Academic literature on the topic 'Polisaccaridi'

A biofilm is any group of microorganisms in which cells stick to each other and adhere to a surface by excreting a matrix of extracellular polymeric substances (EPS). The chemoautotrophic nitrifying bacteria hardly form biofilms due to their extremely low growth rate; however, biofilm formation of nitrifying bacteria trends to attach in carrier by extracellular polysaccharides that facilitate mutual adhesion, the forming biofilm is also beneficial in nitrogen removal in biological filter systems, especially in aquaculture water treatment systems. The microbial activity within bio-carrier is a key factor in the performance of biofilm reactor. Selection the nitrifier bacteria that biofilm formation and immobilization on the carrier for application in ammonium polluted water treatment technologies, especially in aquaculture is our research objective. Therefore, in this study, ten and six strains of ammonia oxidizing bacteria (AOB) and nitrite oxidizing bacteria (NOB) respectively were isolated from six different aquaculture water samples collected from Quang Ninh and Soc Trang. Basing on their high nitrification activity and biofilm forming capacity, six bacterial strains have been selected to take photo by scanning electron microscope (SEM) and carry out in 2 – liter tanks with and without carriers. As the results, the system with carriers (30% of total volume) increased nitrogen compounds elimination efficiency from 1.2 times to 2 times in comparison with the system without carrier. Two representatives of ammonia oxidizing bacterial group (B1.1; G2-1.2) were classification based on characteristics and they were classified as Nitrosomonas sp. and Nitrosococcus sp. Màng sinh học được hình thành từ vi sinh vật nhờ các tế bào tiết ra các chất cao phân tử ngoại bào (EPS) và dính vào nhau đồng thời được gắn lên một bề mặt vật thể lỏng hoặc rắn. Vi khuẩn nitrate hóa tự dưỡng có thể tạo ra màng sinh học nhưng khá khó khăn do tỷ lệ sinh trưởng rất chậm của chúng. Tuy nhiên vi khuẩn nitrate hóa tạo màng sinh học thường có xu thế bám lên giá thể nhờ sự gắn kết của các polisaccarit ngoại bào. Sự hình thành màng sinh học cũng là lợi thế để loại bỏ các hợp chất nitơ trong các hệ thống lọc sinh học, đặc biệt là trong các hệ thống xử lý nước nuôi trồng thủy sản. Hoạt tính vi sinh vật cùng với giá thể sinh học là một yếu tố quan trọng để thực hiện trong các bể phản ứng màng sinh học. Trong nghiên cứu này, mục tiêu của chúng tôi là lựa chọn được các vi khuẩn nitrate hóa có khả năng tạo màng sinh học và cố định chúng lên giá thể để ứng dụng trong các công nghệ xử lý nước bị ô nhiễm ammonia đặc biệt là trong nuôi trồng thủy sản. Kết quả cho thấy, từ sáu mẫu nước nuôi trồng thủy sản khác nhau từ Quảng Ninh và Sóc Trăng, 10 chủng vi khuẩn oxy hóa ammonia (AOB) và 6 chủng vi khuẩn oxy hóa nitrite (NOB) đã được phân lập. Dựa vào hoạt tính nitrate hóa và khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được 6 chủng điển hình đã được lựa chọn để chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét và được ứng dụng trong hai bể sinh học với dung tích 2 lít có chứa và không chứa chất mang (giá thể). Sau 7 ngày, hệ thống sinh học chứa giá thể (chiếm 30% thể tích) có hiệu suất loại bỏ các hợp chất nitơ tăng hơn từ 1,2 đến 2 lần so với bể sinh học không chứa chất mang. Hai đại diện của nhóm vi khuẩn oxy hóa ammonia (B-1.1 và G2-1.2) đã được phân loại sơ bộ dựa vào một số đặc điểm sinh học và chúng đã được xác định thuộc chi Nitrosomonas và chi Nitrosococcus.

Due studi multicentrici, randomizzati, controllati, in cieco hanno esaminato l'effetto terapeutico di una barriera di tipo chimico-meccanico nelle vie respiratorie superiori prodotta da uno sciroppo per la tosse a base di polisaccaridi, resine e miele nei bambini con tosse acuta associata a un comune raffreddore. L'azione mucoprotettiva del prodotto ha alleviato in maniera significativa la tosse pediatrica rispetto a uno sciroppo a base di carbocisteina e a un placebo. L'effetto benefico è stato evidente specialmente nei bambini con tosse grave e/o episodi di tosse notturna.

Fin dall’antichità le alghe sono state considerate una grande risorsa di prodotti naturali che rivestonoun ruolo fondamentale nella ricerca di nuovi farmaci.Tra i vari composti di origine algale,i polisaccaridi solfonati sono ampiamente usati nell’industria alimentare, cosmetica e farmaceutica. Tali composti, infatti, possiedono molteplici attività biologiche tra le quali quella antivirale, anti-infiammatoria, anti-tumorale e anticoagulante. Il presente lavoro di tesi, riporta i risultati di un’attività di ricerca basata sull’estrazione di polisaccaridi solfonati da alcune specie di macroalghe al fine di valutarne la loro attività antiprotozoaria. Esemplari di Chaetomorpha linum (O.F. Müller) Kützing, Gracilaria bursa-pastoris (S.G. Gmelin) P.C. Silva, Gracilaria viridis Sfriso, Wolf, Sciuto, M. Morabito, Andreoli et Moro, Agardhiella subulata (C. Agardh) Kraft et M.J. Wynne, Hypnea cornuta (Kützing) J. Agardh, Sargassum muticum (Yendo) Fensholt e Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar sono stati raccolti nella Laguna di Venezia e nel Lago di Ganzirri a Messina. Gli estratti polisaccaridici ottenuti sono stati testati su colture di Leishmania infantum (MHOM/IT/80/IPT1), protozoo endemico del Mediterraneo e responsabile della Leishmaniosi, una malattia parassitaria che colpisce numerose specie animali, incluso l’uomo. Attualmente non esistono farmaci specifici in grado di eradicare la malattia. I trattamenti farmacologici comunemente utilizzati possono causare gravi effetti collaterali. I risultati preliminari emersi da questo studio hanno evidenziato che gli estratti polisaccaridici algali hanno un marcato effetto leishmanicida in vitro, rappresentando pertanto una potenziale risorsa di prodotti naturali sfruttabili in campo farmaceutico.

