Academic literature on the topic 'Pluripotencia'

Pocos avances recientes han revolucionado tanto la biología del desarrollo como la reprogramación de células por transferencia nuclear. Desde 1952 a la fecha, se ha acumulado suficiente información teórica así como tecnologías de avanzada, para desmitificar el paradigma de la irreversibilidad de la diferenciación celular. El cigoto totipotente cuando empieza a segmentarse da origen al blastocisto, estado embrionario cuyas células de la masa celular interna son pluripotentes y capaces de originar los linajes celulares de las tres capas germinales. Estas células son las denominadas células madre embrionarias. La diversidad celular en un organismo adulto es consecuencia del control epigené- tico de la expresión génica que restringe progresivamente la pluripotencia y permite que algunas de ellas proliferen continuamente durante la vida del individuo, otras estén en reposo proliferativo y unas pocas alcancen una masa adecuada y dejen de proliferar. Sin embargo en todas estas poblaciones celulares, existen grupos pequeños que son pluripotentes y se denominan células madre adultas. La transferencia de núcleos somáticos a citoplasma de ovocitos o de cigotos demostró que su información genética puede ser reprogramada y regresarla al estado de pluripotencia. Los conocimientos señalados, han permitido emplear esta biotecnología con fines reproductivos y terapéuticos pero cuya aplicación en humanos es cuestionada desde el punto de vista de la bioética. Recientemente se ha logrado fusionar células madre embrionarias con células somáticas adultas, logrando que la célula hibrida resultante vuelva al estado pluripotente. Además se ha descubierto que la pluripotencia es consecuencia de la

<p>A partir de diferentes estadios del desarrollo embrionario murino, es posible establecer in vitro cultivos de células troncales que presentan dos rasgos distintivos:<br />su capacidad para proliferar indefinidamente, dando lugar a nuevas células troncales (auto-renovación), y su capacidad de diferenciación a todos los tipos celulares que forman el organismo adulto (pluripotencia). Durante décadas,<br />el tránsito del estado pluripotente al estado de diferenciación terminal fue considerado irreversible; sin embargo, en la actualidad es posible revertir este proceso e inducir la pluripotencia en células somáticas mediante la expresión de<br />factores de transcripción que regulan la identidad de las células troncales embrionarias. Este proceso, denominado reprogramación celular, da lugar a la generación<br />de células troncales pluripotentes inducidas (iPSCs), que presentan características moleculares y funcionales similares a las de células troncales embrionarias (ESCs). Por ello, las células reprogramadas son una valiosa herramienta<br />en Biomedicina, y están siendo empleadas para modelar enfermedades humanas o para la búsqueda de nuevos tratamientos en patologías que no responden<br />a los enfoques clínicos tradicionales.</p>

Introducción: El proceso de regeneración puede ocurrir en múltiples niveles de la organización biológica y la habilidad de los diferentes organismos para regenerar partes faltantes es altamente variable. El gen Nanog es un factor de transcripción en células madre embrionarias; se cree que es clave en el mantenimiento de la pluripotencia. Objetivo: Determinar la filogenia de la inactivación de los genes Nanog postembrionario en comparación con el Ambystoma mexicanum. Materiales y métodos: Se utilizó un diseño cualitativo, basado en la revisión y recolección de las secuencias genómicas con datos del Genbank, donde se compararon las secuencias de nucleótidos por BLAST, se trabajó con el software de alineamiento genético MEGA, para alinear las secuencias y se construyeron dendogramas de Neighbor Joining. Resultados: Se observó que las especies con mayor similitud con el Ambystoma mexicanum son las aves, al contar con una distancia evolutiva menos amplia que la del Homo sapiens, entre las que encontraron Taeniopygia guttata, Zonotrichia albicollis, una especie en particular es el Ornithorhynchus anatinus. Conclusión: El Ambystoma mexicanum y el Homo sapiens presentan un alto grado de distancia genética por ser pocas las secuencias genómicas del gen Nanog que comparten, en comparación con otras especies que comparten más secuencias genómicas. Se cree que para inducir la regeneración en humanos lo mejor sería poder reproducir los procesos que la naturaleza nos muestra en animales como la salamandra. Este proceso parece bloquear la formación del blastema. En principio, los genes o moléculas que atenúan la inflamación o que bloquean la remodelación de la matriz podrían favorecer una respuesta regenerativa al impedir la cicatrización.

Se analizaron las propiedades biológicas de las células madre mesenquimales (CMM) provenientes del líquido sinovial de las articulaciones de las extremidades de caballo. Las muestras fueron caracterizadas por su peculiaridad de adherirse al plástico de los frascos de cultivos. Se utilizó la técnica de campos electromagnéticos (MACS) y el biomarcador de superficie STRO-1 con la finalidad de optimizar su aislamiento mediante el enriquecimiento de células precursoras mesenquimales (CMM-LS). Para determinar la expresión de los genes multipotencia, se extrajo el ARN total y se usó la transcriptasa reversa M-MLV para el ADNc, el que sirvió como molde para la qPCR (PCR cuantitativa). El qPCR se realizó utilizando el sistema BioRad con cuantificación mediante Sybr Green. Los genes de multipotencia cuantificados fueron OCT4 y NANOG. Las células seleccionadas utilizando MACS con el biomarcador de superficie STRO-1 (CMM-LS STRO-1), proliferan más rápidamente que las CMM-LS obtenidas sin purificar. Además, manifestaron una mayor predisposición a diferenciarse en condrocitos y osteocitos en comparación a las CMM-LS sin purificar, y una menor predisposición a diferenciarse en adipocitos. Así mismo, la expresión de OCT-4 fue significativamente superior en la CMM-LS STRO-1 en comparación con las CMM-LS sin purificar. La expresión de NANOG fue ligeramente superior en las CMM-LS STRO-1, pero sin diferencia significativa. Los resultados hacen suponer que la coexpresión de OCT-4 y Nanog podrían incrementar las funciones fisiológicas de las CMM-LS STRO-1 relacionadas con una mejor proliferación, autorrenovación y la predisposición a diferenciarse en los linajes osteocondrales; sin embargo, se necesita aclarar el papel funcional de estos marcadores de pluripotencia en células madre adultas.

