Dissertations / Theses on the topic 'Plasmodium berghei ANKA'

Les souris c57bl/6 developpent des symptomes de la malaria cerebrale ves le 10eme jours apres l'inoculation des souris par plasmodium berghei anka et meurent. Par contre les souris balb/c developpent progressivement une hyperparasitemie sanguine et meurent vers le 25eme jours. Le traitement par des acides gras durant les 4 premiers jours de l'infection protege les c57bl/6 des symptomes de la malaria cerebrale et meurent avec une hyperparasitemie. La mobilite electrophoretique cellulaire l'electrophorese en gel de polyacrylamide des proteines membranaires et la coloration au giemsa-cresyl ont permis d'identifie au cours de ces 4 premiers jours l'apparition d'une sous population d'erythrocyte jeune envahit preferentiellement par plasmodium berghei anka et parait jouer un role cle dans le declenchement de la pathologie de la malaria cerebrale.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006.
Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2009-10-24T13:16:24Z No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5)
Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-27T13:18:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5)
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A talidomida é uma droga imunomoduladora que tem sido utilizada experimentalmente em muitas condições clínicas, porém seu uso na malária ainda é insipiente. A malária é uma doença com alta morbi-mortalidade presente em todas as regiões tropicais do mundo. As manifestações severas da doença, possivelmente, estão ligadas à excessiva resposta imunitária, principalmente à produção de fator de necrose tumoral e radicais de oxigênio e nitrogênio. A talidomida diminui a produção de FNT por aumentar a degradação do seu ARNm e diminuir a ativação do NFκB. O presente trabalho avaliou a influência da talidomida sobre a evolução da malária e sobre as funções dos macrófagos em camundongos susceptíveis ou não à malária cerebral. Camundongos Balb/C e CBA foram infectados com 106 eritrócitos parasitados por Plasmodium berghei ANKA, tratados a partir do terceiro dia de infecção com 150 mg/Kg de talidomida diluída em solução a 0,8M de sacarose, por via oral, uma vez ao dia, em um volume de 100 μL. Outros dois grupos não foram infectados, mas foram tratados da mesma forma. No oitavo dia de infecção, o sangue foi obtido para a determinação do FNT e os macrófagos foram recuperados da cavidade abdominal para avaliação, in vitro, da capacidade fagocitária, produção de peróxido de hidrogênio, óxido nítrico e FNT. A capacidade fagocitária foi avaliada pelo teste de fagocitose, com ou sem opsoninas, em placa sendo determinado o índice fagocitário. A produção de peróxido de hidrogênio foi determinada pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. O óxido nítrico foi determinado pela reação de Griess. O FNT foi quantificado no soro e no sobrenadante das culturas dos macrófagos pelo teste imunoenzimático. A influência da talidomida, mas também da sacarose e da associação da talidomida com sacarose foi avaliada na evolução da malária por meio da curva de sobrevida, da parasitemia, anemia e peso dos camundongos Balb/C. Nos camundongos Balb/C, o tratamento com talidomida não modificou a sobrevida, diminuiu a perda de peso, retardou a elevação da parasitemia em nove dias, porém agravou a anemia a partir do vigésimo primeiro dia de infecção. O tratamento com solução a 0,8M de sacarose antecipou em um dia o início da morte e diminuiu em nove dias o tempo de vida, aumentou a perda de peso no início da infecção e posteriormente, a partir do décimo quarto dia, reduziu a perda de peso, agravou a parasitemia e a anemia. Porém, a associação da talidomida com a sacarose não modificou a curva de sobrevida e retardou a evolução da parasitemia a partir do vigésimo primeiro dia de infecção, por outro lado, agravou a evolução da anemia e aumentou a perda de peso a partir do vigésimo primeiro dia de infecção. Nos camundongos CBA, a associação da talidomida com sacarose não modificou a curva de sobrevida dos animais, a perda de peso, a parasitemia e a anemia. Em relação à função dos macrófagos, o tratamento dos camundongos Balb/C e CBA com talidomida diluída em solução 0,8M de sacarose não alterou a capacidade fagocitária e a produção de peróxido de hidrogênio, modulou negativamente a produção de óxido nítrico e diminuiu a produção de FNT tanto na cultura de macrófagos quanto no soro. Nossos dados sugerem que a talidomida, nos camundongos Balb/C, modulou a hiperativação do sistema imunitário de forma benéfica, uma vez que os aspectos gerais da evolução da malária não foram alterados, ao contrário, houve diminuição da perda de peso e retardo na evolução da parasitemia, porém, a administração isolada de sacarose deve ser avaliada pelos seus possíveis efeitos deletérios durante a infecção. Os dois modelos estudados não respondem da mesma forma à infecção provavelmente determinados por fatores genéticos. Sugerem, portanto, que a utilização da talidomida como terapia adjuvante aos anti-plasmodiais, antes das manifestações clínicas de gravidade, deve ser avaliada em seres humanos, exceto mulheres, com o objetivo de diminuir a grande morbidade e mortalidade da malária. ______________________________________________________________________ ABSTRACT
Thalidomide is an immunomodulatory drug that has been successfully evaluated in several clinical conditions, however it needs better evaluation in severe malaria. Malaria has high morbimortality in vast areas of the world. The excessive activation of the immune system, with increased production of tumor necrosis factor, oxygen and nitrogen reactive species, plays an important role in the pathogenesis of the disease. Thalidomide inhibits the production of TNF increasing the rate of mRNA degradation and depressing NFκB pathway. This work aimed to evaluate the influence of thalidomide on malaria outcome and on macrophage functions of susceptible (CBA) and not susceptible (Balb/C) mice to cerebral malaria. Balb/C and CBA mice were injected with 106 Plasmodium berghei ANKA infected-erythrocytes, and after three days mice were treated per os with 150 mg/Kg/day of thalidomide in 100 μL of 0,8M sucrose solution. The same treatment was administered to two other not infected groups. Another group was treated with only 0,8M sucrose solution. On the eightieth day after infection, blood was collected and macrophages were obtained from peritoneal cavity to assess, in vitro, immunological functions. Phagocytosis was evaluated by phagocytic index. Hydrogen peroxide was assessed by phenol red oxidation and nitric oxide production was assessed by Griess reaction. TNF production was evaluated in serum and supernatant of peritoneal macrophage cultures by immunoassay test. The influence of thalidomide on mortality, parasitemia, hematocrit and body weight was assessed in Balb/C and CBA-infected mice. Another Balb/c group treated with sucrose was added. Thalidomide did not influence the survival time, diminished body weight loss, delayed parasitemia in fortieth day, but worsened anemia twenty one days onward of infection in Balb/C mice compared to non-treated animals. The treatment with sucrose prompts one day the beginning of death and nine days the survival time. Firstly sucrose increased and after fortieth day of infection decreased body weight loss. It worsened parasitemia and anemia compared to that non-treated animals. However, association of thalidomide and sucrose did not alter survival time and body weight loss but increased parasitemia on fourth day onward of infection and worsened anemia after twenty one days of infection compared to that non-treated animals. The association of thalidomide and sucrose to treat CBA infected mice did not alter the survival time, body weight loss, parasitemia or anemia. The treatment with thalidomide of Balb/C and CBA infected mice did not influence the phagocytosis and hydrogen peroxide production, but it downregulated nitric oxide production, and decreased TNF production in serum (Balb/C) and supernatant of peritoneal macrophage cultures (Balb/C and CBA). Our findings suggest that thalidomide improved the outcome of disease, by decreasing body weight loss and delaying the parasitemia. Treatment with sucrose should be better evaluated because its possible deleterious effects. Our findings suggest that both experimental models show different immunopathological mechanisms, probably due to genetic factors. Moreover, thalidomide as adjuvant therapy in human malaria should be evaluated, except in women, to reduce morbidity and mortality of severe malaria.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-16T13:54:24Z No. of bitstreams: 1 danielachavesrenhe.pdf: 1786524 bytes, checksum: f1793eba761123a74e1cc5c588ca4fea (MD5)
Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-16T14:25:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 danielachavesrenhe.pdf: 1786524 bytes, checksum: f1793eba761123a74e1cc5c588ca4fea (MD5)
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Dentre as várias estratégias utilizadas com o intuito de induzir imunidade antimalárica está o uso de doses ultra-baixas de parasitos vivos de fase sanguínea dos plasmódios. Contudo, apesar desse método aparentemente induzir imunidade transcendente a cepa e espécie dois pontos precisam ser esclarecidos: 1- nenhum estudo tem avaliado se imunizações com parasitos vivos de baixa virulência são capazes de proteger contra o desenvolvimento de quadros graves da doença incluindo malária cerebral; 2 - considerando que crianças africanas frequentemente apresentam malária grave somente após reexposição a parasitos altamente virulentos, a relação entre o uso de parasitos vivos e o possível desenvolvimento de infecções graves precisa ser investigada. Para esclarecer tais questões, animais C57BL/6 foram imunizados uma ou duas vezes com 10³ hemácias infectadas por P. berghei NK65 ou P. berghei ANKA e posteriormente desafiados com 10^5 hemácias parasitadas por P. berghei ANKA. Imediatamente após primeira imunização, somente animais imunizados com P. berghei NK65 apresentaram níveis positivos de anticorpos IgG, os quais reconheceram tanto o antígeno homólogo quanto heterólogo. Independentemente do protocolo de imunização, animais imunizados uma vez apresentaram, tanto no cérebro quanto nos pulmões, menos áreas com acúmulo de hemácias e infiltrado inflamatório que animais somente desafiados ou imunizados duas vezes. Apesar das imunizações (uma ou duas vezes) com P. berghei ANKA e P. berghei NK65 terem controlado o desenvolvimento da parasitemia sanguínea por P. berghei ANKA, somente animais imunizados com P. berghei NK65 permaneceram vivos por até 30 dias após desafio experimental com P. berghei ANKA. Tanto no cérebro quanto nos pulmões, os níveis de TNF-α tenderam a elevar-se em relação ao IFN-ꝩ em animais que sofreram dois ciclos de imunizações, o que pode espelhar os maiores danos teciduais observados nesses animais. Contudo, os padrões de citocinas antiinflamatórias e pró-inflamatórias observados nesse estudo não explicam a mortalidade ou sobrevivência observada em animais imunizados com P. berghei ANKA e P. berghei NK65, respectivamente, e desafiados com P. berghei ANKA.
