Academic literature on the topic 'Polymère à empreintes de protéines'

Le but de ce travail de thèse était de concevoir et de développer un nouveau type de matériau nanostructuré qui pourrait être utilisé dans une biopuce capable de détecter sélectivement des protéines telles que des biomarqueurs cancéreux. La méthode choisie pour atteindre cet objectif a été la technique des polymères à empreinte moléculaire (MIP). Le MIP a dû être structuré en lignes nanométriques pour être couplé par la suite avec un système de détection sans marquage utilisant la diffraction de la lumière. L'ensemble pourrait être ensuite mis en forme sur des biopuces. Pendant la première partie de ce projet, les différentes formulations d'hydrogel ont été évaluées, ce qui nécessite de répondre à plusieurs spécifications: processus de polymérisation à 25-37° C, dans une solution tampon phosphate et temps de polymérisation de moins de 15 minutes. En outre, l'hydrogel devait porter des groupes fonctionnels pouvant interagir avec une protéine, être transparent et biocompatible. Enfin, ces matériaux devaient présenter d'une part des tailles de pores compatibles avec celle de la protéine afin d'assurer une reconnaissance en surface et d'autre part des propriétés mécaniques qui soient compatibles avec les procédés technologiques usuels. Trois formulations ont été sélectionnées pour la synthèse d'hydrogel, ayant des groupes fonctionnels présentant soit une charge positive ou négative, ou sans charge du tout. Ces matériaux ont été caractérisés par des techniques telles que piézorhéométrie, calorimétrie différentielle à balayage (DSC), microscopie électronique à balayage (MEB, MET et cryoSEM), microscopie à force atomique (AFM) et profilométrie. En suivant la formation de l'hydrogel sous irradiation UV par piézorhéométrie, nous avons montré que la réticulation maximale était atteinte en moins de 5 minutes en utilisant une lampe avec une puissance de 150 mW/cm2. En outre, nous avons également confirmé que ces formulations sont compatibles avec la lithographie par nanoimpression UV et que des réseaux périodiques de taille sub-micrométriques pouvaient être obtenus. Les MIP à protéine réalisés à partir des conditions optimisées ont été évalués par fluorescence après les expériences de ré-incubation, indiquant une reconnaissance de la streptavidine avec un facteur d'impression de F. I = 1,7<br>The aim of this PhD work was to design and develop a new type of nanostructured material that could be further used in a biochip capable of selectively detecting proteins such cancer biomarkers. The chosen method to achieve this goal was the molecularly imprinted polymer (MIP) technique. The MIP had to be structured in nanometric lines to be coupled subsequently with the diffracting label-free detection. During the first part of this project, different hydrogel formulations were assessed, which needed to respond to several specifications: polymerization process at 25-37°C in phosphate buffer solution and a polymerization time of less than 15 minutes. In addition, the hydrogel required functional groups that can interact with the protein, it needed to be transparent and biocompatible. Finally, these materials had to have pore sizes compatible with that of the protein for successful surface recognition and exhibit mechanical properties which are compatible with routine technological processes. Three formulations for hydrogel synthesis were selected, including functional groups presenting either a positive or negative charge, or no charge at all. These materials were characterized by techniques such as piezorheometry, differential scanning calorimetry (DSC), electron microscopy (SEM, TEM and cryoSEM), atomic force microscopy (AFM) and profilometry. By following the formation of the hydrogel under UV irradiation by piezorheometry, we showed that maximal crosslinking was achieved in less than 5 minutes when using a lamp with a power of 150 mW/cm2. In addition we also confirmed that these formulations were compatible with UV-nanoimprint lithography and that sub-micron periodic gratings could be obtained. The protein MIPs after batch rebinding experiments were evaluated by fluorescence, showing recognition for streptavidin with an imprinting factor of I. F= 1. 7