Hydrogels are unique materials composed of hydrophilic gelators linked together in a three-dimensional network capable of encapsulating large amounts of water. These materials are easily adaptable to different application areas i.e. biomedical areas, agriculture, removal of heavy metals from water or in food industry. In this thesis, some eco-sustainable gelators have been selected as starting materials to develop hydrogels that possess characteristics related to the selected applications. For this purpose, zwitterionic amine oxide surfactants and polysaccharides, i.e. alginate and chitosan, were selected for their ability to form hydrogels by modulating their concentration or by adding crosslinking agents. In Section B, several common techniques were selected to fully characterize the two polysaccharides in order to determine their structural features, which can affect the hydrogels properties. In Section C, the hydrogels were prepared based on the selected application areas i.e. bioconversion, food packaging and cultural heritage. The effect of surfactants structure and immobilization into hydrogel structure on the catalytic properties of Candida rugosa lipase (CRL) was investigated. The selected amine oxide surfactants exploited an improvement of the enzymatic activity as a function of the morphology of the micellar aggregates; in particular, by varying the headgroup size and the chain length, the micelles shift from spherical to rod-like leading to an increased hydrolytic activity. Furthermore, CRL was effectively entrapped in alginate hydrogel beads formed by ionotropic gelation induced by calcium ions. Different bead formulations were prepared and the effect of their morphology on the catalytic properties of CRL was assessed by studying two model reactions. The immobilized lipase showed noticeable recyclability and improved thermostability compared to the free enzyme. Part of this study was addressed to the application of chitosan-based hydrogels to prepare membranes applicable as eco-friendly food packaging material. Chitosan-succinate films were prepared, starting by their hydrogel form, by solvent casting method using glycerol as plasticizer. The NaOH-neutralized membranes, compared to the non-neutralized ones, showed improved mechanical and physicochemical properties. The formation of amide bonds between chitosan and succinic acid, suggested by the FTIR analysis, was then confirmed by acid-base titration. The prepared membranes are currently under preliminary study as novel food packaging for pecorino cheese samples. The last part of this thesis is included in a wider project focused on “Product and process innovation for maintenance, preservation and sustainable programmed restoration of cultural heritage” (Smart Cities and Communities and Social Innovation on Cultural Heritage project). It aimed at the improvement of the restoration and maintenance intervention on stone-based cultural heritages. For this purpose, novel approaches to reduce microbial colonization from stone materials were developed using classic oxidant biocidal agents supported in alginate hydrogels. Novel ionically crosslinked alginate hydrogels, which contain oxidative biocides were developed and tested. All hydrogel formulations were able to eliminate biofilms from the stone surface, keeping the chromaticity and capillary properties of the cleaned stones unchanged. To assess the presence of residues, any type of surface alteration and to evaluate the hygroscopic behavior of the stone samples, microscopic techniques, colorimetry and 1H-NMR T2 relaxation measurements have been performed. They were applied both on a laboratory scale, using calcarenite specimens artificially colonized by filamentous cyanobacteria and green microalgae and “in situ” on stone artworks in rupestrian churches of “Sassi of Matera”.

Questo studio approfondisce le dinamiche di crescita e la produzione in campo di quattro specie algali a rapido accrescimento Ulva rigida, Gracilaria gracilis, Gracilaria vermiculophylla e Gracilariopsis longissima e indaga quelle che sono le principali frazioni biochimiche nelle alghe quanto a contenuto di: proteine, carboidrati totali, polisaccaridi solforati solubili e ceneri durante l’arco di un anno. L’uso congiunto di queste informazioni svela i periodi e le condizioni più idonee per la coltivazione e la produzione di diversi composti. La valorizzazione delle biomasse algali è stata quindi ulteriormente qualificata dallo studio e messa a punto di metodiche innovative per l’estrazione e la quantificazione delle ficobiliproteine e per la purificazione della ficoeritrina.