The use of ultra-low doses of live blood stage parasites is one of several strategies used to induce anti-malarial immunity. Although this method apparently induces cross-species and strain-transcendent immune response, there are two points that need to be explored: 1) no study has assessed whether immunization with live low virulence parasites is able to protect against the development of severe malaria, including cerebral malaria; 2) African children often develop severe malaria only after re-exposure to highly virulent parasites. Thus, the relationship between the use of live parasites and possible development of serious infections needs to be investigated. To clarify these two points, C57BL/6 mice were immunized once or twice with 10³ erythrocytes infected with P. berghei NK65 or P. berghei ANKA, and subsequently challenged with 10^5 P. berghei ANKA-parasitized erythrocytes. After the first immunization, only P. berghei NK65 immunized animals showed positive levels of IgG antibodies, which recognizes both homologous and heterologous antigen. In animals immunized only once, both brain and lungs exhibited fewer regions with accumulation of red blood cells and inflammation, when compared to control group or twice-immunized animals. Regardless of immunization protocols, all of the mice exhibit controlled development of P. berghei ANKA blood parasitemia. However, only P. berghei NK65 immunized animals remained alive 30 days after the being challenged with P. berghei ANKA. The TNF-α levels, on both brain and lungs, tended to rise in relation to IFN-ꝩ in animals undergoing two cycles of immunizations, which might reflect the higher tissue damage observed in these animals. However, the patterns of pro and anti-inflammatory cytokines present do not explain the observed mortality and survival rate in animals immunized with P. berghei ANKA and P. berghei NK65, respectively.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2018-09-20T13:42:20Z No. of bitstreams: 0
Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-10-16T11:34:15Z (GMT) No. of bitstreams: 0
Made available in DSpace on 2018-10-16T11:34:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2018-02-28
Devido à ampla distribuição da malária entre os continentes e ao elevado número de casos clínicos e óbitos registrados anualmente, o desenvolvimento de uma vacina antimalárica segura e eficaz contra a doença ainda é de extrema importância. Dentre os vários modelos propostos até o momento, aquelas compostas por parasitos vivos ou por extrato proteico têm sido as mais promissoras no desenvolvimento de imunidade antimalárica. Entretanto, ainda não claro se imunizações com cepas com baixo potencial de virulência seriam capazes de prevenir ou amenizar os sintomas associados à malária grave. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar se camundongos imunizados com extrato proteico de Plasmodium berghei NK65, cepa de baixa virulência e não indutora de malária cerebral nesse modelo, são protegidos contra o desenvolvimento de malária cerebral induzida pela cepa ANKA de Plasmodium berghei (PbA). Para isto, foram realizados dois ciclos de imunização utilizando extrato proteico de Plasmodium berghei associado ao adjuvante CPG-ODN, com intervalo de 21 dias, em camundongos fêmeas C57BL/6, com idade entre 6 e 8 semanas. Após 30 dias da última imunização foi realizado o desafio experimental utilizando a cepa ANKA de P. berghei e iniciado o acompanhamento diário dos animais para avaliação do seu quadro clínico e da carga parasitária. Diante da presença de sinais neurológicos (escore clínico < 5), os animais foram pesados e eutanasiados para realização da coleta de sangue, baço e cérebro, enquanto animais sem esses sinais continuaram por ser acompanhados diariamente e, então, sacrificados a partir do 13º dia. A partir das amostras coletadas, foram determinados os níveis de anticorpos sorológicos, a frequência da população celular esplênica (células T CD4+ e CD8+, e linfócitos B), níveis de citocinas teciduais e análise histopatológica do tecido nervoso. Observouse que 46% dos animais imunizados com extrato de PbN e 69% dos animais imunizados com extrato de PbA foram protegidos do desenvolvimento de malária cerebral e tiveram sua taxa de sobrevivência prolongada, entretanto, estes animais desenvolveram hiperparasitemia sanguínea, com níveis de até 38% de parasitos circulantes. Estes animais não apresentaram sinais clínicos neurológicos, o que foi confirmado macroscopicamente pela ausência de hemorragia e reduzida inflamação no cérebro em relação aos animais que evoluíram para malária cerebral. Histopatologicamente, os animais com hiperparasitemia apresentaram poucos leucócitos aderidos ao endotélio vascular e ausência de vasos obstruídos. Em relação aos níveis de citocinas (IL-10, TNF-α, IFN-) e número de linfócitos esplênicos (T CD4+ e CD8+, e linfócitos B), estes estiveram significativamente reduzidos nos animais que desenvolveram hiperparasitemia em relação aos que desenvolveram malária cerebral. Interessantemente, os animais imunizados foram capazes de reconhecer tanto antígenos homólogos quanto heterólogos ao utilizado durante o processo de imunização, porém, esses anticorpos pareceram não influenciar o padrão clínico apresentado pelos animais. Portanto, nosso estudo demonstra que imunizações com parasitos de baixa virulência podem induzir imunidade capaz de proteger contra cepas altamente virulentas, mas os fatores que medeiam essa proteção ainda precisam ser melhor investigados.
The broad distribution of malaria around of the globe and the large number of clinical cases/deaths attributed to this disease turns the discovery of a safe and effective malaria vaccine an essential tool to halt the spread of the disease. Vaccines focused on the use of live parasites and crude parasites antigens have shown good results on the induction of antimalarial immunity, although it is still not clear if immunizations with low virulent strains are capable to prevent the development of symptoms of cerebral malaria. This research aim to investigate if immunizations with crude antigen of Plasmodium berghei NK65 (PbN), a low virulence strain noninductive of cerebral malaria in C57BL/6 mice, are able to protect the animals against the development of cerebral malaria after challenge with Plasmodium berghei ANKA (PbA). Mice were immunized twice with crude antigen associated to CPG-ODN adjuvant. Thirty days after the second immunization animals were challenged with 105 red blood cells infected with P. berghei ANKA. Animals were daily monitored to evaluate the clinical score and parasitaemia levels. If the presence of neurological signs (score < 5) were detected, animals were euthanized and blood samples, spleen and brain were collected; animals without neurological commitment were followed daily until the 14 day post-infection. Antibodies and cytokines levels, splenic cellular population (T CD4+, T CD8+ and B lymphocytes) and histopathological analysis were performed. The results showed that 46% of the animals immunized with crude antigen of PbN and 69% of the animals immunized with crude antigen of PbA were protected from the development of cerebral malaria and had their survival rate prolonged, however, these animals developed hyperparasitaemia, with levels up to 38% of circulating parasites. These animals did not present neurological signs which were confirmed macroscopically by the absence of hemorrhage and reduce brain inflammation in relation to the animals that evolved to cerebral malaria. Histopathologically, the animals with hyperparasitaemia presented few adhered leukocytes in the vascular endothelium and absence of obstructed vessels. In relation to cytokine levels and number of splenic lymphocytes, these were significantly reduced in animals that developed hyperparasitism in comparison with those who developed cerebral malaria. Interestingly, the immunized animals were able to recognize both homologous and heterologous antigens used during the immunization process, however, these antibodies did not appear to influence at the clinical condition presented by the animals. Therefore, our study demonstrates that immunizations with low virulence parasites may induce immunity capable of protecting against highly virulent strains, but the factors that mediate this protection still need to be better investigated.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-27T14:27:24Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_TratamentoGlutacionaPontecializa.pdf: 1349253 bytes, checksum: 951b82d9cf4ff21197d61b7c853835ed (MD5)
Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-04-11T12:24:03Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_TratamentoGlutacionaPontecializa.pdf: 1349253 bytes, checksum: 951b82d9cf4ff21197d61b7c853835ed (MD5)
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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas
A malária é uma doença causada por protozoários do gênero Plasmodium e apresenta-se como um dos principais problemas de saúde pública no mundo. Para avaliar o quadro de malária, modelos murinos tem sido utilizado devido às suas similaridades entre as espécies infectantes para os camundongos e as espécies infectantes para o homem. O aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e alterações na atividade de enzimas como a glutationa peroxidase e superóxido dismutase foram caracterizadas dentro do quadro clínico da doença, porém pouco se sabe a respeito da participação de moléculas antioxidantes como a glutationa na evolução da doença. Diante do exposto, o principal objetivo deste trabalho é avaliar o efeito da glutationa na evolução do quadro de malária murina e frente aos danos causados pela infecção com cepa ANKA de Plasmodium berghei (PbA). Para isso foram utilizados camundongos Balb-C, o qual foi inoculado (~106 de eritrócitos parasitados) via intraperitoneal. Os grupos foram divididos em: grupo malária (PbA) (n=6), grupo PbA + GSH 1mg (n=6), grupo PbA +GSH 3mg (n=6) e grupo PbA +GSH 8mg (n=7), tratados por 7 dias consecutivos. O desenvolvimento da doença foi monitorado diariamente pela determinação da sobrevivência, massa corpórea e a parasitemia foi monitorada a cada três dias em distensões sanguíneas, também foi analisado os cortes histológicos do tecido hepáticos e foi realizado a dosagem bioquímica das transaminases hepáticas. Nossos dados demonstraram que o tratamento com GSH (8mg/kg) acelerou a mortalidade dos animais infectados uma vez que entre o 13-14 dia pós infecção cerca de 43% dos animais evoluíram a óbito. No grupo infectado com PbA que não recebeu tratamento com GSH, uma diminuição semelhante (40%) só foi observada a partir do 23-25 dia pós infecção. Já em relação aos grupos PbA+GSH 1mg e PbA+GSH 3mg, não houve diferença quando comparado com o grupo PbA. Interessantemente, embora o tratamento com GSH 8mg tenha acelerado a mortalidade no grupo infectado, não observamos diferença significativa no nível de parasitemia dos quatros grupos analisados. Em relação a massa corpórea foi possível observar uma diferença entre o dia 0 e 24 em todos os grupos, porém quando analisado entre os grupos. Já no que diz respeito as análises histológicas e dosagens bioquímicas, podemos observar que ouve alterações tanto na histologia quanto na nas transaminases, sendo estas alterações mais expressas no grupo PbA que foi tratado com glutationa 8mg/kg do que no grupo PbA. Concluindo que a glutationa quando administrada via intraperitoneal acelera a mortalidade dos camundongos infectados com a cepa ANKA, porém essa mortalidade não está associada com aumento da parasitemia, indicando então que a mortalidade pode ser decorrente das alterações hepáticas.