Cette thèse de doctorat s'intègre dans un projet de recherche en collaboration avec deux autres partenaires, l'INERIS et l'UMR CNRS 6600, financé par le Conseil Régional de Picardie. Ce projet vise à développer, pour des études de toxicité de molécules chimiques, un système in vitro basé sur la culture cellulaire dans une puce microfluidique. Ce système permettra de reproduire de façon la plus proche possible un système biologique. Le projet développé vise à proposer un système in vitro, permettant de reproduire de façon la plus proche possible le système biologique à petite échelle. Sous forme de chambre de culture microfluidique, il aura pour mission de permettre la croissance et la multiplication de plusieurs types de cellules représentant le système biologique entier, en créant un micro-environnement dynamique qui se rapproche des conditions de flux sanguin. Ce système pourra être utilisé pour des tests de toxicologie, si après injection de produits à tester à différentes concentrations, une réponse des cellules peut être détectée. Notamment, lorsque la dose de produit est toxique, la cellule meurt, libérant son contenu dans le liquide qui circule. Il suffira donc de placer en aval un biocapteur permettant de détecter les substances caractéristiques de la mort cellulaire. Un biocapteur est constitué d’un élément de reconnaissance (anticorps, enzyme, récepteur, ADN), qui adsorbe sélectivement l’analyte cible en question, et qui en contact avec un transducteur qui traduit le signal chimique ou physique obtenu en un signal facilement quantifiable. Le but de cette thèse, et notre contribution au projet global, était de développer un tel biocapteur, ce qui représentait un réel défi scientifique et technologique. L’un des facteurs limitant était le fait qu’un système cellulaire est susceptible de libérer des enzymes hydrolytiques capables de dégrader les biomolécules utilisées comme éléments de reconnaissance, à l’état vivant mais encore davantage après la mort cellulaire. Pour cela, nous nous sommes tournés vers des récepteurs synthétiques à base de polymères à empreintes moléculaires. Ces matériaux ne sont à priori pas biodégradables et présentent de toute façon une plus grande stabilité chimique et physique comparé aux biomolécules. Le système microfluidique pourra être ainsi facilement régénéré et stabilisé, ce qui est primordial pour une application en culture cellulaire. Comme molécule cible nous avons dans un premier temps sélectionné le cytochrome c, petite protéine intracellulaire qui est l’une des premières protéines relarguées lors de la mort cellulaire. Ceci représente également un défi car la technique de l’impression moléculaire, appliquée de façon quasi-routinière aux petites molécules, est à l’heure actuelle beaucoup moins développée pour les protéines. Pour être intégrer dans un système microfluidique, le polymère devait être obtenu sous forme d’un film mince, et afin d’éviter des temps de réponse trop longs, les sites de reconnaissance pour la cible doivent être facilement accessibles. Nous avons sélectionné comme méthodes de caractérisation du film l’AFM pour des études de morphologie, et la fluorescence pour mesurer la reconnaissance et l’adsorption de la cible. De plus, nous avons employé, pour la première fois, la spectroscopie de force par AFM, pour mesurer la force d’interaction entre la cible et son site de reconnaissance dans le film de polymère à empreinte moléculaire à l’échelle d’une molécule, et ainsi apporter une preuve directe de l’existence de ces sites. Dans la première partie de ce mémoire, nous nous attacherons à faire un rappel du contexte bibliographique de l’impression moléculaire, et nous présenterons les différentes méthodes de synthèse et les différentes applications de ces matériaux. Puis nous parlerons spécifiquement des difficultés pouvant être rencontrées lors de l’impression moléculaire de protéines, et des possibles solutions. Enfin, nous expliquerons la méthode de la microscopie à force atomique en détaillant notamment l’approche spectroscopie de force. Dans la deuxième partie, nous présenterons et discuterons les stratégies et les différents travaux réalisés pour obtenir et caractériser un polymère à empreinte moléculaire pour le cytochrome c.