Las células madre embrionarias (CME) son derivadas de la masa celular interna de blastocitos de mamíferos y debido a su pluripotencia in vitro e in vivo son capaces de generar los 200 tipos celulares identificados en el organismo. El uso de medios selectivos suplementados con determinados factores y la expresión artificial de genes que regulan vías de diferenciación específicas, ha permitido dirigir in vitro la diferenciación de las CME hacia tipos celulares especializados somáticos como células neuronales, cardiacas, etc. Recientes estudios han demostrado que la diferenciación espontánea de las CME, también puede dar origen in vitro a células de tipo germinal que posteriormente se desarrollan hacia células similares a gametos, como son los espermatozoides y óvulos. Lo anterior plantea la interesante idea de generar sistemas in vitro, que permitan dirigir la diferenciación de las CME hacia la formación in vitro de gametos. El desarrollo de estos sistemas tendrá un impacto directo en el entendimiento molecular de la programación genética, que interviene en los procesos de la oogénesis y espermatogénesis, así como el desarrollo de protocolos más eficientes para la clonación animal, clonación terapéutica, fertilización in vitro y transferencia de embriones. En relación a lo anterior, nuestro grupo de trabajo se ha enfocado al estudio de genes denominados ̈maestros ̈, cuya expresión además de darse en etapas muy tempranas de la determinación de la línea germinal, está en relación directa con el correcto desarrollo de las células germinales en los ovarios y testículos, características que los hace candidatos a ser utilizados para dirigir la diferenciación de las CME hacia células de linaje germinal. DOI: https://doi.org/10.54167/tecnociencia.v2i1.67

Homeobox a1 (Hoxa1) is one of the most rapidly induced genes in ES cell differentiation and it is the earliest expressed Hox gene in the mouse embryo. In this study, we used genomic approaches to identify Hoxa1-bound regions during early stages of ES cell differentiation into the neuro-ectoderm. Within 2 h of retinoic acid treatment, Hoxa1 is rapidly recruited to target sites that are associated with genes involved in regulation of pluripotency, and these genes display early changes in expression. The pattern of occupancy of Hoxa1 is dynamic and changes over time. At 12 h of differentiation, many sites bound at 2 h are lost and a new cohort of bound regions appears. At both time points the genome-wide mapping reveals that there is significant co-occupancy of Nanog (Nanog homeobox) and Hoxa1 on many common target sites, and these are linked to genes in the pluripotential regulatory network. In addition to shared target genes, Hoxa1 binds to regulatory regions of Nanog, and conversely Nanog binds to a 3′ enhancer of Hoxa1. This finding provides evidence for direct cross-regulatory feedback between Hoxa1 and Nanog through a mechanism of mutual repression. Hoxa1 also binds to regulatory regions of Sox2 (sex-determining region Y box 2), Esrrb (estrogen-related receptor beta), and Myc, which underscores its key input into core components of the pluripotential regulatory network. We propose a model whereby direct inputs of Nanog and Hoxa1 on shared targets and mutual repression between Hoxa1 and the core pluripotency network provides a molecular mechanism that modulates the fine balance between the alternate states of pluripotency and differentiation.

As gastrulation proceeds, pluripotential stem cells with the capacity to contribute to all primary germ layers disappear from the mammalian embryo. The extinction of pluripotency also occurs during the formation of embryoid bodies from embryonic stem (ES) cells. In this report we show that if the initial differentiated progeny are removed from ES cell aggregates, further differentiation does not proceed and the stem cell population persists and expands. Significantly, the presence of even minor populations of differentiated cells lead to the complete loss of stem cells from the cultures. This finding implies that the normal elimination of pluripotent cells is dictated by inductive signals provided by differentiated progeny. We have exploited this observation to develop a strategy for the isolation of pluripotential cells. This approach, termed stem cell selection, may have widespread applicability to the derivation and propagation of stem cells.

The adaptive response of cells to external stimuli is an intriguing mechanism at the basis of the existence of life itself. For this purpose, signalling pathways and gene regulatory networks elegantly evolved translating extracellular signals into finely tuned cellular responses. Among them, the Wnt/ß-catenin signalling pathway converges on the regulation of ß-catenin protein, which, in turn regulates target gene expression. In particular the Wnt/ß-catenin pathway plays a pivotal role in sustaining pluripotency and somatic cell reprogramming. Here we identified a temporal of Wnt/ß-catenin activity during somatic cell reprogramming, controlling the expression levels of mesenchymal-to-epithelial transition and senescence-associated genes through TCF1. We demonstrated that the “Wnt-OFF” state is an early reprogramming marker and that dynamic modulation can be effectively used to increase the reprogramming efficiency. Furthermore the Wnt/ß-catenin pathway is a key regulator of pluripotency and self-renewal of mouse embryonic stem cells (mESCs) and a small-molecule activator of the Wnt pathway is widely used to maintain embryonic stem cells in a ground state of pluripotency. The role of ß-catenin in mESCs is however still controversial. We noticed available ß-catenin knock-out models are flawed by the production of N-terminally truncated proteins with unknown functions. We therefore generated a novel ß-catenin knock-out using CRISPR/Cas9 technology, hoping to have clearer insight of ß-catenin functions in mESCs. We have also found that ground state pluripotency promoted by sustained Wnt pathway activation cannot be maintained indefinitely, resulting in a “lapsed” ground state possibly due, among other factors, to regulatory negative feedback loops that impair Wnt/ß-catenin activity.
La respuesta adaptativa de las células a estímulos externos es un mecanismo fundamental de la existencia de la vida en sí misma. Para este fin, rutas de señalización y redes de regulación génica evolucionaron elegantemente, traduciendo señales extracelulares en respuestas celulares calibradas con precisión. Entre ellas, la ruta de señalización de Wnt/ß-catenin converge en la regulación de la proteína ß-catenin, que a su vez regula la expresión de genes diana. En particular, la ruta de Wnt/ß-catenin tiene un rol fundamental en el mantenimiento de la pluripotencia y la reprogramación de células somáticas. En esta tesis hemos identificado un papel temporal de actividad de Wnt/ß-catenin durante la reprogramación de células somáticas, lo que controla los niveles de expresión de genes asociados a transición mesenquima-epitelial y senescencia a través de TCF1. Además, la ruta de Wnt/ß-catenin es un regulador clave de la pluripotencia y la auto-renovación de células madre embrionarias de ratón (mESCs). Una pequeña molécula, activadora de la ruta Wnt es usada comúnmente para mantener las células madre embrionarias en “ground state” de pluripotencia. Sin embargo, el rol de la ß-catenin en las mESCs es aún controvertido. Observamos que los modelos disponibles de Knock-Out de ß-catenin producen proteínas truncadas en N-terminal con funciones desconocidas. Por ello, generamos un nuevo Knock-Out usando CRISPR/Cas9, al fin de clarificar funciones de ß-catenina en mESCs. Hemos encontrado también que el “ground state” de pluripotencia promovido por la activación sostenida de Wnt no puede ser mantenido indefinidamente, resultando esto en un“ lapsed ground state”; debido posiblemente, entre otros factores, a feedback-loop negativos que afectan negativamente la actividad de Wnt/ß-catenin.