Il lavoro sperimentale di questa tesi è stato condotto sulla coltivazione della diatomea Phaeodactylum tricornutum che grazie alla sua capacità di sintetizzare e di accumulare una elevata quantità di acidi grassi polinsaturi (PUFAs) ω-3 tra cui l’acido eicosapentanoico (EPA), ha un notevole interesse commerciale per la nutrizione umana. Il lavoro di tesi è stato svolto presso il Laboratorio di Biologia delle Alghe in due fasi sperimentali, nella prima, l’alga è stata coltivata usando un medium standard con due diversi rapporti molari N/P, valutando l’effetto della somministrazione di 1mg L-1 al giorno di CO2 sulla velocità di crescita e sulla composizione percentuale in termini di proteine polisaccaridi e lipidi della biomassa raccolta in fase stazionaria. I risultati ottenuti hanno mostrato che la somministrazione di CO2 durante la crescita dell’alga, determina un significativo incremento della biomassa algale ottenuta e una produzione maggiore di lipidi e polisaccaridi per cellula. Nella seconda fase sperimentale P.tricornutum è stata coltivata usando un refluo industriale con lo scopo di valutare la capacità dell’alga di rimozione dei componenti azotati e del fosforo per effettuare un processo di fitodepurazione e ridurre i costi dovuti all’impiego dei nutrienti nella coltivazione. I risultati ottenuti dimostrano che nel refluo l’alga presenta una velocità di crescita più elevata rispetto alle condizioni precedenti e, dopo la somministrazione di CO2, accumula una percentuale maggiore di proteine e di acidi grassi. In conclusione questi dati suggeriscono che l’utilizzo di un refluo industriale con la concomitante aggiunta di CO2 in basse concentrazioni nella coltivazione delle microalghe potrebbe ridurre i costi di produzione della biomassa su larga scala e consentirebbe di ottenere biomassa algale con un maggior valore commerciale.

Il principale costituente delle foglie di aloe è il gel di aloe ampiamente utilizzato in diversi settori industriali (cosmetico, medico, alimentare) grazie alle sue caratteristiche chimico-fisiche, tra cui la presenza di polisaccaridi con un’elevata capacità di ritenzione di acqua e sostanze oleose. L’obbiettivo di questo lavoro di tesi è stato la valutazione della capacità di assorbimento di cinque diverse matrici oleose (olio di mais raffinato, olio di soia raffinato, olio di girasole raffinato, olio extra vergine di oliva, glicerolo) da parte di polisaccaridi ottenuti dalla liofilizzazione di gel di aloe. Il prodotto liofilizzato è stato utilizzato per l’estrazione dei residui insolubili in alcol (AIRs) su cui è stata poi valutata la capacità di assorbimento delle matrici oleose. Per la caratterizzazione delle diverse tipologie di campioni utilizzati, sono state realizzate alcune determinazioni analitiche: per quanto riguarda gli AIRs, è stata realizzata la determinazione degli zuccheri mediante analisi gascromatografica, degli acidi uronici mediante spettrofotometria e del grado di metil esterificazione delle pectine mediante spettroscopia a infrarossi. Nelle matrici oleose è stata invece valutata la composizione in acidi grassi. I dati ottenuti sono risultati in accordo con quanto già presente in letteratura. Non è stato, inoltre, evidenziato un assorbimento selettivo in funzione dei diversi oli vegetali testati.

2010 - 2011
L’introduzione, nell’ultimo decennio, di limiti normativi sempre più restrittivi per lo scarico dei reflui trattati (D. Lgs. 152/2006) o il loro riutilizzo per scopi irrigui e industriali (D. Lgs. 185/2003) rende necessari interventi di up-grade degli impianti di depurazione esistenti e l’utilizzo di tecnologie innovative in grado di assicurare maggiori efficienze depurative. Tra le moderne tipologie impiantistiche, i bioreattori a membrana (MBR), derivanti dalla combinazione dei processi di degradazione biologica a fanghi attivi e di filtrazione su membrana, sono oggi sempre più utilizzati nel trattamento di reflui civili e industriali grazie all'elevata qualità degli effluenti trattati, a fronte di ridotte superfici d’ingombro. Il principale svantaggio degli MBR è rappresentato dal fouling (o “sporcamento”) delle membrane, che comporta un incremento non trascurabile dei costi d’investimento e di gestione di tali impianti e la progressiva riduzione dell’efficienza della filtrazione. Il fouling è sensibilmente influenzato dalle condizioni operative, dalla tipologia di materiali e dalla configurazione delle membrane filtranti, oltre che dalla miscela liquida, ricca di colloidi, fango biologico e macromolecole disciolte. Le componenti macromolecolari, comunemente dette "Sostanze Polimeriche Extracellulari", includono polisaccaridi, proteine, acidi nucleici, lipidi e altri polimeri presenti sulla superficie cellulare dei singoli microrganismi e nello spazio intercellulare degli aggregati microbici. Esperienze scientifiche testimoniano come la presenza di EPS nella miscela liquida sia tra le principali cause del fouling. Nel tentativo di approfondire le conoscenze concernenti i meccanismi di evoluzione del fenomeno, l'attività sperimentale, svolta presso il Laboratorio di Ingegneria Sanitaria Ambientale dell’Università degli Studi di Salerno e, per un quadrimestre, presso la Scuola di Scienze Applicate della Cranfield University (UK), è stata finalizzata all'individuazione e caratterizzazione dei meccanismi di fouling occorrenti nella filtrazione a flusso costante di sospensioni sintetiche di polisaccaridi comunemente prodotti dalla biomassa di reattori MBR operanti a scala reale o facilmente rilevabili perché già presenti nei reflui trattati. L'impiego di due differenti set-up sperimentali di filtrazione tangenziale e ortogonale, e di apparecchiature di analisi dimensionale ha permesso di analizzare l'influenza, sulle performance della filtrazione, della concentrazione iniziale dei composti indicatori nell'alimentato, del flusso di permeato applicato, della distribuzione