Le mélanome est le plus agressif et le plus sévère des cancers cutanés du fait de son fort potentiel métastatique. Pourtant à ce jour, aucun biomarqueur pour la détection précoce du mélanome n'est unanimement reconnu. Notre groupe a récemment démontré que le métabolisme du céramide est fortement altéré dès les premiers stades de la maladie, conduisant à l'augmentation de la production d'un dérivé du céramide, la sphingosine 1-phosphate (S1P). La S1P est sécrétée par les cellules du mélanome et a été identifiée comme une molécule majeure du remodelage du microenvironnement tumoral, qui favorise la progression du cancer. De façon physiologique, la S1P circulante se trouve majoritairement sous forme liée aux protéines de haute densité (HDLs), aux protéines de basse et très basse densité (LDLs et VLDLs) ainsi qu'à l'albumine. Les cellules de mélanome pourraient produire de la S1P non liée qui pourrait rendre compte des effets produits par ce lysosphopholipide sur les cellules du microenvironnement tumoral suite à sa fixation sur les récepteurs S1PR présents à la surface des cellules stromales. Ainsi, cette forme libre de S1P pourrait représenter un nouveau biomarqueur pour la détection précoce du mélanome. Cependant, il n'existe à l'heure actuelle aucun moyen permettant de la quantifier. Le but de ce travail interdisciplinaire a été de développer un nouveau capteur basé sur un polymère à empreintes moléculaires (MIP) dans le but de quantifier la S1P libre dans le sang de patients atteints de mélanome. Cette étude a été réalisée entre l'équipe " Ingénierie pour les sciences du vivant (ELiA) " du Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes (LAAS), et l'équipe " Sphingolipides, métabolisme, mort cellulaire et progression tumorale " du Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (CRCT), en étroite collaboration avec l'équipe " Biomimétisme et structures bioinspirées " de l'Université Technologique de Compiègne (UTC). Dans un premier temps, nous avons synthétisé un nouveau MIP dirigé contre la S1P par une méthode de thermopolymérisation en masse. Nous avons caractérisé puis optimisé ce MIP en effectuant des mesures de spectrométrie de masse couplée à la chromatographie en phase liquide et des mesures de spectroscopie de fluorescence. Le MIP a été comparé à un NIP (Non Imprinted Polymer) et exposé à des analogues de la S1P afin d'évaluer sa sélectivité. Dans un second temps, en vue de l'utilisation d'un MIP en tant que couche sensible d'un futur capteur et pour anticiper son immobilisation et sa structuration sur le transducteur, nous avons mis au point un nouveau MIP photopolymérisable en 2D. Ce MIP a d'abord été structuré en motifs par photolithographie sur des surfaces de silicium puis validé par des mesures de microscopie de fluorescence. Le MIP a également été structuré sous la forme de couches minces sur les surfaces actives de capteurs de Microbalance à Cristal de Quartz (QCM) dans le but de le valider par cette méthode sans marquage. Enfin, nous avons exploré l'utilisation d'une fibre optique recouverte d'une couche de MIP photopolymérisé dans le but de détecter, par spectroscopie infrarouge, la liaison de la S1P avec le MIP à la surface de la fibre<br>Melanoma is the most aggressive and severe form of cutaneous cancer due to its high metastatic potential. However, to date, no marker for the early detection of melanoma has been unanimously accepted. Our group has demonstrated that ceramide metabolism is strongly altered in melanoma, leading to the overproduction of sphingosine 1-phosphate (S1P), one of its derivatives. S1P is secreted by melanoma cells and has been identified as a critical molecule of tumor microenvironment remodeling that supports cancer progression. Physiologically, circulating S1P is predominantly linked to high density lipoproteins (HDLs), low and very low density lipoproteins (LDLs and VLDLs), as well as albumin. Melanoma cells produce unbound S1P that could be responsible for the effects induced by this lysophospholipid on the tumor microenvironment, as a result of its binding to S1PR receptors present on the surface of stromal cells. Thus, secreted tumor S1P could represent a new biomarker for the early detection of melanoma. However, there are currently no means to quantify it. The goal of this interdisciplinary work was to develop a new sensor based on a Molecularly Imprinted Polymer (MIP) in order to quantify unbound S1P present in the blood of melanoma patients. This study has been conducted between the "Engineering for Life science Applications (EliA)" group at the Laboratory for Analysis and Architecture of Systems (LAAS) and the "Sphingolipids, metabolism, cell death and tumor progression" group at the Cancer Research Center of Toulouse (CRCT), in strong collaboration with the team "Biomimetism and Bioinspired Structures" of the University of Technology of Compiègne (UTC). First, we synthesized a new MIP against