Malaria is a disease caused by protozoa of the genus Plasmodium and presents itself as a major public health problems in the world. To evaluate the malaria frame, murine models have been used for its similarities between species infective for mice and species infective to man. The increased production of reactive oxygen species and changes in the activity of enzymes such as glutathione peroxidase and superoxide dismutase have been characterized within the clinical picture of the disease, but little is known about the participation of antioxidant molecules such as glutathione in the evolution of the disease. Given the above, the main objective of this study is to evaluate the effect of glutathione in the evolution of murine malaria frame and front to damage caused by infection with Plasmodium berghei ANKA strain (PbA). To this were Balb-C mice, which were inoculated (~106 parasitized erythrocytes) intraperitoneally. The groups were divided into malaria group (PbA), PbA group + GSH 1 mg, PbA group + GSH 3 mg and PbA group + GSH 8 mg treated for 7 days consecutive. The development of the disease was monitored daily by determining the survival, body mass and parasitaemia was monitored every three days in blood strains, was also analyzed the histological sections of liver tissue was performed and the biochemical analysis of liver transaminases. Our data demonstrated that treatment with GSH (8mg/kg) accelerated mortality of infected animals once between days 13-14 after infection about 43% of the animals progressed to death. In the group infected with PbA that received no treatment with GSH, a similar reduction (40%) was observed only from 23-25 days post infection. In relation to PbA + GSH 1mg groups and GSH + PbA 3 mg, there was no difference when compared to the PbA group. Interestingly, although treatment with GSH 8mg has accelerated mortality in the infected group, no significant difference in parasitaemia level of the four groups analyzed. In relation to body mass was observed a difference between day 0 and 24 in all groups, but when analyzed between groups. In what concerns the histological and biochemical tests, we noted that listen both changes in histology and in transaminase, with the latter being expressed in PbA changes group was treated with glutathione 8mg / kg group than in PbA. Concluding that glutathione when administered intraperitoneally accelerates the mortality of mice infected with the ANKA strain, but this mortality is not associated with increased parasitemia, then indicating that mortality may result from liver changes.

Platelet-activating factor (PAF) is an inflammatory mediator able to change vascular permeability and activate polymorphonuclear cells and monocytes, leading to actions with deleterious consequences for the host. Given its significance under inflammatory conditions, the aim of this study was to investigate the role of this molecule in experimentalcerebral malaria through the use of mice lacking the PAF receptor (PAFR-/-) and the administration of antagonists for this receptor. Animals PAFR-/- showed protective effect against infection when compared to C57Bl/6 WT, as evidenced by a significant delay in lethality. However, no differences in parasitemia and behavioral parameters were noticed.Histopathological analysis in brain tissue demonstrated that C57Bl/6 WT presented increased vascular obstruction and more severe cerebellar hemorrhage, in comparison with PAFR-/- mice (6dpi). The histopathological changes in the lungs of WT infected mice werealso more expressive when compared with PAFR-/- mice. On day 6p.i., WT and PAFR-/- mice presented a significant increase in leukocyte rolling and adhesion in brain endothelium compared to controls, as well as in the expression of adhesion molecules. Nevertheless, these events were similar between WT and PAFR-/- mice. The profile of cytokines and chemokines in brain tissue was not different between the two groups,although there were differences in systemic levels of these molecules, with higher concentration in C57Bl/6 WT infected mice. Caspase-3 activation was higher in brain of WT compared with PAFR-/- mice. Immunohistochemistry analysis of brain tissue revealed a greater intensity for cleaved caspase-3 in endothelial cells and sequestered leukocytes in WT infected mice. The evaluation of vascular permeability showed a stronger Evans blue extravasation into the brain and pulmonary parenchyma in WT infected mice in comparison to PAFR-/- mice. There was a significant increase in the recruitment and activation of CD8+T cells in the brain tissue of infected animals, whereas PAFR-/- mice exhibited a lower count of these parameters than WT animals. PAFR-/- infected mice also presented fewer macrophages and CD8+ T cells in lung when compared with C57Bl/6 mice. Treatment with PAFR antagonist, UK-74,505 in WT infected mice delayed lethality when compared to animals that received vehicle. This therapeutic strategy triggered a protection similar that was found in PAFR-/- infected mice, suggesting that PAFR signaling is important for the development of experimental cerebral malaria. Mechanistically, the activation of PAFR iscrucial for the cascade of events leading to changes in vascular permeability, recruitment and activation of CD8+ T cells, apoptosis of endothelial cells and leukocytes
O fator de ativação plaquetário (PAF) é um mediador inflamatório capaz de alterar a permeabilidade vascular e ativar polimorfonucleares e monócitos, podendo levar a ações com graves conseqüências para o hospedeiro. Pela importância do PAF em condições inflamatórias, buscou-se investigar a participação desta molécula na malária experimental, através do uso de animais deficientes do receptor de PAF (PAFR) e o emprego de antagonista desse receptor. Animais PAFR-/- apresentaram proteção em relação à infecção quando comparados a animais C57Bl/6 WT, evidenciada por um atraso significativo naletalidade. No entanto, não houve diferença na parasitemia e nos parâmetros comportamentais. Através da análise histopatológica no tecido cerebral, demonstrou-se que animais C57Bl/6 WT apresentaram obstrução vascular aumentada e hemorragia cerebelar mais intensa em relação aos animais PAFR-/- (6dpi). As alterações histopatológicas nopulmão de animais C57BL/6 WT infectados também foram mais expressivas quando comparadas aos camundongos PAFR-/-. Animais C57Bl/6 WT e PAFR-/- apresentaram, no sexto dpi, aumento significativo nos processos de rolamento e adesão leucocitária no endotélio cerebral em comparação com os respectivos controles, assim como expressãoelevada de moléculas de adesão. Porém, esses eventos foram similares entre animais WT e PAFR-/- infectados. O perfil de citocinas e quimiocinas no tecido cerebral não foi diferente entre animais C57Bl/6 WT e PAFR-/-. Entretanto, os níveis sistêmicos foram significativamente distintos entre os grupos, com concentração superior em animais C57Bl/6 WT infectados. A ativação de caspase-3 foi maior no cérebro de animais C57Bl/6 WT em comparação ao PAFR-/- infectado. A marcação de caspase-3 clivada no tecido cerebral, demonstrou uma maior intensidade em células endoteliais associadas com leucócitos sequestrados, em animais C57Bl/6 WT infectados. Através da avaliação da permeabilidade vascular, nota-se um forte extravasamento de Azul de Evans para o parênquima cerebral e pulmonar de animais C57Bl/6 infectados em relação a animais PAFR-/- infectados. Houve um aumento significativo do recrutamento e ativação de células T CD8+ no tecido cerebral de animais infectados, com animais PAFR-/- apresentando umnúmero significativamente reduzido. Camundongos PAFR-/- infectados apresentaram um número menor de macrófagos e de células T CD8+ no tecido pulmonar, quando comparado com animais C57Bl/6 infectados. O tratamento com antagonistas de PAFR, UK-74,505, emanimais C57Bl/6 WT infectados, acarretou um atraso na letalidade, quando comparados a animais que receberam veículo. Esta estratégia terapêutica determinou um perfil de proteção semelhante à encontrada em animais PAFR-/- infectados, sugerindo que a sinalização por PAFR é importante para o desenvolvimento da malária cerebral experimental. Do ponto-de-vista de mecanismo, a ativação de PAFR é crucial para a cascata de eventos que levam a alterações na permeabilidade vascular, no recrutamento e na ativação de linfócitos T CD8+ , na apoptose de células endoteliais e leucócitos

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais
A malária é um grave problema de saúde pública. Os medicamentos de escolha para tratar a doença são as terapias baseadas em combinações de artemisininas. Porém, uma crescente resistência à estas drogas tem sido reportada. A presente investigação teve como objetivo avaliar o papel do extrato etanólico bruto de Trichoderma stromaticum (Ext-Ts) em camundongos C57BL/6 infectados com Plasmodium berghei ANKA, um conhecido modelo experimental de malária cerebral experimental. Foram monitoradas as manifestações clinicas, histológicas, imunológicas e bioquímicas características da infecção. Observou-se que o tratamento com Ext-Ts foi capaz de prevenir as alterações neurológicas associadas à malária cerebral experimental, diminuir os níveis de parasitemia e aumentar significativamente a sobrevivência de animais infectados. Além disso, foi observado que em camundongos tratados com Ext-Ts houve diminuição dos níveis de colesterol total, triglicerídeos e TGP no soro, menor deposição de hemozoína no fígado, atenuação da intensidade do edema pulmonar, proteção da integridade da barreira hematoencefálica, assim como menor citoaderência e achados histopatológicos nos tecidos avaliados, quando comparado com camundongos infectados não tratados. Esta proteção foi associada com uma diminuição na expressão de IFN-γ e ICAM-1 no cérebro dos animais tratados em relação a animais não tratados. Estes resultados sugerem que o Ext-Ts é uma potencial fonte de compostos antimaláricos e/ou imunomoduladores que poderiam melhorar o tratamento atual no contexto do aumento da resistência aos derivados da artemisinina.
Malaria is a severe health problem. The first-line treatment against the disease are the artemisinin-based combination therapies. However, increased resistance to these drugs has been reported. The aim of this study was to evaluate the role of crude etanolic extracts of Trichoderma stromaticum (Ext-Ts) in C57BL/6 mice infected with Plasmodium berghei ANKA, a well-known model of experimental cerebral malaria. Clinical, histological, immunological and biochemical features of the infection were monitored. It was found that Ext-Ts treatment was able to prevent neurological alterations associated with experimental cerebral malaria, decreased parasitemia levels and significantly improved survival of infected animals. Furthermore, it was observed that in Ext-Ts-treated mice a reduction of total serum cholesterol, triglycerides and TGP, lower hemozoin deposition into the liver, attenuation of pulmonary edema intensity, integrity of the blood-brain barrier as well as fewer cytoadherence and histopathological findings in assessed tissues in comparison with untreated infected mice. This protection was associated with decreased IFN-γ and ICAM-1 mRNA expression in brain of treated animals compared with untreated animals. These results suggest that Ext-Ts is a potential source of antimalarial and immunomodulatory compounds that could improve the current treatment in the context of resistance to artemisinin derivatives.
Dissertação (Mestrado)

Les lymphocytes T sont caractérisés par l’expression d’un récepteur de l’antigène, le TCR (T cell receptor), produit lors de réarrangements somatiques conférant une grande diversité à la population lymphocytaire périphérique. Nous avons caractérisé la diversité du répertoire des lymphocytes T spléniques, sanguins et cérébraux lors de l’infection de souris par Plasmodium berghei ANKA, parasite induisant le neuropaludisme (NP). Nos résultats montrent une modification progressive du répertoire de la rate et du sang au cours de l’infection, associée à l’expansion de certains clones chez les souris développant un NP (NP+), par rapport aux individus infectés ne développant pas de NP, accordant une valeur diagnostique à l’analyse du répertoire. Ces expansions sont retrouvées dans le cerveau des souris NP+, indiquant un recrutement ciblé de lymphocytes T au niveau cérébral. Notre étude suggère l’utilisation de l’analyse du répertoire pour le développement de stratégies thérapeutiques.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2013.
