MRSA colonization, a standardized questionnaire with clinical data from each resident was completed. Two cohorts of residents (MRSA carriers and non-carriers) were followed up to 18 months, with nasal cultures performed every six months. PCR detection of several genes and plasmid transfer assays were done in MRSA, S. epidermidis and S. hominis linezolid-resistant isolates to decipher the determinants of this resistance. The multidrug resistance plasmid (pERGB) was characterized after cloning different gene fragments in pUCP24. Results and conclusions The epidemiologic profile of MRSA strains from our hospital was characterized for the endemic presence of 3 major clones during 1999-2004 (ST125-IVc, ST228-I and ST22-IVh). The ST125-IVc and ST228-I clones were also predominant in many Spanish hospitals at that time, whereas the ST22-IVh (EMRSA-15), the most prevalent in British hospitals, was almost nonexistent in centers of the Iberian Peninsula in that period. These three clones were also predominant in the others Majorcan hospitals. In 2008, 7% of MRSA isolates were PVL-producers. MRSA carriage in participants living in the geriatric facility was 8%, lower in comparison with other studies, and generally intermittent. Previous hospital admission, vascular disease, diabetes mellitus, presence of decubitus ulcers and previous antibiotic treatment were the risk factors for MRSA colonization. Most of the residents carrying MRSA did not develop subsequent MRSA infections. MRSA isolates belonged to two different clones, both found also in the reference hospital. A multidrug resistance conjugative plasmid was described for the first time carriyng cfr, ant(4’)-Ia, tet(L) and dfrK genes driving resistance to linezolid and other antimicrobials in S. aureus and S. epidermidis strains. All the linezolid-resistant S. hominis strains belonged to the same clone and presented the G2576T mutation at the 23S rRNA gene.

Objetivo general. Abordar la caracterización molecular y funcional de un sistema binario de plásmidos crípticos involucrados en la transferencia horizontal de genes por conjugación en la bacteria fijadora de nitrógeno y simbionte de alfalfa, Sinorhizobium meliloti. Objetivos específicos. En el marco del objetivo precedente abordaremos el estudio de las funciones que hacen a la transferencia conjugativa y a la replicación del plásmido críptico modelo pSmeLPU88b de S. meliloti descripto previamente por Pistorio et al., (2003) según el siguiente esquema: - Identificación y caracterización de elementos estructurales y genes involucrados en la movilización del plásmido modelo pSmeLPU88b. - Caracterización del complejo Dtr (DNA transfer and replication). - Clonado, y caracterización de la región génica del plásmido pSmeLPU88b asociada al módulo Dtr. Búsqueda y caracterización del gen de la relaxasa y de su producto de traducción como una de las proteínas centrales de la transferencia de ADN via conjugativa. - Identificación y caracterización funcional del origen de transferencia (oriT). - Evaluación con herramientas moleculares del grado de ubicuidad de funciones de movilización (Dtr) en S. meliloti. - Identificación y caracterización de los módulos de replicación del plásmido pSmeLPU88b. - Clonado de los módulos de replicación, secuenciamiento, estudios de incompatibilidad. - Evaluación de la transmisibilidad del plásmido pSmeLPU88b en el medio suelo, en condiciones de laboratorio y de campo.