S1P employing a bulk thermopolymerization approach. The resulting MIP was characterized and optimized by performing both mass spectrometry and fluorescence spectroscopy measurements. It was compared to a Non Imprinted Polymer (NIP) and exposed to S1P analogues to assess its selectivity. Second, in order to use the MIP as the sensitive layer of a future sensor and prepare its immobilization and structuration onto a transducer, we synthesized a new surface photopolymerizable MIP. This MIP was first structured by photolithography onto silicon substrates and validated by fluorescence microscopy measurements. The MIP was also structured as a thin layer onto Quartz Crystal Microbalance (QCM) chips in order to validate its binding capacities using this label-free method. Finally, the use of a MIP-coated optical fiber as an infrared sensor was explored, with the aim of detecting S1P in blood using Attenuated Total Reflectance (ATR) spectroscopy

Les polymères à empreintes moléculaires sont des matériaux aux propriétés de reconnaissance spécifiques qui peuvent être mis à profit pour la détection d’une large gamme d’analytes. Ainsi, depuis quelques années, des travaux décrivent leur utilisation dans des capteurs en raison de leur capacité à piéger une cible définie.L’objectif de ce travail est d’ajouter des propriétés redox à des polymères à empreintes moléculaires pour détecter le Bisphénol A (BPA) par des méthodes électrochimiques simples. Ces polymères électroactifs sont synthétisés par polymérisation par précipitation d’une sonde redox, le méthacrylate deméthylferrocène (Fc), et du diméthacrylate d’éthylène glycol (EDMA) en présence du BPA pour le polymère imprimé (e-MIP-Fc) et en son absence pour le polymère non-imprimé (e-NIP-Fc).L’introduction d’un deuxième monomère fonctionnel, la 4-vinyl pyridine (4-VP), conduit à deux autres polymères imprimé (e-MIP-Fc-VP) et non-imprimé (e-NIP-Fc-VP). Les propriétés d’adsorption des polymères ainsi obtenus sont caractérisés en batch à l’aide de la LC-MS et présentent une capacité de reconnaissance du BPA avec un facteur d’empreinte de 2,5 et 1,3 respectivement pour l’e-MIP-Fc-VP et e-MIP-Fc justifiant de l’efficacité de l’empreinte. Leurs caractérisations par voltampérométrie cyclique confirment d’une part la bonne intégration du monomère ferrocényle dans les e-MIP/e-NIP et d’autre part la capacité de ces polymères à révéler la présence ou pas de la cible. Les particules e-MIP-Fc ont ensuite été intégrées dans des dispositifs type micro électrode ou transistor OECT (Organic ElectroChemical Transistor). Les premiers résultats, mêmes s’ils doivent être confirmés, s’avèrent encourageants avec,comme attendu, des modifications des propriétés électriques en présence du BPA. L’e-MIP-Fc-VP après mélange avec de la pâte de carbone, a été utilisé en sérigraphie pour obtenir une électrode de travail modifiée dans des électrodes sérigraphiées (Screen Printed Electrode). Ces électrodes permettent la reconnaissance du BPA avec des limites de détection et de quantification de 60 pM et 190 pM respectivement pour une gamme de concentrations comprise entre 0,15 et 1,84 nM, ouvrant ainsi des perspectives intéressantes pour la détection du BPA en milieu aqueux<br>Molecularly imprinted polymers are materials with specific recognition properties that can be used for the detection of a wide range of template. In recent years, many works have been reported on their use in sensors because of their capability to specifically bind a defined analyte.The aim of this work is to assign to the molecularly imprinted polymers redox properties in order to detect Bisphenol A (BPA) by using easy electrochemical techniques. These electroactive polymers are synthesizedby precipitation polymerization of ferrocenylmethyl methacrylate (Fc) and ethylene glycol dimethacrylate(EDMA) in the presence of BPA for the imprinted polymer (e-MIP-Fc) and in its absence for the nonimprinted polymer (e-NIP-Fc). The copolymerization of the previous monomer with 4-vinylpyridine (4-VP) leads to two other imprinted (e-MIP-Fc-VP) and non-imprinted (e-NIP-Fc-VP) polymers. The resulting polymers are characterized in batch using LC-MS and have ability to recognize BPA with an imprinting factor of 2.5 and 1.3 respectively for e-MIP-Fc-VP and e-MIP-Fc the proving the recognition efficiency ofthese polymers. Their cyclic voltammetry recording confirm first, the good integration of the redoxferrocenyl monomer inside the polymers e-MIP/e-NIP during the polymerization, and on the other hand,the capability of these polymers to reveal the presence of BPA in the solution. The e-MIP-Fc particles were then integrated inside devices like microelectrode and OECT (Organic ElectroChemical Transistor). The first results, even if they must be confirmed, are positive regarding the modification of the electrical properties of these devices in the presence of BPA. The e-MIP-Fc-VP particles, after mixing with a carbon paste, were screen-printed to obtain a modified working electrode in a screen-printed electrode device. This electrode enable the recognition of BPA with limits of detection and quantification of 60 pM and 190 pM respectively, for a concentration range between 0.15 and 1.84 nM, thus opening up interesting perspectives for the detection of BPA in aqueous medium