X-Chromosome Reactivation (XCR) occurs in the epiblast cells of the blastocyst and in germ cells, thereby coupling XCR with pluripotency. We performed a screen in iPS cells by knocking down the expression of candidate genes picked from a single cell microarray expression profile in blastocysts. We thereby identified candidates which had an effect on both pluripotency and X-Reactivation. However, we also identified factors with a specific role in XCR. This suggests that XCR is not an absolute requirement for iPSC reprogramming and that the two processes can be uncoupled. Among these factors, there was the cohesin complex member Smc1a. In experiments based on Super resolution microscopy (STORM), we observed a preferential enrichment of Smc1a on the active compared to inactive X, suggesting a role in shaping the Xa structure. Therefore, we conclude that cohesin-mediated changes in X-chromosome structure are a key step during the XCR process.
La reactivación del cromosoma X (XCR) ocurre en las células epiblásticas del blastocisto y en las células germinales, acoplando XCR con la pluripotencia. Se realizó un cribaje durante la reprogramación de iPSC reduciendo la expresión de genes candidatos, seleccionados a partir de un microarray de expresión en blastocitos. Se identificaron factores con un efecto tanto en la pluripotencia como en la XCR y factores con un rol específico en la XCR. Esto sugiere que la XCR no es un requisito absoluto para la reprogramación de las iPSC, y que los dos procesos se pueden desacoplar. Se identificó el miembro Smc1a del complejo de cohesina. Mediante microscopía de súper resolución (STORM) se observó un enriquecimiento preferencial de Smc1a en el cromosoma X activo en comparación con el X inactivo, lo que sugiere un papel en la configuración de la estructura del X activo. Por lo tanto, concluimos que los cambios mediados por cohesina en la estructura del cromosoma X son un paso clave durante el proceso de XCR.

Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass (ICM) of the blastocyst and have the capacity for unlimited proliferation while retaining their potential to differentiate into a wide variety of cell types when cultured in vitro. These properties have made of human embryonic stem cells (hESC) an excellent model on which to study the conditions required for differentiation into specific cell lineages, and consequently the possibility of transplanting specific cell types into damaged tissues. The continued turn over of ESC while maintaining an undifferentiated state is dependent on unusual cell cycle properties. These unusual proliferative properties are responsible for the generation of tumours when these cells are injected into adult animals. Thus, the study of the unusual proliferative properties of hESC needs to be addressed if their potential is to be realized. To date, most studies of the cell cycle in hESC have been descriptive, lacking functional studies that reveal the mechanisms of how the cell cycle maintains pluripotency and self- renewal of hESC. In this thesis we sought to understand the mechanisms of cell cycle control of hESC. We asked the question if a single cell cycle gene could regulate the self-renewal or pluripotency properties of hESC using a gain and loss of gene function strategy. We have identified that the protein expression of the p27Kip1 cell cycle inhibitor was low in human pluripotent cells, but its expression increased during differentiation together with changes in the cell cycle structure of pluripotent cells. By adopting a gain and loss of function strategy we increased or reduced its expression in undifferentiating conditions to define its functional role in self-renewal and pluripotency of Hesc, using undifferentiation conditions, overexpression of p27Kip1 in hESC lead to a G1 phase arrest with an enlarged and flattened hESC morphology and consequently loss of self-renewal ability. Loss of p27Kip1 caused an increase of self-renewal while maintaining an undifferentiated phenotype. Moreover, we have shown that a change in the balance of p27Kip1 levels in undifferentiated hESC affects expression of the mesoderm markers: BRACHYURY and TWIST. We have found that expression changes of TWIST are associated with the presence of p27Kip1 protein in the TWIST1 gene promoter. The results presented in this thesis have interesting implications in stem cell biology. Firstly, these results define that the maintenance of p27Kip1 protein levels at a certain level is essential for self-renewal and pluripotency of hESC. Secondly, p27Kip1 is involved in the regulation of TWIST which is upregulated in several types of tumours and induces an epithelial-mesenchymal transition to facilitate tumor metastasis.
Las células madre embrionarias humanas (conocidas como hESC por sus siglas en inglés de human embryonic stem cells) son derivadas de la masa celular interna de los blastocistos y poseen la capacidad para auto-renovarse ilimitadamente, reteniendo su potencial para diferenciarse hace una amplia variedad de tipos celulares (pluripotencia), cuando son cultivadas in vitro. Estas propiedades permiten el estudio de las condiciones requeridas para la diferenciación hacia linajes específicos y la posibilidad de trasplantar tipos celulares específicos en tejidos dañados. El continuo recambio de las hESC al mismo tiempo que mantienen un estado de indiferenciación es dependiente de sus inusuales propiedades proliferativas. El objetivo de esta tesis doctoral fue el estudio de los mecanismos de control del ciclo celular de las hESC. Nos preguntamos si una única proteína del ciclo celular podría regular las propiedades de auto-renovación o pluripotencia de las hESC. En esta tesis doctoral identificamos que la expresión proteica del inhibidor del ciclo celular p27Kip1 era baja en diversas líneas celulares humanas pluripotentes pero aumentó durante la diferenciación, al mismo tiempo que la estructura del ciclo celular cambió. Mediante una estrategia de ganancia y pérdida de función, aumentamos o reducimos la expresión de p27Kip1 a fin de definir su función en la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC. En condiciones de indiferenciación, la sobreexpresión de p27Kip1 en las hESC resultó en un arresto del ciclo celular en fase G1 y un cambio hacia una morfología más grande y aplanada, y consiguiente pérdida de la propiedad de auto-renovación. La pérdida de p27Kip1 causó un aumento de la auto-renovación manteniendo un fenotipo indiferenciado. También, hemos demostrado que un cambio en la expresión de p27Kip1 en hESC indiferenciadas afecta la expresión de los reguladores de mesodermo: BRACHYURY y TWIST. Además, hemos descubierto que los cambios en la expresión de TWIST están asociados con la presencia de la proteína p27Kip1 en el promotor de TWIST1. Estos resultados definen que los niveles de expresión de p27Kip1 son críticos para la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC y sugieren una función para p27Kip1 en el control de la transición de epitelio a mesénquima.