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A malária ainda é um importante problema de saúde global, acometendo milhões de pessoas e resultando em aproximadamente 1 milhão de mortes por ano. A forma cerebral é uma das complicações mais grave da infecção pelo Plasmodium falciparum em seres humanos, e sua patogênese não está ainda totalmente esclarecida. A hiperativação do sistema imunitário tem sido considerada um importante determinante da evolução para as formas graves. O desequilíbrio da resposta imunitária com polarização para a resposta inflamatória tem um papel central na hiperativação do endotélio vascular, no sequestro de eritrócitos parasitados na microvasculatura cerebral e nas lesões das células cerebrais. Os mediadores inflamatórios são liberados em resposta aos antígenos plasmodiais, às próprias citocinas, aos eicosanóides e a outros produtos como a hemozoína e heme livre, que estimulam diferentes vias de ativação e regulação intracelular. O objetivo deste trabalho foi avaliar os mecanismos da resposta inflamatória envolvidos nas alterações cerebrais em camundongos suscetíveis (CBA e C57BL/6) ou resistentes (BALB/c) à malária cerebral para melhor esclarecer os possíveis mecanismos imunopatogênicos determinantes das formas graves da doença e melhor caracterizar os modelos experimentais da malária. Foram utilizados para este estudo camundongos machos de 8 a 12 semanas de idade, infectados ou não com 106 eritrócitos parasitados pelo Plasmodium berghei ANKA. Para cada linhagem, a morte espontânea foi avaliada dia a dia e a parasitemia foi comparada entre eles no terceiro, quinto e oitavo dia da infecção. A produção de óxido nítrico foi determinada pela reação de Griess. O peróxido de hidrogênio foi determinado pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. As citocinas IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12, IL-17 e o FNT-α foram quantificadas nos homogenatos do cérebro e cerebelo por teste imunoenzimático. A presença de COX-2 e 5-LOX foi avaliada nos macrófagos peritoneais e micróglia por citometria de fluxo, e nos vasos cerebrais e células cerebrais por imunohistoquímica. A ativação do metabolismo lipídico foi avaliada pela quantificação dos corpúsculos lipídicos no citoplasma dos macrófagos peritoneais pela técnica do Oil red e Bodipy. As vias de ativação do NF?B, o inflamassoma e a regulação pelo PPAR- ? foram avaliados no citoplasma e no núcleo dos macrófagos peritoneais. Cortes histológicos do cérebro também foram avaliados utilizando o método clássico de coloração pela hematoxilina-eosina e também por microscopia eletrônica de varredura. A permeabilidade vascular foi avaliada pela quantificação do extravasamento do corante de azul de Evans para o tecido cerebral. Os camundongos C57BL/6 começaram a morrer no sexto dia após a infecção, os camundongos CBA, dois dias depois, enquanto 55% dos camundongos BALB/c ainda estavam vivos no décimo quinto dia da infecção. A parasitemia nos camundongos C57BL/6 foi maior do que na linhagem BALB/c no terceiro e quinto dias após a infecção e no oitavo dia também foi maior do que nos camundongos CBA. Nos camundongos C57BL/6 houve ativação da via canônica do NF?B, e diminuição da produção de NO e aumento do H2O2, FNT-α e IL-10; não houve alteração na produção de IL-4, IL-12 e IL17; e houve aumento na formação de corpúsculos lipídicos e predominância da expressão de 5-LOX. Observamos também ativação do inflamassoma NALPR1, porém diminuição da produção IL-1β. Nos camundongos CBA houve ativação preponderantemente da via não-canônica do NF?B, diminuição da produção do FNT-α e da IL-10, não houve alteração da produção de IL-12, NO e H2O2, mas observamos um padrão de IL-4 e IL-17 maior do que o das outras linhagens. Houve também ativação do inflamassoma, mas não houve alteração na produção de IL-1β. Nos camundongos BALB/c houve ativação preponderantemente da via canônica do NF?B, mas não houve alteração na produção de IL-12, NO e H2O2, que são estimulados pela atividade desta via. Ainda observamos diminuição na produção de FNT-α e IL-1β. Observamos que houve aumento da formação de corpúsculos lipídicos, mas não houve aumento paralelo na expressão de COX-2 e 5-LOX. Entretanto, a linhagem BALB/c foi a única que apresentou uma translocação importante do regulador PPAR-γ para o núcleo. O perfil de resposta foi seguido de alterações histopatológicas características para cada linhagem, sendo os camundongos C57BL/6 os que apresentaram a maior permeabilidade e sequestro de leucócitos. Os camundongos CBA também apresentaram aumento de permeabilidade, porém menor do que os camundongos C57BL/6, e também apresentaram maior sequestro de eritrócitos do que leucócitos. Poucas alterações foram observadas nos camundongos BALB/c. Os resultados desse trabalho evidenciam diferentes mecanismos de respostas celulares que devem em conjunto ter contribuído para a evolução clínica da malária e mostram que a escolha do modelo experimental para pesquisas em malária deve levar em consideração a linhagem do camundongo e suas capacidades individuais de resposta. Além disso, indicam que a forma cerebral pode ser resultado de diferentes mecanismos fisiopatológicos. Provavelmente, esses resultados também expliquem as diferentes evoluções clínicas observadas da malária humana. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Malaria is one of the most important problems of public health, affecting millions people and resulting in almost one million death every year. Cerebral disease is one of the most severe complications of Plasmodium falciparum malaria and its immunopathogenesis is not well established. It has been considered that the excessive activation of the immune system by some parasite components is critical to the pathogenesis of severe malaria. The imbalance of immune response with polarization towards the inflammatory mechanisms plays a key role in the activation of endothelial vessels, in the sequestration of parasitized erythrocytes within the small vessels of brain and in cerebral cells lesions. The inflammatory mediators are released in response to plasmodial antigens, cytokines, eicosanoids and other products as hemozoin and free heme, which stimulates differently the activation and regulation of intracellular pathways. This work aimed at evaluating the inflammatory response which is involved in cerebral alterations in susceptible (CBA and C57BL/6) and resistant (BALB/c) mice to cerebral malaria, to better understanding of the immunopathological mechanisms and to better characterize the experimental murine models of malaria. In this work, 8-12 weeks-old male mice were infected with 106 Plasmodium berghei ANKA parasitized erythrocytes. For each strain, the survival rate and parasitemia were assessed. The nitric oxide production was evaluated by the Griess reaction and the hydrogen peroxide production was assessed by the Pick´s method. IL-1β, IL-4, IL-10, IL-12, IL-17 and TNF-α production in brain tissue were quantified by an ELISA test. The COX-2 and 5-LOX expression in microglia and peritoneal macrophages were analyzed in a flow cytometer. COX-2 and 5-LOX expression were evaluated in cerebral cells and vessels by immunohistochemistry. The lipid body formation is a hallmark of the activation of lipid metabolism and it was quantified in peritoneal macrophages by oil red O staining and bodipy fluorescent probe. The activation of NF?B pathway, inflammasome and PPAR-? were evaluated in the nuclei and cytoplasm of peritoneal macrophages. Histopathological evaluation of the brain was performed by hematoxilin-eosin staining and by scanning electron microscopy. Vascular permeability was measured by Evans blue dye extraction. The C57BL/6 mice began to die on the sixth day post-infection, CBA mice, two days later, while 55% of BALB/c mice still remained alive 15 days after infection. C57BL/6 mice showed the highest parasitemia compared with the two other strains. Only the canonical NF?B pathway was activated in C57BL/6 mice, there was a decrease in NO production, and an increase in H2O2, TNF-α e IL-10 levels after Plasmodium infection, but no alteration was observed in IL-4, IL-12 and IL-17 production; the lipid bodies formation was enhanced and 5-LOX was predominantly expressed. It was also observed the NALPR1 inflammasome activation, but the IL-1β production was decreased. The non-canonical NF?B pathway was more activated than the canonical one in CBA mice. They showed a decline in TNF-α and IL-10 productions, while no alteration in IL-12, NO and H2O2 was observed; the IL-4 and IL-17 pattern production was higher in these mice than in the other strains. The inflammasome was activated, but no production of IL-1β was observed. The BALB/c mice showed predominantly activation of the canonical NF?B pathway, but the products stimulated by the activity of this pathway, such as, IL-12, NO e H2O2 was not changed in infected animals, and even a decreased production of TNF-α and IL-1β was observed. There was an increased formation of lipid bodies, however, COX-2 and 5-LOX were not significantly expressed. In addition, higher translocation of PPAR-γ into the nuclei was observed in this resistant model. These profiles of responses were followed by histopathological alterations that were characteristics for each strain. The C57BL/6 mice showed the highest vascular permeability and leukocyte sequestration; the CBA mice also showed increased vascular permeability but lower than C57BL/6 mice, and they showed more erythrocyte than leukocyte sequestered. Few changes were observed in BALB/c mice. The results presented in this work suggest that different mechanisms of cellular responses may have contributed to determinate clinical malaria and showed that the choice of the experimental model for research on malaria should take into consideration the strain of mice and their individual capacities of responses. They also showed that the cerebral form of the disease may result from different pathophysiological mechanisms. Probably, these results may also explain the different clinical outcomes observed in human malaria.

Orientador: Ana Maria Aparecida Guaraldo
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-14T15:15:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_HelenCupertinoSilva_M.pdf: 1411655 bytes, checksum: 74209c9aaeedc867a4d0f783be898b27 (MD5) Previous issue date: 2009
Resumo: A malária cerebral humana é a manifestação mais grave do Plasmodium falciparum que ocorre em 1% das infecções, sendo responsável por mais de dois milhões de mortes anuais entre crianças abaixo de cinco anos. O modelo experimental mais aceito da malária cerebral é o camundongo C57BL/6 infectado pelo Plasmodium berghei ANKA (PbA). A administração da fração mononuclear da medula óssea, contendo principalmente células tronco mesenquimais e hematopoiéticas, constitui uma estratégia promissora no tratamento de danos neurais causados por acidente vascular cerebral. Neste estudo, foi avaliado o efeito de células da medula óssea de camundongos transgênicos C57BL/6 GFP HET transplantadas em C57BL/6JUnib infectados com 106 hemácias parasitadas pelo PbA. Resumidamente, células perfundidas da medula do fêmur e tíbia de C57BL/6 GFP HET foram purificadas por gradiente de Ficoll (Histopaque) a 1000 x g por 15 minutos. Após duas lavagens em meio RPMI, as células foram ressuspensas em NaCl 0,15 M. No segundo dia após a infecção (dai) pelo PbA, foram injetadas 3,0 x 106 a 4,6 x 107 células de medula óssea (CMO) no plexo oftálmico dos camundongos devidamente anestesiados com ketamina/xylasina (protocolo 1078-1 CEEA/Unicamp). Alguns camundongos receberam apenas a injeção de células totais da medula óssea (CTMO), sem a purificação pelo gradiente de Ficoll. Foi avaliada a integridade da barreira hemato-encefálica, mediante a injeção de azul de Evans 1% no plexo oftálmico em camundongos transplantados e não transplantados com células mononucleares da medula óssea (CMoMO) no 2º dai. Após 3 e 4 dias do transplante, não houve proteção da barreira hemato-encefálica. Para constatação da presença das células de medula óssea no cérebro, outro grupo de camundongos infectados pelo PbA recebeu no 2º dai, 4,6 x 107 CMoMO provenientes de camundongos GFP. Após a manifestação de sinais clínicos da MC os camundongos foram sacrificados para remoção do cérebro e preparo de cortes em criostato. Foi possível observar, sob microscópio de fluorescência, a presença de células da medula no bulbo olfatório de camundongos com MC+. Também foram avaliadas a sobrevivência, a parasitemia e a ação coadjuvante do tratamento com cloroquina (0,8 mg/dia/animal). Todos os 38 animais do grupo controle morreram até o 7º dia de infecção pelo PbA (13,16% no 5º dia, 68,42% no 6º dia e 18,42 % no 7º dai). A injeção de células da medula óssea não interferiu na parasitemia dos animais. Apesar dos animais que superaram a fase aguda da malária cerebral morrerem em decorrência de hiperparasitismo e anemia, o tratamento com células da medula óssea (fração mononuclear ou células totais) mostrou-se capaz de ampliar a sobrevivência em 10 a 21 dias, resultados considerados promissores. As células da medula óssea promoveram a melhora clínica do quadro neurológico da malária cerebral.