dimensionale delle particelle in sospensione nella miscela liquida, delle condizioni idrodinamiche in prossimità delle membrane. L'utilizzo di sospensioni sintetiche dei cinque polisaccaridi (alginato di calcio, alginato di sodio, gomma di xantano, destrano e ß-1,3-glucano) ha inoltre permesso di esaminare in maniera più approfondita il ruolo delle EPS nell'evoluzione temporale della resistenza alla filtrazione. I dati di pressione registrati nel corso delle prove di laboratorio mostrano come l'alginato di calcio sia il carboidrato con la maggiore propensione al fouling; il destrano ed il ß-1,3-glucano sono invece responsabili di un incremento molto più contenuto della pressione transmembranale nel tempo. Il fouling, registrato nelle prove di filtrazione ortogonale e tangenziale, diviene più marcato all'aumentare della concentrazione iniziale dei composti impiegati. La linearizzazione dei dati di pressione, rilevati nella filtrazione tangenziale ed ortogonale delle sospensioni di xantano e degli alginati di calcio e di sodio, secondo le equazioni di pore blocking e cake formation testimonia la progressiva deposizione di materia sulla superficie filtrante a formare un cake. Con il procedere della filtrazione tangenziale, si rileva tuttavia per gli alginati l'incremento pressoché esponenziale della pressione transmembranale, a conferma dell'instaurarsi di meccanismi di fouling complessi. Differente tendenza presentano le sospensioni di ß-1,3-glucano e di destrano, per le quali l'incremento temporale della TMP è assai contenuto. L'analisi della distribuzione dimensionale delle particelle nei campioni di alimentato, concentrato e permeato ha poi evidenziato la presenza in sospensione di microaggregati di dimensioni variabili nel tempo e fortemente influenzate dalle caratteristiche del sistema di filtrazione e dall'idrodinamica in prossimità della membrana. Nelle prove di filtrazione tangenziale, le dimensioni delle particelle, con la sola eccezione del destrano, tendono gradualmente a ridursi nel corso dei test; nelle prove di filtrazione ortogonale si registra invece un sostanziale incremento dimensionale nel tempo per tutti i composti analizzati. Il fenomeno rilevato nei test di filtrazione tangenziale è dovuto, in parte, alla deposizione sulla membrana degli aggregati di dimensioni maggiori, responsabili dell’incremento di TMP, ed in parte alla loro disgregazione, indotta dall'idrodinamica e dalle caratteristiche costruttive dei set-up sperimentali. In tali condizioni, il meccanismo di trasporto esercitato dalla corrente di retentato è quello della diffusione indotta dalla sollecitazione tangenziale. Nei test di filtrazione ortogonale, la ridotta turbolenza favorisce invece l'aggregazione delle particelle. Lo studio condotto testimonia come i composti indicatori abbiano differenti proprietà chimico-fisiche ed una diversa propensione al fouling. [a cura dell'autore]
X n.s.

2007/2008
I carboidrati sono stati per molto tempo considerati molecole aventi solo funzioni di tipo strutturale e di riserva energetica per la cellula e non sembravano in alcun modo coinvolti nei processi che contribuiscono allo sviluppo di una cellula completamente funzionante. Nuove ed accurate ricerche hanno dimostrato il ruolo svolto dai carboidrati in numerosi processi biologici al punto che attualmente essi sono considerati la terza categoria di macromolecole con caratteristiche bio-informative. I carboidrati sono strutture che possono dare una quantità di informazioni estremamente elevata; l’innumerevole variabilità dei legami con cui le unità monosaccaridiche possono costituire strutture più complesse, permette ai carboidrati di utilizzare un linguaggio estremamente eloquente. Questo linguaggio ha preso il nome di Glicocodice. I decifratori del glicocodice sono tipicamente proteine leganti gli zuccheri chiamate lectine, caratterizzate da un’elevata specificità; lectine in grado di riconoscere in modo specifico unità beta-galattosidiche, chiamate galectine, risultano coinvolte in numerosi processi che regolano l’omeostasi cellulare, tra cui le interazioni cellula-cellula, cellula-matrice, ma anche i sistemi apoptotici ed il differenziamento cellulare. Inoltre esse risultano strettamente correlate con lo sviluppo di numerose patologie tra cui i tumori e le infiammazioni articolari come l’osteartrite e l’artrite reumatoide. In particolare, la galectina-1, molecola regolatrice pro-apoptotica, risulta sovraespressa nei pazienti affetti da artrite reumatoide. Al contrario, l’aumentata espressione della galectina-3 risulta essere un fattore rilevante per lo sviluppo di patologie osteoartritiche. Le convenzionali metodologie di indagine diagnostica per immagine sono purtroppo strumenti deboli per l’analisi di patologie croniche, in particolare risulta difficile la distinzione tra stadio acuto e cronico e l’identificazione di fasi iperacute. E’ per questo motivo che è così complessa la distinzione tra l’artrite reumatoide e le altre patologie osteoarticolari nelle prime fasi della malattia. La messa a punto di metodologie in grado di fornire una diagnosi precoce e precisa è dunque uno dei passi fondamentali nella lotta all’artrite reumatoide. Oggi sono disponibili test di tipo immunologico a livello sierico e tecniche di imaging in grado di dare alcune informazioni importanti sulla natura e sul decorso della malattia. Tuttavia questi risultano essere strumenti ancora carenti per una diagnosi precoce della patologia. Nella moderna era della medicina molecolare, terapie geniche e terapie cellulari potranno essere studiate direttamente e indirettamente tramite l’uso dell’ imaging molecolare. L’utilizzo di tecniche di imaging funzionale e molecolare assieme a strumenti di immagine anatomica, può indubbiamente incrementare la specificità e la sensibilità della diagnosi. Le procedure di indagine molecolare dovrebbero essere dunque considerate importanti strumenti complementari