El periodonto está formado por varios tejidos: la encía, el ligamento periodontal, el cemento radicular y el hueso alveolar. El periodonto tiene dos funciones fundamentales: protección e inserción. La función de protección la realizan la encía y el epitelio de unión, mientras que la función de inserción se desempeña a través del ligamento periodontal, el cemento radicular y el hueso alveolar.- El ligamento periodontal es un tejido celular altamente vascularizado que rodea la raíz del diente. Se compone por haces de fibras de tejido conectivo fibroso que unen el cemento radicular y la pared del alveolo. Presenta una mayor anchura en el extremo cervical, apical y en dientes funcionales, siendo más estrecho en la parte central y en dientes no funcionales. – Las enfermedades periodontales son un conjunto de entidades patológicas de causa infecciosa y naturaleza inflamatoria que afectan a los tejidos que rodean los dientes. Su etiología es multifactorial. La enfermedad periodontal es un importante problema de salud pública y el desarrollo de terapias efectivas para tratar esta enfermedad debería ser un objetivo principal de la comunidad científica. Dependiendo del grado de afectación y de la susceptibilidad del individuo se distinguen dos tipos de enfermedad periodontal: la gingivitis y la periodontitis. La gingivitis se define como la inflamación de los tejidos gingivales sin que exista pérdida ósea y se trata de la enfermedad periodontal más habitual. Sin embargo, si no se trata a tiempo, la gingivitis puede derivar a periodontitis, una enfermedad menos habitual pero con peores consecuencias, ya que afecta al 90% de la población por encima de los 35 años y es la primera causa de perdida de dientes en todo el mundo. La periodontitis se caracteriza por la destrucción del tejido periodontal, incluyendo el ligamento periodontal, el cemento, el hueso alveolar y la encía. La importancia de la periodontitis no está en su prevalencia sino en la morbilidad asociada que conlleva la pérdida de dientes, consecuencia final de la enfermedad periodontal destructiva. En general, se estima que la periodontitis provoca el 30-35% de todas las extracciones dentales. – El objetivo principal del tratamiento periodontal es de prevenir la pérdida de inserción y de regenerar los tejidos del soporte periodontal. En los últimos años se han utilizado diferentes técnicas de tratamiento periodontal, métodos destinados a reproducir o reconstituir una parte perdida o dañada de los tejidos de soporte dentario con el objetivo de restaurar la arquitectura y función de estos tejidos. Las técnicas no-quirúrgicas como la terapia mecánica convencional y los procedimientos quirúrgicos y materiales regenerativos, como por ejemplo la regeneración tisular guiada, el uso de injertos óseos, la aplicación de factores de crecimiento y la modulación de factores del huésped, así como la combinación de varias de estas técnicas. En la mayoría de los casos se consigue una curación a través de un epitelio largo de unión, pero no se consigue una reparación del cemento o el hueso. – Por esta razón se plantea la terapia celular como una posibilidad futura para regenerar el periodonto, la cual requiere la implicación de: células madre, moléculas de señalización y la matriz extracelular tridimensional. – Por definición, una célula madre es una célula indiferenciada que es capaz de autorenovarse y de diferenciarse hacia múltiples tipos celulares. Estas dos propiedades, en conjunto, permiten a las células madre proliferar y regenerar los tejidos perdidos o dañados. Las células madre se han podido aislar de una amplia variedad de tejidos y se pueden clasificar en 3 categorías: células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas y células madre adultas. – Las células madre embrionarias (ESC) son células pluripotentes, que se aíslan de la masa celular interna del blastocito. Las ESC tienen la capacidad de proliferar extensamente manteniéndose en un estadio indiferenciado pero, bajo unas condiciones adecuadas, son capaces de diferenciarse en células con características de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Aunque presentan un gran potencial de proliferación y se pueden mantener indefinidamente en cultivo en un estado indiferenciado, su uso en terapias regenerativas está limitado por cuestiones legales y éticas, ya que para su obtención es necesaria la utilización de embriones. Debido a ésto, se intentaron conseguir poblaciones de células madre pluripotentes a partir de células somáticas mediante modificación genética, llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Estas células tienen la ventaja de ser autólogas, al provenir del propio individuo, lo que evitaría los problemas de rechazo. Sin embargo, las manipulaciones genéticas pueden alterar el crecimiento y desarrollo de las células reprogramadas, lo que dificulta la previsibilidad de su comportamiento y, como tal, limita su aplicación terapéutica en la regeneración de tejidos. Como alternativa se aislaron las células madre adultas de prácticamente todo el cuerpo humano: médula ósea, sangre periférica, músculo esquelético, hígado, páncreas, epitelio de la piel y del intestino, pulpa dental, córnea, retina del ojo, sistema nervioso central y corazón. Sin embargo, la obtención de estas células madre resulta laboriosa, en algunos casos y, en otros, las células obtenidas tienen una capacidad de diferenciación limitada. – Nuestro grupo de investigación del Regenerative Medicine Research Institute de la UIC Barcelona ha conseguido aislar una nueva población de células madre adultas a partir de la pulpa dental de los terceros molares. El tercer molar es el último diente en desarrollarse y contiene una cantidad óptima de tejido pulpar para la extracción de células madre. Estas características de los terceros molares, junto con la utilización de un protocolo de cultivo específico, permitieron el aislamiento de una nueva población de células madre de la pulpa dental, las DPPSC (dental pulp pluripotent-like stem cells). Estas células, a diferencia de otras células madre adultas, tienen una capacidad regenerativa similar a la de las células madre embrionarias, al expresar marcadores de pluripotencia (Oct4, Nanog, Sox2 y Lin28) y tener la capacidad de diferenciarse a tejidos de las tres capas embrionarias, lo cual las convierte en una fuente muy prometedora de células madre para los estudios de medicina regenerativa. – El objetivo de esta tesis doctoral ha sido investigar el potencial regenerativo de las DPPSC para formar tejido periodontal nuevo in vitro usando dientes sanos y estériles como soporte. Nuestro estudio pretende reproducir la topografía de la superficie de la raíz natural del diente para favorecer la elongación celular perpendicular, condición óptima para la regeneración de las fibras periodontales. – Resultados – Se aislaron las células DPPSC del tercer molar y se cultivaron hasta pase 4. Se caracterizaron estas células a través de microscopia óptica y de microscopia electrónica de transmisión (TEM) donde se observaron que las células presentaban un tamaño pequeño, morfología triangular con un núcleo prominente y escaso citoplasma, característica especifica de las células embrionarias. – Para comprobar el fenotipo de las DPPSC indiferenciadas del cultivo primario se analizaron las células mediante citometría de flujo. Los resultados evidenciaron expresiones positivas para los marcadores de membrana: CD105 (92,15%), CD29 (99,63%), CD146 (15,54%), CD45 (0,02%) y para los marcadores de pluripotencialidad: OCT3/4 (70,72%) y NANOG (30,18%). Los resultados de la RT-PCR también revelaron la expresión genética positiva para los marcadores de pluripotencia OCT 3/4, NANOG y SOX-2. – Mediante el análisis de inmunofluorescencia se confirmó el fenotipo de las DPPSC indiferenciadas y los resultados mostraron la expresión del marcador de células adultas CD 13 y el marcador de pluripotencia SSEA4. – Para comprobar la estabilidad genética del cultivo antes de realizar la diferenciación periodontal se realizó la hibridación genética comparativa corta. El perfil genómico analizado en la muestra 8DD fue equilibrado y no se observó ninguna anormalidad cromosómica. – Después de la caracterización de nuestras células DPPSC se realizó la diferenciación de las DPPSC a tejido periodontal. El experimento consistía en sembrar las células DPPSC encima de los dientes sanos y estériles, tratados previamente con FN, y mantenerlas en cultivo durante 21 días en medio osteogénico. En total se sembraron 5 placas, 3 de las cuales (a razón de una por semana) fueron utilizadas para aislamiento de RNA. De las 2 restantes, una se destinó al análisis del SEM y la otra al examen histológico. – Con las muestras obtenidas cada semana, se realizaron las pertinentes RT-PCRs. Se analizó la expresión de diferentes marcadores (ALP, OC, PLAP-1, COL I, COL III, BGN, POSTN, S100A4) entre los 5 grupos (DPPSC, DPPSC diferenciadas en 2D, DPPSC diferenciadas en 3D en la primera semana, segunda semana y tercera semana de diferenciación). Los resultados mostraron altos niveles de expresión para los marcadores óseos y periodontales desde la primera semana a la tercera semana de diferenciación. La expresión de estos marcadores fue mayor que en la diferenciación 2D. – Después de cultivar las DPPSC in vitro durante 21 días, las matrices se analizaron al microscopio electrónico de barrido (SEM). Las imágenes de las raíces a diferentes aumentos (5000X, 15000X y 30000X) mostraron una gran densidad de masa celular encima de las superficies dentales para todas las muestras de DPPSC, indicando la capacidad de las células para adherirse y crecer sobre esa superficie. Después de 3 semanas de diferenciación, el análisis de SEM permitió observar la formación de fibras de colágeno de las matrices dentales. Se observaron algunos vasos sanguíneos y algunos cementoblastos en las muestras del grupo de DPPSC, al igual que en el grupo control positivo, que consistía en el ligamento periodontal de un diente erupcionado. Por el contrario, en el control negativo, que consistía en un diente estéril en el que previamente se había eliminado el ligamento periodontal, no se observó la presencia de células u otro tejido. – Con el fin de visualizar la formación de nuevos tejidos se realizaron las tinciones: tricrómica; Azul alcián y Hematoxilina-eosina (H&E). En los cortes histológicos del grupo de las DPPSC se observó la formación de fibras de colágeno insertadas perpendicular al cemento, pareciéndose a las fibras de Sharpey en comparación al grupo control negativo, donde no se observan estas fibras. A mayor aumento se reveló la homogeneidad de las fibras nuevas de colágeno unidas a las superficies a los 21 días de la diferenciación. – Discusión -- Las células utilizadas en este estudio se aislaron de la pulpa dental de los terceros molares. El desarrollo tardío del tercer molar, permite la extracción de una gran cantidad de células progenitoras. El aislamiento y cultivo de las DPPSC a partir de la pulpa de los terceros molares requiere de unas condiciones de cultivos específicos y bastante estrictos, por lo que es importante caracterizar esta subpoblación antes de realizar los experimentos. – Las DPPSC poseen grandes núcleos alargados, lo que indica su alta capacidad replicativa, característica típica de las células embrionarias. Sin embargo, la expresión del marcador CD13 observado en la inmunofluorescencia nos indica el origen adulto de estas células, por lo tanto, se trata de células adultas con características pluripotentes. La elección de estas células para la realización de esta tesis doctoral se debe a su alta capacidad de diferenciación y su alta proliferación, lo que va ligado a la expresión de marcadores de pluripotencia, como Oct-4, Sox-2, SSEA4 o Nanog, en su etapa indiferenciada. Estas características podrían favorecer la regeneración del ligamento periodontal en las raíces de los dientes. Además, la estabilidad genética observada en estas células es requisito indispensable para su futura aplicación clínica. – En este estudio se ha investigado la capacidad de los dientes humanos para actuar como una matriz óptima in vitro para la regeneración del tejido periodontal humano. Los resultados obtenidos en este estudio han demostrado que los cortes de dientes humanos tratados, junto con células madre de la pulpa dental (DPPSC), parecen constituir una buena combinación para la regeneración completa del tejido periodontal, ya que no solamente se observa la adhesión de estas células a la superficie de la raíz de los dientes, sino que, además, se consiguen generar in vitro gran parte de los componentes de este tejido, como fibras, células y vasos sanguíneos. No obstante el tratamiento de los dientes con la FN mejoró la adhesión de las células a los dientes. – Los estudios demostraron que los tejidos periodontales de ligamentos de diferentes pacientes pueden tener diferentes proteínas o genes. Debido que hasta la fecha, no se ha encontrado un marcador específico para identificar los fibroblastos del ligamento periodontal y diferenciarlos de otras células circundantes en nuestro estudio hemos utilizado más de un marcador periodontal, incluyendo PLAP-1, BGN, POSTN, S100A4, COL I, COL III; y algunos marcadores óseos, incluyendo la fosfatasa alcalina (ALP) y la osteocalcina (OC). – El perfil de expresión del ligamento periodontal mostró que el colágeno tipo I y tipo III fueron los genes más abundantes, lo que les hace ser considerados en nuestro estudio. El colágeno I es la principal proteína de membrana extracelular (ECM) del ligamento periodontal y proporciona un microambiente ideal para que las PDLPs (células madre del ligamento periodontal) se adhieran, proliferen y formen un tejido periodontal. Los ensayos de RT-PCR muestran un aumento de la expresión de este tipo de colágeno durante las dos primeras semanas de la diferenciación y descendiendo en la tercera semana. Este descenso podría estar asociado a un aumento en la mineralización del tejido diferenciado durante la tercera semana, como indica el incremento en la expresión de marcadores óseos como la osteocalcina (OC) o la fosfatasa alcalina (ALP). – La expresión de proteína PLAP-1 en células del ligamento periodontal in vitro está demostrada en algunos artículos y se observó el aumento durante el curso de la citodiferenciación de las células del ligamento periodontal en células formadoras de tejido mineralizado, tales como osteoblastos y cementoblastos. Estas observaciones sugirieron que PLAP-1 está implicada en la formación de la matriz mineralizada en los tejidos periodontales. Los resultados de este estudio muestran un aumento en la expresión de PLAP-1 a lo largo de la diferenciación en 3D, mientras que no se observa expresión de la misma durante la diferenciación en 2D. Este hecho podría estar indicando el papel del diente en la inducción de la diferenciación de las DPPSC hacia tejido periodontal y la mineralización de las mismas, como ya se ha observado que ocurre con otras matrices y otros tipos celulares. – Finalmente, POSTN (Periostin) es una proteína de membrana extracelular (ECM) muy importante para la homeostasis periodontal y mantenimiento del espacio periodontal. Su expresión cambia dinámicamente en respuesta a la tensión y compresión del ligamento periodontal. POSTN juega un papel importante en la respuesta característica de las células periodontales a los estímulos mecánicos y de superficie. En este sentido, los resultados de esta tesis corroboran esa respuesta, ya que, al igual que ocurría con PLAP- 1, POSTN sólo se expresa en la diferenciación en 3D, mientras que no se observa expresión de la misma en la diferenciación en 2D. – En nuestro estudio hemos utilizado un medio de diferenciación osteogénico para la regeneración periodontal, ya que el perfil genético del ligamento periodontal es muy parecido al del hueso. Además, de momento no se ha descrito un medio de diferenciación periodontal específico. Después de 3 semanas de cultivo de las DPPSC en el medio de osteodiferenciación, las imágenes del SEM mostraron un claro incremento en la cantidad de células, similares a los cementoblastos observados en el control positivo de ligamento periodontal. Además, se observó la formación de una matriz extracelular abundante de fibras de colágeno, lo que sugiere que la diferenciación de las DPPSC a ligamento periodontal fue funcional. – Por lo tanto, con los resultados obtenidos en esta tesis doctoral se propone la terapia con DPPSC como un procedimiento alternativo en la medicina regenerativa del ligamento periodontal. Sin embargo, estudios en animales y ensayos clínicos complementarios son necesarios antes de que estas células se puedan aplicar como tratamiento de medicina regenerativa para las enfermedades periodontales.