Abstract: The cerebral malaria (CM) is the most serious complication of Plasmodium falciparum occurring in 1% of infections, and is responsible for more than two million of annual deaths among children under five years old. The experimental model for brain malaria currently used is the C57BL/6 mice infected by Plasmodium berghei ANKA (PbA). Administration of mononuclear population from bone marrow containing mainly mesenchymal stem cells and haematopoietic stem cells, is a promising strategy to treat neural damages caused by stroke. In this study was evaluated the effect of bone marrow mononuclear cells of transgenic mice C57BL/6 GFP HET transplanted into C57BL/6JUnib, infected by 106 parasitized erythrocyte PbA. Briefly, bone marrow mononuclear cells flushed from femur and tibia of C57BL/6 GFP HET were purified through Ficoll (Histopaque) gradient at 1000xg during 15 minutes. After two washes with RPMI medium, the cells were resuspended in NaCl 0,15M. On the second day after infection (DAI) by PbA, were injected into mice orbital plexus 3x10 6 to 4.6x107 cells of after anaesthesia with Ketamine/Xylazine (protocol nº 1078-1 CEEA/UNICAMP). Some mice received only injection of total bone marrow cells without purification on Ficoll gradient. The injection of bone marrow mononuclear cells on the second day of infection by PbA was unable in recovering the brain blood barrier after three or four days. In order to confirm the presence of bone marrow cells in the brain, another group of infected C57BL/6JUnib received on the second day after infection 4.6 x 107 bone marrow mononuclear cells from GFP mice. They were sacrificed between 6th and 8th day after onset of clinical signs of the CM. After removal and preparation of the brain for criostate cuts, was possible to observe, under fluorescence microscope, the presence of GFP bone marrow cells in the olfactory bulb on CM+ mice. It was evaluated survival, parasitemia and action of the adjuvant treatment of chloroquine (0.8 mg/day/animal) as well. All the 38 animals from control group died until 7th DAI. (13.16% at 5th DAI,68.42% at 6th DAI and 18.42% at 7th DAI). The transplantation of bone marrow cells did not affect the parasitemia. The bone marrow cells therapy infected mice by PbA was able to revert the clinical signs of cerebral malaria, increasing the survival up to 21 days.
Mestrado
Parasitologia
Mestre em Parasitologia

Submitted by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2012-07-31T13:20:19Z No. of bitstreams: 2 Tese_ AlteracoesNeuroquimicasTecido.pdf: 1670494 bytes, checksum: fb924142659122e339b77aae96a47bb7 (MD5) license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5)
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FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
A Malária Cerebral (MC) apresenta-se como uma severa complicação resultante da infecção por Plasmodium falciparum. Esta condição encontra-se comumente associada a disfunções cognitivas, comportamentais e motoras, sendo a retinopatia uma das mais graves conseqüências da doença. Diversos modelos experimentais já foram descritos no intuito de elucidar os mecanismos fisiopatológicos relacionados a esta síndrome, no entanto, estes ainda permanecem pouco compreendidos. Dentro deste contexto, o presente trabalho procurou investigar as alterações neuroquímicas envolvidas na patologia da MC. Os camundongos C57Bl/6 (fêmeas e machos) inoculados com ≈106 eritrócitos parasitados (PbA) apresentaram baixa parasitemia (15-20%) com sinais clínicos evidentes como: deficiência respiratória, ataxia, hemiplegia e coma seguido de morte, condizentes com o quadro de MC. A análise no tecido retiniano demonstrou uma diminuição nos níveis de GSH com 2 dias após a inoculação. Entretanto, essa diminuição não foi tão evidente com o decorrer da infecção (4º e 6º dias após infecção). Concomitante a este aumento durante o processo infeccioso, observamos um progressivo aumento na captação de 3H-glutamato (4º e 6º dia após infecção) por um sistema independente de Na+, sugerindo que o quadro de MC é responsável por um aumento na atividade de uma proteína transportadora. Dados obtidos com a imunofluorescência demonstram que além de aumentar a atividade do sistema de transporte, o quadro de MC também estimula o aumento na expressão do sistema xCG - no tecido retiniano. O presente trabalho demonstra ainda que estes eventos neuroquímicos no tecido retiniano são independentes de ativação inflamatória, visto que os níveis de TNF-α e expressão de NOS-2, apresentam-se alterados somente no tecido retiniano.
Cerebral Malaria (CM) is a severe complication resulting from Plasmodium falciparum infection. This condition has usually been associated with cognitive, behavioral and motor dysfunctions, being the retinopathy the most serious consequence resulting from the disease. The pathophysiologymechanisms underlying the complications of CM remain incompletely understood. Several experimental models of CM have already been developed in order to clarify those mechanisms related to this syndrome. In this context, the present work has been performed to investigate which possible neurochemistry alteration could be involved in the CM pathology. Male and female susceptible C57Bl/6 mice (6-8 week old) infected with ≈106 parasitized red blood cells (PbA), showed a low parasitaemia (15-20%), with evident clinical signs as: respiratory failure, ataxia, hemiplegia, and coma followed by animal death. In parallel to the clinical characterization of CM, retinal analysis demonstrated that the disease led to a decrease in the glutathione levels with 2 days post inoculation. However, this decrease was not so evident with the course of the infection (4º and 6º days post- infection). We further demonstrated that the increase in the glutathione levels during the infection is followed by the increase in the 3H-glutamate uptake rate (4º and 6º days post-infection), suggesting that CM condition causes an up-regulation of the transporters systems. Immunofluorescence data demonstrated that besides the activity increases, CM condition also stimulated the increase of the xCG- system expression in the retinal tissue. Furthermore, our findings also highlighted that in the retina the neurochemistries alterations occurs in a manner independent on the establishment of an inflammatory response, once TNF-α levels and NOS-2 expression were altered only in the cerebral tissue.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006.
Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-11-21T17:57:59Z No. of bitstreams: 1 Dissert Tatiana Karla dos Santos Borges.pdf: 2968588 bytes, checksum: d1737b7181d22a3495a13593d5cfbbba (MD5)
Approved for entry into archive by Joanita Pereira(joanita) on 2010-01-14T18:45:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert Tatiana Karla dos Santos Borges.pdf: 2968588 bytes, checksum: d1737b7181d22a3495a13593d5cfbbba (MD5)
Made available in DSpace on 2010-01-14T18:45:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Tatiana Karla dos Santos Borges.pdf: 2968588 bytes, checksum: d1737b7181d22a3495a13593d5cfbbba (MD5) Previous issue date: 2006
A malária é um dos problemas mais importantes de saúde pública mundial, devido sua grande morbi-mortalidade e sua ampla distribuição geográfica. As manifestações clínico-patológicas observadas na malária decorrem da hiperativação do sistema imunitário com produção aumentada de citocinas, particularmente do FNT, que participa da ativação do sistema imunitário e da defesa antiplasmódio, mas por outro lado, está envolvido nos mecanismos imunopatogênicos. A pentoxifilina é um inibidor da via de sinalização e transcrição do NF-B que promove a transcrição de vários componentes da resposta imune, inclusive do FNT, podendo modular algumas funções do sistema imunitário. Este trabalho avaliou a influência da pentoxifilina sobre a evolução da malária e sobre as funções dos macrófagos em camundongos susceptíveis ou não à malária cerebral. Foram estudados camundongos Balb/C e CBA infectados com 106 eritrócitos parasitados por Plasmodium berghei ANKA, tratados a partir do terceiro dia de infecção com 8 mg/kg/dia de pentoxifilina ou com NaCl 0,9%. Outros dois grupos não infectados foram tratados com 8 mg/kg/dia de pentoxifilina ou com NaCl 0,9%. No oitavo dia de infecção, o sangue foi obtido para a determinação do FNT e os macrófagos foram recuperados da cavidade peritoneal para avaliação, in vitro, das funções imunológicas. A capacidade fagocitária dos macrófagos peritoneais foi avaliada pelo teste de fagocitose em placa sendo determinado o índice fagocitário. A produção de óxido nítrico foi determinada pela reação de Griess. O peróxido de hidrogênio foi determinado pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. O FNT foi avaliado no soro e nos sobrenadantes das culturas dos macrófagos pelo teste imunoenzimático. Foi avaliada também a influência da pentoxifilina sobre a parasitemia, o hematócrito, o peso e a mortalidade. O tratamento com 8 mg/Kg/dia de pentoxifilina aumentou em um dia o início da morte e em três dias a sobrevida dos camundongos Balb/C e retardou a parasitemia em quinze dias em relação aos animais não tratados. Nos camundongos CBA, a pentoxifilina não alterou a parasitemia nem influenciou o início da morte, porém, aumentou em treze dias a sobrevida dos animais. Enquanto, os camundongos Balb/C infectados e tratados morreram a partir do décimo segundo dia com parasitemia de 52,4%, anemia com hematócrito de 12,2% e menor perda de peso; os camundongos CBA morreram a partir do oitavo dia com uma parasitemia de 7,3% e hematócrito de 43%, entretanto a pentoxifilina não influenciou a evolução do peso. Foi observado que o tratamento com a pentoxifilina estimulou o aumento da capacidade fagocitária dos macrófagos peritoneais dos camundongos Balb/C, por meio dos receptores para opsoninas, mas não alterou a fagocitose nos camundongos CBA. Observamos também que a produção de FNT é maior no sobrenadante das culturas de macrófagos peritoneais do que no soro e que a produção basal de FNT é maior nos camundongos Balb/C infectados e tratados do que nos camundongos CBA infectados e tratados. Observamos ainda que a pentoxifilina não alterou a produção de peróxido de hidrogênio pelos macrófagos peritoneais dos camundongos Balb/C e CBA infectados com Plasmodium berghei ANKA. Apesar do tratamento com pentoxifilina não ter alterado a produção basal ou estimulada de óxido nítrico nos camundongos Balb/C, a droga promoveu um aumento significante da produção basal de óxido nítrico nos camundongos CBA infectados pelo Plasmodium berghei ANKA. Nossos dados sugerem que as duas cepas de camundongos apresentam mecanismos imunopatogênicos diferentes e que a hiperativação do sistema imunitário que ocorre nas formas graves da malária está relacionado provavelmente com as características genéticas do indivíduo, que determinarão o tipo de evolução da doença. Demonstram também que a pentoxifilina não interferiu de modo significante na resposta do sistema imunitário envolvida na imunopatogenia nos camundongos Balb/C, não susceptíveis a forma cerebral da malária, melhorando inclusive alguns aspectos evolutivos da doença como a sobrevida e o retardo da parasitemia. Sugerem, portanto, que a utilização da pentoxifilina como terapêutica complementar às drogas antiplasmodiais, na dose de 8mg/kg/dia, antes das manifestações clínicas de gravidade, deve ser avaliada em seres humanos, com o objetivo de diminuir a grande morbidade e mortalidade da malária. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT
Malaria has global importance in health care due to its high prevalence, worldwide geographic distribution and high morbidity and mortality. The pathophysiology and clinical manifestations of the disease are manly caused by hiperactivation of immune system with high production of cytokines, mainly TNF, which may modulate several functions of the immune system. Furthermore, TNF is involved in anti-plasmodial defense. However, this cytokine may also participate in malaria immunopathology. Pentoxifylline is a phosphodiesterase inhibitor that has suppressive effect on TNF production by probably acting on NF-κB signaling pathway. It has been shown that this drug can modulate many functions of the immune system. This work aimed to evaluate the influence of pentoxifylline on malaria outcome and on macrophage functions of susceptible (CBA) and not susceptible (Balb/C) mice to cerebral malaria. The Balb/C and CBA mice were injected with 106 Plasmodium berghei ANKA infected-erythrocytes, and after three days mice were treated with 8mg/Kg/day of pentoxifylline or NaCl 0,9%. Two other not infected groups were treated the same way. On the eightieth day after infection, blood was collected and macrophages were obtained from peritoneal cavity to assess, in vitro, immunological functions. Phagocytosis was evaluated by phagocytic index. Nitric oxide production was evaluated by Griess reaction. Hydrogen peroxide production was evaluated by phenol red oxidation. TNF production was assessed in serum and supernatant of peritoneal macrophage cultures by immunoassay test. Influence of pentoxifylline on parasitemia, hematocrit, body weight and mortality were assessed. Pentoxifylline increased in one day the beginning of death and in three days the survival time and delayed the increase of parasitemia in fifteen days in the Balb/C mice. Pentoxifylline did not influence parasitemia and neither influenced the beginning of death of the CBA mice. However, this drug increased thirteen days the survival time of these animals. While, infected-treated Balb/C mice began to die on twelfth day post-infection with 52,4% of parasitemia, 12,2% of hematocrit and less weight body loss, infected-treated CBA mice began to die on eighties day postinfection with 7,3% of parasitemia and 43% of hematocrit. Although pentoxifylline enhanced the phagocytic capacity of the Balb/C peritoneal macrophages by opsoninreceptors, it did not influence the phagocytosis of the CBA mice in both groups. TNF production by peritoneal macrophages was higher than TNF serum levels. Furthermore, the production of TNF by the infected-treated Balb/C group was higher than that produced by CBA group. Pentoxifylline did not influence hydrogen peroxide and nitric oxide production by macrophages of both CBA and Balb/C mice, except for Plasmodium berghei ANKA infected-treated CBA mice, in which the treatment increased the production of this cytokine. Our findings suggest that both CBA and Balb/c mice show different immunopathological mechanisms and that the hiperactivation of immune system seems to be related to individual genetic features, which may determinate the malaria outcome. Moreover, pentoxifylline therapy did not influence the disease outcome and immune response of mice not susceptible to cerebral malaria (Balb/C), but it improved some features of the disease, such as survival and parasitemia. Our data suggest that pentoxifylline associated to antiplasmodial therapy, before clinical manifestations of severity of the disease, should be evaluated to reduce the morbidity and mortality of severe human malaria.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-06-19T16:07:50Z No. of bitstreams: 1 saramalagutiandradesoares.pdf: 1936313 bytes, checksum: bac06dfaa717be34b6dd2753dd6bf232 (MD5)
Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-06-29T12:30:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 saramalagutiandradesoares.pdf: 1936313 bytes, checksum: bac06dfaa717be34b6dd2753dd6bf232 (MD5)
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FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
A obesidade é motivo de preocupação para a saúde pública em todo o mundo. Apesar de existirem muitos estudos sobre seu impacto no sistema imunológico, a influência nas doenças infecciosas é pouco relatado. A incidência da obesidade vem aumentando em países em desenvolvimento, assim é de grande importãncia o estudo do papel da obesidade na resposta imunológica a patógenos, principalmente em doenças infecciosas de grande relevãncia como a malaria. A obesidade é caracterizada por uma inflamação sistêmica de baixo grau crõnica, e acredita-se que as manifestações complicadas da malária, como a malaria cerebral, injuria respiratória, denominada malária grave, podem ser resultado da resposta inflamatória exagerada causada pelo sequestro de hemácias infectadas nos vasos endoteliais de orgãos vitais como cérebro e pulmão. Portanto a inflamação na obesidade pode alterar o curso da infecção do Plasmodium berguei ANKA, parasitas causadores da malária cerebral em modelo murino. Neste trabalho, investigamos a influência da obesidade na resposta imune frente à infecção por Plasmodium berguei ANKA. Para isso foram utilizados camundongos C57BL/6 machos, com idade de 4 a 6 semanas, alimentados durante 12 semanas por uma dieta hiperlipídica com 60% das quilocalorias advindas de lipídeos. Após esse período os animais foram infectados com a cepa ANKA de Plasmodium berguei. Nos animais alimentados com a dieta hiperlipídica, observou-se aumento do peso corporal, assim como da gordura perigonadal dos animais alimentados pela dieta hiperlipídica, sem aumento do consumo de ração. A resistência ao desenvolvimento da malária grave foi observada nos animais obesos; além de conseguir controlar a parasitemia, . Somente esses animais sobreviveram à infecção, por 25 dias após o desafio, sem apresentar sintomas clínicos da doença, ao contrário, os não obesos infectados, vieram a óbito após oito dias de infecção. Foram observadas diferenças no perfil celular dos animais obesos infectados quando comparados aos controles infectados, sugerindo que a inflamação prévia dos animais obesos pode ter influenciado o curso da infecção. Assim, os resultados indicam que alterações na resposta imunológica do camundongo obeso conseguem protege-lo contra o desenvolvimento da malaria grave.
Obesity is a public heaith concern currentiy affecting worldwide, aithough there are many studies on the impact of obesity on the immune system, the various aspects of the association between obesity and infection is seidom reported. The incidence of obesity is increasing in the developing countries, and it is very important to study the role of obesity in the immune response to pathogens, especially infectious diseases such as maiaria. Obesity is characterized by a iow-grade, systemic, chronic infiammation and it is believed that the complicated manifestations of maiaria, as severe maiaria, can be the result of an exaggerated inflammatory response caused by sequestration of infected erythrocytes to endothelial vesseis of vital organs such as brain and lung. So infiammation in obesity may alter the course of infection of Plasmodium berguei ANKA, parasites that cause cerebral maiaria in mice. In this work, we investigated the influence of obesity on the immune response to infection by Plasmodium berguei ANKA. For this, mate C57BL/6 mice aged 4 to 6 weeks were used, fed by a high fat diet with 60% of kilocalories from lipid, for 12 weeks. After this period the animais were infected with the strain ANKA of Plasmodium berguei. There was an increase in body weight as well as the perigonadal fat in animais fed with the high fat diet, without increasing the food intake, from the second week of dieting. The resistance to the deveiopment of severe maiaria was observed in the obese animais, beside of control the parasitemia, oniy those animais survived the infection for 25 days post challenge, without any clinicai symptoms of the disease, unlike infected non obese, who died after eight days of infection. Differences were observed in the cell profile of infected obese animais compared to infected controls, suggesting that prior infiammation in obese animais may have infiuenced the course of infection. Thus, the resuits indicate that changes in the immune response of obese mice can protect against the deveiopment of severe maiaria.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical, 2015.
Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-06-29T17:06:58Z No. of bitstreams: 1 2015_DaniloCorazza_Parcial.pdf: 479104 bytes, checksum: bcf2308e28506da1d7ea87452e96914e (MD5)
Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-20T11:42:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_DaniloCorazza_Parcial.pdf: 479104 bytes, checksum: bcf2308e28506da1d7ea87452e96914e (MD5)
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A malária ainda é um problema grave para a saúde pública mundial, com bilhões de pessoas vivendo em áreas de risco de infecção, e milhões de pessoas acometidos pela doença, levando a cerca de quase um milhão de mortes anualmente. É uma doença febril aguda e nas formas graves pode apresentar prostração, alteração do estado de consciência, convulsões e edema pulmonar. As manifestações patológicas como o paroxismo febril, malária cerebral e choque, são decorrentes da resposta inflamatória exacerbada, com consequente aumento da adesão de células e o sequestro de eritrócitos principalmente no endotélio das vênulas pós-capilar. A pentoxifilina (PTX) é uma droga com capacidade imunomoduladora, regulando a produção de citocinas inflamatórias como o fator de necrose tumoral (FNT) e com potencial uso para prevenir as formas graves da malária por diminuir a produção do FNT. Este trabalho avaliou a influência da PTX sobre as alterações histopatológicas do cérebro, fígado e pulmão em camundongos susceptíveis ou não as formas graves da malária. Foram estudados camundongos machos com 8 semanas de idade das linhagens C57BL/6, CBA e BALB/c compondo quatro grupos, sendo que dois grupos foram infectados com 106 eritrócitos parasitados com Plasmodium berghei ANKA, tratados a partir do terceiro dia após a infecção, com 8mg/kg/dia de PTX e o outro grupo tratado com NaCl 0,9%. Outros dois grupos não foram infectados porém, seguiram o mesmo tratamento com PTX e NaCl 0,9%. No sexto dia da infecção os camundongos foram sacrificados e após perfusão cardíaca, foram retirados os órgãos (cérebro, fígado e pulmão), e procedido o processamento histológico. As lâminas foram coradas com Hematoxilina-Eosina (HE) e avaliadas em microscopia óptica. Observamos que a PTX foi capaz de diminuir a necrose de neurônios nos modelos CBA e BALB/c, porém, o contrário foi observado no modelo C57BL/6, onde a droga aumentou a necrose de neurônios no cérebro. Observamos também que no córtex cerebral, a PTX aumentou a congestão vascular no modelo C57BL/6, mas diminuiu a congestão vascular nos camundongos CBA e BALB/c. No fígado dos camundongos C57BL/6 e BALB/c dos animais infectados e tratados com a PTX observamos menor número de células de Kupffer com pigmento malárico. No pulmão dos camundongos C57BL/6 observamos aumento da permeabilidade da membrana alvéolo-capilar, que também foi observada nos camundongos CBA e no BALB/c após infecção pelo plasmódio. Contudo, após a administração da PTX, houve redução na congestão vascular. Nossos dados sugerem que as três linhagens de camundongos possuem mecanismos diferentes de resposta em cada órgão, evidenciando a heterogeneidade da influência da droga em camundongos com diferentes bases genéticas, e evidenciando a necessidade de melhor esclarecimento das vias pelas quais a droga age em cada órgão.