alle tecniche di indagine per immagini utilizzate correntemente in clinica. Nuovi mezzi di contrasto per MRI in grado di interagire a livello molecolare potranno dunque incrementare il potenziale di questa tecnica. Inoltre, l’emergere di nuove tecniche di diagnostica per immagini che utilizzano metodi ottici (fluorescenza e bioluminescenza), che sono attualmente di comune utilizzo in modelli animali in fase pre-clinica, sono in corso di sviluppo per la loro applicazione anche sull’uomo. Il presente progetto di dottorato ha avuto come obiettivo la messa a punto di un sistema diagnostico per immagini che permetta di individuare precocemente e con alta specificità la presenza di patologie artritiche infiammatorie, in modo tale da diagnosticare la malattia artritica nei primi stadi del suo sviluppo, ma anche di discriminarne la tipologia e la prognosi, al fine di poter applicare una corretta e tempestiva strategia terapeutica. Per realizzare tale obiettivo, nel corso del dottorato di ricerca, sono state sviluppate strategie sintetiche di nuovi mezzi di contrasto in grado di individuare markers specifici della patologia artritica, successivamente utilizzati su modelli cellulari e animali. In particolare, come bersaglio per tali mezzi di contrasto sono state individuate le galectine. Per ottenere l’interazione con le galectine i nuovi mezzi di contrasto devono contenere sonde per la diagnostica per immagini coniugate con strutture opportunamente modificate con ramificazioni di galattosio, al fine di permettere il legame selettivo alle galectine ed indicarne la presenza. Il progetto è stato articolato in due parti: Parte A, Analisi delle Patologie Articolari a Livello Molecolare. In questa fase sono stati sintetizzati complessi polimerici che potrebbero aiutare la comprensione dello sviluppo delle patologie articolari a livello molecolare. In particolare è stata effettuata la clusterizzazione di unità galattosidiche, note sonde biologiche per le galectine. La scelta delle strategie sintetiche è stata effettuata a partire dalla conoscenza del biopolimero Chitlac, composto le cui caratteristiche chimico/fisiche erano già ben note nel nostro laboratorio e a cui sono state riconosciute capacità di influenzare la crescita dei condrociti. Per meglio comprendere le interazioni e gli effetti di tale polisaccaride con molecole biologiche e colture cellulari, sono stati effettuati studi a livello molecolare e in vitro. In primo luogo si è quindi determinata la costante di affinità del Chitlac per le galectine-1 e -3, successivamente sono stati condotti studi di internalizzazione del Chitlac da parte di cellule presentanti un elevato numero di recettori per il galattosio (cellule di epatocarcinoma) e di condrociti primari, oggetto principale della nostra ricerca. I risultati ottenuti, hanno permesso di stabilire che il polisaccaride viene internalizzato negli epatociti in misura maggiore e in condrociti, in misura inferiore. Ne è seguito uno studio sull’effetto che il Chiltac svolge sul ciclo cellulare di tali cellule. Il risultato ottenuto ci ha indotti a pensare che il Chitlac sia in grado di interferire con le strutture che regolano il ciclo cellulare presumibilmente interferendo proprio con le galectine, proteine che controllano a monte l’espressione di proteine regolatrici dei checkpoint del ciclo cellulare. Questi risultati potrebbero finanche suggerire l’utilizzo del Chitlac non solo come sonda diagnostica ma anche some possibile agente terapeutico. Parte B, Analisi delle Patologie Artritiche a Livello Tissutale. Unità galattosidiche sono state ancorate a sonde per MRI, tra cui il DTPAGd (Magnevist®) presente in commercio e comunemente utilizzato in clinica, al fine di ottenere sonde maggiormente selettive nei confronti di patologie presentanti alterazioni dell’espressione di lectine. Come atteso, l’aggiunta dei gruppi ossidrilici dello zucchero ha portato ad un aumento dell’indice di relassività rispetto alla sonda commerciale con conseguente miglioramento dell’immagine MRI ottenuta dopo l’iniezione endovenosa del complesso di gadolinio. Infine, il Chitlac è stato utilizzato per evidenziare patologie artritiche in modelli animali tramite l’utilizzo dell’imaging ottico. A tale scopo, il polimero è stato coniugato con la sonda fluorescente Cy5.5. Le iniezioni intra-articolari del polimero hanno evidenziato le sole articolazioni patologiche, mentre il Chitlac è stato rapidamente allontanato dalle articolazioni sane. Una prima prova per via endovenosa ha inoltre permesso di verificare la permanenza nell’articolazione del polimero che dunque appare non subire un significativo sequestro da parte del fegato, come poteva essere ipotizzabile dai risultati ottenuti in vitro. Dagli studi condotti nel corso del presente progetto di tesi, è possibile concludere che la clusterizzazione del galattosio induce un incremento dell’affinità nei confronti delle galectine-1 e -3. Inoltre il polimero Chitlac (chitosano lattosilato) si è dimostrato in grado di interagire a livello cellulare al punto da influenzare il ciclo cellulare. Ulteriori studi potrebbero permettere una migliore comprensione di tali eventi. Infine, la possibilità di studiare condrociti derivanti da tessuti di articolazioni patologiche potrebbe permettere di valutare se in tali condizioni l’alterazione dell’espressione delle galectine possa essere tale da aumentare l’internalizzazione del polimero nelle cellule malate ed i suoi effetti sul ciclo cellulare. Studi preliminari in vivo su modelli di animale artritici, hanno permesso di evidenziare la permanenza del Chitlac nella articolazioni degli animali patologici, diversamente dagli animali sani, suggerendo un potenziale uso del polisaccaride nella discriminazione delle due tipologie di articolazione, effetto non evidenziabile con l’utilizzo di due polisaccaridi di controllo (chitosano e destrano), cioè privi del sostituente galattosio.