Continuous C/EBPa expression converts B cells into macrophages while its transient upregulation before the Yamanaka factors yields highly efficient iPSC reprogramming. C/EBP members regulate Il6 pathway genes and IL-6 signaling participates in macrophage differentiation and somatic cell reprogramming. We have explored the possibility that C/EBPa regulates the Il6 pathway during B cell transitions and found that it activates Il6 or Il6ra expression in different subsets. Il6 expression results dispensable for macrophage switch but it impairs pluripotency and trophectodermal genes in iPSC reprogramming. Those signatures firstly arise during preimplantation development with the segregation of ICM and trophectoderm layers in the blastocyst. We detected C/EBPa in 4- to 8-cell mouse embryos and later in the trophectoderm. We also found Il6 and Il6ra being respectively expressed in the trophectoderm and ICM, with IL-6 blockade delaying blastocyst formation and C/EBPa null blastocysts bearing low Il6 levels. Inducible C/EBPa clones of ESCs activate Il6ra as well as trophectoderm and pluripotency programs among different cells. We speculate that C/EBPa could instruct ICM/trophectoderm segregation through IL-6 signaling regulation.
La expresión continuada de C/EBPa convierte células B en macrófagos mientras que su activación transitoria precediendo a los factores de Yamanaka genera una eficiente reprogramación en células iPSC. Miembros C/EBP regulan genes de la vía del Il6 y su señalización participa en la diferenciación de macrófagos y en la reprogramación de células somáticas. Hemos explorado la posibilidad de que C/EBPa regule la vía del Il6 durante estas transiciones en células B y hemos descubierto que C/EBPa activa la expresión de Il6 o Il6ra en diferentes poblaciones. Il6 resulta prescindible para el cambio a macrófagos aunque impide la activación de genes pluripotentes y del trofectodermo durante la reprogramación en iPSCs. Estos genes aparecen por primera vez en el desarrollo preimplantacional con la segregación de las capas de ICM y trofectodermo en el blastocisto. Hemos detectado C/EBPa en embriones de ratón de 4 a 8 células así como más adelante en el trofectodermo. También hemos visto que Il6 y Il6ra se expresan respectivamente en el trofectodermo y la ICM, que el bloqueo de IL-6 retrasa la formación del blastocisto y que embriones sin C/EBPa muestran bajos niveles de Il6. La inducción de C/EBPa en clones de ESCs activa Il6ra así como programas de pluripotencia y trofectodermo en diferentes grupos de células. Especulamos que C/EBPa podría instruir la segregación de ICM y trofectodermo a través de la regulación de la vía del Il6.