Malaria is still a major problem for global public health, with billions of people in contamination risk areas, and millions affected by the disease, leading to around nearly one million deaths annually. It is an acute febrile illness and in severe forms can present prostration, altered state of consciousness, seizures and pulmonary edema. Pathological manifestations, as febrile paroxysm, cerebral malaria and shock, are due to the increased inflammatory response, with consequent increase in cell adhesion and sequestration of erythrocytes mainly in the endothelium of post-capillary venules. Pentoxifylline (PTX) is a drug with immunomodulatory capacity, regulating the production of inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor (TNF), and with a potential use to prevent severe forms of malaria by reducing the production of TNF. This study evaluated the influence of PTX on the histopathological changes in the brain, liver and lung in mice susceptible or not to severe forms of malaria. C57BL/6, CBA and BALB/c male mice (8 weeks old) were studied. They comprised four groups, in which two were infected with 106 Plasmodium berghei ANKA parasitized erythrocytes and treated with PTX (8 mg/kg/day) or 0.9% NaCl from the third day after infection onward. The two other remaining groups were not infected, but followed the same treatment, with PTX or 0.9% NaCl. On the sixth day after infection, mice were sacrificed and underwent to a cardiac perfusion, the organs were removed (brain, liver and lung) and carried to a histological processing. The slides were stained with hematoxylin-eosin (HE) and evaluated by light microscopy. We observed that the PTX was able to decrease neuronal necrosis in CBA and BALB/c mice. However, the opposite was observed in C57BL/6 mice, in which PTX increased the neuronal necrosis in brain. We also observed that in the cerebral cortex, PTX increased vascular congestion in C57BL/6 model, but decreased vascular congestion in CBA and BALB/c mice. In the liver of the C57BL/6 and BALB/c mice of infected animals that were treated with PTX, it was observed fewer Kupffer cells showing malaria pigment. In lungs of C57BL/6 mice, there was an increase in the permeability of the alveolar-capillary membrane, which was also observed in CBA mice after Plasmodium infection. However, after treatment with PTX, there was a reduction in vascular congestion. Our data suggest that the three strains of mice have different mechanisms of response in each organ, showing the heterogeneity of drug influence, and highlighting the need to better understanding of the ways by which the drug acts in each organ from each of these experimental malaria models.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2015-06-08T17:59:33Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoRespostaInflamatoria.pdf: 1919267 bytes, checksum: c50878eb5031e9aca92984be34efef40 (MD5)
Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2015-06-18T13:09:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_CaracterizacaoRespostaInflamatoria.pdf: 1919267 bytes, checksum: c50878eb5031e9aca92984be34efef40 (MD5)
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FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A malária cerebral (MC) é uma das complicações mais graves resultante da infecção por P. falciparum e a principal causa de morte em crianças. O quadro de MC apresenta uma patogênese complexa, associado a complicações neurológicas provenientes de uma resposta imunológica exacerbada, bem como eventos hemorrágicos. Estudos descrevem uma retinopatia associada ao quadro, juntamente com um intenso processo de astrogliose nas proximidades de vasos que nutrem o tecido retiniano. O presente trabalho buscou caracterizar o processo inflamatório e as possíveis alterações neuroquímicas e eletrofisiológicas no tecido retiniano de camundongos albino suíço, quando inoculados com a cepa ANKA de Plasmodium berghei (PbA). Camundongos albino suíço foram infectados com cepa PbA. Para caracterização do quadro de malária cerebral experimental (MCE) foram avaliados diversos parâmetros, como surgimento dos sinais clínicos, curva de sobrevivência, parasitemia (%), ganho de massa corpórea, permeabilidade vascular e quantificação de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) no tecido cortical. Para avaliarmos alterações na funcionalidade do tecido retiniano, utilizamos eletrorretinograma de campo total. Para a avaliação dos sistemas de neurotransmissão foi realizado ensaio de liberação e captação de glutamato e GABA que, posteriormente foi quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Para análise da resposta inflamatória foi realizada a quantificação de citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-10) no tecido retiniano. Após a caracterização do quadro de MCE nós observamos a diminuição da amplitude de onda-b de cones e bastonetes, bem como aumento do tempo implícito de bastonetes, respostas mistas em diferentes intensidades e potencial oscilatório. Observamos aumento na liberação e captação de glutamato e, ainda, a ativação de uma via antiinflamatória no tecido retiniano. Este trabalho nos permitiu validar o modelo murino de MCE e caracterizar, pela primeira vez, alterações na funcionalidade do tecido retiniano, acompanhada de alterações no sistema glutamatérgico, bem como ativação de uma via antiinflamatória no tecido retiniano.
Cerebral malaria (CM) is one of the most serious complications resulting from infection by P. falciparum and the leading cause of death in children. The CM frame has a complex pathogenesis associated with neurological complications arising in an enhanced immune response as well as hemorrhagic events. Studies describing retinopathy associated with the frame, together with an intense process of astrogliosis in the vicinity of retinal vessels that nourish the tissue. This paper sought to characterize the inflammatory process and the possible neurochemical and electrophysiological changes in the retinal tissue of Swiss albino mice, when inoculated with Plasmodium berghei ANKA strain (PbA). Swiss albino mice were infected with PbA strain. To characterize the above experimental cerebral malaria (ECM) was evaluated several parameters, such as onset of clinical signs, survival curves parasitemia (%) and body mass gain, vascular permeability and quantification of cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-10) in the cortical tissue. To evaluate changes in retinal tissue functionality, use full-field electroretinography. For the evaluation of neurotransmitter systems release assay was performed and uptake of glutamate and GABA which was then quantified by High Performance Liquid Chromatography. The inflammatory response analysis was performed to quantify the cytokines (TNF-α, IL-6 and IL-10) in retinal tissue. After characterizing the MCE framework we observe a reduction in the amplitude of b-wave of rods and cones, as well as increase the implicit time of rods, mixed responses at different intensities and oscillatory potential. We observed an increase in the release and glutamate uptake and also the activation of an anti-inflammatory pathway in retinal tissue. This study allowed us to validate the murine model of MCE and characterize for the first time, changes in the retinal function accompanied by changes in the glutamatergic system as well as activation of the inflammatory pathway in retinal tissue.

Tese de mestrado, Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia), 2009, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências
Resumo alargado em português disponível no documento
Malaria is a major infectious disease worldwide, causing ~1 million deaths each year due to severe complications, one of the most lethal being cerebral malaria (CM). Thereby, understanding CM pathogenesis is of vital importance for developing effective therapies against it. The experimental cerebral malaria (ECM) model of C57BL/6 mice infected with P. berghei ANKA (PbA) shares many similarities with human CM. However, whereas in humans a critical event is sequestration of Plasmodium-infected red blood cells (iRBCs) in the brain microvasculature, in rodents is mostly leukocyte sequestration that occurs. Thereby, the pathologic significance of iRBCs brain sequestration during ECM is controversial and remains to be clarified. Recently, it was shown that heme-oxygenase-1 (HO-1) plays a crucial role in protection against ECM, which appears to be mediated by carbon monoxide (CO) production, an end-product of its enzymatic activity. In fact, administration of CO by inhalation rescues all C57BL/6 PbA-infected mice from developing ECM. The present study shows that CO protection comprises the reduction of iRBC brain sequestration in infected mice, supporting the importance of this process in ECM pathogenesis and the relevance of C57BL/5 PbA-infected mouse model to study CM. Moreover, our results indicate that CO has a therapeutic potential as a molecule with anti-inflammatory and anti-chemotaxis effects. We also demonstrate that CORM-2, a CO-relasing molecule (CORM-2), mimics CO protection against ECM, suppressing neuroinflammation and parasite sequestration in the brain. Importantly, CORM-2 does not induce formation of carboxyhemoblogin, circumventing CO inhalation toxicity. Moreover, CORM-2 inhibits platelet aggregation and loss of RBC deformability, which likely contributes to prevent disease development. Additionally, CORM-2 also leads to an arrest in parasite load, which origin and relevance is not clear. Altogether, these results indicate that CO-RMs seem to represent a novel class of drugs with therapeutic potential to protect the host from cerebral malaria.

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia Aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências. 2011
Malaria is an infectious disease caused by an intracellular parasite (genus Plasmodium). Sequestration of mature erythrocytic forms of P. falciparum is a key factor in the development of severe malaria-associated pathologies, namely CM. Brains of patients that died of CM show a preferential sequestration of the MF, and blood-smears of malaria patients at hospital admission show exclusively immature erythrocytic forms. Recently, it was demonstrated that in PbA-infected C576BL/6 mice, an experimental cerebral malaria model, there is accumulation of pRBCs in the brain, as well as CD8+T cells. On the contrary, PbA-infected Balb/C mice, which don‟t develop ECM, don‟t accumulate these cell-populations. PbNK65-infected C57BL/6 mice also don‟t develop ECM, though they accumulate CD8+T cells in the brain, but not infected erythrocytes. Using these models of malaria, our main goal was to study the blood-stage dynamics and sequestration capabilities of both parasite strains and associate that pattern with the pathology. Results show that MF of both parasite strains are not seen in circulation at a certain point in infection. Also, this disappearance from circulation is concomitant with sequestration of PbA schizonts in the spleen and lungs (C57BL/6 mice), as well as in the fat tissue and liver (both hosts). In addition, we wanted to clarify the importance of parasite versus host in cytoadherence of pRBCs to the brain microvasculature. Our results suggest that the absence of PbNK65 sequestration in the brain of C57BL/6 mice is mainly due to differences between this parasite and PbA in its intrinsic cytoadherence capability. Moreover, we observed a significant difference in numbers of merozoites formed per schizont between PbNK65 and PbA infections, which might account for the differences in parasitaemia growth rates and infectivity that have been described for these strains.