XXI Ciclo
1976

Hyadd4-G è un derivato dell’acido ialuronico avente l’ 1÷3% di gruppi carbossilici legati a catene laterali di esadecilammina. L’introduzione di catene laterali esadeciliche sull’acido ialuronico (HA) porta alla formazione di un polisaccaride con nuove proprietà in grado di formare idrogel fisici, stabili a concentrazioni di polimero molto basse, mentre l’ HA nativo forma soluzioni viscose anche a concentrazioni dieci volte maggiori. Il comportamento strutturale e dinamico dell’idrogel Hyadd4-G riguarda diverse scale temporali e spaziali. Il fattore dinamico di struttura, f(Q,t), ottenuto con misure di DLS, è stato usato per ricavare i tempi microscopici caratteristici e le dimensioni della maglia del network. La metodologia del recupero di fluorescenza dopo photobleaching, FRAP, è stata usata per misurare i coefficienti di diffusione di sonde fluorescenti con diverse dimensioni. Le dimensioni idrodinamiche delle sonde, evidenziando un effetto di setaccio degli idrogel con gli esperimenti di FRAP, possono essere comparate con le dimensioni di maglia, δ, degli idrogel Hyadd4-G studiati con DLS. Misure di reologia nel regime viscoelastico lineare hanno mostrato che Hyadd4-G è un gel “soffice” viscoelastico. Tali misure hanno mostrato inoltre un particolare meccanismo di ricostituzione (“recupero di struttura”) dopo la distruzione del network del gel con misure in flusso e l’iniettabilità dell’idrogel è supportata da un pronunciato comportamento di “shear-thinning” sotto una deformazione non-lineare. La tecnica dello scattering dei neutroni ha fornito informazioni sulla microstruttura e sulle proprietà di diffusione dell’acqua nel network. La caratterizzazione dello Hyadd4-G ha mostrato che la formazione del gel è dovuta all’interazione tra le catene laterali idrofobiche che stabilizzano il network 3D con un’architettura di dimensioni nanoscopiche, nonostante il basso grado di sostituzione. Questa rappresentazione fornisce il necessario background per considerare Hyadd4-G come un potenziale nuovo idrogel utilizzabile per trattamenti di malattie osteoarticolari. Lo xantano e il konjac glucomannano accoppiati forniscono uno dei sistemi di idrogel sinergici maggiormente studiati. Le zone di giunzione che stabilizzano una struttura 3D sono rappresentate da complessi macromolecolari in soluzione formati da catene polisaccaridiche parzialmente depolimerizzate. Le interazioni non-covalnti che stabilizzano la struttura del complesso polisaccaridico causano la distruzione di una struttura ordinata del complesso in soluzione e dell’idrogel. L’introduzione di legami chimici nella struttura 3D dell’idrogel sinergico rimuove questo comportamento, aggiungendo nuove caratteristiche al rigonfiamento e alle proprietà viscoelastiche dell’idrogel. L’utilizzo di epicloridrina come agente reticolante a basso peso molecolare non influisce sulla vitalità di fibroblasti NIH 3T3.
Hyadd4-G is a derivatized hyaluronic acid having 1÷3% of the carboxyl groups grafted with a hexadecylic amide side-chains. The introduction of a hexadecyl side chain onto hyaluronic acid (HA) chains yields a polysaccharide with new properties, capable of forming physical hydrogels, stable at very low polymer concentrations, whereas native HA forms viscous solutions at ten times higher concentrations. We addressed the structural and dynamic behavior of Hyadd4-G hydrogels at different time and length scales. Dynamic structural factor, f(Q,t), obtained by DLS, was used to extract the microscopic characteristic times and pore size of the network. Fluorescence recovery after photobleaching methodology, FRAP, was used to measure diffusion coefficients of fluorescent probes with different size. The hydrodynamic coil dimensions of dextrans evidencing a sieving effect of the hydrogels by FRAP experiments can be compared with the mesh size, δ, of Hyadd4-G hydrogels studied by DLS. Rheology measurements in the linear viscoelastic regime show that Hyadd4-G is a soft viscoelastic gel. Rheological measurements showed an unusual self-healing mechanism (structure recovery) after destruction of the gel network in a shear flow and the injectability of the hydrogel is supported by a pronounced shear-thinning behavior under nonlinear deformations. Neutron scattering techniques can provide information about the microstructure and the diffusional properties of water within the pores of the network. Characterization of Hyadd4-G showed that the driving force for its gel-like behavior is the occurrence of hydrophobic interactions involving hydrophobic side-chains stabilizing a 3D-network with nano-sized architecture, despite the low degree of substitution. This picture provides the necessary background to assess Hyadd4-G as one of the potential new hydrogel systems suitable for treatment of osteoarticular diseases. Xanthan and konjac glucomannan pair provides one of the most studied synergistic hydrogels. The junction zones stabilizing the 3D structure of this gel are present as macromolecular complexes in solution formed by the partially depolymerised polysaccharidic chains. The non-covalent interactions stabilizing the structure of the polysaccharidic complex cause the melting of the ordered structure of the complex in the solution and of the hydrogels. Introduction of chemical cross-links in the 3D structure of the synergistic hydrogel removes this behaviour, adding new features to the swelling and to the viscoelastic properties of the cured hydrogel. The use of epichlorohydrin as low molecular weight cross-linker does not impact on the viability of NIH 3T3 fibroblasts.