Le myélome multiple (MM) est une néoplasie lymphocytaire B qui se caractérise par l'accumulation d'un clone de cellules plasmocytaires tumorales dans la moelle osseuse interagissant de manière étroite avec le microenvironnement. L'étude du profil d'expression génique à l'aide des puces à ADN a permis de préciser l'hétérogénéité de cette pathologie et de découvrir de nouveaux acteurs susceptibles d'avoir un rôle importent dans sa physiopathologie. La surexpression de Oct-3/4, Sox2, c-Myc et KLF4 dans des cellules adultes les reprogramme à l'état de cellules souches. J'ai montré une surexpression significative de 3 de ces 4 gènes – KLF4, MYC, SOX2 - dans le MM. Ces gènes sont également fréquemment surexprimés dans 18 types de cancers sur 40 étudiés. Par ailleurs, leur expression peut y être associé à un mauvais pronostique ou un signe de progression tumorale, dus peut-être à leur capacité à induire des caractéristiques de cellules souches cancéreuses. Nous avons par la suite débuté l'étude de la fonction des protéines codées par ces gènes dans le MM, en commençant par KLF4, facteur de transcription activateur ou répresseur. KLF4 est exprimé dans les plasmocytes (PC) normaux, mais son expression est perdue dans les PC tumoraux (cellules myélomateuses, MMC) de 2 patients sur 3 atteints de MM au diagnostic. Parmi les patients pour lesquels les MMC expriment KLF4, se trouve un groupe de patients à haut risque, le groupe MMSET portant la translocation t(4 ;14). L'utilisation d'un modèle inductible d'expression de KLF4 dans des lignées de MM avec transduction lentivirale, a mis en évidence un arrêt du cycle associé à l'expression de P27/KIP1 pour les lignées avec des mutations inactivatrices de P53, mais également de P21/WAF1 pour des lignées avec P53 sauvage. Cette sortie du cycle due à l'expression de KLF4 pourrait protéger les plasmocytes tumoraux de l'apoptose induite par certaines drogues ciblant le cycle, comme nous l'observons in vitro avec le Melphalan.L'objectif majeur de notre équipe est de comprendre le fonctionnement du PC normal et celui du PC tumoral. Afin d'atteindre cet objectif, il est nécessaire d'obtenir un système efficace permettant d'introduire un gène dans un PC. Nous avons montré que des lentivirus pseudotypés avec des glycoprotéines tronquées (hemagglutinine et fusion) issus du virus de la rougeole, transduisent de façon stable et efficace des PC normaux et tumoraux
Multiple myeloma (MM) is a B-cell neoplasia characterized by the accumulation of a clone of malignant plasma cells in bone marrow closely interacting with its microenvironment.Gene expression profiling using DNA microarrays has clarified the heterogeneity of this disease and has allowed the finding of new actors that may have an important function in MM pathophysiology.Overexpression of Oct-3/4, Sox2, c-Myc and KLF4 in adult cells causes their return to the state of stem cells, commonly called induced pluripotent stem cells (iPS). Our team has shown a significant overexpression of at least one of these four factors in 18 out of 40 cancers studied. Moreover, their expression may be associated with poor prognosis or may be a sign of tumor progression, perhaps due to their ability to induce characteristics of cancer stem cells.We therefore began the study of the function of these genes in MM, starting with KLF4, which can either be an activator or a repressor of transcription, depending on the promoter. KLF4 is expressed in normal plasma cells (PC), but its expression is lost in 2 out of 3 patients with MM at diagnosis. Among patients for whom the PCs express KLF4, is a group of high-risk patients, the MMSET group, bearing the t(4;14) translocation.An inducible model of KLF4's expression in MM cell lines was obtained using lentiviral transduction. Our model revealed a KLF4 induced cycle arrest, associated with the expression of P27/KIP1 when P53 is mutated, but also P21/WAF1 in case of wild type P53. This cell cycle blockade due to the expression of KLF4 could protect malignant plasma cells from the apoptosis induced by certain drugs targeting the cell cycle, as shown by our in vitro observations using melphalan.The main goal of our team is to understand the normal function of PCs and the PC tumor. To achieve this, it is necessary to obtain an effective system for introducing a gene in a given PC. We have shown that lentiviruses pseudotyped with truncated glycoproteins (Hemagglutinin and Fusion) from measles virus, can a stably and efficiently transduce normal and malignant PCs