A malária é uma doença infecciosa responsável por mais de 225 milhões de infecções e 781 000 mortes por ano, a grande maioria de crianças até aos 5 anos de idade [1]. O seu impacto faz-se sentir não só a nível social, mas também a nível económico, sendo umas das causas da perpetuação do ciclo de pobreza que é vivido nos países afectados por esta doença [2]. A malária é causada por um parasita eucariota intracelular, do género Plasmodium, transmitido através da picada de um mosquito do género Anopheles, que pode infectar mamíferos, répteis e aves. No Homem, a malária pode ser decorrente da infecção por cinco espécies diferentes: P. falciparum, P. vivax, P. malariae, P. ovale e P. knowlesi [3]. Os parasitas do género Plasmodium têm um ciclo de vida complexo que se divide entre a fase sexuada, no vector invertebrado, e a fase assexuada, no mamífero. A infecção inicia-se quando o mosquito se alimenta de sangue de um mamífero e deposita na sua derme os esporozoítos [4]. Estes entram na corrente sanguínea, através da qual migram até atingir o fígado, onde irão dar início à fase hepática da infecção, clinicamente silenciosa. Dentro dos hepatócitos, cada esporozoíto irá desenvolver-se, dando origem a milhares de outros parasitas – merozoítos. Estes acabarão por sair da célula-hospedeira em grupos de uma a duas centenas, em vesículas envoltas por membranas do próprio hepatócito [5, 6], chamadas merosomas. Os merosomas entram na corrente sanguínea [5] e tendem a acumular-se a nível dos alvéolos pulmonares [6], onde irão lisar e libertar os merozoítos. Estes infectam eritrócitos, dando início à fase sanguínea da infecção, a fase sintomática da malária [6]. Dentro dos glóbulos vermelhos, o parasita aumenta de tamanho, desenvolvendo-se da forma imatura, em anel, até ao trofozoíto. Nesta fase, o parasita continua a aumentar de tamanho, iniciando-se a replicação de DNA e a produção de cristais de hemozoína, como resultado da digestão da hemoglobina da célula-hospedeira [7]. O momento de passagem a esquizonte dá-se quanto se inicia a esquizogenia. Este processo consiste num conjunto de mitoses assimétricas e assíncronas consecutivas que dão origem a múltiplos parasitas (merozoítos) dentro do eritrócito infectado [8]. Os merozoítos, aquando da lise da célula-hospedeira, libertam-se na corrente sanguínea e infectam outros eritrócitos, dando assim início a um novo ciclo de desenvolvimento sanguíneo. Durante a fase sanguínea, alguns parasitas intraeritrocíticos podem diferenciar-se em gametócitos femininos e masculinos, em resposta a stress ou outros factores. Os gametócitos, ao serem ingeridos por um mosquito numa refeição de sangue, sofrem fusão meiótica e um complexo processo de desenvolvimento que culmina na acumulação de esporozoítos nas glândulas salivares do mosquito. Estes podem ser introduzidos no hospedeiro mamífero na próxima refeição de sangue, assegurando assim a perpetuação da espécie [9]. As formas sanguíneas maturas (FSM) de P. falciparum podem ser sequestradas em vários órgãos [10] e esta característica está associada ao grau de severidade da doença [11]. A capacidade de citoaderência tem vindo a ser considerada um factor-chave no desenvolvimento de patologias severas associadas à malária, nomeadamente no desenvolvimento de malária cerebral (MC) [12, 13]. No cérebro de doentes que morreram de MC há sequestração prefencial das FSM, e os parasitas encontrados nos esfregaços de sangue de pacientes que deram entrada em hospitais com malária severa apresentam exclusivamente formas imaturas em anel [10]. Ratinhos C57BL/6 infectados com P. berghei ANKA (PbA) são o modelo de MC mais usado. Foi recentemente demonstrado neste modelo a sequestração de eritrócitos parasitados (EP) no cérebro, assim como de células T CD8+, durante o desenvolvimento da patologia [14]. No entanto, ratinhos Balb/C infectados com o mesmo parasita não desenvolvem malária cerebral experimental (MCE). Foi descrito que no cérebro destes ratinhos não ocorre sequestração, nem de células T CD8+, nem de EP [14]. Curiosamente, ratinhos C57BL/6 infectados com P. berghei NK65 também não desenvolvem MCE nem sequestram EP, embora sequestrem células T CD8+ no cérebro [14]. Não é ainda claro se, durante a MCE, as FSM são as únicas que sequestram ou se estão presentes em circulação, tal como na MC humana. Usando os modelos murinos de malária referidos acima, o objectivo principal deste trabalho é o estudo da dinâmica das formas sanguíneas e a capacidade de citoaderência das duas estirpes de P. berghei, e a sua possível relação com sinais de doença observados nestes animais. Os nossos resultados mostram que, nas combinações de parasita-hospedeiro estudadas, as FSM de PbA e de PbNK65 dimiminuem proporcionalmente em circulação, em determinados fases da infecção in vivo e voltam a aumentar em proporção mais tarde na infecção. Para determinar se o desaparecimento de circulação das FSM de PbA é devido à sua sequestração em algum órgão ou à eliminação do parasita no baço, infectámos ratinhos C57BL/6 ou Balb/C com uma linha de PbA que expressa uma proteína de fusão, a Luciferase-GFP, apenas nas FSM. Em diferentes fases da infecção, e após perfusão para eliminar os parasitas circulantes, determinados órgãos foram extraídos (baço, fígado, pulmões e tecido adiposo) e o conteúdo em luciferase foi determinado por técnicas de bioimagiologia. Os nossos resultados mostram que as FSM de PbA sequestram a nível do baço e dos pulmões (nos ratinhos C57BL/6 infectados), assim como no tecido adiposo e fígado (em ambos os hospedeiros), sequestrando proporcionalmente muito mais no baço e no tecido adiposo. Esta sequestração é concomitante com uma diminuição da proporção destas formas em circulação. É de referir que os baços de ratinhos Balb/C eram mais escuros e de maiores dimensões do que os baços de ratinhos C57BL/6, o que pode indicar um maior conteúdo em hemozoína e uma maior proliferação celular. Isto sugere uma maior eliminação do parasita pelo baço nos ratinhos Balb/C comparativamente com os ratinhos C57BL/6. No entanto, a quantidade de esquizontes viáveis sequestrados é significativamente inferior nos ratinhos Balb/C do que nos ratinhos C57BL/6. Pretendíamos também esclarecer a importância relativa do parasita versus hospedeiro na citoaderência de EP à microvasculatura cerebral, durante o desenvolvimento de MC. Especificamente, pretendíamos perceber se a ausência de sequestração de EP de PbNK65 no cérebro de ratinhos C57BL/6 é devida à incapacidade destes EP aderirem ao endotélio activado, ou se poderão haver diferenças no micro-ambiente gerado no cérebro em resposta ao parasita que possam explicar esse fenótipo. Para isso, co-infectámos ratinhos C57BL/6 com PbNK65-GFP e PbA. Usando PCR-quantitativo em tempo real, medimos a expressão de GFP (e portanto a presença do parasita PbNK65) nos cérebros destes ratinhos, na fase final de MC. Os nossos resultados sugerem que os EP por PbNK65 não são sequestrados no cérebro de ratinhos C57BL/6, devido à sua incapacidade intrínsica de aderir ao endotélio activado. Este projecto pretendia clarificar a dinâmica das formas circulantes e a capacidade de citoaderência de duas estirpes de P. berghei, e a forma como estes padrões se podem correlacionar com a patologia. Os resultados não são conclusivos e mais experiências têm de ser realizadas para elucidar este assunto. No entanto, consideramos que indiciam diferenças entre os mecanismos de sequestração no cérebro em relação a outros órgãos, de PbA, assim como de PbNK65. Os nossos resultados também sugerem que existem diferenças intrínsecas ao parasita na capacidade de citoaderência de EP por PbA versus EP por PbNK65 à microvasculatura cerebral. Além disto, observámos uma diferença significativa no número de merozoítos formados por cada esquizonte, entre a infecção sanguínea por PbA e por PbNK65. Sugerimos que este facto pode estar na origem das diferenças já descritas [15] entre as duas estirpes de P. berghei no que diz respeito à taxa de crescimento de parasitémia e infecciosidade.

Severe manifestations of malaria, including cerebral malaria (CM) and respiratory distress, result in approximately three million deaths annually worldwide. Currently, relatively little is known about severe disease pathogenesis. The development and outcome of severe malaria is determined by host-pathogen interactions, a complex interface of genetics and immune responses. Hypothetically, a spectrum of genetic susceptibility and resistance to severe disease exists within the host population, and malaria infection results in diverse host and parasite responses that impact disease outcome. The aim of this study was to identify differential host and parasite responses in a murine model of severe malaria, Plasmodium berghei ANKA (PbA), in CM-susceptible and CM-resistant mice; and to analyze host genetics in patients with severe disease due to Plasmodium falciparum. In vivo, expression microarray analysis showed that, in malaria target organs, differential responses were related to immune response – primarily interferon and complement pathways – and apoptosis. Histopathological examination of the brain confirmed an increased prevalence of apoptosis in CM-susceptible mice. Further examination of the role of complement in CM-susceptibility determined that early complement 5 (C5) activation conferred susceptibility to CM, and that C5 deficiency conferred resistance, which could be recapitulated by antibody blockade of activated C5 or its receptor in susceptible mice. Additionally, single nucleotide polymorphism (SNP) studies identified that complement receptor 1 SNPs were associated with disease severity in patients with P. falciparum malaria. PbA parasites displayed a unique transcriptional signature in each tissue examined (brain, liver, spleen and lung), showed differential gene expression between CM-resistant and susceptible hosts, and were most prominent in lung tissue. Closer examination of lung involvement in PbA infection revealed that PbA-infected C57BL/6 mice develop acute lung injury (ALI), defined by disruption of the alveolar-capillary membrane barrier. ALI susceptibility did not correlate with CM susceptibility, but was influenced by peripheral parasite burden and CD36-mediated parasite sequestration in the lung. PbA provides a clinically relevant experimental model for CM and ALI, through which important disease mechanisms can be identified and modulated. Ideally, the use of such models aids in the discovery of disease biomarkers and novel therapeutic strategies, which may be applied to human severe and cerebral malaria.