Nous avons cherché à concevoir des macromolécules ayant un comportement de chaperonne vis à vis de diverses protéines et notamment en fondant leur activité sur des propriétés stimulables par la lumière. Les interactions hydrophobes constituent un paramètre clé de l'effet chaperonne qui a été mis en évidence dans les chaperonnes biologiques aussi bien que dans les chaperonnes artificielles. Nous avons synthétisé des polymères à amphiphilie photo-stimulable portant des chaînes pendantes azobenzènes. Ces polymères sont capables d'association/dissociation photo-stimulables avec des particules colloïdales à coeur hydrophobe. Différents paramètres peuvent moduler ces associations comme la force ionique, le taux de modification hydrophobe, la nature du greffon... Ces polymères ont montré plusieurs propriétés caractéristiques de chaperonnes artificielles : ils déstabilisent une protéine modèle, le cytochrome C, protègent de l'agrégation et augmentent l'efficacité des procédés de renaturation de l'anhydrase carbonique et d'un fragment d'anticorps surexprimé en bactérie. L'évolution du repliement a été caractérisée par suivi des structures secondaires en dichroïsme circulaire et par suivi de la compacité des protéines en fluorescence. L'association polymère/protéine a été étudiée par électrophorèse capillaire et par diffusion de la lumière.

L’objectif de ce travail a été de développer une nouvelle technique d’impression moléculaire sur surface appliquée à des (bio)-macromolécules (protéines, ADN, etc. ). Cette approche repose sur un support d’impression de type couche phospholipidique (monocouche ou bicouche) dont la composition et les propriétés physico-chimiques permettent de contrôler la reconnaissance combinatoire de la molécule-cible et la mémorisation de l’empreinte par la température. Les caractéristiques de ces supports lipidiques assurent la réversibilité du processus d’impression basée sur la transition d’un mélange de lipides d’un état fluide vers un état gel et inversement. Pour cette raison, seuls des mélanges de lipides ayant une température de transition de phase proche de la température ambiante ont été utilisés. Des études de caractérisation physico-chimiques détaillées nous ont conduits à de nouvelles conclusions, notamment sur le mécanisme de formation des bicouches lipidiques supportées et la diffusion des lipides. Ensuite, le travail a été principalement consacré à l’étude de l’impression moléculaire d’annexine V sur des bicouches et monocouches lipidiques par différentes techniques de caractérisation (QCM-D, microscopie de fluorescence, AFM). L’utilisation de ces techniques complémentaires a permis d’obtenir des résultats très encourageants pour les bicouches et les monocouches qui suggèrent la présence des empreintes moléculaires mais sans aucune preuve directe des phénomènes réversibles de reconnaissance. Ainsi, la validation de notre approche nécessitera l’optimisation du système lipidique et l’utilisation de nouvelles techniques d’investigation<br>The aim of this work was to investigate if supported lipid bilayers can be used as two-dimensional matrices for large templates (proteins, DNA, etc. ). This idea requires a liquid bilayer composed of at least two compounds to allow a phase separation in contact with a suitable template. The composition and the physicochemical properties permit to control the combinatorial recognition of the template and the freezing of the imprints by temperature. The features of the lipid supports assure the reversibility of the imprinting process based on the transition of a lipid mixture from the fluid state to the gel state and vice versa. We have carried out detailed physicochemical characterisations of several such systems with a phase transition temperature close to the ambient. This has led to new conclusions concerning the mechanism of bilayer formation. In addition we have demonstrated that the mobility of the lipids strongly depends on the lateral pressure of the upper leaflet of the bilayer, confirming existing hypothesis. We have also been able to demonstrate by various techniques (QCM-D, fluorescence microscopy and AFM) that the adsorbing template leads to a 2D-phase separation (patterning). However this remains a difficulty to prove that this structuration leads to reversible recognition events. The present work has been successful in narrowing down considerably the parameter space for future experiments. Thus, the validation of our approach will require the optimization of the lipid system and the use of new investigation techniques