Deux états d'autorenouvellement des cellules souches pluripotentes (PSCs) ont été définis, à savoir les états naïf et amorcé. De nombreuses différences existent entre ces deux états dont la plus marquante est la capacité unique des PSCs à l'état naïf, de coloniser l'embryon préimplantatoire et former des chimères. L'objectif de mon projet doctoral a été d'étudier la pluripotence chez le lapin. Dans ce cadre, j'ai d'abord entrepris de fabriquer et de caractériser des cellules souches pluripotentes induites (RbiPSCs), puis d'évaluer leur capacité à coloniser l'embryon et à former des chimères. Trois lignées de RbiPSCs dépendantes du FGF2 ont été obtenues par reprogrammation de fibroblastes de lapin. Leur caractérisation moléculaire et fonctionnelle a révélé des caractéristiques mixtes, naïves et amorcées. En revanche, sur le plan fonctionnel, elles sont incapables de coloniser l'embryon de lapin, une caractéristique de la pluripotence amorcée. La seconde partie de mon projet doctoral a consisté à reprogrammer des RbiPSCs vers l'état naïf. Dans ce but, j'ai surexprimé KLF2 et KLF4, deux gènes appartenant au réseau de pluripotence naïf, et utilisé les conditions de culture des PSCs de souris. Les cellules ainsi obtenues présentent un profil d'expression génique plus proche de celui de l'ICM de lapin, dû notamment à la réactivation de marqueurs spécifiques de la pluripotence naïve. Enfin, les cellules ainsi reprogrammées présentent une capacité accrue pour la colonisation de l'embryon préimplantatoire de lapin. Mes travaux constituent le premier exemple de reprogrammation de cellules souches pluripotentes vers l'état naïf chez le lapin. Les cellules ainsi produites ouvrent la voie à la fabrication de chimères somatiques et germinales
Pluripotent stem cells (PSCs) can self-renew at two distinct states, the naive and primed states. Many differences exist between these two states, the most striking is the unique ability of PSCs naïve to colonize the preimplantation embryo and form chimeras. The purpose of my doctoral project was to study pluripotency in rabbits. In this context, I initially manufactured and characterized induced pluripotent stem cells (RbiPSCs) and then evaluated their ability to colonize the embryo and form chimeras. Three RbiPSCs lines were obtained by rabbit fibroblasts reprogramming. Their molecular characterization revealed mixed characteristics, naïve and primed. However, functionally, they are unable to colonize the rabbit embryo, a feature of primed pluripotency. The second part of my doctoral project was to reprogram RbiPSCs to the naïve state. To this end, I have overexpressed Klf2 and Klf4, two genes belonging to the naïve pluripotency network and the mouse PSCs culture conditions. These new cell lines have a gene expression profile closer to that of the rabbit ICM, particularly due to the reactivation of specific markers of naïve pluripotency. Finally, the reverted cells have an increased capacity of colonization of the preimplantation embryo rabbit. My work represents the first example of pluripotent stem cells reprogramming toward the naive state in rabbits. The cells thus produced pave the way for the production of somatic and germline chimeras

The reactivation of the inactive X chromosome has the potential to provide a unique system to study the developmentally induced formation of euchromatin. However, insights into this process were hampered by the lack of adequate systems, which would allow the dissection of the process using high-throughput sequencing techniques. Here I describe the development of a novel induced pluripotent stem cell reprogramming system that allows the isolation of cells poised for X-reactivation, subsequently achieving near-deterministic efficiency of X-reactivation. Utilizing this novel system, we were able to reveal that the reactivation of silenced genes occurs rapidly and can be divided into distinct initiation and completion phases. Similarly, we could show that chromatin opening of the inactive X proceeds in a two-step fashion, initiating in close proximity to previously open regions, and possibly being initiated by pluripotency factors. Finally, we could show that mega-domains and TADs correspond to two different levels of three-dimensional genome organization superimposed on the Xi, independent of gene expression. We conclude that gene expression and chromatin accessibility during X-reactivation share similar kinetics, while genome organization might follow distinct principles.
La reactivación del cromosoma X inactivo tiene el potencial de proporcionar un sistema único para estudiar la formación de eucromatina inducida por el desarrollo. Sin embargo, la comprensión de este proceso se vio obstaculizada por la falta de sistemas adecuados, lo que permitiría la disección del proceso utilizando técnicas de secuenciación de alto rendimiento. Aquí describo el desarrollo de un nuevo sistema de reprogramación de células madre pluripotentes inducidas que permite el aislamiento de células preparadas para la reactivación de X, logrando posteriormente la eficiencia casi determinista de la reactivación de X. Utilizando este novedoso sistema, pudimos revelar que la reactivación de genes silenciados ocurre rápidamente y puede dividirse en distintas fases de iniciación y finalización. Del mismo modo, podríamos mostrar que la apertura de cromatina de la X inactiva se realiza en dos pasos, iniciando en las proximidades de regiones previamente abiertas, y posiblemente iniciada por factores de pluripotencia. Finalmente, podríamos mostrar que los mega-domains y los TADs corresponden a dos niveles diferentes de organización del genoma tridimensional superpuestos en el Xi, independientemente de la expresión génica. Llegamos a la conclusión de que la expresión génica y la accesibilidad a la cromatina durante la reactivación X comparten una cinética similar, mientras que la organización del genoma podría seguir principios distintos.