Bacteroides fragilis è un batterio anaerobio, Gram-negativo e costituisce meno dell'1% della microflora intestinale umana. In B. fragilis sono stati individuati otto differenti polisaccaridi capsulari, tra cui il polisaccaride A (PSA). Il PSA appartiene ad una classe di carboidrati batterici noti come polisaccaridi zwitterionici (ZPS). Tali polisaccaridi sono caratterizzati dall'essere costituiti da unità ripetute presentanti ognuna una carica positiva ed una negativa che conferiscono alla molecola proprietà immunomodulatorie. Questi polisaccaridi, infatti, sono gli unici carboidrati capaci di stimolare una risposta immunitaria da parte dei linfociti T (Tzianabos A.O. et al., 2000). Il PSA presenta proprietà immunoregolatorie provate da vari studi, in particolare è in grado dare protezione dalla colite indotta sperimentalmente con Helicobacter hepaticus o chimicamente con il TNBS (Mazmanian S.K. et al., 2008). Per indurre una risposta immunitaria, il PSA deve essere processato tramite la via endocitica e presentato da un MHCII in maniera analoga a come sono presentati i peptidi antigenici (Watts C. et al., 1999). E' stato dimostrato che le principali cellule che presentano il PSA sono le cellule dendritiche sia plasmacitoidi (pDC) (Dasgupta S. et al., 2014) che convenzionali (Mazmanian S.K. et al., 2005). B. fragilis non aderisce però alla sua cellula bersaglio ma è in grado di rilasciare il PSA in vescicole di membrana all'esterno (OMVs) (Shen Y. et al., 2012). Tali vescicole sono riconosciute, sulla superficie delle cellule dendritiche, da recettori specifici ovvero i Toll-like receptor 2. Inoltre, l'attivazione di cellule T richiede la presenza di HLA-DR e molecole co-stimolatorie ICOSL e CD86 sulla superficie delle DC, che si legano rispettivamente a ICOS e CD28 sulle cellule T CD4+. Le cellule T CD4+ vergini riconoscono il PSA presentato da MHCII tramite il loro TCR e si differenziano in cellule T di memoria CD4+CD45+RBlow che producono la citochina anti-infiammatoria IL-10 (Dasgupta S. et al., 2014). Quando si ha una rottura della barriera intestinale molti batteri, tra cui B. fragilis, si riversano nella cavità peritoneale. Le cellule Th17 secernono IL-17 che è essenziale per la formazione dell'ascesso. I macrofagi interagiscono con B. fragilis e secernono IL-10 necessaria per il contenimento della malattia in quanto è noto che tale citochina inibisce la sintesi di citochine pro-infiammatorie quali IFN-γ, IL-2, IL-3, TNF-α e GM-CSF. Questo studio tende ad apportare ulteriori conoscenze sull'intricata relazione, tra gli organismi commensali e il sistema immunitario dell'ospite e a identificare se il PSA possa essere una molecola immunomodulatoria con rilevanza clinica. In particolare ho valutato l'eventuale miglioramento che il PSA può apportare nei confronti di stati infiammatori cronici come quelli indotti dal batterio patogeno Gram negativo Bartonella henselae, in siti diversi da quello intestinale. A tal fine nella prima fase del mio lavoro ho condotto indagini morfologiche, ultrastrutturali e molecolari su campioni di aorta e di fegato di topi immunocompetenti C57BL/6J. Ho confrontato i tessuti prelevati da un gruppo di controllo con quelli isolati da topi sottoposti a cinque differenti trattamenti. I topi sono stati infettati con il ceppo selvatico di B. fragilis NCTC9343, con il ceppo mutante B. fragilis ΔPSA che non esprime il PSA, con B. henselae ATCC49882 o co-infettati con B. henselae e, o il ceppo selvatico o il ceppo mutante, di B. fragilis. B. henselae è stata somministrata per via intraperitoneale una settimana dopo la somministrazione per via orale di B. fragilis. Gli organi sono stati prelevati 36 giorni dopo l'infezione con B. henselae. Le analisi morfologiche eseguite tramite colorazione con ematossilina-eosina e l'analisi ultrastrutturale mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) hanno evidenziato la presenza nei topi infettati con la sola B. henselae, di granulomi nel fegato e di cellule del sistema immunitario nell'avventizia dell'aorta e l'assenza nei topi co-infettati con B. fragilis di risposta infiammatoria marcata, confermando l'effetto protettivo svolto dalla molecola di PSA del Bacteroides. Dato ulteriormente confermato da una risposta infiammatoria più debole nei topi co-infettati con B. fragilis ΔPSA. Nella seconda parte del mio lavoro ho effettuato ulteriori indagini morfologiche e ultrastrutturali su campioni di fegato e aorta di topi SCID, cioè topi con grave deficienza immunitaria combinata privi totalmente di linfociti B e T per blocco precoce della maturazione linfocitaria dai precursori midollari, sottoposti ai medesimi trattamenti dei topi immunocompetenti. Ciò al fine di valutare gli effetti delle infezioni e l'eventuale ruolo protettivo del PSA anche in condizione di immunodeficienza, condizione questa importante essendo l'infezione da B. henselae concausa di morte in esseri umani