Les cellules souches embryonnaires de souris (ESCs) et les cellules souches de l'épiblaste (EpiSCs) représentent, respectivement, les états naïf et amorcé de la pluripotence et sont maintenues in vitro par des voies de signalisation spécifiques. De plus les ESCs cultivées dans un milieu sans sérum avec deux inhibiteurs (2i) sont décrites comme étant les plus naïves. Plusieurs études ont suggéré que chaque type de cellules pluripotentes est caractérisé par une organisation différente de l'épigénome. Nous présentons ici une étude comparative de l'état épigénétique et transcriptionnel des séquences satellites répétées péricentromériques (PCH) entre les ESCs (2i et sérum) et EpiSCs. Nous montrons que H3K27me3 au PCH est très dynamique et peut discriminer les ESCs en 2i des autres cellules souches pluripotentes. Alors que la transcription des séquences satellites est élevée dans les ESCs en sérum, elle est plus faible dans ESCs en 2i et encore plus réprimée dans les EpiSCs. La suppression de la méthylation de l'ADN ou d'H3K9me3 dans les ESCs conduit à un dépôt important de H3K27me3 au PCH, mais peu de changements transcriptionnels de ces séquences. En revanche, l'absence d'H3K9me3 dans les EpiSCs n'empêche pas la méthylation de l'ADN au PCH, mais induit la transcription de ces séquences. La conversion in vitro des ESCs en EpiSCs est plus longue que le passage des cellules de l'ICM en épiblaste in vivo. Cette inefficacité ne peut pas être expliquée par une mise en place retardée du nouveau réseau transcriptionnel. Pour conclure notre étude a révélé que les EpiSCs ont perdu de la plasticité par rapport au ESCs sur l'hétérochromatine ainsi que l’euchromatine, comme le montre la réduction des niveaux d'H3K9ac et des domaines bivalents, étant ainsi plus proche épigénétiquement de cellules somatiques que de la pluripotence naïve
Mouse embryonic stem cells (ESCs) and epiblast stem cells (EpiSCs) represent naïve and primed pluripotency states, respectively and are maintained in vitro using specific signaling pathways. Furthermore, ESCs cultured in serum-free medium with two inhibitors (2i) are described as being the most naïve. Several studies have suggested that each pluripotent cell type is characterized by a different epigenome organization. Here we present a comparative study of the epigenetic and transcriptional state of centromeric and pericentromeric (CH/PCH) satellite repeats in ESCs (2i and serum ones) and EpiSCs. We show that the pattern of H3K27me3 at PCH is highly dynamic and discriminate 2i-ESCs from the other pluripotent stem cells. Whereas satellites transcription is high in serum-ESCs, it is lower in 2i-ESCs and even more repressed in EpiSCs. Removal of either DNA methylation or H3K9me3 in ESCs leads to enhanced deposition of H3K27me3 but few changes in satellite transcription. By contrast, in EpiSCs removal of H3K9me3 does not prevent DNA methylation at PCH but de-represses the satellite transcription. In vitro conversion from naive to primed pluripotency showed an important delay compared to the in vivo development of ICM cells into post-implantation epiblast. Such inefficiency cannot be explained by a delayed switch to the new transcriptional network. Altogether our study reveals that EpiSCs have lost the chromatin plasticity of ESCs on heterochromatin as well as euchromatin, as shown by the reduction of H3K9ac levels and bivalent domains, thus being closer to somatic cells in terms of epigenetics than naive pluripotency

Le microenvironnement apporte une multitude d'informations aux cellules régulant ainsi leurs fonctions et leur organisation. L'objectif de cette thèse a été de contrôler différents paramètres du microenvironnement cellulaire in vitro afin de moduler l'autorenouvellement et la destinée des cellules souches embryonnaires (CSE).Cette thèse comporte 3 parties. Premièrement, des films de polyélectrolytes multicouches à base de poly(L-lysine) et de hyaluronane ont été utilisés comme substrats modulables. Les propriétés mécaniques ainsi que la chimie des films régulent la proportion de sous-populations de CSE qui reflètent soit le stade masse cellulaire interne, soit le stade épiblaste.Dans un deuxième temps, un équilibre entre l'expression des marqueurs embryonnaires de l'axe proximodistal a été mis en évidence dans la culture de CSE. L'emploi de micro-patrons adhésifs permettant de contrôler la géométrie des colonies a révélé l'importance des contraintes topologiques sur la distribution des cellules exprimant le marqueur proximal Brachyury. Enfin, l'action combinée de BMP2 et de wnt3a mimant l'environnement biochimique du stade tardif de la ligne primitive a permis d'isoler une population pure et très précoce de progéniteurs cardiaques SSEA1+ multipotents
The microenvironment provides stem cells with numerous pieces of information. Biochemical and mechanical cues synergize to regulate cell function and organization. The aim of this PhD thesis was to control specific microenvironmental parameters to modulate embryonic stem cell (ESC) self-renewal and fate.First, poly(L-lysine) and hyaluronan based polyelectrolyte multilayer films were used as tunable substrates. Both mechanical and chemical properties of the films influenced the balance between ESC subpopulations reflecting different embryonic stages (inner cell mass versus epiblast)Second, a dynamic equilibrium was found between the expression of embryonic proximal and distal markers within ESC culture. The uses of micropatterned substrates to control colony shape uncovered a key role for geometrical constraints in the distribution of Brachyury expression.Last, BMP2 was used together with secreted wnt3a to mimic the late streak stage of the embryo and to trigger the differentiation of pluripotent cells towards the cardiogenic mesoderm. Responsive cells could be sorted out based on SSEA1 expression. This purified population represents the earliest ESC derived multipotent cardiac progenitor population identified to date

Exposure to endocrine disruptor DDT impairs development of adrenal zona glomerulosa by higher expression of pluripotency factors along with the suppression of factors that ensure the maturation of cortical cells. It leads to a decrease in aldosterone production and compensatory hyperplasia of zona glomerulosa.

Human embryonic stem cells (hESCs) have remarkable potentials for breakthroughs in future cell-based therapeutics owing to their self-renewal capability and pluripotency [1–2]. However, their intrinsic mechanosensitivity to biophysical signals from the local cellular microenvironment is not well characterized [3–4]. In this work, we introduced a simple, yet precise, microfabrication strategy for accurate control and patterning of local nanoroughness on glass surfaces using photolithography and reactive ion etching (RIE). Our results demonstrated that nanoscale topological features could provide a potent regulatory signal over a diverse array of hESC behaviors, including their morphology, adhesion, proliferation and clonal expansion, and differentiation.