immunocompromessi (Chiaraviglio L. et al., 2010). Le indagini morfologiche su sezioni fini di fegato colorate con blu di toluidina e le analisi ultrastrutturali al TEM evidenziano che i topi SCID tollerano l'infezione da B. henselae a elevate concentrazioni. Il topo SCID, risponde all'infezione da B. henselae con una notevole deposizione di collagene che permette all'organismo di contenere i batteri, anche se offre agli stessi un ambiente protetto dove evitare la digestione da parte della risposta immunitaria. Nei campioni infettati da B. fragilis WT si è notato invece la riduzione nella produzione di collagene e una maggiore risposta da parte dei macrofagi dimostrando che in condizione di immunocompromissione il PSA stimola la proliferazione e attivazione di cellule dell'immunità innata riuscendo a contenere i danni indotti dall'infezione da B. henselae. Nell'ultima parte del mio progetto ho effettuato una serie di indagini su cellule progenitrici endoteliali (EPC) che vengono infettate e risultano una nicchia primaria di B. henselae (Salvatore P. et al. 2008). Si è inizialmente valutato tramite FACS se il numero di EPC viene influenzato dalle infezioni batteriche sia nei topi immunocompetenti sia in quelli immunocompromessi. Nei topi immunocompetenti infettati da B. henselae il numero di EPC diminuisce drasticamente di circa il 90% rispetto al numero di EPC dei topi controllo. Diminuzione sorprendentemente contrastata dal PSA dato che il numero di EPC aumenta nei soli campioni infettati o co-infettati da B. fragilis WT. Le stesse analisi condotte sul sangue di topi immunocompromessi, hanno evidenziato, invece, un aumento delle EPC nei campioni infettati da B. henselae rispetto ai controlli, oltre che, anche in questo caso, nei campioni infettati e ancora di più in quelli co-infettati con B. fragilis WT. L'aumento di EPC in risposta all'infezione da B. henselae nei topi immunocompromessi, potrebbe essere dovuto a un maggiore apporto di precursori endoteliali essenziali per far si che venga assicurato il turn over delle cellule endoteliali danneggiate dall'infezione con B. henselae. L'immunofluorescenza con anticorpi specifici anti-lipopolisaccaride di B. fragilis (LPS) e anti-B. henselae ha mostrato che sia B. fragilis WT che il suo mutante ΔPSA possono essere internalizzati dalle EPC come precedentemente documentato per B. henselae (Salvatore P et al., 2008) dimostrando che tale processo è indipendente dal PSA. I dati di immunofluorescenza sono stati confermati anche dalle osservazioni al TEM effettuate su colture cellulari di EPC umane sottoposte agli stessi trattamenti infettivi dei topi per 48 ore. Dalle micrografie è emerso che i B. fragilis sia WT sia ΔPSA riescono a infettare le EPC venendo però digeriti all'interno dei lisosomi e, inoltre, nelle co-infezioni con il B. fragilis WT, si è osservato un numero ridotto di invasomi rispetto alle cellule infettate dalla sola B. henselae, come se il batterio avesse difficoltà a duplicarsi all'interno di queste cellule. Tramite RT2 Profiler Array PCR e visualizzando contemporaneamente il profilo di 84 principali geni infiammatori codificanti chemochine, citochine e i loro recettori, in entrambe le co-infezioni sia con B. fragilis WT sia B. fragilis ΔPSA rispetto alla semplice infezione con B. henselae si è registrato un aumento del numero di geni differenzialmente espressi (DE) rispetto alle cellule non infette. In particolare, il confronto diretto dei livelli di espressione nei campioni co-infettati ha rivelato che B. fragilis WT esercita una significativa down-regolazione di chemochine pro-infiammatorie fornendo contemporaneamente una positiva modulazione di geni anti-infiammatori come IL-10 e Interferone-alfa 2 (IFNA2). Infine tramite test ELISA effettuato sui surnatanti delle stesse cellule infette risulta che nei campioni co-infettati il ceppo di B. fragilis WT esercita una significativa sotto modulazione di interleuchine pro-infiammatorie e, al contrario, un incremento positivo di IL-10, di TNFα e GM-CSF. Questo dato ha confermato che le early EPC possono svolgere un ruolo essenziale nella risposta immunitaria se stimolate dal PSA. Il PSA ha, quindi, un ruolo protettivo nei confronti dell'infiammazione cronica indotta da B. henselae. Tale molecola esercita il suo ruolo anti-infiammatorio stimolando il rilascio di IL-10 da parte di cellule T non solo a livello intestinale ma anche a livello sistemico. Inoltre stimola nei soggetti immunocompromessi la risposta immunitaria innata sia attivando macrofagi, sia stimolando cellule EPC, le quali si è visto che, in vitro, rilasciano se stimolate dal PSA citochine, quali GM-CSF, che portano a un'ulteriore proliferazione di macrofagi. Questi risultati preliminari ottenuti inducono a pensare che il PSA possa iniziare a essere utilizzato per trials clinici al fine di sviluppare innovative terapie nei confronti di malattie infiammatorie croniche.